JP5737721B2 - Htra1変異と家族性虚血性脳小血管病との関連 - Google Patents
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Description
本出願は、全体を参照により本明細書に組み込んだ2009年4月20日出願の米国仮出願第61/170,762号の優先権の利益を主張する。
(1)HTRA1遺伝子の遺伝子変異
遺伝子変異の情報は、遺伝子変異を検出するための従来の方法によって得ることができる。例えば、配列決定法、PCR法、鋳型として配列特異的オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーション法(例えば、TaqManPCR法)などを使用することができる。PCR法および直接配列決定法は、遺伝子変異の任意の種類を検出するために使用することができる。
HTRA1遺伝子の変異は、直接配列決定法を使用することによって検出することができる。このアッセイでは、DNA試料はまず、適切な方法によって対象から採取する。標的検出領域は、適切なベクターにクローニングし、宿主細胞(例えば、細菌細胞)の増殖によって増幅させる。あるいは、標的検出領域内のDNAはPCRを使用することによって増幅してもよい。増幅後、標的検出領域内のDNAに適切な方法による配列決定を実施する。このような配列決定法の例には、限定はしないが、自動配列決定法が含まれる。このような自動配列決定法の例には、ダイターミネーターを使用する方法などが含まれる。 配列決定結果は、適切な表示方法によって示される。その後、予め決定した変異の有無が測定される。
本発明では、HTRA1遺伝子の変異は、PCRをベースにしたアッセイを使用することによって検出することができる。PCRアッセイは、変異型または野生型対立遺伝子内においてのみハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。DNA試料は、変異型および野生型のためのプライマーからなるプライマーセットを使用することによって増幅する。変異型プライマーのみがPCR産物を生成するとき、対象は変異型対立遺伝子を有することを示唆している。野生型プライマーのみがPCR産物を生成するとき、対象が野生型対立遺伝子を有することを示唆している。
本発明では、HTRA1遺伝子の変異は、ハイブリダイゼーションアッセイを使用することによって検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、試料から得られたDNAが相補的DNA分子(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)とハイブリダイズする能力に基づいて、予め決定した変異の有無を測定する方法である。ハイブリダイゼーションアッセイは、様々なハイブリダイゼーション技術および検出技術によって実施する。プローブが標的検出配列(例えば、変異)とハイブリダイズするかどうかは、ハイブリダイズしたプローブを視覚化することによって直接検出することができる。この方法は、ノーザンアッセイまたはサザンアッセイとして知られている(Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1991))。その後、予め決定した変異の有無を測定する。
(1)siRNAおよびshRNA
TGF-βによるシグナル伝達を阻害するために、TGF-βの発現および/または機能を阻害する方法を使用する。TGF-βによるシグナル伝達を阻害するために、RNA干渉(RNAi)を使用することができる。TGF-β遺伝子を標的とするsiRNA(低分子干渉RNA)は、RNAi用の細胞を形質導入するために設計し、合成することができる。RNAiとは、dsRNA(2本鎖RNA)が特異的および選択的に標的遺伝子に結合し、その後除去されて、標的の発現を効率よく阻害する現象である。例えば、dsRNAを細胞に導入すると、RNAと相同な配列を有する遺伝子の発現がノックダウンする。siRNAは以下のように設計する。
本発明におけるデコイ核酸とは、転写因子が結合する部位を含む短いデコイ核酸を意味する。この核酸が細胞に形質移入されると、転写因子はこの核酸に競合的に結合して、転写因子がゲノム上の本来の結合部位に結合するのを阻害する。結果として、転写因子の発現が阻害される。通常は、デコイ核酸は、標的結合配列に結合することができる少なくとも1つの核酸配列を含有する核酸およびその核酸の類似体である。デコイ核酸は、1本鎖または相補鎖を含む2本鎖を作製することによって、TGF-βまたはプロTGF-βのヌクレオチド配列をベースにして設計することができる。長さに特に制限はないが、所望する長さは、15から60塩基、好ましくは20から30塩基の範囲である。
