RU2325441C1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pYAII-39, USED FOR 4TH AND 9TH HUMAN CHROMOSOME MARKING IN METAPHASIC AND INTERPHASIC CELLS - Google Patents

Abstract

FIELD: organic chemistry, genetics.

SUBSTANCE: invention refers to genetic engineering. Recombinant plasmid DNA pYAll-39 contains: - Pstl-Pstl-DNA vector fragment pUC19 sized 2700 nucleotide pairs, - Pstl- Pstl - alphoid DNA fragment of human lymphocytes high-specific for centromeric areas of 4^th and 9^th human chromosomes sized 680 nucleotide pairs. The latter is produced from Pstl restriction fragments of alphoid DNA total fraction as chromosomes hybridization in situ under special conditions of high stiffness with standard saline solution with 55% phormamide. Genetic marker is -Ampr - gen of ampicillin-resistance. Invention enables to reliably identify 4^th and 9^th human chromosomes in norm and pathology, including preimplantation, prenatal and postnatal diagnostics of chromosome anomaly including aneuploidy at various cancer types, as well as for cytogenetic human genome mapping.

EFFECT: identification of 4^th and 9^th human chromosomes in norm and pathology.

1 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации 4-й и 9-й хромосом человека в норме и патологии, включая преимплантационную, пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, в том числе анеуплоидии при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.The invention relates to the field of genetic engineering, in particular to the field of construction of molecular genetic markers, and can be used in medical genetics for reliable identification of the 4th and 9th human chromosomes in normal and pathological conditions, including preimplantation, prenatal and postnatal diagnosis of chromosomal abnormalities , including aneuploidy in various forms of cancer, as well as for cytogenetic mapping of the human genome.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом 1, 3, 6, 11, 13, 18, 21 и Х человека (Гиндилис и др., 1985, №1203108; Юров и др., 1989, №1494724; Юров и др., 1993, №1792429; Юров и др., 1997, №2087533; Соловьев и др., 1997, №2087534, Юров и др., 2000, №2161199; Юров и др., 2005, №2265060). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа предлагаемой в данном изобретении рекомбинантной плазмиды. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые имеются в хромосомах 4 и 9 (Alexandrov et al., 1988; Product catalogue 2001-2002 "Innovative probe technology", Cytocell Limited, Oxfordshire, OX17 3SN, UK). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосом 4 и 9 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосом 4 и 9, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерных районов данных хромосом. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосом 4 и 9. Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркеров для центромерного района хромосом 4 и 9 человека, которые позволили бы проводить идентификацию центромерных районов в интерфазных и метафазных клетках.It is known that, to date, DNA probes for various human chromosomes have been cloned and characterized. However, unique (single-copy or small-copy DNA sequences) are most often used as DNA probes, which do not allow efficient molecular-cytogenetic diagnostics due to the low resolution of modern cytogenetic methods. An exception is chromosome-specific DNA probes containing repeating (multi-copy) DNA sequences. These include satellite (alpha and classical satellites) DNA, which are repeatedly repeated from several hundred to several thousand times relatively short (up to 170 nucleotide pairs) DNA fragments that form the centromeric regions of all human chromosomes. Based on them, alphoid DNA probes with specificity for chromosomes 1, 3, 6, 11, 13, 18, 21 and X of a person were created and protected by copyright certificates of DNA (Gindilis et al., 1985, No. 1203108; Yurov et al., 1989, No. 1494724; Yurov et al., 1993, No. 1792429; Yurov et al., 1997, No. 2087533; Soloviev et al., 1997, No. 2087534, Yurov et al., 2000, No. 2161199; Yurov et al., 2005, No. 2265060). The task of obtaining highly efficient DNA probes for labeling the remaining human chromosomes remains relevant. Currently, a number of cloned alpha satellite and classical satellite DNAs are described, which are characterized by specificity for different human chromosomes. These sequences can be considered as a prototype of the recombinant plasmid of the invention. However, the possibility of their use for marking and identification of human chromosomes remains open. In particular, variants of human alpha-DNA were found that are found on chromosomes 4 and 9 (Alexandrov et al., 1988; Product catalog 2001-2002 "Innovative probe technology", Cytocell Limited, Oxfordshire, OX17 3SN, UK). These DNA probes have not been studied in sufficient detail from the point of view of their construction for labeling chromosomes 4 and 9 of the person in applied works. Moreover, all recombinant plasmids described in the literature that contain human alpha-satellite DNA with specificity for chromosomes 4 and 9 do not possess sufficiently high specificity for the centromeric regions of these chromosomes. Therefore, they cannot be used for effective molecular cytogenetic diagnostics in medical practice, when correct identification of chromosome abnormalities and subsequent medical genetic counseling or prenatal diagnostics with possible termination of pregnancy due to aberrations of chromosomes 4 and 9 is required. The construction of markers for molecular cytogenetic diagnostics remains relevant centromeric region of chromosomes 4 and 9 of the person, which would allow identification of centromeric regions in nterfaznyh and metaphase cells.

Данная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерных районов хромосом 4 и 9 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида pYA11-39 отличается от известных по литературе клонированных альфа-сателлитных ДНК по совокупности признаков: способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосом 4 и 9 человека. Предлагаемое техническое решение не имеет вышеперечисленных общих признаков ни с одним из приведенных аналогов, т.к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерных районов хромосом 4 и 9 человека данное техническое решение разработано впервые.This recombinant plasmid was developed for the first time for highly specific labeling of centromeric regions of chromosomes 4 and 9 of humans. The obtained recombinant plasmid pYA11-39 differs from the cloned alpha-satellite DNAs known in the literature in terms of the combination of features: the production method, the restriction map and the size of the insert of human alphaoid DNA, the peculiarities of chromosome localization, and high specificity for human chromosomes 4 and 9. The proposed technical solution does not have the above common features with any of the above analogues, because for molecular cytogenetic labeling and identification of centromeric regions of chromosomes 4 and 9 of humans, this technical solution was developed for the first time.

