RU2291700C2 - Method for photodynamic action on viruses or cells - Google Patents

Abstract

FIELD: biology and medicine, in particular therapy of viral and tumor diseases.

SUBSTANCE: claimed method includes exposing of viruses or cells with siglet oxygen generating from molecular oxygen by using of carbon photosensitizing agent contacting with molecular oxygen and said viruses or cells and irradiating with optical radiation. As photosensitizing agent slurry of polyhedral layered carbon nanostructures having interlaminar distances of 0.34-0.36 nm are used.

EFFECT: nanostructures with high heat and radiation resistance, precipitation resistance and relatively low cost.

10 cl, 3 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для терапии вирусных и онкологических заболеваний путем фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки.The invention relates to the field of biology and medicine and can be used for the treatment of viral and oncological diseases by photodynamically affecting viruses and cancer cells.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Известные способы фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки основаны на применении фотосенсибилизатора, который тем или иным образом вводят в достаточно близкий контакт с указанными вирусами или клетками в присутствии молекулярного кислорода и облучают при этом световым излучением. Фотосенсибилизатор при световом облучении возбуждается и генерирует синглетный кислород путем передачи энергии молекулярному кислороду, находящемуся в тканях или физиологических жидкостях, подвергаемых фотодинамическому воздействию. Генерируемый синглетный кислород обладает высоким поражающим действием в отношении вирусов и раковых клеток.Known methods for the photodynamic effect on viruses and cancer cells are based on the use of a photosensitizer, which in one way or another is brought into rather close contact with these viruses or cells in the presence of molecular oxygen and is irradiated with light radiation. A photosensitizer is excited by light irradiation and generates singlet oxygen by transferring energy to molecular oxygen in tissues or physiological fluids subjected to photodynamic effects. The generated singlet oxygen has a high damaging effect against viruses and cancer cells.

Для эффективного фотодинамического воздействия на раковые клетки и вирусы фотосенсибилизатор должен обладать такими свойствами как:For an effective photodynamic effect on cancer cells and viruses, a photosensitizer must have such properties as:

- способность эффективно генерировать синглетный кислород под действием светового облучения,- the ability to effectively generate singlet oxygen under the influence of light irradiation,

- совместимость с тканями и биологическими жидкостями,- compatibility with tissues and body fluids,

- устойчивость к разрушению под действием светового облучения при длительном и многократном воздействии,- resistance to destruction under the action of light irradiation during prolonged and repeated exposure,

- способность к адресной доставке к патологическим тканям,- the ability to targeted delivery to pathological tissues,

- дешевизна и доступность получения.- low cost and availability of receipt.

В настоящее время в качестве фотосенсибилизаторов широко используются всевозможные красители как природного, так и синтетического происхождения. Так, для лечения онкологических заболеваний используются синтезированные производные гематопорфирина (HpD), такие как Protofrin (Lipson et al. J.Natl. Cancer Inst., 26, (1961) р.1-11), а для очистки плазмы крови от вирусов применяют синтетический краситель метиленовый голубой (Н.Mohr. // Methods of Enzymology, 319, (2000), р.207-216). К фотосенсибилизаторам второго поколения относятся имеющие более высокую степень очистки производные порфиринов, фталоцианиды, хлорины (М.Kreimer-Birmbaum // Semin. Hematol. 26, (1989), р.157-173), и другие новые фотосенсибилизаторы (D. Braichotte, et al. // Photodynamic therapy and biomedical lasers, pp.461-465, ed. Elsevier, Amsterdam, 1992).Currently, various dyes of both natural and synthetic origin are widely used as photosensitizers. So, for the treatment of oncological diseases, synthesized hematoporphyrin derivatives (HpD) are used, such as Protofrin (Lipson et al. J. Natl. Cancer Inst., 26, (1961) p. 1-11), and for the purification of blood plasma from viruses methylene blue synthetic dye (H. Mohr. // Methods of Enzymology, 319, (2000), p.207-216). Second-generation photosensitizers include higher-purity derivatives of porphyrins, phthalocyanides, chlorins (M. Kreimer-Birmbaum // Semin. Hematol. 26, (1989), p. 157-173), and other new photosensitizers (D. Braichotte, et al. // Photodynamic therapy and biomedical lasers, pp. 461-465, ed. Elsevier, Amsterdam, 1992).

Существенным недостатком известных фотосенсибилизаторов на красителях как первого, так и второго поколения является сложность очистки организма или плазмы крови от использованного красителя, любой из которых относительно токсичен, а также от продуктов его разрушения, также, как правило, являющихся токсичными.A significant drawback of the known photosensitizers on dyes of both the first and second generation is the difficulty in cleaning the body or blood plasma of the dye used, any of which is relatively toxic, as well as from the products of its destruction, which are also usually toxic.

Например, эксперименты на пациентах показали, что краситель второго поколения Foskan на 75% разрушается прямо в опухоли в конце фотодинамической обработки при 10 Дж/см² (Photochem. Photobiol. 46 (1987), pp.925-938). Это относится и к метиленовому голубому, который используется для очистки плазмы крови от вирусов в промышленных масштабах. В результате возникает сложная проблема последующей очистки плазмы крови от использованного красителя и особенно от продуктов его разрушения.For example, experiments on patients showed that the second-generation dye Foskan is 75% destroyed directly in the tumor at the end of photodynamic treatment at 10 J / cm ² (Photochem. Photobiol. 46 (1987), pp.925-938). This also applies to methylene blue, which is used to clean blood plasma from viruses on an industrial scale. As a result, a complex problem arises of subsequent purification of blood plasma from the dye used and especially from the products of its destruction.