本発明は、脳血管疾患を治療または予防するための、1つまたは複数の前記siRNA、shRNAまたはデコイ核酸を含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物が適用可能な疾患には、CARASILが含まれる。本発明の医薬組成物をこれらの疾患に適用するとき、前記疾患は、単独で存在することができ、または複数の疾患を伴うこともできる。
「キット」という用語は、野生型または変異型HTRA1遺伝子を増幅するプライマーセットを供給するための供給システムを意味する。反応アッセイ法で使用する場合は、反応試薬および/または補助物質を保存、輸送または供給するためのシステムをこのような供給システムに含める。このような反応試薬の例には、限定はしないが、容器に含めたオリゴヌクレオチドおよび酵素が含まれる。このような補助物質の例には、限定はしないが、緩衝剤および指示書が含まれる。このようなキットの例には、関連反応試薬および/または補助物質などを含有する少なくとも1種の収納単位(例えば、箱)が含まれる。
被験者および遺伝子分析
アジア人(日本人)を祖先とする血縁家族の5人の発端者および連鎖分析のためにそれらの家族のメンバーの数人を登録した(表1および図1Aにおける家族2285、1872、2321、2402および2520)。CARASILの原因遺伝子を同定した後、病理学的に確認されたCARASILを有する家族3119の被験者を一人追加登録した(表1)。家族3119の患者の神経病理学的検査において、内膜肥厚および高密度のコラーゲン繊維に関連した動脈硬化症が脳小動脈に認められた(図1I)。参加者または家族のメンバーの自己申告書類によって、祖先を決定した。発端者は、核磁気共鳴画像法においてびまん性白質病変、常染色体劣性遺伝、20年から50年の間の症状の発症および脊椎症または脱毛症を示した(表1および図1E、1F、1Gおよび1H)6〜8。
候補領域を絞るために、カリフォルニア大学サンタクルーズゲノムブラウザデータベース(http://genome.ucsc.edu/index.html)の2006のヒト参照配列から得られた単純反復情報に基づいて、5つの新たなマイクロサテライトマーカー、すなわち、M1236、M1238、M1241、M1260およびM1264を確立した。
野生型または1〜140コドンを欠如した変異型HTRA1相補DNA(cDNA)をベクターpGEX 6P-3にサブクローニングして、大腸菌(Escherichia coli)内でグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合物としてポリペプチドを発現させた(GE Healthcare)。HTRA1のプロテアーゼ活性が消失するセリンプロテアーゼモチーフS328Aのアミノ酸置換を陰性対照として使用した14。GST融合タンパク質を過剰発現させ、精製した。FITC標識基質β−カゼインを使用したプロテアーゼ活性を、組換えGST-HTRA1を使用することによってQuantiCleave Fluorescentプロテアーゼアッセイキット(Pierce)で評価した。GST-HTRA1のN-末端の欠如がプロテアーゼ活性の結果に影響を及ぼす可能性を排除するために、緑色蛍光蛋白質(GFP)でタグ付けした完全長野生型または変異型HTRA1を安定的に発現する細胞の培養上清を使用して同一のプロテアーゼアッセイも実施した。GFPタグ付けHTRA1タンパク質は、抗GFP抗体(MBL)を使用することによって検出した。
全RNAは、全血または培養皮膚線維芽細胞から単離した。cDNAは、High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)で合成した。HTRA1の遺伝子特異的プライマーを使用して、全血中のHTRA1mRNAの発現をアッセイした。グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素の発現と比較して、培養した皮膚線維芽細胞におけるHTRA1 mRNAレベルをアッセイするために、特異的TaqMan(登録商標)プローブおよびプライマーセット(Applied Biosystems)を使用して、リアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施した。SYBR Greenアッセイ(Applied Biosystems)を使用したリアルタイム定量的RT-PCRによって、β−アクチンの発現と比較した培養皮膚線維芽細胞におけるNOG mRNAレベルをアッセイした。
HTRA1におけるR370Xナンセンス変異が変異型対立遺伝子のmRNAの欠如を生じるかどうかを測定するために、全血のmRNAを分析した。全RNAをPAX Gene Blood RNA kit(Pre-Analytix)で単離した。cDNAは、High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)で合成した。PCRは以下のプライマー対で実施した。
