RU2302870C1 - Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof - Google Patents
Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2302870C1 RU2302870C1 RU2006122062/15A RU2006122062A RU2302870C1 RU 2302870 C1 RU2302870 C1 RU 2302870C1 RU 2006122062/15 A RU2006122062/15 A RU 2006122062/15A RU 2006122062 A RU2006122062 A RU 2006122062A RU 2302870 C1 RU2302870 C1 RU 2302870C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- temperature
- drug
- solution
- months
- acetone
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из эпифиза (шишковидной железы) и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, обладающее геропротекторной активностью.The group of inventions relates to a medicinal product and a method for its preparation from animal organs, in particular, to isolating a biologically active substance from the pineal gland (pineal gland) and to obtain a parenteral dosage form that can be used in medicine as a drug with geroprotective activity.
Известно, что терапевтический потенциал многих пептидных препаратов проявляется в стимуляции иммунных и репаративных процессов. Пептиды вызывают метаболические изменения, управление которыми осуществляется через механизмы генной регуляции [Khavinson V.Kh.Malinin V.V.Gerontological Aspects of Genome Peptide Regulation. - Basel: Karger, 2005. - 104 p.]. Известны иммуностимуляторы пептидной природы: тактивин (патент Франции №2570278), тимозин (Goldstein a. L. et.al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v.69, p.1856-1863). Эти препараты и представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на другие физиологические функции организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов.It is known that the therapeutic potential of many peptide drugs is manifested in the stimulation of immune and reparative processes. Peptides cause metabolic changes, which are controlled through the mechanisms of gene regulation [Khavinson V. Kh. Malinin V. V. Gerontological Aspects of Genome Peptide Regulation. - Basel: Karger, 2005. - 104 p.]. Known immunostimulants of a peptide nature: tactivin (French patent No. 2570278), thymosin (Goldstein a. L. et.al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1972, v.69, p. 1856-1863). These drugs are a set of polypeptides of various lengths, affecting various parts of the immune response, as well as other physiological functions of the body, which leads to the appearance of unwanted side effects.
Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (а.с. SU №1218521, 1994; а.с. SU №1227198, 1986; патент РФ №1298879, 1993; патент РФ №1448443, 1994; патент РФ №1522486, 1993; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ №2161501, 2001; а.с. SU №1522486, 1993; патент US №4341765; патент GB №1161896, 1969; патент FR №2583982, 1987).Known methods for producing biologically active substances and medicines from animal raw materials (A.S. SU No. 1218521, 1994; A.S. SU No. 1227198, 1986; RF patent No. 1298879, 1993; RF patent No. 1448443, 1994; RF patent No. 1522486, 1993; RF patent No. 2075944, 1997; RF patent No. 2161501, 2001; AS SU No. 1522486, 1993; US patent No. 4341765; GB patent No. 1161896, 1969; FR patent No. 2583982, 1987).
Известен способ получения пептидного комплекса из эпифиза или шишковидной железы крупного рогатого скота, включающий экстракцию измельченного сырья 3-5% уксусной кислотой с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкости шестью объемами ацетона и эфира, его ренатурацию в 1%-ной уксусной кислоте с последующим осветлением и приготовлением лекарственной формы (патент РФ №944191, 1994).A known method of producing a peptide complex from the pineal gland or pineal gland of cattle, including extraction of crushed raw materials with 3-5% acetic acid with the addition of zinc chloride, centrifugation, sedimentation of the target product from the supernatant with six volumes of acetone and ether, its renaturation in 1% acetic acid, followed by clarification and preparation of the dosage form (RF patent No. 944191, 1994).
Известен способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, обладающих геропротекторным действием, из эпифиза мозга животных (патент РФ №2163129, 2000), являющийся наиболее близким аналогом - прототипом для предлагаемого средства.There is a method of obtaining from animal raw materials a complex of biologically active polypeptides having a geroprotective effect, from the pineal gland of the animal brain (RF patent No. 2163129, 2000), which is the closest analogue to the prototype of the proposed tool.
Согласно способу, описанному патенте РФ №2163129, комплекс биологически активных полипептидов получают путем измельчения эпифиза, экстракции 3% раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывания органическим растворителем, причем экстракцию проводят при температуре 7÷15°С в течение 48 часов, рН 3,0÷4,0, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, обработку надосадочной жидкости ацетоном проводят в соотношении 1:5 при t=5°C, отстаивают до образования сформировавшегося осадка, надосадочную жидкость сифонируют, полученный осадок промывают ацетоном в соотношении 1:(15-20), отстаивают до осветления надосадочной жидкости и сифонируют ее, осадок фильтруют и промывают ацетоном при комнатной температуре, высушивают и готовят водный раствор с содержанием пептидов 15-35 мг/мл, полученный раствор перемешивают, центрифугируют, затем высокомолекулярные водорастворимые фракции отделяют ультрафильтрацией через материалы с задерживающей способностью до 15000 Да, полученный целевой продукт лиофилизируют.According to the method described by RF patent No. 2163129, a complex of biologically active polypeptides is obtained by grinding the pineal gland, extraction with a 3% solution of acetic acid in the presence of zinc chloride, treating the supernatant with acetone, washing with an organic solvent, and the extraction is carried out at a temperature of 7 ÷ 15 ° C for 48 hours, pH 3.0 ÷ 4.0, the extract is separated from the ballast substances by separation, the treatment of the supernatant with acetone is carried out in a ratio of 1: 5 at t = 5 ° C, sedimented until a formed precipitate forms ka, the supernatant is siphoned, the precipitate obtained is washed with acetone in a ratio of 1: (15-20), settled until the supernatant is clarified and siphoned, the precipitate is filtered and washed with acetone at room temperature, dried and an aqueous solution containing peptides 15-35 mg is prepared / ml, the resulting solution is stirred, centrifuged, then the high molecular weight water-soluble fractions are separated by ultrafiltration through materials with a retention capacity of up to 15,000 Da, the obtained target product is lyophilized.
