RU2301072C1 - Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof - Google Patents
Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2301072C1 RU2301072C1 RU2006122065/15A RU2006122065A RU2301072C1 RU 2301072 C1 RU2301072 C1 RU 2301072C1 RU 2006122065/15 A RU2006122065/15 A RU 2006122065/15A RU 2006122065 A RU2006122065 A RU 2006122065A RU 2301072 C1 RU2301072 C1 RU 2301072C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- temperature
- kgf
- acetone
- drug
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Группа изобретений относится к лекарственному средству и способу его получения из органов животных, в частности к выделению биологически активного вещества из кровеносных сосудов и получению лекарственной формы для парентерального введения, которая может использоваться в медицине как средство, нормализующее функции кровеносных сосудов.The group of inventions relates to a medicinal product and a method for its preparation from animal organs, in particular, to isolating a biologically active substance from blood vessels and to obtain a parenteral dosage form, which can be used in medicine as a means of normalizing blood vessel functions.
Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (патент РФ № 944191, 1994; а.с. SU № 1112606, 1996; а.с. SU № 1218521, 1994; патент РФ 1298879, 1993; патент РФ № 1448443, 1994; патент РФ № 2075944, 1997; патент РФ № 2104702, 1998; патент РФ № 2161501, 2001; патент US 4341765, патентов 1161896, 1969; патент FR 2583982, 1987).Known methods for producing biologically active substances and medicines from animal raw materials (RF patent No. 944191, 1994; AS SU No. 1112606, 1996; AS SU No. 1218521, 1994; RF patent 1298879, 1993; RF patent No. 1448443 , 1994; RF patent No. 2075944, 1997; RF patent No. 2104702, 1998; RF patent No. 2161501, 2001; US patent 4341765, patents 1161896, 1969; patent FR 2583982, 1987).
Известен комплекс полипептидов, выделенных из кровеносных сосудов животных, снижающих содержание холестерина в крови (а.с. SU № 1227198, 1986, А61К 35/44), являющийся наиболее близким аналогом - прототипом для предлагаемого средства и способа его получения.A known complex of polypeptides isolated from the blood vessels of animals that lower cholesterol in the blood (and.with. SU No. 1227198, 1986, A61K 35/44), which is the closest analogue - the prototype for the proposed tool and method for its preparation.
Способ получения полипептидов, описанный в а.с. SU № 1227198, включает экстрагирование измельченных кровеносных сосудов животных 3%-ным водным раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка в течение 48÷72 ч, центрифугирование, обработку надосадочной жидкости ацетоном при температуре от минус 3 до минус 5°С, растворение осадка в 1%-ном водном растворе уксусной кислоты, фильтрование и лиофилизацию фильтрата.The method of producing polypeptides described in A.S. SU No. 1227198, includes the extraction of animal blood vessels crushed with a 3% aqueous solution of acetic acid in the presence of zinc chloride for 48 ÷ 72 hours, centrifugation, treatment of the supernatant with acetone at a temperature of minus 3 to minus 5 ° C, dissolution of the precipitate in 1 % aqueous solution of acetic acid, filtration and lyophilization of the filtrate.
К недостаткам известного способа следует отнести извлечение в процессе экстракции из ткани сосудов большого количества (более 70%) веществ не пептидной природы, которые, являясь примесями, не определяют биологическую активность выделенного активного вещества, а также его низкий выход.The disadvantages of this method include the extraction in the process of extraction from the tissue of blood vessels of a large number (more than 70%) of substances of non-peptide nature, which, being impurities, do not determine the biological activity of the isolated active substance, as well as its low yield.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача разработки способа получения средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, в виде лекарственной формы для парентерального введения, из кровеносных сосудов телят не старше 12-месячного возраста или свиней, техническим результатом которого является оптимальная технология выделения пептидного комплекса с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да и получение водного раствора экстракта с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, позволяющая не только очистить получаемый продукт от примесей, но и увеличить его выход.The present invention posed and solved the problem of developing a method for producing a means that normalizes the function of blood vessels, in the form of a parenteral dosage form, from blood vessels of calves no older than 12 months of age or pigs, the technical result of which is the optimal technology for the isolation of the peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90%, with a molecular weight of its peptide components ranging from 72 to 678 Yes and obtaining an aqueous solution of the extract with co centration polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml, which allows not only to clean impurities from the resulting product, but also to increase its output.
Экспериментальная проверка показала, что предлагаемый способ обеспечивает фармацевтическую стабильность, максимальную биологическую ценность и терапевтическую эффективность средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.Experimental verification showed that the proposed method provides pharmaceutical stability, maximum biological value and therapeutic efficacy of the agent that normalizes the function of blood vessels, made in the form of a dosage form for parenteral administration, which is confirmed by the experimental results given in the examples illustrating the invention.