フォワードプライマー:5’-CGCCATCATCAACTATCG-3’(配列番号15)
リバースプライマー:5’-GTCAAAAGTCTTGAGTGTCC-3’(配列番号16)
RT-PCR産物は、2%アガロースゲルで分析し、同じプライマーを使用して配列決定した。
NOG mRNAについて
フォワードプライマー:5’-CCAGCACTATCTCCACATC-3’(配列番号17)
リバースプライマー:5’-GCAGCGTCTCGTTCAGATC-3’(配列番号18)
β−アクチンmRNAについて
フォワードプライマー:5’-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3’(配列番号19)
リバースプライマー:5’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-3’(配列番号20)
GeneTailor部位特異的変異導入システム(Invitrogen)を使用してHTRA1変異型および構成的活性型TGF-β1プロタンパク質(活性化した変異型C223S/C225Sを含有するproTGF-β1)17をコードするcDNAを合成し、その後pcDNA DEST-40ベクター(Invitrogen)にこれらのcDNAを個々にサブクローニングした。構成的活性型TGF-β1は、活性化した変異型C223S/C225Sを含有するpro-TGF-β1から合成した。ヒト全脳cDNAライブラリー(Clontech)からSMAD2 cDNAを単離し、pcDNA DEST-40ベクターにサブクローニングした。ルシフェラーゼアッセイは以前に記載されたように実施した15、16。マウスC2C12筋芽細胞をpRL-TKウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド、HTRA1発現ベクター並びに以下の構築物で同時形質移入した:(SBE)4−ホタルルシフェラーゼベクター(TGF-β応答性レポーターベクター)並びにSMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するTGF-β1をコードする)を含有するベクター17;pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)16並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-4(プロ骨形態形成タンパク質4をコードする)を含有するベクター;pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)16並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-2(pro-BMP-2をコードする)を含有するベクター18。細胞抽出物をルシフェラーゼ活性に関してDual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)を使用してアッセイした。活性は、pRL-TKウミシイタケルシフェラーゼ活性を使用して形質移入効率について補正した。各試料を3連で形質移入し、各実験は3回繰り返した。
ヒト胚性腎(HEK)293細胞を、HTRA1を含有するベクター並びに以下の構築物で同時形質移入した:SMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGF-β1をコードする)を含有するベクター;SMAD1、SMAD4およびBMP-4を含有するベクター;SMAD1、SMAD4およびBMP-2を含有するベクター17、18。細胞は、ホスファターゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中で溶解した。抗Smad1、抗ホスホ-Smad1/5/8、抗Smad2/3および抗ホスホ-Smad2(Cell Signaling)抗体を使用して、ウエスタンブロットによる分析によって、それぞれSmad1、リン酸化Smad1、Smad2およびリン酸化Smad2タンパク質を検出した。
検死解剖した2人のCARASIL患者および検死解剖した対照患者(脳卒中の84歳女性患者、統合失調症患者および筋萎縮性側索硬化症患者)から採取し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した脳の免疫ペルオキシダーゼ染色を実施した8、9。1次抗体はTGF-β1(1:50、Santa Cruz)、バーシカン(1:100、Seikagaku)およびフィブロネクチンED-A(1:100、Abcam)に対するものである。陰性対照として、非免疫性イムノグロブリンGを使用した。ジゴキシゲニン標識アンチセンスおよびセンス相補的RNAプローブの鋳型として、フィブロネクチンのED-Aドメイン(フィブロネクチンアイソフォーム1:NM_212482.1の5404〜5704ヌクレオチド断片)をコードするcDNAを使用した。陰性対照として、センスプローブを使用した。パラフィン包埋切片においてプローブでin situハイブリダイゼーションを実施した。洗浄およびブロッキングを行った後、この切片をアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体でインキュベートした。4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸溶液(Roche)中でシグナルを発生させた。この切片をファストレッドで対比染色した。
