RU2336902C2 - Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы - Google Patents

Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы Download PDF

Info

Publication number
RU2336902C2
RU2336902C2 RU2004116308/15A RU2004116308A RU2336902C2 RU 2336902 C2 RU2336902 C2 RU 2336902C2 RU 2004116308/15 A RU2004116308/15 A RU 2004116308/15A RU 2004116308 A RU2004116308 A RU 2004116308A RU 2336902 C2 RU2336902 C2 RU 2336902C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
bmp
seq
proteins
glaucoma
cells
Prior art date
Application number
RU2004116308/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2004116308A (ru
Inventor
Эббот Ф. КЛАРК (US)
Эббот Ф. КЛАРК
Роберт Дж. УОРДИНГЕР (US)
Роберт Дж. УОРДИНГЕР
Original Assignee
Алькон, Инк.
Юниверсити Оф Норт Тексэс Хелт Сайенс Сентер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Алькон, Инк., Юниверсити Оф Норт Тексэс Хелт Сайенс Сентер filed Critical Алькон, Инк.
Publication of RU2004116308A publication Critical patent/RU2004116308A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2336902C2 publication Critical patent/RU2336902C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Предлагается использовать для лечения глаукомы композиции, содержащие по меньшей мере один агонист ВМР-4. При этом композицию вводят непосредственной доставкой в глаз пациента, например посредством местных глазных капель; глазной мази; устройства замедленного высвобождения, имплантированного в слепой мешок глаза или около склеры глаза или внутри глаза; посредством инъекции. Концентрация ВМР-4 в композиции предпочтительно составляет от 0,01 до 2%. Способ основан на свойстве ВМР-4 снижать внутриглазное давление. 7 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл.