Другим аспектом изобретения является средство, нормализующее функции кровеносных сосудов в виде лекарственной формы для парентерального введения, представляющее собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, технический результат которого заключается в том, что выделенное вещество отличается от известных веществ, полученных ранее из животного сырья, по молекулярной массе (от 500 до 1500 Да) входящих в него пептидных компонентов (патенты РФ №№ 1298879, 2104702, 2163129), а также по его не токсичности и апирогенности за счет полной очистки от примесей.Another aspect of the invention is an agent that normalizes the function of blood vessels in the form of a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction from 70 to 90% with a molecular weight of its peptide components ranging from 72 to 678 Da, with a concentration of polypeptides 2.5 ÷ 2.9 mg / ml, the technical result of which is that the isolated substance differs from known substances obtained previously from animal raw materials in molecular weight (from 500 to 1500 Yes) its peptide components (RF patents Nos. 1298879, 2104702, 2163129), as well as its non-toxicity and pyrogen-free nature due to complete purification from impurities.
В ходе исследований в экспериментах на животных выявлено, что полученный водный раствор средства с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл является терапевтически эффективной дозой, что позволяет считать показанным использование средства при различных видах патологии сосудистой системы. Это подтверждается приводимыми ниже примерами.In the course of studies in animal experiments, it was found that the obtained aqueous solution of the drug with a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml is a therapeutically effective dose, which allows us to consider the use of the tool for various types of vascular system pathology. This is confirmed by the following examples.
В процессе проведения исследований была установлена важность следующих стадий способа получения средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения (далее - препарат):In the process of conducting research, the importance of the following stages of the method of obtaining a means of normalizing the function of blood vessels, made in the form of a dosage form for parenteral administration (hereinafter referred to as the drug), was established:
- повторное осаждение образовавшегося гомогенизированного осадка двукратными объемами ацетона не менее двух раз и последующее промывание на нутч-фильтре двукратными объемами ацетона до получения осадка светло-серого цвета, что свидетельствует о полной очистке осадка от примесей, таких как липидные, белковые, фосфолипидные и другие;- repeated precipitation of the resulting homogenized precipitate with double volumes of acetone at least two times and subsequent washing on the suction filter with double volumes of acetone until a light gray precipitate is obtained, which indicates complete purification of the precipitate from impurities such as lipid, protein, phospholipid and others;
- получение водного раствора экстракта в концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл; его центрифугирование, фильтрование, с последующей ультрафильтрационной очисткой на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, и добавлении в ультрафильтрат гликокола до конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6;- obtaining an aqueous solution of the extract in a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml; its centrifugation, filtration, followed by ultrafiltration cleaning at the installation with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Da, and glycocol added to ultrafiltrate to a final concentration of 10 ÷ 20 mg / ml at pH = 5.6 ÷ 6.6;
- стерилизующая фильтрация, ампулирование и автоклавирование в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2, что обеспечивает стабильность препарата при сохранении терапевтической эффективности.- sterilizing filtration, ampouling and autoclaving for 8 minutes at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2 , which ensures the stability of the drug while maintaining therapeutic efficacy.
Режим и время автоклавирования были установлены экспериментально.The mode and time of autoclaving were established experimentally.
Указанный технический результат достигается тем, что средство, нормализующее функции кровеносных сосудов, выполнено в виде лекарственной формы для парентерального введения и представляет собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл и получено из кровеносных сосудов телят не старше 12-месячного возраста или свиней путем экстракции уксусной кислотой в присутствии хлористого цинка.The specified technical result is achieved in that the agent normalizing the function of blood vessels is made in the form of a parenteral dosage form and is a peptide complex with a low molecular weight fraction of 70 to 90% with a molecular weight of the peptide components included in it ranging from 72 to 678 Yes, with a concentration of polypeptides of 2.5–2.9 mg / ml and obtained from blood vessels of calves no older than 12 months of age or pigs by extraction with acetic acid in the presence of zinc chloride.