遺伝子分析
5家族の全ゲノム連鎖解析の実施において、D10S587およびD10S1656(θ=0.0)で最大累積ペアワイズLODスコア3.97および3.59が得られ、これらのマーカーは全患者においてホモ接合型であった(図1A)。次に、D10S1483および5つの確立された多型マイクロサテライトマーカー(M1236、M1238、M1241、M1260およびM1264、表2参照)を使用して、D10S597とD10S575との間の領域をファインマップした(図1Aおよび1B)。M1236とM1260との間の領域は、発端者全てにおいてホモ接合型であったため、原因遺伝子は、この2.4Mb領域内に位置することが示唆された。
ミスセンス変異またはR370Xのいずれかを含有する構築物によってコードされたHTRA1のプロテアーゼ活性は、野生型HTRA1の活性の21〜50%であった。対照的に、R370X変異を含有する構築物によってコードされたHTRA1は、野生型HTRA1と類似のプロテアーゼ活性を有した(図2AおよびB)。HTRA1はα1-アンチトリプシンの反応性中心ループを攻撃し、α1-アンチトリプシンのセリンプロテアーゼ活性を高め、それによって2分子間の共有結合複合体の形成を媒介する14。α1-アンチトリプシンとV297M、A252TまたはR302Xのいずれかを含有するcDNAによってコードされた変異型HTRA1との間には、安定な複合体の形成は認められなかった。対照的に、野生型HTRA1およびR370Xを含有するcDNAによってコードされたHTRA1は、α1−アンチトリプシンと安定な複合体を形成した(図2C)。
未成熟終止コドンが最も3’側のエキソン−エキソン接合部の少なくとも50から55ヌクレオチド上流に位置する場合は、メッセンジャーRNA(mRNA)はナンセンス変異依存分解機構によって分解され得る20。R370Xの位置はこれらの基準を満たすので(図1C)、R370X含有HTRA1 mRNAがナンセンス変異依存分解機構によって分解されるかどうかを測定した。R370X変異を有する患者の線維芽細胞におけるHTRA1 mRNA発現のレベルは、対照患者のレベルの6.0%であり、ナンセンス変異依存分解機構の阻害剤、シクロヘキシミドで処理すると、R370X HTRA1 mRNAの発現は基準レベルの発現の4倍に増加した(図3A)。R370X変異を有する患者の線維芽細胞の培地中では、HTRA1タンパク質は検出されなかった(図3B)。さらに、この変異のヘテロ接合型の保有者の白血球のHTRA1の分析によって、野生型HTRA1 mRNAのみの存在が示された(図3C)。
HTRA1のセリンプロテアーゼ活性は、TGF-βファミリーシグナル伝達の阻害に必要である15。したがって、「ミスセンス」アミノ酸を有するHTRA1の変異種がTGF-βファミリーのメンバー、TGF-β、BMP-4およびBMP-2によるシグナル伝達を抑制する能力を試験した(図4Aおよび図5)。予測通り、ミスセンス変異したHTRA1タンパク質はいずれもこれらの分子によるシグナル伝達を抑制しなかった。HTRA1プロテアーゼ活性がリポーター系に直接影響を及ぼす可能性を排除するため、これらのアッセイにおいてSmadのリン酸化をアッセイし(リン酸化SmadはTGF-βシグナル伝達経路の下流エフェクターである)、変異型HTRA1がいずれもSmadタンパク質のその後のリン酸化を抑制しないことを観察した(図4Bおよび図6)。
TGF-βファミリーのシグナル伝達は、血管新生および再構築に密接に関与しており、細胞の種類および細胞外マトリクスに応じて、血管の内皮細胞および血管の平滑筋細胞において多面的な役割を果たしている25、26。さらに、TGF-βファミリーのシグナル伝達の調節異常は、遺伝性血管障害を生じる26。TGF-β受容体における変異による不完全なTGF-βのシグナル伝達は、遺伝性出血性毛細血管拡張症を引き起こし、他方、TGF-βのシグナル伝達の活性化は、マルファン症候群および関連障害に関与する26。我々の知見は、遺伝性虚血性脳小血管病を含めるため、TGF-βのシグナル伝達の調節異常によって引き起こされることが示された様々な疾患に適用される。さらに、CARASILにおける病理学的所見は、高血圧を有する非遺伝性虚血性脳小血管病で認められたものと類似しており、高血圧はTGF-βのシグナル伝達を増加させる可能性がある7〜11、27。したがって、TGF-βのシグナル伝達は高血圧を伴う非遺伝性虚血性脳小血管病の分子的基礎となり得る。