Description

1. Область изобретения
Настоящее изобретение раскрывает способы и реагенты для диагностики и лечения глаукомы и близких нарушений.
2. Описание области техники
"Глаукомы" представляют группу нарушающих зрение глазных заболеваний, которые являются основной причиной возникновения необратимой слепоты в США и других развитых странах. Первичная открытоугольная глаукома ("POAG") - наиболее распространенная форма глаукомы - характеризуется дегенерацией трабекулярной сети, приводящей к блокаде нормальной способности глазной жидкости к оттоку из глаза без перекрытия пространства (например, "угла") между радужкой и роговицей (Vaughan D. et al. (1992)). Характерным признаком подобной блокады при данном заболевании является повышенное внутриглазное давление ("IOP"), что в конечном итоге при отсутствии соответствующего и своевременного лечения приводит к прогрессирующей потере зрения и слепоте. Установлено, что заболевание поражает 0,4-3,3% взрослых людей в возрасте старше 40 лет (Leske M.C. et al. (1986); Bengtsson B. (1989); Strong N.P. (1992)). Кроме того, распространение заболевания возрастает до 6% у людей в возрасте 75 лет или старше (Strong N.P. (1992)).
Поскольку повышенное IOP является хорошо определяемым признаком глаукомы, то диагностика заболевания в основном проводится по измерению внутриглазного давления (тонометрия) (Strong N.P. (1992); Greve M. et al. (1993)). К сожалению, поскольку пределы давления при глаукоме и нормального давления перекрываются, подобные методы обладают ограниченной ценностью, если только не проводятся многократные определения (Hitchings R.A. (1993); Tuck M.W. et al. (1993); Vaughan D. et al. (1992); Vernon S.A. (1993)). По этой причине часто применяют дополнительные способы, такие как прямое обследование диска зрительного нерва и определение степени потери поля зрения у пациента для повышения точности постановки диагноза (Greve M. et al. (1993)).
При глаукоме поражаются три отдельных ткани в глазе. Повышенное IOP, связанное с POAG, возникает за счет морфологических и биохимических изменений в трабекулярной сети (ТМ), ткани, расположенной в углу между роговицей и радужкой. Большая часть питающей глазной жидкости проходит через передний сегмент глаза по ТМ. Прогрессирующая потеря клеток ТМ и скопление внеклеточного дебриса в ТМ глаза при глаукоме приводит к повышенному сопротивлению оттоку глазной жидкости (Lutjen-Drecoll and Rohen, 1996; Rohen, 1983; Rohen et al., 1993; Grierson and Calthorpe, 1988), в результате чего повышается IOP. Повышенное IOP, а также другие факторы, такие как ишемия, приводят к дегенеративным изменениям в головке глазного нерва (ONH), вызывая прогрессирующее "углубление" ONH (Varma and Minckler, 1996; Hernandez and Gong, 1996; Hernandez et al., 1990; Hernandez and Pena, 1997; Morrison et al., 1990) и потерю ганглиозных клеток сетчатки (Quigley et al., 2000; Quigley, 1999; Quigley et al., 1995; Kerrigan et al., 1997) и аксонов. Детальный молекулярный механизм, ответственный за повреждение ТМ, ONH и ганглиозных клеток сетчатки при глаукоме, остается неизвестным.
Лечение глаукомы в настоящее время направлено на снижение IOP, основного фактора риска для развития и прогрессирования глаукомы. В результате подобного лечения снижается IOP, но оно не направлено непосредственно на механизм патогенеза, и заболевание продолжает прогрессировать. По меньшей мере, у половины пациентов с глаукомой диагноз не поставлен, и со временем, когда у пациентов все-таки глаукома диагностируется, потеря ганглиозных клеток сетчатки уже составляет примерно 40%. Следовательно, имеется потребность в способах более раннего установления и диагностики глаукомы.
В свете значения глаукомы и, по меньшей мере, частичной неадекватности способов диагностики предшествующего уровня техники было бы желательным иметь усовершенствованный, более точный способ диагностики глаукомы на ранних стадиях заболевания. Кроме того, было бы желательным иметь новые терапевтические средства, направленные на механизм патогенеза глаукомы.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении преодолеваются данные и другие недостатки предшествующего уровня техники обеспечением способов и наборов для ранней диагностики глаукомы, для лечения глаукомы и для идентификации соединений, пригодных для лечения глаукомы.
В некоторых конкретных воплощениях изобретение обеспечивает способ диагностики глаукомы в пробе, полученной из клетки или жидкости организма, детектированием измененной экспрессии гена, члена семейства морфогенных белков кости. В целом способ включает стадии:
а) получения пробы ткани или жидкости от пациента с подозрением на глаукому;
b) экстрагирования ДНК из указанной пробы;
с) получения множества ПЦР-праймеров, при этом каждый из указанных праймеров включает последовательность, состоящую из 18-1547 смежных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:53;
d) амплификации областей экстрагированной ДНК с использованием указанных праймеров с получением продукта ПЦР;
е) выделения продукта ПЦР; и
f) идентификации различий между последовательностью продукта ПЦР и нормальной последовательностью гена;
при этом различие между амплифицированной последовательностью и нормальной последовательностью гена является диагностическим признаком глаукомы.
В основном способы по изобретению могут включать получение пробы от индивидуума и экстрагирование ДНК из указанной пробы. Выбранные ПЦР-праймеры для конкретных членов семейства генов ВМР затем используются для амплификации соответствующих областей экстрагированного гена с получением продукта ПЦР. Продукт ПЦР выделяют методом, с помощью которого можно эффективно установить различия в последовательностях ДНК между нормальной и мутантной формой конкретного гена семейства ВМР, которые подвергаются оценке (экстрагированной ДНК). Установленные различия между последовательностями указывают на наличие глаукомы.
Пробой ткани или жидкости для использования в способах по изобретению может быть кровь или клетки щеки.
Как правило, последовательности праймеров будут иметь длину в пределах примерно от 10, 15 или 18 нуклеотидов до примерно 20 или примерно 30 нуклеотидов. Более длинные последовательности, например, из 40, 50, 80, 90, 95, 100 нуклеотидов, даже до полноразмерных последовательностей, являются даже более предпочтительными для некоторых воплощений. Специалисты в данной области считают допустимыми олигонуклеотиды длиной, по меньшей мере, из 18-20 нуклеотидов, как достаточные для проведения в достаточной мере специфической гибридизации, в качестве молекулярного зонда, описанные Lathe (1985), данный источник специально для этой цели включен здесь для сведения. Предпочтительно нуклеотидная последовательность будет состоять из 20-100 смежных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:53. Также предусматривается, что последовательности праймеров могут состоять из последовательностей, по меньшей мере, из 10, 15 или 18 смежных нуклеотидов последовательностей генов ВМР-рецепторов и связанных с ВМР белков, последовательности которых хорошо известны.
Молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие участки из 10, 18, 20, 30, 50, 60, 65 или даже до и включая 100 нуклеотидов, и так далее, комплементарные любой из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:53, пригодны в качестве зондов для гибридизации. Специалисты в данной области признают, что праймеры или зонды, имеющие нуклеотидную длину из примерно 18 нуклеотидов, обеспечивают высокую специфичность гибридизации с последовательностью-мишенью. Полный размер фрагмента, а также размер комплементарных участков, в конечном итоге будет зависеть от предназначаемого применения конкретного сегмента нуклеиновой кислоты. В воплощениях гибридизации, как правило, найдут применение меньшие фрагменты, у которых длина комплементарной области может варьировать так, например, в пределах примерно от 10, 18, 20 или 30 и до примерно 50, 60, 70, 80, 90 или 100 нуклеотидов или даже полного размера, соответственно комплементарным последовательностям, которые подвергаются детектированию.
В особо предпочтительных воплощениях праймеры будут состоять из смежных последовательностей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:53. В других предпочтительных воплощениях праймеры будут состоять из смежных последовательностей из генов ВМР-рецепторов (раскрыты у Dijke et al., 1993; Astrom et al., 1999; Nohno et al., 1995, все включены здесь для сведения) или из связанных с ВМР генов, таких как хордин (NCBI NM_029130), гремлин (Murphy et al., 1999; McMahon et al., 2000), фоллистатин (NCBI NM_003892) или бамби (NCBI NM_005791). Наиболее предпочтительно праймеры будут состоять из смежной последовательности из SEQ ID NO:3. В некоторых аспектах, по меньшей мере, некоторые из праймеров могут дополнительно включать детектируемую метку.
В некоторых воплощениях изобретение обеспечивает способ лечения глаукомы введением пациенту, нуждающиеся в этом, композиции, содержащей последовательность, состоящую, по меньшей мере, из одного соединения, выбранного из группы, состоящей из агониста ВМР-2, агониста ВМР-4, агониста ВМР-5, агониста ВМР-7, агониста Smad 1/5, антагониста хордина, антагониста гремлина и антагониста фоллистатина.
В дополнительных аспектах настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации терапевтического средства для лечения глаукомы. Терапевтические средства можно идентифицировать, например:
а) получением первой композиции, содержащей популяцию рекомбинантных клеток, экспрессирующих ВМР-2А, ВМР-4, ВМР-5 или ВМР-7;
b) получением соединения-кандидата;
с) инкубацией указанной композиции и указанного соединения-кандидата;
тестированием указанной композиции на ее способность воздействовать на индуцированные ВМР пути передачи сигнала с участием Smad и/или регулируемую ВМР экспрессию гена; и идентификацией соединения-кандидата, которое ингибирует или стимулирует данные эффекты в прямом направлении ВМР.
Другим аспектом изобретения являются диагностические наборы, содержащие последовательности по настоящему изобретению и подходящие реагенты, такие как детектируемая метка, связанная с белком, пептидом или самим антителом. Альтернативно детектируемая метка может быть связана со второй последовательностью, которая избирательно гибридизуется с последовательностью по изобретению.
Близкие воплощения включают терапевтические наборы, которые содержат фармацевтически приемлемые композиции либо последовательностей нуклеиновых кислот, либо последовательностей пептидов или белков, раскрытых здесь. Подобные наборы пригодны для детектирования измененной экспрессии генов ВМР и белков в клинических пробах для диагностики глаукомы.
Краткое описание фигур
Фигуры составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять при обращении к одной или более фигур в сочетании с подробным описанием конкретных воплощений, представленных здесь.
Фиг.1. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ВМР-2А.
Фиг.2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ВМР-4.
Фиг.3. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ВМР-5.
Фиг.4. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность ВМР-7.
Фиг.5. Путь передачи сигнала с участием морфогенных белков кости. Димеры морфогенных белков кости (ВМР) связываются с мембранным комплексом, состоящим из ВМР-рецепторов 1 и 2, которые представляют серин/треонинкиназы. Регуляторные Smad (Smad 1/Smad 5) фосфорилируются и связываются с со-Smad (Smad 4). Данный образующийся Smad-комплекс проникает в ядро, где он связывается с факторами транскрипции (TF) и регулирует экспрессию гена. Связанные с ВМР белки действуют в качестве антагонистов ВМР, связываясь с ВМР и предупреждая взаимодействие ВМР с ВМР-рецепторами.
