RU2087534C1 - Recombinant plasmid dna alpha r 1-6 designated for marking the 13-th and 21-d human chromosomes - Google Patents

Abstract

FIELD: genetic engineering, medicinal genetics. SUBSTANCE: invention relates to constructing the new molecular-genetic marker of 13-th and 21-d human chromosomes that shows specificity with respect to centimeter region involving heterochromatin of both arms. This nucleotide sequence relates to class of alphoid DNA (on the basis of data of DNA-probe restriction mapping, blot-hybridization and chromosome hybridization in situ). New recombinant plasmid has human DNA genome fragment (size is 680 base pairs) that contains two internal unique restriction site PstI and genome fragment flanking with Eco RI-site from the different ends. Also, this new DNA-probe shows minor hybridization site on human chromosomes in situ that involves chromosomes 2, 4, 14, 15, 18, 20 and 22. This DNA- probe hybridizes only with centimeter regions of human chromosome 13 and 21. Plasmid can be used for diagnosis of chromosomal pathology (Down's and Pataw's syndromes). EFFECT: improved method of chromosome marking.

Description

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 13-й и 21-й хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомной патологии, диагностику анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека. Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК-зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК-зондов чаще всего используют уникальные (однокопийный или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомо-специфичные ДНК-зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократные повторяющиеся от нескольких сотен до нескольких тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 п.о.) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК-зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, II и X человека (Гиндилис и др. 1985, N 1203108; Юров и др. 1989, N 1494724; Юров и др. 1993, N 1792429, Юров и др. 1994, патентная справка N 94012782). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК-зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосомах 13 и 21 (B. Vissel, K.H. Choo "Four distinot alpha satellite subfamilies shared by human chromosomes 13, 14 and 21", 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2, 271 277; S. Lawrence et al. "Integration of gene maps: Cromosome 21 (human genome)", 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8, 7210-7214; Murata Makiko, Ohki Reiko "Isolation of centromeric region of human chromosomes 21 long arm DNA-markers and their mapping by pulse gel-electrophores", 1993, Kyorin Med. Soc. 24, 3, 465 476; Geronimo i. et al. "Physical map of the short arm/centromeric region of human chromosome 21", 1993, Amer. J. Hum. Genet. 53, 3, 1294). Эти ДНК-зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения конструирования ДНК-зондов для маркировки хромосом 13 и 21 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосом 13 и 21, не обладают достаточно высокой сецифичностью для центромерных районов хромосом 13 и 21 человека. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуются корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосом 13 и 21. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерных районов хромосом 13 и 21 человека, которые позволили бы проводить маркирование и идентификацию центромерных районов хромосом 13 и 21 в интерфазных и метофазных клетках. The invention relates to the field of genetic engineering, in particular to the field of designing molecular genetic markers, and can be used in medical genetics for reliable identification of the 13th and 21st human chromosomes in normal and pathological conditions, including prenatal and postnatal diagnosis of chromosomal pathology, diagnostics aneuploidy in various forms of cancer, as well as for cytogenetic mapping of the human genome. It is known that, to date, DNA probes for various human chromosomes have been cloned and characterized. However, unique (single-copy or small-copy DNA sequences) are most often used as DNA probes, which do not allow for efficient molecular-cytogenetic diagnostics due to the low resolution of modern cytogenetic methods. An exception is chromosome-specific DNA probes containing repeating (multi-copy) DNA sequences. These include satellite (alpha and “classical” satellite) DNAs, which are multiple repeating relatively short (up to 170 bp) DNA fragments from several hundred to several thousand times that form the centromeric regions of all human chromosomes. Based on them, DNA probes of alpha-DNA with specificity for human chromosomes 1, 3, II and X were created and protected by copyright certificates (Gindilis et al. 1985, N 1203108; Yurov et al. 1989, N 1494724; Yurov et al. 1993, N 1792429, Yurov et al. 1994, patent reference N 94012782). The task of obtaining highly efficient DNA probes for labeling the remaining human chromosomes remains relevant. Currently, a number of cloned alpha satellite and classical satellite DNAs are described, which are characterized by specificity for different human chromosomes. These sequences can be considered as a prototype of the recombinant plasmid of the invention. However, the possibility of their use for marking and identification of human chromosomes remains open. In particular, human alpha-DNA DNA variants are found that are found on chromosomes 13 and 21 (B. Vissel, KH Choo "Four distinot alpha satellite subfamilies shared by human chromosomes 13, 14 and 21", 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2, 271 277; S. Lawrence et al. "Integration of gene maps: Cromosome 21 (human genome)", 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8, 7210-7214; Murata Makiko, Ohki Reiko "Isolation of centromeric region of human chromosomes 21 long arm DNA-markers and their mapping by pulse gel-electrophores ", 1993, Kyorin Med. Soc. 24, 3, 465 476; Geronimo i. et al." Physical map of the short arm / centromeric region of human chromosome 21 ", 1993, Amer. J. Hum. Genet. 53, 3, 1294). These DNA probes have not been studied in sufficient detail from the point of view of constructing DNA probes for marking chromosomes of 13 and 21 people in applied works. Moreover, all recombinant plasmids described in the literature that contain human alpha-satellite DNA with specificity for chromosomes 13 and 21 do not possess sufficiently high specificity for centromeric regions of chromosomes 13 and 21. Therefore, they cannot be used for effective molecular cytogenetic diagnostics in medical practice, when correct identification of chromosome abnormalities and subsequent medical genetic counseling or prenatal diagnostics with possible termination of pregnancy due to aberrations of chromosomes 13 and 21 are required. The construction of markers for molecular cytogenetic diagnostics remains relevant centromeric regions of chromosomes 13 and 21 of the person, which would allow marking and identification of centros dimensional regions of chromosomes 13 and 21 in interphase and metaphase cells.

Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифического маркирования центромерных районов хромосом 13 и 21 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида альфа R1-6 отличается от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосом 13 и 21 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерного района хромосом 13 и 21 человека данное техническое решение разработано впервые. The invention has no analogues, since such a recombinant plasmid for highly specific labeling of the centromere regions of chromosomes 13 and 21 of humans has been developed for the first time. The resulting recombinant plasmid alpha R1-6 differs from the cloned satellite DNAs known in the literature in the production method, in the restriction map and in the size of the insert of human alphaoid, in terms of chromosome localization and high specificity for 13 and 21 chromosomes. The proposed technical solution has no common features with any of the above analogues, because for molecular cytogenetic labeling and identification of the centromere region of chromosomes 13 and 21 of the person, this technical solution was developed for the first time.

Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 13-й и 21-й хромосом человека, а именно специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами:
строго маркировал околоцентромерные районы хромосом 13 и 21 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;
эффективно маркировал центромерные районы хромосом 13 и 21 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.The aim of the invention is the creation of a new effective molecular genetic marker of the 13th and 21st chromosomes of a person, namely, specific for centromeric regions, including heterochromatin of both arms, which, in contrast to the recombinant plasmids described in the literature, had the following advantages:
strictly marked the near-centromeric regions of chromosomes 13 and 21 without cross-hybridization with other chromosomes;
effectively labeled the centromeric regions of chromosomes 13 and 21 in interphase nuclei to identify numerical chromosomal aberrations, which is necessary for karyological analysis of non-dividing cells, such as tumor cells.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pBR 325 (6,1 т.п.о.) по EcoR1-сайтам фрагмент ДНК человека альфа R1-6 размером 680 пар оснований, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 13-й и 21-й хромосом человека. Данный фрагмент имеет длину 680 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК-зонда, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ. The essence of the invention lies in the fact that cloned in plasmid pBR 325 (6.1 kbp) at EcoR1 sites a human DNA fragment of alpha R1-6 with a size of 680 base pairs, which is a sequence of human alphaoid DNA, is used as a specific molecular marker of the 13th and 21st human chromosomes. This fragment has a length of 680 nucleotides and belongs to the class of alpha-DNA, which was proved by restriction mapping of the DNA probe, experiments on blot hybridization and hybridization on chromosomes in situ.

Новый ДНК-зонд отличается от известных геномных фрагментов ДНК человека размером 680 пар оснований, имеющего 2 внутренних уникальных сайта рестрикции Pst1 и ограниченного EcoR1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот новый ДНК-зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 4, 14, 15, 18, 20, 22. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерными районами хромосом 13 и 21 человека. The new DNA probe differs from known genomic fragments of human DNA with a size of 680 base pairs, which has 2 unique internal Pst1 restriction sites and is limited to EcoR1 sites from different ends of the genomic fragment. In addition, this new DNA probe is distinguished by minor hybridization sites on human chromosomes under in situ conditions, which include chromosomes 2, 4, 14, 15, 18, 20, 22. Under the special conditions described in the examples and method of use, this DNA the probe hybridizes only with the centromeric regions of chromosomes of 13 and 21 people.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. The specific goal of the study was achieved as follows.