Целью изобретения является создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 4-й и 9-й хромосом человека, а именно специфичного для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, который в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид обладал следующими преимуществами:The aim of the invention is the creation of a new effective molecular genetic marker of the 4th and 9th chromosomes of a person, namely, specific for centromeric regions, including heterochromatin of both arms, which, in contrast to the recombinant plasmids described in the literature, had the following advantages:

1. Строго маркировал околоцентромерные районы хромосом 4 и 9 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами;1. Strictly marked near-centromeric regions of chromosomes 4 and 9 without cross hybridization with other chromosomes;

2. Эффективно маркировал центромерные районы хромосом 4 и 9 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.2. Effectively labeled the centromeric regions of chromosomes 4 and 9 in interphase nuclei to identify numerical chromosome aberrations, which is necessary for karyological analysis of non-dividing cells, such as tumor cells.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pUC19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst1-сайтам фрагмент ДНК человека pYA11-39 размером 680 пар нуклеотидов, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 4-й и 9-й хромосом человека. Данный фрагмент имеет длину 680 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зонда, опытов по блотгибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.The essence of the invention lies in the fact that the cloned in plasmid pUC19 (2700 nucleotide pairs) at Pst1 sites a fragment of human DNA pYA11-39 with a size of 680 nucleotides, which is a sequence of human alphaoid DNA, is used as a specific molecular marker of the 4th and 9th human chromosomes. This fragment has a length of 680 nucleotides and belongs to the class of alpha-DNA, which was proved by conducting restriction mapping of the probe DNA, experiments on blot hybridization and hybridization on chromosomes in situ.

Новый ДНК зонд содержит альфоидную ДНК, ограниченную Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента, и отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар нуклеотидов. Кроме того, этот ДНК зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 2, 8, 18 и 20. В специальных условиях повышенной жесткости с использованием стандартного солевого раствора с 55% раствором формамида, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизируется только с центромерными районами хромосом 4 и 9 человека.The new DNA probe contains alpha-DNA limited by Pst1 sites from different ends of the genomic fragment, and differs from the known human genomic DNA fragment with a size of 680 nucleotides. In addition, this DNA probe is distinguished by minor in situ hybridization sites on human chromosomes, which include chromosomes 2, 8, 18 and 20. Under special conditions of increased stringency using standard saline solution with 55% formamide solution described in the examples and method use, this DNA probe hybridizes only with the centromere regions of chromosomes 4 and 9 of the person.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерного фрагмента pYA11-39 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pst1 до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в Pst1-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.The specific goal of the study was achieved as follows. The source of isolation of the marker fragment pYA11-39 is human lymphocyte DNA purified by electrostatic filtration on an Amicon XM-300 ultrafiltration membrane. The preparation of purified human lymphocytic DNA (obtained from a male individual) is treated with restriction enzyme Pst1 until complete hydrolysis. The obtained restriction fragments are “sewn” by ligation at the “sticky” ends to the Pst1 site of the bacterial plasmid vector pUC19 (2700 nucleotides). This plasmid carries the ampicillin resistance gene. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells to be selected on the medium with this antibiotic. Thus, this vector allows the creation of a recombinant clonoteca (of the "short-gun" type) for automatic selection on a medium with ampicillin.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфоидной ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²Р) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена в основном альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дают позитивные рефлексы на радиоавтографах, в результате гибридизации отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.At the next stage, clones possessing homology with alpha-DNA are identified in the created clone library. For this, recombinant clones on nitrocellulose filters are introduced into a hybridization reaction with radioactive phosphorus-labeled ( ³² P) DNA of the total fraction of human ARI-DNA, which is mainly represented by alpha-DNA. Colonies whose DNA gives positive reflexes on radio autographs, as a result of hybridization, are selected and used to determine the chromosome localization of the restriction fragments of human DNA cloned in them directly in cytological preparations of chromosomes in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 часов. За 1,5 часа до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3:1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.For this, chromosome preparations are prepared from dividing cells in a culture of peripheral blood lymphocytes according to a known method. Blood lymphocytes stimulated by division with phytohemagglutinin (Difco, USA) are cultured in penicillin vials at a temperature of 37 ° C in Eagle's medium with the addition of up to 20% bovine serum for 72 hours. 1.5 hours before the end of cultivation, colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37 ° C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative in a ratio of 3: 1 three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37 ° C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 M дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 при концентрации 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10 импульсов в мин в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic tag by a known substitution method; 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ; 0.05 M dithiothreitol), 5 μl of non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0 each) are successively dissolved in 100 μl of deionized water , 01 mmol of each with the exception of thymidine triphosphate), 5 μl of DNAase-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl of ³ H-thymidine triphosphate (specific activity 114 Ci / mol, concentration of 5 mCi / ml, 10 μl of DNA polymerase 1 at a concentration of 2 u / μl). The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20 ° C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 × 10 pulses per minute per 1 μg of DNA.

Клонированные фрагменты альфоидной ДНК были картированы на хромосомах человека in situ с использованием стандартных условий гибридизации в растворе, содержащем стандартный солевой раствор (2×SSC), 50% формамид, 10% декстрансульфат-500. Все клоны гибридизировались с центромерными районами всех хромосом человека без видимой специфики для индивидуальных хромосом. Однако применение специальных условий гибридизации, повышенной жесткости гибридизации за счет повышения концентрации формамида в растворе до 55% позволило выявить рекомбинантную ДНК pYA11-39, которая принципиально отличается по хромосомной специфичности от остальных альфоидных ДНК.Cloned alphaoid DNA fragments were mapped to human in situ chromosomes using standard hybridization conditions in a solution containing standard saline (2 × SSC), 50% formamide, 10% dextransulfate-500. All clones hybridized with the centromere regions of all human chromosomes without apparent specificity for individual chromosomes. However, the use of special hybridization conditions, increased stringency of hybridization due to an increase in the concentration of formamide in solution up to 55% made it possible to identify recombinant DNA pYA11-39, which is fundamentally different in chromosome specificity from other alpha-DNAs.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 секунд в 0,07N NaOH с последующей промывкой по 10 минут в растворах 70° и 96,6° спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% раствор декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимзы в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.Hybridization of pYA11-39 recombinant DNA labeled with radioactive precursors with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: metaphase chromosome preparations are denatured for 30 seconds in 0.07 N NaOH followed by washing for 10 minutes in solutions of 70 ° and 96.6 ° alcohol; preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 55% formamide solution, 10% dextransulfate-500 solution and standard saline solution (2 × SSC) for 10 min at a temperature of 100 ° C. Hybridization is carried out at a temperature of 37 ° C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 × SSC at room temperature, in solutions of 70 ° and 96.6 ° ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer, the preparations are thoroughly washed for 2 minutes with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of × 1000 or × 1125.