Фиг.6. Экспрессия ВМР в человеческих клетках и тканях ТМ. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР для ВМР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР экспрессии ВМР в человеческих клетках (полосы 1-5) и тканях (полосы 6-7) ТМ. L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.7. Экспрессия ВМР-рецептора в человеческих клетках и тканях ТМ. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР экспрессии ВМР-рецепторов в человеческих клетках (полосы 1-5) и тканях (полосы 6-7) ТМ. L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.8. Экспрессия ВМР в человеческих астроцитах ONH, тканях ONH и астроцитах мозга человека. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР экспрессии ВМР в человеческих астроцитах ONH (полосы 1-5), тканях ONH (полоса 6) и астроцитах мозга человека (полоса 7). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.9. Экспрессия ВМР в линиях человеческих клеток решетчатой полости склеры. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР человеческих клеток решетчатой полости склеры (полосы 1-9). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.10. Экспрессия ВМР-рецептора в человеческих астроцитах ONH, тканях ONH и астроцитах мозга человека. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР экспрессии ВМР-рецепторов в астроцитах головки зрительного нерва человека (ONA) (полосы 1-5), ткани ONH (полоса 6) и астроцитах мозга человека (полоса 7). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.11. Экспрессия ВМР-рецепторов в линиях человеческих клеток решетчатой полости склеры. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР человеческих клеток решетчатой полости склеры (полосы 1-9). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.12. Вестерн-иммуноблоттинг экспрессии ВМР и ВМР-рецепторов в культивированных человеческих клетках ТМ, астроцитах головки зрительного нерва (ONA) и клетках решетчатой полости склеры. Хемилюминесцентное детектирование ВМР-белков и ВМР-рецепторов в человеческих клетках трабекулярной сети (полосы 1-2), астроцитах ONH (полосы 3-4) и клетках решетчатой полости склеры (полосы 5-6). Масса белков указана в kDa.
Фиг.13. Экспрессия мРНК связанных с ВМР белков в человеческих клетках ТМ. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР человеческих клеток ТМ (полосы 1-5). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.14. Экспрессия мРНК связанных с ВМР белков в человеческих клетках решетчатой полости склеры и астроцитах ONH. Окрашенный бромистым этидием агарозный гель продуктов ПЦР из проб кДНК, полученных при анализе ОТ-ПЦР клеток решетчатой полости склеры (LC) (полосы 1-7) и астроцитов ONH (полосы 8-11). L = маркеры пар оснований. С = отрицательная контрольная полоса при ПЦР. β-актин использовали в качестве положительного внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР.
Фиг.15. Иллюстрация повышенной экспрессии антагониста ВМР гремлина (CКTSF1B1) в клетках ТМ при глаукоме. Экспрессию гена оценивали с использованием совокупности генов Affymetrix (генный чип U133А Affymetrix).
Подробное описание предпочтительных воплощений
Было высказано предположение, что трабекулярная сеть играет важную роль в движении глазной жидкости в норме, и полагается, что она представляет основное место сопротивления оттоку в глазе при глаукоме. Клетки трабекулярной сети человека (НТМ) являются специализированными клетками, которые образуют каналы для оттока, по которым глазная жидкость выходит из глаза. Измененная синтетическая функция клеток может участвовать в патогенезе POAG, стероидной глаукомы и других типов глаукомы.
Несмотря на годы интенсивных исследований, точный молекулярный механизм, ответственный за повреждения глаза, возникающие в результате глаукомы, остается неизвестным. В результате недавно проведенных исследований было высказано предположение, что факторы роста могут быть важными в поддержании нормального гомеостаза в тканях глаза, связанных с развитием глаукомы, и изменения факторов роста/рецепторов факторов роста могут играть роль в патогенезе глаукомы. Факторы роста представляют очень большое семейство полипептидов, которые регулируют рост и дифференциацию клеток. Данные молекулы обладают различными специфичными для клеток эффектами в отношении экспрессии генов, состава и отложения внеклеточного матрикса, организации цитоскелета и регуляции функции клеток. ТМ экспрессирует широкий ряд факторов роста, рецепторов факторов роста (Tripathi et al., 1993a; Tripathi et al., 1993b; Tripathi et al., 1994a; Tripathi et al., 1994b; Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999), а также нейротрофинов/нейротрофических факторов и их рецепторов (Liu et al., 2001; Wordinger et al., 2000). Астроциты ONH и клетки решетчатой полости склеры, два типа клеток головки зрительного нерва, экспрессируют факторы роста, нейротрофины и их рецепторы (Lambert et al., 2001; Pena et al., 1999). Глазная жидкость также содержит различные факторы роста, включая FGF2, EGF, TGFβ, HGH (Tripathi et al., 1996; Tripathi et al., 1991; Tripathi et al., 1992; Hu and Ritch, 2001), а также нейротрофины (Chundru et al., 2000). Сообщалось о повышенном уровне TGFβ-2 и HGF в глазной жидкости пациентов с POAG (Tripathi et al., 1994c; Inatani et al., 2001; Picht et al., 2001). Факторы роста могут участвовать в развитии глаукомы, изменяя нормальное развитие и/или функцию ТМ и ONH.
Настоящее изобретение частично происходит из представлений о том, что морфогенные белки кости (ВМР) индуцируют образование не только кости и хряща, но являются многофункциональными цитокинами, оказывающими широкий ряд воздействий на многочисленные типы клеток (Hogan, 1996; Reddi, 1997), и экспрессируются как клетками трабекулярной сети (НТМ), так и головки зрительного нерва (ONH) человека (Wordinger et al., 2002). ВМР являются членами суперсемейства TGFβ, и у человека имеется примерно 15-20 генов ВМР, 3 ВМР-рецептора и ряд связанных с ВМР белков, которые функционируют в качестве антагонистов ВМР (Yamashita et al., 1996). ВМР передают сигнал через рецепторный комплекс, состоящий из BMPR-I и BMPR-II. Сообщалось, что члены суперсемейства TGFβ и TGFβR (Agarwal et al., 1997; Lambert et al., 1997) и GDNF и GDNFR (Wordinger et al., 1999; Liu et al., 1999) экспрессируются как клетками НТМ, так и ONH.
ВМР и ВМР-рецепторы экспрессируются в тканях глаза (Obata et al., 1999; You et al., 1999), но предшествующие сообщения в основном касались развития глаза. Функция ВМР является важной для развития глаза, поскольку направленный разрыв генов, кодирующих ВМР у мышей, приводит к тяжелым дефектам развития в сетчатке и хрусталике (Jena et al., 1997; Luo et al., 1995; Dudley et al., 1995). ВМР-2, ВМР-4 и ВМР-7 принимают участие в развитии хрусталика и сетчатки (Jena et al., 1997; Furuta and Hogan, 1998; Reddi, 2000; Trousse et al., 2001). Оказалось, что ВМР-6 и ВМР-7 играют роль в защите нейронов от повреждения в результате гипогликемии или ишемии (Nonner et al., 2001; Liu et al., 2001), и было показано, что ВМР-2 повышает экспрессию нейротрофина в ганглиозных клетках (Zhang et al., 1998). Гетерозиготные "нокаутные" мыши с гаплонедостаточностью по Bmp4 имеют зрительные фенотипы, включающие дисгенез переднего сегмента, повышенное IOP и аномалии зрительного нерва (Chang et al., 2001). Имеется очень ограниченная опубликованная информация, касающаяся роли ВМР для глаза человека в постнатальном периоде.
Mohan и коллеги (1998) сообщали, что ВМР-2-, ВМР-4- и ВМР-рецепторы экспрессировались в клетках роговицы взрослого человека, и предположили, что в функции ВМР может входить воздействие на пролиферацию и апоптоз кератоцитов роговицы. You и коллеги (1999) подтвердили результаты данного исследования и также сообщили об экспрессии ВМР-3, ВМР-5 и ВМР-7 в условиях ex vivo и культивированных клетках эпителия роговицы и стромы. Они сообщили, что уровень транскрипции ВМР был выше в строме, в то время как уровень рецепторов был выше в культивированных эпителиальных клетках роговицы.
С использованием ОТ-ПЦР авторы настоящего изобретения выявили мРНК ВМР, ВМР-рецепторов BMPR-IА, BMPR-IВ и BMPR-II, а также связанных с ВМР белков гремлина, хордина, фоллистатина и бамби в НТМ, решетчатой полости склеры (LC) и клеточных линиях астроцитов и тканях ONH (Wordinger et al., 2002). Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что клетки НТМ и ONH экспрессируют белки ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5 и ВМР-7.
Глаукому можно будет диагностировать по обнаружению генетических изменений в генах членов сигнального семейства ВМР. В том смысле, в котором они здесь используются, выражения "ген, член семейства морфогенных белков кости" и "сигнальное семейство ВМР" относится к ВМР, ВМР-рецепторам и связанным белкам. Термин "генетические изменения" хорошо известен специалистам в данной области. Существуют многочисленные примеры заболеваний, связанных с генетическими изменениями в определенных генах (см. примеры у Cummings, 1997; Strachan et al., 1996; Jorde et al., 1999). Генетические изменения в конкретном гене (например, ВМР) можно определить с использованием различных методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как SSCP, DGGE, ASO, RFLP, гетеродуплексный анализ, CCM, PTT и расщепление РНКазой (см. Birren et al., 1998).
Глаукома может быть вызвана измененной экспрессией одного или более генов семейства ВМР в глазе, что приводит к повышенному IOP и/или нейропатии зрительного нерва при глаукоме. "Измененная экспрессия гена ВМР" означает экспрессию продукта данного гена, которая отличается от таковой в норме. Термин может также относится к изменениям в последовательности гена или белка. Ген ВМР в норме был хорошо охарактеризован (см. выше), и сообщалось об экспрессии ВМР в различных тканях, включая ТМ и ONH. Генетические изменения в кодирующей области генов семейства ВМР могут изменять функцию данных белков. Генетические изменения вне кодирующей области также могут привести к глаукоме.
Специалистам в данной области хорошо известно, что "изменения вне" кодирующей области конкретного гена являются важными для регуляции экспрессии гена. Например, известно, что область выше (5') кодирующей области большинства генов служит в качестве промоторной области, которая "способствует" и регулирует экспрессию данного гена. Промоторная область содержит многочисленные нуклеотидные последовательности, распознаваемые различными факторами транскрипции и ДНК-связывающими белками, которые ответственны за активацию или подавление экспрессии гена. Нижние области (3') гена могут также определять полиаденилирование продукта гена, тем самым регулируя процессинг РНК и трансляцию продукта гена.
