HRP20070268B1 - Ciljana modifikacija faktora viii - Google Patents

Ciljana modifikacija faktora viii Download PDF

Info

Publication number
HRP20070268B1
HRP20070268B1 HRP20070268AA HRP20070268A HRP20070268B1 HR P20070268 B1 HRP20070268 B1 HR P20070268B1 HR P20070268A A HRP20070268A A HR P20070268AA HR P20070268 A HRP20070268 A HR P20070268A HR P20070268 B1 HRP20070268 B1 HR P20070268B1
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
fviii
factor viii
mutein
pegylated
peg
Prior art date
Application number
HRP20070268AA
Other languages
English (en)
Inventor
Clark Q Pan
John E. Murphy
Baisong Mei
Jonathan S Strauss
Hendri Tjandra
Jianmin Chen
Thomas Barnett
Liang Tang
Deqian Wang
Original Assignee
Bayer Healthcare Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36337298&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HRP20070268(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bayer Healthcare Llc filed Critical Bayer Healthcare Llc
Publication of HRP20070268A2 publication Critical patent/HRP20070268A2/hr
Publication of HRP20070268B1 publication Critical patent/HRP20070268B1/hr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

Ovaj izum se odnosi na muteine faktora VIII koji su kovalentno vezani, na predodređenom mjestu koje nije N-terminalni amin, za jedan ili više biokompatibilnih polimera kao što je polietilen glikol. Mutein konjugati zadržavaju prokoagulantno djelovanje faktora VIII te imaju poboljšane farmakokinetičke značajke.