Кроме того, фотосенсибилизаторы на красителях обладают недостаточно высоким индексом селективности (в терминах ткань-мишень / здоровая ткань) и низким коэффициентом экстинции, что требует введения относительно большого количества препарата для получения удовлетворительного фотодинамического терапевтического эффекта. Например, высокая аккумуляция красителей на коже при их внутривенном введении делает кожу чувствительной к свету еще 6-8 недель после фотодинамической обработки. В течение этого времени пациенты вынуждены оставаться в темном помещении до окончательного выведения красителя из организма.In addition, dye photosensitizers do not have a sufficiently high selectivity index (in terms of target tissue / healthy tissue) and a low extinction coefficient, which requires the introduction of a relatively large amount of the drug to obtain a satisfactory photodynamic therapeutic effect. For example, the high accumulation of dyes on the skin during their intravenous administration makes the skin sensitive to light for another 6-8 weeks after photodynamic treatment. During this time, patients are forced to remain in a dark room until the final removal of the dye from the body.

Для решения вышеуказанных проблем, связанных с недостаточно высокой эффективностью и токсичностью фотосенсибилизаторов на красителях и трудностью их последующего удаления, было предложено использовать в качестве фотосенсибилизатора фуллерены, которые характеризуются высокой эффективностью генерирования синглетного кислорода при облучении светом и в то же время не токсичны и не распадаются на токсичные составляющие.To solve the above problems associated with the insufficiently high efficiency and toxicity of dye photosensitizers and the difficulty of their subsequent removal, it was proposed to use fullerenes as photosensitizers, which are characterized by high efficiency of generation of singlet oxygen when irradiated with light and at the same time are not toxic and do not decompose into toxic constituents.

Так, в качестве фотосенсибилизаторов предлагалось использование химически модифицированных водорастворимых форм фуллерена (US 5994410, 30.10.1999). Например, был предложен способ получения фотосенсибилизатора для фотодинамического лечения путем химического модифицирования фуллерена с помощью водорастворимого полимера (JP 9235235, 19.09.1997). Полученный этим способом химически модифицированный фуллерен предназначен для фотодинамического воздействия на раковые ткани. Препарат вводится внутривенно и преимущественно накапливается в опухолевых тканях, поражая их при световом облучении. Однако известно, что химическое модифицирование фуллерена приводит к нарушению его π-электронной системы и, вследствие этого, к уменьшению эффективности генерирования им синглетного кислорода. К тому же известно, что полученный таким способом водорастворимый полимер сохраняет свои свойства растворимости в воде при содержании фуллерена не более 1% по весу к полимеру, что ограничивает дозировку фотосенсибилизатора в препарате. В результате использование водорастворимых форм фуллеренов не получило широкого распространения, как из-за сложности получения модифицированного водорастворимого фуллерена, так и по причине снижения фотосенсибилизирующих свойств фуллерена вследствие его модификации.Thus, the use of chemically modified water-soluble forms of fullerene was proposed as photosensitizers (US 5994410, 10.30.1999). For example, a method has been proposed for the production of a photosensitizer for photodynamic treatment by chemically modifying fullerene using a water-soluble polymer (JP 9235235, 09/19/1997). The chemically modified fullerene obtained by this method is intended for the photodynamic effect on cancerous tissues. The drug is administered intravenously and mainly accumulates in tumor tissues, affecting them under light irradiation. However, it is known that chemical modification of fullerene leads to disruption of its π-electron system and, as a result, to a decrease in the efficiency of generation of singlet oxygen by it. In addition, it is known that the water-soluble polymer obtained in this way retains its water solubility properties when the fullerene content is not more than 1% by weight of the polymer, which limits the dosage of the photosensitizer in the preparation. As a result, the use of water-soluble forms of fullerenes is not widespread, both because of the difficulty in obtaining the modified water-soluble fullerene, and because of the decrease in the photosensitizing properties of fullerene due to its modification.

В патенте US 5566316, 02.02.1999, было предложено использовать в качестве фотосенсибилизатора немодифицированный фуллерен С₆₀, состоящий только из атомов углерода. Поскольку такие фуллерены практически не растворимы в воде, было предложено использовать их в виде водной суспензии, что облегчает последующее удаление фуллеренов, например, из подвергаемой фотодинамическому воздействию плазмы крови.In US Pat. No. 5,566,316, 02/02/1999, it was proposed to use unmodified C ₆₀ fullerene consisting only of carbon atoms as a photosensitizer. Since such fullerenes are practically insoluble in water, it was proposed to use them in the form of an aqueous suspension, which facilitates the subsequent removal of fullerenes, for example, from a blood plasma subjected to photodynamic effects.

Однако суспензии фуллеренов в воде или физиологической жидкости весьма неустойчивы, так как фуллерены в таких суспензиях имеют тенденцию к быстрому осаждению и обычно требуют постоянного перемешивания во время осуществления фотодинамического воздействия. В такой суспензии трудно получить достаточно высокую концентрацию фуллерена, поскольку при повышении концентрации устойчивость суспензии резко ухудшается.However, suspensions of fullerenes in water or physiological fluid are very unstable, since fullerenes in such suspensions tend to precipitate rapidly and usually require constant mixing during the implementation of photodynamic effects. In such a suspension, it is difficult to obtain a sufficiently high concentration of fullerene, since with increasing concentration, the stability of the suspension deteriorates sharply.