Измененную экспрессию генов ВМР или мутации в последовательности генов, которая указывает на наличие глаукомы, можно детектировать с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, предусматривается, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты практически любой длины, при полной длине предпочтительно ограничивать простотой получения и применения в предназначенном протоколе. Последовательности нуклеиновой кислоты, раскрытые здесь, могут также применяться в качестве зондов или праймеров в воплощениях гибридизации нуклеиновых кислот. Если это так, то предполагается, что сегменты нуклеиновой кислоты, которые включают область последовательности, состоящей из последовательности, по меньшей мере, из 14 смежных нуклеотидов, которая имеет ту же последовательность, или комплементарную последовательность из 14 смежных нуклеотидов ВМР-2А (SEQ ID NO:1), ВМР-4 (SEQ ID NO:3), ВМР-5 (SEQ ID NO:5), ВМР-7 (SEQ ID NO:7), ВМР-RIA (SEQ ID NO:37), ВМР-RIB (SEQ ID NO:39), ВМР-RII (SEQ ID NO:41), хордина (SEQ ID NO:43), гремлина (SEQ ID NO:45), фоллистатина (SEQ ID NO:47) или бамби (SEQ ID NO:53), будет иметь особую применимость. Также в некоторых воплощениях можно использовать смежные идентичные или комплементарные последовательности большей длины, например, примерно из 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 нуклеотидов (включая все последовательности с промежуточными длинами) и вплоть до полноразмерных последовательностей примерно из 1547 нуклеотидов (для ВМР-2А), 1946 нуклеотидов (для ВМР-4), 2153 нуклеотидов (для ВМР-5) и 1878 нуклеотидов (для ВМР-7), 2932 нуклеотидов (для ВМР-RIA), 2032 нуклеотидов (для ВМР-RIB), 3611 нуклеотидов (для ВМР-RII), 3561 (для хордина), 4049 нуклеотидов (для гремлина), 1386 нуклеотидов (для фоллистатина) и 1523 нуклеотидов (для бамби).
Легко понять, что "последовательности с промежуточными длинами" в данном контексте означают любую длину между указанными пределами, такую как 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д.; 21, 22, 23 и т.д., 30, 31, 32 и т.д., 50, 51, 52, 53 и т.д., 100, 101, 102, 103 и т.д., 150, 151, 152, 153 и т.д., включая все целые числа в пределах 200-500, 500-1000, 1000-2000, до и включая последовательности из 2001, 2002, 2050, 2051 нуклеотидов и тому подобное.
Способность таких нуклеотидных зондов и праймеров специфически гибридизоваться с кодирующими последовательностями ВМР и праймерами для специфической амплификации последовательностей ВМР позволит использовать их для детектирования наличия комплементарных последовательностей в данной пробе. Однако предусматриваются другие применения, включая применение информации по секвенированию для получения праймеров мутантных видов или праймеров для получения других генетических конструкций.
Молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие области последовательности, состоящие из участков смежных нуклеотидов длиной 10, 20, 30, 50 и даже 100-200 нуклеотидов или так далее, идентичные или комплементарные последовательностям ВМР-2А (SEQ ID NO:1), ВМР-4 (SEQ ID NO:3), ВМР-5 (SEQ ID NO:5), ВМР-7 (SEQ ID NO:7), ВМР-RIA (SEQ ID NO:37), ВМР-RIB (SEQ ID NO:39), ВМР-RII (SEQ ID NO:41), хордина (SEQ ID NO:43), гремлина (SEQ ID NO:45), фоллистатина (SEQ ID NO:47) или бамби (SEQ ID NO:53), особенно пригодны для использования в качестве зондов для гибридизации, например, при оценке SNP и в тестах гибридизации на твердой фазе, в дополнение к саузерн- и нозерн-блоттингу. Это позволит проводить анализ структурных и регуляторных генов ВМР в тканях и клетках. Полный размер фрагмента, а также размер комплементарного участка(ов), в конечном итоге будет зависеть от предназначаемого применения конкретного сегмента нуклеиновой кислоты. Меньшие фрагменты, как правило, будут применяться при гибридизации, когда длина смежной комплементарной области может варьировать, например, в пределах примерно от 10 до примерно 100 нуклеотидов, но можно использовать более крупные смежные комплементарные участки вплоть до примерно 1547 нуклеотидов (для ВМР-2А), 1946 нуклеотидов (для ВМР-4), 2153 нуклеотидов (для ВМР-5) и 1878 нуклеотидов (для ВМР-7), 2932 нуклеотидов (для ВМР-RIA), 2032 нуклеотидов (для ВМР-RIB), 3611 нуклеотидов (для ВМР-RII), 3561 (для хордина), 4049 нуклеотидов (для гремлина), 1386 нуклеотидов (для фоллистатина) и 1523 нуклеотидов (для бамби) нуклеотидов, соответственно длине комплементарных последовательностей, которые желательно детектировать.
При применении зонда для гибридизации длиной примерно 10-14 нуклеотидов образуется дуплексная молекула, которая одновременно является стабильной и избирательной. Молекулы, имеющие смежные комплементарные последовательности к участкам длиной более 10 оснований, в основном являются предпочтительными, хотя для повышения стабильности и избирательности гибрида, и тем самым для улучшения качества и степени получаемых конкретных гибридных молекул, как правило, предпочтительно конструировать молекулы нуклеиновых кислот, имеющих комплементарные участки для генов, состоящих из 15-20 смежных нуклеотидов или, при необходимости, длиннее.
Зонды для гибридизации можно выбрать из любого участка любой последовательности, раскрытой здесь. Все, что требуется, это проанализировать представленные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 или SEQ ID NO:53 и выбрать любой смежный участок последовательности длиной примерно от 10 нуклеотидов и вплоть до полноразмерной последовательности, который желательно использовать в качестве зонда или праймера. При выборе последовательностей зонда и праймера можно руководствоваться различными факторами, только в качестве примера, например, желательно ли использовать праймеры к концам целой последовательности или от концов функциональных кодирующих домен последовательностей, для последующей амплификации ДНК.
Способ отбора и получения сегмента нуклеиновой кислоты, который включает смежную последовательность из последовательностей ВМР-2А (SEQ ID NO:1), ВМР-4 (SEQ ID NO:3), ВМР-5 (SEQ ID NO:5), ВМР-7 (SEQ ID NO:7), ВМР-RIA (SEQ ID NO:37), ВМР-RIB (SEQ ID NO:39), ВМР-RII (SEQ ID NO:41), хордина (SEQ ID NO:43), гремлина (SEQ ID NO:45), фоллистатина (SEQ ID NO:47) или бамби (SEQ ID NO:53), альтернативно может быть определен как получение фрагмента нуклеиновой кислоты. Конечно, фрагменты также можно получить другими методами, такими как, например, механическое гидродинамическое фрагментирование ДНК или расщепление рестриктазой. Небольшие сегменты или фрагменты нуклеиновой кислоты можно легко получить, например, прямым синтезом фрагмента химическими методами, как это широко распространено на практике с использованием автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Кроме того, фрагменты можно получить применением методов репродукции нуклеиновой кислоты, такой как технология ПЦР™ согласно патенту США № 4683202 и патенту США № 4682195 (каждый включен здесь для сведения), введением отобранных последовательностей в рекомбинантные векторы для рекомбинантной продукции, и другими методами рекомбинантной ДНК, хорошо известными специалистам в области молекулярной биологии.
Следовательно, нуклеотидные последовательности по изобретению можно использовать по их способности к селективному образованию дуплексных молекул с комплементарными участками генов или кДНК ВМР. В зависимости от предполагаемого подхода будет желательно использовать различные степени избирательности гибридизации для достижения различной степени избирательности зонда относительно последовательности-мишени. Для применений, где требуется высокая избирательность, как правило, желательно использовать относительно жесткие условия для образования гибридов, например, следует выбрать условия с относительно низкой концентрацией соли и/или высокой температурой, такие как обеспечиваются при использовании 0,02-0,15 М NaCl при температуре 50-70°С. В подобных условиях имеется небольшая, если вообще таковая существует, вероятность ошибочного спаривания зонда и матрицы или цепи-мишени, и они особенно подходят для исследования генов ВМР.
Конечно, для некоторых применений, например, когда желательно получить или идентифицировать мутанты с использованием цепи мутантного праймера, гибридизованного с лежащей в основе матрицей, или когда необходимо выделить кодирующие последовательности ВМР из близких видов, функциональных эквивалентных вариантов и тому подобное, как правило, требуются менее жесткие условия гибридизации для образования гетеродуплекса. В данных обстоятельствах может быть желательным использовать такие условия, как концентрация соли 0,15-1,0 М при температуре в пределах примерно от 20 до 55°С. Тем самым можно легко идентифицировать перекрестно-гибридизующиеся виды в качестве положительно гибридизующихся сигналов по отношению к контрольной гибридизации. В любом случае в целом предусматривается, что условия можно сделать более жесткими при снижении концентрации NaCl или добавлении возрастающих количеств формамида, который служит для дестабилизации гибридного дуплекса так же, как повышенная температура. Таким образом, можно легко манипулировать условиями гибридизации, и, таким образом, имеется метод выбора в зависимости от желаемых результатов.
В некоторых воплощениях будет преимущественным использовать последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в сочетании с подходящими средствами, такими как метка, для определения результатов гибридизации. В данной области известны самые различные соответствующие индикаторные средства, включая флуоресцентные, радиоизотопные, ферментативные или другие лиганды, такие как авидин/биотин, которые способны воспроизводить детектируемый сигнал. В предпочтительных воплощениях желательно использовать флуоресцентную метку или ферментативную метку, такую как уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, вместо радиоактивного или других нежелательных для окружающей среды реагентов. В случае ферментативных меток известны индикаторные субстраты для колориметрии, которые можно использовать для обеспечения средств, видимых человеческому глазу или обнаруживаемых при спектрофотометрии, для идентификации специфической гибридизации с пробами, содержащими комплементарные нуклеиновые кислоты.
В общем предусматривается, что зонды для гибридизации, описанные здесь, будут пригодными в качестве реагентов как для гибридизации в растворе, так и в воплощениях с использованием твердой фазы. В воплощениях с твердой фазой анализируемая ДНК (или РНК) адсорбируется или фиксируется иначе на выбранном матриксе или поверхности. Затем данную фиксированную одноцепочечную нуклеиновую кислоту подвергают специфической гибридизации с отобранными зондами в желаемых условиях. Выбранные условия будут зависеть от конкретных обстоятельств, основанных на конкретных требуемых критериях (в зависимости, например, от содержания G+C, типа нуклеиновой кислоты-мишени, источника нуклеиновой кислоты, размера зонда для гибридизации и т.д.). После промывания гибридизованной поверхности для удаления неспецифически связанных молекул зонда, проводят детектирование специфической гибридизации или даже количественное определение, с помощью метки.
Также следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями ВМР-2А (SEQ ID NO:1), ВМР-4 (SEQ ID NO:3), ВМР-5 (SEQ ID NO:5), ВМР-7 (SEQ ID NO:7), ВМР-RIA (SEQ ID NO:37), ВМР-RIB (SEQ ID NO:39), ВМР-RII (SEQ ID NO:41), хордина (SEQ ID NO:43), гремлина (SEQ ID NO:45), фоллистатина (SEQ ID NO:47) или бамби (SEQ ID NO:53). Так, рекомбинантные векторы и выделенные сегменты ДНК могут включать кодирующие области ВМР сами по себе, "верхние" или "нижние" гены, кодирующие области, несущие выбранные изменения или модификации основной кодирующей области, или они могут кодировать более крупные полипептиды, которые, тем не менее, включают кодирующие области ВМР, или могут кодировать биологически эквивалентные функциональные белки или полипептиды, имеющие вариантные аминокислотные последовательности.