Образцы рекомбинантной ДНК pYA11-39 для гибридизации на хромосомах in situ можно метить и нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), уже описанным выше методом замещения. Для этого готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанола, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50 mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.Samples of pYA11-39 recombinant DNA for in situ hybridization on chromosomes can also be labeled with non-radioactive fluorescent nucleotides, for example biotin-16-dUTP (biotin-16-deoxy-uridine triphosphate), already described by the substitution method. For this, a reaction mixture of the following composition is prepared: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.04 mM nucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP), 0.03 mM biotin -16-dUTP, 10U DNA polymerase 1 from E. coli, 5-10 μg of DNAase I and 2 μg of recombinant plasmid DNA. The volume of the reaction mixture is 50 μl. The reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 15 ° C. The reaction was stopped by the addition of EDTA (up to 50 mM), the labeled DNA of the recombinant plasmid was precipitated with ethanol, dried and dissolved in a hybridization mixture (55% formamide, 2 × SSC). Store in the dark at a temperature of -20 ° C.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х - 18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина, (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ и 0,1М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.Hybridization of pYA11-39 recombinant DNA labeled with fluorescent nucleotides with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: a labeled recombinant plasmid at a concentration of 10-20 ng in 10 μl of a hybridization mixture consisting of a 55% solution of formamide in 2 × SSC is placed on a cytological preparation containing fixed metaphase chromosomes or interphase nuclei, cover with a 22 × 22 mm coverslip and warm at 75 ° C for 5 min to simultaneously denature chromosome DNA and recombinant DNA; then hybridization is carried out at a temperature of 42 ° C for 4 to 18 hours in a humid chamber. After hybridization, the preparations are washed in a hybridization mixture (50% formamide, 2 × SSC) at a temperature of 42 ° C for 3 min and a solution of 2 × SSC at 42 ° C for 5 min and then rinsed with a buffer solution: 0, 1 M NaH ₂ PO ₄ and 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at room temperature (or at 37 ° C) for 1 min. Further, the preparations are incubated with avidin labeled with fluorescein (fluorescein isothiocyanate - a solution for contrasting staining) for 30 min at a temperature of 37 ° C in a humid chamber; at the same time, 20 μl of avidin, (concentration of 5 μg / ml) is applied to one preparation and covered with a plastic plate or Parafilm film. The preparations are washed three times for 5-15 minutes with a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ and 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at a temperature of 37 ° C.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4',6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.To stain the preparations, a photoprotective solution is applied to them: 2% 1,4-diazobicyclo- (2,2,2) octane (DABCO) in 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 (15-20 μl) 400 ng / ml DAPI fluorescent dye (4 ', 6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), propidium iodide at a concentration of 400 ng / ml and covered with a coverslip (22 × 22 mm) for microscopic observation.

При микроскопии используют обычный флюоресцентный микроскоп, оснащенный соответствующим набором светофильтров. Например, для одновременного анализа гибридизационных сигналов (зеленый цвет - FITC) и хромосом (красный цвет - йодистый пропидий) - фильтр 13, Leitz. Для хромосом и интерфазных ядер без гибридизационных сигналов - фильтр A, Leitz (DAPI - голубой цвет) или фильтр N 2.1, Leitz (йодистый пропидий - красный цвет).Microscopy uses a conventional fluorescence microscope equipped with an appropriate set of filters. For example, for the simultaneous analysis of hybridization signals (green color - FITC) and chromosomes (red color - propidium iodide) - filter 13, Leitz. For chromosomes and interphase nuclei without hybridization signals - filter A, Leitz (DAPI - blue) or filter N 2.1, Leitz (propidium iodide - red).

При необходимости усиления гибридизационных сигналов (используя цитологические препараты низкого качества - плохая фиксация и т.п.) проводят дополнительную обработку гибридизационных сигналов - иммунологическую амплификацию.If necessary, amplification of hybridization signals (using low-quality cytological preparations - poor fixation, etc.) is carried out additional processing of hybridization signals - immunological amplification.