Кроме того, устойчивость фуллеренов к лучевому и термическому воздействию, а также их механическая устойчивость в ряде случаев также оказывается недостаточной. В частности, при интенсивном облучении светом фуллерены могут распадаться под воздействием генерируемого ими синглетного кислорода, что понижает эффективность фотодинамического воздействия. Недостаточная устойчивость фуллеренов обычно не позволяет многократно использовать их для фотодинамической обработки. При этом фуллерены имеют довольно высокую стоимость вследствие сложности процесса их получения.In addition, the stability of fullerenes to radiation and thermal effects, as well as their mechanical stability in some cases also turns out to be insufficient. In particular, under intense light irradiation, fullerenes can decompose under the influence of singlet oxygen generated by them, which reduces the efficiency of the photodynamic effect. The insufficient stability of fullerenes usually does not allow their repeated use for photodynamic processing. Moreover, fullerenes have a rather high cost due to the complexity of the process of their preparation.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Задачей изобретения является создание способа фотодинамического воздействия на вирусы или клетки с помощью нетоксичного фотосенсибилизатора, состоящего только из атомов углерода, который обладает большей, по сравнению с фуллеренами, устойчивостью к лучевому и термическому воздействию, большей устойчивостью к осаждению при его использовании в виде суспензии и меньшей стоимостью.The objective of the invention is to provide a method of photodynamic exposure to viruses or cells using a non-toxic photosensitizer consisting only of carbon atoms, which has greater, compared with fullerenes, resistance to radiation and thermal effects, more resistance to precipitation when used in suspension and less cost.

Задача изобретения решается путем использования в качестве фотосенсибилизатора материала, состоящего только из атомов углерода и представляющего собой полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, используемые в виде суспензии, например, в воде или физиологической жидкости. Такие наноструктуры полиэдральной формы имеют, в отличие от фуллеренов, многослойное строение и значительно больший размер частиц (который может составлять десятки или сотни нанометров, в то время как, например, размер частиц фуллерена С₆₀ равен 0,7 нм).The objective of the invention is solved by using as a photosensitizer material consisting of only carbon atoms and representing polyhedral multilayer carbon nanostructures used in the form of a suspension, for example, in water or physiological fluid. Such polyhedral nanostructures have, in contrast to fullerenes, a multilayer structure and a significantly larger particle size (which can be tens or hundreds of nanometers, while, for example, the particle size of C ₆₀ fullerene is 0.7 nm).

Из заявки на патент RU 2000124887, дата публикации 20.10.2002, известна одна из разновидностей таких полиэдральных многослойных углеродных наноструктур, которые обычно образуются как побочный продукт при получении фуллеренов. В RU 2000124887 эти структуры, названные авторами "астраленом", были впервые идентифицированы, и был предложен способ их выделения. Согласно этому способу, астрален получают путем термического распыления графитового анода в плазме дугового разряда, горящей в атмосфере инертного газа, осаждения продуктов распыления на катоде и переработки катодного осадка окислением, при котором корку катодного осадка измельчают и подвергают последовательным операциям окисления в газовой фазе и окисления в жидкой фазе в расплаве вещества, выбранного из группы, включающей гидроксиды, галогениды, нитраты щелочных металлов или их смеси, с последующим выделением целевого продукта. Полученные в результате этого процесса структуры обладают высокой химической стабильностью при существенной пористости, а также высокой термобароустойчивостью. Астрален имеет меньшую стоимость по сравнению с фуллеренами, при этом для его получения используют ту часть катодного осадка, которая ранее шла в отходы при производстве фуллеренов.From the patent application RU 2000124887, publication date 10/20/2002, one of the varieties of such polyhedral multilayer carbon nanostructures is known, which are usually formed as a by-product upon receipt of fullerenes. In RU 2000124887, these structures, called by the authors "astralen", were first identified, and a method for isolating them was proposed. According to this method, astralen is obtained by thermal sputtering of a graphite anode in an arc discharge plasma burning in an inert gas atmosphere, deposition of sputtering products on the cathode and oxidation processing of the cathode deposit, in which the crust of the cathode deposit is ground and subjected to sequential gas phase oxidation and oxidation the liquid phase in the melt of a substance selected from the group comprising hydroxides, halides, nitrates of alkali metals or mixtures thereof, followed by isolation of the target product. The structures obtained as a result of this process have high chemical stability with substantial porosity, as well as high thermal resistance. Astralen has a lower cost compared to fullerenes, while for its production, that part of the cathode deposit that was previously waste in the production of fullerenes is used.

Частицы астралена характеризуются межслоевым расстоянием 0,34-0,36 нм, средним размером частиц 60-200 нм, насыпной плотностью 0,6-0,8 г/см³, пикнометрической плотностью 2,2±0,1 г/см³, показателем термобароустойчивости к графитизации при 3000°С не менее 50 Кбар, рентгенографическим показателем графитизации 0,01-0,02 и удельным электрическим сопротивлением при давлении 120 МПа не более 2,5×10⁴ Ом·м. Предпочтительный средний размер частиц для их использования согласно настоящему изобретению составляет 100-120 нм.Astralen particles are characterized by an interlayer distance of 0.34-0.36 nm, an average particle size of 60-200 nm, a bulk density of 0.6-0.8 g / cm ³ , a pycnometric density of 2.2 ± 0.1 g / cm ³ , an indicator of thermobar resistance to graphitization at 3000 ° С not less than 50 Kbar, an x-ray indicator of graphitization 0.01-0.02 and a specific electrical resistance at a pressure of 120 MPa not more than 2.5 × 10 ⁴ Ohm · m. A preferred average particle size for use according to the present invention is 100-120 nm.