Сегменты ДНК по настоящему изобретению включают биологически эквивалентные функциональные белки и полипептиды ВМР. Данные последовательности можно получить в результате избыточности кодона и функциональной эквивалентности, которые, как известно, имеют место в естественных условиях в последовательностях нуклеиновой кислоты и белках, их кодируемых. Альтернативно, функционально эквивалентные белки или полипептиды можно получить с помощью применения технологии рекомбинантной ДНК, с помощью которой можно воспроизвести изменения в структуре белка, основанные с учетом свойств аминокислот, которые подвергаются замене. Сконструированные человеком изменения можно ввести с помощью методов сайт-направленного мутагенеза, например, для повышения антигенных свойств белка или тестирования мутантов ВМР для исследования связывающей активности на молекулярном уровне.
Терапевтическое средство для лечения глаукомы может быть пептидом или белком, пептидомиметиком, олигонуклеотидом или дериватизированным олигонуклеотидом, или небольшой подобной лекарственному препарату молекулой, которые воздействуют на одну или более сторон зрительных путей с участием ВМР. Предпочтительными терапевтическими средствами являются: (1) агонисты ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5 или ВМР-7; (2) антагонисты хордина, гремлина, фоллистатина или бамби; и/или (3) агонисты Smad1, Smad5 и/или Smad4.
Средство можно непосредственно вводить в глаз (например, в виде глазных капель или мазей для местного применения; с помощью устройств с замедленным высвобождением в слепой мешок или имплантированных около склеры или внутри глаза; посредством периокулярной, конъюнктивальной, в теноновую фасцию, в камеру или в стекловидное тело инъекций) или парентерально (например, перорально, с помощью внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекций; через кожу и т.д.) с использованием методов, хорошо известных в данной области. Последующее представляет примеры возможных композиций, воплощенных данным изобретением.
(а) Глазная композиция для местного применения вес.%
Средство, повышающее экспрессию ВМР-4 в глазе 0,01-2
НРМС 0,5
Хлорид натрия 0,8
ВАС 0,01
ЭДТА 0,01
NaOH/HCl до рН 7,4
Очищенная вода до 100 мл
(b) Глазная композиция для местного применения вес.%
Антагонист гремлина 0,01-2
НРМС 0,5
Хлорид натрия 0,8
ВАС 0,01
ЭДТА 0,01
NaOH/HCl до рН 7,4
Очищенная вода до 100 мл
(с) Глазная композиция для местного применения вес.%
Агонист Smad 1/5 0,01-2
НРМС 0,5
Хлорид натрия 0,8
ВАС 0,01
ЭДТА 0,01
NaOH/HCl до рН 7,2
Очищенная вода до 100 мл
Дополнительно предусматривается, что соединения по изобретению можно приготовить в виде устройств для внутриглазной доставки.
А. Анализ терапевтических средств
Данное изобретение также пригодно для обнаружения новых терапевтических средств против глаукомы, которые принимают участие в путях передачи сигналов с ВМР (см. фиг.5). Избирательные лиганды ВМР связываются с ВМР-рецепторами серин/треонинкиназами типа I и типа II (ВМР-RI и ВМР-RII) и передают сигнал через Smad-белки. Сигнал ВМР распространяется Smad через белок-белковые и белок-ДНК взаимодействия (Attisano and Tuen Lee-Hoeflich, 2001). Регуляторные белки Smad1 и Smad5 активируются (посредством фосфорилирования) связанными с лигандом ВМР-рецепторами (Bubnoff and Cho, 2001). Затем данные регуляторные белки Smad взаимодействуют с Smad4 с образованием гетеромерного комплекса, который перемещается в ядро. Данный комплекс способен активировать или подавлять транскрипцию избирательных генов, которые распознают данный транскрипционный комплекс в зависимости от того, какие ядерные кофакторы присутствуют.
Путь передачи сигналов с участием ВМР/Smad отрицательно регулируется несколькими механизмами. Некоторые ВМР-связывающие белки (такие как гремлин, BABMI или фоллистатин) связывают ВМР и подавляют их взаимодействие с ВМР-рецепторами. Кроме того, имеются ингибирующие Smad-белки (например, Smad6 и Smad7), которые связываются и инактивируют ВМР-рецепторы (Kowabata et al., 1998; Itoh et al., 2000; Miyazono, 2000). Авторы настоящего изобретения установили, что человеческие клетки ТМ, астроциты ONH и клетки решетчатой полости склеры экспрессируют мРНК и белок для рецепторного комплекса ВМР. Таким образом, данные клетки могут давать ответную реакцию на эндогенные лиганды ВМР.
Для обнаружения новых терапевтических средств против глаукомы можно использовать различные методы, и данные методы хорошо известны специалистам в данной области. Например, средства на основе пептидов или пептидомиметиков, которые действуют в качестве агонистов или ингибиторов ВМР, можно установить с помощью молекулярного моделирования ВМР/ВМР-рцепторных структур (Nickel et al., 2001). Передача сигнала с участием ВМР включает избирательные группы Smad-белков (Kawabata et al., 1998; Itoh et al., 2000; Attiseno et al., 2000). Избирательные агонисты ВМР и агонисты Smad можно обнаружить с использованием клеточных тестов. Тестируемая клетка должна экспрессировать соответствующие ВМР-рецептор(ы) и располагать соответствующим путем передачи сигнала с участием ВМР. Поскольку основными эффектами передачи сигнала ВМР является изменение экспрессии гена, агонисты ВМР и агонисты Smad можно обнаружить при скрининге ВМР-индуцированных генов. Индукцию регулируемых ВМР генов также можно измерить путем количественного определения уровней мРНК с использованием количественной ОТ-ПЦР (Wang et al., 2001), микросовокупностей ДНК или конструкций репортерного гена. Имеются природные ингибиторы передачи сигнала с участием ВМР, ВМР-связывающие белки (известные как связанные с ВМР белки) такие, как хордин, гремлин и фоллистатин. Антагонисты ингибиторов белков можно обнаружить с использованием тестов связывания лиганда. Например, анализируемые агенты можно добавить к рекомбинантному очищенному гремлину, и идентифицировать те агенты, которые будут связываться с гремлином, с использованием различных методов, известных специалистам в данной области. Для определения того, являются ли данные агенты антагонистами гремлина, используют клеточный тест, аналогичный описанному выше.
Предполагается, что в сочетании с настоящим изобретением можно использовать любую известную модель скрининга in vitro и in vivo для идентификации новых лекарственных средств против глаукомы, обладающих воздействием на семейство генов ВМР. Подобные модели хорошо известны специалистам в данной области и их постановка на практике является общепринятой. Небольшие пептиды или пептидомиметиков можно сконструировать, основываясь на представлениях о структуре/функции ВМР, BMPR и/или продуктов гена, связывающихся с ВМР белков. Можно использовать тесты связывания лиганда для детектирования небольших молекул, которые связываются с ВМР, BMPR или белками, связывающимися с ВМР. При постановке клеточных тестов можно обнаружить действие различных агентов на пути передачи сигнала с участием ВМР. Можно получить клеточные линии "нокин", включающие промоторы генов семейства ВМР, связанные с репортерным геном, для обнаружения средств, которые изменяют экспрессию члена семейства генов ВМР. Данные тесты можно использовать для идентификации как молекул агонистов, так и антагонистов. Тесты ex vivo такие, как культивирование передних сегментов человеческого глаза при перфузии (Clark et al., 1995a; Pang et al., 2000), можно использовать для исследования эффектов средств на IOP и передачу сигнала с участием ВМР в ткани ТМ. Можно создать модели глаукомы на грызунах с использованием хорошо известных методов для создания стабильных трансгенных с членом семейства ВМР, без "нокаутных" или "нокиновых" штаммов мышей и крыс. Данные модели на грызунах можно использовать для скрининга средств, которые изменяют глаукомоподобный фенотип(ы) (например, с помощью тонометрии определяют воздействие на IOP, с помощью гистологии оценивают воздействие на нейрологию зрения при глаукоме).
В. Наборы
Настоящее изобретение обеспечивает способы, композиции и наборы для раннего обнаружения глаукомы. Наборы могут включать сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или белок ВМР. Набор может дополнительно включать реагенты для детектирования взаимодействия между пробой и нуклеиновой кислотой или пептидом по настоящему изобретению. Обеспеченный реагент может включать радиоизотопную, флуоресцентную или ферментативную метку. Набор может содержать известный меченый радиоизотопом агент, способный связываться или взаимодействовать с нуклеиновой кислотой или пептидом, или белком по настоящему изобретению.
Реагент набора может быть обеспечен в виде жидкого раствора, связанным с твердой подложкой или в виде сухого порошка. Предпочтительно, когда реагент обеспечивается в виде жидкого раствора, в этом случае жидкий раствор представляет собой водный раствор. Предпочтительно, когда обеспеченный реагент связан с твердой подложкой, в этом случае твердая подложка может быть средой для хроматографии, аналитическим планшетом, имеющим множество лунок, или микроскопическим стеклом. Когда обеспеченный реагент представляет собой сухой порошок, то порошок можно восстановить добавлением подходящего растворителя, который также может находиться в наборе.
В еще дополнительных воплощениях настоящее изобретение касается способов диагностики и связанных наборов для диагностики глаукомы. Предполагается, что связанные с ВМР пептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать для детектирования полиморфизма или мутаций в нуклеиновых кислотах ВМР из проб пациентов. В основном данные способы будут включать в начале получение пробы с подозрением на присутствие полиморфизма или мутации, контактирование пробы с пептидом или нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению в условиях, эффективных для образования комплекса и затем детектирование присутствия комплекса.
В основном детектирование образования комплекса довольно хорошо известно в данной области и его можно проводить при использовании различных подходов. Например, настоящее изобретение предусматривает применение ELISA, RIA, методов непрямой флуоресценции и тому подобное. Обычно образование комплекса будет детектироваться при использовании метки, такой как радиоактивная метка или ферментативная метка (такая как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и тому подобное). Конечно, можно найти дополнительные преимущества при использовании вторично связывающегося лиганда.
Последующие примеры представляют методы, использованные авторами изобретения для осуществления аспектов настоящего изобретения. Несмотря на то, что данные методы представляют примеры предпочтительных воплощений на практике изобретения, специалисты в данной области в свете настоящего описания должны понимать, что можно сделать многочисленные модификации, не отступая от сущности и предполагаемого объема изобретения.
Пример 1
Культура клеток: человеческие клетки ТМ и клетки ONH получали из глаза доноров, как описано (Steely et al., 1992; Steely et al., 2000; Wilson et al., 1993; Clark et al., 1994; Clark et al., 1995b; Clark et al., 1995c; Clark et al., 1996; Clark et al., 2001a; Clark et al., 2001b; Dickerson et al., 1998; Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al., 2000; Wordinger et al., 2002; Lambert et al., 2001; Agarwal et al., 1999; Liu et al., 2001). Клетки ТМ культивировали из эксплантатов ТМ от доноров в возрасте от 6 дней до 90 лет. Астроциты головки зрительного нерва и клетки решетчатой полости склеры (LC) человека получали из аккуратно отпрепарированных головок оптического нерва (доноры в возрасте от 2 дней до 90 лет) и охарактеризовали, как описано ранее (Lambert et al., 2001; Clark et al., 1995a). Клетки культивировали до слияния в следующей среде: среда Хэма F10 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone, Logan, UT) и антибиотики (Gibco BRL-Life Technologies, Grand Island, NY) для клеток ТМ; модифицированная по Дульбекко среда Игла (DMEM, HyClone), содержащая 10% FBS для клеток LC; и среда для культивирования астроцитов (AGM, Clonetics, San Diego, CA), содержащая 5% FBS для астроцитов ONH.