Для этого препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 M Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20 в течение 5-15 мин; инкубируют с биотинилированными антителами к авидину (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл) 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С во влажной камере, накрывая пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Далее препараты промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37-45°С и повторно инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (20 мкл блокирующего раствора при концентрации 5 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатной температуре или 20 мин при температуре 37°С. Затем препараты опять промывают в буфере 0,1 М NaH₂PO₄, 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащем 0,1% Твин-20, три раза по 5-15 мин при комнатной температуре или при температуре 37-45°С и подготавливают для микроскопии. Процедуру амплификации слабого гибридизационного сигнала при необходимости можно проводить 2-3 раза.For this, the preparations are washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 for 5-15 minutes; incubated with biotinylated anti-avidin antibodies (20 μl blocking solution at a concentration of 5 μg / ml) for 30 min at room temperature or 20 min at 37 ° C in a humid chamber, covering with a plastic plate or Parafilm film. Next, the preparations are washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20, three times for 5-15 minutes at room temperature or at temperature 37-45 ° C and re-incubated with avidin labeled with fluorescein (20 μl of blocking solution at a concentration of 5 μg / ml) for 30 min at room temperature or 20 min at 37 ° C. Then the preparations are again washed in a buffer of 0.1 M NaH ₂ PO ₄ , 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20, three times for 5-15 minutes at room temperature or at a temperature of 37-45 ° C and prepared for microscopy. The amplification procedure of a weak hybridization signal, if necessary, can be carried out 2-3 times.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYA11-39 локализован в прицентромерных районах 4-й и 9-й пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данных пар хромосом.In situ hybridization on metaphase human chromosomes shows that the cloned fragment pYA11-39 is located in the pericentromeric regions of the 4th and 9th pairs of homologous human chromosomes and is thus a specific molecular marker of these chromosome pairs.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды pYA11-39 для идентификации хромосом 4 и 9 человека в метафазных и интерфазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.Methods of using the obtained recombinant plasmid pYA11-39 to identify human chromosomes 4 and 9 in metaphase and interphase cells for the purpose of molecular-cytogenetic diagnosis are illustrated by the following examples.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным раствором декстрансульфата-500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4°С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (рН 8,0), 5 мМ MgCl₂, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).Example 1. Whole heparinized blood of a healthy donor is diluted with 0.015 M NaCl in a volume ratio of 1: 3. To precipitate red blood cells, diluted blood is mixed with a 6% solution of dextransulfate-500 in a ratio of 5: 1; the mixture is left to stand for 30 minutes at room temperature; all subsequent procedures are carried out at a temperature of 0-4 ° C. Leukocytes from the supernatant are precipitated by centrifugation at 450g for 20 minutes and washed three times by centrifugation in 0.15 M NaCl (450g, 10 minutes). The washed cells are resuspended in STM buffer containing 0.5 M sucrose, 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl ₂ , 0.02 mM EDTA with Triton X-100 at a final concentration of 0.05%. The nuclear fraction was washed three times by centrifugation in the same buffer without X-100 newt (450 g, 10 min).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис HCl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65°С не менее 1 часа до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ+1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 часов.Nuclei are resuspended in TE buffer (50 mM Tris HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA) based on: 100 ml of buffer per 1 ml of nuclear sediment and lysed by adding sarcosyl to a concentration of 1%. The lysate is incubated at a temperature of 65 ° C for at least 1 hour until completely clear and centrifuged for 60 minutes at 2000 rpm to remove mechanical impurities. The supernatant is transferred to a cylinder, covered with an XM-300 ultrafilter (Amicon) from below. An equal volume of TE buffer + 1% sarcosyl is layered onto the supernatant. The fluid in the cylinder is separated from the anode chamber by a dialysis membrane. The lower edge of the filter cylinder is lowered into the cathode chamber; both electrode chambers are filled with buffer containing 89 mM Tris HCl, 89 mM HBO and 5 mM EDTA (pH 8.3). Electrofiltration of the solution is carried out at 5 mm / cm ² for 6-8 hours.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ.After electrophoretic deposition of DNA on the filter, the liquid is removed from the cylinder, and the gel-like layer of DNA is dissolved in the desired volume of 0.1 M TE.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека клетки E.coli, несущие плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37°С на качалке в течение 12 часов. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% раствор тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65°С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 часов инкубации при температуре 65°С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (температура - 18°С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1×SSC (1×SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81°С в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1 М KCl + 20 мМ трис-HCl рН 7,1 при температуре 0°С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50° изопропилового или 70° этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.For preparative isolation of plasmid DNA with an insert of human DNA, E. coli cells carrying the plasmid are grown in 100 ml of LB medium (10 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl) with the addition of necessary antibiotics (100 μg / ml ampicillin) at a temperature of 37 ° C on a rocking chair for 12 hours. Cells are pelleted by centrifugation (5000 rpm, 10 min) and resuspended in 10 ml of a solution of 50 mM glucose, 50 Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA and 5% Triton X-100. Freshly prepared lysozyme solution up to 5 mg / ml is added to the suspension and left at room temperature for 10-15 minutes. Then the sample volume is brought to 50 ml with a buffer without lysozyme and placed overnight in a thermostat at a temperature of 65 ° C. The DNA-membrane complex and denatured cell proteins are precipitated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. 100 μg / ml RNAse A is added to the supernatant and, after 2 hours of incubation at a temperature of 65 ° C, phenolic and then chloroform deproteinization is carried out. DNA from the solution is precipitated with an equal volume of isopropyl alcohol (temperature - 18 ° C, 20 min), the precipitate is dissolved in TE. The DNA solution was dialyzed on Sephadex G-50 against 0.1 × SSC (1 × SSC g / L sodium chloride and 4.8 g / L sodium citrate). This solution is heated at a temperature of 81 ° C for 10 min and quickly cooled by adding a volume of 1 M KCl + 20 mm Tris-HCl pH 7.1 at a temperature of 0 ° C. The resulting mixture was passed through a column of nitrocellulose Nitro-Cell-S (Serva) at the rate of 1 mg of DNA per 10 cm ³ column volume. Fractions containing circular forms of plasmid DNA are combined; DNA is precipitated from them with an equal volume of isopropyl alcohol; the precipitate is washed in solutions of 50 ° isopropyl or 70 ° ethanol, dried under vacuum and dissolved in TE buffer to the desired concentration.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 минут при температуре 0°С. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию в течение 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при температуре 0°С. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (температура - 18°С, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.DNA of recombinant plasmids for screening bacterial clones was isolated from 5 ml of overnight culture, precipitated by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, the pellet was resuspended in 1 ml of 25 mM Tris-HCl (pH 8.0); 20 mm EDTA, 50 mm glucose and 2 mg / ml lysozyme, followed by incubation for 30 minutes at 0 ° C. 2 ml of a 0.2N NaOH solution with 1% SDS was added to the cells to lyse the cells, and after thorough mixing, incubation was continued for 5 minutes. 1.5 ml of 3 M sodium acetate is added to the lysate, the solution is gently mixed and left for an hour at a temperature of 0 ° C. The precipitate formed is removed by centrifugation (1200 rpm), nucleic acids from the supernatant are precipitated with 2.5 volumes of ethyl alcohol (temperature - 18 ° C, 30 min). The precipitate was dissolved in 1 ml of 50 mm Tris-HCl (pH 8.0) + 0.1 M sodium acetate and reprecipitated with ethanol. The reprecipitation procedure is repeated twice, the final precipitate after drying is dissolved in 100 μl of TE.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 часов при температуре 37°С. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70°С в течение 10 мин.Endonuclease treatment of human DNA and bacterial plasmids is carried out in REB buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM NaCl and 1 mM dithiothreitol (DTT). Complete endonuclease DNA hydrolysis is obtained at a relative concentration of restriction enzymes of 5-8 u / μg of DNA after the reaction for 2 hours at 37 ° C. The reaction is stopped by heating the sample at a temperature of 70 ° C for 10 minutes