Description

Upućivanje na povezanu prijavu
Ova prijava zahtijeva pravo prioriteta dokumenta US Patent App. Ser. No. 60/627,277, zaprimljenog 12. studenog 2004., koji je ovdje u potpunosti uključen referencom.
Polje izuma
Ovaj izum se odnosi na muteine (proteini izmijenjenog aminokiselinskog slijeda) faktora VIII (čimbenika VIII) (FVIII) koji omogućuju vezanje, na definirano mjesto, jednog ili više biokompatibilnih polimera kao što je polietilen glikol. Dodatno su pružene s time povezane formulacije, doze i metode njihovog davanja za terapeutske svrhe. Te modificirane FVIII inačice, te s njima povezane smjese i metode korisne su kod pružanja mogućnosti liječenja, za pojedince koji pate od hemofilije A, sa smanjenom učestalošću injektiranja i smanjenim imunogenim odgovorom.
Pozadina izuma
Hemofilija A je najčešći nasljedni poremećaj zgrušavanja krvi, s procijenjenom incidencijom od jednog slučaja na 5000 muškaraca. Uzrokovan je deficijencijom ili strukturnim oštećenjima kod FVIII koji je kritična komponenta intrinzičnog puta zgrušavanja krvi. Trenutno liječenje hemofilije A uključuje intravenozno injektiranje humanog FVIII. Humani FVIII je bio proizveden rekombinantno kao jednolančana molekula od približno 300 kD. Sastoji se od strukturnih domena A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22). Prekursor se prerađuje u dva polipeptidna lanca, od 200 kD (teški) i 80 kD (laki), u Golgijevom tijelu, pri čemu se dva lanca drže zajedno zahvaljujući metalnim ionima (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979).
B-domena faktora VIII čini se nebitnom pošto se za FVIII s delecijom B-domene (engl.: "B-domain deleted FVIII", BDD) (90 kD A1-A2 teški lanac plus 80 kD laki lanac) također bilo pokazalo da je učinkovit kao zamjenska terapija hemofilije A. Slijed (aminokiselina) faktora VIII s delecijom B-domene odlikuje se delecijom svih osim 14 aminokiselina B-domene.
Pacijenti koji pate od hemofilije A u ovom se trenutku liječe intravenoznim davanjem FVIII po potrebi ili kao profilaktička terapija koja se daje nekoliko puta tjedno. Za profilaktičku terapiju daje se 15-25 IU/kg tjelesne mase faktora VIII tri puta tjedno. Pacijent ima za tim stalnu potrebu. Zbog svog kratkog poluživota kod ljudi, FVIII se mora davati često. Usprkos svojoj veličini koja prelazi 300 kD za cijeli protein, poluživot FVIII kod ljudi iznosi samo približno 11 sati. (Ewenstein et al, 2004, Semin. Hematol. 41 , pp.1-16). Potreba za čestim intravenoznim injektiranjem stvara goleme prepreke udovoljavanju pacijentima. Bilo bi puno prikladnije za pacijente kada bi se mogao razviti FVIII proizvod koji bi imao duži poluživot te bi stoga zahtijevao rjeđe davanje. Nadalje, trošak liječenja mogao bi biti smanjen ako bi se produžio poluživot, pošto bi tada bilo potrebno manje doza.
Dodatni nedostatak trenutnoj terapiji predstavlja činjenica da približno 25-30% pacijenata razvije antitijela koja inhibiraju djelovanje FVIII (Saenko et al, 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11). Glavni epitopi za inhibirajuća antitijela smješteni su unutar A2 domene na ostacima 484-508, A3 domene na ostacima 1811-1818, te C2 domene. Razvoj antitijela sprječava korištenje FVIII kao zamjenske terapije, prisiljavajući tu grupu pacijenata da potraže još skuplji oblik liječenja velikim dozama rekombinantnog faktora VIIa i terapijom imunotolerancije.
Slijedeće studije identificirale su FVIII epitope za inhibirajuća antitijela. U studiji 25 inhibirajućih uzoraka plazme, za njih 11 je pronađeno da se vežu za trombinom stvoreni fragment A3C1C2 lakog lanca od 73 kD, 4 za A2 domenu, a 10 za oba mjesta (Fulcher, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32). U drugoj studiji, šest od osam inhibitora A2 domene pacijenata bili su neutralizirani rekombinantnim A2 polipeptidom (Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), pp.1767-75). Epitopi za šest od devet inhibitora iz pacijenata bili su mapirani na A2 ostatke 379-538 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6). Epitop za 18 inhibitora teškog lanca je bio lokaliziran na istu N-terminalnu regiju od 18.3 kD domene A2 (Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp.1618-26).
Djelatna, rekombinantna hibridna humana/svinjska molekula FVIII, stvorena zamjenjivanjem ostataka 387-604 humane A2 domene s homolognim slijedom svinje, bila je rezistentna na A2 inhibitor pacijenta (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41) i rezistentna na mišje monoklonsko antitijelo mAB 413 IgG koje se natječe s pacijentovim A2 inhibitorima za vezanje na A2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp.665-71). Taj epitop A2 domene je zatim lokaliziran na ostatke 484-508 domene A2 kada su eksperimenti pokazali da mAB 413 IgG i četiri inhibitora pacijenta ne inhibiraju hibridni humani/svinjski FVIII kod kojega su ostaci 484-508 A2 domene bili zamijenjeni onima svinje (Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp.14505-9). Taj hibridni FVIII je također bio rezistentniji na najmanje polovicu od 23 plazma pacijenata koje su bile podvrgnute probiru (engl.: "screening") (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp. 564-8). Alanin-skenirajuća mutageneza (engl.: "alanine-scanning mutagenesis") odredila je ostatak 487 kao kritičan za vezanje na svih pet ispitanih inhibitora pacijenta, dok su ostaci 484, 487, 489 i 492 svi bili važni za interakciju s mAB 413 IgG (Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5). Titri inhibirajućih antitijela kod miševa koji su primali R484A/R489A/P492A mutant, ali ne i R484A/R489A mutant, bili su značajno niži nego kod miševa koji su kao kontrolu primali humani BDD FVIII (Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp. 704-10). Konačno, čini se da je regija 484-508 A2 domene mjesto na koje se vežu inhibitori djelovanja FVIII.
Dodatno razvijanju imunološkog odgovora na FVIII, još jedan problem s konvencionalnom terapijom je taj da ona zahtijeva često doziranje zbog kratkog poluživota FVIII in vivo. Bili su proučavani mehanizmi klirensa FVIII iz optoka krvi.
Učinak klirensa FVIII iz optoka krvi bio je djelomično pripisan specifičnom vezanju na protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće (engl.: "low-density lipoprotein receptor-related protein", LRP) koji predstavlja receptor hepatičkog klirensa sa širokom specifičnošću za ligande (Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp. 133-139). Nedavno je pokazano da i receptor za lipoprotein niske gustoće (engl. krat.: LDL) igra ulogu kod klirensa FVIII, npr. suradnjom s LRP kod reguliranja razina FVIII u plazmi (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp. 906-910). Obje interakcije su omogućene vezanjem heparin sulfat proteoglikana (engl. krat.: HSPGs) za staničnu površinu. Poluživot u plazmi kod miševa može se produžiti 3,3 puta kada je LRP blokiran ili 5,5 puta kada su blokirani i LRP i HSPGs stanične površine (Sarafanov et al., 2001 , J. Biol. Chem. 276, pp. 11970-11979). Postavila se hipoteza da HSPGs koncentriraju FVIII na staničnoj površini i da ga prezentiraju LRP-u. Mjesta vezanja LRP na FVIII bila su lokalizirana na A2 ostatke 484-509 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 37685-37692), A3 ostatke 1811-1818 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370-9377) i epitop u C2 domeni (Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734- 23739).
FVIII se također odstranjuje iz optoka krvi djelovanjem proteaza. Za razumijevanje ovog učinka, mora se shvatiti mehanizam kojim je FVIII uključen u zgrušavanje krvi. FVIII se u optoku nalazi kao heterodimer teškog i lakog lanca, vezanog za vWF. Vezanje za vWF uključuje FVIII ostatke 1649-1689 (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234), i dijelove C1 (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp. 958-965) i C2 domena (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8). FVIII se aktivira trombinom, koji cijepa peptidne veze nakon ostataka 372, 740 i 1689 kako bi se stvorio heterotrimer A1, A2, i A3-C1-C2 domena (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439). Nakon aktiviranja, FVIII se odvaja od vWF te se koncentrira na staničnu površinu trombocita vezanjem za fosfolipid. Vezanje za fosfolipid uključuje FVIII ostatke 2199, 2200, 2251 i 2252 (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp. 6374-6381). Ondje se veže za FIX kroz interakcije s ostacima 558-565 faktora VIII (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527) i 1811-1818 (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 , pp. 1935- 1940) i za FX kroz interakcije s ostacima 349-372 faktora VIII (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771) te djeluje kao kofaktor za aktiviranje FX pomoću FIX, što je bitna komponenta intrinzičnog puta zgrušavanja. Aktivirani FVIII (FVIIIa) je djelomično inaktiviran proteazom aktiviranim proteinom C (engl. krat.: APC) kroz cijepanje nakon ostataka 336 i 562 faktora VIII (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987). Predominantna odrednica inaktiviranja je ipak odvajanje A2 domene od A1 i A3-C1-C2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962).
Jedna metoda za koju je bilo pokazano da produžuje in vivo poluživot proteina je PEGilacija. PEGilacija je kovalentno vezanje dugolančanih molekula polietilen glikola (PEG) za protein ili drugu molekulu. PEG može biti u ravnolančanom obliku ili u razgranatom obliku kako bi se dobile različite molekule s različitim značajkama. Pored produžavanja poluživota peptida ili proteina, PEGilacija se koristi za potiskivanje razvoja antitijela, zaštitu proteina od razgradnje proteazom i zadržavanje materijala izvan bubrežnog filtrata (Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51). Dodatno, PEGilacija može također povećati ukupnu stabilnost i topivost proteina. Konačno, produženo zadržavanje PEGiliranih proteina u određenoj koncentraciji u plazmi može smanjiti raspon štetnih popratnih učinaka smanjivanjem razlike između najnižih i najviših razina lijeka, čime se isključuje potreba ranog uvođenja visokih razina proteina koje su iznad fizioloških razina.
Nasumična modifikacija FVIII usmjeravanjem velikih polimera kao što su PEG i dekstran na primarne amine (N-terminus i lizini) bila je iskušana s različitim stupnjem uspjeha (WO94/15625, US Patent 4970300, US Patent 6048720). Najdramatičnije poboljšanje, što je objavljeno u patentnoj prijavi iz 1994. (WO94/15625), pokazuje četverostruko produžavanje poluživota, ali uz dvostruki gubitak djelovanja nakon reagiranja FVIII pune dužine s pedeseterostrukim molarnim suviškom PEG-a. WO2004/075923 objavljuje konjugate faktora VIII i polietilen glikola koji su stvoreni nasumičnom modifikacijom. Nasumice PEGilirani proteini, kao što je interferon-alfa (Kozlowski et al, 2001, BioDrugs 15, pp. 419- 429) u prošlosti su odobreni kao terapeutici.
Taj nasumični pristup je ipak problematičniji za heterodimerne FVIII. FVIII ima stotine potencijalnih mjesta za PEGilaciju, uključujući 158 lizina, dva N-terminusa, i mnoge histidine, serine, treonine i tirozine, od kojih svi mogu potencijalno biti PEGilirani reagensima koji su prvenstveno usmjereni na primarne amine. Na primjer, pokazalo se da glavni pozicijski izomer za PEGilirani interferon Alfa-2b predstavlja histidin (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640). Nadalje, heterogena prerada FVIII pune dužine može dati mješavinu početnog materijala što dovodi do dalje kompleksnosti kod PEGiliranih produkata. Dodatna poteškoća koja dovodi do nemogućnosti kontroliranja mjesta PEGilacije na FVIII je potencijalno smanjenje djelovanja kada se PEG treba vezati za ili blizu kritičnih aktivnih mjesta, osobito kada se na FVIII konjugira više od jednog PEG-a ili jedan veliki PEG. Pošto će nasumična PEGilacija uvijek proizvesti velike količine višestruko PEGiliranih produkata, pročišćavanje s ciljem dobivanja samo mono-PEGiliranih produkata će drastično sniziti ukupni prinos. Konačno, enormna heterogenost u profilu produkta učinit će konzistentnu sintezu i karakterizaciju svake pojedine šarže skoro nemogućom. Pošto načela kvalitetne proizvodnje zahtijevaju konzistentni, dobro karakterizirani produkt, heterogenost produkta predstavlja barijeru na putu ka komercijalizaciji. Iz svih tih razloga poželjna je specifičnija metoda PEGilacije FVIII.
U nedavnom pregledu (Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, dostupno "online" od 15. listopada 2005., direct object identifier doi:10.1016/j.cbpa.2005.10.007) sažete su razne strategije ciljane PEGilacije proteina. Jedan pristup uključuje ugrađivanje umjetnih (sintetskih) aminokiselina u proteine pomoću kemijske sinteze ili rekombinantne ekspresije nakon čega slijedi adicija PEG derivata koji će specifično reagirati s umjetnom aminokiselinom. Na primjer, umjetna aminokiselina može sadržavati keto grupu koja se ne nalazi u izvornim proteinima. Ipak, kemijska sinteza proteina nije izvediva za toliko velike proteine kao što je FVIII. Trenutno ograničenje sinteze peptida je približno 50 ostataka. Nekoliko peptida može se povezati kako bi se dobio veći polipeptid, ali da bi se proizveo čak samo FVIII s delecijom B-domene bilo bi potrebno više od 20 vezanja, što bi rezultiralo s manje od 1% rekuperacije čak i pod idealnim uvjetima reakcije. Rekombinantna ekspresija proteina s umjetnim aminokiselinama je do sada uglavnom bila ograničena na sustave ekspresije kod organizama koji nisu sisavci. Očekuje se da bi taj pristup bio problematičan za veliki i kompleksan protein, kao što je FVIII, koji se treba eksprimirati u sustavima sisavaca.
Slijedeći pristup kod ciljane PEGilacije proteina je usmjeravanjem PEG-aldehida na N-terminalni amin glavnog lanca. Niski pH, koji je u ovom postupku potreban za postizanje specifičnosti nad ostalim aminskim grupama, ipak, nije kompatibilan s uskim, skoro neutralnim rasponom pH potrebnim za stabilnost FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15). Još k tome, N-terminalna PEGilacija FVIII može ne dovesti do produženog poluživota u plazmi ako ta regija nije uključena u plazmatski klirens. Zapravo, N-terminalna regija lakog lanca FVIII je uključena u vezanje za von Willebrandov faktor (vWF), nosivi protein koji je kritičan za opstanak FVIII u optoku. N-terminalnom modifikacijom faktora VIII, kritično važno povezivanje s vWF može biti prekinuto ili oslabljeno. Stoga N-terminalna PEGilacija FVIII može imati suprotan učinak skraćivanja poluživota FVIII u plazmi.
WO90/12874 objavljuje ciljanu modifikaciju humanog IL-3, faktora stimuliranja granulocitne kolonije i eritropoetinskih polipeptida umetanjem cisteina ili zamjenjivanjem cisteina drugom aminokiselinom te, zatim, dodavanjem liganda koji ima sulfhidril reaktivnu grupu. Ligand se veže selektivno za cisteinske ostatke. Modifikacija FVIII ili bilo koje njegove inačice nije objavljena.
Iz gore iznesenih razloga nameće se potreba za poboljšanom inačicom FVIII koja se odlikuje duljim djelovanjem in vivo i smanjenom imunogeničnošću dok, uz to, zadržava funkcionalno djelovanje. Nadalje, poželjno je da se takav protein proizvodi kao homogeni produkt na konzistentan način.
Sažetak izuma
Cilj ovog izuma je pružiti biokompatibilni polimerom konjugirani polipeptid funkcionalni faktor VIII koji ima poboljšane farmakokinetičke i terapeutske karakteristike.
Slijedeći je cilj ovog izuma pružiti biokompatibilni polimerom konjugirani protein FVIII s uklonjenom B domenom koji ima poboljšane farmakokinetičke značajke.
Još jedan cilj izuma je pružiti biokompatibilni polimerom konjugirani polipeptid funkcionalni faktor VIII koji se odlikuje smanjenim vezanjem za protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće (LRP), receptor lipoproteina niske gustoće (LDL), heparan sulfat proteoglikane (HSPGs) i/ili za inhibirajuća antitijela protiv FVIII.
Još jedan cilj ovog izuma je pružiti poboljšanu FVIII inačicu koja se odlikuje duljim trajanjem djelovanja in vivo i smanjenom imunogeničnošću, a koja se može proizvesti kao homogeni produkt na konzistentan način.
U jednom aspektu izuma pruža se konjugat s prokoagulantnim djelovanjem faktora VIII koji se sastoji od polipeptida funkcionalnog faktora VIII kovalentno vezanog, na jednom ili više predodređenih mjesta na polipeptidu, za jedan ili više biokompatibilnih polimera, pri čemu predodređeno mjesto nije N-terminalni amin. Izum također uključuje metodu za pripravljanje tog konjugata, a koja se sastoji od mutiranja nukleotidnog slijeda koji kodira polipeptid funkcionalni faktor VIII kako bi se zamijenio kodirajući slijed za cisteinske ostatke na predodređenom mjestu; ekspresije mutiranog nukleotidnog slijeda kako bi se proizveo cisteinom obogaćeni mutein; pročišćavanja muteina; reagiranja muteina s biokompatibilnim polimerom koji je bio aktiviran na način da reagira s polipeptidima, u osnovi samo s uvedenim cisteinskim ostacima tako da se dobije konjugat; i pročišćavanja konjugata. Izum je također usmjeren na farmaceutske smjese koje sadrže konjugat i farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo, te metode liječenja hemofilije davanjem terapeutski učinkovitih količina tih farmaceutskih smjesa sisavcu kojemu je to potrebno.
Izum se također odnosi na metodu ciljane PEGilacije muteina faktora VIII koja se sastoji od (a) ekspresije ciljanog muteina faktora VIII pri čemu mutein ima cisteinsku zamjenu za aminokiselinski ostatak na izloženoj površini muteina faktora VIII i pri čemu je taj cistein zaštićen zaštitnom skupinom; (b) dovođenja u kontakt cisteinskog muteina s redukcijskim sredstvom pod uvjetima koji dovode do blage redukcije cisteinskog muteina i do otpuštanja zaštitne skupine; (c) uklanjanja zaštitne skupine i redukcijskog sredstva iz cisteinskog muteina; i (d) barem približno 5 minuta nakon uklanjanja redukcijskog sredstva, tretiranja cisteinskog muteina s PEG koji sadrži sulfhidril vezni dio pod takvim uvjetima da se proizvede PEGilirani mutein faktora VIII.
Kratak opis slika
Slika 1. Mape vektora i strategija mutageneze za PEG muteine.
Slika 2. UV apsorpcijski profil kod 280nm, s obzirom na vrijeme za PEG2 protein pročišćen kroz kromatografsku kolonu monoklonskog FVIII antitijela. Kromatografija je bila provedena korištenjem AKT A(R) Explorer 100 kromatografskog sustava (Amersham Bioscience).
Slika 3. Metoda ciljane PEGilacije u tri koraka. PEG predstavlja cistein-reaktivni PEG kao što je PEG-maleimid. Simbol ┌┐ predstavlja stvaranje disulfida dok simbol ׀ ׀ predstavlja reducirane cisteine.
Slika 4. Ciljana PEGilacija spoja PEG2.
Slika 5. Ciljana PEGilacija spoja PEG6.
Slika 6a. Ciljana PEGilacija spojeva BDD, PEG2, 4, 5 i 6. Gornje ploče su obojane antitijelima za teške (engl. krat.: H) lance dok su donje ploče obojane antitijelima za lake (engl. krat.: L) lance. "U" predstavlja neprerađeni materijal koji sadrži i H i L.
Slika 6b. PEGilacija spojeva PEG15 i PEG7 s PEG2 i PEG6 kao kontrolama. Početni (engl.: "start", S) pročišćeni PEG muteini su reducirani s TCEP i PEGilirani s 12 kD ("12") ili s 22 kD ("22") PEG nakon uklanjanja redukcijskog sredstva ("R"). Uzorci su provedeni kroz 6% Tris-glicin SDS PAGE i obojani antitijelima za teške lance (engl. krat.: HC) na lijevoj ploči ili antitijelima lakih lanaca (engl. krat.: LC) na desnoj ploči. "U" predstavlja neprerađeni materijal koji sadrži i HC i LC. PEGilirane vrpce istaknute su točkama.
Slika 6c. PEGilacija spoja PEG2+6 s PEG2 i PEG6 kao kontrolama. PEG2, PEG6 ili PEG2+6 je reduciran s TCEP i PEGiliran s 5 kD ("5") ili s 43 kD ("43") PEG nakon uklanjanja redukcijskog sredstva ("R"). PEG2+6 je također bio PEGiliran s 12, 22 i 33 kD PEG. Uzorci su provedeni kroz 6% Tris-glicin SDS PAGE i obojani coomassie bojom za proteine na lijevoj strani ili antitijelima za teške (H) ili lake lance (L). "U" predstavlja neprerađeni materijal koji sadrži i H i L. PEGilirane vrpce istaknute su točkama.
Slika 6d. PEGilacija divljeg tipa FVIII pune dužine (KG-2) s PEG2 kao kontrolom. Lijevi gel je obojan coomassie bojom za proteine, a desni gel jodom za PEG. "BDD U" predstavlja neprerađeni BDD materijal koji sadrži i H i L. PEGilirane vrpce istaknute su točkama.
Slika 7. Cijepanje PEGiliranog PEG2 trombinom. N-terminalna polovica A2 domene je obojana plavo, a C-terminalna polovica zeleno pri čemu je epitop R8B12 antitijela istaknut tamno zeleno (desni FVIII model). PEG2 (stupac 1) i 22 kD PEGilirani PEG2 (stupac 2) tretirani su trombinom (stupac 3 odnosno 4) i zatim provedeni kroz 7% Tris-Acetat gel (Invitrogen) i obojani R8B12 antitijelom. Svaka vrpca sadrži približno 50 ng FVIII.