Согласно RU 2000124887, астрален благодаря своей высокой дисперсности и термобароустойчивости может быть использован как противоизносная добавка к антифрикционным материалам, в частности эпоксидоуглепластикам, а также в качестве добавки в пластики для повышения электропроводности и снятия статического электричества. Какое-либо упоминание о возможности медицинского использования астралена в качестве фотосенсибилизатора в данной заявке отсутствует.According to RU 2000124887, astralen due to its high dispersion and thermal resistance can be used as an antiwear additive to antifriction materials, in particular epoxy carbon plastic, as well as an additive in plastics to increase electrical conductivity and remove static electricity. There is no mention of the possibility of medical use of astralen as a photosensitizer in this application.

Однако авторы настоящего изобретения установили, что полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, такие как астрален, обладают достаточно высокой эффективностью генерирования синглетного кислорода, сравнимой с эффективностью генерирования синглетного кислорода фуллеренами, что дает возможность использовать их для фотодинамического воздействия на биологические структуры, такие как вирусы, клетки и т.п. В то же время, благодаря своей морфологии, такие частицы обладают гораздо большей устойчивостью к внешним воздействиям по сравнению с фуллеренами. Благодаря повышенной устойчивости, полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры допускают многократное их использование при более высокой интенсивности светового облучения, чем допустимо для фуллеренов.However, the authors of the present invention found that polyhedral multilayer carbon nanostructures, such as astralen, have a sufficiently high generation efficiency of singlet oxygen, comparable to the efficiency of generation of singlet oxygen by fullerenes, which makes it possible to use them for photodynamic effects on biological structures such as viruses, cells and etc. At the same time, due to its morphology, such particles are much more resistant to external influences than fullerenes. Due to the increased stability, polyhedral multilayer carbon nanostructures allow their repeated use at a higher intensity of light irradiation than is permissible for fullerenes.

Поскольку полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, подобно фуллеренам, нерастворимы в воде, они могут быть введены, например, в плазму крови или в цельную кровь в виде суспензии в воде или физиологическом растворе, легко удалены после осуществления фотодинамического воздействия и, благодаря высокой устойчивости, использованы повторно. При этом водные суспензии полиэдральных многослойных углеродных наноструктур являются весьма однородными и значительно более устойчивыми в отношении оседания частиц по сравнению с водными суспензиями фуллеренов, особенно при добавлении в такую суспензию поверхностно-активных веществ. Концентрация частиц в суспензии может находиться, например, в пределах 0,5-0,002% вес. и такая суспензия может вводиться в биообъект внутримышечно или внутривенно. Для повышения эффективности воздействия в суспензию может быть дополнительно введен молекулярный кислород или газовая смесь, содержащая молекулярный кислород.Since polyhedral multilayer carbon nanostructures, like fullerenes, are insoluble in water, they can be introduced, for example, into blood plasma or into whole blood in the form of a suspension in water or physiological saline, are easily removed after photodynamic exposure, and, due to their high stability, are reused . Moreover, aqueous suspensions of polyhedral multilayer carbon nanostructures are very homogeneous and significantly more resistant to particle settling compared to aqueous suspensions of fullerenes, especially when surfactants are added to such a suspension. The concentration of particles in the suspension may be, for example, in the range of 0.5-0.002% by weight. and such a suspension may be administered intramuscularly or intravenously into the bioobject. To increase the effectiveness of the action, molecular oxygen or a gas mixture containing molecular oxygen can be added to the suspension in addition.

Предпочтительный вариант осуществления изобретенияPreferred Embodiment

При осуществлении предложенного способа фотодинамическое воздействие на вирусы или клетки осуществляется с использованием синглетного кислорода, генерируемого из молекулярного кислорода с помощью фотосенсибилизатора, вводимого в контакт с молекулярным кислородом и указанными вирусами или клетками и облучаемого оптическим излучением, причем в качестве фотосенсибилизатора используют астрален, представляющий собой нерастворимые в воде полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, в виде суспензии в воде или физиологической жидкости.When implementing the proposed method, the photodynamic effect on viruses or cells is carried out using singlet oxygen generated from molecular oxygen using a photosensitizer, brought into contact with molecular oxygen and these viruses or cells and irradiated with optical radiation, and astralen, which is insoluble, is used as a photosensitizer in water polyhedral multilayer carbon nanostructures, in the form of a suspension in water or physiologically liquid.

В RU 2000124887 впервые описано выделение астралена как целевого продукта путем переработки части катодного осадка, а именно его наружной корки, преимущественно содержащей наночастицы астралена.RU 2000124887 describes for the first time the separation of astralen as a target product by processing a portion of the cathode deposit, namely its outer crust, mainly containing astralen nanoparticles.

Согласно RU 2000124887 астрален получают термическим распылением графитового анода в плазме дугового разряда, горящей в атмосфере инертного газа, например аргона или гелия. Продукты распыления осаждаются на охлаждаемых стенках камеры и, в основном, на поверхности катода. Полученный катодный осадок (катодный депозит) представляет собой сложный агломерат, имеющий центральную рыхлую часть и более плотную кору, в которой, кроме спекшегося графита, содержатся разнообразные наноструктуры, ранее считавшиеся бесполезными примесями. Некоторое количество таких наноструктур есть и в центральной части катодного депозита.According to RU 2000124887, astralen is obtained by thermal spraying of a graphite anode in an arc discharge plasma burning in an inert gas atmosphere, such as argon or helium. Spray products are deposited on the cooled walls of the chamber and, mainly, on the surface of the cathode. The obtained cathode deposit (cathode deposit) is a complex agglomerate having a central friable part and a denser crust, which, in addition to sintered graphite, contains various nanostructures that were previously considered useless impurities. A certain amount of such nanostructures is also in the central part of the cathode deposit.