Целевой продукт, полученный способом, описанным в патенте РФ №2163129, содержит комплекс полипептидов с молекулярной массой от 1000 до 12000 Да, является наиболее близким аналогом - прототипом для предлагаемого средства, обладающего геропротекторной активностью.The target product obtained by the method described in the patent of the Russian Federation No. 2163129, contains a complex of polypeptides with a molecular weight of from 1000 to 12000 Yes, is the closest analogue - the prototype for the proposed tool with geroprotective activity.
К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани эпифиза большого количества (более 70%) веществ непептидной природы, которые, являясь примесями, не определяют геропротекторную активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.The disadvantages of this method include the extraction during extraction from the pineal gland tissue of a large amount (more than 70%) of non-peptide substances, which, being impurities, do not determine the geroprotective activity of the isolated active substance, as well as its low yield.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, обладающего геропротекторной активностью, в виде лекарственной формы для парентерального введения, выделенного из эпифиза (шишковидной железы) телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.The present invention posed and solved the problem of developing a method for producing a drug having geroprotective activity in the form of a parenteral dosage form isolated from the pineal gland (pineal gland) of calves no older than 12 months of age or pigs, the technical result of which is the optimal technology for the isolation of the peptide complex with the content of the low molecular weight fraction from 70 to 90% with a molecular weight of the peptide components included in it ranging from 70 to 212 Da and obtaining an aqueous solution ora extract with a polypeptide concentration of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml, which allows not only to clean the resulting product from impurities, but also to increase its yield.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, обладающего геропротекторной активностью, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.Experimental verification showed that the proposed method provides pharmaceutical stability, maximum biological value and therapeutic efficacy of the drug with geroprotective activity, made in the form of a parenteral dosage form, which is confirmed by the experimental results given in the examples illustrating the invention.
Другим аспектом изобретения является средство, обладающее геропротекторной активностью, в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из эпифиза животных, по молекулярной массе входящих в него пептидных компонентов, а также по его нетоксичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.Another aspect of the invention is an agent having geroprotective activity, in the form of a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90% with a molecular weight of its peptide components ranging from 70 to 212 Da, with a concentration of polypeptides 2.5-2.9 mg / ml, the technical result of which is that the isolated substance differs from the known substances obtained previously from the pineal gland of animals in terms of molecular weight peptide components, as well as its non-toxicity and pyrogen-free nature due to complete purification from impurities.
В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах возрастной патологии. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.In the course of studies in animal experiments, it was found that the obtained aqueous solution of the agent with a concentration of polypeptides of 2.5-2.9 mg / ml is a therapeutically effective dose, which allows us to consider the use of the agent for various types of age-related pathologies. This is confirmed by the following examples.
В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, обладающего геропротекторной активностью, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):In the process of conducting research, the importance of the following stages of the method of obtaining funds having geroprotective activity, made in the form of a dosage form for parenteral administration (hereinafter referred to as the drug), was established:
- повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;- repeated precipitation of the resulting homogenized precipitate with double volumes of acetone at least two times and subsequent washing on the suction filter with double volumes of acetone until a light gray precipitate is obtained, which indicates complete purification of the precipitate from impurities such as lipid, protein, phospholipid and others;
- получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6;- obtaining an aqueous solution of the extract in a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml; its centrifugation, filtration, followed by ultrafiltration cleaning at the installation with a back pressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Da and the addition of glycocol to the ultrafiltrate to a final concentration of 10 ÷ 20 mg / ml at pH = 5.6 ÷ 6 , 6;
- стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.- sterilizing filtration, ampouling and autoclaving for 8 minutes at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2 , which ensures the stability of the drug while maintaining therapeutic efficacy.
Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.The mode and time of autoclaving were established experimentally.
Необходимо отметить, что предлагаемое средство, обладающее геропротекторной активностью, отличается от известных биологически активных веществ, выделенных ранее из эпифиза животных, поскольку представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, выделенных из эпифиза, в то время как препарат, полученный способом, описанным в патенте РФ №2163129, содержит в своем составе преимущественно комплекс полипептидов с молекулярной массой от 1000 до 12000 Да.It should be noted that the proposed agent with geroprotective activity differs from the known biologically active substances isolated previously from the pineal gland of animals, since it is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90% with a molecular weight of its constituent peptide components ranging from 70 up to 212 Yes, isolated from the pineal gland, while the preparation obtained by the method described in RF patent No. 2163129 contains mainly a complex of polypeptides with molecular with a mass of 1000 to 12000 Yes.
Указанный технический результат достигается тем, что средство, обладающее геропротекторной активностью, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл и получено из эпифиза телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.The specified technical result is achieved in that the agent having geroprotective activity is made in the form of a parenteral dosage form and is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90% with a molecular weight of the peptide components included in it ranging from 70 to 212 Yes , with a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml and obtained from the pineal gland of calves not older than 12 months of age or pigs by extraction with acetic acid in the presence of zinc chloride.
Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, обладающего геропротекторной активностью, характеризуется тем, что эпифиз (шишковидную железу) телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20-22°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20°±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3÷5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее двух раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автоклавируют в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.The specified technical result is also achieved by the fact that the proposed method of obtaining funds with geroprotective activity is characterized in that the pineal gland (pineal gland) of calves no older than 12 months of age or pigs are frozen at a temperature of at least minus 40 ° C, kept at a temperature of minus 20 -22 ° C for at least two months, then crushed, add a 3% solution of acetic acid in a volume ratio of 1: 5 at a temperature of 20 ° ± 5 ° C, extraction is carried out with constant stirring, after receiving one 1% zinc chloride solution in a volume ratio of 50: 1 is added to the suspension, it is cooled with constant stirring to a temperature of 7 ÷ 16 ° С, then it is stirred for 1 hour after every 4 hours of settling for 48 hours, the extract is separated from the ballast substances by separation , acetone is added to the extract in a volume ratio of 1: 5, kept at a temperature of 3 ÷ 5 ° C for 4 hours, the resulting homogenized precipitate is re-precipitated with acetone at least two times, then the precipitate containing the active substance is washed twice with a suction filter volumes of acetone cooled to a temperature of 7 ÷ 16 ° С until a light gray precipitate is obtained, wiped through a metal sieve, dried, dissolved in distilled water at room temperature and with constant stirring to a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml, solution centrifuged, filtered, subjected to ultrafiltration cleaning at the installation with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Yes, glycol is added to the ultrafiltrate to its final concentration of 10 ÷ 20 mg / ml at pH = 5.6 ÷ 6 , 6, p target is subjected to sterilizing filtration under pressure of not more than 2.0 kgf / cm 2, filled into vials of 2 ml and autoclaved for 8 minutes at 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2.
Сущность изобретения поясняется чертежом и таблицами.The invention is illustrated in the drawing and tables.
На чертеже представлено влияние препарата на развитие эксплантатов эпифиза.The drawing shows the effect of the drug on the development of pineal gland explants.
В Таблице 1 представлено влияние препарата на продолжительность жизни и возникновение опухолей у самок мышей SAMP.Table 1 shows the effect of the drug on life expectancy and the occurrence of tumors in female SAMP mice.
В Таблице 2 представлено влияние препарата на продолжительность жизни и возникновение опухолей у самок мышей SAMR.Table 2 shows the effect of the drug on life expectancy and the occurrence of tumors in female SAMR mice.
В Таблице 3 представлено влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.Table 3 presents the effect of the drug on the morphological and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs in the study of toxicity.
В Таблице 4 представлена динамика субъективных показателей у больных с климактерическим синдромом.Table 4 presents the dynamics of subjective indicators in patients with menopausal syndrome.
В Таблице 5 представлена динамика изменения содержания гормонов гипофиза в сыворотке крови больных с климактерическим синдромомTable 5 presents the dynamics of changes in the content of pituitary hormones in the blood serum of patients with menopausal syndrome
Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; примеры 2 и 3, подтверждающие геропротекторную активность препарата; пример 4 - изучение токсичности препарата; пример 5, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.The invention is illustrated by the following examples: example 1 - a method of obtaining a preparation; examples 2 and 3, confirming geroprotective activity of the drug; example 4 - the study of the toxicity of the drug; example 5, confirming the therapeutic effectiveness of the drug, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
Пример 1. Способ получения препаратаExample 1. The method of obtaining the drug
В качестве сырья используется эпифиз мозга (шишковидная железа) телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, который замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев.The epiphysis of the brain (pineal gland) of calves (not older than 12 months of age) or pigs, which are frozen at a temperature of at least minus 40 ° C and kept at a temperature of minus 20 ÷ 22 ° C for at least two months, is used as raw material.
В реактор для экстракции перекачивают 400 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры (20±5)°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 80 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры плюс 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.400 l of a 3% solution of acetic acid are pumped into the extraction reactor and cooled to a temperature of (20 ± 5) ° C, then 80 kg of crushed material are loaded into the reactor with constant stirring until a homogeneous mass of raw material is obtained. The extraction is carried out with constant stirring, after obtaining a homogeneous suspension, a 1% solution of zinc chloride in a volume ratio of 50: 1 is added to it, cooled with constant stirring to a temperature of plus 7 ÷ 16 ° C, then it is stirred for 1 hour after every 4 hours of settling for 48 h
Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при (5000±500) об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре плюс 3÷5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное веществе, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.The extract is separated from the ballast substances by separation at (5000 ± 500) rpm for 1 hour. Acetone in a volume ratio of 1: 5 is added to the extract. It is kept at a temperature of plus 3 ÷ 5 ° C for 4 hours. The precipitate formed is homogenized and re-precipitated with acetone at least two times. Then the precipitate containing the active substance is washed on a suction filter with twice volumes of acetone cooled to a temperature of 7-16 ° C until a light gray precipitate is obtained. The washed precipitate is wiped through a metal sieve, spread in a thin layer into enameled cuvettes, covered with a double layer of cotton cloth and dried with periodic stirring in a fume hood until the smell of acetone is completely removed.
Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из эпифиза) составляет 50 г на 1 кг исходного сырья.The output of the active substance (powder of a biologically active peptide complex isolated from the pineal gland) is 50 g per 1 kg of feedstock.
Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5÷2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при (3000±200) об/мин в течение (20±5)мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.The resulting powder is dissolved in distilled water with constant stirring at room temperature for 40 min to a concentration of peptides 2.5 ÷ 2.9 mg / ml The resulting solution was centrifuged at (3000 ± 200) rpm for (20 ± 5) minutes. The centrifuge is filtered through an AP-15 filter or similar.
Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см2, через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.The filtrate is subjected to ultrafiltration purification in an ultrafiltration unit with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 , through materials with a retention capacity of 15,000 Da.
В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН=5,6÷6,6.In the ultrafiltrate add the calculated sample of glycol to its final concentration of 10 ÷ 20 mg / ml, mix until the glycol is completely dissolved while maintaining the pH = 5.6 ÷ 6.6.
Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0 кгс/см2.The solution is subjected to sterilizing filtration, which is carried out under a pressure not exceeding 2.0 kgf / cm 2 .
Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см2.The resulting solution is poured into 2.0 ml ampoules and autoclaved, and the ampoules with the preparation are sterilized for 8 minutes at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of not more than 1.1 kgf / cm 2 .
Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.The preparation is a colorless, transparent solution and contains a peptide complex with a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.Testing for the absence of high molecular weight protein components is carried out by adding to the contents of 1 ampoule of the drug 1 ml of a 10% solution of trichloroacetic acid. The transparency of the solution indicates the absence of high molecular weight protein components.
Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.To determine peptide bonds in a preparation, a biuret reagent is added to its solution. Staining the solution with violet color indicates the peptide bonds present in the preparation.
С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.In order to determine the polypeptides and their fractions in the preparation, the methods of ultraviolet spectrophotometry, gel chromatography, mass spectrometry, high performance liquid chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis are used.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270±5 нм.The ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the region of wavelengths from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 270 ± 5 nm.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат, определяют следующими методами:The molecular weight of the polypeptides that make up the drug is determined by the following methods:
методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);by gel chromatography on Sephadex G-25 and G-50 (Pharmacia, Sweden). Peptide Molecuar Weight Kit MS III (Serva, Germany) was used to calibrate a 1.6 x 60 cm column;
методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300-2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6×106 тор;mass spectrometry method. Spectra are obtained on a Voyager DE Biospectrometry time-of-flight mass spectrometer with laser desorption and ionization using a matrix (MALDI-TOF) at a relative intensity of a nitrogen laser of 2300-2400, an accelerating voltage of 25000 V, a delay time of 90 ns, and a pressure in the vacuum chamber of 2.6 × 10 6 torr;
методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.by electrophoresis in a 15% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins.
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 70 до 212 Да.Using the methods listed above, it was found that the composition of the drug includes polypeptides with a molecular weight of from 70 to 212 Da.
С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.Using reverse-phase high-performance liquid chromatography in an acetonitrile gradient (Lichrosorb C18 sorbent, column 2 × 62 mm), it was found that the preparation contains mainly low molecular weight fractions - from 70 to 90%, and there are no high molecular weight components in the preparation.
Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Показано, что препарат является апирогенным.Pyrogenicity of the drug is determined in rabbits by the generally accepted method (GF XI, issue 2, p. 183) with a test dose of 0.25 mg per 1 kg of animal weight in 1.0 ml of isotonic 0.9% sodium chloride solution for injection. It is shown that the drug is pyrogen-free.
Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 70 до 212 Да, с концентрацией полипептидов 2,5-2,9 мг/мл.Thus, in the above method, a preparation is obtained - a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90%, with a molecular weight of its peptide components ranging from 70 to 212 Da, with a concentration of 2.5 polypeptides -2.9 mg / ml.
Пример 2. Влияние препарата на развитие эксплантатов эпифизаExample 2. The effect of the drug on the development of pineal gland explants
Эксперименты проведены на 52 фрагментах эпифиза крыс линии «Wistar» с массой тела 150÷200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл). Добавляют препарат в концентрациях 2, 10, 20, 50, 100 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента эпифиза. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.The experiments were performed on 52 fragments of the pineal gland of Wistar rats weighing 150–200 g. The culture medium for explant cultivation consisted of 35% Eagle's solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks' solution, 5% chicken embryonic extract, on Wednesday glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml) were added. Add the drug in concentrations of 2, 10, 20, 50, 100 ng / ml. The criterion of biological activity was the area index (PI) —the ratio of the area of the entire explant together with the growth zone to the outgoing area of the pineal gland fragment. The IP values were expressed as a percentage, the control IP value was taken as 100%.
На чертеже представлено влияние препарата на развитие эксплантатов эпифиза. Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 20 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 35%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов эпифиза на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.The drawing shows the effect of the drug on the development of pineal gland explants. It was found that after 1 day of cultivation, the explants spread on a collagen substrate and the proliferation of proliferating and migrating cells began on the periphery of the explant. On the 3rd day of cultivation at a drug concentration of 20 ng / ml, a significant increase in the explant PI by 35% was observed, compared with the reference PI values. When studying the pineal gland explants for longer cultivation periods (7 days), a similar stimulating effect of the drug at the same concentration was revealed.
Таким образом, в отношении ткани эпифиза препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.Thus, in relation to the tissue of the pineal gland, the drug had a tissue-specific effect, manifested in stimulating the growth of explants.
Пример 3. Влияние препарата на продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез у мышей с ускоренным старением (SAM)Example 3. The effect of the drug on life expectancy and spontaneous carcinogenesis in mice with accelerated aging (SAM)
Одной из наиболее перспективных экспериментальных моделей для изучения механизмов старения и канцерогенеза являются генетически модифицированные мыши SAM (senescence accelerated mice). В результате возникающего повреждения генома интенсивность спонтанного мутагенеза у мышей SAMP (SAM prone), наиболее предрасположенных к ускоренному старению, значительно выше, чем у мышей других линий, включая и "дикую линию" SAMR (SAM resistant).One of the most promising experimental models for studying the mechanisms of aging and carcinogenesis is genetically modified SAM (senescence accelerated mice) mice. As a result of damage to the genome, the intensity of spontaneous mutagenesis in SAMP mice (SAM prone), the most prone to accelerated aging, is significantly higher than in mice of other lines, including the wild line SAMR (SAM resistant).