Slika 8. Cijepanje PEGiliranog divljeg tipa FVIII pune dužine (KG-2) trombinom. "S" = početni KG-2 materijal. "R" = reducirani KG-2, redukcijsko sredstvo uklonjeno. "P" = "R" PEGiliran s 43 kD PEG. "Pure" = "P" pročišćen od suviška PEG-a. "L" = laki lanac. PEGilirane vrpce istaknute su točkama.
Slika 9. Bojanje jodom PEGiliranog PEG2. 22 ili 43 kD PEGilirani PEG2 je proveden kroz 6% TrisGlicine gel i obojan R8B12 antitijelom za FVIII (stupci 1 i 2) ili jodom (stupci 3 i 4). Dva su obojenja poredana u skladu sa njihovim stupcima biljezima molekularnih masa. Svaki od stupaca 1 i 2 sadrži približno 30 ng FVIII dok stupci 3 i 4 sadrže približno 2 μg.
Slika 10. MALDI masena spektrometrijska analiza PEGiliranog i nePEGiliranog PEG2. MALDI masena spektrometrija je bila provedena na PEG2 (slika 10a) ili 22 kD PEGiliranom PEG2 (slika 10b). Nakon PEGilacije, vršni nalaz (engl.: "peak") teškog (H) lanca PEG2 je uvelike smanjen, a pojavio se novi vršni nalaz (H+PEG), koji leži na 111 kD (22 kD PEG + 89 kD teški lanac). Nije utvrđen vršni nalaz PEGiliranog lakog (L) lanca, za koji se očekivalo da se smjesti na 100 kD (22 kD PEG + 83 kD laki lanac).
Slika 11. MALDI masena spektrometrija PEGiliranog i nePEGiliranog PEG2 nakon cijepanja trombinom.
Slika 12. MALDI masena spektrometrijska analiza PEGiliranog PEG6 prije i nakon cijepanja trombinom.
Slika 13. UV apsorpcijski profil kod 280 nm, PEGiliranog PEG2 pročišćenog u koloni isključenjem po veličini.
Slika 14. UV apsorpcijski profil kod 280 nm, PEGiliranog i nePEGiliranog PEG6 pročišćenog u koloni kationskom izmjenjivaču.
Slika 15. UV apsorpcijski profil kod 280 nm, PEGiliranog i nePEGiliranog PEG6 pročišćenog u koloni isključenjem po veličini.
Slika 16. Djelovanje PEGiliranog proteina je uspoređeno s djelovanjem nePEGiliranog proteina, izmjereno kromogenom analizom i analizom zgrušavanja. Pročišćeni FVIII pune dužine je predstavljen kao KG-2. Prikazani postotak djelovanja bio je određen dijeljenjem vrijednosti uzorka tretiranog s PEG nakon reduciranja i uklanjanja redukcijskog sredstva vrijednošću uzorka tretiranog s puferskom kontrolom, pri čemu se uzima u obzir prinos PEGilacije.
Slika 17. PK (farmakokinetička) studija PEGiliranog PEG2 u usporedbi s PEG2 kod zečeva.
Slika 18. PK studija PEGiliranog PEG2 u usporedbi s BDD i PEG2 kod zečeva. P-vrijednosti su rezultat usporedbe PEGiliranog PEG2 i BDD.
Slika 19. PK studija PEGiliranog PEG6 u usporedbi s BDD i PEG6 kod zečeva.
Slika 20. PK studija PEGiliranog divljeg tipa FVIII pune dužine (engl. krat.: "fl") u usporedbi s nemodificiranim fl FVIII, kod zečeva.
Slika 21. PK studija PEGiliranog PEG6 u usporedbi s PEG6 i BDD, kod hemofiličnih miševa.
Slika 22. PK studija 22 i 43 kD PEGiliranog PEG2 u usporedbi s BDD, kod normalnih miševa.
Slika 23. PK studija 22 kD PEGiliranog PEG2 u usporedbi s BDD, kod normalnih miševa, u punom trajanju.
Slika 24. Histogram rekuperacije (BDD) faktora VIII kod hemofiličnih miševa koji prikazuje farmakokinetičku (PK) procjenu poluživota dvije vrste BDD faktora VIII u analizi kod hemofiličnih miševa.
Slika 25. Studija laceracije bubrega hemofiličnih miševa, za 22 kD PEGilirani PEG2 u usporedbi s BDD. Miševi tretirani samom nosivom tvari pokazali su gubitak krvi od 25 uL po gramu tjelesne mase.
Slika 26. Kromogeno djelovanje PEGiliranih PEG2 i BDD u prisustvu rastućih količina FVIII antitijela. Epitop antitijela je označen zagradama.
Slika 27. Kromogeno djelovanje PEGiliranog PEG2 u prisustvu rastućih količina FVIII mAB 413 antitijela.
Slika 28. Kromogeno djelovanje BDD, 43 kD PEGiliranog PEG2, 33 kD PEGiliranog PEG6 i 33 kD diPEGiliranog PEG2+6 u prisustvu humane plazme dobivene od pacijenata koji su razvili inhibitore faktora VIII. Titar inhibitora i datum sakupljanja krvi zabilježeni su na vrhu. Gornje dvije ploče uključuju podatke sakupljene kod peterostrukog do 405-erostrukog razrjeđenja plazme pacijenta. Donja lijeva ploča se usredotočuje na razrjeđenje 1:15 HRF-828 plazme pacijenta. Donja desna ploča potvrđuje da doza od 0.064 IU/mL, korištena za svaki pojedini uzorak FVIII u gornje dvije ploče nije bila doza zasićenja.
Slika 29. Metoda probira i potvrđivanja PEGilacije. Gornja ploča prikazuje shemu probira PEGilacije prolazno ekprimiranih PEG muteina. Donja ploča prikazuje Western analizu PEGiliranih produkata korištenjem za teški lanac specifičnih ("H"-specifičnih) antitijela (lijevo) ili za laki lanac specifičnih ("L"-specifičnih) antitijela (desno). PEGilirane vrpce istaknute su točkama. "U" predstavlja neprerađeni materijal koji sadrži i H i L.
Slika 30. Probir PEGilacije PEG15-17. Western analiza PEGiliranih produkata korištenjem za teški lanac specifičnih ("H"-specifičnih) antitijela (R8B12 i 58.12) ili za laki lanac specifičnih ("L"-specifičnih) antitijela (C7F7 i GM). Sva su tri muteina selektivna za teški lanac, s relativnom učinkovitošću PEGilacije PEG15~PEG16>PEG17. PEGilirane vrpce istaknute su točkama. "U" predstavlja neprerađeni materijal koji sadrži i H i L.
Slika 31. Gel koji prikazuje PEGilaciju PEG2+14 kao funkciju koncentracije redukcijskog sredstva. PEG2+14 je bio tretiran sa 67 do 670 uM TCEP kroz 30 minuta pri 4 oC. Redukcijsko sredstvo je bilo uklonjeno spin-kolonom nakon čega je slijedila PEGilacija s 12 kD PEG. Teški i laki lanci FVIII su istaknuti s "H" odnosno "L". Dvije točke ukazuju na PEGilirane teške i lake lance.
Slika 32. Razloženi maseni spektri (engl.: "Deconvoluted Mass Spectra") spoja PEG2+14 tretiranog sa 67 do 670 uM TCEP nakon čega je slijedilo uklanjanje redukcijskog sredstva.
Detaljan opis izuma
Ovaj je izum zasnovan na otkriću da polipeptidi koji imaju djelovanje faktora VIII mogu biti kovalentno vezani na predodređenom mjestu, koje nije N-terminalni amin, za biokompatibilni polimer, te da takvi polipeptidi u osnovi zadržavaju svoje koagulacijsko djelovanje. Nadalje, ti konjugati polipeptida imaju poboljšano vrijeme zadržavanja u optoku krvi i smanjenu antigeničnost. Konjugati izuma imaju prednost nad trenutno u struci poznatim konjugatima koji imaju polimere nasumično vezane za FVIII ili su vezani za N-terminus. Ciljano vezanje omogućuje izvođenje modifikacija koje izbjegavaju regije koje su potrebne za biološko djelovanje i time za zadržavanje osnovnog djelovanja FVIII. Ono također omogućuje da se, kod izvođenja, polimeri vežu na način da blokiraju vezanje na mjesta uključena u klirens FVIII. Ciljano vezanje također omogućuje dobivanje jednolikog produkta, više od heterogenih konjugata koji se trenutno dobivaju u struci nasumičnim vezanjem polimera. Izbjegavanjem vezanja za N-terminalni amin lakog lanca, konjugati ovog izuma izbjegavaju mogući gubitak djelovanja koji dolazi od vezanja liganda za aktivno mjesto FVIII polipeptida. Za N-terminalnu regiju lakog lanca se vjeruje da je uključena u vezanje vWF faktora za FVIII, što u optoku krvi predstavlja stabilizirajuću vezu.
DEFINICIJE
Biokompatibilni polimer. Biokompatibilni polimer uključuje polialkilen okside kao što su, bez ograničavanja, polietilen glikol (PEG), dekstrani, kolominske kiseline ili drugi na ugljikohidratima zasnovani polimeri, polimeri aminokiselina, derivati biotina, polivinil alkohol (PVA), polikarboksilati, polivinilpirolidon, anhidrid polietilen-co-maleinske kiseline, polistiren-co-(anhidrid jabučne kiseline), polioksazolin, poliakriloilmorfolin, heparin, albumin, celuloze, hidrolizati hitosana, škrobovi kao što su hidroksietil škrobovi i hidroksi propil škrobovi, glikogen, agaroze i njihovi derivati, guar guma, pululan, inulin, ksantan guma, karagenan, pektin, hidrolizati alginske kiseline, drugi biopolimeri i svi njihovi ekvivalenti. Preferira se polietilen glikol, a još se više preferira metoksipolietilen glikol (mPEG). Ostali korisni polialkilen glikol spojevi su polipropilen glikoli (PPG), polibutilen glikoli (PBG), PEG-glicidil eteri (Epoks-PEG), PEG-oksikarbonilimidazol (engl. krat.: CDI-PEG), razgranati polietilen glikoli, ravnolančani polietilen glikoli, rašljasti polietilen glikoli i mnogograni ili "super razgranati" polietilen glikoli (zvjezdasti PEG).
Polietilen glikol (PEG). "PEG" i "polietilen glikol" kako se ovdje koriste su međusobno zamjenjivi te uključuju bilo koji u vodi topivi poli(etilen oksid). Tipično, polietilen glikoli za upotrebu u skladu s izumom sadrže slijedeću strukturu "-(OCH2CH2)n-" gdje (n) predstavlja 2 do 4000. Kako se ovdje koristi, PEG također uključuje "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" i "-(OCH2CH2)nO-", zavisno od toga jesu li ili nisu terminalni atomi kisika bili uklonjeni. Kroz opis i zahtjeve treba zapamtiti da pojam "PEG" uključuje strukture koje imaju različite terminalne skupine ili "terminalne zaštitne" skupine, kao što su, bez ograničavanja na to, hidroksil ili C1-20 alkoksi grupe. Pojam "PEG" također označuje polimer koji sadrži većinu, drugim riječima više od 50%, —OCH2CH2—ponavljajućih podjedinica. S obzirom na specifične oblike, PEG može imati bezbroj inačica molekularnih težina, kao i struktura ili geometrija kao što su razgranate, ravnolančane, rašljaste i multifunkcionalne.
PEGilacija. PEGilacija predstavlja postupak pri kojem se polietilen glikol (PEG) kovalentno veže za molekulu kao što je protein.
Aktivirana ili aktivna funkcionalna grupa. Kada je funkcionalna grupa kao što je biokompatibilni polimer opisana kao aktivirana, funkcionalna grupa lako reagira s elektrofilom ili nukleofilom druge molekule.
FVIII s delecijom B domene (BDD). Kako se ovdje koristi, BDD je karakteriziran time da ima aminokiselinski slijed koji se odlikuje delecijom svih osim 14 aminokiselina B-domene faktora VIII. Prve četiri aminokiseline B-domene (SFSQ, slijed br. 1 u popisu sljedova) povezane su na zadnjih 10 ostataka B-domene (NPPVLKRHQR, slijed br. 2 u popisu sljedova). (Lind, P. et al, 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27). BDD koji se ovdje koristi ima aminokiselinski slijed koji odgovara slijedu br. 3 u popisu sljedova.
FVIII. Faktor zgrušavanja krvi VIII (FVIII, faktor VIII) predstavlja glikoprotein sintetiziran i izlučen u optok krvi od strane jetra. U krvnom optoku veže se za von Willebrandov faktor (vWF, također poznat i kao s faktorom VIII povezani antigen) i stvara stabilni kompleks. Nakon aktiviranja trombinom, odvaja se od kompleksa kako bi sudjelovao s ostalim faktorima zgrušavanja u kaskadi zgrušavanja, koja konačno vodi ka stvaranju ugruška. Humani FVIII pune dužine ima aminokiselinski slijed koji odgovara slijedu pod br. 4 iz popisa sljedova, premda su moguće i alelne inačice.
Polipeptid funkcionalni faktor VIII. Kako se ovdje koristi, polipeptid funkcionalni faktor VIII označuje funkcionalni polipeptid ili kombinaciju polipeptida koji su sposobni, in vivo ili in vitro, ispravljati nedostatke humanog faktora VIII karakterizirane, na primjer, hemofilijom A. Faktor VIII ima u prirodnom stanju mnoge degradacijske ili prerađene oblike. Oni su proteolitički dobiveni iz prekursora, jednolančanog proteina, kao što je ovdje pokazano. Polipeptid funkcionalni faktor VIII uključuje takav jednolančani protein te također pruža takve različite degradacijske produkte koji imaju biološko djelovanje ispravljanja nedostataka humanog faktora VIII. Isto tako postoje i alelne varijacije. Polipeptidi funkcionalni faktori VIII uključuju sve takve alelne varijacije, glikozilat inačice, modifikacije i fragmente koji rezultiraju derivatima faktora VIII sve dok one sadrže funkcionalni segment humanog faktora VIII i dok bitno, karakteristično djelovanje humanog faktora VIII ostaje na isti način nepromijenjeno. Ti derivati faktora VIII koji posjeduju nužno funkcionalno djelovanje mogu se lako identificirati jednostavnim, ovdje opisanim, in vitro testovima. Nadalje, polipeptid funkcionalni faktor VIII je sposoban katalizirati prevođenje faktora X u Xa u prisustvu faktora IXa, kalcija, i fosfolipida, kao i ispravljati poremećaj zgrušavanja u plazmi dobivenoj od pojedinaca koji pate od hemofilije A. Fragmenti koji se mogu izvesti cijepanjem DNA pomoću restrikcijskog enzima ili proteolitičkom ili drugačijom razgradnjom proteina humanog faktora VIII stručnjacima će biti očiti iz ovdje objavljenog popisa aminokiselinskih sljedova humanog faktora VIII i funkcionalnih regija.
FIX. Kako se ovdje korist, FIX označuje faktor zgrušavanja IX, koji je također poznat kao humani faktor zgrušavanja IX, ili plazmatska tromboplastinska komponenta.
FX. Kako se ovdje korist, FX označuje faktor zgrušavanja X, koji je također poznat pod imenima humani faktor zgrušavanja X i eponimom Stuart-Prower faktor.
Farmakokinetika. "Farmakokinetika" (engl. krat.: PK) predstavlja pojam koji se koristi za opisivanje značajka apsorpcije, distribucije i metabolizma lijeka u tijelu te eliminacije lijeka iz tijela. Poboljšanje farmakokinetike lijeka označuje poboljšanje onih karakteristika koje čine lijek učinkovitijim in vivo kao terapeutsko sredstvo, osobito njegovog korisnog trajanja u tijelu.
Mutein. Mutein predstavlja genetičkim inženjeringom dobiveni protein koji nastaje kao rezultat laboratorijski potaknute mutacije proteina ili polipeptida.
Protein. Kako se ovdje korist, protein i polipeptid su sinonimi.
Receptor FVIII klirensa. Receptor FVIII klirensa, kako se ovdje koristi, označuje receptorsku regiju na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII koja veže ili se udružuje s jednom ili više drugih molekula što rezultira klirensom faktora VIII iz optoka. Receptori klirensa faktora VIII uključuju bez ograničenja regije molekule FVIII koje vežu LRP, LDL receptor i/ili HSPG.
RASPRAVA
Zamišljeno je da svaki polipeptid funkcionalni faktor VIII može biti mutiran na predodređenom mjestu i zatim kovalentno vezan na tom mjestu za biokompatibilni polimer u skladu s metodama izuma. Korisni polipeptidi uključuju, bez ograničenja, faktor VIII pune dužine koji ima aminokiselinski slijed kao što je prikazano u slijedu pod br. 4 u popisu sljedova te BDD FVIII koji ima aminokiselinski slijed kao što je prikazano u slijedu pod br. 3 u popisu sljedova. Preferira se BDD FVIII.
Biokompatibilni polimer korišten u konjugatima izuma može biti bilo koji gore naveden polimer. Biokompatibilni polimer se bira na način da pruži željeno poboljšanje farmakokinetike. Na primjer, identitet, veličina i struktura polimera se bira tako da poboljša cirkulacijski poluživot polipeptida koji ima djelovanje FVIII ili smanji antigeničnost polipeptida bez neprihvatljivog slabljenja djelovanja. Preferira se da polimer sadrži PEG, a još se više preferira da najmanje 50% njegove molekularne težine otpada na PEG. U jednom uobličenju, polimer predstavlja polietilen glikol terminalno zaštićen s terminalnom zaštitnom skupinom kao što je hidroksil, alkoksi, supstituirani alkoksi, alkenoksi, supstituirani alkenoksi, alkinoksi, supstituirani alkinoksi, ariloksi i supstituirani ariloksi. Još se više preferiraju polimeri koji sadrže metoksipolietilen glikol. Još više se preferiraju polimeri koji sadrže metoksipolietilen glikol čiji je raspon veličine od 3 kD do 100 kD, više se preferira od 5 kD do 64 kD ili od 5 kD do 43 kD.
Preferira se da polimer ima reaktivnu skupinu. Na primjer, u jednom uobličenju, polimer ima sulfhidril reaktivnu skupinu koja može reagirati sa slobodnim cisteinom na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII kako bi se stvorila kovalentna veza. Takve sulfhidril reaktivne skupine uključuju tiol, triflat, tresilat, aziridin, oksiran, S-piridil ili maleimid dijelove. Preferira se maleimid skupina. U jednom uobličenju, polimer je ravnolančani te ima na jednom terminusu "zaštitnu skupinu" koja nije jako reaktivna prema sulfhidrilima (kao što je metoksi) i sulfhidril reaktivnu skupinu na drugom terminusu. U preferiranom uobličenju, konjugat sadrži PEG-maleimid te ima veličinu od 5 kD do 64 kD.
Dalje smjernice za odabiranje korisnih biokompatibilnih polimera su pružene u slijedećim primjerima.
Ciljana mutacija nukleotidnog slijeda koji kodira polipeptid koji ima djelovanje faktora VIII može se izvesti bilo kojom metodom poznatom u struci. Preferirane metode uključuju mutagenezu za uvođenje cisteinskog kodona na mjesto odabrano za kovalentno vezanje polimera. To se može postići korištenjem na tržištu dostupnih kompleta za ciljanu mutagenezu, kao što je Stratagene cQuickChange(TM) II komplet za ciljanu mutagenezu, Clontech Transformer komplet br. K1600-1 za ciljanu mutagenezu, Invitrogen GenTailor sustav br. 12397014 za ciljanu mutagenezu, Promega Altered Sites II komplet br. Q6210 za in vitro mutagenezu, ili Takara Mirus Bio LA PCR komplet za mutagenezu br. TAK RR016.
Konjugati izuma mogu se pripraviti prvo zamjenjivanjem kodona za jednu ili više aminokiselina na površini funkcionalnog polipeptida FVIII kodonom za cistein, stvaranjem cisteinskog muteina u rekombinantnom ekspresijskom sustavu, reagiranjem muteina s reagensom za cistein-specifični polimer, i pročišćavanjem muteina.
U ovom sustavu, dodavanje polimera na mjesto cisteina može se postići kroz maleimid reaktivnu skupinu na polimeru. Primjeri te tehnologije su pruženi dolje. Količina korištenog sulfhidril reaktivnog polimera treba biti barem ekvimolarna molarnoj količini cisteina koji treba derivirati, a preferira se da je prisutan u suvišku. Preferira se da se koristi barem peterostruki molarni suvišak sulfhidril reaktivnog polimera, a još se više preferira da se koristi barem deseterostruki suvišak takvog polimera. Drugi uvjeti korisni za kovalentno vezanje spadaju unutar znanja struke.
U primjerima koji slijede, muteini su nazivani na u struci konvencionalan način. Konvencija za imenovanje mutanata je zasnovana na aminokiselinskom slijedu za konačne faktore VIII pune dužine kakav je pružen pod br. 4 u popisu sljedova. Kao izlučeni protein, FVIII sadrži signalni slijed koji je proteolitički odcjepljen za vrijeme postupka prevođenja. Nakon uklanjanja signalnog slijeda 19 aminokiselina, prva aminokiselina izlučenog FVIII produkta je alanin.
Kao što je konvencionalno i kao što se koristi ovdje, kada se govori o mutiranim aminokiselinama u BDD FVIII, mutirana aminokiselina je označena svojim položajem u slijedu FVIII pune dužine. Na primjer, PEG6 mutein raspravljen dolje je označen s K1808C jer je lizin (K) zamijenjen cisteinom (C) na položaju analognom položaju 1808 u slijedu pune dužine.
Najbolje je predodređeno mjesto za kovalentno vezanje polimera odabrati među mjestima izloženima na površini polipeptida koja nisu uključena u djelovanje FVIII ili u ostale mehanizme koji stabiliziraju FVIII in vivo, kao što je vezanje za vWF. Takva mjesta je također najbolje odabrati među mjestima za koja se zna da su uključena u mehanizam kojim se FVIII deaktivira ili izlučuje iz optoka. Odabir tih mjesta je detaljno raspravljen dolje. Preferirana mjesta uključuju aminokiselinski ostatak na ili blizu mjesta vezanja za (a) protein srodan receptoru lipoproteina niske gustoće, (b) heparin sulfat proteoglikan, (c) receptor lipoproteina niske gustoće i/ili (d) inhibirajuća antitijela faktora VIII. S "na ili blizu mjesta vezanja" označuje se ostatak koji je dovoljno blizu mjestu vezanja da bi kovalentno vezanje biokompatibilnog polimera na to mjesto rezultiralo steričkim zaprječivanjem mjesta vezanja. Očekuje se, na primjer, da se takvo mjesto nalazi unutar 20 Ǻ od mjesta vezanja.