Для получения астралена корку катодного осадка измельчают и подвергают последовательным операциям окисления в газовой фазе и окисления в жидкой фазе в расплаве гидроксидов, или галогенидов, или нитратов щелочных металлов, или их смесей с последующим выделением целевого продукта. Окисление измельченной корки в газовой фазе (на воздухе) осуществляют при температуре 500-700°С. Жидкофазное окисление проводят в расплаве неорганического соединения щелочного металла, такого как, например, натрий, калий или цезий. В качестве таких неорганических соединений могут быть использованы гидроксиды, галогениды (хлориды, бромиды), или нитраты щелочных металлов, или смеси указанных соединений. Окисление в жидкой фазе проводят при температуре 400-500°С, предпочтительно 430-500°С.To obtain astralen, the cathode cake is crushed and subjected to sequential oxidation in the gas phase and oxidation in the liquid phase in the melt of hydroxides or halides or nitrates of alkali metals, or mixtures thereof, followed by isolation of the target product. The oxidation of crushed crust in the gas phase (in air) is carried out at a temperature of 500-700 ° C. Liquid phase oxidation is carried out in the melt of an inorganic compound of an alkali metal, such as, for example, sodium, potassium or cesium. As such inorganic compounds, hydroxides, halides (chlorides, bromides), or alkali metal nitrates, or mixtures of these compounds can be used. The oxidation in the liquid phase is carried out at a temperature of 400-500 ° C, preferably 430-500 ° C.

Перед операциями окисления обрабатываемая масса может быть смешана с окислителями, такими как нитраты или хлориды щелочных металлов или аммония. Окислитель добавляют в количестве 3-10% от массы обрабатываемого материала. Окислитель может быть смешан с обрабатываемым материалом в виде тонкодисперсного порошка или в виде насыщенного водного раствора. В последнем случае углеродный материал, смешанный с окислителем, должен быть высушен перед операцией жидкофазного окисления.Before the oxidation operations, the treated mass can be mixed with oxidizing agents, such as nitrates or chlorides of alkali metals or ammonium. The oxidizing agent is added in an amount of 3-10% by weight of the processed material. The oxidizing agent can be mixed with the processed material in the form of a fine powder or in the form of a saturated aqueous solution. In the latter case, the carbon material mixed with the oxidizing agent must be dried before the liquid phase oxidation operation.

Например, согласно примеру изготовления астралена, описанному в RU 2000124887, катодный осадок может быть получен электродуговой эрозией анодного графитового стержня сечением 100 мм² с графитовым катодом того же сечения при плотности тока 200 А/см² и падении напряжения на дуге 24 В в гелиевой атмосфере (давление Не 70 Top). Осадок представляет собой трубчатую бахромчатую структуру длиной около 120 мм и диаметром около 35 мм неоднородной плотности с рыхлой сердцевиной и плотной оболочкой (коркой) с внутренним диаметром 9-10 мм и толщиной около 2 мм. Корку отделяют и измельчают до порошка со средней дисперсностью 200-800 нм. Порошок смешивают с 5% масс. диспергированного нитрата калия и помещают во вращающуюся трубчатую печь, в которой проводят газофазное окисление при температуре 550-600°С. После газофазного окисления порошок разделяют электрофлотацией, отбирая всплывающую фракцию с дисперсностью 100-300 нм. Отобранную фракцию высушивают, смешивают с 5% масс. сухого мелкодисперсного нитрата калия и помещают в расплав гидроксида калия, где подвергают жидкофазному окислению при температуре около 500°С. Расплав охлаждают, растворяют в воде, мелкодисперсный продукт отделяют электрофлотацией, отбирая всплывающую фракцию с дисперсностью 100-300 нм. Отобранную фракцию высушивают, смешивают с 5% масс. сухого мелкодисперсного нитрата калия и помещают в расплав гидроксида калия, где подвергают жидкофазному окислению при температуре около 500°С. Расплав охлаждают, растворяют в воде, мелкодисперсный продукт отделяют электрофлотацией, нейтрализуют кислотой, тщательно промывают на фильтре дистиллированной водой и переводят в дисперсию в органическом растворителе, например диметилформамиде. В других примерах изготовления астралена жидкофазное окисление проводят в расплаве смеси нитрата цезия и хлорида натрия в соотношении 1:3, или в расплаве хлорида лития, или в расплаве хлорида калия и гидроксида натрия в соотношении 1:4.For example, according to the astralen manufacturing example described in RU 2000124887, a cathode deposit can be obtained by electric arc erosion of an anode graphite rod with a cross section of 100 mm ² with a graphite cathode of the same cross section at a current density of 200 A / cm ² and a voltage drop across the arc of 24 V in a helium atmosphere (Pressure Not 70 Top). The precipitate is a tubular fringed structure with a length of about 120 mm and a diameter of about 35 mm of inhomogeneous density with a loose core and a dense shell (crust) with an inner diameter of 9-10 mm and a thickness of about 2 mm. The crust is separated and crushed to a powder with an average fineness of 200-800 nm. The powder is mixed with 5% of the mass. dispersed potassium nitrate and placed in a rotary tube furnace, in which gas-phase oxidation is carried out at a temperature of 550-600 ° C. After gas-phase oxidation, the powder is separated by electroflotation, selecting a pop-up fraction with a dispersion of 100-300 nm. The selected fraction is dried, mixed with 5% of the mass. dry finely divided potassium nitrate and placed in a molten potassium hydroxide, where it is subjected to liquid phase oxidation at a temperature of about 500 ° C. The melt is cooled, dissolved in water, the finely divided product is separated by electroflotation, selecting a pop-up fraction with a fineness of 100-300 nm. The selected fraction is dried, mixed with 5% of the mass. dry finely divided potassium nitrate and placed in a molten potassium hydroxide, where it is subjected to liquid phase oxidation at a temperature of about 500 ° C. The melt is cooled, dissolved in water, the finely divided product is separated by electroflotation, neutralized with acid, thoroughly washed on the filter with distilled water and transferred to a dispersion in an organic solvent, for example dimethylformamide. In other examples of the manufacture of astralen, liquid phase oxidation is carried out in a melt of a mixture of cesium nitrate and sodium chloride in a ratio of 1: 3, or in a melt of lithium chloride, or in a melt of potassium chloride and sodium hydroxide in a ratio of 1: 4.