Указанный технический результат достигается также тем, что предлагаемый способ получения средства, нормализующего функции кровеносных сосудов, характеризуется тем, что кровеносные сосуды телят не старше 12-месячного возраста или свиней замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев, затем измельчают, добавляют 3% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 1:5 при температуре 20°±5°С, экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси в нее добавляют 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч, экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием, к экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5, выдерживают при температуре 3÷5°С в течение 4 ч, образовавшийся гомогенизированный осадок повторно осаждают ацетоном не менее 2-х раз, затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета, протирают через металлическое сито, высушивают, растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и постоянном перемешивании до концентрации полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл, раствор центрифугируют, фильтруют, подвергают ультрафильтрационной очистке на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см2 через материалы с задерживающей способностью 15000 Да, в ультрафильтрат добавляют гликокол до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл при рН=5,6÷6,6, раствор подвергают стерилизующей фильтрации под давлением не более 2,0 кгс/см2, разливают в ампулы по 2 мл и автокпавируют в течение 8 мин при температуре 120°С и атмосферном давлении 1,1 кгс/см2.The specified technical result is also achieved by the fact that the proposed method of obtaining a means of normalizing the function of blood vessels is characterized in that the blood vessels of calves no older than 12 months of age or pigs are frozen at a temperature of at least minus 40 ° C, kept at a temperature of minus 20 ÷ 22 ° C for at least two months, then crushed, add a 3% solution of acetic acid in a volume ratio of 1: 5 at a temperature of 20 ° ± 5 ° C, extraction is carried out with constant stirring, after obtaining a homogeneous the links are added to it with a 1% solution of zinc chloride in a volume ratio of 50: 1, cooled with constant stirring to a temperature of 7 ÷ 16 ° C, then stirred for 1 hour after every 4 hours of sedimentation for 48 hours, the extract is separated from the ballast substances by separation, acetone is added to the extract in a volume ratio of 1: 5, kept at a temperature of 3 ÷ 5 ° C for 4 h, the resulting homogenized precipitate is re-precipitated with acetone at least 2 times, then the precipitate containing the active substance is washed twice with a suction filter volumes and acetone cooled to a temperature of 7-16 ° C until a light gray precipitate is obtained, wiped through a metal sieve, dried, dissolved in distilled water at room temperature and with constant stirring to a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml, solution centrifuged, filtered, subjected to ultrafiltration cleaning at the installation with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 through materials with a retention capacity of 15,000 Yes, glycol is added to the ultrafiltrate to its final concentration of 10 ÷ 20 mg / ml at pH = 5.6 ÷ 6 , 6, solution p dvergayut sterilizing filtration under pressure of not more than 2.0 kgf / cm 2, filled into vials of 2 ml and avtokpaviruyut for 8 minutes at 120 ° C and atmospheric pressure of 1.1 kgf / cm 2.
Сущность изобретения поясняется таблицами и чертежом.The invention is illustrated by tables and drawing.
В Таблице 1 показано влияние препарата на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.Table 1 shows the effect of the drug on the morphological and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs in the study of toxicity.
На чертеже показано влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенки.The drawing shows the effect of the drug on the development of explants of the vascular wall.
В Таблице 2 представлено влияние препарата на показатели липидного и углеводного обмена у больных атеросклерозом артерий.Table 2 shows the effect of the drug on lipid and carbohydrate metabolism in patients with arteriosclerosis.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами: пример 1 - способ получения препарата; пример 2 - изучение токсичности препарата; пример 3, подтверждающий биологическую активность препарата; пример 4, подтверждающий терапевтическую эффективность препарата, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.The invention is illustrated by the following examples: example 1 - a method of obtaining a preparation; example 2 - the study of the toxicity of the drug; example 3, confirming the biological activity of the drug; example 4, confirming the therapeutic effectiveness of the drug, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
Пример 1. Способ получения препаратаExample 1. The method of obtaining the drug
В качестве сырья используются кровеносные сосуды телят (не старше 12-месячного возраста) или свиней, которые замораживают при температуре не менее минус 40°С и выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев.The blood vessels of calves (not older than 12 months of age) or pigs that are frozen at a temperature of at least minus 40 ° C and kept at a temperature of minus 20 ÷ 22 ° C for at least two months are used as raw materials.
В реактор для экстракции перекачивают 500 л 3% раствора уксусной кислоты и охлаждают до температуры (20±5)0°С, затем в реактор при постоянном перемешивании загружают 100 кг измельченного до получения гомогенной массы сырья. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании, после получения однородной взвеси добавляют в нее 1% раствор хлористого цинка в объемном соотношении 50:1, охлаждают при постоянном перемешивании до температуры плюс 7÷16°С, затем перемешивают по 1 часу через каждые 4 ч отстаивания в течение 48 ч.500 l of a 3% solution of acetic acid are pumped into the extraction reactor and cooled to a temperature of (20 ± 5) 0 ° С, then 100 kg of crushed material is loaded into the reactor with constant stirring until a homogeneous mass of raw material is obtained. The extraction is carried out with constant stirring, after obtaining a homogeneous suspension, a 1% solution of zinc chloride in a volume ratio of 50: 1 is added to it, cooled with constant stirring to a temperature of plus 7 ÷ 16 ° C, then it is stirred for 1 hour after every 4 hours of settling for 48 h
Экстракт отделяют от балластных веществ сепарированием при (5000±500) об/мин в течение 1 ч. К экстракту добавляют ацетон в объемном соотношении 1:5. Выдерживают при температуре плюс 3÷5°С в течение 4 ч. Образовавшийся осадок гомогенизируют и повторно осаждают ацетоном не менее двух раз. Затем осадок, содержащий активное вещество, промывают на нутч-фильтре двукратными объемами охлажденного до температуры 7÷16°С ацетона до получения осадка светло-серого цвета. Промытый осадок протирают через металлическое сито, выкладывают тонким слоем в эмалированные кюветы, закрывают двойным слоем ткани хлопчатобумажной и высушивают при периодическом помешивании в вытяжном шкафу до полного удаления запаха ацетона.The extract is separated from the ballast substances by separation at (5000 ± 500) rpm for 1 hour. Acetone in a volume ratio of 1: 5 is added to the extract. It is kept at a temperature of plus 3 ÷ 5 ° C for 4 hours. The precipitate formed is homogenized and re-precipitated with acetone at least two times. Then the precipitate containing the active substance is washed on a suction filter with twice volumes of acetone cooled to a temperature of 7-16 ° C until a light gray precipitate is obtained. The washed precipitate is wiped through a metal sieve, spread in a thin layer into enameled cuvettes, covered with a double layer of cotton cloth and dried with periodic stirring in a fume hood until the smell of acetone is completely removed.
