RU2266002C2 - Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, способ тестирования вещества на применимость для лечения болезни альцгеймера (варианты), плазмида (варианты), способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки - Google Patents
Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, способ тестирования вещества на применимость для лечения болезни альцгеймера (варианты), плазмида (варианты), способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266002C2 RU2266002C2 RU2000120677/13A RU2000120677A RU2266002C2 RU 2266002 C2 RU2266002 C2 RU 2266002C2 RU 2000120677/13 A RU2000120677/13 A RU 2000120677/13A RU 2000120677 A RU2000120677 A RU 2000120677A RU 2266002 C2 RU2266002 C2 RU 2266002C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- presenilin
- amino acid
- gene
- animal
- mutant
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 114
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 claims description 152
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 116
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 claims description 103
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 78
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 78
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 69
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 56
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 54
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 34
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 claims description 23
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 claims description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 11
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006399 behavior Effects 0.000 claims description 4
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 4
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 4
- 101100433464 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) BA71V-013 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 claims description 3
- 102200001906 rs104894322 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200136864 rs397516183 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058102 rs63749824 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058106 rs63749967 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058176 rs63750004 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058165 rs63750306 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058168 rs63750306 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058149 rs63750322 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058147 rs63750353 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058144 rs63750522 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058131 rs63750601 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058143 rs63750800 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058150 rs63751106 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058156 rs63751272 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 2
- 102200061530 rs63749835 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061617 rs63749836 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061486 rs63749925 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061599 rs63750053 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200058123 rs63750450 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200058171 rs63750590 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061473 rs63750646 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061611 rs63750799 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061538 rs63750900 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061493 rs63751223 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061615 rs63751309 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061470 rs63751416 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims 1
- -1 isoleucine amino acid Chemical class 0.000 claims 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 102200017280 rs267606661 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061590 rs63749885 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061540 rs63750301 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061534 rs63750526 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061543 rs63750543 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061532 rs63751163 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061544 rs63751229 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061526 rs63751420 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061469 rs661 Human genes 0.000 claims 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 67
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 57
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 46
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 102100022036 Presenilin-2 Human genes 0.000 description 22
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 17
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 16
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 15
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 15
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 15
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 15
- 108091007270 mouse presenilin 1 Proteins 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 101150089079 PS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 3
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 3
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 101100074828 Caenorhabditis elegans lin-12 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100478118 Caenorhabditis elegans spe-4 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102400000269 Amyloid protein A Human genes 0.000 description 1
- 101710144835 Amyloid protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101100465890 Caenorhabditis elegans sel-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 102000055060 human PSEN1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001682 neurofibril Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102220288729 rs1553826739 Human genes 0.000 description 1
- 102200061580 rs17125721 Human genes 0.000 description 1
- 102200061553 rs63750231 Human genes 0.000 description 1
- 102200061555 rs63750231 Human genes 0.000 description 1
- 102200061547 rs63751139 Human genes 0.000 description 1
- 102200061551 rs63751235 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 101150112575 sel-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области генетической инженерии. Предложен способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном пресенилина-1. Способ предусматривает перенос мутантного гена путем гомологичной рекомбинации в эмбрион животного. Полученное животное характеризуется способностью экспрессировать мутантный белок пресенилина-1 и индукцией продукции β-амилоидного белка, что приводит к развитию прогрессирующего нервного заболевания в гиппокампе или периферическом отделе коры головного мозга. Предложено также несколько плазмид, несущих мутированный ген. Раскрыт также способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки из полученных мутированных животных. Кроме того, предложены также несколько способов тестирования веществ на применимость для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера. Способы предусматривают введение тестируемого вещества мутированному животному и оценку полученных результатов. Полученные мутированные животные могут быть использованы как модельные животные при исследовании болезни Альцгеймера. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил.
Description
Изобретение касается трансгенных животных. Более конкретно, настоящее изобретение касается животного, трансгенного по пресенилину, содержащего внесенный мутантный ген пресенилина, обусловливающий болезнь Альцгеймера у человека.
Предпосылки изобретения
Симптомом болезни Альцгеймера является прогрессирующее слабоумие. Ее патогистология характеризуется возникновением огромного количества сенильных бляшек в головном мозге и нарастающей дегенерацией нейрофибрилл в нейронах. Данное заболевание является нейродегенеративным, при котором нейроны постепенно гибнут. Как правило, болезнь Альцгеймера развивается в пожилом возрасте, а ее встречаемость растет со старением. В настоящее время надежное лечение болезни Альцгеймера невозможно. Следовательно, с точки зрения подготовки к резкому возрастанию пожилого населения в будущем желательной является как можно скорейшая разработка способов терапевтического и профилактического лечения болезни Альцгеймера и разработка эффективного лекарственного средства, предназначенных для профилактического и терапевтического лечения данного заболевания.
Сенильная бляшка является отложением вещества вне нейронов, состоящим из различных компонентов, а их основным компонентом является пептид, состоящий из 39-42 аминокислотных остатков, называемый β-амилоидным белком (Аβ). Амилоидный белок-предшественник (АРР) расщепляется с участием протеаз, которые предположительно называют β-секретазой и γ-секретазой, в результате чего образуется зрелый β-амилоидный белок. В сенильной бляшке β-амилоид откладывается в виде регидного образования, обладающего β-складчатой структурой. Такая сенильная бляшка вначале образуется в виде пятноподобного отложения, называемого диффузной сенильной бляшкой. На этом этапе нейродегенеративные процессы еще не происходят. Считается, что по мере того, как диффузная сенильная бляшка превращается в более жесткое отложение, происходит и дегенерация или гибель нейронов, в результате чего проявляются такие симптомы болезни Альцгеймера, как деменция. Существуют Аβ40, состоящий из 40 аминокислотных остатков, и Аβ42, состоящий из 42 аминокислотных остатков, такой как амилоид β. Большая часть амилоида-β, вырабатываемого клетками, представлена изоформой Аβ40, и при этом присутствует лишь небольшое количество Аβ42. Однако Аβ42 характеризуется свойствами более интенсивной агрегируемости, и, таким образом, Аβ42 играет более выраженную роль в образовании сенильной бляшки по сравнению с Аβ40 (Tamaoka, Naika, Intern. Med., vol. 77, P843, 1996).
При болезни Альцгеймера имеет место семейное развитие по аутосомно-доминантному типу наследования. Ген, который был в 1991 году первым идентифицирован в качестве гена, обусловливающего семейную манифестацию болезни Альцгеймера, - это мутантный ген АРР: этот ген локализован в 21 хромосоме, а в аминокислотной последовательности мутация обусловливала замену валина на изолейцин в 717-м положении (A.Goate et al., 1991, Nature, vol. 349, p.704).
В качестве причины, как причины болезни Альцгеймера, были идентифицированы и другие мутанты АРР такие как обусловливающие замену указанного аминокислотного остатка в положении 717 на фенилаланин (J.Murrell et al., 1991, Science, vol. 254, р.97); обусловливающие замену аминокислотного остатка в том же положении на глицин (Chartier, Harlin et al., 1991, Nature, vol. 353, p.844); обусловливающие замену двух аминокислотных остатков - лизин - метионин на аспарагин-лейцин (M.Mullan et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p.345); и обусловливающие замену аланина на глицин в 692-м положении (L.Hendrisk et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p.218), и подобные.
В 1993 году сообщалось что аполипопротеин-Е (аро Е), является этиологическим фактором или фактором риска развития семейной болезни Альцгеймера. У пациентов с болезнью Альцгеймера аллель ароЕ4, в котором аминокислотный остаток в положении 112 представляет собой аргинин, и аминокислотный остаток в положении 158 представляет собой аргинин, идентифицируется с существенно большей частотой по сравнению со здоровыми лицами среди других аллелей ароЕ, гены которых локализованы в 19 хромосоме (E.H.Corder et al., 1993, Science, vol. 261, p.921).
После этого мутация в гене «пресенилина-1» (PS1, исходно обозначавшегося как S182), картированном в 14 хромосоме (R.Sherrington et al., 1995, vol. 375, р. 754), и мутация в гене «пресенилина-2» (PS2, исходно обозначавшегося как Е5-1 или STM-2), картированном в 1 хромосоме (B.Sherrington et al.. Nature, 1995, vol. 375, р. 754), были в 1995 году идентифицированы как новые гены, вызывающие болезнь Альцгеймера (в данной заявке каждый из этих генов определен как «ген пресенилина-1» и «ген пресенилина-2», соответственно, а каждый из продуктов этих генов обозначается как «белок пресенилин-1» и «белок пресенилин-2», или «PS1» и «PS2», соответственно).
Белок пресенилин-1 и белок пресенилин-2, состоящие, соответственно, из 467 и 448 аминокислотных остатков, включают семи- или восьмискладчатую трансмембранную структуру: следовательно, они предположительно являются мембранными белками. Гомология этих двух белков на уровне аминокислотных последовательностей существенна - 67% общей и 84% только по трансмембранным доменам. Что касается функций пресенилин-1, существует предположение, что функции данного белка схожи с таковыми белка sel-12 нематоды или с белка SPE-4, на что указывает высокая гомология данных белков. Белок SPE-4 участвует в процессах сперматогенеза у нематоды, и предполагается, что он вовлечен в транспортировку и запасание белков.