図1.CARASILの家族の系図およびHTRA1変異
パネルAは、CARASILの患者の系図を示す。四角は男性、丸は女性、黒い印は罹患した家族のメンバー、白い印は罹患していないメンバー、2重の横線は近親婚を示す。マイクロサテライトマーカーは、セントロメアからq腕末端までの順番で示す。元々開発されたマイクロサテライトマーカーは、青色で示す。相が明瞭に特定されていない対立遺伝子は括弧内に示す。罹患した対象それぞれのホモ接合体の領域は四角で囲ってある。パネルBは、染色体10qのCARASILの候補領域の物理地図を示す。パネルCは、9つのエキソン(四角)からなるHTRA1の変異の分布を示す。色のついた四角は、インシュリン様増殖因子結合タンパク質ドメイン(緑)、Kazal型セリンプロテアーゼ阻害因子ドメイン(赤)、トリプシン様セリンプロテアーゼドメイン(青)、PDZドメイン(黄色)および非翻訳領域(灰色)に対応するエキソンを表す。ミスセンス変異は黒であり、ナンセンス変異は赤である。パネルDは、CARASILにおいて変異したHTRA1残基の保存を示す。保存されたアミノ酸残基は影付きである(黒、100%、濃灰色、80%、灰色 60%)。配列はGenBankから入手した。厚さ5mmの脳のT2強調核磁気共鳴画像法(繰り返し時間、5000msec、エコー時間、150msec)は、大脳基底核および白質における虚血領域を示しており(パネルEおよびF、被験者II-7、家族2321)、厚さ5mmの腰部T1強調核磁気共鳴画像法(繰り返し時間、519msec、エコー時間、19msec)は腰椎の脊椎性変化を示した(パネルG、被験者II-3、家族1872)。頭部の側頭部および/または頭頂部のびまん性脱毛が認められた(被験者II-2、家族2285、パネルH)。家族3119の被験者II-1のクモ膜の脳小動脈は、著しい内膜肥厚、管腔の狭小化、ヒアリン症および内部の弾性膜の***を示した(パネルI、エラスチカワンギーソン染色)。
パネルAおよびBは、変異したHTRA1のFITC標識β-カゼインアッセイを示す。蛍光単位は、プロテアーゼ活性を表す。C末端に緑色蛍光蛋白質(GFP)でタグ付けしたHTRA1(パネルA)または大腸菌(E.coli)で発現したN末端欠失組換えHTRA1(パネルB)を安定発現するHEK293細胞の培養上清を、FITC標識β-カゼインと共にインキュベートした。HTRA1タンパク質の量は、抗GFP抗体によるイムノブロッティング(パネルA)またはクーマシーブリリアントブルー(CBB)染色(パネルB)によって示された。棒は標準誤差を表す。パネルCは、α-アンチトリプシンと野生型(WT)またはR370X HTRA1のいずれかとの間の共有結合複合体形成(高分子量産物、上図)を示す。安定なHtrA/α1-アンチトリプシン複合体の形成は、その他の変異型HTRA1では生じなかった。HTRA1タンパク質の量は、抗V5抗体によるイムノブロッティングによって示された(下図)。
パネルAは、ナンセンス変異依存分解機構阻害剤シクロヘキシミド(CHX;100μg/ml)の存在下、または非存在下において4時間後の、R370X HTRA1を有する家族2285、被験者II-2の培養皮膚線維芽細胞におけるHTRA1 mRNAレベルを対照患者(n=4)の細胞のレベルのパーセントとして示している。棒は標準誤差を表す。パネルBは、R370Xを有する家族2285、被験者II-2および対照患者の培養皮膚線維芽細胞を使用したHTRA1抗体(MAB2916; R&D Systems)によるHTRA1のウエスタンブロット分析を示している。パネルCは、RT-PCRアッセイの結果を示している。転写物の長さが600bpであることが予測されるHTRA1 PCR増幅産物は、家族2285、ヘテロ接合型II-1の末梢血から調製したcDNAから得られたのに対し、家族2285、被験者II-2の末梢血から調製したcDNAからは得られなかった。電気泳動図は、影響を受けなかった家族2285、ヘテロ接合型被験者II-1の白血球のゲノムDNAから得られたPCR産物における野生型および変異型(C1108→T)を示しており、他方、野生型対立遺伝子のみが同一個体の白血球のRNAから得られた逆転写PCR産物において検出された。