Источником выделения маркерного фрагмента альфа R1-6 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидов мужского пола) обрабатывают рестриктазой EcoR1 до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью легирования по "липким" концам в EcoR1-сайт бактериального плазмидного вектора pBR 325. Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинатную клонотеку (по типу "short gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином. The source of isolation of the marker fragment of alpha R1-6 is human lymphocyte DNA purified by electrostatic filtration on an Amicon XM-300 ultrafiltration membrane. The preparation of purified human lymphocytic DNA (obtained from male individuals) is treated with restriction enzyme EcoR1 until complete hydrolysis. The obtained restriction fragments are “cross-linked” by doping at the “sticky” ends to the EcoR1 site of the bacterial plasmid vector pBR 325. This plasmid carries the ampicillin resistance gene. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells to be selected on the medium with this antibiotic. Thus, this vector allows the creation of a recombinant clonoteque (of the "short gun" type) for automatic selection on a medium with ampicillin.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²P) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.In the next step, clones possessing homology with alpha DNA are identified in the created clonoteca. For this, recombinant clones on nitrocellulose filters are introduced into a hybridization reaction with radioactive phosphorus-labeled ( ³² P) DNA of the total fraction of human ARI-DNA, which is represented mainly by alpha-DNA. Colonies whose DNA gives positive reflections on radio autographs as a result of hybridization are selected and used to determine the chromosome localization of the restriction fragments of human DNA cloned in them directly in cytological preparations of chromosomes in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при 37^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в отношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в 4 опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.For this, chromosome preparations are prepared from dividing cells in a culture of peripheral blood lymphocytes according to a known method. Blood lymphocytes stimulated by division with phytohemagglutinin (Difco, USA) are cultured in penicillin vials at 37 ^° C in Eagle’s medium with addition of up to 20% bovine serum for 72 hours. Colchicine is introduced 1.5 hours before the end of cultivation concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at 37 ^° C. Fixation was carried out with methanol-vinegar fixative (3: 1 ratio) three times for 20 min. Chromosome preparations are stored at 37 ^o C and used in 4 experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20 40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25•10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic label using a known substitution method: 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ; 0, 05 M dithiothreitol), 5 μl non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0.01 mmol each except thymidine triphosphate), 5 μl DNAse-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl ³ H-thymidine triphosphate (specific activity 114 Ci / mol, concentration 5 mCi / ml, 10 μl DNA polymerase-1 (concentration 2 u / μl). the reaction mixture is 150 μl, the Reaction is carried out 20 40 min at 20 ^o C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 • 10 ⁶ pulses per minute per 1 μg of DNA.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-6 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96% спирте; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2•SSC), в течение 10 мин при 100^oC в течение 17 18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2•SSC при комнатной температуре, в 70 и 96% -ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10 - 15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 x или 1125 x.Hybridization of radiolabeled precursors of recombinant DNA alpha R1-6 with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: metaphase chromosome preparations are denatured for 30 s in 0.07 N NaOH followed by washing for 10 minutes in 70 and 96% alcohol; preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline (2 • SSC) for 10 minutes at 100 ^o C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 • SSC at room temperature, in 70 and 96% ethanol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer, the preparations are thoroughly washed for 2 minutes with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of 1000 x or 1125 x.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-6 локализован в прицентромерных районах 13-й и 21-й пар гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом. In situ hybridization on human metaphase chromosomes shows that the cloned alpha R1-6 fragment is located in the pericentromeric regions of the 13th and 21st pairs of homologous human chromosomes and is thus a specific molecular marker of these chromosome pairs.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды альфа R1-6 для идентификации хромосом 13 и 21 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами. Methods of using the obtained recombinant plasmid alpha R1-6 to identify chromosomes of 13 and 21 in metaphase and interphase cells in order to conduct molecular cytogenetic diagnostics are illustrated by the following examples.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0 4^oC. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (pH 8,0) 5 мМ MgCl, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05% Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450g, 10 мин).Example 1. Whole heparinized blood of a healthy donor is diluted with 0.015 M NaCl in a volume ratio of 1: 3. To precipitate red blood cells, diluted blood is mixed with 6% dextran sulfate 500 in a ratio of 5: 1; the mixture is left to stand for 30 minutes at room temperature; all subsequent procedures are carried out at 0 4 ^o C. Leukocytes from the supernatant are precipitated by centrifugation at 450g for 20 min and washed three times by centrifugation in 0.15 M NaCl (450 g, 10 min). The washed cells are resuspended in STM buffer containing 0.5 M sucrose, 50 mM Tris HCl (pH 8.0) 5 mM MgCl, 0.02 mM EDTA with X-100 Triton at a final concentration of 0.05%. The nuclear fraction is washed by centrifugation three times. in the same buffer without newt X-100 (450g, 10 min).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50мМ трис HCl, pH 8,0; 5мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1% Лизат инкубируют при 65^oC не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ HBO и 5 мМ EDTA (pH 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6 8 ч.Nuclei are resuspended in TE buffer (50 mM Tris HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA) based on: 100 ml of buffer per 1 ml of nuclear sediment and lysed by adding sarcosyl to a concentration of 1%. Lysate is incubated at 65 ^° C for at least 1 h until completely enlightened. and centrifuged for 60 minutes at 2000 rpm to remove solids. The supernatant is transferred to a cylinder, covered by an XM-300 ultrafilter ("Amicon") from below. An equal volume of TE buffer + 1% sarcosyl is layered onto the supernatant. The fluid in the cylinder is separated from the anode chamber by a dialysis membrane. The lower edge of the filter cylinder is lowered into the cathode chamber; both electrode chambers are filled with buffer containing 89 mM Tris HCl, 89 mM HBO and 5 mM EDTA (pH 8.3). Electrofiltration of the solution is carried out at 5 mm / cm ² for 6 to 8 hours