Соответственно, считается, что пресенилин-1, по-видимому, участвует в процессинге мембранных белков, таких как АРР, аксоплазматическом транспорте и слиянии мембранных пузырьков с мембранами. Для гена sel-12 было установлено, что он устраняет эмбриональную аномалию, вызванную мутацией lin-12, которая подавляет развитие нематоды. Считается, что lin-12 вовлечен в межклеточную передачу сигнала, следовательно, также существует предположение, что белок пресенилин-1 участвует в определенной стадии внутриклеточной передачи сигналов.
В первом же описании белка пресенилин-1 было указано на то, что мутации, обусловливающие проявление семейной болезни Альцгеймера, являются заменами аминокислотных остатков по пяти положениям. После этого сообщения гены, мутантные по различным их участкам, были идентифицированы во многих семьях с диагнозом семейной болезни Альцгеймера, включая OS-2 (замена изолейцина на треонин в 213-м положении) и OS-3 (замена валина на фенилаланин в 96-м положении), причем обе эти мутации описаны авторами настоящего изобретения (K.Kamino et al., 1996, Neurosci. Lett., vol. 208, р.195), а к настоящему времени известно более 40 различных вариантов аминокислотных замен более чем по 30 положениям (Hardy, 1997, TINS, vol. 20, р.154).
В настоящее время 70-80%. случаев семейной болезни Альцгеймера, как считается, обусловливается мутациями в белке пресенилин-1. Сообщалось о мутациях мутации по двум сайтам белка пресенилин-2. Как объяснялось выше, генетический анализ подтвердил, что мутации пресенилин-1 и пресенилин-2 самым непосредственным образом вовлечены в этиологию семейной болезни Альцгеймера.
Механизмы, по которым мутантные белки пресенилин-1 и пресенилин-2 вызывают начало болезни Альцгеймера, в настоящее время интенсивно изучаются. Было сообщено, что белок AJ340 находится на том же уровне, что и уровни белков пресенилин-1 и пресенилин-2, в то время как количество Аβ42 в существенной степени увеличивается по сравнению с нормальными уровнями пресенилин-1 и пресенилин-2 в сыворотке или в культуральной среде культуры фибробластов кожи, взятых у пациента с болезнью Альцгеймера, при наличии указывавшихся выше мутаций (D.Scheuner et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p.864), в культуральной среде клеточной линии, трансформированной мутантными вариантами белков пресенилин-1 и пресенилин-2 (W.Xia et al., 1997, J. Biol. Chem., vol. 272, p.7977; D.R.Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17, p.1005; M. Citron et al., 1997, Nature Med., vol. 3, p.67) и в ткани головного мозга у пациента с диагнозом семейной болезни Альцгеймера, несущего мутантный белок пресенилин-1 (C.A.Lemere et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p.1146).
В этих сообщениях было показано, что мутации белков пресенилин-1 и пресенилин-2, которые обусловливают семейную болезнь Альцгеймера, по-видимому, обеспечивают манифестацию болезни Альцгеймера за счет обусловливания повышения количества белка Аβ42, что, как считается, играет существенную роль в образовании сенильных бляшек. Трансгенная мышь, несущая ген, который кодирует мутантный белок пресенилин-1, была ранее создана (К.Duff et al., 1996, Nature, vol. 383, р.710; D.R.Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17, p.1005; M.Citron et al., 1997, Nature Med., vol, 3, p.67). Было сообщено, что содержание Аβ42 в головном мозге такой трансгенной мыши селективно возрастало. Эти данные несомненно подтвердили вероятность того, что мутации в белках пресенилин-1 и пресенилин-2 обусловливают проявление семейной болезни Альцгеймера вследствие обусловливания увеличения количества Aβ42, который предположительно играет важную роль в образовании сенильных бляшек, тем самым инициируя болезнь Альцгеймера. Однако не было опубликовано данных о гистологических параметрах головного мозга упоминавшихся выше трансгенных мышей: считается, что причиной этого является отсутствие существенных гистологических изменений в головном мозге таких трансгенных мышей.
В целом, трансгенные животные применимы в качестве моделей анализа функций гена-мишени in vivo. Однако технически весьма затруднительно проконтролировать экспрессию перенесенного гена на количественном уровне, оценить тканеспецифичность и специфичность в ходе индивидуального развития. Также существует проблема в том, что два генных продукта присутствуют в смеси в организме трансгенных животных, потому что ген, наследуемый этими животными, сохраняет нормальную экспрессию, а функции переносимого гена не могут быть достоверно проанализированы. Более того, когда переносимый ген подвергается избыточному экспрессированию, то функции, в норме не наследуемые in vivo, могут возникать у трансгенного животного, в результате чего образовавшийся дефект может привести к недостоверности в анализе животных, несущих мутантный ген.
Помимо трансгенных животных нокаут-животные также могут быть использованы в качестве модели для изучения функций гена-мишени. У нокаут-животных ген-мишень, в норме наследуемый данным животным, искусственным путем выводится из строя таким образом, чтобы стать полностью нефункциональным (т.е. «выключается»). Подробный анализ нокаут-животных может помочь установить функции гена-мишени in vivo. Однако конкретные изменения у нокаут-животных, являющихся гомозиготами, иногда не проявляются, поскольку функции других генных продуктов у нокаут-животных могут заменять функции «выключенных» разрушенных генных продуктов. Более того, также существует проблема в том, что гомозиготное животное может иногда оказываться летальным из-за того, что генный продукт существен с точки зрения индивидуального развития и роста данного животного, в результате чего анализ функций гена у животного являющегося жизнеспособной гетерозиготой, практически невозможен.
Описание настоящего изобретения
Объектом настоящего изобретения является получение (с точки зрения создания животной патогенетической модели болезни Альцгеймера) животного, являющегося патогенетической моделью, патологические свойства которой близки к таковым у пациента с болезнью Альцгеймера, вместо трансгенного животного, для которого свойственны указанные выше недостатки. Более конкретно объектом настоящего изобретения является получение генетически мутированного животного, способного экспрессировать мутантный белок пресенилин в их головном мозге, путем переноса мутантного гена пресенилина, который, как считается, является причиной болезни Альцгеймера (мутантный пресенилиновый ген) с использованием процесса гомологичной рекомбинации. Другим объектом настоящего изобретения является представление способа получения указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, плазмиды, применимой для упомянутого выше способа получения, и способа оценки субстанции или агента, эффективного с точки зрения профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера с использованием указанного выше генетически мутированного животного.
С целью установления роли пресенилин-1 и выяснения механизма манифестации болезни Альцгеймера в ответ на мутацию гена пресенилина-1 заявители настоящего изобретения создали нокин-мышь, у которой нормально наследуемый ген пресенилина-1 заменен на указанный выше ген пресенилина-1, включающий мутацию OS-2. В результате заявителями было установлено, что мышь, несущая мутантный ген, успешно избегает дефектов, характерных для трансгенной мыши и нокаут-мыши, а также то, что животное применимо для исследований причин и патологии болезни Альцгеймера, обусловливаемой мутацией в гене пресенилина-1. Далее заявители продолжили исследования и пришли к описываемому далее изобретению.
Таким образом настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, а более предпочтительно настоящее изобретение относится к генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей белок пресенилин-1, в последовательности которого одна аминокислота заменена на другую аминокислоту.
Также настоящее изобретение относится к
отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает последовательность ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, характеризующийся аминокислотной последовательностью, в составе которой одна или большее число аминокислот по положениям, которые выбирают из группы, включающей следующие аминокислотные положения - 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 и 436, - заменены на другую(ие) аминокислоту(ы) в последовательностях пресенилин-1, предпочтительно являющегося белком пресенилин-1 мыши; и
отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает последовательность ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого имеется одна или несколько мутаций, выбираемых из группы, включающей A79V, V82L, V96F, У115Н, У115С, Е120К, E120D, N135D, M139V, М139Т, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, Н163У, H163R, G209V, I213T, А231Т, A231V, L235P, А246Е, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269H, Е280А, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, С410У, А426Р и P436S, в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, более предпочтительно являющегося белком пресенилин-1 мыши (каждая буква алфавита соответствует аминокислоте, обозначаемой однобуквенным символом, а каждый номер соответствует номеру положения аминокислоты, считая от N-конца полипептида пресенилин-1, а применяемое описание указывает на то, что аминокислота дикого типа, отмеченная слева от цифры, заменяется на аминокислоту, обозначенную справа от номера. В данной заявке мутантный белок пресенилин-1 и мутантный белок пресенилин-2 охарактеризованы одинаковым образом).
Далее настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему, мутантный ген пресенилина-1, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого изолейцин по положению 213 белка пресенилин-1 заменен на отличную от изолейцина аминокислоту, а также отличное от человека генетически мутированное животное, несущее мутантный ген пресенилина-1, включающий ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого изолейцин по 213-му положению в аминокислотной последовательности пресенилин-1 заменен на треонин.