U jednom uobličenju izuma, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid funkcionalni faktor VIII na aminokiselinski ostatak na ili blizu (a) receptora za klirens faktora VIII kao što je definirano gore, (b) mjesta vezanja proteaze koja može razgraditi faktor VIII i/ili (c) mjesta vezanja inhibirajućih antitijela faktora VIII. Proteaza može biti aktivirani protein C (APC). U drugom uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan na predodređeno mjesto na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII na način da je vezanje proteina srodnog receptoru lipoproteina niske gustoće na polipeptid slabije nego na polipeptid kada nije konjugiran, a preferira se je više nego dva puta slabije. U jednom uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan na predodređeno mjesto na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII na način da je vezanje heparin sulfat proteoglikana na polipeptid slabije nego na polipeptid kad nije konjugiran, a preferira se da je više nego dva puta slabije. U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan na predodređeno mjesto na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII na način da je vezanje inhibirajućih antitijela faktora VIII na polipeptid slabije nego na polipeptid kada nije konjugiran, preferira se da je više nego dva puta slabije nego vezanje na polipeptid kada nije konjugiran. U slijedećem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan na predodređeno mjesto na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII na način da je vezanje receptora lipoproteina niske gustoće na polipeptid slabije nego na polipeptid kada nije konjugiran, preferira se više nego dva puta slabije. U slijedećem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan na predodređeno mjesto na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII na način da proteaza iz plazme razgrađuje polipeptid slabije nego kada polipeptide nije konjugiran. U daljem uobličenju, razgradnja polipeptida proteazom iz plazme je više nego dva puta slabija od razgradnje polipeptida kada nije konjugiran, što je izmjereno pod istim uvjetima u istom vremenskom periodu.
Afinitet vezanja LRP-a, LDL receptora ili HSPG-a od strane faktora VIII može se odrediti korištenjem tehnologije rezonancije površinskih plazmona (Biacore). Na primjer, FVIII se može izravno ili neizravno preko FVIII antitijela nanijeti na Biacore(TM) čip, a različite koncentracije LRP mogu biti puštene preko čipa kako bi se izmjerile i vezanja ("on-rate") i brzina interakcije otpuštanja ("off-rate") (Bovenschen N. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7). Omjer te dvije brzine daje mjeru afiniteta. Poželjno je dvostruko, preferira se peterostruko, više se preferira deseterostruko, a još se više preferira 30-erostruko smanjivanje afiniteta nakon PEGilacije.
Razgradnja FVIII proteazom APC može se izmjeriti bilo kojim metodama poznatima stručnjacima.
U jednom uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid na jednom ili više slijedećih aminokiselinskih položaja faktora VIII: 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 i 2284. U slijedećem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid na jednom ili više slijedećih aminokiselinskih položaja faktora VIII: 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 i 2284, te je (1) vezanje konjugata za protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće slabije od vezanja nekonjugiranog polipeptida za protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće; (2) vezanje konjugata za receptor lipoproteina niske gustoće slabije od vezanja nekonjugiranog polipeptida za receptor lipoproteina niske gustoće; ili (3) vezanje konjugata i za protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće i za receptor lipoproteina niske gustoće slabije od vezanja nekonjugiranog polipeptida za protein srodan s receptorom lipoproteina niske gustoće i receptor lipoproteina niske gustoće.
U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid na jednom ili više slijedećih aminokiselinskih položaja faktora VIII: 377, 378, 468, 491, 504, 556 i 711, a vezanje konjugata za heparin sulfat proteoglikan je slabije nego vezanje nekonjugiranog polipeptida za heparin sulfat proteoglikan. U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid na jednom ili više slijedećih aminokiselinskih položaja faktora VIII: 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 i 2284, a konjugat se slabije veže za inhibirajuća antitijela faktora VIII od nekonjugiranog polipeptida. U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za polipeptid na jednom ili više slijedećih aminokiselinskih položaja faktora VIII: 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 i 2284, a preferira se na jednom ili više slijedećih položaja: 377, 378, 468, 491, 504, 556 i 711, a konjugat se slabije razgrađuje proteazom iz plazme sposobnom za razgradnju faktora VIII nego što je to slučaj s nekonjugiranim polipeptidom. Više se preferira da je proteaza iz plazme aktivirani protein C.
U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je kovalentno vezan za faktor VIII s delecijom B-domene, na aminokiselinskim položajima 129, 491, 1804, i/ili 1808, više se preferira na položajima 491 ili 1808. U daljem uobličenju, biokompatibilni polimer je vezan za polipeptid na aminokiselinskom položaju 1804 faktora VIII te sadrži polietilen glikol. Preferira se da je jedno ili više predodređenih mjesta za vezanje biokompatibilnog polimera kontrolirano pomoću ciljane mutacije cisteina.
Jedno ili više mjesta, preferira se jedno ili dva, na polipeptidu funkcionalnom faktoru VIII mogu biti predodređena mjesta za vezanje polimera. U osobitim uobličenjima, polipeptid je monoPEGiliran ili diPEGiliran.
Izum se također odnosi na metodu za pripravljanje konjugata, a koja se sastoji od mutiranja nukleotidnog slijeda koji kodira polipeptid funkcionalni faktor VIII kako bi se na predodređenom mjestu zamijenio kodirajući slijed za cisteinski ostatak; ekspresije mutiranog nukleotidnog slijeda s ciljem proizvodnje cisteinom obogaćenog muteina; pročišćavanja muteina; reagiranja muteina s biokompatibilnim polimerom koji je bio aktiviran kako bi reagirao s polipeptidima u osnovi samo na reduciranim cisteinskim ostacima tako da se dobije konjugat; i pročišćavanja konjugata. U slijedećem uobličenju, izum pruža metodu za ciljanu PEGilaciju muteina faktora VIII, a koja se sastoji od: (a) ekspresije ciljanog muteina faktora VIII pri čemu mutein ima cisteinske zamjene za aminokiselinske ostatke na izloženoj površini muteina faktora VIII te je cistein zaštićen zaštitnom skupinom; (b) dovođenja u kontakt cisteinskog muteina s redukcijskim sredstvom pod uvjetima koji blago reduciraju cisteinski mutein i otpuštaju zaštitnu skupinu; (c) uklanjanja zaštitne skupine i redukcijskog sredstva iz cisteinskog muteina; i (d) najmanje približno 5 minuta, a preferira se najmanje 15 minuta, više se preferira najmanje 30 minuta nakon uklanjanja redukcijskog sredstva, tretiranja cisteinskog muteina s PEG koji sadrži sulfhidril veznu skupinu, pod uvjetima koji dovode do stvaranja PEGiliranog muteina faktora VIII. Sulfhidril vezna skupina PEG-a je odabrana iz grupe koja se sastoji od: tiol, triflat, tresilat, aziridin, oksiran, S-piridil i maleimid skupina, preferira se maleimid.
Izum se također tiče farmaceutskih smjesa za parenteralno davanje koje sadrže terapeutski učinkovite količine konjugata izuma i farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo. Farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva predstavljaju tvari koje se mogu dodati djelatnom sastojku kako bi pomogle formulirati ili stabilizirati pripravak, a ne uzrokuju značajne štetne toksikološke učinke za pacijenta. Primjeri takvih pomoćnih sredstava su dobro poznati stručnjacima, a uključuju vodu, šećere kao što je maltoza ili saharoza, albumin, soli, itd. Druga pomoćna sredstva su opisana na primjer u Remington's Farmaceutical Sciences od E. W. Martina. Takve smjese će sadržavati učinkovitu količinu tog konjugata zajedno s prikladnom količinom nosive tvari s ciljem pripravljanja farmaceutski prihvatljivih smjesa prikladnih za učinkovito davanje subjektu. Na primjer, konjugat se može parenteralno dati subjektima koji pate od hemofilije A u dozi koja može varirati s obzirom na ozbiljnost epizode krvarenja. Prosječne doze dane intravenozno su u rasponu od 40 jedinica po kilogramu za predoperativne indikacije, 15 do 20 jedinica po kilogramu za manje krvarenje, te 20 do 40 jedinica po kilogramu danih kroz 8-satni period za dozu održavanja.
U jednom uobličenju inventivna metoda uključuje zamjenjivanje jedne ili više aminokiselina s površine BDD-a cisteinom, proizvodnju cisteinskog muteina u ekspresijskom sustavu sisavaca, reduciranje cisteina koji je za vrijeme ekspresije bio zaštićen cisteinom iz medija za rast, uklanjanje redukcijskog sredstva kako bi se omogućilo BDD disulfidima da se ponovno formiraju, te reagiranje s reagensom cistein-specifičnim biokompatibilnim polimerom, kao što je PEG-maleimid. Primjeri takvih reagensa su PEG-maleimid s veličinama PEG dijelova od 5, 22, ili 43 kD, a koji su dostupni od strane Nektar Therapeutics of San Carlos, CA pod Nektar kataloškim brojevima 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD, odnosno 2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kD, ili 12 odnosno 33 kD koji su dostupni od strane NOF Corporation, Tokio, Japan pod NOF kataloškim brojevima Sunbright ME-120MA odnosno Sunbright ME-300MA. PEGilirani produkt je pročišćen korištenjem ionsko-izmjenjivačke kromatografije kako bi se uklonili neizreagirani PEG te korištenjem kromatografije isključenjem po veličini za uklanjanje neizreagiranog BDD. Ova se metoda može koristiti za identificiranje i selektivno potiskivanje svih neželjenih interakcija s FVIII kao što je receptorom posredovani klirens, vezanje inhibirajućih antitijela te razgradnja proteolitičkim enzimima. Zamijetili smo da je PEG reagens dobiven od tvrtke Nektar ili NOF kao 5kD po rezultatima testiranja u našem laboratoriju pokazao vrijednost od 6kD, i, slično PEG reagens dobiven kao linearni 20 kD po rezultatima testiranja u našem laboratoriju pokazao vrijednost od 22 kD, onaj dobiven kao 40 kD po rezultatima testiranja u našem laboratoriju pokazao vrijednost od 43 kD, a onaj dobiven kao 60kD po rezultatima testiranja u našem laboratoriju pokazao vrijednost od 64kD. Kako bi se izbjegla zabuna u ovoj raspravi koristimo molekularne težine kao što su pokazali rezultati testiranja u našem laboratoriju, osim za 5 kD PEG, koji navodimo kao 5kD u skladu s podacima proizvođača.
Dodatno cisteinskim mutacijama na položajima 491 i 1808 BDD-a (navedeno gore), položaji 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 i 1804 su bili mutirani u cistein kako bi potencijalno omogućili blokiranje vezanja LRP-a nakon PEGilacije. Također, položaji 377, 378 i 556 su bili mutirani u cistein kako bi se omogućilo blokiranje vezanja i LRP-a i HSPG-a nakon PEGilacije. Položaji 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 i 2284 su bili odabrani tako da budu jednako razmaknuti na BDD kako bi ciljana PEGilacija s velikim PEG molekulama (>40 kD) na tim položajima, zajedno s PEGilacijom na izvornim mjestima glikozilacije (41, 239 i 2118) te mjestima vezanja LRP-a, potpuno prekrila površinu BDD-a i identificirala nove mehanizme klirensa BDD-a.
U jednom uobličenju, medij za kulturu stanica sadrži cisteine koji "zaštićuju" cisteinske ostatke muteina stvaranjem disulfidnih veza. Kod pripravljanja konjugata, cisteinski mutein proizveden rekombinantnim sustavom zaštićen je cisteinom iz medija, a ta se zaštitna skupina uklanja blagom redukcijom koja otpušta zaštitnu skupinu prije dodavanja reagensa cistein-specifičnog polimera. Mogu se također koristiti ostale metode poznate u struci za ciljane mutacije FVIII, kao što će biti očito stručnjacima.
PRIMJERI
ANALIZA ODNOSA STRUKTURE I DJELOVANJA FVIII. FVIII i BDD FVIII predstavljaju vrlo velike kompleksne molekule s mnogo različitih mjesta uključenih u biološke reakcije. Prethodni pokušaji njihovog kovalentnog modificiranja s ciljem poboljšanja farmakokinetičkih značajka dalo je različite rezultate. Bilo je iznenađujuće da se molekule mogu specifično mutirati i da se zatim može dodati polimer na način specifičan za određeno mjesto. Nadalje, rezultati poboljšanih farmakokinetičkih značajka i zadržano djelovanje su također bili iznenađujući, uz probleme s prošlim polimernim konjugatima koji su dovodili do nespecifične adicije i smanjenog djelovanja.
U jednom uobličenju, izum se tiče ciljane mutageneze korištenjem cistein-specifičnih liganda kao što je PEG-maleimid. Nemutirani BDD nema niti jedan dostupan cistein koji bi reagirao s PEG-maleimidom, tako da će samo mutirani cisteinski položaj biti mjesto PEGilacije. Specifičnije, BDD FVIII ima 19 cisteina, od kojih 16 tvore disulfide, a ostala 3 od njih predstavljaju slobodne cisteine (McMullen et al., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746). Strukturni model BDD navodi na to da su sva 3 slobodna cisteina skrivena (Stoilova-McPhie et al., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223). Zbog toga što se oksidirani cisteini ne mogu PEGilirati PEG-maleimidima, 16 cisteina koji tvore disulfide u BDD se ne mogu PEGilirati bez da su prvo reducirani. S obzirom na strukturne modele BDD-a, 3 slobodna cisteina u BDD se ne mogu PEGilirati bez da se prvo denaturira protein kako bi se ti cisteini izložili PEG reagensu. Stoga se ne čini mogućim postići specifičnu PEGilaciju BDD-a PEGilacijom na izvornim cisteinskim ostacima bez da se značajno izmjeni struktura BDD-a, što bi najvjerojatnije zatrlo njegovu funkciju.
Redoks stanje 4 cisteina u B domeni FVIII pune dužine je nepoznato. PEGilacija 4 cisteina u B domeni može biti izvediva ukoliko oni ne tvore disulfide te ako su izloženi na površini. Ipak, zbog toga što FVIII pune dužine i BDD imaju sličan farmakokinetički (PK) profil i slična trajanja poluživota in vivo (Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260), PEGilacija B domene vjerojatno neće rezultirati poboljšanjem poluživota u plazmi osim ako se dogodi da PEG također zaštiti i regije van B domene.
Kako bi se odredilo predodređeno mjesto na polipeptidu koji ima djelovanje FVIII, za vezanje polimera na način da se zadrži djelovanje faktora VIII i poboljša farmakokinetičke značajke, predstavljene su slijedeće smjernice zasnovane na BDD FVIII. Modifikacije trebaju biti usmjerene prema klirensu, inaktiviranju i imunogeničnim mehanizmima kao npr. LRP, HSPG, APC, te mjestima vezanja inhibirajućih antitijela. Stoilova-McPhie. S. et al., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23 prikazuje strukturu BDD-a. Na primjer, kako bi se produžilo poluživot, može se uvesti pojedinačni PEG na specifično mjesto na ili blizu mjesta vezanja LRP-a na A2 ostacima 484-509 i A3 ostacima 1811-1818. Uvođenje glomaznog PEG na tim mjestima poremetilo bi sposobnost FVIII da veže LRP i snizilo klirens FVIII iz optoka. Također se smatra da, da bi se produžio poluživot a da se značajno ne utječe na djelovanje, se PEG može uvesti na ostatak 1648, koji se nalazi na spoju B domene i A3 domene u molekuli pune dužine te na 14-aminokiselinski linker I BDD između A2 i A3 domena.
Specifičnost PEGilacije se može postići pomoću inženjeringa smještajući pojedinačne cisteinske ostatke u A2 ili A3 domene korištenjem tehnika rekombinantne DNA mutageneze nakon čega slijedi ciljana PEGilacija uvedenih cisteina s cistein-specifičnim PEG reagensom kao što je PEG-maleimid. Slijedeća prednost PEGilacije na 484-509 i 1811-1818 je ta da ta dva epitopa predstavljaju dva od tri glavna razreda inhibirajućih antigeničnih mjesta kod pacijenata. Kako bi se postigao maksimalni učinak poboljšanja poluživota u optoku i smanjivanja imunogenog odgovora, i A2 i A3 mjesta vezanja LRP-a mogu biti PEGilirana kako bi se dobio diPEGilirani produkt. Treba zapaziti da PEGilacija unutar 1811-1818 regije može dovesti do značajnog gubitka djelovanja pošto je ta regija također uključena u vezanje FIX. Ciljana PEGilacija unutar 558-565 trebala bi ukinuti vezanje HSPG, ali može također smanjiti djelovanje pošto se ta regija također veže za FIX.
Dodatna mjesta na površini mogu biti PEGilirana kako bi se identificirali novi mehanizmi klirensa FVIII. PEGilacija A2 domene može ponuditi dodatne prednosti na način da se A2 domena odvoji od FVIII nakon aktiviranja te se po svoj prilici uklanja iz optoka brže od ostatka FVIII molekula zbog svoje manje veličine. PEGilirana A2, s druge strane, može biti dovoljno velika da izmakne bubrežnom klirensu te da ima poluživot u plazmi usporedivo s ostatkom FVIII te tako može rekonstituirati aktivirani FVIII in vivo.
IDENTIFIKACIJA MJESTA PEGilacije U A2 i A3 REGIJAMA. Pet položaja (Y487, L491, K496, L504 i Q468 koji odgovaraju položajima PEG1-5) na ili blizu navodne A2 regije vezanja LRP-a je bilo odabrano za primjere ciljane PEGilacije na osnovu visokog stupnja izlaganja na površini i smjeru prema van njihovih Cα-Cβ putanja. Nadalje, ti ostaci su u grubo jednako udaljeni jedan od drugoga u trodimenzionalnoj strukturi molekule, tako da zajedno mogu predstavljati cijelu tu regiju. Osam položaja (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804 koji odgovaraju PEG6-14) na ili blizu navodne A3 regije vezanja LRP-a je bilo odabrano za primjer ciljane PEGilacije. PEG6 (K1808) se nalazi do 1811-1818 i prirodnog mjesta N-vezane glikozilacije na 1810. PEGilacija na položaju 1810 (PEG7) zamijenit će šećer s PEG. Mutacija na PEG8 položaju T1812 će također ukinuti mjesto glikozilacije. Premda je za položaj PEG9 (K1813) predviđeno da bude usmjereno prema unutra, odabran je u slučaju da strukturni model nije točan. PEG10 (Y1815) je glomazna hidrofobna aminokiselina unutar petlje vezanja LRP-a, te može biti kritični interaktivni ostatak pošto se hidrofobne aminokiseline tipično nalaze u sredini interakcija protein-protein. Zbog toga što je za 1811-1818 regiju bilo nađeno da je uključena i u vezanje LRP-a i faktora IX, mislilo se da PEGilacija unutar te petlje moguće rezultira smanjenim djelovanjem. Stoga je za PEG11-PEG14 (1795, 1796, 1803, 1804) bilo zamišljeno da se nalaze blizu 1811-1818 petlje ali ne unutar petlje tako da se vezanje LRP-a i faktora IX može odijeliti različitim veličinama PEG-a.
Za blokiranje oba mjesta vezanja LRP-a istovremeno, može se izvesti dvostruka PEGilacija na, primjerice, PEG2 i PEG6 položajima.
Pošto je za 558-565 regiju bilo pokazano da veže i HSPG i FIX, unutar te regije nije predviđeno niti jedno mjesto. Umjesto toga su predviđeni PEG15-PEG17 (377, 378 i 556) između A2 regija vezanja LRP-a i HSPG-a tako da se vezani PEG može umiješati u obje interakcije i poremetiti moguće interakcije između njih. Dodatna mjesta koja su izložena na površini i okrenuta prema van mogu se također odabrati unutar ili blizu regija vezanja LRP-a i HPSG-a. Za identificiranje novih mehanizama klirensa, FVIII može biti sistematski PEGiliran. Dodatno PEG1-17, mogu se koristiti druga tri prirodna mjesta glikozilacije, to jest N41, N239 i N2118 što odgovara PEG 18-20, kao vezne točke za PEGilaciju pošto one trebaju biti izložene na površini. Površinska područja unutar radijusa od 20 angstrema od Cβ atoma PEG2, PEG6 i četiri mjesta glikozilacije mapirana su na BDD modelu dodatno mjestima funkcionalne interakcije s vWF, FIX, FX, fosfolipidom i trombinom.
PEG21-29 što odgovara Y81, F129, K422, K523, K570, N1864, T1911, Q2091 i Q2284 su tada bili odabrani na osnovu njihove sposobnosti da prekriju gotovo cijelu preostalu površinu BDD s radijusom od 20 angstrema od svakog pojedinog njihovog Cβ atoma. Ti su položaji također bili odabrani zbog toga što su potpuno izloženi, okrenuti prema van, i vrlo udaljeni od prirodnih cisteina kako bi se minimaliziralo moguće nepravilno stvaranje disulfida. Radijus od 20 angstrema je odabran zbog toga što se za veliki PEG, kao što je razgranati PEG od 64 kD, očekuje da ima potencijal da pokrije područje s radijusom od približno 20 angstrema. PEGilacija PEG21-29 zajedno s PEG2 i PEG6 i mjestima glikozilacije PEG 18, 19 i 20 vjerojatno će zaštititi skoro cijelu nefunkcionalnu površinu FVIII.
Položaji PEGilacije koji dovode do poboljšanih značajka kao što su poboljšani PK profil, veća stabilnost, ili smanjena imunogeničnost mogu se kombinirati kako bi se stvorio višestruko PEGilirani produkt s maksimalno poboljšanim značajkama. PEG30 i PEG31 su izvedeni uklanjanjem izloženih disulfida u A2 odnosno A3 domeni. PEG30, ili C630A treba za PEGilaciju osloboditi svog disulfidnog partnera C711. Isto tako, PEG31, C1899A treba omogućiti da se C1903 PEGilira.
MUTAGENEZA. Supstrati za ciljanu PEGilaciju faktora VIII mogu se dobiti uvođenjem cisteinskog kodona na mjesto odabrano za PEGilaciju. Stratagene cQuickChangeTM II komplet za ciljanu mutagenezu je korišten za izvedbu svih PEG mutanata (Stratagene komplet 200523 od Stratagene Corporation, La Jolla, CA). Metoda cKvikChangeTM ciljane mutageneze je izvedena korištenjem PfuTurbo® DNA polimeraze i kontrolera temperaturnog ciklusa. Dvije komplementarne oligonukleotidne početnice (engl.: "primer"), koje sadrže željene mutacije, produžene su korištenjem PfuTurbo, pri čemu se početnice ne razmještaju. Kao kalup je korištena dsDNA (dvolančana DNA) koja sadrži gen divljeg tipa FVIII. Nakon višestrukih ciklusa produžavanja, produkt je digestiran s Dpnl endonukleazom, koja je specifična za metiliranu DNA. Iznova sintetizirana DNA, koja sadrži mutaciju, nije metilirana, dok je roditeljska DNA divljeg tipa metilirana. Digestirana DNA se tada koristi za transformiranje XL-1 Blue super-kompetentnih stanica.