Для определения физико-химических параметров полученный продукт отделяют от растворителя и исследуют по следующим параметрам.To determine the physico-chemical parameters, the resulting product is separated from the solvent and examined according to the following parameters.

Определяют плотность полученного материала: насыпная плотность астралена равна 0,6-0,8 г/см³, пикнометрическая плотность равна 2,2±0,1 г/см³.The density of the obtained material is determined: the bulk density of astralen is 0.6-0.8 g / cm ³ , the pycnometric density is 2.2 ± 0.1 g / cm ³ .

Рентгенографически определяют межслоевое расстояние в многослойных частицах, которое равно 0,34-0,36 нм.Radiographically determine the interlayer distance in the multilayer particles, which is equal to 0.34-0.36 nm.

Рентгенографически определяют количество аморфного графита, оставшегося в продукте (показатель графитизации), которое составляет 0,01-0,02.Radiographically determine the amount of amorphous graphite remaining in the product (graphitization index), which is 0.01-0.02.

Определяют сорбционные свойства продукта по отношению к четыреххлористому углероду; указанный показатель, равный 50 мг/г, свидетельствует о практическом отсутствии аморфного графита в продукте.The sorption properties of the product with respect to carbon tetrachloride are determined; this indicator, equal to 50 mg / g, indicates the practical absence of amorphous graphite in the product.

Под давлением из продукта формируют таблетку, на которой под давлением 120 МПа измеряют удельное сопротивление, которое не превышает 2,5×10^-4 Ом·м (в то время как удельное сопротивление графита составляет 0,5×10^-2Ом·м).Under pressure, a tablet is formed from the product, on which a resistivity is measured under a pressure of 120 MPa, which does not exceed 2.5 × 10 ⁻⁴ Ω · m (while the specific resistance of graphite is 0.5 × 10 ⁻² Ω · m) .

Показатель термобароустойчивости определяют на установке для синтеза технических алмазов; при 3000°С материал выдерживает давление 50 Кбар (50000 атм) без изменения структурных характеристик.The thermal resistance index is determined on the installation for the synthesis of industrial diamonds; at 3000 ° С the material withstands pressure of 50 kbar (50,000 atm) without changing the structural characteristics.

Наконец, с помощью просвечивающего электронного микроскопа определяют форму полученных частиц и их размер. В RU 2000124887 приведены фотографии типичных частиц астралена. Характерные полиэдральные многослойные частицы астралена длиной около 150 мм имеют внутренний щелевидный капилляр. Другие полиэдральные частицы астралена имеют разветвленную форму без внутреннего капилляра.Finally, using a transmission electron microscope to determine the shape of the resulting particles and their size. RU 2000124887 provides photographs of typical astralen particles. The characteristic polyhedral multilayer particles of astralen with a length of about 150 mm have an internal slit-shaped capillary. Other polyhedral particles of astralen have a branched shape without an internal capillary.

Предпочтительный для осуществления настоящего изобретения размер (длина) частиц астралена находится в пределах 100-120 нм.Preferred for the implementation of the present invention, the size (length) of astralen particles is in the range of 100-120 nm.

Авторы настоящего изобретения установили, что частицы астралена при воздействии света обладают явлением обратимой насыщенной адсорбции, условием проявления которого служит наличие возбужденных триплетных состояний π-сопряженной электронной оболочки на торцевых поверхностях частиц астралена. В частности, экспериментально установлено, что при облучении астралена наблюдается интенсивная фотолюминесценция синглетного кислорода, образующегося при оптическом возбуждении частиц астралена. Достаточно высокая эффективность генерирования синглетного кислорода (порядка 60% по сравнению с эффективностью фуллерена C₆₀) позволяет использовать астрален в качестве фотосенсибилизатора при осуществлении фотодинамического воздействия на вирусы и раковые клетки.The authors of the present invention found that astralen particles when exposed to light have a reversible saturated adsorption phenomenon, the condition for the manifestation of which is the presence of excited triplet states of the π-conjugated electron shell on the end surfaces of astralen particles. In particular, it was experimentally established that during the irradiation of astralen intense photoluminescence of singlet oxygen is observed, which is formed upon the optical excitation of astralen particles. A sufficiently high efficiency of generation of singlet oxygen (about 60% compared with the efficiency of fullerene C ₆₀ ) allows the use of astralen as a photosensitizer in the implementation of photodynamic effects on viruses and cancer cells.

Фотодинамическое воздействие с использованием астралена может осуществляться аналогично известным способам такого воздействия, как in vivo, так и in vitro.Photodynamic exposure using astralen can be carried out similarly to known methods of such exposure, both in vivo and in vitro.