Выход активного вещества (порошка биологически активного пептидного комплекса, выделенного из кровеносных сосудов) составляет 30 г на 1 кг исходного сырья.The yield of active substance (powder of a biologically active peptide complex isolated from blood vessels) is 30 g per 1 kg of feedstock.
Полученный порошок растворяют в дистиллированной воде при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 40 мин до концентрации пептидов 2,5÷2,9 мг/мл. Полученный раствор центрифугируют при (3000±200) об/мин в течение (20±5)мин. Центрифугат фильтруют через фильтр типа АР-15 или аналогичный.The resulting powder is dissolved in distilled water with constant stirring at room temperature for 40 min to a concentration of peptides 2.5 ÷ 2.9 mg / ml The resulting solution was centrifuged at (3000 ± 200) rpm for (20 ± 5) minutes. The centrifuge is filtered through an AP-15 filter or similar.
Фильтрат подвергают ультрафильтрационной очистке на установке для ультрафильтрации при противодавлении не более 1,0 кгс/см2, через материалы с задерживающей способностью 15000 Да.The filtrate is subjected to ultrafiltration purification in an ultrafiltration unit with a backpressure of not more than 1.0 kgf / cm 2 , through materials with a retention capacity of 15,000 Da.
В ультрафильтрат добавляют расчетную навеску гликокола, до его конечной концентрации 10÷20 мг/мл, перемешивают до полного растворения гликокола при сохранении рН=5,6÷6,6.A calculated sample of glycocol is added to the ultrafiltrate, to its final concentration of 10–20 mg / ml, and mixed until the glycol is completely dissolved while maintaining pH = 5.6–6.6.
Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, которую проводят под давлением, не превышающим 2,0, кгс/см2.The solution is subjected to sterilizing filtration, which is carried out under pressure not exceeding 2.0 kgf / cm 2 .
Полученный раствор разливают в ампулы по 2,0 мл и автоклавируют, причем ампулы с препаратом подвергают стерилизации в течение 8 минут при температуре 120°С и атмосферном давлении не более 1,1 кгс/см2.The resulting solution is poured into 2.0 ml ampoules and autoclaved, and the ampoules with the preparation are sterilized for 8 minutes at a temperature of 120 ° C and atmospheric pressure of not more than 1.1 kgf / cm 2 .
Препарат представляет собой бесцветный, прозрачный раствор и содержит пептидный комплекс с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.The preparation is a colorless, transparent solution and contains a peptide complex with a concentration of polypeptides of 2.5 ÷ 2.9 mg / ml.
Тестирование на отсутствие высокомолекулярных белковых компонентов осуществляют путем добавления к содержимому 1 ампулы препарата 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Прозрачность раствора свидетельствует об отсутствии высокомолекулярных белковых компонентов.Testing for the absence of high molecular weight protein components is carried out by adding to the contents of 1 ampoule of the drug 1 ml of a 10% solution of trichloroacetic acid. The transparency of the solution indicates the absence of high molecular weight protein components.
Для определения в препарате пептидных связей к его раствору добавляют биуретовый реактив. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в препарате пептидных связях.To determine peptide bonds in a preparation, a biuret reagent is added to its solution. Staining the solution with violet color indicates the peptide bonds present in the preparation.
С целью определения в препарате полипептидов и их фракций используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле.In order to determine the polypeptides and their fractions in the preparation, the methods of ultraviolet spectrophotometry, gel chromatography, mass spectrometry, high performance liquid chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis are used.
Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 270÷5 нм.The ultraviolet spectrum of the drug solution is recorded in the wavelength range from 250 to 350 nm: the absorption maximum is observed at a wavelength of 270 ÷ 5 nm.