Učinkovitost mutageneze je skoro 80%. Reakcije mutageneze su bile izvedene bilo u pSK207+BDD C2.6 bilo u pSK207+BDD (slika 1). Uspješna mutageneza je potvrđena sekvenciranjem DNA, a odgovarajući fragmenti, koji sadrže mutaciju, bili su preneseni u glavni lanac FVIII ekspresijskim vektorom sisavaca pSS207+BDD. Nakon prijenosa, sve su mutacije bile ponovno sekvencijski potvrđene. Za A3 muteine PEG 6, 7, 8, 9, i 10, mutageneza je bila izvedena u vektoru pSK207+BDD C2.6. Nakon potvrde sekvenciranjem, mutirani fragment, Kpnl/Pme je bio subkloniran u pSK207+BDD. BDD mutein je zatim subkloniran u pSS207+BDD ekspresijski vektor. Za A3 muteine PEG 11, 12, 13, 14, mutageneza je bila izvedena izravno u vektoru pSK207+BDD a na osnovu slijeda potvrđeni mutant BDD je zatim bio subkloniran u pSS207+BDD. Za A2 muteine PEG 1, 2, 3, 4, 5, mutageneza je bila izvedena u pSK207+ BDD C2.6 vektoru. Mutant potvrđenog slijeda bio je subkloniran u pSK207+BDD i zatim u pSS207+BDD.
POPIS POČETNICA (SAMO KODIRAJUĆI LANAC) KORIŠTENIH ZA MUTAGENEZU U SVAKOJ POJEDINOJ REAKCIJI:
PEG1, Y487C: GATGTCCGTCCTTTGTGCTCAAGGAGATTACCA (slijed br. 5 u popisu sljedova)
PEG2, L491C: TTGTATTCAAGGAGATGCCCAAAAGGTGTAAAAC (slijed br. 6 u popisu sljedova)
PEG3, K496C: TTACCAAAAGGTGTATGCCATTTGAAGGATTTTC (slijed br. 7 u popisu sljedova)
PEG4, L504C: AAGGATTTTCCAATTTGCCCAGGAGAAATATTC (slijed br. 8 u popisu sljedova)
PEG5, Q468C: GATTATATTTAAGAATTGCGCAAGCAGACCATAT (slijed br. 9 u popisu sljedova)
PEG6, K1808C: TAGAAAAAACTTTGTCTGCCCTAATGAAACCAAAAC (slijed br. 10 u popisu sljedova)
PEG7, N1810C: AACTTTGTCAAGCCTTGCGAAACCAAAACTTAC (slijed br. 11 u popisu sljedova)
PEG8, T1812C: GTCAAGCCTAATGAATGCAAAACTTACTTTTGGA (slijed br. 12 u popisu sljedova)
PEG9, K1813C: CAAGCCTAATGAAACCTGCACTTACTTTTGGAAAG (slijed br. 13 u popisu sljedova)
PEG10, Y1815C: CTAATGAAACCAAAACTTGCTTTTGGAAAGTGCAAC (slijed br. 14 u popisu sljedova)
PEG11, D1795C: ATTTCTTATGAGGAATGCCAGAGGCAAGGAGCA (slijed br. 15 u popisu sljedova)
PEG12, Q1796C: TCTTATGAGGAAGATTGCAGGCAAGGAGCAGAA (slijed br. 16 u popisu sljedova)
PEG13, R1803C: CAAGGAGCAGAACCTTGCAAAAACTTTGTCAAGCCT (slijed br. 17 u popisu sljedova)
PEG14, K1804C: GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (slijed br. 18 u popisu sljedova)
PEG15, K377C: CGCTCAGTTGCCAAGTGTCATCCTAAAACTTGG (slijed br. 19 u popisu sljedova)
PEG16, H378C: TCAGTTGCCAAGAAGTGTCCTAAAACTTGGGTA (slijed br. 20 u popisu sljedova)
PEG17, K556C CTCCTCATCTGCTACTGCGAATCTGTAGATCAA (slijed br. 21 u popisu sljedova)
PEG18, N41C: CAAAATCTTTTCCATTCTGCACCTCAGTCGTGTAC (slijed br. 22 u popisu sljedova)
PEG19, N239C: GTCAATGGTTATGTATGCAGGTCTCTGCCAGGT (slijed br. 23 u popisu sljedova)
PEG20, N2118C: CAGACTTATCGAGGATGTTCCACTGGAACCTTA (slijed br. 24 u popisu sljedova)
PEG21, Y81C: ATCCAGGCTGAGGTTTGTGATACAGTGGTCATT (slijed br. 25 u popisu sljedova)
PEG22, F129C: GAAGATGATAAAGTCTGTCCTGGTGGAAGCCAT (slijed br. 26 u popisu sljedova)
PEG23, K422C: CAGCGGATTGGTAGGTGTTACAAAAAAGTCCGA (slijed br. 27 u popisu sljedova)
PEG24, K523C: GAAGATGGGCCAACTTGCTCAGATCCTCGGTGC (slijed br. 28 u popisu sljedova)
PEG25, K570C: CAGATAATGTCAGACTGCAGGAATGTCATCCTG (slijed br. 29 u popisu sljedova)
PEG26, N1864C: CACACTAACACACTGTGTCCTGCTCATGGGAGA (slijed br. 30 u popisu sljedova)
PEG27, T1911C, CAGATGGAAGATCCCTGCTTTAAAGAGAATTAT (slijed br. 31 u popisu sljedova)
PEG28, Q2091C: ACCCAGGGTGCCCGTTGCAAGTTCTCCAGCCTC (slijed br. 32 u popisu sljedova)
PEG29, Q2284C: AAAGTAAAGGTTTTTTGCGGAAATCAAGACTCC (slijed br. 33 u popisu sljedova)
PEG30, C630A: TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA (slijed br. 34 u popisu sljedova)
PEG31, C1899A: AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT (slijed br. 35 u popisu sljedova)
EKSPRESIJA MUTEINA. Nakon umetanja u vektor koji prenosi otpornost na Higromicin B, PEG muteini su bili transfektirani u HKB11 stanice (US Patent 6,136,599) kompleksirani s 293 Fectin Transfection Reagent (Invitrogen Corp. Cat#12347-019) prema uputama proizvođača. Ekspresija FVIII tri dana nakon transfekcije bila je ocijenjena Coatest kromogenom analizom (Chromogenix Corp. Cat#821033, vidi Primjer 12 kromogena analiza) (tablica 1). Transfektirane stanice su zatim bile stavljene pod selektivni tlak s 50 g/ml Hyg B u mediju za rast kojemu je dodano 5% FBS. Kada su se pojavile na Hyg B otporne kolonije, one su bile ručno sakupljene te je učinjen probir na FVIII ekspresiju pomoću Coatest kromogene analize. Stanice sa stabilnom ekspresijom FVIII su zatim prilagođene mediju koji sadrži dodatak HPPS-a. Stanice su bile razmnožene i nacijepljene pri koncentraciji od 1 X 106 stanica/ml u tikvice sa svježim medijem podvrgnute trešnji. Tekućina kulture tkiva (engl.: "Tissue culture fluid", TCF), sakupljena nakon 3 dana, korištena je za pročišćavanje FVIII BDD muteina. Djelovanje faktora VIII iz TCF analizirana je pomoću Coatest-a (tablica 1).
Sažeti pregled PEG Mutein Titara
[image]
Tablica 1. Razina ekspresije PEG muteina iz prolaznih i stabilnih transfekcija.
PROČIŠĆAVANJE MUTEINA. Nakon sakupljanja supernatanta stanične kulture koji sadrži izlučeni protein mutein FVIII, supernatant je filtriran kroz 0,2 mikronski membranski filter kako bi se uklonile sve preostale stanice. Supernatant je zatim koncentriran bilo ultrafiltracijom bilo anionskom izmjenom. Zatim je proveden kroz imunoafinitetnu kolonu gdje su uklonjene komponente medija za kulturu stanica i većina proteinskih nečistoća stanica domaćina. Eluat iz imunoafinitetne kolone je zatim podvrgnut puferskim izmjenjivanjem pomoću diafiltracije u formulacijski pufer koji sadrži saharozu, te zamrznut. Prinos i rekuperacija proteina kroz kolonu monoklonskog FVIII antitijela bili su procijenjeni pomoću kromogene analize. Uzorci punjenja, protoka, razne frakcije eluata, cijeđenja, i diafiltrirani eluat provedene kromatografije bili su analizirani na djelovanje FVIII (tablica 2). Tablica 2 prikazuje rekuperaciju PEG2 muteina iz kolone monoklonskog antitijela. Antitijela predstavljaju C7F7 antitijela. Postotak rekuperacije u tablici 2 određen je pomoću kromogene analize. Konačan prinos je bio 73%. Na slici 2 prikazan je grafikon UV apsorpcije kod 280nm s obzirom na vrijeme, za PEG2 protein pročišćen kroz kromatografsku kolonu monoklonskog FVIII antitijela. Kromatografija je bila provedena korištenjem AKTA® Explorer 100 kromatografskog sustava od Amersham Bioscience. Taj uređaj opremljen je monitorom koji prikazuje više valnih duljina UV i vidljivog zračenja, kao i dvomilimetarskom protočnom stanicom. PEG2 mutein eluiran je iz kolone u prisustvu visoke koncentracije soli, a elucijski vršni nalaz je naznačen i apsorpcijom kod 280nm i analizom djelovanja FVIII.
[image]
Tablica 2. Rekuperacija PEG 2 muteina iz kolone monoklonskog FVIII antitijela.
PEGILACIJA. Izvorni FVIII pune dužine ili BDD ne može se PEGilirati cistein-specifičnim PEG-ima bez redukcije i denaturacije uz preko stostruki suvišak PEG-a: omjer proteina (podaci nisu prikazani), potvrđuju hipotezu zasnovanu na strukturnom modelu BDD po kojem svi izvorni cisteini tvore disulfide ili su skriveni unutar FVIII. FVIII cisteinski muteini eksprimirani i pročišćeni korištenjem standardnih gore popisanih protokola ne mogu se PEGilirati s cistein-specifičnim PEG maleimid reagensom, vjerojatno zbog toga što je uvedeni FVIII cistein "zaštićen zaštitnom skupinom", u reakciji sa sulfhidril grupama kao što je cistein i β-merkaptoetanol koji je prisutan u podlozi za rast stanica. To se pitanje potencijalno može riješiti eliminiranjem cisteina i β-merkaptoetanola iz podloge za kulturu stanica, ali to može dovesti do niže produkcije FVIII te neće spriječiti sulfhidrile otpuštene iz stanica da blokiraju uvedeni FVIII cistein.
U slijedećem aspektu izuma, bila je razvijena metoda u tri koraka za omogućavanje ciljane PEGilacije FVIII (slika 3). U koraku 1, pročišćeni FVIII cisteinski mutein, približno 1 μM, je blago reduciran s redukcijskim sredstvima kao što je približno 0.7 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP) ili 0.07 mM ditiotreitola (DTT) kroz 30 minuta kod 4ºC kako bi otpustio "zaštitnu skupinu". U koraku 2, redukcijsko sredstvo se uklanja zajedno sa "zaštitnom skupinom" pomoću metode kromatografije isključenjem po veličini (engl.: "size-exclusion chromatography", SEC), kao što je provođenjem uzorka kroz spin kolonu (BioRad®) kako bi se omogućilo FVIII disulfidima da se ponovno formiraju u isto vrijeme ostavljajući uvedeni cistein slobodan i reduciran. U koraku 3, najmanje 30 minuta nakon uklanjanja redukcijskog sredstva, oslobođeni FVIII cisteinski mutein tretira se s najmanje 10-erostrukim molarnim suviškom PEG-maleimida veličina u rasponu od 5 do 64 kD (Nektar Therapeutics i N.O.F. Corporation) kroz najmanje 1 sat pri 4ºC. Ova metoda prinosi visoko konzistentni profil produkta s podacima koji se mogu reproducirati u desecima reakcija ponavljanih od strane raznih pojedinca.
Pošto metoda spin kolone za uklanjanje TCEP nije kvantitativna, odabrana je gel filtracijska kromatografija s odsoljivanjem. Ipak, nakon testiranja te metode korištenjem uzorka s dodanim TCEP standardom, bilo je pokazano da je TCEP eluiran u mjerljivim razinama i kod pražnjenja kolone, a ne samo u frakciji soli, kao što bi se očekivalo od molekule tako male molekularne težine. Western Blot analize pokazale su značajnu pozadinsku PEGilaciju vjerojatno uzrokovanu nepotpunim uklanjanjem TCEP-a. U međuvremenu su zasebni eksperimenti pokazali da se od C7F7 pročišćeni materijal može značajno dalje pročistiti od drugih proteinskih nečistoća korištenjem medija kromatografskog anionskog izmjenjivača kombiniranog s gradijentom soli. Tada je odlučeno reducirati C7F7 materijal s TCEP kao što je opisano gore i zatim provesti materijal kroz kolonu anionskog izmjenjivača. Zbog razlike u naboju, FVIII protein bi bio zadržan dok bi TCEP tekao kroz kolonu i ne bi bio zadržan. Za vrijeme elucije gradijenta soli, FVIII protein bio bi pročišćen od većine preostalih proteinskih nečistoća. To je značilo da bi kasnija PEGilacija bila teoretski homogenija s čišćim početnim materijalom. Ipak, nakon testiranja uzorkom s dodanim TCEP standardom, bilo je pokazano da mjerljive razine TCEP eluiraju u gradijentu s FVIII. Stoga je odlučeno da se provede gel filtracijska kromatografija s odsoljivanjem nakon kromatografije s anionskim izmjenjivačem tako da bi ta dva koraka kada se koriste jedan za drugim rezultirala potpunim uklanjanjem TCEP-a i eliminacijom nespecifične PEGilacije.
ANALIZA PEGILACIJE POMOĆU SDS PAGE I WESTERN BLOT. PEGilirani produkt može se analizirati pomoću elektroforeze na reducirajućem 6% TrisGlicin SDS poliakrilamid gelu (Invitrogen). Nakon elektroforeze, gel se može obojiti s Coomassie Blue kako bi se identificirali svi proteini ili se može podvrgnuti standardnom Western Blot protokolu kako bi se identificirali uzorci PEGilacije na različitim regijama FVIII. Bojanje uzorka mišjim monoklonskim R8B12 ili C7F7 antitijelom izvedenima tako da se vežu na C-terminalnu regiju teškog lanca FVIII odnosno na N-terminalnu regiju lakog lanca VIII, trebalo bi identificirati PEGilaciju odnosnih lanaca. Bojanje s 413 antitijelom koje se veže na 484-509 regiju faktora VIII odredit će je li PEGilacija zaista ciljana ili nije, kod muteina kao što su PEG1-4. Isto tako, bojanje s CLB-CAg A antitijelom koje prepoznaje 1801-1823 regiju faktora VIII odrediti će je li PEGilacija ciljana ili nije, za muteine kao što su PEG6-10.
Za PEG2 (L491C) PEGilaciju je pokazano da je selektivna za teški, a ne za laki lanac te da je posebno selektivna za 484-509 regiju (slika 4) dok je za PEG6 (K1808C) pokazano da je selektivna za laki, a ne teški lanac (slika 5).
Za ispitivanje prikazano na slici 4, PEG2 mutein (stupci 1 i 8) je reduciran s TCEP nakon čega je slijedilo uklanjanje TCEP-a (stupci 2 i 9) i tretiranje s 5, 12, 22, 33 ili 43 kD PEG-maleimidom (stupci 3-7 i 10-14). NePEGilirani FVIII se pokazuje kao vrpce neprerađenih (H+L) i prerađenih teških (H) i lakih (L) lanaca. Sve tri vrpce se mogu odrediti na s Coomassie Blue obojanom gelu (dolje desno) dok Western Staining metoda bojanja sa za lance specifičnim antitijelima otkriva samo neprerađeni i odgovarajući lanac. Korištenjem R8B12 bojanja (gore lijevo), vrpca teškog lanca (H) je znatno smanjenog intenziteta kada se PEG2 tretira s PEG-maleimidom, a stvara se nova vrpca koja pokazuje veću vrijednost od roditeljske H vrpce, proporcionalno veličini PEG-a. Korištenjem C7F7 bojanja (dolje lijevo), vrpce lakog lanca (L) (vrpca je više zbog heterogene glikozilacije) ne mijenjaju intenzitet. Vrpca neprerađenih H+L za oba bojanja su pomaknute zbog toga što H lanac predstavlja dio neprerađenog FVIII. Coomassie bojanje također potvrđuje puno više PEGilacije teškog lanca, to jest smanjivanje intenziteta vrpce H, nego lakog lanca. Konačno, PEGilirane vrpce gube relativno više intenziteta kod bojanja antitijelom 413 (gore desno) nego kod R8B12 bojanja na način ovisan o veličini PEG-a vjerojatno zbog ciljane PEGilacije 491, što blokira vezanje antitijela 413 na 484-509. Količine FVIII punjenja po stupcu su približno 30 ng za dva lijeva gela, približno 1000 ng za gornji desni gel, te približno 2000 ng za donji desni gel.
Redukcija nakon koje slijedi uklanjanje redukcijskog sredstva ne mijenja migraciju FVIII (usp. stupce 1 i 2 te 8 i 9). Dodavanje 22kD PEG u PEG2 blokira vezanje antitijela 413, što je u skladu sa specifičnom PEGilacijom na položaju 491 (slika 4 gel gore desno). To također navodi na zaključak da će PEGilirani PEG2 imati nižu imunogeničnost kod čovjeka zbog toga što se za antitijelo 413 pokazalo da dijeli isti epitop kao humana A2 inhibirajuća antitijela (Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, pp. 665-71).
Za ispitivanje prikazano na slici 5, PEG6 mutein je reduciran s TCEP nakon čega je slijedilo uklanjanje TCEP-a (stupci 1 i 6) i tretiranje s 5, 12, 22, ili 33 kD PEG-maleimidom (stupci 2-5 i 7-10). NePEGilirani FVIII se pokazuje kao vrpce neprerađenih (H+L) i prerađenih teških (H) i lakih (L) lanaca. Zbog toga što PEG6 (K1808) mutacija odsjeda na laki lanac, PEGilacija je bila utvrđena samo na lakom lancu, a ne na teškom lancu. Količina FVIII punjenja po stupcu je približno 100 ng za lijevi gel i približno 30 ng za desni gel.
BDD koji je korišten kao kontrola nije pokazao značajne PEGilacije nakon tretiranja s više nego stostrukim molarnim suviškom PEG-maleimida čak i nakon redukcije i postupka uklanjanja redukcijskog sredstva opisanog gore (slika 6a). Ista je metoda također primijenjena na PEG4 i PEG5 (slika 6a). U usporedbi s PEG2, ti muteini nisu bili toliko učinkovito PEGilirani, ali su bili selektivni za teški lanac slično kao PEG2 (L491C). Učinkovitost PEGilacije PEG6 (K1808C) je relativno niska, možda zbog toga što se nalazi vrlo blizu mjesta N-vezane glikozilacije na N1810, što može blokirati PEGilaciju na položaju 1808. Stoga smo oblikovali PEG7 (N1810C) kako bi uklonili izvorno mjesto glikozilacije na 1810. PEG7 pokazuje poboljšanu učinkovitost PEGilacije u usporedbi "jedan na jedan" s PEG6 (slika 6b). Slično, PEG 15 pokazuje malo bolju učinkovitost PEGilacije od PEG2. PEG2+6, dvostruki mutant BDD-a, može se PEGilirati i na teškom i na lakom lancu pošto PEG2 predstavlja cisteinsku mutaciju teškog lanca dok PEG6 predstavlja mutaciju lakog lanca (slika 6c). Ta metoda je također primijenjena na divlji tip FVIII pune dužine (slika 6d). PEGilacija je dokazana za najveći fragment teškog lanca koji uključuje A1, A2, i većinu B domene. Uzorak PEGilacije sugerira monoPEGilaciju te da se radi samo o PEGilaciji jednog cisteina.
ANALIZA PEGILACIJE CIJEPANJEM TROMBINOM I WESTERN BLOT ANALIZOM. PEGilirani produkt može se tretirati trombinom (40 IU/ug FVIII) pri 37 ºC kroz 30 minuta. Korišteni trombin također sadrži APC kao kontaminant. Cijepanje trombinom stvoriti će 50 kD A1 i 43 kD A2 domene od teškog lanca dok će cijepanje APC-om dalje podijeliti A2 domenu u fragmente od 21 i 22 kD (slika 7). Bojanje R8B12 antitijelom, koje prepoznaje C-terminus teškog lanca, identificirati će samo intaktnu A2 domenu i 21 kD C-terminalni fragment (FVIII 562-740). Stoga, ako je PEG2 PEGilacija bila specifična za položaj 491, 43 kD A2 domena bi trebala biti PEGilirana, ali ne i 21 kD C-terminalni fragment. To je i potvrđeno Western blot analizom 22 kD PEGiliranog PEG2, što je prikazano na slici 7. Tako je, eliminacijom, PEG2 PEGilacija bila lokalizirana na N-terminalni fragment od 22 kD (FVIII 373-561) A2 domene. Pošto je PEG-maleimid potpuno selektivan za cisteine pri pH 6.8, a jedini cisteini izvornog FVIII unutar 373-561 dolaze od skrivenih disulfida između 528 i 554, PEG2 je vrlo vjerojatno PEGiliran na uvedenom cisteinu na položaju 491. Western bojanje trombinom tretiranog PEGiliranog PEG2 s antitijelima N-terminalnog dijela teškog lanca FVIII pokazalo je da nema PEGilacije A1 domene (podaci nisu prikazani). Selektivna PEGilacija PEG2 korištenjem metode cijepanja trombinom također je bila potvrđena za molekule PEG od 5, 12, 33 i 43 kD (podaci nisu prikazani). Cijepanje PEGiliranog divljeg tipa FVIII pune dužine trombinom prikazuje da je samo B domena PEGilirana (slika 8).
ANALIZA PEGILACIJE BOJANJEM JODOM. Kako bi se potvrdilo da su novostvorene vrpce kod Coomassie Blue i Western bojanja bile zaista PEGilirane vrpce, korišteno je barij-jod bojanje, koje je specifično za PEG (slika 9). PEGilirani PEG2 je ispitan na 6% TrisGlicine gelu (Invitrogen) i obojan s R8B12 antitijelima za teški lanac ili s barij-jod otopinom (Lee et al, Pharm Dev Technol. 1999 4:269-275). PEGilirane vrpce usklađene su između dva bojanja korištenjem za poklapanje biljega molekularne mase, te su time potvrdile PEGilaciju teškog lanca FVIII.
ANALIZA PEGILACIJE POMOĆU MALDI MASENE SPEKTROMETRIJE. Za potvrđivanje PEGilacije A2 domene teškog lanca, bio je analiziran rFVIII uzorak prije i nakon PEGilacije pomoću MALDI (matricom potpomognuta laserska desorpcija/ionizacija) masene spektrometrije. Uzorci su bili pomiješani i kristalizirani na MALDI podlozi-meti sa matricom sinapinske kiseline u 30%-tnom acetonitrilu, 0.1% TFA. Zatim su bili analizirani u Voyager DE-PRO spektrometru u pozitivnom, linearnom modu. Rezultati, prikazani na slici 10, pokazuju laki lanac PEG2 centriran kod 83 kD i teški lanac (HC) kod 89 kD. Spektar dobiven za PEGilirani uzorak pokazuje pad u HC vršnom nalazu i stvaranje novog vršnog nalaza centriranog kod 111 kD. To potvrđuje PEGilaciju teškog lanca. Iznad granične razine detekcije nije opažen PEGilirani laki lanac (kod 105 kD).
Oba su uzorka zatim bila podvrgnuta trombinskoj digestiji uz 20 jedinica trombina/mg FVIII kod 37 ºC kroz 30 minuta, nakon čega slijedi određivanje koncentracije FVIII pomoću analize aminokiselina (Commonwealth Biotechnologies, Inc). Teški lanac je rascijepljen u 46 kD (A1) N-terminalnu frakciju i 43 kD (A2) frakciju. MALDI spektar dobiven za PEGilirani uzorak (slika 11) prikazuje nestanak vršnog nalaza kod 43 kD i razvoj novog vršnog nalaza kod 65 kD, zbog PEGilirane A2 domene. PEGilacija LC ponovno nije utvrđena iznad granične razine detekcije. Ti rezultati ponovno potvrđuju PEGilaciju A2 domene faktora VIII. Ista je analiza primijenjena na PEGilirani PEG6, te je potvrdila PEGilaciju fragmenta A3C1C2 lakog lanca (slika 12).
MJERENJE DJELOVANJA
ANALIZA ZGRUŠAVANJA. Ispitna metoda zgrušavanja FVIII:C je analiza u jednom koraku zasnovana na aktiviranom parcijalnom tromboplastinskom vremenu (APTV). FVIII djeluje kao kofaktor u prisustvu faktora IXa, kalcija i fosfolipida kod enzimatskog prevođenja faktora X u Xa. U toj analizi, razrijeđeni ispitni uzorci su inkubirani kod 37 ºC s mješavinom supstrata plazme kojoj nedostaje FVIII i s APTV reagensom. Kalcijev klorid se dodaje inkubiranoj mješavini te je inicirano zgrušavanje. Vrijeme (u sekundama) potrebno za formiranje ugruška i logaritam koncentracije FVIII:C obrnuto su proporcionalni. Razine djelovanja nepoznatih uzoraka su interpolirane uspoređivanjem vremena zgrušavanja raznih razrjeđenja ispitnog materijala s krivuljom dobivenom iz niza razrjeđenja standardnog materijala poznatog djelovanja te su prikazane u međunarodnim jedinicama po mL (IU/mL).