В эксперименте было изучено влияние препарата на показатели продолжительности жизни и развития опухолей у мышей SAMP и SAMR. В качестве препарата сравнения использовали мелатонин. Двухмесячных животных каждой линии (111 самок SAMP и 95 самок SAMR) разделили на 4 группы. Мыши 1-й группы являлись интактным контролем. Животным 2-й группы (контроль с растворителем) вводили подкожно курсами (ежедневно в течение одной недели каждый месяц) по 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Мыши 3-й группы получали в таком же режиме мелатонин в ночное время (с 20:00 до 8:00) с питьевой водой в концентрации 20 мг/л. Мышам 4-й группы по такой же схеме, как мышам 2-й группы, вводили подкожно исследуемый препарат в двух разовых дозах 1,5 мкг (70 мкг/кг) и 7 мкг (350 мкг/кг) в 0,1 мл стерильного физиологического раствора, для чего животные 4-й группы были разделены на 2 подгруппы.In the experiment, the effect of the drug on life expectancy and tumor development in SAMP and SAMR mice was studied. Melatonin was used as a reference drug. Two-month-old animals of each line (111 SAMP females and 95 SAMR females) were divided into 4 groups. Group 1 mice were an intact control. Animals of the 2nd group (control with solvent) were injected subcutaneously in courses (daily for one week every month) in 0.1 ml of sterile saline. Mice of the 3rd group received melatonin in the same mode at night (from 20:00 to 8:00) with drinking water at a concentration of 20 mg / L. The mice of the 4th group according to the same scheme as the mice of the 2nd group were injected subcutaneously with the studied drug in two single doses of 1.5 μg (70 μg / kg) and 7 μg (350 μg / kg) in 0.1 ml of sterile saline, for which animals of the 4th group were divided into 2 subgroups.
При сравнении динамики гибели мышей SAM разных линий выявлены признаки ускоренного старения мышей SAMP (Таблица 1 и Таблица 2).When comparing the death dynamics of SAM mice of different lines, signs of accelerated aging of SAMP mice were revealed (Table 1 and Table 2).
При этом в Таблице 1 и Таблице 2 приняты следующие сокращения СПЖ - средняя продолжительность жизни; α - константа в уравнении Гомпертца; MRDT - время удвоения смертности; # - общее количество опухолей (лимфом и фиброзных гистиоцитом), в скобках указано количество фиброзных гистиоцитом.Moreover, in Table 1 and Table 2, the following abbreviations of life expectancy are adopted — average life expectancy; α is a constant in the Gompertz equation; MRDT - time for doubling mortality; # - total number of tumors (lymphomas and fibrous histiocytes), the number of fibrotic histiocytes is indicated in parentheses.
У животных этой сублинии отмечено уменьшение средней продолжительности жизни последних 10% особей и максимальной ее продолжительности, увеличение показателя скорости старения популяции и уменьшение времени удвоения смертности. Значительных различий в средней продолжительности жизни у интактных мышей SAMP и SAMR обнаружить не удалось.In animals of this subline, a decrease in the average life expectancy of the last 10% of individuals and its maximum duration, an increase in the rate of aging of the population, and a decrease in the time for doubling mortality were noted. No significant differences in life expectancy were found in intact SAMP and SAMR mice.
Исследуемый препарат и мелатонин не оказывали статистически достоверного влияния на среднюю продолжительность жизни мышей обеих сублиний. В то же время, и препарат, и мелатонин проявили геропротекторный эффект у мышей SAMP. Так, мелатонин увеличивал у животных сублинии SAMP продолжительность жизни последних 10% мышей. У них возросла также максимальная продолжительность жизни, в 1,56 раза уменьшились величина константы, отражающей скорость старения популяции, и время удвоения смертности. Применение исследуемого препарата сопровождалось увеличением на 1,5 мес (8%) средней продолжительности жизни 10% максимально проживших мышей, и на столько же максимальной продолжительности их жизни. Дозировка препарата не влияла на выраженность его геропротекторного действия.The studied drug and melatonin did not have a statistically significant effect on the average life expectancy of mice in both sublines. At the same time, both the drug and melatonin showed a geroprotective effect in SAMP mice. Thus, melatonin increased the life span of the last 10% of mice in animals of the SAMP subline. They also increased their maximum life expectancy; the value of the constant reflecting the aging rate of the population and the time for doubling mortality decreased 1.56 times. The use of the study drug was accompanied by an increase of 1.5 months (8%) in the average life expectancy of 10% of the maximum living mice, and by the same maximum life expectancy. The dosage of the drug did not affect the severity of its geroprotective effect.
Основной причиной смертности животных обеих сублиний являлось развитие лимфом, связанное с происхождением мышей SAM от высоколейкозной линии AKR. Для злокачественных лимфом у мышей SAM характерным было существенное увеличение размеров печени, селезенки, тимуса и поражение подмышечных, паховых и мезентериальных лимфатических узлов с инфильтрацией их опухолевыми клетками с многочисленными митозами. В печени очаги лимфомы обычно располагались вокруг кровеносных сосудов. Кроме злокачественных лимфом у животных обнаруживали злокачественные фиброзные гистиоцитомы в виде опухолевых узлов, располагавшихся под кожей и прораставших в окружающие ткани. Опухоли состояли из атипичных веретенообразных клеток с множественными митозами и разрастаниями фиброзной ткани. У части мышей отмечены также кисты яичников, представляющие собой тонкостенные образования, заполненные фибрином или геморрагическим содержимым.The main cause of animal death in both sublines was the development of lymphomas associated with the origin of SAM mice from the AKR high leukemia line. For malignant lymphomas in SAM mice, a significant increase in the size of the liver, spleen, thymus, and damage to axillary, inguinal, and mesenteric lymph nodes with infiltration of their tumor cells with numerous mitoses was characteristic. In the liver, foci of lymphoma were usually located around the blood vessels. In addition to malignant lymphomas, malignant fibrous histiocytomas were found in animals in the form of tumor nodes located under the skin and growing into surrounding tissues. Tumors consisted of atypical spindle-shaped cells with multiple mitoses and proliferation of fibrous tissue. Ovarian cysts, which are thin-walled formations filled with fibrin or hemorrhagic contents, were also noted in some mice.