Молекулярную массу полипептидов, входящих в препарат определяют следующими методами:The molecular weight of the polypeptides included in the drug is determined by the following methods:
методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия);by gel chromatography on Sephadex G-25 and G-50 (Pharmacia, Sweden). Peptide Molecuar Weight Kit MS III (Serva, Germany) was used to calibrate a 1.6 x 60 cm column;
методом масс-спектрометрии. Спектры получают на времяпролетном масс-спектрометре Voyager DE Biospectrometry с лазерной десорбцией и ионизацией с помощью матрицы (MALDI-TOF) при относительной интенсивности азотного лазера 2300÷2400, ускоряющем напряжении 25000 В, времени задержки 90 нс и давлении в вакуумной камере 2,6×106 тор;mass spectrometry method. Spectra are obtained on a Voyager DE Biospectrometry time-of-flight mass spectrometer with laser desorption and ionization using a matrix (MALDI-TOF) at a relative intensity of a nitrogen laser of 2300 ÷ 2400, an accelerating voltage of 25000 V, a delay time of 90 ns, and a pressure in the vacuum chamber of 2.6 × 10 6 torr;
методом электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков.by electrophoresis in a 15% polyacrylamide gel in comparison with a standard set of marker proteins.
Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят полипептиды с молекулярной массой от 72 до 678 Да.Using the methods listed above, it was found that the composition of the drug includes polypeptides with a molecular weight of 72 to 678 Da.
С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C18», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав препарата входят преимущественно низкомолекулярные фракции - от 70 до 90%, а высокомолекулярные компоненты в препарате отсутствуют.Using reverse-phase high-performance liquid chromatography in an acetonitrile gradient (Lichrosorb C18 sorbent, column 2 × 62 mm), it was found that the preparation contains mainly low molecular weight fractions - from 70 to 90%, and there are no high molecular weight components in the preparation.
Пирогенность препарата определяют на кроликах общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций. Показано что препарат является апирогенным.Pyrogenicity of the drug is determined in rabbits by the generally accepted method (GF XI, issue 2, p. 183) with a test dose of 0.25 mg per 1 kg of animal weight in 1.0 ml of isotonic 0.9% sodium chloride solution for injection. It is shown that the drug is pyrogen-free.
Таким образом, вышеизложенным способом получен препарат - лекарственная форма для парентерального введения, представляющая собой пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной фракции от 70 до 90%, с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 72 до 678 Да, с концентрацией полипептидов 2,5÷2,9 мг/мл.Thus, in the above method, a preparation is obtained - a parenteral dosage form, which is a peptide complex with a low molecular weight fraction of from 70 to 90%, with a molecular weight of its constituent peptide components ranging from 72 to 678 Da, with a concentration of 2.5 polypeptides ÷ 2.9 mg / ml.
Пример 2. Изучение токсичности препаратаExample 2. The study of the toxicity of the drug
Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.The general toxic effect of the drug was investigated in accordance with the requirements of the Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances (2000): acute toxicity with a single administration of the drug, as well as subacute and chronic toxicity with prolonged administration of the drug.
Исследование по изучению острой токсичности проведено на 72 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20÷22 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 35 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг, 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.A study of acute toxicity was conducted on 72 white mongrel male mice with a body weight of 20–22 g. Animals were randomly divided into 6 equal groups. The drug was administered to animals once intramuscularly at doses of 35 mg / kg, 50 mg / kg, 100 mg / kg, 150 mg / kg, 200 mg / kg in 0.25 ml of sterile 0.9% NaCl solution. Animals of the control group were injected with the same volume of 0.9% NaCl solution.
Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 65 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150÷180 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.Studies on the study of subacute toxicity were carried out on 65 white outbred male rats with a body weight of 150 ÷ 180 g. Once daily, animals of the experimental groups were injected intramuscularly for 90 days at doses of 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg 0.5 ml of a sterile 0.9% NaCl solution. The animals of the control group were injected in the same volume with a sterile 0.9% NaCl solution. Before administration of the drug on the 30, 60 and 90 days after the start of drug administration, the morphological composition and properties of peripheral blood were studied in animals. At the end of the experiment, biochemical and coagulological blood parameters were examined.
Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата на 84 морских свинках-самцах с массой тела 250÷280 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно препарат в течение 6 мес в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинно-мозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.Studies of chronic toxicity were carried out for 6 months based on the duration of the recommended clinical prescription of the drug in 84 male guinea pigs with a body weight of 250–280 g. Animals of the experimental groups received intramuscular preparation once daily for 6 months at doses of 1 mg / kg, 10 mg / kg, 100 mg / kg in 0.5 ml of a sterile 0.9% NaCl solution. In the control group, animals were injected in a similar fashion with a sterile 0.9% NaCl solution in the same volume. In animals, peripheral blood was determined by conventional methods: the number of red blood cells, hemoglobin, reticulocytes, platelets, white blood cells, white blood cell count, erythrocyte sedimentation rate (ESR), and erythrocyte resistance. Along with this, the content of total protein in blood serum was determined by the method of Lowry, potassium and sodium by plasma spectrophotometry. After the experiment was completed, a pathomorphological study of the brain and spinal cord, spinal ganglia, thyroid gland, parathyroid glands, adrenal glands, testes, pituitary gland, heart, lungs, aorta, liver, kidney, bladder, pancreas, stomach, small intestine, colon intestines, thymus, spleen, lymph nodes, bone marrow.