パネルAでは、C2C12細胞をpRL-TKウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド、野生型(WT)または変異型HTRA1発現プラスミド並びに以下の構築物で同時形質移入した:(左)(SBE)4−ホタルルシフェラーゼベクター(TGF-β応答性レポーターベクター)並びにSMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGFβ1をコードする)を含有するベクター17;(中央)pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)16並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-4(プロ骨形態形成タンパク質4をコードする)を含有するベクター;(右)pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)16並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-2(pro-BMP-2をコードする)を含有するベクター18。データは、3回の独立した実験から正規化したホタルルシフェラーゼ/ウミシイタケルシフェラーゼ活性の標準誤差を含む平均を表す。パネルBでは、HEK293細胞をWTまたは変異型HTRA1-V5発現ベクター以下の構築物で同時形質移入した:(左)(SBE)SMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGF-β1をコードする)を含有するベクター17;(中央)SMAD1、SMAD4およびBMP-4(プロ骨形態形成タンパク質4をコードする)を含有するベクター;SMAD1、SMAD4およびBMP-2(プロBMP-2をコードする)を含有するベクター18。リン酸化Smadタンパク質の比は、全細胞溶解物のイムノブロッティングによって調べた。データは、4回の独立した実験の標準誤差を含む平均を表す。パネルAおよびBでは、WT-HTRA1の平均値は、チューキー多重比較試験によって他のものよりも著しく低かった(P<0.05)。パネルCでは、2人の対照患者およびR370X HTRA1を有する家族2285、被験者II-2の線維芽細胞をpRL-TKウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド並びにSMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGF-β1をコードする)を含有するベクター17で同時形質移入した。R370Xの平均値は、チューキー多重比較試験によって他のものよりも著しく高かった(P<0.05)。パネルDは、R370X HTRA1を有する家族2285、被験者II-2の線維芽細胞におけるNOG mRNAレベルを対照患者(n=4)の線維芽細胞のレベルの比として示している。パネルE、F、G、H、I、J、KおよびLでは、検死解剖した家族3119、被験者II-1(R302X変異のホモ接合型)の脳小動脈は、著しい内膜増殖(パネルEおよびG、エラスチカワンギーゾン染色)、内膜におけるED-Aフィブロネクチンの発現増加(パネルFおよびH、IST-9抗体)、内皮細胞および内皮下平滑筋細胞におけるED-AフィブロネクチンのmRNA発現増加(パネルIおよびJ)並びに内膜におけるバーシカン(パネルK)および中膜におけるTGF-β1(パネルL)の発現増加を示す。パネルM、N、OおよびPでは、検死解剖した対照患者(筋萎縮性側索硬化症を有する40歳女性)の脳小動脈の免疫組織化学分析。エラスチカワンギーゾン染色(パネルM)ならびに抗EDA-フィブロネクチン抗体(IST-9、パネルN)、抗バーシカン抗体(パネルO)および抗TGF-β1抗体(パネルP)による染色。同じ結果が、2人の他の対照患者(脳卒中の84歳女性、脳卒中の62歳男性および統合失調症の36歳女性)から得られた。
TGF-β1ファミリー依存性転写応答アッセイにおける形質導入HTRA1タンパク質の発現レベル
C2C12細胞は、pRL-TKウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド、野生型(WT)または変異型HTRA1発現プラスミド並びに以下の構築物で同時形質移入した:
(左)(SBE)4−ホタルルシフェラーゼベクター(TGF-β応答性レポーターベクター)並びにSMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGF-β1をコードする)を含有するベクター、
(中央)pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-4(プロ骨形態形成タンパク質4をコードする)を含有するベクター、
(右)pGL3-Id985WT-ホタルルシフェラーゼベクター(BMP応答性レポーターベクター)並びにSMAD1、SMAD4およびBMP-2(pro-BMP2をコードする)を含有するベクター。
Smadタンパク質のリン酸化のアッセイにおける形質導入HTRA1タンパク質の発現レベル
HEK293細胞は、WTまたは変異型HTRA1-V5発現ベクターおよび以下の構築物で同時形質移入した:
(左)SMAD2、SMAD4およびTGF-β1(2つの点突然変異(C223S、C225S)を有するpro-TGF-β1をコードする)を含有するベクター、
(中央)SMAD1、SMAD4およびBMP-4(プロ骨形態形成タンパク質4をコードする)を含有するベクター、
(右)SMAD1、SMAD4およびBMP-2(プロBMP-2をコードする)を含有するベクター。
培養した皮膚線維芽細胞におけるNOG mRNA発現に対するTGF-βの効果
健康な日本人被験者(n=3)の培養した皮膚線維芽細胞を組換えTGF-β1、0.04〜5.0ng/mlで2時間処理した。NOG mRNAレベルは、TGF-β1を有さない細胞におけるレベルの倍率変化である。棒は標準誤差を表す。
脳小動脈における免疫組織化学分析
パネルA、BおよびCにおいて、検死解剖した家族5、被験者II-3(A252T変異のホモ接合型)の脳小動脈は、フィブロネクチンのエキストラドメインA(パネルA)および内膜におけるバーシカン(パネルB)および中膜におけるTGF-β1の発現増加(パネルC)を示す。
脳小動脈におけるフィブロネクチンのエキストラドメインAのmRNA発現
In situハイブリダイゼーションは、フィブロネクチンのエキストラドメインAから得られたアンチセンスプローブ(パネルAおよびC)およびセンスプローブ(パネルBおよびD)を使用して、検死解剖した家族6、被験者II-1(R302X変異のホモ接合型)の脳小動脈において実施した。パネルEおよびFは、検死解剖した被験患者(筋萎縮性側索硬化症を有する40歳女性)の脳小動脈におけるフィブロネクチンアンチセンスプローブによるエキストラドメインAのin situハイブリダイゼーション分析。
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Claims (16)
- ヒトにおける常染色体劣性脳動脈症に起因する脳血管疾患の検出方法であって、
(a)前記ヒトの試験試料におけるHTRA1遺伝子の変異を検出するステップ、および
(b)HTRA1遺伝子の変異が存在するときは、常染色体劣性脳動脈症に起因する脳血管疾患の存在を示すとするステップ
を含む前記方法。 - 前記試験試料が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、口腔粘膜および爪からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記試験試料が血液である、請求項1に記載の方法。
- 常染色体劣性脳動脈症に起因する脳血管疾患が、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体劣性脳動脈症(CARASIL)である、請求項1または2に記載の方法。
- 変異型HTRA1遺伝子および野生型HTRA1遺伝子を増幅するためのプライマーセットを含む、ヒトにおける常染色体劣性脳動脈症に起因する脳血管疾患を診断または検出するためのキット。
- 前記ヒトの試験試料におけるHTRA1遺伝子の変異が、ナンセンス変異またはミスセンス変異である請求項1に記載の方法。
- 変異が、A252T、V297M 、R302X およびR370Xからなる群から選ばれるHTRA1タンパク質におけるアミノ酸変異をもたらすものである請求項1に記載の方法。
- 変異が、G754→A、G889→A、C904→TまたはC1108→Tから選ばれるものである請求項1に記載の方法。
- 変異の検出が、直接配列決定アッセイを行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- 変異の検出が、HTRA1遺伝子についてPCRを行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- 変異の検出が、ハイブリダイゼーションアッセイを行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの試験試料におけるHTRA1遺伝子がcDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトの試験試料におけるHTRA1遺伝子がゲノムDNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 変異型HTRA1遺伝子が、ナンセンス変異またはミスセンス変異を含む、請求項5に記載のキット。
- 変異型HTRA1遺伝子が、A252T、V297M 、R302X およびR370Xからなる群から選ばれるHTRA1タンパク質におけるアミノ酸変異をもたらすものである請求項5に記載のキット。
- 変異型HTRA1遺伝子が、G754→A、G889→A、C904→TまたはC1108→Tから選ばれる変異を含む、請求項5に記載のキット。
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