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ. After electrophoretic deposition of DNA on the filter, the liquid is removed from the cylinder, and the gel-like layer of DNA is dissolved in the desired volume of 0.1 M TE.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека E. Coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пентона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37^oC на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HC1 (pH 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона X-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10 15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65^oC. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при 65^oC проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18^oC, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 x SSC (1 x SSC 18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81^oC в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1М KCl + 20 мМ трис-HCl pH 7,1 при 0^oC. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают 50%-ным изопропиловым или 70%-ным этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.For preparative isolation of plasmid DNA with a human DNA insert, E. Coli carrying the plasmid is grown in 100 ml of LB medium (10 g / l penton, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl) with the necessary antibiotics (100 μg / ml of ampicillin) at 37 ^° C on a shaker for 12 hours. Cells are pelleted by centrifugation (5000 rpm, 10 min) and resuspended in 10 ml of a solution of 50 mM glucose, 50 Tris-HC1 (pH 8.0), 50 mM EDTA and 5% Triton X-100. Freshly prepared lysozyme solution up to 5 mg / ml is added to the suspension and left at room temperature for 10 15 minutes. Then, the sample volume was adjusted to 50 ml with lysozyme-free buffer and placed overnight in a thermostat at 65 ^o C. The DNA-membrane complex and denatured cell proteins were precipitated by centrifugation at 12000 rpm for 10 min. 100 μg / ml RNAse A is added to the supernatant and, after 2 hours of incubation at 65 ^° C, phenolic and then chloroform deproteinization is carried out. DNA from the solution is precipitated with an equal volume of isopropyl alcohol (-18 ^o C, 20 min), the precipitate is dissolved in TE. The DNA solution was dialyzed on Sephadex G-50 against 0.1 x SSC (1 x SSC 18 g / L sodium chloride and 4.8 g / L sodium citrate). This solution was heated at 81 ^° C for 10 minutes and quickly cooled by adding a volume of 1 M KCl + 20 mM Tris-HCl pH 7.1 at 0 ^° C. The resulting mixture was passed through a Nitro-Cell-S (Serva) nitrocellulose column 1 mg DNA per 10 cm ³ column volume. Fractions containing circular forms of plasmid DNA are combined; DNA is precipitated from them with an equal volume of isopropyl alcohol; the precipitate is washed with 50% isopropyl or 70% ethyl alcohol, dried under vacuum and dissolved in TE buffer to the desired concentration.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (pH 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при 0^oC. К пробе добавляют 2 мл раствора 0,2 н. NaOH с 1% SDS и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и осаждают на 1 ч при 0^oC. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18^oC, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.DNA of recombinant plasmids for screening bacterial clones was isolated from 5 ml of overnight culture, precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 10 min, the pellet was resuspended in 1 ml of 25 mM Tris-HCl (pH 8.0); 20 mM EDTA, 50 mM glucose and 2 mg / ml lysozyme, followed by incubation for 30 minutes at 0 ^° C. To the sample, add 2 ml of a 0.2 N solution. NaOH with 1% SDS and after thorough mixing continue incubation for 5 minutes 1.5 ml of 3 M sodium acetate was added to the lysate, the solution was gently mixed and precipitated for 1 h at 0 ^° C. The resulting precipitate was removed by centrifugation (1200 rpm), nucleic acids were precipitated from the supernatant with 2.5 volumes of ethyl alcohol (-18 ^o C, 30 min). The precipitate was dissolved in 1 ml of 50 mm Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1 M sodium acetate and reprecipitated with ethanol. The reprecipitation procedure is repeated twice, the final precipitate after drying is dissolved in 100 μl of TE.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мм MgCl, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5 8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37^oC. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70^oC в течение 10 мин или добавлением 1/4 объема смеси 0,1%-ного раствора SDS, 25% -ного раствора сахарозы, 5 мМ ацетат натрия и 0,05%-ного раствора бромфенолового синего.Endonuclease treatment of human DNA and bacterial plasmids is carried out in a buffer containing 10 mm Tris-HCl (pH 7.4), 10 mm MgCl, 10 mm NaCl and 1 mm dithiothreitol (DTT). Complete endonuclease hydrolysis of DNA is obtained at a relative concentration of restriction enzymes of 5 8 units / μg of DNA after the reaction for 2 hours at 37 ^° C. The reaction is stopped by heating the sample at 70 ^° C for 10 minutes or by adding 1/4 of the mixture 0.1% SDS solution, 25% sucrose solution, 5 mM sodium acetate and 0.05% bromophenol blue solution.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pBR 325, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. To obtain the genomic clonotope of human DNA, the bacterial plasmid pBR 325 carrying the ampicillin resistance gene is used as a vector. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells to be selected on the medium with this antibiotic.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E.coli HB 101, выращивают на качалке при 37^oC до мутности А 0,4 0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10 15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0^oC раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20 30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0^oC по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80^oC, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4 5 месяцев.A competent bacterial culture for transformation is prepared as follows: in 25 ml of LB culture medium, 1 ml of fresh night-time culture of E. coli HB 101 is inoculated, grown on a rocking chair at 37 ^° C to a turbidity of A 0.4 0.5. Cell division is stopped by placing the culture on ice for 10 15 minutes, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes in the cold. The pellet is washed with an equal volume of a solution of 100 mM CaCl ₂ cooled to 0 ^° C, the cells are pelleted and resuspended with 12 ml of 100 mM CaCl ₂ . The cell suspension is kept in the cold for 20-30 minutes, centrifuged, and the pellet is resuspended in 2.5 ml of 0.1 M CaCl ₂ with 15% glycerol. After incubation of the resulting suspension at 0 ^° C. for at least 30 minutes, the culture can be transformed. It is stored in small portions at -80 ^o C, while its competence is maintained for 4 to 5 months.