Предпочтительные варианты указанных выше вариантов изобретения относятся к:
указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует любому нуклеотиду кроме Т, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении, указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует С, М соответствуют Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении, и
указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCXYZCACTGGAAAGGCCC-3', причем XYZ представляет триплет (кодон), кодирующий отличную от изолейцина, аминокислоту, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенелина-2, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей белок, в котором аминокислоты по положениям 141 и (или) 436 заменены иными аминокислотами в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-2. Предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к указанному выше отличному от человека генетически мутированному животному, причем мутантный ген пресенелина-2, включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-2, который включает мутацию N141I и (или) M239V в аминокислотной последовательности белка пресенилин-2.
Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген причем сверхэкспрессия β-амилоидного белка обусловливается мутантным геном пресенилина-1 и (или) мутантным геном пресенилина-2; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген которое способно экспрессировать мутантный белок пресенилин, причем экспрессия упомянутого белка индуцирует выработку β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующей нейропатии в периферических отделах коры головного мозга данного животного; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген причем животное является грызуном, предпочтительно мышью; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген, причем, указанный выше мутантный ген преселин-1 и (или) указанный выше мутантный ген преселин-2 переносят с применением гомологичной рекомбинации; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген, причем количество амилоидного белка, экспрессируемого в ткани головного мозга под влиянием указанного выше гена пресенилина-1, достаточно для того, чтобы обусловить снижение ответа в тесте на тренировку памяти по сравнению с нормальным животным с индукцией нейропатии в периферических отделах коры головного мозга и гиппокампа головного мозга данного животного; и указанному выше генетически мутированному животному, несущему ДНК, которая включает мутантный ген пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, в составе которого одна или несколько аминокислот заменены на отличающиеся аминокислоты в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, наряду с ДНК, характеризующейся нуклеотидной последовательностью, кодирующей маркерный белок.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к плазмиде, включающей ДНК характеризующуюся последовательностью мутантного гена пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-го аминокислотного положения пресенилин-1 следующая - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует A, G или С, М соответствуют Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении; и
плазмиде, включающей ДНК, характеризующуюся последовательностью мутантного гена пресенилина-1, который кодирует мутантный белок пресенилин-1, причем, аминокислота в 213-м положении заменена на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности белка пресенилин -1, а последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-го аминокислотного положения в составе пресенилин -1 такова - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCXYZCACTGGAAAGGCCC-3', причем М соответствует Т или С, XYZ представляет триплет (кодон), кодирующий отличную от изолейцина аминокислоту, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении. Кроме того, настоящее изобретение относится к геномной (хромосомной) ДНК, включающей 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, причем аминокислота в 213-м положении заменена на отличную от изолейцина аминокислоту в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-1.
Далее настоящее изобретение относиться к плазмиде, включающей ДНК, в состав которой Sau2АI-сайт внесен в нуклеотидную последовательность, включающую полную или мутировавшую часть кДНК или геномной ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, в аминокислотной последовательности которого аминокислота по 213-му положению заменена на отличную от изолейцина аминокислоту. Также изобретение относится к указанной выше плазмиде, причем замена аминокислоты по 213-му положению является заменой изолейцина на треонин, а также плазмиде, включающей ДНК, представленную следующей нуклеотидной последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3', - в которой М соответствует Т или С.
В дополнение к указанным выше вариантам настоящее, изобретение относится к гену, кодирующему мышиный мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности пресенилин-1 мыши, а также указанный выше ген, причем такой заменой является замена изолейцина на треонин. Также относится к плазмиде, включающей: (1) ген, кодирующий мышиный мутантный белок пресенилин-1 в котором изолейцин по 213-му положению заменен на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности пресенелин-1 мыши и (2) неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную последовательностями loxPs; а также указанную выше плазмиду, причем заменой является замена изолейцина на треонин (loxPs представляются открытой японской патентной публикацией N4-501501, стр.4).
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к эмбриону, несущему плазмиду, включающую ДНК, представленную нуклеотидной последовательностью 5'- TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3', в которой М соответствует Т или С; эмбрион, полученный путем гомологичной рекомбинации с использованием каждой из упоминавшихся выше плазмид; и указанный выше эмбрион, представляющий вид грызунов, предпочтительно эмбрион мыши. Также настоящее изобретение относится к первичной клеточной культуре или пересеваемой клетке, полученным путем выделения клетки от указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, и культивированию клетки по типу тканевой культуры; способу получения отличного от человека генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, причем такой способ включает этап внесения мутантного гена пресенилина-1 с помощью гомологичной рекомбинации в эмбрион животного, причем мутантный ген пресенилина-1 способен экспрессировать мутантный белок пресенилин-1, индуцируя тем самым выработку β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующей нейропатии в периферических отделах коры головного мозга; и указанный выше метод получения, причем мутантный белок пресенилин-1, который может быть экспрессирован, включает замену изолейцина в 213-м положении на отличную от изолейцина аминокислоту.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу оценки средства, применяемого для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, который включает этап обработки указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, которому вводят тест-средство с целью сравнения с генетически мутированным животным, несущим мутантный ген, которому такое тест-соединение не вводили. Типичным примером способа оценки является тест-скрининг. Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к указанному выше способу оценки, в котором для сравнения используется тест на тренировку памяти, указанному выше способу оценки, причем сравнение осуществляется в патогенетическом тесте; указанному выше способу оценки, в котором для сравнения применяется патогенетический тест, основанный на параметрах невропатологии периферических отделов коры головного мозга; указанному выше способу оценки, причем для сравнения используется невропатологический тест при сравнении с одним или несколькими такими тестами, выбираемыми из группы, которая включает подавление снижения интенсивности глиоза (разрастания астроглии) в периферических отделах коры головного мозга, подавление снижения поглощения 2-дезоксиглюкозы в периферических отделах коры головного мозга и подавление снижения доступности 2-дезоксиглюкозы в периферических отделах коры головного мозга; а также указанному выше способу оценки, в котором сравнение осуществляется по ряду параметров, выбираемых из группы, которая включает продолжительность выживания, параметры поискового и двигательного поведения.
Еще, кроме того, настоящее изобретение относится к способу оценки лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Альцгеймера, который включает этап культивирования первичной клеточной культуры или пересеваемой клетки in vitro в присутствии тестируемого соединения; способу диагностики болезни Альцгеймера или риска развития болезни Альцгеймера, который включает использование частичной нуклеотидной последовательности мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный пресенилин-1, вариант OS-2; субстанцию, применяемую для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, выбираемую с применением любого из указанных выше способов; и лекарственное средство, предназначенное для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, включающее указанную выше субстанцию в качестве активного компонента.
Также настоящее изобретение относится к генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем это животное является гибридным животным или его потомством, получаемыми в результате скрещивания указанного выше генетически мутированного животного, несущего мутантный ген с животным, несущим ген, который кодирует мутантный амилоидный белок-предшественник, характеризующимся высоким уровнем выработки β-амилоидного белка, а более предпочтительно это животное является гибридом мыши или его потомством, которое получают в результате скрещивания или которое рождается в результате указанного скрещивания. Предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к указанному выше генетически мутированному животному, причем животное несет ген, кодирующий мутантный амилоидный белок-предшественник, характеризуется высоким уровнем выработки β-амилоидного белка и является PS1-мутантной мышью.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана рестрикционная карта Pα-фрагмента геномной ДНК, включающего 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши, который был получен путем клонирования геномной клонотеки мыши.
На фиг.2 показана схема способа конструирования плазмиды ртХ-1, включающей сегмент 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши, в составе которого находится участок, в который с применением методов направленного мутагенеза была внесена мутация OS-2.
На фиг.3 показан способ конструирования направляющего вектора.
На фиг.4 показан способ конструирования направляющего вектора.
На фиг.5 показан способ конструирования направляющего вектора.
На фиг.6 показан способ конструирования направляющего вектора.
На фиг.7 показан способ конструирования направляющего вектора и структура направляющего вектора pOS-2 neoloxP.
На фиг.8 показаны результаты применения электрофореза в 1%-ном агарозном геле в отношении продукта ПЦР, полученного после скрещивания мыши №2 (самец), несущей мутантный по OS-2 ген пресенилина-1, с мышью CAG-cre, №13 в F4 (самка), отрезания кусочка ткани хвоста у полученного потомка, выделения ДНК из этого образца и проведения ПЦР в соответствии с описанным в примере 10. Как видно, у мышей, которым соответствуют 2-я и 4-я дорожки, считая справа, не проявляют экспрессии гена neo с их геномной ДНК. На этой фигуре крайняя левая дорожка соответствует маркеру молекулярной массы. [А] отмечены бэнды, характерные для дефицита neo в составе геномной ДНК. [В] отмечены бэнды, соответствующие ДНК дикого типа. И [С] показывает бэнды, соответствующие присутствию гена neo в составе хромосомной (геномной) ДНК.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретения
Мутантным геном пресенилина, используемым для получения генетически мутированного животного по настоящему изобретению, является ген, кодирующий мутантный белок пресенилин, а по использованию в данном тексте термин «мутантный ген пресенилина» обозначает как мутантный ген пресенилина-1 и мутантный ген пресенилина-2 в отдельности, так и их оба вместе, а термин «мутантный белок пресенилин» обозначает как мутантный белок пресенилин-1 и мутантный белок пресенилин-2 в отдельности, так и их оба вместе. Свойством мутантного гена пресенилина является обеспечение повышенного уровня выработки β-амилоидного белка. Генетически мутированным животным по настоящему изобретению является млекопитающее, трансформированное с использованием указанного выше мутантного гена пресенилина, для чего используется, например, гомологичная рекомбинация. Мутацией, происходящей в составе мутантного белка, предпочтительно является замена аминокислотных остатков. Число таких мутаций не ограничивается, а предпочтительно оно равно 1.