Поскольку астрален абсолютно не растворим в воде, он используется в виде суспензии в воде или физиологических жидкостях. Предпочтительный способ получения такой суспензии заключается в обработке частиц астралена в воде или физиологических жидкостях ультразвуком с добавлением или без добавления поверхностно-активных веществ. Суспензии астралена достаточно однородны и устойчивы в течение длительного времени в отношении оседания частиц. Концентрация частиц суспензии астралена может варьироваться в широких пределах, например от 0,5 вес.% до 0,002 вес.%, что позволяет контролировать дозировку лечебной композиции. Суспензию, в которую может дополнительно вводиться молекулярный кислород, добавляют к физиологической жидкости, такой как плазма крови или цельная кровь, для осуществления фотодинамического воздействия на содержащиеся в ней вирусы, такие как вирусы гепатита или вирусы иммунодефицита человека.Since astralen is absolutely insoluble in water, it is used as a suspension in water or physiological fluids. A preferred method for preparing such a suspension is to sonicate astralen particles in water or body fluids with or without surfactant. Suspensions of astralen are quite homogeneous and stable for a long time in relation to sedimentation of particles. The concentration of particles of a suspension of astralen can vary within wide limits, for example, from 0.5 wt.% To 0.002 wt.%, Which allows you to control the dosage of the treatment composition. A suspension, in which molecular oxygen can be added, is added to a physiological fluid, such as blood plasma or whole blood, to effect photodynamic effects on the viruses contained therein, such as hepatitis viruses or human immunodeficiency viruses.

В качестве оптического излучения для активации астралена при осуществлении фотодинамического воздействия может быть использовано широкополосное ламповое излучение или лазерное излучение, например, с длиной волны порядка 0,5 мкм. Излучение может быть как непрерывным, так и импульсным.As optical radiation for the activation of astralen in the implementation of photodynamic effects can be used broadband tube radiation or laser radiation, for example, with a wavelength of about 0.5 microns. Radiation can be either continuous or pulsed.

Морфология наночастиц астралена обеспечивает их высокую термическую и лучевую прочность. Это позволяет многократно использовать полученную композицию для фотодинамической обработки.The morphology of astralen nanoparticles provides their high thermal and radiation strength. This allows you to reuse the resulting composition for photodynamic processing.

Суспензия астралена может быть использована как для очистки плазмы крови и других биологических жидкостей от вирусов, так и для разрушения онкологических опухолей. Лечебная композиция может быть введена в биообъект внутримышечно или внутривенно.Astralen suspension can be used both for purification of blood plasma and other biological fluids from viruses, and for the destruction of cancer tumors. The treatment composition may be administered intramuscularly or intravenously into the bioobject.

Заявляемое изобретение далее поясняется примерами, но не ограничено ими.The invention is further illustrated by examples, but not limited to.

Пример 1.Example 1

В качестве фотосенсибилизатора использовали полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры - астрален в виде суспензии. Для приготовления суспензии астрален предварительно высушивали в вакууме при 100°С в течение 6 часов в тонком слое. Затем 1 г астралена помещали в коническую колбу, в которую наливали 100 мл физиологического раствора. Колбу помещали в ультразвуковую ванну на 5 часов.Polyhedral multilayer carbon nanostructures — astralen in the form of a suspension — were used as a photosensitizer. To prepare a suspension, astralen was previously dried in vacuum at 100 ° C for 6 hours in a thin layer. Then 1 g of astralen was placed in a conical flask, into which 100 ml of physiological saline was poured. The flask was placed in an ultrasonic bath for 5 hours.

После процесса обработки ультразвуком содержимое колбы переливали в цилиндр и выдерживали в нем в течение 2 часов для осаждения крупных частиц. После отделения осадка получившуюся суспензию использовали для дальнейших экспериментов.After the ultrasonic treatment process, the contents of the flask were poured into a cylinder and kept there for 2 hours to precipitate large particles. After separation of the precipitate, the resulting suspension was used for further experiments.

Эксперименты по фотодинамическому воздействию астраленов на вирусы проводили in vitro. В качестве вирусной культуры использовали вирус гриппа A/PR/8/34 (H1N1), культивированный в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов. Затем аллантоисная жидкость, содержащая культуру вируса гриппа, помещалась в лунки 24 луночного планшета I для клеточных культур (Sarstedt, Германия). В лунки добавляли суспензию астралена, полученную, как описано выше, при различной концентрации. Готовили контрольный планшет II, лунки которого содержали аналогичные рабочему планшету составы. Контрольный планшет II помещали в темноту.Experiments on the photodynamic effects of astralenes on viruses were carried out in vitro. Influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1) cultured in the allantoic cavity of 10-12-day-old chicken embryos was used as a viral culture. Then, the allantoic fluid containing the influenza virus culture was placed in the wells of 24 wells of cell culture plate I (Sarstedt, Germany). A suspension of astralen, prepared as described above at various concentrations, was added to the wells. A control plate II was prepared, the wells of which contained compositions similar to the working plate. Control plate II was placed in the dark.

Планшет I освещали 500 W галогеновой лампой, сплошной спектр испускания которой близок к солнечному. Спектр действующего света (выбор светофильтров) и время облучения выбирались исходя из спектра поглощения фотосенсибилизатора и получения необходимой световой дозы. Температура планшета поддерживалась в пределах 20-24°С.Tablet I was illuminated with a 500 W halogen lamp whose continuous emission spectrum was close to the sun. The spectrum of the active light (the choice of light filters) and the irradiation time were selected based on the absorption spectrum of the photosensitizer and the required light dose. The temperature of the tablet was maintained within 20-24 ° C.