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека.To obtain a genomic clonotope of human DNA, the bacterial plasmid pUC19 carrying the ampicillin resistance gene is used as a vector. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells carrying plasmids with human DNA to be selected on the medium with this antibiotic.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры клеток E.coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37°С до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0°С раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл раствора 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М раствора CaCl₂ с 15%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при температуре 0°С по крайней мере в течение 30 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при температуре -80°С, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. В дальнейшем при использовании к 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0°С добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42°С) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 часа при температуре 37°С. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением ампициллина, обусловливающих селекцию трансформированных клонов.A competent bacterial culture for transformation is prepared as follows: in 25 ml of LB nutrient medium, 1 ml of fresh night culture of E. coli HB 101 cells is inoculated, grown on a shaker at a temperature of 37 ° C to a turbidity of A = 0.4-0.5. Cell division is stopped by placing the culture on ice for 10-15 minutes, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes in the cold. The precipitate is washed with an equal volume of a solution of 100 mM CaCl ₂ cooled to a temperature of 0 ° C, the cells are precipitated and resuspended in 12 ml of a solution of 100 mM CaCl ₂ . The cell suspension is kept in the cold for 20-30 minutes, centrifuged, and the pellet is resuspended in 2.5 ml of 0.1 M CaCl ₂ solution with 15% glycerol. After incubation of the resulting suspension at a temperature of 0 ° C for at least 30 minutes, the culture can be transformed. It is stored in small portions at a temperature of -80 ° C, while its competence is maintained for 4-5 months. Subsequently, when used, to 200 μl of a competent bacterial culture at a temperature of 0 ° C, 0.1-0.2 μg of ligated plasmid DNA is added and incubated at this temperature for 45-60 minutes. Then the mixture is transferred to a water bath (temperature 42 ° C) for 1-1.5 minutes and placed on ice. LB nutrient broth is added to the transformed culture and it is grown on a rocking chair for 2-3 hours at a temperature of 37 ° C. Transformants are plated on solid medium with 1.5% agar (0.1 ml culture per Petri dish) with the addition of ampicillin, causing selection of transformed clones.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl₂. инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70°С 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (рН 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²Р-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 часа при температуре 37°С. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5×10⁸ имп/мин/мкг ДНК.30 μl of a solution containing 0.1-0.2 μg of plasmid DNA or 0.1 μg of a fragment prepared from the gel and 1 μl of DNAase-1 in 0.015 M NaCl, 5 mM CaCl ₂ . incubated for 10 min at room temperature, DNA-aza-1 was inactivated at 70 ° C for 10 min, after which a buffer solution of 0.4 M Tris-HCl (pH 7.4) was added to the mixture; 50 mM MgCl ₂ , 25 mM DTT (up to 1/5 of the final volume), 1 nmole of each of the unlabeled DNA precursors, 20-40 μCi of one of the ³² P-deoxynucleoside triphosphates with a specific activity of 110 TB / mmol (3000 Ci / mmol) ( Amersham) and 1 unit of DNA polymerase-1. The volume of the reaction mixture, as a rule, is 100 μl, the reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 37 ° C. The radioactivity of the acid-insoluble fraction of DNA is measured on a LRB 1215 counter according to a special program. The average specific activity of labeled preparations is 2-5 × 10 ⁸ imp / min / μg of DNA.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37°С. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтровальной бумагой, дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (рН 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2×SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37°С. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80°С в течение 1-2 часов.To identify human DNA inserts in hybrid clones, bacterial colonies previously tested as recombinant in phenotype are replicated on nitrocellulose filters (Millipore, HAWP) located directly on the surface of a solid nutrient medium in Petri dishes and grown for 24 hours at 37 ° C. The grown colonies with the filter are transferred to the surface of a solution of 0.5 M NaOH and left for 5-10 minutes. After drying the filter on the underside with filter paper, it is treated twice with 10 M solution of 1 M Tris-HCl (pH 7.5), and then 1.5 M NaCl with 1 M Tris HCl (pH 7.5). Air-dried filter is placed in a solution of 2 × SSC with proteinase K at a concentration of 50 μg / ml and incubated in it for 30 min at a temperature of 37 ° C. Next, the dried filter is washed in 0.3 M NaCl, and then dried under vacuum at a temperature of 80 ° C for 1-2 hours.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68°С в растворе 2×SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон- 350 в течение 60-90 минут. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6×SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу ³²Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5×10⁶ имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68°С в течение 18-24 часов. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5×SSC с 0,5% SDS при температуре 68°С в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.Before hybridization, the filter is soaked at a temperature of 68 ° C in a solution of 2 × SSC, 0.5% SDS, 0.1% ficol-400 and 0.1% polyvinylpyrrolidone-350 for 60-90 minutes. Following this, the filter is dry dried with filter paper and placed in 4-5 ml of a hybridization mixture containing 6 × SSC; 0.1% SDS; 10% dextransulfate-500, 50 μg / ml poly (A) and a denatured sample of ³² P-labeled DNA with a total activity of 1-5 × 10 ⁶ cpm. Hybridization is carried out at a temperature of 68 ° C for 18-24 hours. The filters are washed in several changes of a 0.5 × SSC solution with 0.5% SDS at a temperature of 68 ° C for several hours. The washed filters are finally dried and placed in a cassette with x-ray film PM-1. After 2-24 hours, the exposure is shown autographically and hybrid clones are identified by the presence of positive signals (round blackening sites).

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pst1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой Pst1 и идентификации полосы AR1 340 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых получила название pYA11-39.In the described manner, experiment was performed on three filter replicas with a Pst1 clone collection of human DNA fragments. In this case, as a probe for hybridization with colonies on the filters, a sample of human alpha-DNA is taken, which was isolated preparatively from an agarose gel after electrophoretic separation of the hydrolyzate of human genomic DNA by endonuclease Pst1 and identification of the AR1 band of 340 nucleotides. An isotopic label is introduced into the indicated DNA sample as previously described by the substitution method. After hybridization in the colonies, a positive signal is detected particularly clearly in several colonies, one of which is called pYA11-39.

Препараты хромосом готовят из культуры лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США). Клетки культивируют в пенициллиновых флаконах или шприцах при температуре 37°С в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 часов. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37°С. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37°С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.Chromosome preparations are prepared from a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated by division with phytohemagglutinin (Difco USA). Cells are cultured in penicillin vials or syringes at a temperature of 37 ° C in Eagle's medium with the addition of up to 20% bovine serum for 74 hours. An hour before the end of cultivation, colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37 ° C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative (in a ratio of 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37 ° C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят как изотопной меткой, так и флюоресцентной метками методом замещения. В первом случае (изотопный метод), в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05M дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н³-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н³-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и 5 мкл ДНК (1 мкг) пробы pYA11-49. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20°С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25×10⁶ импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with both an isotopic tag and fluorescence tags using the substitution method. In the first case (isotopic method), 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl ₂ ) is successively dissolved in 100 μl of deionized water; 0.05 M dithiothreitol, 5 μl non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0.1 mm each except H ³ -thymidine triphosphate), 5 μl DNAse-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl H ³ -thymidine triphosphate (specific activity 114 Ci / mol, concentration 5 mCi / ml), 5 μl of DNA polymerase 1 (concentration 2 u / μl) and 5 μl of DNA (1 μg) of the pYA11-49 sample. The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20 ° C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 × 10 ⁶ pulses per minute per 1 μg of DNA.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 сек в 0,07н. NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70° и 96,6° этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 55% раствор формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2×SSC), в течение 10 мин при температуре 100°С. Гибридизацию проводят при температуре 37°С в течение 17-18 часов. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2×SSC при температуре 37°С, в двух сменах 2×SSC при комнатной температуре, в растворах 70° и 96,6° этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении ×1000 или ×1125.Hybridization of pYA11-39 recombinant DNA labeled with radioactive precursors with metaphase chromosomes in situ is carried out with preliminary denaturation for 0 sec in 0.07 N. NaOH followed by washing for 10 minutes in solutions of 70 ° and 96.6 ° ethyl alcohol. The preparations of radioactive DNA samples were denatured in a hybridization mixture containing 55% solution of formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline solution (2 × SSC) for 10 min at a temperature of 100 ° C. Hybridization is carried out at a temperature of 37 ° C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 × SSC at a temperature of 37 ° C, in two shifts of 2 × SSC at room temperature, in solutions of 70 ° and 96.6 ° of ethanol for 15 min in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer for 2 minutes, the preparations are thoroughly washed with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of × 1000 or × 1125.