Полноразмерная последовательность пресенилина-1 млекопитающего описана, например, у Е.Levy-Lahad et al., 1995, Science, 269, pp.973-977. Полноразмерные последовательности белков пресенилин-1 человека и мыши и примеры последовательностей ДНК, которые кодируют эти белки, показаны в SEQ ID NO 1-4. Например, сайтом для мутирования пресенилина-1 мыши предпочтительно может быть сайт, выбираемый из положений №№79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269. 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 и 436.
Более предпочтительными мутациями являются одна или большее число мутаций, выбираемых из группы, которая включает мутации A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, Е120К, E120D, N135D, M139V, М139Т, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, А231Т, A231V, L235P, А246Е, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269H, Е280А, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, А426Р и P436S в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1, а более предпочтительно - аминокислотной последовательности белка пресенилин-1 мыши. Среди этих мутаций, в частности, предпочтительными являются замены 213-й аминокислоты на другую аминокислоту (в ряде разделов настоящего текста они обозначаются как «мутации типа OS-2»). Например, наиболее предпочтительной является мутация, в результате которой изолейцин в 213-м положении заменяется на какую-либо иную аминокислоту, кроме изолейцина, или мутация, в результате которой изолейцин-213 заменяется на треонин.
Полноразмерная последовательность белка пресенилин-2 млекопитающего описана, например, в Science, 1995, 269, pp.973-977. Предпочтительными сайтами мутирования являются 141-я и (или) 436-я аминокислоты, а в последовательности мыши более предпочтительными являются мутации N141I и M239V. Одна или большее число мутаций могут иметь место либо в одном из белков пресенилин (-1 или -2), или в обоих этих белках.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется наличием одной из вышеуказанных мутаций гена пресенилина-1 и (или) гена пресенилина-2 в составе его геномной ДНК. Генетически мутированное животное не ограничено ни чем иным, кроме того, что оно является млекопитающим, а вид животного при этом специально не ограничивается. Например, пригодным для использования является вид грызунов. В частности, предпочтительным видом является мышь. Генетически мутированное животное по настоящему изобретению может быть получено путем конструирования плазмиды с использованием ДНК, характеризующейся последовательностью длиной примерно 10 тысяч пар нуклеотидов, включающей мутантный пресенилиновый ген, с последующим внесением этой плазмиды в эмбриональную стволовую клетку, что тем самым обусловливает прохождение внутриклеточной гомологичной рекомбинации.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется тем, что аминокислотная мутация имеет место в основном в единственном сайте в результате внесения указанных выше мутантных генов пресенилина-1 и (или) пресенилина-2 с применением гомологичной рекомбинации. В случае так называемого «трансгенного животного» последовательность ДНК, включающая мутантный сегмент, вносится в состав геномной ДНК случайным образом, а по множеству различных сайтов оказываются внесенными десятки копий повторяющейся последовательности. Генетически мутированное животное по настоящему изобретению позволяет избежать такой проблемы: возможным является точный анализ патогенеза болезни Альцгеймера на генетическом уровне. Когда ДНК, включающая маркер или подобное, вносится в организм генетически мутированного животного по настоящему изобретению, такое животное может иметь маркерный сайт и последовательность для внесения такого маркера. Например, для внесения по сайту, распознаваемому рестриктазой Sau3AI, может быть заменен один нуклеотид, а такая замена может быть проверена путем расщепления ПЦР-продукта рестриктазой Sau3AI с последующим анализом полученных фрагментов электрофоретически и подобным образом.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется своеобразным свойством вырабатывать β-амилоидный белок в большом количестве по сравнению с животным дикого типа в результате генетической мутации. Увеличенное количество β-амилоидного белка, достигаемое у генетически мутированного животного по настоящему изобретению, ни чем специально не ограничивается: предпочтительно это количество должно быть достаточным для установления отчетливой разницы в оценках степени нарушения памяти, патологических параметров и различных невропатологии по сравнению с нормальными животными.
ДНК, плазмиды, клеточные культуры и эмбрионы млекопитающих, представляемые настоящим изобретением, характеризуются наличием мутантного гена пресенилина-1 и (или) мутантного гена пресенилина-2. Например, в объем настоящего изобретения попадают кДНК или полноразмерная геномная ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, предпочтительно мутантный по мутации OS-2 белок пресенилин-1, или последовательность ДНК, включающая один или несколько мутантных сайтов; плазмида, включающая ДНК, которая является указанной выше кДНК или полноразмерной геномной ДНК, или указанной выше ДНК, включающей один или несколько мутантных сайтов, в которую дополнительно встроен рестрикционный Sаu3АI-сайт; геномная ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующей мутантный белок пресенилин-1 с мутацией OS-2. Далее настоящее изобретение охватывает указанный выше ген или ДНК, которые дополнительно включают один или больше, а предпочтительно от 1 до 20, а более предпочтительно от 1 до нескольких нуклеотидных замен.
Примерами ДНК и плазмид по настоящему изобретению являются:
1) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении пресенилин-1 заменен на треонин, или плазмида, включающая упомянутую ДНК;
2) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислоты вокруг 213-го остатка аминокислотной последовательности мутантного белка пресенилин-1, является следующей последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3', - при том, что N соответствует любому нуклеотиду кроме Т, а М соответствуют Т или С, или плазмида, включающая упомянутую ДНК;
3) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, причем нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислоты вокруг 213-го остатка аминокислотной последовательности мутантного по OS-2 белка пресенилина-1, является следующей последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3', причем М соответствует Т или С, XYZ соответствует кодону, кодирующему аминокислоту, отличную от изолейцина, или плазмида, включающая эту ДНК;
4) любая ДНК или плазмида, включающая упомянутые ДНК, соответствующие упомянутым выше пп.(1)-(4), причем в их состав внесен рестрикционный Sаu3АI-сайт;
5) ДНК или плазмида, включающая упомянутую ДНК, причем рестрикционный Sаu3АI-сайт вносят в последовательность, включающую полноразмерную кДНК или геномную ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на треонин в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, или в состав мутантного сегмента упомянутой последовательности;
6) ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1 мыши, кодирующего мутантный по OS-2 белок пресенилин-1, и неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную loxP, или плазмида, включающая упомянутую ДНК; и
7) ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на треонин в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, и неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную loxP, или плазмида, включающая упомянутую ДНК. Однако масштаб настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.
Эмбрионы или клетки, представляемые настоящим изобретением, включают эмбрион или клетку, в которые внесена указанная плазмида, например плазмида, включающая нуклеотидную последовательность PRL-104 или PRL-105. Предпочтительными клетками по настоящему изобретению являются те клетки, которые трансформированы геном, кодирующим мутантный белок пресенилин, который характеризуется мутацией в 213-м положении аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, путем гомологичной рекомбинации с использованием указанной выше плазмиды. Типы эмбрионов и клеток ни чем не ограничены, кроме того, чтобы они были производными от млекопитающего, а предпочтительными являются те, которые производны от грызуна, предпочтительно от мыши.
Получение генетически мутированного животного
После получения ДНК, кодирующей мутантный пресенилин человека, генгетически мутированное животное по настоящему изобретению, несущее мутантный ген пресенилина, может быть получено в соответствии со способом, описанным здесь далее. Приводимый пример выстроен таким образом, что используемым млекопитающим является мышь, а используемым мутантным геном пресенилина является мутантный ген пресенилина-1 человека. Однако генетически мутированное животное по настоящему изобретению не ограничивается теми животными, которые получаются с использованием указанных компонентов. Далее, данный способ является примером способа получения генетически мутированного животного по настоящему изобретению, а сам способ по настоящему изобретению не ограничивается описываемым далее способом. Основываясь на базовом способе, описываемом далее, и на конкретных способах, описанных в примерах, путем подходящего модифицирования или изменения этих способов, если это оказывается необходимым, специалист в данной области техники легко сможет получить генетически мутированное животное по настоящему изобретению.
С целью конструирования зонда, предназначаемого для использования в методе ПЦР, фрагмент ДНК, который включает сайт для мутирования 8-го экзона гена пресенилина-1, производного от того животного, получение которого осуществляется, получают на материале геномной клонотеки мыши. Может быть использована геномная клонотека ДНК мышей любой линии, включая геномную клонотеку мыши линии 129, описываемой в примерах. Когда мышь является тем животным, в геном которого вносят мутацию, то используют 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши. Когда используют другие виды животных, то необходимо подобрать соответствующий сегмент.