Разрушительное воздействие описанной процедуры на вирионы гриппа контролировалось с помощью электронной микроскопии (электронный микроскоп JEM - 100S фирмы JEOL, Япония). Изменение морфологии вирусных частиц проявлялось в появлении дефектов вирусной оболочки и разрушения поверхностных гликопротеидов. Это приводило к повышению в вирусной популяции дефектных вирионов, не способных к полноценной репликации. На электронно-микроскопических снимках оценивали соотношение вирусных частиц с интактной и нарушенной оболочкой.The destructive effect of the described procedure on influenza virions was monitored by electron microscopy (JEM-100S electron microscope from JEOL, Japan). A change in the morphology of viral particles was manifested in the appearance of defects in the viral membrane and the destruction of surface glycoproteins. This led to an increase in the viral population of defective virions, not capable of full replication. On electron microscopic images, the ratio of viral particles with intact and damaged shell was evaluated.

В контрольном планшете II никакого изменения морфологии вирусных частиц не наблюдалось. В рабочем планшете I наблюдаемое изменение морфологии вирионов находилось в соответствии с мощностью и временем облучения (от 10 до 70% разрушенных вирионов).In control plate II, no change in the morphology of viral particles was observed. In working plate I, the observed change in the morphology of the virions was in accordance with the power and time of irradiation (from 10 to 70% of the destroyed virions).

Пример 2.Example 2

Воздействие осуществляли аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в суспензию астралена в физиологическом растворе готовили при добавлении водорастворимого поверхностно-активного вещества.The exposure was carried out analogously to example 1, with the only difference being that a suspension of astralen in physiological saline was prepared by adding a water-soluble surfactant.

Пример 3.Example 3

Воздействие осуществляли аналогично примерам 1 и 2, с той лишь разницей, что вместо астралена использовали полиэдральные многослойные углеродные нанотрубки.The exposure was carried out similarly to examples 1 and 2, with the only difference being that instead of astralen, polyhedral multilayer carbon nanotubes were used.

Claims (10)

1. Способ фотодинамического воздействия на вирусы или клетки с использованием синглетного кислорода, генерируемого из молекулярного кислорода с помощью углеродного фотосенсибилизатора, вводимого в контакт с молекулярным кислородом и указанными вирусами или клетками в виде суспензии в воде или физиологической жидкости и облучаемого оптическим излучением, отличающийся тем, что в качестве указанного фотосенсибилизатора используют полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры, характеризующиеся межслойным расстоянием 0,34-0,36 нм.1. The method of photodynamic exposure to viruses or cells using singlet oxygen generated from molecular oxygen using a carbon photosensitizer, introduced into contact with molecular oxygen and these viruses or cells in the form of a suspension in water or physiological fluid and irradiated with optical radiation, characterized in that polyhedral multilayer carbon nanostructures characterized by an interlayer distance of 0.34-0.36 nm are used as said photosensitizer. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры характеризуются средним размером частиц 60-200 нм и насыпной плотностью 0,6-0,8 г/см².2. The method according to claim 1, characterized in that said polyhedral multilayer carbon nanostructures are characterized by an average particle size of 60-200 nm and a bulk density of 0.6-0.8 g / cm ² . 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные наноструктуры представляют собой астрален.3. The method according to claim 2, characterized in that said nanostructures are astralen. 4. Способ любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанные полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры получены путем термического распыления графитового анода в плазме дугового разряда, горящей в атмосфере инертного газа, осаждения продуктов распыления на катоде и переработки катодного осадка, при которой корку катодного осадка измельчают и подвергают последовательным операциям окисления в газовой фазе и окисления в жидкой фазе в расплаве вещества, выбранного из группы, включающей гидроксиды, галогениды, нитраты щелочных металлов или их смеси, с последующим выделением указанных полиэдральных многослойных углеродных наноструктур.4. A method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that said polyhedral multilayer carbon nanostructures are obtained by thermal sputtering of a graphite anode in an arc discharge plasma burning in an inert gas atmosphere, deposition of sputtering products on the cathode, and processing of the cathode deposit, in which the cathode deposit is ground and subjected to sequential oxidation in the gas phase and oxidation in the liquid phase in the melt of a substance selected from the group consisting of hydroxides, halides, alkali nitrates lls or mixtures thereof, followed by the isolation of said polyhedral multilayer carbon nanostructures. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанные полиэдральные многослойные углеродные наноструктуры характеризуются размером частиц в пределах 100-120 нм.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that said polyhedral multilayer carbon nanostructures are characterized by a particle size in the range of 100-120 nm. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанная суспензия содержит поверхностно-активные вещества.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that said suspension contains surfactants. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что концентрация частиц суспензии находится в пределах 0,5-0,002 вес.%.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the concentration of particles of the suspension is in the range of 0.5-0.002 wt.%. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что в указанную суспензию дополнительно вводят молекулярный кислород или газовую смесь, содержащую молекулярный кислород.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that molecular oxygen or a gas mixture containing molecular oxygen is additionally introduced into said suspension. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что введение указанных наноструктур в контакт с вирусами или клетками осуществляют путем добавления указанной суспензии к физиологической жидкости, такой, как плазма крови или цельная кровь, содержащей указанные вирусы или клетки.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the introduction of these nanostructures into contact with viruses or cells is carried out by adding the specified suspension to a physiological fluid, such as blood plasma or whole blood containing these viruses or cells. 10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что введение указанных наноструктур в контакт с вирусами или клетками осуществляют путем ввода указанной суспензии внутримышечно или внутривенно в биообъект, содержащий указанные вирусы или клетки.10. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the introduction of these nanostructures in contact with viruses or cells is carried out by introducing the specified suspension intramuscularly or intravenously into a bioobject containing these viruses or cells.