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0^oC добавляют 0,1 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45 60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42^oC) на 60 90 с и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2 3 ч при 37^oC. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) и добавляют необходимые антибиотики, обусловливающие селекцию трансформированных клонов.To 200 μl of a competent bacterial culture at 0 ^° C., 0.1 0.2 μg of ligated DNA was added and incubated at this temperature for 45-60 minutes. The mixture was then transferred to a water bath (42 ^° C.) for 60 to 90 seconds and placed on ice. Nutrient LB broth is added to the transformed culture and it is grown on a rocking chair for 2 3 hours at 37 ^° C. Transformants are seeded on solid medium with 1.5% agar (0.1 ml of culture per Petri dish) and the necessary antibiotics are added to condition the selection of the transformed clones.

30 мкл раствора, содержащего 0,1 0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70^oC 10 мин, после чего к раствору добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (pH 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20 - 40 мкКи одного из ³²P-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед. ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при 37^oC. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2 5•10⁸ имп./мин/мкг ДНК.30 μl of a solution containing 0.1 0.2 μg of plasmid DNA or 0.1 μg of a preparatively isolated fragment from the gel and 1 μl of DNase-1 in 0.015 M NaCl, 5 mM CaCl ₂ , incubated for 10 min at room temperature, DNA -azu-1 is inactivated at 70 ^° C. for 10 minutes, after which a buffer solution of 0.4 M Tris-HCl (pH 7.4) is added to the solution; 50 mM MgCl ₂ , 25 mM DTT (up to 1/5 of the final volume), 1 nmol of each of the unlabeled DNA precursors, 20 - 40 μCi of one of the ³² P-deoxynucleoside triphosphates with a specific activity of 110 TB / mmol (3000 Ci / mmol) ( Amersham) and 1 unit. DNA polymerase-1. The volume of the reaction mixture, as a rule, is 100 μl, the reaction is carried out for 1 h at 37 ^o C. The radioactivity of the acid-insoluble fraction of DNA is measured on a LRB 1215 counter according to a special program. The average specific activity of labeled preparations is 2 5 • 10 ⁸ pulse / min / μg of DNA.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при 37^oC. Выросшие колонки вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5 10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой, его дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (pH 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (pH 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 x SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 37^oC. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при 80^oC в течение 1 2 ч.To identify human DNA inserts in hybrid clones, bacterial colonies previously tested as recombinant in phenotype are replicated on nitrocellulose filters (Millipore, HAWP) located directly on the surface of a solid nutrient medium in Petri dishes and grown for 37 days at 37 ^o C. The grown columns together with the filter are transferred to the surface of a solution of 0.5 M NaOH and left for 5 10 minutes. After drying the filter on the underside with filter paper, it is treated twice with 10 M solution of 1 M Tris-HCl (pH 7.5) and then 1.5 M NaCl with 1 M Tris HCl (pH 7.5). The air-dried filter is placed in a solution of 2 x SSC with proteinase K at a concentration of 50 μg / ml and incubated in it for 30 minutes at 37 ^o C. Then, the dried filter is washed in 0.3 M NaCl and then dried under vacuum at 80 ^o C within 1 2 hours

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68^oC в растворе 2 x SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60 90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промывают фильтровальной бумагой и помещают в 4
5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6 x SSC; 0,1% SDS; 10 декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²P-меченой ДНК с суммарной активностью 1 5 x 10⁶ имп./мин. Гибридизацию проводят при 68^oC в течение 18 24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 x SSC с 0,5% SDS при 68^oC в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2 24 ч экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.Before hybridization, the filter is soaked at 68 ^° C. in a solution of 2 x SSC, 0.5% SDS, 0.1% ficol-400 and 0.1% polyvinylpyrrolidone-350 for 60 to 90 minutes. Following this, the filter is washed dry with filter paper and placed in 4
5 ml of a hybridization mixture containing 6 x SSC; 0.1% SDS; 10 dextransulfate-500, 50 μg / ml poly (A) and a denatured sample of ³² P-labeled DNA with a total activity of 1 5 x 10 ⁶ cpm. Hybridization is carried out at 68 ^o C for 18 24 hours. The filters are washed in several changes of a solution of 0.5 x SSC with 0.5% SDS at 68 ^o C for several hours. The washed filters are finally dried and placed in a cassette with x-ray film PM-1. After 2 to 24 hours, the exposure is shown autographically and hybrid clones are identified by the presence of positive signals (round blackened areas).