KROMOGENA ANALIZA. Metoda kromogene analize sastoji se od dva uzastopna koraka pri čemu je intenzitet boje proporcionalan djelovanju FVIII. U prvom koraku, faktor X se aktivira do FXa pomoću FIXa njegovim kofaktorom, FVIIIa, u prisustvu optimalnih količina kalcijevih iona i fosfolipida. Prisutan je suvišak količina faktora X tako da brzina aktiviranja faktora X ovisi samo o količini FVIII. U drugom koraku, faktor Xa hidrolizira kromogeni supstrat kako bi se dobio kromofor, a intenzitet boje se očita fotometrički kod 405 nm. Izračunat je učinak nepoznatih uzoraka, a vrijednost analize je provjerena pomoću statističke metode "slope-ratio". Djelovanje je prikazano u međunarodnim jedinicama po mL (IU/mL).
Petlja 1811-1818 je uključena u vezanje za FIX, ali važnost pojedinih položaja unutar te petlje nije bila određena. PEG7-10 muteini pokazuju skoro istovjetno specifično kromogeno djelovanje u odnosu na izvorni FVIII (tablica 3). Tablica 3 prikazuje postotak specifičnog djelovanja (engl.: "specific activity", S.A.) PEG muteina i PEGiliranog PEG2 ili PEG6 u odnosu na BDD. S.A. je bio određen dijeljenjem kromogena, zgrušavanja, ili djelovanja vezanja vWF s ukupnom antigen ELISA (TAE) vrijednošću. S.A. PEGiliranih muteina je zatim podijeljen sa S.A. BDD-a (8 IU/ug kromogen, 5 IU/ug zgrušavanje, i 1 vWF/TAE) i pomnožen sa 100 kako bi se dobio postotak S. A. iznesen u tablici 3 u stupcima kromogen, zgrušavanje i vWF/TAE.
[image] Tablica 3. Postotak specifičnog djelovanja (S.A.) PEG muteina i PEGiliranog PEG2 i PEG6 u odnosu na BDD.
Kao što se koristi u tablici 3, "PEG2 red." predstavlja PEG2 mutein koji je bio tretiran s redukcijskim sredstvom nakon čega je slijedilo uklanjanje redukcijskog sredstva. Taj postupak redukcije nije značajno izmijenio tri funkcionalna djelovanja faktora VIII. PEG2 mutein konjugiran na PEG u rasponu od 5 kD (PEG2-5kD) do 43 kD (PEG2-43kD) nije izgubio značajne količine kromogenog djelovanja, ali ima uvelike sniženo djelovanje zgrušavanja čim veličina PEG poraste iznad 5 kD. Također može postojati umjereno smanjivanje vezanja vWF kod većeg PEGiliranog PEG2.
ELISA ZA UKUPNE ANTIGENE (engl.: "TOTAL ANTIGEN ELISA", TAE). FVIII je smješten na mikrotitar ploču koja je bila presvučena s poliklonskim FVIII antitijelom. Vezani FVIII je određen s biotiniliranim poliklonskim rFVIII antitijelom i konjugatom streptavidin peroksidaze hrena (engl. krat.: HRP). Kompleks peroksidaza-streptavidin dovodi do reakcije u boji nakon dodavanja tetrametilbenzidin (TMB) supstrata. Koncentracije uzoraka su interpolirane iz standardne krivulje korištenjem modela za poklapanje s četiri parametra. Rezultati za FVIII su prikazani u μg/mL.
ELISA VEZANJA vWF. FVIII je pušten da se veže za vWf iz otopine ozbiljno hemofilične plazme. Kompleks FVIII-vWf je zatim smješten na mikrotitar ploču koja je presvučena sa za vWf specifičnim monoklonskim antitijelom. FVIII vezan za vWf određen je s FVIII poliklonskim antitijelom te konjugatom peroksidaze iz hrena i anti-zečjih antitijela. S peroksidazom konjugirani kompleks antitijela dovodi do reakcije obojenja nakon dodavanja supstrata. Koncentracije uzoraka su interpolirane iz standardne krivulje korištenjem modela za poklapanje s četiri parametra. Rezultati vezanja FVIII prikazani su u μg/mL. Nije bilo značajnog utjecaja niti na jedno djelovanje nakon PEGilacije, što bi bilo u skladu s PEGilacijom na B domeni.
[image]
Tablica 4. Specifično djelovanje (S. A.) divljeg tipa FVIII pune dužine (KG-2) prije i nakon PEGilacije s različitim veličinama PEG-a.
PROČIŠĆAVANJE PEGiliranog FVIII ION-IZMJENJIVAČKOM KROMATOGRAFIJOM. PEGilirani FVIII je pušten u anion-izmjenjivačku kolonu ili kation-izmjenjivačku kolonu gdje se protein veže za kolonu dok se sav suvišak slobodnog PEG reagensa ne veže te ukloni protokom. PEG mutein se zatim eluira iz kolone s gradijentom natrijevog klorida. Otopinom barij-jod obojan 4-12% Bis-Tris gel punjenja, protoka, i frakcija gradijenta koristi se za potvrdu da se u frakcijama elucije kolone nalazi PEGilirani mutein.
PROČIŠĆAVANJE PEGiliranog FVIII POMOĆU KROMATOGRAFIJE ISKLJUČIVANJEM PO VELIČINI. Anion-izmjenjivačke frakcije koje sadrže većinu PEG2 muteina su udružene i koncentrirane ultrafiltracijom i zatim provedene kroz kolonu isključenja po veličini. Kolona je zatim eluirana korištenjem formulacijskog pufera. O razlici u veličini i obliku proteina ovisi da li se PEG veže za protein, pri čemu ova kolona odvaja PEGilirani PEG2 mutein od svog preostalog PEG2 koji nije PEGiliran. Frakcije PEGiliranog muteina FVIII su udružene na osnovu posjedovanja većine djelovanja FVIII, zatim su zamrznute za dalje studije na životinjama i molekularnu karakterizaciju. Slika 13 uspoređuje eluciju nePEGiliranog PEG2 muteina s onom 43 kD PEGiliranog PEG2 muteina. PEGilirani PEG2 eluira značajno ranije, što naznačuje povećanje njegove veličine i oblika kovalentno vezanim PEG.
Kod muteina kao što je PEG6 koji pokazuje niže učinkovitosti PEGilacije, tj. manje od 50%, najučinkovitiji postupak pročišćavanja kako bi se dobio mono-PEGilirani produkt visokog stupnja čistoće je korištenje kombinacije kation-izmjenjivačke kromatografije nakon čega slijedi kromatografija isključenjem po veličini. Na primjer, kod PEG6, kation-izmjenjivačka kromatografija pročišćava PEGilirani PEG6 (frakcija koja eluira ranije, slika 14) od većine nePEGiliranog PEG6 (frakcija koja eluira kasnije, slika 15). Kromatografija isključenjem po veličini zatim dalje pročišćava PEGilirani protein (frakcija koja eluira ranije, slika 15) od ostatka nePEGiliranog proteina (frakcija koja eluira kasnije, slika 15).
UČINAK VELIČINE PEG-a NA DJELOVANJE. Kako bi se ispitalo da li veličine PEG-a utječu i na zgrušavanje i kromogena djelovanja FVIII nakon PEGilacije, pročišćeni FVIII pune dužine, PEG2, PEG6 i PEG 14 bili su reducirani pomoću TCEP nakon čega je slijedilo uklanjanje redukcijskog sredstva i reakcija s kontrolnim puferom ili PEG u rasponu od 6 kD do 64 kD. Rezultirajući PEGilirani FVIII je izravno analiziran bez uklanjanja suviška PEG-a ili nePEGiliranog FVIII. Kontrolni eksperimenti su pokazali da suvišak PEG-a nema učinak na djelovanje FVIII.
Slika 16 prikazuje rezultate te studije. Pročišćeni FVIII pune dužine je na slici 16 predstavljen s KG-2. Postotak djelovanja iznesen na slici 16 bio je određen dijeljenjem vrijednosti uzorka tretiranog s PEG nakon redukcije i uklanjanja redukcijskog sredstva s onom uzorka tretiranog kontrolnim puferom uzimajući u obzir prinos PEGilacije. Prinosi PEGilacije bili su usporedivi za sve PEG za svaki dani konstruirani FVIII. Oni približno iznose 80% za KG-2, PEG2 i PEG14 te približno 40% za PEG6. Na primjer, PEG14 tretiran kontrolnim puferom ima djelovanje zgrušavanja od 6.8 IU/mL nasuprot 3.2 IU/mL za 12 kD PEGilirani PEG14 uzorak. Ipak, učinkovitost PEGilacije je bila približno 80%, što znači da 3.2 IU/mL predstavlja udruženo djelovanje približno 80% PEGiliranog i približno 20% nePEGiliranog. Uz pretpostavku da nePEGilirani uzorak ima isto djelovanje kao i PEG14 tretiran kontrolnim puferom, postotak djelovanja nePEGiliranog kod PEGiliranog PEG14 iznosi 34% = (3.2-6.8 puta 20%)/(6.8 puta 80%).
PEGilacija unutar A2 ili A3 domene kod PEG2, PEG6 ili PEG14 položaja BDD dovodi do dramatičnog smanjivanja djelovanja zgrušavanja kada se poveća veličina PEG-a iznad 6 kD. Ipak, PEGilacija unutar B domene na izvornom cisteinu B-domene FVIII pune dužine nije imalo učinka na djelovanje zgrušavanja. Zanimljivo je da na kromogeno djelovanje nije bilo utjecaja kod svih konstruiranih PEGiliranih struktura. Razlog tome mogu biti razlike u analizi. Moguće je da supstrat malog kromogenog peptida ima lakši pristup PEGiliranom FVIII/FIX/FX kompleksu nego što je to slučaj sa supstratom većeg proteina korištenim u analizi zgrušavanja. Alternativno, PEG može utjecati na aktiviranje muteina. To bi bilo lakše otkriti analizom zgrušavanja u jednom koraku nego kromogenom analizom u dva koraka.
Kako bi se potvrdilo opažanje učinaka PEG-a na djelovanje zgrušavanja kod PEG2, 6 i 14, nekoliko konstruiranih PEGiliranih struktura bilo je pročišćeno od suviška PEG-a i nePEGiliranih molekula. Pošto PEG nema nikakav učinak na kromogeno djelovanje, omjer kromogenog i djelovanja zgrušavanja je dobra procjena relativnog učinka PEG-a na djelovanje zgrušavanja (tablica 5). Veći PEG na danom položaju kao u slučaju PEG2 i veći broj PEG-a kao u slučaju s konstruiranom PEG2+6 strukturom potiče veće smanjivanje djelovanja zgrušavanja.
[image]
Tablica 5. Omjer kromogena i zgrušavanja za pročišćeni PEGilirani BDD.
*razgranati PEG ;PK STUDIJA KOD ZEČEVA. Za razumijevanje učinaka PEGilacije na farmakokinetiku (PK) faktora VIII, kod mnogih su vrsta izvedene PK studije. U studiji su korišteni NZW SPF zečevi: 10 ženka, 5 zečeva po grupi, 2 grupe (PEG2 FVIII i 22kD PEGilirani PEG2). Uzorci su bili razrijeđeni u sterilnom PBS u konačnu koncentraciju od 100 IU/mL (kromogenih jedinica). Svaki zec je primio dozu od 1 ml/kg (100 IU/kg) razrijeđene ispitne ili kontrolne tvari kroz marginalnu venu uške. U različita vremena nakon injektiranja, uzorci krvi (1 mL) su uvučeni u štrcaljku od 1 mL (napunjenu sa 100 μL 3.8% Na-citrata) iz središnje arterije uške u određenim intervalima nakon davanja doze. Uzorci plazme su inkubirani s R8B12 antitijelima teškog lanca koji su nanijeti na mikrotitar ploču s 96 jažica kako bi specifično vezali dozirani humani FVIII. Djelovanje vezanog FVIII je određeno kromogenom analizom (slika 17). PEGilirani PEG2 i PEGilirani PEG6 su također uspoređeni s BDD (slike 18 i 19), pri čemu su PEGilirani muteini pokazali poboljšanje rekuperacije u plazmi u usporedbi s BDD. Čini se da PEGilirani divlji tip FVIII pune dužine nije pokazao veliko poboljšanje (slika 20). ;PK STUDIJA KOD MIŠEVA. Kao druga vrsta u PK studijama korišteni su ICR normalni ili hemofilični, FVIII deficijentni miševi (Taconic, Hudson, NY). Normalni miševi su korišteni za studiju, 5 miševa po grupi po vremenskoj točci. Ispitni materijali su razrijeđeni u formulacijski pufer do nominalne konačne koncentracije od 25 IU/mL. Svakom se mišu može dati 4 mL/kg (~0.1 mL ukupnog volumena) razrijeđenog ispitnog materijala kroz repnu venu. Uzorci krvi (0.45 ili 0.3 mL za studiju normalnog odnosno hemofiličnog miša) su uvučeni u štrcaljku (napunjenu s 50 ili 30 μL 3.8% Na-citrata za studiju normalnih odnosno hemofiličnih miševa) iz donje šuplje vene (inferior vena cava) u naznačenim vremenskim točkama (jedna životinja po uzorku). Uzorci plazme su analizirani na koncentraciju FVIII korištenjem gore opisane metode kromogene analize. PEGilirani PEG6 pokazuje veću rekuperaciju u plazmi u usporedbi s BDD ili PEG6 (slika 21). PEGilirani PEG2 pokazuje veću rekuperaciju u plazmi u usporedbi s BDD (slike 22 i 23). ;[image] ;Tablica 6. Sažetak PK studije PEGiliranog FVIII koji prikazuje poluživote u plazmi u satima. *Početni pripravak 33kD PEGiliranog PEG6 s poluživotom od 9.6 sati kod zečeva nije bio tolikog stupnja čistoće kao kasniji pripravak koji je dao rezultat od 17.4 sati.
Mutein PEG FaktorPEG 6 12kD 2.9PEG 6 33kD 2.9PEG 2+6 33kD 3.3PEG 14 33kD 2.5PEG 2+6 33kD 4.4PEG 2+14 33kD 2.1PEG22 64kD 3.2
Tablica 7. Rekuperacija PEGiliranih PEG muteina u plazmi kod hemofiličnih miševa. Iznesen je faktor poboljšanja rekuperacije u plazmi 16 sati nakon injektiranja, u usporedbi s BDD kontrolom provedenom na isti dan.
REKUPERACIJA BDD FAKTORA VIII HEMOFILIČNOG MIŠA. Histogram rekuperacije BDD faktora VIII hemofiličnog miša iznesen na slici 24 prikazuje farmakokinetičku (PK) procjenu poluživota dvije vrste BDD faktora VIII u analizi hemofiličnog miša. Ta je analiza zamišljena tako da se mjere koncentracije u plazmi i BDD faktora VIII (koji je na slici 24 označen s "wt" ili divlji tip (engl.: "wild tipe") BDD faktora VIII) i PEG 2+6 dvostruko PEGilirane inačice BDD faktora VIII (također drugdje u ovome označen kao L491C, K1808C dvostruka inačica BDD faktora VIII) u tri vremenske točke nakon intravenskog davanja u modelu miša. Dok su PK procjene za vremenske točke i 0.8 i 4 sata, bile usporedive, procjena za 16 sati je osobito dostojna pažnje. U usporedbi s nePEGiliranom molekulom, 16 sati nakon davanja je u plazmi preostalo približno četiri puta više (400%) dvostruko PEGilirane inačice BDD faktora VIII (PEG 2+6).
MODEL LACERACIJE BUBREGA. Za određivanje da li su PEGilirani FVIII muteini učinkoviti u zaustavljanju krvarenja kod hemofiličnog miša koristio se model laceracije bubrega. Hemofilični miševi (C57/BL6 s poremećenim FVIII genom) anestezirani su pod izofluoranom te izvagani. Donja šuplja vena je izolirana te je injektirano 100 ul ili fiziološke otopine ili FVIII, korištenjem igle broj 31. Igla je pažljivo uklonjena, a mjesto injektiranja je pritisnuto kroz 30-45 sekunda kako bi se spriječilo krvarenje. Nakon dvije minute desni bubreg je izoliran i zahvaćen forcepsom uzduž okomite osi. Korištenjem skalpela #15, bubreg je zarezan vodoravno do dubine od 3 mm. Kako bi se osigurala jednolika dubina lezije, bubreg je lagano pridržavan u sredini kako bi tkivo sa svake strane forcepsa bilo jednako. Izložena površina bubrega je zarezana do dubine forcepsa. Gubitak krvi bio je kvantificiran kao što je opisano gore. Na miševima su bile ispitane različite doze FVIII kako bi se karakterizirao odnos doze i odgovora za FVIII kod krvarenja bubrega. PEGilirani PEG2 pokazuje usporedivu moć smanjivanja gubitka krvi nakon ozljede bubrega kod miša u odnosu na BDD (slika 25). Tako, premda je djelovanje zgrušavanja PEGiliranog PEG2 niže nego ono BDD-a, ovaj model laceracije bubrega pokazuje da in vivo učinkovitost PEGiliranog PEG2 nije mjerljivo smanjena u usporedbi s BDD, što je u skladu s podacima kromogene analize.
ANALIZA INHIBICIJE ANTITIJELIMA. Dodavanje polimera velike molekularne mase kao što je polietilen glikol (PEG) specifično na položaj 491 (tj. PEG2) trebalo bi smanjiti vezanje i osjetljivost na mAB 413, te indirektno na veliki dio inhibirajućih antitijela pacijenta pošto mnogi pacijenti razvijaju inhibirajuća antitijela protiv istog mAB 413 epitopa. Kako bi se to ispitalo, rastuće količine mAB 413 bile su inkubirane s količinama BDD-a ili 43 kD PEGiliranog PEG2 nižim od količina zasićenja (0.003 IU/mL), te su ispitane na funkcionalno djelovanje u kromogenoj analizi (slika 26). Neinhibirajuće antitijelo R8B12 i inhibirajuće antitijelo ESH4 koje je usmjereno na C2 domenu bila su korištena kao kontrole. PEGilirani PEG2 je zaista rezistentniji na mAB 413 inhibiciju od BDD-a te pokazuje sličan uzorak inhibicije u prisustvu kontrolnih antitijela koja se ne vežu blizu položaja 491. Nadalje, zaštitni učinak PEG-a od mAB 413 inhibicije je zavisan o veličini PEG-a, pri čemu veći PEG-i imaju veći učinak (slika 27). Za ispitivanje da li je PEGilirani FVIII rezistentniji na inhibirajuća antitijela pacijenata, izmjereno je kromogeno djelovanje u prisustvu panela plazme dobivene iz pacijenata s hemofilijom A koji su razvili inhibitore faktora VIII. Od osam plazma pacijenata koje su ispitane, kod 4 uzoraka plazme pacijenta 43kD PEGilirani PEG2 je bio rezistentniji na inhibiciju od strane plazme pacijenta nego BDD. Na primjer, PEGilirani PEG2, PEG6 ili PEG2+6 pokazali su veće rezidualno djelovanje nego BDD kod jedne plazme pacijenta, ali ne kod ostalih plazma (slika 28). Čini se da je diPEGilirani PEG2+6 rezistentniji od monoPEGiliranog PEG2 ili PEG6. Ti rezultati navode na zaključak da PEGilirani PEG muteini mogu biti učinkovitiji u liječenju pacijenata koji razviju inhibitore faktora VIII.
VISOKO KAPACITETNI PROBIR (engl.: "HIGH TROUGHPUT SCREENING") PEGILACIJE. Učinkovitost PEGilacije određenog PEG muteina je nepredvidiva, osobito pošto ne postoje izravne strukturne informacije o BDD-u. Na primjer, na osnovi strukturnog modela BDD-a, predvidjelo bi se da bi učinkovitost PEGilacije PEG4 i PEG5 trebala biti vrlo visoka, slično onoj PEG2 i PEG15 pošto su sva tri položaja izložena na površini te su, u skladu sa strukturom, usmjerena prema van. Stoga će za korištenje PEG-a za traženje novih mehanizama klirensa sistematskom PEGilacijom trebati učiniti probir na velikom broju muteina.
Za brzi probir velikog broja PEG muteina, razvijena je nova metoda visokog kapaciteta koja može ispitati učinkovitost PEGilacije i funkcionalno djelovanje PEGiliranih produkata iz prolazno transfektiranih muteina. Mala količina kao što je 5-10 mL prolazno eksprimiranih PEG muteina s niskom FVIII kromogenom vrijednošću koja iznosi 0,1-0,2 IU/mL koncentrirana je približno 50-erostruko korištenjem Amicon-centra Ultra uređaja MWCO 30K tako da se postigne koncentracija FVIII iznad 1 nM, blizu afinitetnog raspona interakcije antitijela i FVIII. Koncentrirani PEG mutein (~300 uL) je inkubiran s ~30 uL smole s C7F7 FVIII antitijelima preko noći pri 4 ºC, ispran, eluiran, dijaliziran, i reduciran. Redukcijsko sredstvo je uklonjeno, a reducirani PEG muteini su PEGilirani i provedeni kroz Western analizu kao što je opisano gore (slike 29 i 30). Relativna učinkovitost PEGilacije prolazno eksprimiranih PEG muteina poklapa se potpuno s onom pročišćenih PEG muteina.
Ovom metodom može biti izvršen probir nad desecima PEG muteina za vrijeme od jednog do dva mjeseca. Na primjer, PEG 14 (K1804C BDD) ima najmanje približno 80% PEGilacije lakog lanca s 12 kD PEG te nema PEGilacije teškog lanca (podaci nisu prikazani), u skladu s K1804C mutacijom smještenom na lakom lancu. C - C razmak između K1804 i K1808 (PEG6 položaji) je samo 8,4 angstrema, na osnovu BDD strukture, što navodi na zaključak da će uvođenje 43 kD PEG na tom položaju imati slično poboljšanje u PK kao i 33 kD PEGiliran PEG6, uz prednost puno višeg prinosa PEGilacije. Relativni prinosi PEGilacije za sve ispitane PEG muteine su sažeti u tablici 8. PEGilacija je bila visoko selektivna za određeni FVIII lanac gdje je bila uvedena mutacija cisteina po tome da svaki mutein s cisteinom u teškom lancu biva PEGiliran samo na teškom lancu dok svaki mutein s cisteinom u lakom lancu biva PEGiliran na lakom lancu. Brojevi muteina 2 do 31 predstavljaju mutacije cisteina unutar BDD koje zamjenjuju izvorne aminokiseline na popisanim položajima cisteinom. PEG2+6 je dvostruki mutein BDD-a kod kojeg su položaji 491 i 1808 bili supstituirani cisteinima. A1 i A2, (i B domena kod KG-2, FVIII pune dužine) pripadaju teškom lancu dok A3, C1 i C2 pripadaju lakom lancu. Učinkovitost PEGilacije je procijenjena provođenjem PEGiliranih produkata kroz SDS PAGE uspoređujući intenzitete PEGilirane vrpce s nePEGiliranom vrpcom: oznaka +++ predstavlja prinos PEGilacije ~ >80%, ++ predstavlja prinos ~30-70%, + predstavlja prinos ~10-30%, a – predstavlja ~<10%.
[image]
Tablica 8 Učinkovitost PEGilacije za razne PEGilirane FVIII.
MASENO SPEKTROMETRIJSKA ANALIZA REDUCIRANIH PEG MUTEINA. Za određivanje identiteta "zaštitne skupine" ("cap") koja sprječava izravnu PEGilaciju PEG muteina ili faktora VIII pune dužine, PEG2+14 je bio reduciran s TCEP u koncentracijama u rasponu od 67 uM do 670 uM. Prinos PEGilacije se povećao proporcionalno s povećavajućim količinama TCEP (slika 31). Isti uzorci su također bili analizirani masenom spektrometrijom prije PEGilacije (slika 32). S ciljem da se dobije domena proteina koja se može izravno proučavati, uzorci su bili digestirani s trombinom u omjeru od 20 jedinica/mg FVIII kroz 30 minuta pri 37 ºC. Cijepanje trombinom dalo je A2 fragment koji uključuje ostatke 372 do 740 te nema zauzetih glikozilacijskih mjesta. Digestirani uzorak je bio injektiran na C4 sustav tekuće kromatografije reverzne faze, a eluent iz kolone je bio uveden izravno u četverostruki vremenski maseni spektrometar (engl.: "time-of-flight mass spectrometer") kroz elektroraspršivački međusklop. Spektar masa ispod kromatografskog vršnog nalaza koji odgovara A2 domeni bio je razložen kako bi pružio intaktnu masenu vrijednost proteina. Prije redukcije, A2 domena PEG2+14 dala je masu koja je 118 daltona veća od teoretski predviđene. Kako se koncentracija TCEP povećala, pojavio se novi vršni nalaz koji ima točno predviđenu masu A2 domene. Udio tog novog vršnog nalaza povećao se s povećavanjem koncentracije TCEP. Razlika od 118 daltona može se pripisati cisteinizaciji na ostatku Cis 491 stvaranjem disulfida s cisteinom (119 Da) i preciznosti instrumenata. Stoga ovo pokazuje da su PEG muteini zaštićeni cisteinom što sprječava izravnu PEGilaciju.
Sve ovdje navedene reference su ovime u potpunosti ovdje uključene.