ОТ-ПЦР: ткани ТМ и ONH также иссекали из глаза доноров (Wordinger et al., 1998; Wang et al., 2001). Общую фракцию РНК выделяли из клеток и тканей ТМ и ONH с использованием экстракции TRIzol (Gibco BRL-Life Technologies) и кДНК получали обратной транскрипцией с использованием обычных методов (Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al., 2000; Wordinger et al., 2002). Праймеры для ПЦР конструировали с использованием программного обеспечения Oligos 4,0 (см. пары праймеров в таблице 1). Все пары праймеров конструировали таким образом, что в результате амплификации потенциально загрязненных последовательностей геномной ДНК получали продукты ПЦР, мРНК, которые были значительно больше, чем предполагалось, поскольку интронные последовательности, которые вырезали во время процессинга РНК, включались в геномную ДНК. Праймеры ПЦР β-актина AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC (верхние) и GAAGTCCAGGGCGACGTAGCAC (нижние) при температуре отжига 55°С давали продукт ПЦР размером 350 п.н.
Реакцию ПЦР проводили как описано (Wordinger et al., 1998; Wordinger et al., 1999; Wordinger et al., 2000; Lambert et al., 2001; Wordinger et al., 2002) с использованием Taq Start Antibody Hot Start при следующих условиях циклов: 2 минуты при 94°С, 2 минуты при 92°С и 40 циклов в течение 30 секунд при оптимальной температуре отжига, удлинения в течение 90 секунд при 72°С и денатурация в течение 45 секунд при 92°С. Амплифицированные продукты ПЦР анализировали горизонтальным электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Для обеспечения специфичности продуктов ОТ-ПЦР проводили саузерн-блоттинг с зондами, сконструированными с использованием Oligo 4.0, которые гибридизовали с областью в амплифицированном продукте ПЦР. Продукты ПЦР секвенировали для подтверждения специфичности реакции ПЦР. В таблице 2 представлены члены семейства ВМР, которые экспрессируются в ТМ и ONH человека.
Figure 00000001
Таблица 2
Члены семейства ВМР, экспрессированные в ТМ и ONH человека
Член семейства ВМР Трабекулярная сеть Головка зрительного нерва
BMP-2 + +
BMP-4 + +
BMP-5 + +
BMP-7 + +
BMPR-IA + +
BMPR-IB + +
BMPR-II + +
Хордин + +
Гремлин + +
Фоллистатин + +
Бамби + +
Ноггин - -
CER-1 - -
Вестерн-иммуноблоттинг: белок выделяли из культивированных клеток с использованием лизирующего буфера, и белки разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях перед электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозные мембраны (Lambert et al., 2001). Мембраны блокировали 5% молоком (для ВМР) или 3% желатином (для BMPR) и инкубировали со следующими первичными антителами против: ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-7 (все производства Santa Cruz, Santa Cruz, CA) или ВМР-RIA, ВМР-RIB, ВМР-RII (производства Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Мембраны промывали, инкубировали со вторичными антителами (козьи анти-мышиный IgG-пероксидаза хрена-антитела для ВМР, Santa Cruz; ослиные анти-козий IgG-пероксидаза хрена-антитела для ВМР-рцепторов, Jackson Immuno Research), и проявляли с использованием хемилюминесцентной системы для иммунодетектирования WesternBreeze (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Экспрессия мРНК ВМР, BMPR в человеческих клетках и тканях ТМ: продукты амплификации предлагаемого размера для пар праймеров ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5 и ВМР-7 в человеческих клетках и тканях ТМ представлены на фиг.6. При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. Все человеческие линии клеток и ткани ТМ экспрессировали мРНК для ВМР-2, ВМР-4 и ВМР-7. Однако уровень мРНК для ВМР-5 был низким вплоть до неопределяемого в пробах ткани ТМ человека (фиг.6, полосы 6 и 7). Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации, что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК (фиг.6, полоса С).
На фиг.7 показаны продукты амплификации предполагаемого размера для пар праймеров ВМР-RIA, ВМР-RIB и ВМР-RII в клетках и тканях ТМ человека. Все человеческие клетки и ткани ТМ экспрессировали мРНК для рецепторных комплексов ВМР. При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических праймеров было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. В реакции ПЦР с ВМР-RII детектировали альтернативный продукт амплификации (350 п.н.). Альтернативный продукт амплификации присутствовал во всех клетках и тканях ТМ человека. Данную альтернативную полосу идентифицировали для определения того, соответствует ли она альтернативной сплайсированной форме рецептора. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации (фиг.7, полоса С), что указывает на отсутствие загрязнения реагентов и праймеров ДНК или РНК.
Экспрессия мРНК ВМР и ВМР-рецепторов в человеческих клетках и тканях ONH: продукты амплификации предлагаемого размера для пар праймеров ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5 и ВМР-7 в человеческих астроцитах ONH и тканях ONH представлены на фиг.8. Все астроциты ONH и ткань ONH экспрессировали мРНК для соответствующего ВМР. Астроциты мозга человека использовали в качестве положительной контрольной клеточной линии. При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. За исключением ВМР-2 все другие ВМР экспрессировались астроцитами мозга человека (фиг.8, полоса 7). Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации (фиг.8, полоса С), что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
На фиг.9 показаны продукты амплификации предполагаемых размеров для пар праймеров ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5 и ВМР-7 в культивированных человеческих клетках LC. Все клеточные линии LC экспрессировали мРНК для каждого ВМР. При постановке саузерн-блоттинга было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации (фиг.9, полоса С), что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
Продукты амплификации предполагаемого размера для пар праймеров ВМР-RIA, ВМР-RIB и ВМР-RII в человеческих астроцитах ONH и тканях ONH представлены на фиг.10. Все клеточные линии астроцитов и ткани ONH экспрессировали мРНК для ВМР-RIA и ВМР-RIB. При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. За исключением ткани ONH (фиг.10, полоса 6), ВМР-RII экспрессировался всеми клеточными линиями астроцитов ONH. мРНК для всех ВМР-рецепторов (фиг.10, полоса 7) экспрессировалась клеточной линией астроцитов мозга человека, которая служила в качестве положительного контроля. Оказалось, что имеются различия в экспрессии ВМР-RII в ткани ONH и клеточных линиях ONH. Низкая экспрессия в ткани ONH может отражать низкий уровень экспрессии. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации (фиг.5, полоса С), что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
На фиг.11 показаны продукты амплификации предполагаемых размеров для пар праймер ВМР-RIA, ВМР-RIB и ВМР-RII в культивированных человеческих клетках LC. Все клеточные линии LC экспрессировали мРНК для каждого ВМР-рецептора. При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации (фиг.11, полоса С), что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
Экспрессия ВМР-белков и ВМР-рецепторных белков в человеческих клетках и тканях ТМ и ONH: на фиг.12 представлены результаты детектирования белков ВМР-2, ВМР-4, ВМР-5, ВМР-7, ВМР-RIA, ВМР-RIB и ВМР-RII в человеческих клетках и тканях ТМ и ONH с помощью хемилюминесцентного иммуноблоттинга. Все исследованные клеточные линии экспрессировали соответствующие белки ВМР. Белки ВМР детектировали в клеточных линиях со следующими значениями молекулярной массы: 54-56 kDa для ВМР-2, 25-27 kDa для ВМР-4, 55-57 kDa для ВМР-5 и 77 kDa для ВМР-7. Для ВМР-2 и ВМР-4 детектировали множество полос, которые наиболее вероятно соответствуют гликозилированным и частично гликозилированным формам данных ВМР, как показано в других исследованиях. Однако авторы не проводили исследований по гликозилированию, поскольку они находились вне объема данного исследования. ВМР-рецепторные белки детектировали в клеточных линиях со значениями молекулярной массы: 38 kDa для ВМР-RIA, 64 kDa для ВМР-RIB и 57 kDa для ВМР-RII. Для ВМР-RIB и ВМР-RII детектировали множество полос в клетках ТМ, которые наиболее вероятно соответствуют гликозилированным и частично гликозилированным формам, как это следует из результатов других исследований. Оказалось, что уровни экспрессии белков ВМР-рецепторов ниже в клетках ТМ по сравнению с клетками ONH. Например, ВМР-RII не детектировали в клетках ТМ, и ВМР-RIB было значительно снижено.
Экспрессия мРНК связанных с ВМР белков в культивированных человеческих клетках ТМ и человеческих клетках ONH: продукты амплификации предполагаемого размера для пар праймеров белков, связанных с ВМР, в человеческих клеточных линиях ТМ, представлены на фиг.13. Человеческие линии ТМ экспрессировали мРНК для DRM (гремлина), хордина, фоллистатина и NMA (BAMBI). При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. Явное различие в экспрессии мРНК между клеточными линиями отсутствовало. Все исследованные человеческие клетки ТМ не экспрессировали мРНК для связанных с ВМР белков ноггина и Cer-1. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации, что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
Продукты амплификации предполагаемого размера для пар праймеров связанных с ВМР белков в астроцитах ONH и клеточных линиях LC представлены на фиг.14. Все астроциты ONH и клеточные линии LC экспрессировали мРНК для DRM (гремлина), фоллистатина и NMA (BAMBI). При постановке саузерн-блоттинга с использованием специфических зондов было подтверждено, что это были предполагаемые продукты ПЦР. Большая часть клеток LC и астроцитов ONH экспрессировала мРНК для хордина. Все исследованные человеческие астроциты ONH и клетки LC не экспрессировали мРНК связанных с ВМР белков ноггина и Cer-1. Контрольные реакции без кДНК не давали продуктов амплификации, что указывает на то, что реагенты и праймеры не были загрязнены ДНК или РНК.
На фиг.15 показана повышенная экспрессия антагониста ВМР гремлина (CRTSF1B1) в клетках ТМ при глаукоме. Экспрессию гена оценивали с использованием совокупности генов Affymetrix (генные чипы U133A Affymetrix).
Все композиции и/или способы, раскрытые и заявленные в этом документе, можно осуществить и выполнить без излишнего экспериментирования в свете настоящего описания. Несмотря на то, что композиции и способы по данному изобретению описаны здесь в виде предпочтительных воплощений, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что можно внести вариации в композиции и/или способы, и стадии или последовательность стадий способа, описанного здесь, не отступая от концепции, сущности и объема изобретения. Конкретнее, очевидно, понятно, что некоторые средства, близкие в химическом и структурном отношении, можно использовать здесь вместо средств, описанных здесь с достижением аналогичных результатов. Предполагается, что все замены и модификации, известные специалистам в данной области, находятся в соответствии с сущностью, объемом и концепцией изобретения, которые определены в прилагаемой формуле изобретения.
Источники литературы
Последующие источники литературы в той степени, в которой они обеспечивают примеры методических и других деталей в дополнение к представленным в этом документе, специально включены здесь для сведения.
Книги
Figure 00000002
Figure 00000003
Другие публикации
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012