После того, как полученный в описанном выше способе фрагмент ДНК помечают (32Р) методом случайного прайминга, скрининг геномной клонотеки осуществляют с использованием помеченного зонда, а затем клонируют фрагмент геномной ДНК, включающий 8-й экзон клонированного гена пресенилина-1. Далее субклонируют предназначенный для мутирования сегмент 8-го экзона клонированного гена пресенилина-1, а затем вносят мутацию.
Направляющий вектор конструируют таким образом, чтобы он включал геномную ДНК, включающую 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши, в последовательность которого была внесена мутация. В качестве селективного маркера экспрессионную кассету neo вносят в состав направляющего вектора с целью облегчения того, чтобы те клетки, геном которые не включил данный вектор, уничтожались после добавления антибиотика G418 в культуральную среду. После того, как направляющий вектор был внесен в клетки ES с применением метода электропорации или с помощью какого-либо иного метода, служащего для доставки гена в клетку, клетки ES культивируют в присутствие и отбирают образующиеся колонии. Каждую из полученных колоний разделяют на две части. Одну из половин оставляют для культивирования, пересева или замораживания. Другую половину используют для анализа клеток ES, в геном которых желаемая мутация 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши вносится с помощью гомологичной рекомбинации. Запасенную половину колонии клеток ES, несущую желаемую внесенную мутацию, отбирают и используют в процессе, описанном ниже.
У беременной самки мыши выделяют эмбрион на стадии 8 бластомеров. На этот эмбрион наносят примерно 20 указанных выше сохраненных клеток ES и затем реимплантируют в матку самки мышей с ложной беременностью. Среди родившегося потомства отбирали мышат с мозаичной окраской шерсти. Мозаичную (химерную) мышь скрещивали с мышью линии C57DL/6, а особь, несущая желаемую мутацию, может быть получена в результате отбора среди полученного потомства мышат тех особей, у которых имеется окраска дикого типа («агути»). Полученная в потомстве мышь является гетерозиготной по отношению ко внесенному гену пресенилина-1 с мутацией, в то время как аллель гена пресенилина-1 на другой хромосоме представлен диким типом и лишен мутации.
В качестве исходных материалов для конструирования зонда, необходимого для клонирования геномной ДНК, включающей последовательность 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши из состава геномной клонотеки мыши может быть использована кДНК гена пресенилина-1, который является производным от млекопитающего, отличного от мыши и человека, нуклеотидная последовательность которой известна, равно как и те фрагменты, которые, в частности, упомянуты в примерах. В качестве методов получения фрагмента ДНК, используемого в качестве зонда, может быть применен метод крупномасштабного воспроизводства плазмиды, которая включает геномную ДНК мыши, включающую сегмент, соответствующий 8-му экзону гена пресенилина-1 геномной ДНК, или кДНК гена пресенилина-1, производного от млекопитающего, отличного от мыши и человека, или подобное, нуклеотидная последовательность чего известна, равно как применены и ПЦР-амплификация, описанная в примерах. Далее, после того, как плазмиду расщепили рестриктазой, желательный фрагмент ДНК может быть получен путем отделения части, являющейся фрагментом ДНК, с применением электрофореза в агарозном геле и подобного.
В качестве метода мечения ДНК-фрагмента могут быть использованы такие методы, как те, которые основаны на ПЦР в присутствие 132P-dNTP, равно как и метод случайного прайминга, описанного в примерах. Далее, метка может быть внесена с помощью ПЦР или случайного прайминга с использованием в качестве затравки предварительно помеченного олигонуклеотида. Также для мечения может быть использована хемолюминесценция на основе комплекса авидинабиотина или щелочной фосфатазы или подобного, равно как и радиоактивные изотопы, описанные в примерах. Фрагмент РНК, помеченный с использованием РНК-полимераз нечетных фагов Т3 или Т7, также может быть использован в качестве зонда. Кроме указанных выше известны и другие методы конструирования зонда, и желательный зонд может быть получен с применением любого из этих методов.
Для внесения в ДНК желательной мутации могут быть применены методы, описанные, в частности, в примерах. Кроме того, плазмиду, производную от бактериофага, такого как фаг М13, или плазмиду, дуплицированную с использованием ung- Escherichia coli, связывают комплементарным образом с олигонуклеотидом, синтезированным с целью внесения мутации по желательному сайту (нуклеотиды того сайта, по которому собственно вносится мутация, не являются комплементарными), а полученный в результате комплекс используют в качестве затравки для получения гетеродуплексной плазмиды с применением ДНК-полимеразы, а затем ung-позитивные клетки Escherichia coli трансформируют с использованием полученной в результате плазмиды с получением плазмиды, включающей желаемую мутацию. Применяется и другой подход («кассетный метод») для получения плазмиды, несущей желаемую мутацию: он включает этапы синтеза двух олигонуклеотидов, которые характеризуются модификацией нуклеотидов таким образом, чтобы внести желаемую мутацию и способны пройти отжиг по комплементарному типу, будучи сконструированными таким образом, чтобы внести рестрикционные сайты, и лигирование олигонуклеотида на плазмиду с целью внесения мутации, для чего используется ДНК-лигаза. В ряде случаев искомый результат может быть достигнут с большей эффективностью путем внесения подходящих модификаций или изменений в описанные выше методы в зависимости от конкретной поставленной цели. Кроме того, в качестве метода внесения мутации в данной области техники известны различные доступные методы: следовательно, любой из таких методов может быть применен для достижения указанного результата.
Направляющий вектор предпочтительно может включать экспрессионную кассету селективного маркера, рассматриваемую в качестве необходимого компонента, который включает фрагмент геномной ДНК мыши, включающий мутацию, ДНК-фрагмент, кодирующий селективный маркер, промотор, обеспечивающий их транскрипцию, и терминатор. Фрагмент геномной ДНК мыши, включающий мутацию, является необходимой частью с точки зрения обеспечения гомологичной рекомбинации в клетках ES, причем также необходимы фрагменты геномной ДНК мыши, фланкирующие мутационный сайт по обеим сторонам от него. Следовательно, направляющий вектор включает фрагмент ДНК, в составе которого только мутировавшие нуклеотиды отличаются от нативной нуклеотидной последовательности генома мыши. Длина такого фрагмента предпочтительно может составлять 10 тысяч пар нуклеотидов: в принципе, допустимы и некоторые его удлинение или укорочение. Однако, если данный фрагмент оказывается слишком коротким, то частота гомологичной рекомбинации иногда может снижаться.
В качестве селективных маркеров известны позитивные селективные маркеры, такие как ген резистентности к неомицину и ген резистентности к гигромицину, и негативные селективные маркеры, такие как ген тимидинкиназы простого герпесвируса и фрагмент А генома дифтерийного токсина. В приложении к клеткам ES они могут быть использованы при культивировании клеток в качестве маркеров. В случае использования негативного селективного маркера необходимо размещать его за пределами фрагмента геномной ДНК мыши в составе направляющего вектора. При использовании позитивного селективного маркера необходимо встраивать его экспрессионную кассету в последовательность интрона фрагмента геномной ДНК мыши в составе направляющего вектора. При встраивании гена позитивного маркера в последовательность экзона встроенный ген обычно утрачивает свои функции, и поэтому иногда не удается получить особей, которые можно было бы тестировать по влиянию анализируемой мутации в качестве заключительной цели анализа.
Что касается линии клеток Е3, то обычно используются клеточные линии, производные от мышей линии 129. Клетки ES являются производными от указанной линии мыши: могут быть использованы такие клетки ES (т.е. эмбриональные стволовые клетки), как клетки D3, ССЕ, J1 и АВ1, равно как и клетки R1, описанные в примерах. Например, производные от мыши клетки ES, такой как линия мышей C57BL/6, также могут быть использованы помимо клеток мышей линии 129. Что касается методов внесения направляющего вектора в клетки ES, то в принципе может быть применен метод электропорации в соответствии с описанным в примерах. Может быть применен любой метод, лишь бы он обеспечивал проникновение плазмиды внутрь находящейся в культуре клетки, например метод осаждения с фосфатом кальция или липосомный метод. Когда клетки ES, в которые был внесен направляющий вектор, культивируют в присутствие селективного маркера, то те клетки ES, которые сохраняют жизнеспособность и образуют колонии, по-видимому, претерпели гомологичную рекомбинацию. Метод ПЦР обычно применяется для установления того, произошла ли гомологичная рекомбинация в тех клетках ES, которые образовали колонии. В качестве зонда могут быть использованы фрагмент ДНК, фрагмент РНК, синтетический олигонуклеотид, антитело или подобное.