При анализе влияния исследуемого препарата и мелатонина на канцерогенез показано, что у мышей SAMP мелатонин не повлиял на частоту развития опухолей и срок их обнаружения. Исследуемый препарат не изменял частоту новообразований и существенно (в 1,7 раза) увеличивал продолжительность жизни особей, у которых опухоли не развились (Таблица 1).When analyzing the effect of the test drug and melatonin on carcinogenesis, it was shown that melatonin in SAMP mice did not affect the incidence of tumors and their detection time. The studied drug did not change the frequency of neoplasms and significantly (1.7 times) increased the life expectancy of individuals in which the tumors did not develop (Table 1).
У мышей SAMR применение исследуемого препарата и мелатонина не оказывало влияния на частоту развития злокачественных новообразований, а также на продолжительность жизни животных с опухолями или без них (Таблица 2). Однако под действием исследуемого препарата достоверно увеличивалась средняя продолжительность жизни мышей.In SAMR mice, the use of the studied drug and melatonin did not affect the incidence of malignant neoplasms, as well as the life expectancy of animals with or without tumors (Table 2). However, under the action of the studied drug, the average life expectancy of mice significantly increased.
Таким образом, препарат оказывает выраженное действие на механизмы старения и канцерогенеза, замедляя темп старения и снижая частоту развития злокачественных опухолей. При этом одинаково эффективными оказались дозы препарата 70 мкг/кг и 350 мкг/кг, что свидетельствует о широте терапевтического действия препарата и обоснованности выбора терапевтически эффективной дозы, не превышающей 70 мкг/кг.Thus, the drug has a pronounced effect on the mechanisms of aging and carcinogenesis, slowing down the rate of aging and reducing the incidence of malignant tumors. At the same time, the doses of the drug were 70 μg / kg and 350 μg / kg, which indicates the breadth of the therapeutic effect of the drug and the validity of the choice of therapeutically effective dose, not exceeding 70 μg / kg.
Пример 4. Изучение токсичности препаратаExample 4. The study of the toxicity of the drug
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.The general toxic effect of the drug was investigated in accordance with the requirements of the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances (2000): acute toxicity with a single administration of the drug, as well as subacute and chronic toxicity with prolonged administration of the drug.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 18÷21 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.A study of acute toxicity was conducted on 66 white mongrel male mice weighing 18–21 g. Animals were randomly divided into 6 equal groups. The drug was administered to animals once intramuscularly at doses of 35 mg / kg, 50 mg / kg, 100 mg / kg, 150 mg / kg, 200 mg / kg in 0.25 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Animals of the control group were injected with the same volume of 0.9% NaCl solution.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 70 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150÷180 г.Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.Studies on the study of subacute toxicity were carried out on 70 white outbred male rats with a body weight of 150 ÷ 180 g. Once daily, animals of the experimental groups were injected intramuscularly for 90 days at doses of 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg 0.5 ml of a sterile 0.9% NaCl solution. The animals of the control group were injected in the same volume with a sterile 0.9% NaCl solution. Before administration of the drug, on the 30, 60 and 90 days after the start of drug administration, the morphological composition and properties of peripheral blood were studied in animals. At the end of the experiment, biochemical and coagulological blood parameters were examined.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 84 морских свинках-самцах массой 250-280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl.Studies on the study of chronic toxicity were carried out for 6 months, based on the duration of the recommended clinical prescription of the drug in 84 male guinea pigs weighing 250-280 g. Animals of the experimental groups received once daily intramuscular preparation for 6 months. in doses of 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg in 0.5 ml of a sterile 0.9% NaCl solution.
В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.In the control group, animals were injected in a similar fashion with a sterile 0.9% NaCl solution in the same volume. In animals, peripheral blood was determined by conventional methods: the number of red blood cells, hemoglobin, reticulocytes, platelets, white blood cells, white blood cell count, erythrocyte sedimentation rate (ESR), and erythrocyte resistance. Along with this, the content of total protein in blood serum was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry. After the experiment was completed, a pathomorphological study of the brain and spinal cord, spinal ganglia, thyroid gland, parathyroid glands, adrenal glands, testes, pituitary gland, heart, lungs, aorta, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, colon, thymus, spleen, lymph nodes, bone marrow.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.When studying acute toxicity, it was found that a single administration of the studied drug to animals in a dose exceeding the therapeutic recommended for clinical use by more than 5000 times does not cause toxic reactions, which indicates a large therapeutic breadth of the drug.
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 300-3000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата достоверного изменения показателей не выявлено (Таблица 3).The study of subacute and chronic toxicity of the drug indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug in doses exceeding the therapeutic by 300-3000 times. When studying the effect of the drug on the morphological composition and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs after 3 and 6 months after the start of drug administration, no significant change in the indicators was revealed (Table 3).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.When assessing the general condition of animals, morphological and biochemical parameters of peripheral blood, the morphological state of internal organs, the state of the cardiovascular and respiratory systems, and liver and kidney function, pathological changes in the body were not detected.
Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.Therefore, the drug obtained by the proposed method, with long-term administration to animals does not have toxic properties that prevent its further use as a medicine, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
Пример 5. Эффективность применения препарата у больных с климактерическим синдромомExample 5. The effectiveness of the drug in patients with menopause
Проблема состояния здоровья людей старшего возраста приобретает особое значение для женщин 45 лет и старше, поскольку в этом возрасте у них происходит перестройка функционирования эндокринной системы, нередко сопровождающаяся патологическими проявлениями. Известно, что возрастное снижение функциональной активности эпифиза вызывает нарушение механизмов взаимодействия нервной, эндокринной и иммунной систем и способствует развитию различных заболеваний и патологических состояний. На фоне начинающегося общего старения организма у женщин происходит угасание функций репродуктивной системы, обусловленное нарушением функционирования яичников, гипофиза, гипоталамуса и надгипоталамических структур мозга. Это проявляется значительным снижением гормональных резервов яичников и повышением порога чувствительности гипоталамуса и гипофиза к воздействию эстрогенов, что приводит к нарушению правильного ритма секреции фолликулостимулирующего и лютеинизирующего гормонов. Эти инволюционные изменения репродуктивной системы постепенно приводят к угасанию детородной функции, а затем и гормональной.The problem of the state of health of older people is of particular importance for women 45 years of age and older, since at this age they undergo a restructuring of the functioning of the endocrine system, often accompanied by pathological manifestations. It is known that an age-related decrease in the functional activity of the pineal gland causes a violation of the mechanisms of interaction of the nervous, endocrine and immune systems and contributes to the development of various diseases and pathological conditions. Against the background of the beginning general aging of the body in women, the functions of the reproductive system are fading, due to a malfunction of the ovaries, pituitary, hypothalamus and suphypothalamic brain structures. This is manifested by a significant decrease in the hormonal reserves of the ovaries and an increase in the threshold of sensitivity of the hypothalamus and pituitary to estrogen, which leads to a violation of the correct rhythm of secretion of follicle-stimulating and luteinizing hormones. These involutional changes in the reproductive system gradually lead to the extinction of the reproductive function, and then hormonal.
Клинические испытания эффективности применения препарата были проведены у 28 пациенток в возрасте от 47 до 62 лет с климактерическим синдромом. Больные предъявляли жалобы на приливы жара к голове и верхней части туловища, сопровождаемые повышенным потоотделением, головную боль и изменения артериального давления, боли в области сердца, озноб, приступы тахикардии в покое, склонность к обморочным состояниям, тошноту, чувство «замирания» сердца, головокружение, слабость. Психоэмоциональные расстройства чаще всего проявлялись раздражительностью, плаксивостью, беспокойством, нарушением сна, снижением памяти и внимания, быстрой утомляемостью, сниженной работоспособностью. Пациентки отмечали увеличение частоты возникновения респираторных инфекционных заболеваний. При лабораторном обследовании у пациенток были выявлены нарушения гормонального статуса, характеризующиеся снижением содержания ФСГ и ЛГ в периферической крови. Общеклинические и биохимические показатели в крови не выходили за пределы возрастной нормы.Clinical trials of the effectiveness of the drug were conducted in 28 patients aged 47 to 62 years with menopausal syndrome. Patients complained of hot flashes to the head and upper body, accompanied by increased sweating, headache and changes in blood pressure, pain in the heart, chills, tachycardia attacks at rest, a tendency to fainting, nausea, a feeling of "freezing" of the heart, dizziness weakness. Psycho-emotional disorders were most often manifested by irritability, tearfulness, anxiety, sleep disturbance, decreased memory and attention, rapid fatigue, and reduced working capacity. Patients noted an increase in the incidence of respiratory infections. During a laboratory examination, hormonal status disorders were revealed in patients, characterized by a decrease in the content of FSH and LH in the peripheral blood. General clinical and biochemical parameters in the blood did not go beyond the age norm.
Пациентки были разделены на 2 группы. В основную группу вошли 15 больных, получавших препарат в дозе 5 мг в 2 мл физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.Patients were divided into 2 groups. The main group included 15 patients who received the drug at a dose of 5 mg in 2 ml of saline intramuscularly once daily for 10 days.
Контрольная группа состояла из 13 аналогичных больных, которым назначалось только общепринятое лечение, включающее в себя комплекс витаминов, кавинтон, клофелин, настойку валерианы или пустырника. Гормонозаместительная терапия не применялась у больных обеих групп. Изучение эффективности применения препарата проводили на основе общепринятых методов исследования. В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое и биохимическое исследование крови. Содержание гормонов (ФСГ и ЛГ) в сыворотке крови определяли радиоиммунологическим методом.The control group consisted of 13 similar patients who were prescribed only conventional treatment, including a complex of vitamins, cavinton, clonidine, tincture of valerian or motherwort. Hormone replacement therapy was not used in patients of both groups. The study of the effectiveness of the drug was carried out on the basis of generally accepted research methods. Patients' complaints were evaluated in dynamics, a general clinical and biochemical blood test was performed. The content of hormones (FSH and LH) in the blood serum was determined by the radioimmunological method.
В процессе применения препарата у пациенток с климактерическим синдромом отмечалось улучшение субъективных показателей, что проявлялось в достоверном, по сравнению с показателями у больных до лечения, уменьшении приступов болей в области сердца, головокружения, чувства «замирания» сердца, улучшении сна. Кроме того, достоверно по сравнению с показателями у больных до лечения и с показателями у больных после лечения с применением общепринятых средств уменьшилось количество жалоб на приступы тахикардии, потоотделения, приливы жара к голове и верхней части туловища, колебания артериального давления (Таблица 4). Пациентки отмечали после курса применения препарата существенное повышение работоспособности, которое они связывали с нормализацией психоэмоционального состояния.During the use of the drug in patients with menopausal syndrome, an improvement in subjective indicators was noted, which was manifested in a reliable reduction of heart attacks, dizziness, a feeling of "fading" of the heart, and improved sleep, compared with the parameters in patients before treatment. In addition, the number of complaints of attacks of tachycardia, sweating, hot flashes to the head and upper body, and fluctuations in blood pressure was significantly compared with indicators in patients before treatment and with indicators in patients after treatment using generally accepted means (Table 4). Patients noted a significant increase in working capacity after a course of using the drug, which they associated with the normalization of the psychoemotional state.