Claims (15)

1. Konjugat koji posjeduje prokoagulantno djelovanje faktora VIII koji sadrži polipeptid funkcionalni faktor VIII koji je mutiran na način da je barem jedan ne-cisteinski ostatak zamijenjen s cisteinskim ostatkom tako da postoji mutirani cisteinski ostatak, naznačen time da je polipeptid funkcionalni faktor VIII kovalentno vezan za biokompatibilni polimer na mutiranom cisteinskom ostatku, pri čemu je biokompatibilni polimer kovalentno vezan za polipeptid na jednom od aminokiselinskih položaja faktora VIII 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1864, 1911, 2091, 2118 i 2284.
2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time daje biokompatibilni polimer polietilen glikol.
3. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da je polipeptid funkcionalni faktor VIII faktor VIII s delecijom B-domene.
4. Konjugat prema zahtjevu 3, naznačen time da je biokompatibilni polimer kovalentno vezan za faktor VIII s delecijom B-domene na jednom od aminokiselinskih položaja 129, 491, 1804 ili 1808; biokompatibilni polimer vezan je na aminokiselinskom položaju 491 te je drugi biokompatibilni polimer vezan na aminokiselinskom položaju 1808; ili biokompatibilni polimer vezan je na aminokiselinskom položaju 491 te je drugi biokompatibilni polimer vezan na aminokiselinskom položaju 1804.
5. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da polipeptid funkcionalni faktor VIII ima aminokiselinski slijed kako je prikazano u SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 3.
6. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da polipeptid funkcionalni faktor VIII ima aminokiselinski slijed SEQ ID NO: 3 te je biokompatibilni polimer metoksipolietilen glikol.
7. Konjugat prema zahtjevu 6, naznačen time da je biokompatibilni polimer vezan za polipeptid na aminokiselinskom položaju 1804.
8. Metoda pripravljanja konjugata prema zahtjevu 1, naznačena time da se sastoji od: mutiranja nukleotidnog slijeda koji kodira polipetid funkcionalni faktor VIII kako bi se supstituirao kodirajući slijed za ne-cisteinski ostatak s kodirajućim slijedom za cisteinski ostatak; eksprimiranja mutiranog nukleotidnog slijeda kako bi se proizveo cisteinom obogaćeni mutein; pročišćavanja muteina; reagiranja muteina s biokompatibilnim polimerom, pri čemu biokompatibilni polimer ima sulfhidril reaktivnu skupinu kao što su tiol, triflat, tresilat, aziridin, oksiran, S-piridil ili maleimid skupina koja reagira s polipeptidom na uvedenom cisteinskom ostatku kako bi se oblikovao konjugat; i pročišćavanja konjugata.
9. Metoda prema zahtjevu 8, naznačena time da je biokompatibilni polimer metoksipolietilen glikol te mutein reagira s maleimid skupinom na metoksipolietilen glikolu.
10. Metoda prema zahtjevu 8, naznačena time da se eksprimiranje mutiranog nukleotidnog slijeda odvija u mediju stanične kulture koji se sastoji od sulfhidril skupina koje postaju kovalentno vezane za uvedenu(e) skupinu(e) slobodnog cisteina na cisteinom obogaćenom muteinu, metoda se nadalje sastoji od sljedećih koraka nakon eksprimiranja muteina i prije pročišćavanja muteina: (a) dovođenja u kontakt muteina s redukcijskim sredstvom pod uvjetima koji blago reduciraju mutein i otpuštaju sulfhidril skupinu; i (b) uklanjanja otpuštene sulfhidril skupine i redukcijskog sredstva iz muteina; nadalje naznačena time da mutein reagira s biokompatibilnim polimerom najmanje 5 minuta nakon uklanjanja redukcijskog sredstva.
11. Metoda prema zahtjevu 10, naznačena time da je mutein faktora VIII mutein faktora VIII s delecijom B-domene.
12. Metoda prema zahtjevu 10, naznačena time da je biokompatibilni polimer metoksipolietilen glikol-maleimid i ima raspon veličine od 5 kD do 64 kD.
13. Farmaceutska smjesa za parenteralno davanje, naznačena time da se sastoji od terapeutski učinkovite količine konjugata prema jednom od zahtjeva 1-7 i farmaceutski prihvatljive pomoćne tvari.
14. Uporaba konjugata prema jednom od zahtjeva 1-7, naznačena time da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje hemofilije.
15. Uporaba farmaceutske smjese prema zahtjevu 13, naznačena time da se koristi u proizvodnji lijeka za liječenje hemofilije.
HRP20070268AA 2004-11-12 2007-06-08 Ciljana modifikacija faktora viii HRP20070268B1 (hr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62727704P 2004-11-12 2004-11-12
PCT/US2005/041205 WO2006053299A2 (en) 2004-11-12 2005-11-14 Site-directed modification of fviii