При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого препарата животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.When studying acute toxicity, it was found that a single administration of the studied drug to animals in a dose exceeding the therapeutic recommended for clinical use by more than 5000 times does not cause toxic reactions, which indicates a large therapeutic breadth of the drug.
Изучение подострой и хронической токсичности препарата свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 300÷3000 раз. При исследовании влияния препарата на морфологический состав и биохимические показатели периферической крови морских свинок через 3 и 6 месяцев после начала его введения достоверного изменения показателей не выявлено (Таблица 1).The study of subacute and chronic toxicity of the drug indicates the absence of side effects with prolonged use of the drug in doses exceeding the therapeutic 300-3000 times. When studying the effect of the drug on the morphological composition and biochemical parameters of the peripheral blood of guinea pigs after 3 and 6 months after the start of its administration, no significant change in the indicators was revealed (Table 1).
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.When assessing the general condition of animals, morphological and biochemical parameters of peripheral blood, the morphological state of internal organs, the state of the cardiovascular and respiratory systems, and liver and kidney function, pathological changes in the body were not detected.
Следовательно, препарат, полученный предлагаемым способом, при длительном введении животным не обладает токсическими свойствами, препятствующими дальнейшему его применению в качестве лекарственного средства, выполненного в виде лекарственной формы для парентерального введения.Therefore, the drug obtained by the proposed method, with long-term administration to animals does not have toxic properties that prevent its further use as a medicine, made in the form of a dosage form for parenteral administration.
Пример 3. Влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенкиExample 3. The effect of the drug on the development of explants of the vascular wall
Эксперименты проведены на 39 фрагментах сосудистой стенки периферической артерии крыс линии «Wistar» с массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты сосудистой стенки помещали в эту среду и культивировали на коллагеновой подложке в чашках Петри в термостате при температуре 36,7°С, в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли препарат в концентрациях 1, 10, 50, 100, 200 и 400 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента сосудистой стенки. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.The experiments were performed on 39 fragments of the vascular wall of the peripheral artery of Wistar rats weighing 150-200 g. The culture medium for explant cultivation consisted of 35% Eagle's solution, 25% fetal calf serum, 35% Hanks' solution, 5% chicken embryonic extract , glucose (0.6%), insulin (0.5 units / ml), penicillin (100 units / ml), glutamine (2 mM) were added to the medium. Vascular wall fragments were placed in this medium and cultured on a collagen substrate in Petri dishes in a thermostat at a temperature of 36.7 ° C for 2 days. The preparation was added to the experimental medium at concentrations of 1, 10, 50, 100, 200, and 400 ng / ml. The criterion of biological activity was the area index (PI) - the ratio of the area of the entire explant along with the growth zone to the outgoing area of the vascular wall fragment. The IP values were expressed as a percentage, the control IP value was taken as 100%.
На чертеже показано влияние препарата на развитие эксплантатов сосудистой стенки.The drawing shows the effect of the drug on the development of explants of the vascular wall.
Установлено что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации препарата 50 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 25%, по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов сосудистой стенки на более длительных сроках культивирования (7 дней) было выявлено аналогичное стимулирующее действие препарата в той же концентрации.It was established that after 1 day of cultivation, the explants expanded on a collagen substrate and the proliferation of proliferating and migrating cells began along the periphery of the explant. On the 3rd day of cultivation at a drug concentration of 50 ng / ml, a significant increase in the explant PI by 25% was observed, compared with the control PI values. When studying vascular wall explants for longer periods of cultivation (7 days), a similar stimulating effect of the drug at the same concentration was revealed.
Таким образом, в отношении ткани сосудистой стенки препарат оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.Thus, in relation to the tissue of the vascular wall, the drug had a tissue-specific effect, manifested in stimulating the growth of explants.
Пример 4. Эффективность применения препарата у больных с атеросклерозом сосудов головного мозгаExample 4. The effectiveness of the drug in patients with atherosclerosis of the cerebral vessels
Изучение клинической эффективности применения препарата проводили с участием 27 пациентов, страдающих атеросклерозом сосудов головного мозга в возрасте от 67 до 83 лет. У больных отмечались различные клинические проявления цереброваскулярных расстройств в виде нарушения памяти, концентрации внимания, аффективной лабильности.A study of the clinical efficacy of the drug was carried out with the participation of 27 patients suffering from cerebral arteriosclerosis aged 67 to 83 years. Patients noted various clinical manifestations of cerebrovascular disorders in the form of memory impairment, concentration, affective lability.
Все больные методом простой рандомизации были разделены на 2 группы. В основную группу вошли 15 больных, которые дополнительно к общепринятому лечению получали препарат в дозе 5 мг в 2,0 мл физиологического раствора внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней.All patients using simple randomization were divided into 2 groups. The main group included 15 patients who, in addition to conventional treatment, received the drug at a dose of 5 mg in 2.0 ml of saline intramuscularly once daily for 10 days.