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой EcoR 1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR 1 и идентификации полосы AR1 (340 н.п.). В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно легко на нескольких колониях, одна из которых получила название альфа R1-6. The described method put the experiment on three filter-replicas with a clone collection EcoR 1 fragments of human DNA. In this case, as a probe for hybridization with colonies on the filters, a sample of human alphaoid DNA is taken, which was isolated preparatively from an agarose gel after electrophoretic separation of the hydrolyzate of human genomic DNA with endonuclease EcoR 1 and identification of the AR1 band (340 n.p.). An isotopic label is introduced into the indicated DNA sample by the substitution method described previously. After hybridization in the colonies, a positive signal is found especially easily in several colonies, one of which is called alpha R1-6.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина (фирма "Difco", США) в пенициллиновых флаконах при 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при 13^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.Chromosome preparations are prepared in a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated by division using phytohemagglutinin (Difco, USA) in penicillin vials at 37 ^o C in Eagle's medium with the addition of up to 20% bovine serum for 74 hours. One hour before the end of cultivation colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate is resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at 13 ^o C. Fixation is carried out with methanol-acetic fixative (in the ratio 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at 37 ^o C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 M MgCl₂); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением H³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20 40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 • 10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic label by the substitution method: 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ) is sequentially dissolved in 100 μl of deionized water; 0.05 M dithiothreitol, 5 μl of non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0.1 mm each except for H ³ -thymidine triphosphate), 5 μl of DNase-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl of ³ H-thymidine triphosphate ( specific activity 114 Ci / mol, concentration 5 mCi / ml), μl DNA polymerase 1 (concentration 2 u / μl). The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at 20 ^o C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 • 10 ⁶ pulses per minute per 1 μg of DNA.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК альфа R1-6 с метафазными хромосомами in situ проводят в предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 x SSC), в течение 10 мин при 100^oC. Гибридизацию проводят при 37^oC в течение 17 18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 x SSC при 37^oC, в двух сменах 2 x SSC при комнатной температуре, в 70 96%-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловом проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10 15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000^x или 1125^x.Hybridization of radiolabeled precursors of recombinant DNA alpha R1-6 with metaphase chromosomes in situ is carried out in preliminary denaturation for 30 s in 0.07 N. NaOH followed by washing for 10 minutes in 70 and 96% ethanol. Preparations of radioactive DNA samples were denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline (2 x SSC) for 10 min at 100 ^o C. Hybridization was carried out at 37 ^o C for 17 18 hours After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 x SSC at 37 ^° C, in two shifts of 2 x SSC at room temperature, in 70 96% ethanol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with standard amidol developer for 2 minutes, the preparations are thoroughly washed with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10 15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of 1000 ^x or 1125 ^x .

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент альфа R1-6 локализуется только в прицентромерных районах 13-й и 21-й гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы. In situ hybridization on human metaphase chromosomes shows that the cloned alpha R1-6 fragment is localized only in the pericentromeric regions of the 13th and 21st homologous human chromosomes and is thus a specific molecular marker of these chromosome pairs that specifically mark pericentromeric regions.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 13-й и 21-й хромосомы в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов данных пар) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размерах 13-й и 21-й хромосом и их форме. Example 2. Particularly important is the use of the proposed molecular marker for recognition of the 13th and 21st chromosomes in those cases when these chromosomes (one of the homologues of these pairs) are affected by rearrangement, i.e. has the loss or addition of any part of the chromosome material, which affects the sizes of the 13th and 21st chromosomes and their shape.

