RU2134581C1 - Means for treating irradiated mammalians - Google Patents

Abstract

FIELD: radio-biology. SUBSTANCE: means constitutes purified protein fractions isolated from turtle Tostudo horsfieldi liver extract by gel filtration technique and having molecular weights within a range of 48-80 and 2.5 kD. EFFECT: increased mammalian survival at significantly decreased administered dose. 3 cl, 3 dwg, 3 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской радиобиологии и может быть использовано для создания препаратов, обладающих эффективным терапевтическим действием для лечения облученных млекопитающих. The invention relates to medical radiobiology and can be used to create drugs with an effective therapeutic effect for the treatment of irradiated mammals.

Известно, что препараты, приготовленные из экстракта селезенки, взятой от мышей, показали определенное влияние на выживаемость облученных животных, причем получен противолучевой эффект, выражающийся в увеличении выживаемости леченных облученных животных на 20 - 40% по сравнению с нелеченными. (См., например, ст. "Влияние экстракта селезенки на облученных животных". авт.: О. И.Олонцева и др., ж. "Радиобиология", 1977, т. XVII, вып. 4, стр. 536-540). It is known that preparations prepared from spleen extract taken from mice showed a definite effect on the survival of irradiated animals, and an anti-radiation effect was obtained, which manifests itself in an increase in the survival of treated irradiated animals by 20–40% compared with untreated. (See, for example, Art. "The effect of spleen extract on irradiated animals." Auth .: O. I. Olontseva et al., Radiobiology, 1977, vol. XVII, issue 4, pp. 536-540 )

Наилучшие результаты были получены при использовании очищенного экстракта селезенки, взятой от мышей 3 - 4-недельного возраста. Биологическую активность экстракта и 1-ой фракции из него оценивали по выживаемости мышей, облученных γ-лучами ⁶⁰Co с мощностью 0,097 - 0,106 Гр/мин в дозах 7,9-8,3 Гр. Препарат вводили через 60 мин после воздействия радиации в количестве 5-6 мг белка первичного экстракта или 2,0 - 2,4 мг белка очищенного экстракта на мышь. (См. ст. "Влияние очищенного селезеночного экстракта на выживаемость облученных мышей", авт. О.И.Олонцева и др., ж. "Радиобиология", 1980, т. XX, вып. 6, с. 877-880).The best results were obtained using a purified spleen extract taken from mice 3 to 4 weeks old. The biological activity of the extract and the first fraction from it was estimated by the survival rate of mice irradiated with ⁶⁰ Co γ rays with a power of 0.097 - 0.106 Gy / min in doses of 7.9-8.3 Gy. The drug was administered 60 minutes after exposure to radiation in the amount of 5-6 mg of protein of the primary extract or 2.0 to 2.4 mg of protein of the purified extract per mouse. (See article "The effect of a purified splenic extract on the survival of irradiated mice," authored by OI Olontsev et al., Radiobiology, 1980, vol. XX, issue 6, p. 877-880).

Однако в связи с невысокой радиорезистентностью мышей для получения устойчивого терапевтического воздействия необходимо введение значительного количества полученного средства (до 6 мг белка). However, due to the low radioresistance of mice, in order to obtain a stable therapeutic effect, it is necessary to introduce a significant amount of the obtained agent (up to 6 mg of protein).

Задачей настоящего изобретения является создание средства для лечения облученных млекопитающих, обладающего эффективным лечебным действием при сокращении дозы введения в 10-30 раз. The objective of the present invention is to provide an agent for the treatment of irradiated mammals with an effective therapeutic effect while reducing the dose of administration by 10-30 times.

Эта задача достигается тем что для получения средства для лечения облученных млекопитающих из экстракта кроветворных органов, в данном случае - печени черепахи Testudo horsfieldi, выделяются очищенные белковые фракции. This task is achieved by the fact that purified protein fractions are isolated to obtain a means for treating irradiated mammals from an extract of blood-forming organs, in this case, the liver of a Testudo horsfieldi turtle.

Наибольшей антирадиационной активностью обладают фракции с молекулярным весом: в первом разделении - от 48 - 80 кДа, во второй и третьем - около 2 кДа. The fractions with a molecular weight have the highest anti-radiation activity: in the first division, from 48 - 80 kDa, in the second and third - about 2 kDa.