Во втором случае, при мечении образцов рекомбинантной ДНК нерадиоактивными флюоресцентными нуклеотидами, например биотин-16-dUTP (биотин-16-дезокси-уридинтрифосфат), готовят реакционную смесь следующего состава: 50 mM Tris-HCl (рН 7,5), 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-меркаптоэтанол, по 0,04 mM нуклеозидтрифосфатов (dATP, dGTP, dCTP), 0,03 mM биотин-16-dUTP, 10U ДНК-полимеразы 1 из E.coli, 5-10 мкг ДНК-азы I и 2 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды. Объем реакционной смеси составляет 50 мкл. Реакцию проводят 1 час при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением EDTA (до 50mM), меченную ДНК рекомбинантной плазмиды осаждают этиловым спиртом, высушивают и растворяют в гибридизационной смеси (55% формамид, 2×SSC). Хранят в темноте при температуре -20°С.In the second case, when labeling samples of recombinant DNA with non-radioactive fluorescent nucleotides, for example biotin-16-dUTP (biotin-16-deoxy-uridine triphosphate), a reaction mixture of the following composition is prepared: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.04 mM nucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP), 0.03 mM biotin-16-dUTP, 10U DNA polymerase 1 from E. coli, 5-10 μg DNAase I and 2 μg of recombinant plasmid DNA. The volume of the reaction mixture is 50 μl. The reaction is carried out for 1 hour at a temperature of 15 ° C. The reaction was stopped by the addition of EDTA (up to 50 mM), the labeled DNA of the recombinant plasmid was precipitated with ethanol, dried and dissolved in a hybridization mixture (55% formamide, 2 × SSC). Store in the dark at a temperature of -20 ° C.

Гибридизацию меченой флюоресцентными нуклеотидами рекомбинантной ДНК pYA11-39 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: меченную рекомбинантную плазмиду в концентрации 10-20 нг в 10 мкл гибридизационной смеси, состоящей из 55% раствора формамида в 2×SSC, помещают на цитологический препарат, содержащий фиксированные метафазные хромосомы или интерфазные ядра, накрывают покровным стеклом 22×22 мм и прогревают при температуре 75°С в течение 5 мин для одновременной денатурации ДНК хромосом и рекомбинантной ДНК; затем проводят гибридизацию при температуре 42°С в течение 4-х-18-ти часов во влажной камере. Препараты после проведения гибридизации отмывают в гибридизационной смеси (50% формамид, 2×SSC) при температуре 42°С в течение 3-х мин и растворе 2×SSC при температуре 42°С в течение 5 мин и потом ополаскивают буферным раствором: 0,1 М КаН₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при комнатной температуре (или при температуре 37°С) в течение 1 мин. Далее препараты инкубируют с авидином, меченным флюоресцеином (флюоресцеин изотиоционат - раствор для контрастирующего окрашивания), в течение 30 мин при температуре 37°С во влажной камере; при этом на один препарат наносят 20 мкл авидина, (концентрация 5 мкг/мл) и накрывают пластинкой из пластика или пленкой «Parafilm». Промывают препараты три раза по 5-15 мин буфером 0,1 М NaH₂PO₄ + 0,1 М Na₂HPO₄ (pH 8,0), содержащим 0,1% Твин-20 при температуре 37°С.Hybridization of pYA11-39 recombinant DNA labeled with fluorescent nucleotides with metaphase chromosomes in situ is carried out according to the following procedure: a labeled recombinant plasmid at a concentration of 10-20 ng in 10 μl of a hybridization mixture consisting of a 55% solution of formamide in 2 × SSC is placed on a cytological preparation containing fixed metaphase chromosomes or interphase nuclei, cover with a 22 × 22 mm coverslip and warm at 75 ° C for 5 min to simultaneously denature chromosome DNA and recombinant DNA; then hybridization is carried out at a temperature of 42 ° C for 4 to 18 hours in a humid chamber. After hybridization, the preparations are washed in a hybridization mixture (50% formamide, 2 × SSC) at a temperature of 42 ° C for 3 min and a solution of 2 × SSC at 42 ° C for 5 min and then rinsed with a buffer solution: 0, 1 M CaN ₂ PO ₄ + 0.1 M Na ₂ HPO ₄ (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at room temperature (or at 37 ° C) for 1 min. Further, the preparations are incubated with avidin labeled with fluorescein (fluorescein isothiocyanate - a solution for contrasting staining) for 30 min at a temperature of 37 ° C in a humid chamber; at the same time, 20 μl of avidin, (concentration of 5 μg / ml) is applied to one preparation and covered with a plastic plate or Parafilm film. The preparations are washed three times for 5-15 minutes with 0.1 M NaH ₂ PO ₄ + 0.1 M Na ₂ HPO ₄ buffer (pH 8.0) containing 0.1% Tween-20 at 37 ° C.

Для окрашивания препаратов на них наносят фотозащитный раствор: 2% 1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октан (DABCO) в 50% глицерине, 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (15-20 мкл), 400 нг/мл флюоресцентного красителя DAPI (4',6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), йодистый пропидий в концентрации 400 нг/мл и накрывают покровным стеклом (22×22 мм) для микроскопического наблюдения.To stain the preparations, a photoprotective solution is applied to them: 2% 1,4-diazobicyclo- (2,2,2) octane (DABCO) in 50% glycerol, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 (15-20 μl) 400 ng / ml DAPI fluorescent dye (4 ', 6-Diamidine-2-phenylindole-dihydrochloride), propidium iodide at a concentration of 400 ng / ml and covered with a coverslip (22 × 22 mm) for microscopic observation.