Обращает на себя внимание, что эффект препарата характеризовался устойчивым последействием. Так, через 1 месяц после окончания курсового приема препарата такие симптомы, как головокружение, шум в ушах, общая слабость, повышенная утомляемость, тазовые дисфункции, нарушение сна и цефалгии, практически нивелировались. Исследование содержания гормонов в сыворотке крови больных, применявших препарат, выявило достоверное снижение исходно повышенного содержания ФСГ по сравнению с показателями, как до лечения, так и после лечения общепринятыми средствами при отсутствии достоверных изменений концентрации ЛГ (Таблица 5). Проведенное исследование свидетельствует о корригирующем влиянии препарата на гормональный дисбаланс у больных с климактерическим синдромом.It is noteworthy that the effect of the drug was characterized by a stable aftereffect. So, 1 month after the end of the course of taking the drug, symptoms such as dizziness, tinnitus, general weakness, fatigue, pelvic dysfunction, sleep disturbance and cephalgia, almost leveled. A study of the hormone content in the blood serum of patients using the drug revealed a significant decrease in the initially elevated level of FSH in comparison with indicators both before treatment and after treatment with conventional means in the absence of significant changes in the concentration of LH (Table 5). The study indicates a corrective effect of the drug on hormonal imbalance in patients with menopausal syndrome.
Таким образом, полученные результаты исследования свидетельствуют о нормализующем влиянии препарата в терапевтически эффективной дозе 5 мг (2,5 мг/мл) на гормональный обмен, что позволяет считать целесообразным его применение в комплексном лечении климактерического синдрома и профилактике ускоренного старения, проявляющегося в негативном течении климактерического периода у женщин.Thus, the results of the study indicate a normalizing effect of the drug in a therapeutically effective dose of 5 mg (2.5 mg / ml) on hormonal metabolism, which suggests its use in the complex treatment of menopausal syndrome and the prevention of accelerated aging, which manifests itself in the negative course of menopause period in women.
Средство, обладающее геропротекторной активностью, и способ полученияTable 4
A tool having geroprotective activity, and a method for producing
# Р<0,05 по сравнению с показателем у больных после лечения с применением общепринятых средств. * P <0.05 compared with the indicator in patients before treatment;
# P <0.05 compared with the indicator in patients after treatment using conventional means.
Claims (2)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006122062/15A RU2302870C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof |
| EA200700829A EA010737B1 (en) | 2006-06-22 | 2007-05-10 | Medicament having heteroprotective activity and method for preparing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006122062/15A RU2302870C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2302870C1 true RU2302870C1 (en) | 2007-07-20 |
Family
ID=38431014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006122062/15A RU2302870C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA010737B1 (en) |
| RU (1) | RU2302870C1 (en) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8905606D0 (en) * | 1989-03-11 | 1989-04-26 | Scras | Peptides |
| RU2163129C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Method of preparing animal-origin complex of biologically-active polypeptides exhibiting antioxidant and geroprotection activities, pharmacological agent, and method for utilization thereof |
| RU2161501C1 (en) * | 2000-06-29 | 2001-01-10 | Санкт-Петербургская Общественная Организация "Санкт-Петербургский Институт Биорегуляции И Геронтологии Сзо Рамн" | Method of preparing peptides showing tissue-specific activity and pharmaceutical composition based on thereof |
-
2006
- 2006-06-22 RU RU2006122062/15A patent/RU2302870C1/en active
-
2007
- 2007-05-10 EA EA200700829A patent/EA010737B1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| г. * |
| Морозов В.Г. и др. Цитамины, биорегуляторы клеточного метаболизма.// Под ред. проф. В.Х Хавинсона. СПб., 1999, с.8 и 30-32. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA010737B1 (en) | 2008-10-30 |
| EA200700829A1 (en) | 2007-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zecca et al. | Biological effects of prolonged exposure to ELF electromagnetic fields in rats: III. 50 Hz electromagnetic fields | |
| AU2004286354A1 (en) | Methods of organ regeneration | |
| JP2014501777A (en) | Aloe polysaccharide composition and method | |
| RU2302874C1 (en) | Agent normalizing reproductive function in men and method for its preparing | |
| RU2302870C1 (en) | Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof | |
| UA91135C2 (en) | Peptide revealing an immunogeroprotective effect, pharmaceutical composition based thereon and method of use thereof | |
| EP2024388B1 (en) | Peptide substance stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition on its base, and the method of its application | |
| RU2301071C1 (en) | Hepatoprotective agent and method for production thereof | |
| RU2303454C1 (en) | Preparation for normalizing female reproductive function and method for its obtaining | |
| RU2302871C1 (en) | Brain functions normalizing agent and a method for preparation thereof | |
| RU2302867C1 (en) | Agent normalizing bladder tonus and method for its preparing | |
| RU2302875C1 (en) | Agent normalizing pancreas function and method for its preparing | |
| RU2302872C1 (en) | Agent normalizing cartilage tissue function and method for its preparing | |
| RU2302868C1 (en) | Agent normalizing kidney function and method for its preparing | |
| CN1839922A (en) | Traditional Chinese medicine preparation for treating leukoderma, psoriasis and its preparation method | |
| RU2301072C1 (en) | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof | |
| KR0156623B1 (en) | Remedy composition for epithelial cell | |
| WO2010138024A2 (en) | Agent for protecting brain cells | |
| RU2320354C2 (en) | Method for obtaining hemopoiesis-affecting immunostimulating thymic polypeptides | |
| RU2134581C1 (en) | Means for treating irradiated mammalians | |
| US20070219126A1 (en) | Class of bioactive glycoprotein | |
| TWI556822B (en) | Use of compound extracted from raw polygonum multiflorum thunb. as ghrelin receptor agonist | |
| CN118127109A (en) | Preparation method and application of traditional Chinese medicine hippocampus anti-aging bioactive peptide | |
| CN118256582A (en) | Preparation method and application of Syringa schneideriana peptide | |
| CN116650542A (en) | Application of astragalus polysaccharide combined ganoderma lucidum spore powder in preparation of medicines for treating osteosarcoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20140415 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210715 |