Все процедуры по выделению образца ДНК альфа R1-6 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора носителя сбалансированной транслокации (переноса) более 3/4 длинного плеча 13-й хромосомы на конец длинного плеча 2-й хромосомы. В результате такой транслокации длинное плечо 13-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика данного нарушения (потери хромосомного материала) практически невозможна. Однако с помощью молекулярного маркера альфа R1-6 для 13-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным длинным плечом в этой паре и потеря хромосомного материала в нем легко распознаются непосредственно под микроскопом. All procedures for the isolation of an alpha R1-6 DNA sample and its processing with an isotopic tag for in situ hybridization on metaphase chromosomes, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosome preparations and hybridization on chromosomes, are repeated as in Example 1. The only difference is that Example 1 uses preparations of a normal chromosome set from a healthy male donor, while example 2 uses preparations of a chromosome set of a carrier of balanced translocation (transfer) for more than 3/4 long on the shoulder of the 13th chromosome at the end of the long arm of chromosome 2. As a result of such translocation, the long arm of the 13th chromosome is significantly shortened, and with a normal visual examination of the metaphase plate with this restructuring under a microscope, the diagnosis of this disorder (loss of chromosome material) is practically impossible. However, using the molecular marker alpha R1-6 for the 13th chromosome, a homologous partner with a shortened long arm in this pair and the loss of chromosome material in it are easily recognized directly under the microscope.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера альфа R1-6 для 23-й и 21-й хромосом является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая X-хромосома, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца полого хроматина, образованного одной из двух X-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью маркера альфа R1-6, специфически маркирующего только 13-е и 21-е хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК альфа R1-6 гибридизуется с ДНК прицентромерной области 13-й и 21-й хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и приготовления радиоавтографов) четыре практически одинаковых по размеру скопления /кластеров/ зерен серебра (сигналов изотопной метки). В редких случаях можно видеть в интерфазном ядре три или два крупных скопления зерен метки, если гомологичные хромосомы расположены очень близко друг от друга. Example 3. An important illustration of the practical application of the molecular marker alpha R1-6 for the 23rd and 21st chromosomes is the experience of identifying the presence of this chromosome in the cell nucleus directly from the picture of interphase (non-fissionable) nuclei. As you know, human chromosomes are analyzed only in the metaphase of mitosis after special treatments that facilitate the calculation and analysis of the morphology of chromosomes. The exception is the sex X chromosome, the presence of which in normal women can be determined by definition in the interphase nucleus of a compact body of hollow chromatin formed by one of the two X chromosomes in the female set, as well as the sex Y chromosome, which is defined as a brightly fluorescent body, stained with acrychine mustard gas, in the interphase nucleus of men with a normal chromosome set. However, using the alpha marker R1-6, which specifically marks only the 13th and 21st human chromosomes, the presence of these chromosomes in the cell nucleus can be established without preparation of metaphase chromosome preparations, but only by analyzing the image of interphase nuclei. This is because the alpha R1-6 DNA sample hybridizes with the DNA of the pericentromeric region of the 13th and 21st chromosomes even when these chromosomes are in an untwisted state at the interphase stage. In this case, in each interphase nucleus, one can see (after hybridization and preparation of radio autographs) four almost identical in size clusters / clusters / grains of silver (isotope label signals). In rare cases, three or two large clusters of label grains can be seen in the interphase nucleus if homologous chromosomes are located very close to each other.