Экстракт печени черепахи готовят по методу Ellinger (Ellinger F., Proc. Soc. ExpH. , Biol and Med., 1956, v.92, N 4, p.670 - 673). Для отделения протеинсодержащих фракций экстракт подвергают очистке и фракционированному разделению методом гель-фильтрации. После 1-го разделения на сефадексе G-150 получают три протеинсодержащие фракции A1, A2, A3, из которых фракция A3 с молекулярным весом 48-80 кДа обладает наибольшей антирадиационной активностью. После разделения этой фракции методом гель-фильтрации на ультрагеле AcA 202 получают новые фракции - X1, X2, X3, из которых X3 с молекулярным весом около 2 кДа наиболее активна. Разделение фракции X3 методом гель-фильтрации на сефадексе G-10 приводит к получению еще трех фракций B1, B2, B3, из которых фракция B1 не проявляет антирадиационной активности, а фракция B2 с молекулярным весом около 2,5 кДа проявляет наивысшую противорадиационную активность и выживаемость облученных животных при введении этой фракции приближается к показателям для необлученных животных. Turtle liver extract is prepared according to the Ellinger method (Ellinger F., Proc. Soc. ExpH., Biol and Med., 1956, v. 92, No. 4, p. 670-673). To separate protein-containing fractions, the extract is subjected to purification and fractional separation by gel filtration. After the 1st separation on Sephadex G-150, three protein-containing fractions A1, A2, A3 are obtained, of which the A3 fraction with a molecular weight of 48-80 kDa has the highest anti-radiation activity. After separation of this fraction by gel filtration on an AcA 202 ultra-gel, new fractions are obtained — X1, X2, X3, of which X3 with a molecular weight of about 2 kDa is the most active. Separation of fraction X3 by gel filtration at Sephadex G-10 yields three more fractions B1, B2, B3, of which fraction B1 does not exhibit anti-radiation activity, and fraction B2 with a molecular weight of about 2.5 kDa exhibits the highest anti-radiation activity and survival irradiated animals with the introduction of this fraction approaches the indicators for unirradiated animals.

Таким образом, выделенные из экстракта печени черепахи Testudo horsfieldi протеинсодержащие фракции A3, X3 и B2 можно использовать для лечения пораженных радиационным облучением млекопитающих. Введение предлагаемых веществ животным, подвергшимся радиационному облучению, способствует восстановлению гемопоэза и выживанию облученных в летательной дозе млекопитающих. Выживаемость облученных леченных животных при равных дозах и мощности облучения увеличивается в средней на 30-50% по сравнению с животными, которым вводится экстракт селезенки мышей, и на 50-90% по сравнению с нелеченными облученными животными. При этом в 50-300 раз уменьшается доза вводимых препаратов, что снижает общий расход дефицитных веществ. Благодаря уменьшению вводимой дозы устраняется риск нежелательных побочных действий от введения чужеродного белка. Thus, protein-containing fractions A3, X3 and B2 isolated from the liver extract of Testudo horsfieldi tortoise can be used to treat mammals affected by radiation exposure. The introduction of the proposed substances to animals exposed to radiation, contributes to the restoration of hematopoiesis and the survival of mammals irradiated in a flying dose. The survival rate of irradiated treated animals at equal doses and irradiation power increases by an average of 30-50% compared with animals that are injected with spleen of mice, and 50-90% compared with untreated irradiated animals. At the same time, the dose of injected drugs is reduced by 50-300 times, which reduces the total consumption of scarce substances. By reducing the administered dose, the risk of unwanted side effects from the introduction of a foreign protein is eliminated.

Для получения препаратов печень выделяют, разрезают на кусочки, замораживают в жидком азоте и измельчают до порошкообразного состояния. Измельченную печень заливают физиологическим раствором (0,9% NaCl) из расчета 1 мл физ. р-ра на 170 мг сырой печени. Этот раствор затем выдерживают в течение 24 часов при 4^oC. Далее раствор центрифугируют при 4400g в течение 30 мин. Супернатант собирают и пропускают через миллипоровый фильтр (0,4 мкм).To obtain drugs, the liver is isolated, cut into pieces, frozen in liquid nitrogen and ground to a powder state. The crushed liver is poured with physiological saline (0.9% NaCl) at the rate of 1 ml of physical. solution on 170 mg of crude liver. This solution was then left to stand at 4 ^° C for 24 hours. The solution was then centrifuged at 4400 g for 30 minutes. The supernatant is collected and passed through a millipore filter (0.4 μm).

Гемоглобин, липиды и углеводы выделяются из экстракта по методу Куртиса (Curtis F. J., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 211, p.575). Протеины осаждают смесью хлороформ-метанола (2:1). Затем их ресуспензируют с конечной концентрацией 2 мг/мл в 0,9% NaCl. К полученному раствору добавляют смесь хлороформа и метанола из расчета на 1 объем белка - 9 объемов смеси, выдерживают в течение 30 мин и затем подвергают центрифугированию при 10000g в течение 10 мин. Полученный преципитат отделяют и жидкость подвергают лиофильной сушке. Hemoglobin, lipids and carbohydrates are isolated from the extract according to the Curtis method (Curtis F. J., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 211, p. 575). Proteins precipitated with a mixture of chloroform-methanol (2: 1). Then they are resuspended with a final concentration of 2 mg / ml in 0.9% NaCl. A mixture of chloroform and methanol is added to the resulting solution based on 1 volume of protein — 9 volumes of the mixture, held for 30 minutes, and then centrifuged at 10,000 g for 10 minutes. The precipitate obtained is separated and the liquid is freeze dried.