После того, как клетки ES смешивают с оплодотворенной яйцеклеткой на ранних стадиях ее развития с последующим продолжением этого развития, может быть получена мышь от спермия или яйца, производного от клетки ES. Для смешивания клеток ES, в которых произошла гомологичная рекомбинация, с оплодотворенной яйцеклеткой на ранней стадии ее развития может быть применен метод, описанный в примерах. Кроме того, также может быть применен метод, который включает этапы выделения оплодотворенной яйцеклетки на стадии бластулы из тела беременной самки мыши, инъецирование 10-20 клеток ES в полученное яйцо с помощью микропипетки, реимплантации проинъецированного яйца в матку ложнобеременной самки с последующим продолжением развития до рождения мышонка.
Оплодотворенное яйцо на ранней стадии развития, предназначенное для использования в смешивании с клетками ES, может быть выделено из самок мышей любой линии. С целью облегчения установления того, попали ли в тела потомков клетки ES, предпочтительным является использование оплодотворенного яйца линии мышей, характеризующейся отличающейся окраской шерсти от окраски шерсти у тех мышей, на материале которых были получены клетки ES. Например, клетки ES, используемые в примерах, происходят от мышей линии 129, характеризующихся окраской шерсти «агути» (дикий тип), а мыши, от которых получают оплодотворенные яйцеклетки (линия C57BL/6), окрашены в черный цвет. При использовании такого материала возможным становится проведение простого отбора мышат, несущих клетки, производных от клеток ES, путем отбора потомков с мозаичной окраской. В этом случае мышата, характеризующиеся наибольшей долей окраски дикого типа, являются наиболее вероятными носителями половых клеток, производных от клеток ES. В качестве ложнобеременных самок мышей можно использовать мышей любой линии.
Мышью, которую используют для получения путем скрещивания потомств, несущих желательную встроенную мутацию и являющихся искомыми мозаиками, предпочтительно может быть мышь такой линии, которая характеризуется окраской шерсти, отличной от таковой у мышей линии, от которой были получены клетки ES. Обычно мозаичных самцов мыши скрещивают с самкой отличающейся линии: если получают потомство с окраской шерсти дикого типа, то это значит, что полученные в результате мыши несут желаемую мутацию в гетерозиготном состоянии. Если мышь, несущая мутацию OS-2 в мутантном гене пресенилина-1, также несет экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP, то возможным является получить мышь, у которой экспрессионная кассета neo удалена: для этой цели осуществляют скрещивание с трансгенной мышью, несущей встроенный ген cre.
Как было охарактеризовано выше в данном тексте, считается, что мутация белка пресенилина-1 и пресенилина-2 способствует образованию сенильных бляшек в результате повышения выработки амилоидного белка Аβ42, тем самым приводя к развитию болезни Альцгеймера. В группе трансгенных мышей, которым был внесен ген, кодирующий мутантный АРР, обусловливающий семейную болезнь Альцгеймера, у некоторых мышей отмечалось отложение амилоидных белков в головном мозге (D.Games et al., 1995, Nature, vol. 373, р.523; K.Hsiao et al., 1996, Science, vol. 274, p.99; С.Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p.13287). Предполагается, что у таких трансгенных мышей амилоидные отложения индуцируют повышение количества белка Аβ, вырабатываемого в головном мозге.
Путем скрещивания трансгенного животного, трансформированного геном, кодирующим мутантный белок-предшественник АРР, способного проявлять амилоидные отложения в головном мозге (это животное может быть гомо- или гетерозиготным по отношению ко внесенному трансгену), с животным по настоящему изобретению, несущим мутантный ген пресенилина-1 (это животное может быть гомо- или гетерозиготным по отношению ко внесенному трансгену), может быть получено гибридное животное. Такое животное предпочтительно является мышью. Для использования в скрещивании любое из указанных выше животных может быть самцом.
У потомства отрезают кусочек ткани хвоста, на материале которого экстрагируют геномную (хромосомную) ДНК. Используя эту экстрагированную ДНК в качестве субстрата, осуществляют ПЦР с использованием в качестве затравок двух олигонуклеотидов, нуклеотидная последовательность каждого из которых выстраивается таким образом, чтобы фланкировать мутируемый сайт гена, кодирующего мутантный АРР, и двух олигонуклеотидов, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, фланкирующей сайт мутирования мутантного гена пресенилина-1.
Возможным является определение того, попали ли в состав экстрагированной ДНК ген, кодирующий мутантный АРР, и мутантный ген пресенилина-1 по настоящему изобретению, для чего ПЦР-продукт разгоняют методом электрофореза в агарозном геле с последующим выявлением, например, присутствия или отсутствия бэндов и оценки подвижности бэндов в геле, анализируя конкретный бэнд, соответствующий данной мутации, путем гибридизации с использованием олигонуклеотида, нуклеотидная последовательность которого включает данную мутацию. ПЦР может быть осуществлена в соответствии с методом, описанным в примере 8. Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов, используемых в качестве затравок для ПЦР, могут иметь произвольную длину, лишь бы они позволяли детектировать ген, кодирующий мутантный АРР или мутантный ген PS1. Основываясь на результатах ПЦР, животное, у которого оба этих гена находятся в гетерозиготном состоянии, может быть получено путем отбора животных, несущих ген, кодирующий мутантный АРР, и мутантный ген пресенилина-1 по настоящему изобретению.
С целью получения животных, несущих оба гена, кодирующих мутантный АРР и мутантный пресенилин-1 по настоящему изобретению, находящихся в гомозиготном состоянии, отдельное животное, у которого оба этих гена гомозиготны, выбирают из потомства, полученного от скрещивания самца и самки, отобранных в группе животных, характеризующихся гетерозиготностыо этих генов. Для подтверждения того, что ген, кодирующий мутантный АРР, находится в гомозиготном состоянии, кусочек ткани хвоста такого потомства отбирают для экстрагирования из него геномной ДНК, а после расщепления этой геномной ДНК рестриктазами проводят электрофорез в агарозном геле или полиакриламидном геле. Затем ДНК промакивают на мембранный фильтр и проводят Саузерн-блоттинг с использованием в качестве зонда олигонуклеотида, последовательность которого обеспечивает специфичное связывание с геном, кодирующим мутантный АРР; затем анализируют плотность полученных в результате бэндов.
Аналогично указанным выше процессам может быть проверено присутствие в гомозиготном состоянии мутантного гена пресенилина-1 по настоящему изобретению. Олигонуклеотиды, применяемые в качестве зондов в методе Саузерн-блоттинга, могут быть использованы после их мечения в соответствии со способами, принятыми для прописей Саузерн-блоттинга, например, с помощью радиоактивного изотопа и флуоресцентного красителя. Таким образом может быть получена мышь, несущая оба гена, кодирующих мутантный АРР и мутантный пресенилин-1 по настоящему изобретению. Гибридная мышь, полученная с помощью описанного выше способа, характеризуется высоким уровнем выработки β-амилоидных белков в головном мозге и ускоренным амилоидным отложением.
С использованием генетически мутированного животного, клеток, трансформированных мутантным геном пресенилина, плазмиды, включающей мутантный ген пресенилина, и подобного возможным является осуществлять скрининг субстанций, применяемых для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера и для оценки их применимости. Накопление β-амилоидных белков у здорового млекопитающего прогрессирует очень медленно, в то время как генетически мутированному животному по настоящему изобретению свойственен высокий уровень выработки β-амилоидных белков. Следовательно, путем введения различных тестируемых субстанций генетически мутированному животному по настоящему изобретению и сравнения с животным, которым их не вводили, или с животными, которым вводили контрольные субстанции, возможным является оценить эти субстанции по их применимости для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера. Типичным примером такой оценки является скрининг тест-субстанций, и такому анализу могут быть подвергнуты условия, патологические параметры, фармакологические тесты и подобное.
В случае использования клеток по настоящему изобретению эти клетки выделяют из тела животного по настоящему изобретению и ставят в первичную культуру, а затем эти клетки могут быть стабилизированы и пересеяны в субкультуру с помощью иммортализации первичной клеточной культуры путем обработки соответствующим вирусом или подобного, пересеяны путем выделения фрагмента полученной культуры и далее прокультивированы с использованием свежей порции культуральной среды. Клетки по настоящему изобретению включают первичные культивируемые клетки, такие как нервные клетки, выделенные из тела генетически мутированного животного, равно как и пересеянные клетки, например, т.н. «клеточные линии», получаемые в результате постоянного пересева (субкультивирования) исходной первичной культуры. Когда нервная клетка используется в качестве клетки по настоящему изобретению, эта клетка экспрессирует высокий уровень β-амилоидных белков в результате экспрессии этой клеткой мутантного белка пресенилин-1. Субстанция, которая предотвращает или задерживает гибель нервной клетки вследствие накопления β-амилоидных белков, может быть протестирована, а также может быть оценена ее применимость путем добавления тестируемой субстанции в культуральную систему in vitro таких нервных клеток с последующим сравнением, например, продолжительности выживания клеток или числа выживаемых клеток через некоторый период времени.
Примеры
Настоящее изобретение может быть более детально охарактеризовано с помощью примеров. Однако, масштаб настоящего изобретения не ограничивается этими примерами. В нижеследующих примерах ген пресенилина-1 иногда обозначается как PS1.