Контрольная группа включала 12 пациентов, получавших только общепринятое лечение.The control group included 12 patients who received only conventional treatment.
В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи, биохимическое изучение крови.Patients' complaints were evaluated in dynamics, a general clinical study of blood and urine, a biochemical study of blood was performed.
Установлено что применение препарата у больных с атеросклерозом сосудов головного мозга способствовало улучшению общего самочувствия, уменьшению эмоциональной лабильности, стабилизации настроения, уменьшению тревожности. Больные отмечали улучшение памяти, концентрации внимания.It was established that the use of the drug in patients with cerebral arteriosclerosis contributed to an improvement in overall well-being, a decrease in emotional lability, stabilization of mood, and a decrease in anxiety. Patients noted improved memory, concentration.
Среди лабораторных показателей наиболее информативными были данные биохимического исследования крови (Таблица 2). Применение препарата способствовало достоверному снижению уровня общего холестерина в крови по сравнению с показателем как до лечения, так и после лечения с применением общепринятых средств. Отмечалась также отчетливая тенденция к снижению содержания холестерина липопротеидов очень низкой плотности, являющихся наиболее атерогенными. Это свидетельствует о нормализующем влиянии препарата на метаболизм в клетках сосудистой стенки.Among laboratory indicators, the most informative were the data of a biochemical blood test (Table 2). The use of the drug contributed to a significant decrease in the level of total cholesterol in the blood compared with the indicator both before treatment and after treatment with the use of conventional means. There was also a clear tendency towards a decrease in the cholesterol content of very low density lipoproteins, which are the most atherogenic. This indicates a normalizing effect of the drug on metabolism in the cells of the vascular wall.
Эффективность влияния препарата на интегративную функцию мозга изучали с использованием психофизиологических тестов, характеризующих особенности памяти и мышления у больных с цереброваскулярными расстройствами: «Кратковременная зрительная память на числа» (КПЗ), «Долговременная память на числа» (ДП) и «Установление закономерностей».The effectiveness of the effect of the drug on the integrative function of the brain was studied using psychophysiological tests characterizing the features of memory and thinking in patients with cerebrovascular disorders: “Short-term visual memory for numbers” (CTC), “Long-term memory for numbers” (DP), and “Establishing patterns”.
У больных контрольной группы, получавших общепринятую терапию, достоверных изменений показателей психофизиологических тестов выявлено не было.In patients of the control group receiving conventional therapy, no significant changes in the indicators of psychophysiological tests were detected.
У пациентов основной группы, получавших лечение с применением препарата, были выявлены достоверные изменения показателей тестов по сравнению с показателями до лечения и с показателями у больных контрольной группы (Таблица 3). Это проявлялось в положительной динамике изменения когнитивных функций, характеризующих объем и точность зрительной информации (КЗП на числа), точность запоминания, хранения и оперативного воспроизведения информации (оперативная память, ОП) и логическое мышление (способность к умозаключению). Кроме того, у пациентов основной группы было выявлено достоверное повышение устойчивости и концентрации внимания, скорости переработки информации, нормализация основных корковых процессов, достоверное улучшение кратковременной и даже тенденция к улучшению долговременной памяти, достоверное улучшение показателей, характеризующих логическое мышление, снижение времени сенсомоторной реакции (Таблица 3). Изменения психофизиологических показателей характеризуют усиление процесса возбуждения в коре головного мозга у больных с цереброваскулярными расстройствами, что свидетельствует об улучшении кровоснабжения подверженных ишемии участков головного мозга и о благоприятном действии препарата на функцию кровеносных сосудов. При изучении клинической эффективности применения препарата побочного действия и осложнений не выявлено.In patients of the main group who received treatment with the drug, significant changes were found in test parameters compared with indicators before treatment and with parameters in patients in the control group (Table 3). This was manifested in the positive dynamics of changes in cognitive functions that characterize the volume and accuracy of visual information (KZP by numbers), the accuracy of memorization, storage and operational reproduction of information (random access memory, memory) and logical thinking (ability to inference). In addition, in patients of the main group, a significant increase in stability and concentration of attention, the speed of information processing, normalization of the main cortical processes, a significant improvement in short-term and even a tendency to improve long-term memory, a significant improvement in indicators characterizing logical thinking, a decrease in the sensorimotor reaction time were revealed (Table 3). Changes in psychophysiological parameters characterize the intensification of the excitation process in the cerebral cortex in patients with cerebrovascular disorders, which indicates an improvement in blood supply to areas of the brain subject to ischemia and the beneficial effect of the drug on the function of blood vessels. When studying the clinical effectiveness of the drug, side effects and complications were not detected.