Claims (8)

1. Способ лечения глаукомы, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей по меньшей мере один агонист ВМР-4, где композицию вводят непосредственной доставкой в глаз пациента.
2. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят посредством местных глазных капель.
3. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят посредством местной глазной мази.
4. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят посредством устройства замедленного высвобождения, имплантированного в слепой мешок глаза.
5. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят посредством устройства замедленного высвобождения, имплантированного около склеры глаза.
6. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят посредством устройства замедленного высвобождения, имплантированного внутри глаза.
7. Способ по п.1, где агонист ВМР-4 вводят инъекцией.
8. Способ по п.1, где концентрация агониста ВМР-4 в композиции составляет от 0,01 до 2%.
RU2004116308/15A 2001-10-31 2002-10-31 Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы RU2336902C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33485201P 2001-10-31 2001-10-31
US60/334,852 2001-10-31

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008122296/15A Division RU2008122296A (ru) 2001-10-31 2008-06-03 Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2004116308A RU2004116308A (ru) 2005-03-27
RU2336902C2 true RU2336902C2 (ru) 2008-10-27

Family

ID=23309139

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004116308/15A RU2336902C2 (ru) 2001-10-31 2002-10-31 Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы
RU2008122296/15A RU2008122296A (ru) 2001-10-31 2008-06-03 Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы
RU2012120343/15A RU2012120343A (ru) 2001-10-31 2012-05-16 Морфогенные белки кости (bmp), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008122296/15A RU2008122296A (ru) 2001-10-31 2008-06-03 Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы
RU2012120343/15A RU2012120343A (ru) 2001-10-31 2012-05-16 Морфогенные белки кости (bmp), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы

Country Status (16)

Country Link
US (5) US7405192B2 (ru)
EP (2) EP1440159B1 (ru)
JP (2) JP4255382B2 (ru)
KR (4) KR20110032003A (ru)
CN (2) CN1966725A (ru)
AT (1) ATE349554T1 (ru)
BR (1) BR0213738A (ru)
CA (1) CA2463143A1 (ru)
DE (1) DE60217152T2 (ru)
ES (1) ES2278079T3 (ru)
HK (1) HK1069851A1 (ru)
MX (1) MXPA04003697A (ru)
PL (2) PL214839B1 (ru)
RU (3) RU2336902C2 (ru)
WO (1) WO2003055443A2 (ru)
ZA (1) ZA200402662B (ru)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110032003A (ko) * 2001-10-31 2011-03-29 알콘, 인코퍼레이티드 뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
ATE449842T1 (de) 2003-05-28 2009-12-15 Takeda Pharmaceutical Anti-bambi antikörper oder rna zur diagnose und therapie bei dickdarm- oder leberkrebs
CA2475769C (en) * 2003-08-28 2018-12-11 Veridex, Llc Colorectal cancer prognostics
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US7833971B2 (en) 2006-12-08 2010-11-16 Acceleron Pharma Inc. Uses of cerberus, coco and derivatives thereof
EP1755648A2 (en) 2004-05-27 2007-02-28 Acceleron Pharma Inc. Cerberus/coco derivatives and uses thereof
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
BRPI0510883B8 (pt) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc composto conjugado de droga e anticorpo, composição farmacêutica, método de fabricação de composto conjugado de droga e anticorpo e usos de uma formulação, de um conjugado de droga e anticorpo e um agente quimioterapêutico e de uma combinação
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
JP4993645B2 (ja) 2004-12-01 2012-08-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体薬剤結合体および方法
WO2007028212A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Apollo Life Sciences Limited Noggin and chimeric molecules thereof
CA2659464A1 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Alcon Research, Ltd. Rnai-mediated inhibition of gremlin for treatment of iop-related conditions
MX2009004718A (es) 2006-11-02 2009-06-19 Acceleron Pharma Inc Antagonistas de receptor de alk1 y ligando y sus usos.
US8642031B2 (en) 2006-11-02 2014-02-04 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof
US10059756B2 (en) 2006-11-02 2018-08-28 Acceleron Pharma Inc. Compositions comprising ALK1-ECD protein
AU2009241755B2 (en) 2008-05-02 2015-10-01 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions based on ALK1 antagonists for modulating angiogenesis and pericyte coverage
AU2009270988A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Genentech, Inc. Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
CN102741394B (zh) 2009-10-16 2016-05-04 斯克里普斯研究所 多能细胞的诱导
WO2011116212A2 (en) * 2010-03-17 2011-09-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Bone morphogenetic protein receptor binding agents and methods of their use
ES2430567T3 (es) 2010-04-15 2013-11-21 Spirogen Sàrl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados de las mismas
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
US8679767B2 (en) 2011-05-12 2014-03-25 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring LC-MS/MS method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
PT2750713E (pt) 2011-10-14 2016-01-20 Genentech Inc Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
JP6339063B2 (ja) 2012-03-15 2018-06-06 エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション グレムリン−１に対する抗体
AU2013328623B8 (en) 2012-10-12 2017-06-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
SI2906253T1 (sl) 2012-10-12 2018-11-30 Adc Therapeutics Sa Konjugati pirolobenzodiazepin-protitelo proti PSMA
US10695433B2 (en) 2012-10-12 2020-06-30 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2649990T3 (es) 2012-10-12 2018-01-16 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpos anti-CD22-pirrolobenzodiazepinas
NZ707543A (en) 2012-10-12 2018-09-28 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2680153T3 (es) 2012-10-12 2018-09-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
ES2530968T3 (es) 2012-10-12 2015-03-09 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
CA2894961C (en) 2012-12-21 2020-09-15 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US9567340B2 (en) 2012-12-21 2017-02-14 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
AU2014229529B2 (en) 2013-03-13 2018-02-15 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN105209077B (zh) 2013-03-13 2019-06-11 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓以及其结合物
CA2901941C (en) 2013-03-13 2020-04-07 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AU2014241442B2 (en) 2013-03-14 2018-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to GREM 1
EP3033111B1 (en) 2013-08-12 2019-03-13 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
WO2015052535A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015052532A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
RU2689388C1 (ru) 2013-12-16 2019-05-28 Дженентек, Инк. Пептидомиметические соединения и их конъюгаты антител с лекарственными средствами
MX2016007578A (es) 2013-12-16 2016-10-03 Genentech Inc Compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco dimerico de 1-(clorometil)-2,3-dihidro-1h-benzo [e] indol, y metodos de uso y tratamiento.
CN107106700B (zh) 2013-12-16 2020-10-30 基因泰克公司 肽模拟化合物及其抗体-药物缀合物
US10610570B2 (en) 2014-07-09 2020-04-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating rotator cuff conditions
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AR101844A1 (es) 2014-09-12 2017-01-18 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados genéticamente con cisteína
CN106714844B (zh) 2014-09-12 2022-08-05 基因泰克公司 蒽环类二硫化物中间体、抗体-药物缀合物和方法
EP3194400A1 (en) 2014-09-17 2017-07-26 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
WO2016090050A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
WO2017011762A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating rotator cuff conditions
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
KR101921784B1 (ko) * 2015-10-13 2018-11-23 사회복지법인 삼성생명공익재단 그램린-1을 코딩하는 뉴클레오타이드 또는 그램린-1을 유효성분으로 포함하는 안 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
MA43354A (fr) 2015-10-16 2018-08-22 Genentech Inc Conjugués médicamenteux à pont disulfure encombré
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN105807065B (zh) * 2016-03-16 2018-10-02 沈慧勇 BMP2和Noggin联合使用在制备强直性脊柱炎诊断试剂盒中的应用
EP4273551A3 (en) 2016-03-25 2024-01-17 F. Hoffmann-La Roche AG Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
JP7022080B2 (ja) 2016-05-27 2022-02-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 部位特異的抗体－薬物複合体の特徴付けのための生化学分析的方法
JP7043425B2 (ja) 2016-06-06 2022-03-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド シルベストロール抗体－薬物コンジュゲート及び使用方法
JP7093767B2 (ja) 2016-08-11 2022-06-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド ピロロベンゾジアゼピンプロドラッグ及びその抗体コンジュゲート
CN106086229B (zh) * 2016-08-26 2019-08-16 广东省农业科学院动物科学研究所 鸡生长性状相关的分子标记及其鉴别方法和应用
JP7050770B2 (ja) 2016-10-05 2022-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体薬物コンジュゲートの調製方法
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
AU2018217926B2 (en) 2017-02-08 2019-10-03 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP2020517609A (ja) 2017-04-18 2020-06-18 メディミューン リミテッド ピロロベンゾジアゼピン複合体
EP3612234B1 (en) 2017-04-20 2024-03-13 ADC Therapeutics SA Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
US11318211B2 (en) 2017-06-14 2022-05-03 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC
SI3668874T1 (sl) 2017-08-18 2022-04-29 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepinski konjugati
US20200216463A1 (en) 2017-09-20 2020-07-09 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
CN108531608B (zh) * 2018-01-24 2020-06-30 华南农业大学 Bmp6基因作为黑山羊产羔数性状的分子标记
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
WO2020086858A1 (en) 2018-10-24 2020-04-30 Genentech, Inc. Conjugated chemical inducers of degradation and methods of use
CN113227119A (zh) 2018-12-10 2021-08-06 基因泰克公司 用于与含Fc的蛋白质进行位点特异性缀合的光交联肽
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
WO2020229628A1 (en) * 2019-05-15 2020-11-19 Novo Nordisk A/S Methods for obtaining eye field progenitor cells from human pluripotent stem cells
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
WO2024138128A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5041538A (en) * 1987-08-28 1991-08-20 The Salk Institute For Biological Studies Mammalian follistatin
IT1224795B (it) * 1988-12-01 1990-10-24 Sigma Tau Ind Farmaceuti Uso dell'acetil d-carnitina nel trattamento terapeutico del glaucoma e composizioni farmaceutiche utili in tale trattamento
CZ282231B6 (cs) * 1991-06-05 1997-06-11 The Procter And Gamble Company Prostředek na generování nového růstu kosti v savci
US5364884A (en) * 1993-01-21 1994-11-15 Baylor College Of Medicine Arginine compounds as ocular hypotensive agents
JPH10511840A (ja) * 1994-04-29 1998-11-17 クリエイティブ バイオモレキュールズ，インコーポレイテッド 形態形成タンパク質特異細胞表面レセプターおよびその使用
US5606043A (en) 1994-11-03 1997-02-25 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5846770A (en) * 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US5856094A (en) * 1995-05-12 1999-01-05 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of neoplastic cells
US6040431A (en) * 1995-06-07 2000-03-21 Stryker Corporation Single chain analogs of the TGF-β superfamily (morphons)
ES2152563T3 (es) 1995-08-31 2001-02-01 Lonza Ag Procedimiento para preparar derivados de dihidroxipirimidina.
JP2001503631A (ja) * 1996-11-08 2001-03-21 ユニヴァーシティー オブ アイオワ リサーチ ファンデーション 緑内障に関連するタンパク質ならびに対応する核酸とそれらの治療および診断への利用
AU5244998A (en) 1996-11-15 1998-06-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen-induced regeneration of sense perceptory tissues
PT943014E (pt) * 1996-12-05 2007-03-30 Alcon Mfg Ltd Métodos para diagnóstico do glaucoma e descoberta de farmacos antiglaucoma
US5989885A (en) * 1997-01-10 1999-11-23 Myriad Genetics, Inc. Specific mutations of map kinase 4 (MKK4) in human tumor cell lines identify it as a tumor suppressor in various types of cancer
EP0973926A1 (en) * 1997-03-14 2000-01-26 Selective Genetics, Inc. Adenoviral vectors with modified tropism
US6207450B1 (en) 1998-04-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Glaucoma therapeutics and diagnostics based on a novel human transcription factor
EP1157130A1 (en) * 1999-02-26 2001-11-28 Hibergen Limited Identification of genes having a role in the presentation of diabetic nephropathy
WO2000061774A2 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Human Genome Sciences, Inc. Bone morphogenic proteins
AU4700300A (en) * 1999-05-07 2000-11-21 Human Genome Sciences, Inc. Serine proteases
CA2387696A1 (en) * 1999-06-11 2000-12-21 Human Genome Sciences, Inc. 48 human secreted proteins
WO2002077006A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Human Genome Sciences, Inc. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US20030092019A1 (en) * 2001-01-09 2003-05-15 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating neuropsychiatric disorders such as schizophrenia
US20030096813A1 (en) 2001-04-20 2003-05-22 Jingrong Cao Compositions useful as inhibitors of GSK-3
KR20110032003A (ko) 2001-10-31 2011-03-29 알콘, 인코퍼레이티드 뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ 결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도
JP5112061B2 (ja) 2004-07-02 2013-01-09 ストラスボー ウエハ処理方法およびシステム