Гибридизация in situ, как радиоактивная (изотопная), так и нерадиоактивная (флюоресцентная) на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYA11-39 локализуется только в прицентромерном районе 4-й и 9-й пар гомологичных хромосом человека и является, таким образом, молекулярным маркером данных пар хромосом, специфически маркирующим околоцентромерные районы.In situ hybridization, both radioactive (isotopic) and non-radioactive (fluorescent) on human metaphase chromosomes, shows that the cloned fragment pYA11-39 is localized only in the pericentromeric region of the 4th and 9th pairs of homologous human chromosomes and is thus a molecular marker of these pairs of chromosomes that specifically mark pericentromeric regions.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 4-й и 9-й пар хромосом в тех случаях, когда эти хромосомы (один из гомологов) затронуты перестройкой, т.е. имеет потерю или добавление какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 4-й или 9-й хромосом и их форме.Example 2. Particularly important is the use of the proposed molecular marker for recognition of the 4th and 9th pairs of chromosomes in those cases when these chromosomes (one of the homologs) are affected by rearrangement, i.e. has the loss or addition of any part of the chromosome material, which affects the size of the 4th or 9th chromosomes and their shape.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYA11-39 и его обработке с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора ребенка мужского пола (пробанда) с некоторыми клиническими проявлениями проксимальной делеции длинного плеча хромосомы 9 (9q). При цитогенетическом анализе клеток пробанда был обнаружен кариотип со сбалансированной перестройкой (транслокация 9/11), в которую была вовлечена хромосома 9, но без видимой потери хромосомного материала в околоцентромерном районе. Это должно было соответствовать нормальному фенотипу ребенка. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й хромосом, точно установить изменения в кариотипе не составило труда, так как потеря хромосомного материала в околоцентромерном районе и части длинного плеча хромосомы 9 легко распознавалась непосредственно под микроскопом. В результате молекулярного исследования у пробанда обнаружена проксимальная делеция (потеря хромосомного материала в прицентромерном районе длинного плеча 9-й хромосомы) при транслокации хромосом 9 и 11, которую можно связать с характерными клиническими проявлениями, имеющимися у ребенка. Таким образом, с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 9-й хромосомы изменения в гомологичной хромосоме, затронутой перестройкой, распознаются легко при анализе под микроскопом.All procedures for the isolation of a pYA11-39 DNA sample and its processing with an isotopic tag for in situ hybridization on metaphase chromosomes, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosome preparations and hybridization on chromosomes, are repeated as in Example 1. The only difference is that in Example 1 uses preparations of the normal chromosome set from a healthy male donor, while example 2 uses preparations of the chromosome set of a male child (proband) with some clinical manifestations mi proximal deletion of the long arm of chromosome 9 (9q). A cytogenetic analysis of proband cells revealed a karyotype with balanced rearrangement (9/11 translocation), in which chromosome 9 was involved, but without visible loss of chromosome material in the pericentromeric region. This should have been consistent with the normal phenotype of the child. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes along the length have been found to be ineffective. However, after hybridization on metaphase chromosomes in situ using the molecular marker pYA11-39 for the 4th and 9th chromosomes, it was not difficult to accurately determine the changes in the karyotype, since the loss of chromosome material in the near-centromeric region and part of the long arm of chromosome 9 is easy recognized directly under the microscope. As a result of a molecular study, a proband revealed a proximal deletion (loss of chromosome material in the pericentromere region of the long arm of the 9th chromosome) during translocation of chromosomes 9 and 11, which can be associated with the characteristic clinical manifestations of a child. Thus, using the molecular marker pYA11-39 for the 9th chromosome, changes in the homologous chromosome affected by perestroika are easily recognized by microscopic analysis.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й пар хромосом является опыт по идентификации этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая хромосома X, наличие которой в норме у женщин можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца хроматина X, образованного одной из двух хромосом Х в женском наборе, а также половая хромосома Y, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера pYA11-39, специфически маркирующего только 4-тые и 9-тые хромосомы человека, наличие данных хромосом в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pYA11-39 гибридизуется с ДНК околоцентромерных областей 4-й и 9-й пар хромосом и в том случае, когда эти хромосомы находятся в деспирализованном состоянии на стадии интерфазы. При этом в каждом интерфазном ядре можно видеть после гибридизации четыре скопления метки или сигнала, соответствующих двум парам хромосом 4-й и 9-й.Example 3. An important illustration of the practical application of the molecular marker pYA11-39 for the 4th and 9th pairs of chromosomes is the experience of identifying this chromosome in the cell nucleus directly from the picture of interphase (non-fissionable) nuclei. As is known, human chromosomes are analyzed only in the metaphase of mitosis after special treatments that facilitate the calculation and analysis of chromosome morphology. The exception is the sex chromosome X, the presence of which is normal in women can be determined by definition in the interphase nucleus of the compact body of chromatin X, formed by one of the two chromosomes X in the female set, as well as the sex chromosome Y, which is defined as a brightly fluorescent body stained with acrychine mustard , in the interphase nucleus of men with a normal chromosome set. However, with the help of the molecular marker pYA11-39, which specifically marks only the 4th and 9th chromosomes of a person, the presence of these chromosomes in the cell nucleus can be established without preparation of metaphase chromosome preparations, only by analyzing the image of interphase nuclei. This is due to the fact that the pYA11-39 DNA sample hybridizes with the DNA of the near-centromeric regions of the 4th and 9th pairs of chromosomes even when these chromosomes are in a despiral state at the interphase stage. Moreover, after each hybridization, four clusters of a label or signal corresponding to two pairs of chromosomes of the 4th and 9th can be seen in each interphase nucleus.

Все процедуры по выделению образца pYA11-39 и его обработки с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом клеток периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично процедурам, описанным в примере 1. При этом в каждом интерфазном ядре обнаруживаются четыре скопления гранул метки (четыре кластера) при изотопном мечении или 4 светящихся сигнала при нерадиоактивном мечении, соответствующих гомологичным хромосомам 4-й и 9-й пар. В разных ядрах расстояния между кластерами и сигналами различны. Итак, появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретных пар хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.All procedures for the isolation of sample pYA11-39 and its processing with an isotopic and fluorescent label for hybridization on interphase nuclei, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosomes of peripheral blood cells and hybridization on chromosomes are repeated similarly to the procedures described in example 1. in each interphase nucleus, four clusters of label granules (four clusters) are detected with isotopic labeling or 4 luminous signals with non-radioactive labeling corresponding to homologous chromosomes am 4th and 9th pairs. In different nuclei, the distances between clusters and signals are different. So, a real opportunity arises directly in interphase nuclei to analyze the location of homologous partners of specific pairs of chromosomes in human cells, which is of great scientific interest from the point of view of the functional organization of human hereditary structures.