После лиофильной сушки экстракт представляет собой белый порошок с содержанием влаги 5 ±0,2%. Он обладает хорошей растворимостью в воде (без осадка); содержание белка 62 ±1,5% (определение по методу Lowry), содержание углеводов - 4,0 ± 0,2% (определено метолом Dubois). After freeze drying, the extract is a white powder with a moisture content of 5 ± 0.2%. It has good solubility in water (no precipitate); protein content of 62 ± 1.5% (as determined by the Lowry method), carbohydrate content of 4.0 ± 0.2% (determined by Dubois metol).

Полученный субстрат подвергают гель-фильтрации в колонке 2,6 • 80 см с сефадексом G-150 (с использованием буфера 0,05 М Трис-HCl (pH 8,0) или 0,5 аммониево-ацетатного буфера (pH 8,0), скорость 32 мл/час, относительная концентрация белка определяется фотометрически - 280 nm). The obtained substrate is subjected to gel filtration in a column of 2.6 • 80 cm with Sephadex G-150 (using buffer 0.05 M Tris-HCl (pH 8.0) or 0.5 ammonium acetate buffer (pH 8.0) , speed 32 ml / h, the relative concentration of protein is determined photometrically - 280 nm).

Результаты этого разделения показаны на фиг. 1, где отчетливо видны три пика, обозначенные как A1, A2<A3. Фракция A3 имеет молекулярный вес от 48 до 80 кДа и обладает наибольшей антирадиационной активностью. The results of this separation are shown in FIG. 1, where three peaks are clearly visible, designated as A1, A2 <A3. Fraction A3 has a molecular weight of 48 to 80 kDa and has the highest anti-radiation activity.

Далее фракцию A3 подвергают дальнейшему фракционированию гель-фильтрацией на колонке 2,6 • 80 см с ультрагелем AcA 202 (с использованием 0,1% муравьиной кислоты, скорость 20 мл/час, фотометрическая детекция при 280 nm, 2,0 Au). Результаты этого разделения показаны на фиг. 2, на которой видны три пика, обозначенные X1, X2<X3. X1 фракция с молекулярным весом около 22 кДа не проявляет видимой антирадиационной активности; X2-фракция имеет молекулярный вес около 5,6 кДа и проявляет некоторую антирадиационную активность; и фракция X3 с молекулярным весом около 2 кДа обладает наибольшей антирадиационной активностью. Next, fraction A3 is subjected to further fractionation by gel filtration on a 2.6 x 80 cm column with AcA 202 ultra gel (using 0.1% formic acid, speed 20 ml / h, photometric detection at 280 nm, 2.0 Au). The results of this separation are shown in FIG. 2, on which three peaks are visible, denoted by X1, X2 <X3. X1 fraction with a molecular weight of about 22 kDa does not show visible anti-radiation activity; The X2 fraction has a molecular weight of about 5.6 kDa and exhibits some anti-radiation activity; and the X3 fraction with a molecular weight of about 2 kDa has the highest anti-radiation activity.

Затем фракции X2 и X3 объединяют и подвергают дальнейшему разделению гель-фильтрацией на колонке 2,6 х 80 см с сефадексом g-10 (с использованием 0,1% муравьиной кислоты, скорость 18 мл/час, фотометрическая детекция при 280 nm, 2,0 Au). Результаты фракционирования показаны на фиг. 3, где можно видеть три фракции, обозначенные B1, B2, B3, из которых фракция B1 оказалась токсичной, а фракция B2 с молекулярным весом около 2 кДа обладает максимальной антирадиационной активностью. Then the fractions X2 and X3 are combined and subjected to further separation by gel filtration on a 2.6 x 80 cm column with Sephadex g-10 (using 0.1% formic acid, speed 18 ml / h, photometric detection at 280 nm, 2, 0 Au). The fractionation results are shown in FIG. 3, where you can see three fractions designated B1, B2, B3, of which the B1 fraction was toxic, and the B2 fraction with a molecular weight of about 2 kDa has the maximum anti-radiation activity.