Все процедуры по выделению образца альфа R1-6 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в примерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются четыре скопления гранул метки /четыре кластера/, соответствующих гомологичным хромосомам 13-й и 21-й пар. В разных ядрах расстояния между кластерами различны. Таким образом, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека. All procedures for the isolation of a sample of alpha R1-6 and its processing with an isotopic label for hybridization on interphase nuclei, as well as all procedures for the preparation of metaphase peripheral blood chromosomes and hybridization on chromosomes are repeated similarly to the same procedures described in examples 1 and 2. In each interphase nucleus, four clusters of label granules / four clusters / corresponding to homologous chromosomes of the 13th and 21st pairs are found. In different nuclei, the distances between the clusters are different. Thus, a real opportunity arises directly in interphase nuclei to analyze the location of homologous partners of specific pairs of chromosomes in human cells, which is of great scientific interest from the point of view of the functional organization of human hereditary structures.

Таким образом, клонированная последовательность ДНК альфа R1-6 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 13-й и 21-й хромосом человека как в стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосомных наборов или в случаях с перестройками 13-й и 21-й хромосом, так и в цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 13-й и 21-й хромосом человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосомам 13 и 21 при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека. Thus, the cloned DNA sequence alpha R1-6 from the human genome is an effective tool for recognition of the 13th and 21st chromosomes of a person as in standard (after cell cultivation) preparations of normal chromosome sets or in cases with rearrangements of the 13th and 21th chromosomes, and in cytological (without cell cultivation) preparations of interphase nuclei. These possibilities expand the scope of chromosomal analysis in the practice of clinical genetics, genetic counseling and prenatal diagnosis in cases of rearrangements of the 13th and 21st chromosomes of a person, as well as in the analysis of aneuploidy on chromosomes 13 and 21 in various forms of cancer. Perhaps the effective application of the proposed method in the analysis of hybrid cell lines that are widely used for cytogenetic mapping of normal and mutant human genes.

Claims (1)

Рекомбинантная плазмидная ДНК альфа R 1 6, предназначенная для маркирования 13-й и 21-й хромосом человека, содержащая: -EcoRI EcoRI - фрагмент ДНК вектора рВР 325 размером 6100 п.о. EcoRI EcoRI фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерных районов 13-й и 21-й хромосом человека, размером 680 п.о. с двумя внутренними уникальными сайтами рестрикции Psti; генетические маркеры: Amp^r ген устойчивости к ампициллину.Recombinant plasmid DNA alpha R 1 6, designed for labeling the 13th and 21st chromosomes of humans, containing: -EcoRI EcoRI - DNA fragment of the vector pBP 325 size of 6100 bp EcoRI EcoRI fragment of alpha lymphoid DNA of human lymphocytes, highly specific for centromeric regions of the 13th and 21st chromosomes of humans, size 680 bp with two internal unique Psti restriction sites; genetic markers: Amp ^r ampicillin resistance gene.