Таким образом, результаты проведенного клинического исследования свидетельствуют о лечебной эффективности применения препарата в терапевтически эффективной дозе 5 мг (2,5 мг/мл) внутримышечно однократно ежедневно в течение 10 дней и целесообразности его применения в комплексном лечении атеросклероза артерий.Thus, the results of a clinical study indicate the therapeutic efficacy of the drug in a therapeutically effective dose of 5 mg (2.5 mg / ml) intramuscularly once daily for 10 days and the feasibility of its use in the complex treatment of atherosclerosis of arteries.
# - Р<0,05 по сравнению с показателем после лечения с применением общепринятых средств.* - P <0.05 compared with the indicator before treatment;
# - P <0.05 compared with the indicator after treatment using conventional means.
# - Р<0,05 по сравнению с показателем после лечения с применением общепринятых средств.* - P <0.05 compared with the indicator before treatment;
# - P <0.05 compared with the indicator after treatment using conventional means.
Claims (2)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006122065/15A RU2301072C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof |
| EA200700472A EA010734B1 (en) | 2006-06-22 | 2007-03-21 | Medicament normalizing blood vessel functions, and method for preparing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006122065/15A RU2301072C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2301072C1 true RU2301072C1 (en) | 2007-06-20 |
Family
ID=38314258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006122065/15A RU2301072C1 (en) | 2006-06-22 | 2006-06-22 | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA010734B1 (en) |
| RU (1) | RU2301072C1 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1227198A1 (en) * | 1982-09-29 | 1986-04-30 | Ленинградское Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Производственное Объединение Мясной Промышленности | Method of producing polypeptides |
| RU2073518C1 (en) * | 1993-06-17 | 1997-02-20 | Совместное русско-американское акционерное общество закрытого типа "Неофарм" | Agent recovering retina eye function |
| RU2161982C1 (en) * | 2000-01-20 | 2001-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Клиника Института биорегуляции и геронтологии" | Tetrapeptide stimulating eye retina function, pharmacological agent based on thereof and method of its using |
| WO2005094865A1 (en) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Cardio Incorporated | Compound having angiogenic effect |
-
2006
- 2006-06-22 RU RU2006122065/15A patent/RU2301072C1/en active
-
2007
- 2007-03-21 EA EA200700472A patent/EA010734B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200700472A1 (en) | 2007-12-28 |
| EA010734B1 (en) | 2008-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2461500A1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING A SUBSTANCE CAPABLE OF STIMULATING THE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF HUMAN GRANULOPOIETIC STEM CELLS | |
| EP3835413A1 (en) | Method and composition for promoting cell growth and tissue repair | |
| EP2589389B1 (en) | Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex | |
| WO2009088314A1 (en) | Method for producing a biologically active complex exhibiting neuroregenerative and neuroprotective activity | |
| RU2302874C1 (en) | Agent normalizing reproductive function in men and method for its preparing | |
| RU2301071C1 (en) | Hepatoprotective agent and method for production thereof | |
| RU2301072C1 (en) | Agent for normalizing of blood-vessel function and method for production thereof | |
| RU2301678C1 (en) | Peptide stimulating regeneration of central nervous system neurons, pharmaceutical composition based on thereof and method for its using | |
| CN114209716B (en) | Application of modified lysosome in preparing medicines for treating protein misfolding or processing diseases | |
| CN112566646A (en) | Medicine for treating tissue necrosis or improving cardiac function | |
| EP2656853A1 (en) | Method for treating acute cerebral and spinal blood flow disorders of an ischaemic or haemorrhagic nature | |
| EP2730584B1 (en) | Protein-polypeptide complex obtained from nervous tissue of hoofed livestock embryos, process for preparing same and pharmaceutical composition | |
| RU2302871C1 (en) | Brain functions normalizing agent and a method for preparation thereof | |
| RU2302868C1 (en) | Agent normalizing kidney function and method for its preparing | |
| RU2302875C1 (en) | Agent normalizing pancreas function and method for its preparing | |
| RU2302867C1 (en) | Agent normalizing bladder tonus and method for its preparing | |
| JP2023538109A (en) | Compositions and methods of treatment using microvesicles from bone marrow-derived mesenchymal stem cells | |
| RU2303454C1 (en) | Preparation for normalizing female reproductive function and method for its obtaining | |
| RU2302872C9 (en) | Agent normalizing cartilage tissue function and method for its preparing | |
| CN113651870A (en) | Small molecule modified short peptide for promoting post-traumatic tissue repair and regeneration and application thereof | |
| RU2811901C1 (en) | Agent for stimulating proliferative activity of bone marrow cells | |
| RU2799637C1 (en) | Method of producing biologically active peptide-amino acid preparation based on human blood plasma | |
| RU2033796C1 (en) | Peptide-containing fraction from mammalian spleen showing immunostimulating activity, and a method of its preparing | |
| RU2302870C1 (en) | Geroprotector activity exhibiting agent and a method for preparation thereof | |
| WO2010138024A2 (en) | Agent for protecting brain cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180727 Effective date: 20180727 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180727 Effective date: 20191230 |