Also Published As

Publication number Publication date
BR0213738A (pt) 2006-11-21
RU2008122296A (ru) 2009-12-10
KR20100127891A (ko) 2010-12-06
PL373863A1 (en) 2005-09-19
US20100204086A1 (en) 2010-08-12
US20050118585A1 (en) 2005-06-02
WO2003055443A2 (en) 2003-07-10
US20030134308A1 (en) 2003-07-17
US20080194515A1 (en) 2008-08-14
ZA200402662B (en) 2006-07-26
AU2002364946A1 (en) 2003-07-15
JP2008301834A (ja) 2008-12-18
PL396553A1 (pl) 2012-01-30
CA2463143A1 (en) 2003-07-10
HK1069851A1 (en) 2005-06-03
EP1440159B1 (en) 2006-12-27
WO2003055443A3 (en) 2004-03-25
KR101072867B1 (ko) 2011-10-17
RU2004116308A (ru) 2005-03-27
US7744873B2 (en) 2010-06-29
EP1440159A4 (en) 2005-04-13
ES2278079T3 (es) 2007-08-01
RU2012120343A (ru) 2013-11-27
JP4255382B2 (ja) 2009-04-15
CN1966725A (zh) 2007-05-23
US20120059049A1 (en) 2012-03-08
MXPA04003697A (es) 2005-04-08
US8389496B2 (en) 2013-03-05
EP1440159A2 (en) 2004-07-28
DE60217152D1 (de) 2007-02-08
DE60217152T2 (de) 2007-10-31
ATE349554T1 (de) 2007-01-15
JP2005518788A (ja) 2005-06-30
PL214839B1 (pl) 2013-09-30
CN1685055A (zh) 2005-10-19
US7405192B2 (en) 2008-07-29
EP2053135A1 (en) 2009-04-29
KR20110032003A (ko) 2011-03-29
KR100996226B1 (ko) 2010-11-24
KR20100013352A (ko) 2010-02-09
KR20040054726A (ko) 2004-06-25
US8063013B2 (en) 2011-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2336902C2 (ru) Морфогенные белки кости (вмр), рецепторы вмр и связывающие вмр белки и их применение для диагностики и лечения глаукомы
Wordinger et al. Effects of TGF-β2, BMP-4, and gremlin in the trabecular meshwork: implications for glaucoma
US20070141609A1 (en) Screening and Therapy for Lymphatic Disorders Involving the FLT4 Receptor Tyrosine Kinase (VEGFR-3)
Young et al. SVEP1 as a genetic modifier of TEK-related primary congenital glaucoma
US20120010276A1 (en) Screening and therapy for lymphatic disorders involving the flt4 receptor tyrosine kinase (vegfr-3)
CN113646432A (zh) 用血管生成素样7(angptl7)抑制剂治疗眼科疾病
AU2014329606B2 (en) Methods for the identification, assessment, prevention, and treatment of neurological disorders and diseases using Fndc5
Muralidharan et al. Growth differentiation factor-15–induced contractile activity and extracellular matrix production in human trabecular meshwork cells
EP2491143B1 (en) Methods and compositions for diagnosis and treatment of genetic and retinal disease
JP5737721B2 (ja) Ｈｔｒａ１変異と家族性虚血性脳小血管病との関連
US20120003244A1 (en) Methods for apcdd1 mediated regulation of hair growth and pigmentation and mutants thereof
RU2812912C2 (ru) Лечение офтальмологических патологических состояний ингибиторами ангиопоэтин-подобного белка 7 (angptl7)
AU2002364946B2 (en) Bone morphogenic proteins (BMP), BMP receptors and BMP binding proteins and their use in the diagnosis and treatment of glaucoma
EP1738767A1 (en) Bone morphogenic proteins (BMP), BMP receptors and BMP binding proteins and their use in the diagnosis and treatment of glaucoma
WO2021172315A1 (ja) Ｌａｍｃ２－ｎｒ６ａ１スプライシングバリアント及びその翻訳産物
CN110257465A (zh) Wwox作为防治癌症的药物靶点的应用
Jansen et al. MILD PHENOTYPE IN TUBEROUS SCLEROSIS PATIENTS WITH CODON 905 MISSENSE MUTATIONS IN THE TSC2 GENE
Apte The Edward N. & Della L. Thome Memorial Foundation Awards Program in Age-Related Macular Degeneration Research

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20121101