Пример 4. Исключительно важной иллюстрацией практического использования молекулярного маркера pYA11-39 является опыт по определению присутствия 4-й и 9-й пар хромосом в клетках нативных препаратов ворсин хориона в пренатальной диагностике плода.Example 4. An extremely important illustration of the practical use of the molecular marker pYA11-39 is the experience of determining the presence of the 4th and 9th pairs of chromosomes in the cells of native chorionic villus preparations in prenatal diagnosis of the fetus.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYA11-39, его обработке с изотопной и флюоресцентной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит в том, что в примере 1 используются препараты метафазных хромосом, приготовленные из культуры лимфоцитов периферической крови здорового донора мужского пола, тогда как в примере 4 используются нативные препараты метафазных хромосом клеток ворсин хориона.All procedures for isolating a pYA11-39 DNA sample, processing it with an isotopic and fluorescent label for in situ hybridization on metaphase chromosomes, and performing chromosome hybridization are repeated as in Example 1. The difference is that metaphase chromosome preparations made from cultures of peripheral blood lymphocytes of a healthy male donor, whereas in example 4, native preparations of metaphase chromosomes of chorionic villus cells are used.

Нативные препараты из клеток ворсин хориона получают следующим образом: образцы ворсин хориона промывают в трех сменах изотонического раствора (0,9% раствор хлорида натрия) и помещают на 5-10 мин в 60% раствор уксусной кислоты при комнатной температуре, затем прикладывают («отпечатывают») образцы ворсин хориона к чистому предметному стеклу. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом помещают в термостат (температура 37°С) и используют в опытах уже через 1-2 часа после приготовления.Native preparations from chorionic villus cells are prepared as follows: samples of chorionic villi are washed in three shifts of an isotonic solution (0.9% sodium chloride solution) and placed in a 60% acetic acid solution for 5-10 minutes at room temperature, then applied (“imprint” ") Samples of chorionic villi to a clean slide. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative (in a ratio of 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are placed in a thermostat (temperature 37 ° C) and used in experiments already 1-2 hours after preparation.

При цитогенетическом анализе препаратов клеток ворсин хориона у плода был обнаружен мужской кариотип с кольцевой хромосомой, предположительно кольцевой хромосомой 4 (r4). Следует отметить, что цитогенетический анализ метафазных хромосом на нативных препаратах клеток ворсин хориона часто затруднен из-за неудовлетворительного состояния метафазных пластинок. Однако этот метод используют в практике пренатальной диагностики, когда получить результат цитогенетического анализа необходимо в течение 3-4-х дней в первом триместре беременности. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом по длине оказались в данном случае малоэффективны. После проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й и 9-й хромосомы установлено происхождение кольцевой хромосомы в кариотипе, так как эти хромосомы легко распознавались непосредственно под микроскопом по наличию четырех сигналов. При анализе этих сигналов на гомологичных хромосомах были видны две нормальные гомологичные 9-тые хромосомы, одна нормальная 4-тая хромосома и кольцевая 4-тая хромосома. В результате молекулярного исследования у плода обнаружена кольцевая хромосома 4 (r4). Итак, с помощью молекулярного маркера pYA11-39 для 4-й хромосомы установить присутствие хромосом 4-й пары в кариотипе плода при проведении пренатальной диагностики не представляет труда.A cytogenetic analysis of chorionic villus cell preparations in the fetus revealed a male karyotype with a ring chromosome, presumably a ring chromosome 4 (r4). It should be noted that the cytogenetic analysis of metaphase chromosomes on native preparations of chorionic villus cells is often difficult due to the unsatisfactory state of metaphase plates. However, this method is used in the practice of prenatal diagnosis, when it is necessary to obtain the result of a cytogenetic analysis within 3-4 days in the first trimester of pregnancy. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes along the length have proved to be ineffective in this case. After hybridization on metaphase chromosomes in situ using the molecular marker pYA11-39 for the 4th and 9th chromosomes, the origin of the ring chromosome in the karyotype was established, since these chromosomes were easily recognized directly under the microscope by the presence of four signals. When analyzing these signals on homologous chromosomes, two normal homologous 9th chromosomes, one normal 4th chromosome and a circular 4th chromosome were visible. As a result of molecular studies, a fetal chromosome 4 (r4) was detected in the fetus. So, using the molecular marker pYA11-39 for the 4th chromosome to establish the presence of chromosomes of the 4th pair in the fetal karyotype during prenatal diagnosis is not difficult.

Таким образом, клонированная последовательность ДНК pYA11-39 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 4-тых и 9-тых хромосом как на стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосом человека, так и в случаях перестроенных 4-тых и 9-тых хромосом на различных стадиях клеточного цикла (метафазные и интерфазные ядра), а также на цитологических (без культивирования клеток) нативных препаратах клеток ворсин хориона. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 4-тых и 9-тых хромосом человека, а также при анализе анеуплоидий, особенно по хромосомам 9 и при различных формах рака. Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.Thus, the cloned DNA sequence pYA11-39 from the human genome is an effective tool for recognition of the 4th and 9th chromosomes both on standard (after cell cultivation) preparations of normal human chromosomes and in cases of rearranged 4th and 9th chromosomes at various stages of the cell cycle (metaphase and interphase nuclei), as well as on cytological (without cell cultivation) native preparations of chorionic villus cells. These possibilities expand the scope of chromosomal analysis in the practice of clinical genetics, genetic counseling and prenatal diagnostics in cases of rearrangements of the 4th and 9th chromosomes of a person, as well as in the analysis of aneuploidy, especially on chromosome 9 and various forms of cancer. Perhaps the effective application of the proposed method in the analysis of hybrid cell lines that are widely used for cytogenetic mapping of normal and mutant human genes.

Claims (1)

Рекомбинантная плазмидная ДНК pYA11-39, предназначенная для маркирования 4-й и 9-й хромосом человека, содержащая: - Pst1-Pst1 - фрагмент ДНК вектора pUC19 размером 2700 пар нуклеотидов, - Pst1-Pst1 - фрагмент альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичный для центромерных районов 4-й и 9-й хромосом человека, размером 680 пар нуклеотидов, полученный из Pst1 рестриктов тотальной фракции альфоидной ДНК человека при гибридизации на хромосомах in situ в специальных условиях повышенной жесткости с использованием стандартного солевого раствора с 55%-ным формамидом; генетические маркеры: Ampr - ген устойчивости к ампициллину.Recombinant plasmid DNA pYA11-39, designed for labeling of the 4th and 9th chromosomes of a human, containing: - Pst1-Pst1 - a DNA fragment of the vector pUC19 of 2700 pairs of nucleotides in size, - Pst1-Pst1 - a fragment of the alpha lymphoid DNA of human lymphocytes, highly specific for centromere regions of the 4th and 9th human chromosomes, 680 pairs of nucleotides in size, obtained from Pst1 restriction of the total fraction of human alphaoid DNA by hybridization on chromosomes in situ under special conditions of increased stringency using standard saline solution with 55% formamide; genetic markers: Ampr - ampicillin resistance gene.