Пример 1
Клонирование геномной ДНК, включающей 8-й экзон гена пресенилина-1 (PS1) мыши
Для конструирования зонда, предназначенного для выделения геномной ДНК, включающей 8-й экзон гена PS1 мыши, были синтезированы следующие два олигонуклеотида:
PR-8-U: 5'-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3' (25);
PR-8-L: 5'-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTGA-3' (23).
ПЦР осуществляли с использованием этих двух олигонуклеотидов в качестве затравок, а ДНК экстрагировали из геномной клонотеки мышей линии 129/SVJ (Stratagene) с получением амплифицированного ДНК-фрагмента длиной примерно 130 пар нуклеотидов. Затем этот фрагмент помечали методом случайного прайминга в присутствие 32Р-дЦТФ и затем использовали в качестве зондов для скрининга геномной клонотеки мышей линии 129/SVJ. Полученные в результате позитивные фаговые клоны были протестированы с подтверждением того, что они включают желаемую геномную ДНК, включающую последовательность 8-го экзона гена PS1 мыши. Клонированную ДНК обозначили как Рα и подвергали рестрикционному картированию (фиг.1).
Пример 2
Конструирование плазмиды, предназначенной для внесения мутации
ДНК была экстрагирована из клонированного фага, несущего Рα, и расщеплена рестриктазой Sall и затем подвергнута электрофорезу в 1%-ном геле с целью отбора фрагмента Рα. После расщепления рестриктазами PstI и Xbal полученный продукт подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с целью сбора ДНК-фрагмента длиной примерно 600 пар нуклеотидов, включая нуклеотидную последовательность, которая кодирует изолейцин по 213-му положению последовательности PS1 мыши. Полученный ДНК-фрагмент был обозначен как Х-1. Фрагмент Х-1 лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+ (Stratagene), которую предварительно расщепляли рестриктазами PstI и XbaI, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды рХ-1.
Пример 3
Внесение мутации OS-2
Мутация OS-2 и рестрикционный Sau3AI-сайт были «заново» внесены в состав плазмиды рХ-1 с использованием следующих двух олигонуклеотидов - PRL-104 и PRL-105. Олигонуклеотиды PRL-104 и PRL-105 были 36-нуклеотидными и комплементарными друг другу:
PRL-104: 5'-TGTGGTCGGGA TGATC* GCCA С CCACTGGAAAGGCCC-3';
PRL-105: 5'-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG* ATCATCCCGACCACA-3'.
(Подчеркнутый нуклеотид изменен по отношению к последовательности дикого типа с целью внесения мутации OS-2: а именно дикий тип соответствует Т для PRL-104 и А для PRL-105. Нуклеотиды, отмеченные звездочкой, изменены по отношению к последовательности дикого типа с целью внесения рестрикционного Sau3AI-сайта: а именно, дикий тип соответствует Т для PRL-104 и А для PRL-105).
Внесение данной мутации было осуществлено с использованием набора реактивов Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование полученного продукта подтвердило точное внесение данной мутации. Фрагмент Х-1, несущий мутацию, был обозначен как тХ-1, а плазмиду, несущую mX-1, обозначили как pmX-1 (фиг. 2).
Пример 4
Конструирование геномной ДНК, несущей мутацию OS-2
Полученный в примере 1 фрагмент Рα, включающий 8-й экзон гена PS1 мыши, расщепляли рестриктазой NcoI и затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 в присутствии 4 типов дезоксирибонуклеотидов (dNTP) с получением «тупых концов». Полученный фрагмент далее расщепляли рестриктазой Asp718I и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с целью отбора включающего 8-й экзон фрагмента ДНК длиной примерно 5 тысяч пар нуклеотидов. Этот фрагмент лигировали с использованием' ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+ (Stratagene), которую предварительно расщепляли рестриктазами SamI и Asp718l, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды pSB-0. Плазмиду pSB-0 полностью расщепляли рестриктазой XbaI с последующим частичным расщеплением рестриктазой PstI. Плазмиду pmX-1 расщепляли рестриктазами Xbal и Pstl и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с отбором mX-1. Этот фрагмент mX-1 лигировали на PstI-фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации клеток E.coli. Колонии трансформированной E.coli тестировали с целью отбора колонии, несущей такую плазмиду, в составе которой фрагмент Х-1 плазмиды pSB-0 заменен на фрагмент mX-1. Эту отобранную плазмиду обозначили как pmSB-0 (фиг.3).
Отдельно фрагмент Рα расщепляли рестриктазами BamHI и SalI и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 8 тысяч пар нуклеотидов, включающего 8-й экзон. Этот фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 лигировали в состав плазмиды pBluescript II KS+, которую предварительно расщепляли рестриктазами BamHI и Sall, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды pSB-1. Плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазой NcoI и обрабатывали ДНК-полимеразой в присутствие 4 типов dNTP с образованием «тупых концов». Полученный в результате фрагмент далее расщепляли рестриктазой XbaI и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Выделяли фрагмент ДНК длиной примерно 2200 пар нуклеотидов - XN, - включающий 8-й экзон: затем этот фрагмент и плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазами XbaI и PstI и после этого полученные продукты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Выделенный фрагмент ДНК длиной примерно 2300 пар нуклеотидов - РХ, - не включающий 8-й экзон, лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4. Этот лигированный фрагмент далее лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+, которую предварительно расщепляли рестриктазой Xbal, «затупляли» концы с помощью ДНК-полимеразы Т4 в присутствие 4 типов dNTP, религировали с использованием ДНК-лигазы Т4 и расщепляли рестриктазами SmaI и PstI. После этого полученную плазмиду использовали для трансформации E.coli. Колонии трансформированных клеток тестировали с целью получения плазмиды pmSB-0', несущей только один фрагмент ДНК, в котором ДНК-фрагменты XN и ХР были лигированы по Xbal-сайту (фиг.4).
Пример 5
Конструирование основной части направляющего вектора
Для внесения рестрикционного EagI-сайта по XbaI-сайту плазмиды pmSB-0' был синтезирован олигонуклеотид, характеризующийся следующей 12-нуклеотидной последовательностью:
5'-CTAGACGGCCGT-3' (12).
Этот олигонуклеотид способен отжигаться на нуклеотидную последовательность, характеризующуюся комплементарностью по участку CGGCCG с образованием следующей нуклеотидной последовательности после ее внесения по сайту, распознаваемому рестриктазой XbaI:
5'-TCTAGACGGCCGTCTAGA-3'
3'-AGATCTGCCGGCAGATCT-3'
-----------------
XbaI EagI XbaI
После расщепления плазмиды pmSB-0' рестриктазой XbaI указанный выше олигонуклеотид добавляли к продукту и лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4, а затем использовали для трансформации E.coli с целью получения плазмиды pmSB-0'eag, в последовательности которой EagI-сайт был встроен по XbaI-сайту плазмиды pmSB-0'. После расщепления плазмиды pmSB-0' рестриктазами NcoI и SalI полученные в результате фрагменты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 5300 пар нуклеотидов - SN, - включающего 8-й экзон. Отдельно плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазами BamHI и NcoI и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 2 тысячи пар нуклеотидов - NB, не включающего 8-й экзон. Фрагменты SN и NB лигировали друг на друга с использованием ДНК-лигазы Т4 и обрабатывали рестриктазами BamHI и SalI с получением фрагмента ДНК, в составе которого оба ДНК-фрагмента лигированы по Ncol-сайту. Этот фрагмент ДНК далее лигировали в состав плазмиды pBluescript II KS+ с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации клеток E.coli с целью получения плазмиды рА (фиг. 5), при том, что предварительно плазмиды pBluescript II KS+ расщепляли рестриктазой NotI, «затупляли» концы с использованием нуклеазы фасоли-мунго, религировали с использованием ДНК-лигазы Т4 с разрушением NotI-сайта и EagI-сайта, перекрывающихся в данном сайте, с последующим расщеплением рестриктазами BamHI и SalI.
Пример 6
Конструирование направляющего вектора
Плазмиду pPNT (L.J.Victor et al., 1991, Cell, 65, р.1153) расщепляли рестриктазами XhoI и BamHI и затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с целью получения «тупых концов» и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Отобранный ДНК-фрагмент, включающий экспрессионную кассету neo, лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBS246 (Gibco BRL), которую предварительно расщепляли рестриктазой BamHI и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с целью «затупления» концов, а затем использовали для трансформации E.coli с целью получения плазмиды pBS246neo. Эту плазмиду расщепляли рестриктазой NotI и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК длиной примерно 2 тысячи пар нуклеотидов, включающего экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP. Выделенный ДНК-фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 лигировали в состав плазмиды рА, которую предварительно расщепляли рестриктазой EagI, а затем использовали для трансформации клеток E.coli. Колонии трансформированных клеток затем тестировали на присутствие плазмиды рВ, в составе которой ген neo и ген PS-1 ориентированы одинаково (фиг.6).