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HRP20070268A2 HRP20070268A2 (hr) 2007-09-30
HRP20070268B1 true HRP20070268B1 (hr) 2018-04-20

Family

ID=36337298

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20180481AA HRP20180481B1 (hr) 2004-11-12 2005-11-14 Ciljana modifikacija faktora viii
HRP20070268AA HRP20070268B1 (hr) 2004-11-12 2007-06-08 Ciljana modifikacija faktora viii

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HRP20180481AA HRP20180481B1 (hr) 2004-11-12 2005-11-14 Ciljana modifikacija faktora viii

Country Status (32)

Country Link
US (4) US7632921B2 (hr)
EP (9) EP2772500B1 (hr)
JP (5) JP2008524117A (hr)
KR (7) KR20180110192A (hr)
CN (6) CN103102406B (hr)
AU (1) AU2005304622B2 (hr)
BR (2) BR122016022033B8 (hr)
CA (1) CA2586379C (hr)
CY (3) CY1119292T1 (hr)
DK (3) DK2363414T3 (hr)
ES (4) ES2633916T3 (hr)
FR (1) FR19C1031I2 (hr)
HK (3) HK1117875A1 (hr)
HN (1) HN2007015683A (hr)
HR (2) HRP20180481B1 (hr)
HU (5) HUE033776T2 (hr)
IL (3) IL182903A (hr)
LT (5) LT2371856T (hr)
LU (1) LUC00118I2 (hr)
MA (1) MA29663B1 (hr)
MX (2) MX2007005466A (hr)
NL (1) NL300989I2 (hr)
NO (3) NO20210454A1 (hr)
NZ (1) NZ555032A (hr)
PH (2) PH12014500352A1 (hr)
PL (3) PL1824988T3 (hr)
PT (4) PT1824988T (hr)
RU (1) RU2423380C2 (hr)
SI (4) SI2363414T1 (hr)
UA (1) UA95225C2 (hr)
WO (1) WO2006053299A2 (hr)
ZA (1) ZA200703696B (hr)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2338333B1 (en) 2003-04-09 2017-09-06 ratiopharm GmbH Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
WO2006005058A2 (en) 2004-06-30 2006-01-12 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
SI2586456T1 (sl) 2004-10-29 2016-05-31 Ratiopharm Gmbh Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF)
WO2006053299A2 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of fviii
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP2360170A3 (en) 2005-06-17 2012-03-28 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprinsing at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
US20090252720A1 (en) * 2006-05-24 2009-10-08 Novo Nordisk Health Care Ag Prolonged FIX Analogues and Derivatives
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
DK2101821T3 (da) 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
ES2406267T3 (es) 2007-04-03 2013-06-06 Biogenerix Ag Métodos de tratamiento usando G-CSF glicopegilado
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
KR20100095441A (ko) * 2007-11-09 2010-08-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법
PL2257311T3 (pl) * 2008-02-27 2014-09-30 Novo Nordisk As Koniugaty cząsteczek czynnika VIII
CN102112144A (zh) 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
KR20110017420A (ko) * 2008-06-04 2011-02-21 바이엘 헬스케어 엘엘씨 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 ｆｖｉｉｉ 뮤테인
KR101648734B1 (ko) 2008-06-24 2016-08-18 체에스엘 베링 게엠베하 연장된 생체내 반감기를 갖는 인자 ｖｉｉｉ, 폰 빌레브란트 인자 또는 이들의 복합체
WO2010019263A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Genzyme Corporation Soluble flt constructs for treating cancers
KR20110071012A (ko) * 2008-10-17 2011-06-27 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 낮은 수준의 수용성 중합체를 포함하는 개질된 혈액 인자
EP2352515A4 (en) * 2008-11-03 2012-04-25 Bayer Healthcare Llc METHOD FOR TREATING HEMOPHILIA
JP2012510060A (ja) * 2008-11-24 2012-04-26 バイエル・ヘルスケア・エルエルシー シリカをベースとする活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおけるｐｅｇ化血液凝固因子の活性の測定方法
EP2387413A4 (en) * 2009-01-19 2015-12-23 Bayer Healthcare Llc PROTEIN CONJUGATE WITH AN ENDOPEPTIDASE-SPLICABLE BIOPROTEKTIVES PART
MX362028B (es) 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
CN102333788A (zh) * 2009-02-19 2012-01-25 诺沃—诺迪斯克有限公司 因子viii的修饰
EP2408800B1 (en) * 2009-03-20 2016-05-25 Hanmi Science Co., Ltd. Method for preparing a site-specific conjugate of a physiologically active polypeptide
CN102427823A (zh) * 2009-03-24 2012-04-25 拜耳医药保健有限公司 因子viii变体及使用方法
JP5908401B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-26 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 血液凝固タンパク質複合体
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
AU2010290077C1 (en) * 2009-08-24 2015-12-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same
ES2880038T3 (es) 2009-12-06 2021-11-23 Bioverativ Therapeutics Inc Polipéptidos quiméricos e híbridos de factor VIII-Fc, y métodos de uso de los mismos
US8765432B2 (en) 2009-12-18 2014-07-01 Oligasis, Llc Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
CN102770449B (zh) 2010-02-16 2016-02-24 诺沃—诺迪斯克有限公司 具有降低的vwf结合的因子viii分子
RS59827B1 (sr) * 2010-02-21 2020-02-28 Bayer Healthcare Llc Metoda za aktiviranje i konjugovanje biomolekula
CN106432557A (zh) 2010-04-15 2017-02-22 科迪亚科学企业公司 高分子量的含两性离子的聚合物
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
WO2012006623A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2635297B1 (en) * 2010-11-05 2019-02-27 Baxalta GmbH A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity
JP2014501227A (ja) * 2010-12-16 2014-01-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス 第ｖｉｉｉ因子水溶液
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
AU2012262428C1 (en) * 2011-05-27 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
PL2717898T3 (pl) 2011-06-10 2019-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Związki o działaniu prokoagulacyjnym i sposoby ich stosowania
CN103930440A (zh) 2011-07-01 2014-07-16 拜耳知识产权有限责任公司 松弛素融合多肽及其用途
RS58578B1 (sr) 2011-07-08 2019-05-31 Bioverativ Therapeutics Inc Faktor viii himernih i hibridnih polipeptida i postupci za njihovu upotrebu
CA2849673A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Novo Nordisk A/S Novel glucagon analogues
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
ES2771208T3 (es) 2012-02-15 2020-07-06 Bioverativ Therapeutics Inc Composiciones de factor VIII y métodos de preparación y uso de las mismas
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
EP3549953A1 (en) 2012-02-15 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
EP2666782A1 (en) 2012-05-22 2013-11-27 Imnate Sarl Coagulation factor VIII with reduced immunogenicity.
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2870250B2 (en) 2012-07-06 2022-06-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
EP2908847B1 (en) 2012-10-18 2022-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
WO2014070953A1 (en) 2012-10-30 2014-05-08 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FVIII Polypeptide
LT2968477T (lt) 2013-03-15 2020-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii polipeptido kompozicijos
US20160030524A1 (en) * 2013-03-15 2016-02-04 Bayer Healthcare Llc Recombinant factor viii formulations
AU2014228938B2 (en) 2013-03-15 2019-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX polypeptide formulations
KR20160021758A (ko) 2013-04-18 2016-02-26 노보 노르디스크 에이/에스 의학용으로 사용하기 위한 안정하고 연장된 glp-1/글루카곤 수용체 코-아고니스트
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
TW201519900A (zh) * 2013-04-28 2015-06-01 Bayer Healthcare Llc 用於誘導對凝血因子蛋白之免疫耐受性的組成物及方法
WO2015023894A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
WO2015023891A2 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
WO2015035342A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Oligasis Llc Factor viii zwitterionic polymer conjugates
EP3060242A1 (en) * 2013-10-22 2016-08-31 DBV Technologies Method of treating haemophilia by inducing tolerance to blood factors
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
RU2546297C1 (ru) * 2013-11-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Средство, улучшающее реологические свойства крови
ES2967617T3 (es) 2013-12-06 2024-05-03 Bioverativ Therapeutics Inc Herramientas de farmacocinética poblacional y sus usos
RU2695428C2 (ru) * 2014-01-20 2019-07-23 Октафарма Аг СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ФАКТОРА VIII, ИМЕЮЩЕГО УЛУЧШЕННОЕ СООТНОШЕНИЕ FVIII:C/FVIII:Ag
KR102382402B1 (ko) 2014-02-04 2022-04-01 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온 교환 크로마토그래피의 용도
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
MX2016012447A (es) 2014-03-24 2017-01-06 Biogen Ma Inc Formulaciones de factor ix liofilizadas.
US11181534B2 (en) * 2014-04-04 2021-11-23 Bloodworks Routine laboratory and point-of-care (POC) testing for hemostasis
WO2015157335A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Bayer Healthcare Llc Compounded media powder formulation and method of preparation of liquid medium for cell culture
US10570184B2 (en) 2014-06-04 2020-02-25 Novo Nordisk A/S GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
DK3164150T3 (da) 2014-07-02 2021-02-08 CSL Behring Lengnau AG Modificeret von willebrand-faktor
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
US11155601B2 (en) 2015-03-06 2021-10-26 CSL Behring Lengnau AG Modified von Willebrand factor having improved half-life
EP3298036B1 (en) 2015-05-22 2022-04-06 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von willebrand factor
JP6573989B2 (ja) 2015-05-22 2019-09-11 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
US9849125B1 (en) 2015-11-03 2017-12-26 Banner Lifie Sciences LLC Anti-overingestion dosage forms
SG11201805497QA (en) 2016-01-07 2018-07-30 Csl Behring Recombinant Facility Ag Mutated truncated von willebrand factor
SG10201912857XA (en) 2016-01-07 2020-02-27 CSL Behring Lengnau AG Mutated von willebrand factor
CN109689683A (zh) * 2016-06-24 2019-04-26 财团法人牧岩生命科学研究所 重组单链fvⅲ及其化学缀合物
DK3538133T3 (da) 2016-11-11 2021-04-19 CSL Behring Lengnau AG Trunkeret von willebrand faktor polypeptider til behandling af hæmofili
JP2020504082A (ja) 2016-11-11 2020-02-06 ツェー・エス・エル・ベーリング・レングナウ・アクチエンゲゼルシャフト 血液凝固障害の処置又は予防における血管外投与のための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド
BR112019010034A2 (pt) 2016-11-16 2019-09-03 Bayer Healthcare Llc fator viii alvejado de hemácia e método de uso do mesmo
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
BR112019011115A2 (pt) 2016-12-02 2019-10-01 Bioverativ Therapeutics Inc métodos para tratar artropatia hemofílica usando fatores de coagulação quiméricos
AU2018215092A1 (en) 2017-01-31 2019-08-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
US10335375B2 (en) 2017-05-30 2019-07-02 Patheon Softgels, Inc. Anti-overingestion abuse deterrent compositions
KR20190086269A (ko) * 2018-01-12 2019-07-22 재단법인 목암생명과학연구소 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법
JP2021523878A (ja) 2018-05-18 2021-09-09 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 血友病ａを処置する方法
JP2022553640A (ja) 2019-10-10 2022-12-26 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 眼障害を処置する方法
WO2021091881A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High concentration cell penetrating caspase inhibitor conjugates compositions and methods thereof
EP4069269A4 (en) * 2019-12-06 2023-12-27 The Children's Hospital Of Philadelphia COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING FACTOR VIII FUNCTION

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
WO1997011957A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-03 Pharmacia & Upjohn Ab Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US7138505B1 (en) 1984-01-12 2006-11-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Factor VIII:C nucleic acid molecules
US5422260A (en) 1986-05-29 1995-06-06 Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs Human factor VIII:c muteins
US5451521A (en) 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
US5171844A (en) 1987-06-12 1992-12-15 Gist-Brocades N.W. Proteins with factor viii activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
EP0690126B1 (en) 1987-06-12 2001-11-28 Baxter Aktiengesellschaft Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
AU2473388A (en) * 1987-11-16 1989-06-22 Scripps Clinic And Research Foundation Treatment of factor viii inhibitors
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
DK0627924T3 (da) 1992-10-02 2001-04-30 Genetics Inst Sammensætning, der omfatter koagulationsfaktor VIII formulering, fremgangsmåde til dens fremstilling og anvendelse af et overfladeaktivt middel som stabilisator
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
EP0730660A4 (en) 1993-10-29 1998-02-25 Incyte Pharma Inc CHIMEAN PROTEINE PROTEASE NEXIN-1 CONTAINING VARIANTS
IL113010A (en) 1994-03-31 1999-10-28 Pharmacia & Upjohn Ab Pharmaceutical formulation comprising factor viii with an activity of at least 500iu/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
BE1008491A3 (fr) * 1994-07-14 1996-05-07 Croix Rouge De Belgique Depart Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci.
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
AU691111B2 (en) * 1995-06-21 1998-05-07 Google Technology Holdings LLC Method and antenna for providing an omnidirectional pattern
WO1997003195A1 (en) 1995-07-11 1997-01-30 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered protease sites
AT403438B (de) 1996-05-24 1998-02-25 Immuno Ag Pharmazeutische präparation mit faktor viii prokoagulationsaktivität und vwf-bindungsaktivität
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
RU2199347C2 (ru) * 1996-08-02 2003-02-27 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. Полипептиды, обладающие единственным ковалентно связанным n-концевым водорастворимым полимером
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
WO1999020288A1 (en) * 1997-10-17 1999-04-29 Harvest Technologies Corporation Precipitation of growth-factor-enriched fibrinogen concentrate from platelet rich plasma
EP0922446A1 (en) 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
PT1079805E (pt) 1998-04-27 2005-03-31 Opperbas Holding Bv Composicao farmaceutica compreendendo factor viii e lipossomas neutros
US6759216B1 (en) 1998-11-06 2004-07-06 Emory University Glycosylated, low antigenicity low immunogenicity factor VIII
DK1129186T4 (da) 1998-11-10 2017-02-06 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Et faktor VIII-polypeptid med faktor VIII:C-aktivitet
US6136599A (en) 1998-12-10 2000-10-24 Bayer Corporation Human hybrid host cell for mammalian gene expression
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
IL144259A0 (en) 1999-01-14 2002-05-23 Bolder Biotechnology Inc Methods for making proteins containing free cysteine residues
WO2000071714A2 (en) 1999-05-24 2000-11-30 The American National Red Cross Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor
RU2278123C2 (ru) * 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
JP2004525608A (ja) 2000-09-19 2004-08-26 エモリー ユニバーシテイ 修飾された因子ｖｉｉｉ
JP2005518181A (ja) 2001-01-12 2005-06-23 ジ・アメリカン・ナショナル・レッド・クロス 第ｖｉｉｉ因子のヘパラン硫酸プロテオグリカン仲介性クリアランスを低下させるための方法および組成物
AU2002249096B2 (en) * 2001-03-22 2007-06-28 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor VII derivatives
WO2002098454A2 (en) 2001-05-31 2002-12-12 D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijsen Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
WO2002096454A1 (en) 2001-05-31 2002-12-05 D. Collen Research Foundation Vzw Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
ES2331909T3 (es) 2001-06-14 2010-01-20 The Scripps Research Institute Factor viii estabilizado con enlaces disulfuro modificados geneticamente.
CA2461443C (en) 2001-10-05 2011-07-12 Emory University Nucleic acid and amino acid sequences encoding high-level expressor factor viii polypeptides and methods of use
BR0308860A (pt) 2002-04-18 2005-01-04 Merck Patent Gmbh Fator viii modificado
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8003117B2 (en) 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
WO2004060965A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
ES2308032T5 (es) 2002-12-31 2017-04-24 Nektar Therapeutics Derivados poliméricos de ácido maleámico y sus bioconjugados
KR101207247B1 (ko) 2003-01-06 2012-12-03 넥타르 테라퓨틱스 티올-선택성 수용성 중합체 유도체
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
KR20060028675A (ko) * 2003-05-12 2006-03-31 아피맥스, 인크. 신규한 폴리 (에틸렌 글리콜) 개질 화합물 및 그의 용도
EP2644206B1 (en) 2003-05-23 2019-04-03 Nektar Therapeutics PEG derivatives containing two PEG chains
EP1502921A1 (en) 2003-07-29 2005-02-02 ZLB Behring GmbH Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability
WO2005046583A2 (en) 2003-10-30 2005-05-26 Emory University Modified fviii having reduced immunogenicity through mutagenesis of a2 and c2 epitopes
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
WO2005055930A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 University Of Rochester Recombinant factor viii having increased specific activity
WO2006027111A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Zlb Behring Gmbh Modified coagulation factor viii with enhanced stability
WO2006053299A2 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of fviii
EP1871801A2 (en) 2005-04-01 2008-01-02 Novo Nordisk Health Care AG Blood coagulation fviii analogues
CA2647314A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
WO1997011957A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-03 Pharmacia & Upjohn Ab Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140019489A (ko) 2014-02-14
JP2008524117A (ja) 2008-07-10
IL232540A0 (en) 2014-06-30
ES2633916T3 (es) 2017-09-26
EP1824988B1 (en) 2017-04-19
EP3153181A1 (en) 2017-04-12
EP2772500B1 (en) 2019-12-25
LT1824988T (lt) 2017-10-25
NL300989I2 (nl) 2019-11-28
KR20160105928A (ko) 2016-09-07
AU2005304622B2 (en) 2012-03-29
CN103102406B (zh) 2015-05-27
CY1119292T1 (el) 2018-02-14
HUE060016T2 (hu) 2023-01-28
LTPA2019509I1 (lt) 2019-08-26
EP1824988A4 (en) 2008-12-31
MA29663B1 (fr) 2008-08-01
BRPI0517795A (pt) 2008-10-21
CN103214569A (zh) 2013-07-24
SI3130601T1 (sl) 2020-11-30
IL182903A (en) 2014-09-30
US7632921B2 (en) 2009-12-15
HK1117875A1 (en) 2009-01-23
DK2363414T3 (da) 2022-08-08
EP2363414A3 (en) 2012-03-21
EP1824988A2 (en) 2007-08-29
EP3243833B1 (en) 2020-06-17
BRPI0517795B8 (pt) 2021-05-25
EP3323829B1 (en) 2020-07-15
JP2015134780A (ja) 2015-07-27
EP3243834A1 (en) 2017-11-15
LTC1824988I2 (lt) 2021-02-25
WO2006053299A2 (en) 2006-05-18
KR20140091618A (ko) 2014-07-21
MX2007005466A (es) 2007-10-19
HN2007015683A (es) 2011-07-11
US20130274445A1 (en) 2013-10-17
JP2013067621A (ja) 2013-04-18
NO345800B1 (no) 2021-08-09
LT3130601T (lt) 2020-09-10
NZ555032A (en) 2010-02-26
BRPI0517795A8 (pt) 2018-12-26
CN103102406A (zh) 2013-05-15
NO20072997L (no) 2007-06-27
SI2371856T1 (sl) 2022-09-30
PT3130601T (pt) 2020-10-01
CN101124331B (zh) 2013-04-24
US9096656B2 (en) 2015-08-04
NO20210454A1 (no) 2007-06-27
SI2363414T1 (sl) 2022-09-30
EP3130601A1 (en) 2017-02-15
EP2371856A2 (en) 2011-10-05
RU2423380C2 (ru) 2011-07-10
HK1182121A1 (en) 2013-11-22
ZA200703696B (en) 2008-08-27
AU2005304622A1 (en) 2006-05-18
CN103214569B (zh) 2016-12-28
CY2019024I2 (el) 2019-11-27
HRP20070268A2 (hr) 2007-09-30
BRPI0517795B1 (pt) 2020-03-31
PL2371856T3 (pl) 2022-08-22
US20060115876A1 (en) 2006-06-01
JP6559642B2 (ja) 2019-08-14
PL1824988T3 (pl) 2018-01-31
FR19C1031I1 (hr) 2019-06-28
BR122016022033B8 (pt) 2021-05-25
PT2363414T (pt) 2022-08-04
EP3130601B1 (en) 2020-07-15
MX350293B (es) 2017-09-04
CN101124331A (zh) 2008-02-13
LT2371856T (lt) 2022-08-25
HUE033776T2 (en) 2018-01-29
NO344606B1 (no) 2020-02-10
HRP20180481A2 (hr) 2018-06-29
PH12014500352B1 (en) 2015-07-20
KR101243564B1 (ko) 2013-03-27
PT1824988T (pt) 2017-07-21
BR122016022033B1 (pt) 2021-03-02
JP6109523B2 (ja) 2017-04-05
IL182903A0 (en) 2007-08-19
CN105753968A (zh) 2016-07-13
ES2930159T3 (es) 2022-12-07
JP2017101028A (ja) 2017-06-08
EP2772500A1 (en) 2014-09-03
KR20130036780A (ko) 2013-04-12
LUC00118I2 (hr) 2019-12-27
EP3243833A1 (en) 2017-11-15
IL234433B (en) 2019-11-28
JP6487895B2 (ja) 2019-03-20
CY1123384T1 (el) 2021-12-31
KR20120136413A (ko) 2012-12-18
UA95225C2 (ru) 2011-07-25
DK1824988T3 (en) 2017-08-07
HUS1900026I1 (hu) 2022-04-28
DK2371856T3 (en) 2022-08-08
PH12014500352A1 (en) 2015-07-20
JP6018238B2 (ja) 2016-11-02
KR20070110260A (ko) 2007-11-16
RU2007121517A (ru) 2008-12-20
KR101904630B1 (ko) 2018-10-04
CN107082806A (zh) 2017-08-22
SI1824988T1 (sl) 2017-11-30
KR101468345B1 (ko) 2014-12-03
LT2363414T (lt) 2022-10-25
NO20200044A1 (no) 2007-06-27
CN105148287A (zh) 2015-12-16
HRP20180481B1 (hr) 2022-02-18
EP2363414A2 (en) 2011-09-07
PL2363414T3 (pl) 2022-09-05
LUC00118I1 (hr) 2019-05-13
FR19C1031I2 (fr) 2020-06-05
US20100081615A1 (en) 2010-04-01
CN105148287B (zh) 2019-07-09
HUE050542T2 (hu) 2020-12-28
PH12019501613A1 (en) 2020-09-14
ES2930143T3 (es) 2022-12-07
WO2006053299A3 (en) 2006-08-24
HK1218718A1 (zh) 2017-03-10
CA2586379A1 (en) 2006-05-18
US20160051633A1 (en) 2016-02-25
KR101483917B1 (ko) 2015-01-16
EP2363414B1 (en) 2022-05-18
ES2821832T3 (es) 2021-04-27
EP3323829A1 (en) 2018-05-23
KR20180110192A (ko) 2018-10-08
PT2371856T (pt) 2022-08-12
NL300989I1 (nl) 2019-05-22
JP2017105773A (ja) 2017-06-15
EP2371856B1 (en) 2022-05-18
CY2019024I1 (el) 2019-11-27
CA2586379C (en) 2012-04-03
HUE059193T2 (hu) 2022-10-28
IL232540A (en) 2017-08-31
EP2371856A3 (en) 2012-03-14
KR101654011B1 (ko) 2016-09-05
US9364520B2 (en) 2016-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3243833B1 (en) Site-directed modification of fviii
AU2016203693B2 (en) Site-directed modification of FVIII
AU2012203813B2 (en) Site-directed modification of FVIII

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
AIPI Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application
B1PR Patent granted
PNAN Change of the applicant name, address/residence

Owner name: BAYER HEALTHCARE LLC, US

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20181102

Year of fee payment: 14

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20191029

Year of fee payment: 15

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20201112

Year of fee payment: 16

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20211112

Year of fee payment: 17

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20221111

Year of fee payment: 18

ODRP Renewal fee for the maintenance of a patent

Payment date: 20231030

Year of fee payment: 19