Для исследования эффективности действия препарата проводилось облучение белых мышей весом 18-20 г гамма-лучами ⁶⁰Co мощностью 0,68 Гр/мин при общей дозе от 8 до 9 Гр. Животные были разделены на группы, и через 2 часа после облучения одним группам мышей были введены следующие дозы препаратов: доза на одно животное в 0,3 мл физ. раствора: A1, A2, A3 - по 300 мкг белка; X1, X2, X3 - по 100 мкг белка; B2, B3 - по 100 мкг белка.To study the effectiveness of the drug, white mice weighing 18–20 g were irradiated with ⁶⁰ Co gamma rays with a power of 0.68 Gy / min with a total dose of 8 to 9 Gy. The animals were divided into groups, and 2 hours after irradiation, the following doses of drugs were administered to one group of mice: dose per animal in 0.3 ml of physical solution: A1, A2, A3 - 300 μg of protein; X1, X2, X3 - 100 μg of protein; B2, B3 - 100 μg of protein each.

В качестве контроля одна группа животных была облучена и получила инъекцию только физ. р-ра (0,9% р-р NaCl по 0,3 мл на мышь), а другая группа животных не получила ни облучения, ни инъекции (интактные животные). As a control, one group of animals was irradiated and received an injection only physical. solution (0.9% NaCl solution of 0.3 ml per mouse), and the other group of animals received neither radiation nor injection (intact animals).

На 8 и 11 день после облучения были определены следующие параметры у подопытных животных. On 8 and 11 days after irradiation, the following parameters were determined in experimental animals.

1. Количество эндогенных колоний на селезенке. 1. The number of endogenous colonies on the spleen.

Селезенка извлекается, выдерживается в течение 24 часов в растворе Карнуа. Затем образец помещается на фильтровальную бумагу и под стереоскопом подсчитывается количество колоний. The spleen is removed, aged for 24 hours in a Carnoy solution. Then the sample is placed on filter paper and the number of colonies is counted under a stereoscope.

2. Митотическая активность костного мозга. 2. Mitotic bone marrow activity.

Выделяется бедренная кость, из нее экстрагируется костный мозг, делается мазок и окрашивается краской Гимза-Романовского. Количество митозов подсчитывается под микроскопом из расчета 1000 клеток. A femur stands out, bone marrow is extracted from it, a smear is made and stained with Giemsa-Romanovsky paint. The number of mitoses is counted under a microscope at the rate of 1000 cells.

3. Количество лейкоцитов. 3. The number of leukocytes.

Подсчитывается в камере Горяева под микроскопом. It is counted in the Goryaev’s chamber under a microscope.

4. Масса селезенки. 4. The mass of the spleen.

Селезенка выделяется, переносится на фильтровальную бумагу, взвешивается. The spleen is secreted, transferred to filter paper, weighed.

5. Количество клеток крови. 5. The number of blood cells.

Подсчитывается на автоматическом счетчике клеток "PS-4" ("Пикоскаль", Венгрия). It is counted on an automatic cell counter "PS-4" ("Picoscal", Hungary).

6. 30-суточная выживаемость. 6. 30-day survival.

Определяется процентное отношение выживших в течение 30 суток животных (количество животных в группе до облучения - 100%). The percentage of animals surviving within 30 days is determined (the number of animals in the group before irradiation is 100%).

В таблицах 1-3 приведены результаты исследований. Tables 1-3 show the results of studies.

Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что из полученных после 1-го разделения фракций - A3 обладает наибольшей антирадиационной активностью. Дальнейшее разделение фракции A3 приводит к получению фракции B2, которая проявляет экстремально высокую антирадиационную активность, приближающуюся к значениям для необлученных животных. The results presented in table 1 show that, of the fractions obtained after the 1st separation, A3 has the highest anti-radiation activity. Further separation of the A3 fraction leads to the production of the B2 fraction, which exhibits an extremely high anti-radiation activity, approaching the values for unirradiated animals.

Claims (3)

1. Средство для лечения облученных млекопитающих, содержащееся в экстракте из кроветворных органов, отличающееся тем, что оно представляет собой очищенные белковые фракции, выделенные из печени черепахи Testudo horsfieldi. 1. The tool for the treatment of irradiated mammals contained in the extract from the hematopoietic organs, characterized in that it is a purified protein fraction isolated from the liver of the turtle Testudo horsfieldi. 2. Средство для лечения облученных млекопитающих по п.1, отличающееся тем, что оно содержится в белковой фракции с молекулярным весом от 48 до 80 кДа. 2. The tool for the treatment of irradiated mammals according to claim 1, characterized in that it is contained in the protein fraction with a molecular weight of from 48 to 80 kDa. 3. Средство для лечения облученных млекопитающих по п.1, отличающееся тем, что оно содержится в белковой фракции с молекулярным весом около 2,5 кДа. 3. The treatment for irradiated mammals according to claim 1, characterized in that it is contained in the protein fraction with a molecular weight of about 2.5 kDa.

Images