После расщепления плазмиды рВ рестриктазами BamHI и SalI полученные в результате фрагменты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК - С, - включающего мутацию OS-2 и экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP. Сходным образом фрагмент Pα расщепляли рестриктазами SalI и BamHI и полученный в результате фрагмент ДНК длиной примерно 6,5 тысяч пар нуклеотидов субклонировали в состав плазмиды pBluescript II KS+ с получением плазмиды pSB-2, которую затем расщепляли рестриктазами HindIII и BamHI подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК длиной примерно 4 тысячи пар нуклеотидов - D. Фрагменты ДНК С и D лигировали друг на друга с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем полученный продукт расщепляли рестриктазами HindIII и SalI с получением фрагмента ДНК, в составе которого фрагменты С и D лигированы по BamHI-сайту. Полученный ДНК-фрагмент далее был лигирован с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+, которая предварительно была обработана рестриктазами HindIII и Sail, а затем использован для трансформации клеток E.coli с целью получения направляющего вектора pOS-2neoloxP (фиг.7).
Пример 7
Внесение направляющего вектора в клетки ES
Здесь и далее в описываемых примерах культуры ставили в инкубаторе при 37°С при 5% содержании углекислоты. Направляющий вектор вносили в клетки ES с помощью электропорации (линия R1), которые культивировали в среде DMEM, дополненной 15% плодной телячьей сывороткой и 1000 ед./мл LIF (ESGRO) (культуральная среда DMEM здесь и далее обозначается как среда ES). Культуральную среду заменяли на свежую среду ES за сутки до проведения электропорации и клетки R1 отбирали и промывали с использованием электропорационного буфера (20 мМ HEPES - рН=7,05, 137 мМ NaCI, 5 мМ KCl, 0,7 мМ Na2HPO4, 6 мМ декстрозы). Клетки R1 (107 клеток) смешивали с 25 мкг направляющего вектора pOS-2neoloxP, который предварительно был линеаризован с использованием рестриктазы NotI, а также 0,8 мл линеаризационного буфера с кювете для электропорации. Через 1-2 минуты клетки были подвергнуты обработке на пульсаторе Bio-Rad GenePilser (Bio-Rad) при параметрах пульса 240 В и 500 мкФ. Клетки ES отбирали центрифугированием и суспендировали в 30 мл культуральной среды ES. Суспензию клеток ES (по 2 мл) помещали на каждую из культуральных чашек, в которых размещались клетки-«кормилицы», находящиеся в 8 мл среды ES. К культуре добавляли антибиотик G418 (титр, 150 мкг/мл) через 12-18 часов, после чего культивирование вели неделю. В качестве клеток-«кормилиц» использовали фибробласты, введенные в культуру заявителями, которые были выделены из тел 12-13-дневных эмбрионов, развивающихся после скрещивания «нокаут» по HS1 мышей (I.Taniuchi et al., 1995, EMBO J., vol. 14, p.3664) и мышей линии ICR дикого типа.
Пример 8
Выделение клеток ES с помощью гомологичной рекомбинации
Были отобраны колонии клеток ES, которые образовались в примере 7 в результате недельного культивирования после добавления G418. Каждую колонию разделяли на две части. Одну из этих частей ставили в дальнейшую культуру. Для отбора клонов, в которых имела место гомологичная рекомбинация, Другую часть промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), обрабатывали протеиназой-К и затем геномную ДНК отбирали и подвергали ПЦР с целью отбора клонов. Нуклеотидные последовательности синтетических затравок, использовавшихся в реакции ПЦР, были следующими:
Prsn-1-2: 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3' (нуклеотидная последовательность, находящаяся за пределами сконструированного направляющего вектора);
PKG-1: 5'-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3' (нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты neo).
Реакцию ПЦР проводили на протяжении 35 циклов при следующих условиях: 30 секунд при 93°С, 1 минута при 60°С и 3 минуты при 68°С в каждом цикле. Полученный ПЦР-продукт анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с целью идентификации позитивного клона, который формирует бэнд в ожидаемом положении в геле. Оцененный в качестве позитивного клон далее подвергали ПЦР с использованием олигонуклеотидов PRL-101 и PRL-102. Полученный в результате ПЦР-продукт расщепляли рестриктазой Sau3AI и затем подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле. Внесение мутации проверяли с помощью расщепления бэндов и отбирали те клетки ES, в которых имела место желаемая гомологичная рекомбинация. Нуклеотидные последовательности PRL-101 и PRL-102 были следующими:
PRL-101: 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3';
PRL-102: 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3'.
Пример 9
Получение «нокин» мыши
Клетки ES, для которых была подтверждена гомологичная рекомбинация, были далее прокультивированы в течение 4 дней и затем обработаны трипсином с целью отделения друг от друга. Из самок мышей линии BDF1 были выделены 8-клеточные эмбрионы (этих самок скрещивали с самцом линии BDF1), после чего удаляли вителлиновый слой (zona pellucida). Отделенные друг от друга клетки ES помещали на открытый безвителлиновый эмбрион (20 клеток ES в расчете на один 8-клеточный эмбрион). Обработанный эмбрион реимплантировали в матку ложнобеременной самки мыши и эмбриональное развитие продолжалось вплоть до появления мозаичной мыши. Полученного в результате мозаичного самца мыши скрещивали с самкой линии C57BL/6. Из потомства такого скрещивания отбирали мышей с окраской дикого типа «агути». Вырезали кусочек ткани хвоста и из каждого такого образца экстрагировали геномную ДНК. ПЦР проводили с использованием затравок PRL-101 и PRL-102 и полученный ПЦР-продукт расщепляли рестриктазой Sаu3АI и затем подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле. Присутствие расщепленных бэндов анализировали с целью подтверждения того, что отобранное потомство несет мутацию OS-2. Из проверенного потомства был отобран один самец, которого обозначили как №2.
Пример 10
«Нокин» особь №2, полученная в примере 9, характеризуется гетерозиготностью по экспрессионной кассете neo, фланкированной последовательностями loxP, происходящей из состава направляющего вектора. Эту мышь №2 (самец возраста примерно 4 месяца) скрещивали с самкой мыши трансгенной линии CAG-cre№13 в 4-м поколении (возраст 2 месяца, внесен ген cre, находящийся в гетерозиготном состоянии: K.Sakai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, p.318). ПЦР осуществляли с использованием олигонуклеотидов PRL-100, PRL-102 и PGK-1 с соблюдением условий, описанных в примере 8. Мышь, из генома которой была удалена экспрессионная кассета neo, была выбрана как мутантная по OS-2 «нокин» мышь, лишенная экспрессионной кассеты neo (фиг.8). Эта мышь была гетерозиготной по мутации OS-2 и несла единственную последовательность loxP. Нуклеотидные последовательности PRL-100, PRL-102 и PGK-1, использовавшиеся для проведения ПЦР, были следующими:
PRL-100: 5'-GGT ССА ТСС CAG СТТ САС АСА GAC AAG ТСТ-3'
PRL-102: 5'-ТАС TGA ААТ САС AGC САА GAT GAG CCA TGC-3'
PKG-1: 5'-TAG TGA GAC GTG СТА СТТ ССА ТТТ GTC ACG-3'.
Промышленное применение
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется наличием мутантного гена пресенилина-1 и высоким уровнем выработки β-амилоидного белка в результате наличия гена, отличающегося от такового у нормального животного, не имеющего такой мутации, следовательно, это животное проявляет симптомы болезни Альцгеймера, связанные с быстрой гибелью клеток или разрушением нейронов в гиппокампе головного мозга. Следовательно, скрининг субстанций, применимых для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера, и оценка их применимости могут быть проведены с использованием генетически мутированного животного по настоящему изобретению.
Claims (25)
1. Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, отличающийся тем, что он предусматривает стадию переноса мутантного гена пресенилина-1 путем гомологичной рекомбинации в эмбрион животного, где указанный мутантный ген пресенилина-1 содержит ДНК, имеющую последовательность, кодирующую часть мутантного белка пресенилина-1, в аминокислотной последовательности которого одна аминокислота заменена отличной аминокислотой.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что мутантный ген пресенилина-1 способен экспрессировать мутантный белок пресенилин-1 и индуцировать продукцию β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующего нервного заболевания, в гиппокампе или периферическом отделе коры головного мозга.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что мутантный белок пресенилин-1 имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот в положениях, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных положений 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 и 436, заменены на отличную(ые) аминокислоту(ы).
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что мутантный белок пресенилин-1 содержит одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, Е120К, E120D, N135D, М139V, М139Т, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, А231T, A231V, L235P, А246Е, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269H, Е280А, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, А426Р и P436S, причем каждая буква соответствует аминокислоте, обозначенной в соответствии с однобуквенным кодом, а каждое число соответствует номеру аминокислоты, считая от N-конца белка пресенилина-1, а применяемое обозначение указывает на то, что аминокислота дикого типа, указанная слева от числа, заменяется на аминокислоту, указанную справа.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что мутантный белок пресенилин-1 содержит замену изолейцина в положении 213 на отличную от изолейцина аминокислоту.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что мутантный белок пресенилин-1 содержит замену изолейцина в положении 213 на треонин.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что животное содержит мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг аминокислоты в положении 213 в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1 мутирована с получением следующей последовательности:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3',
причем N соответствует любому нуклеотиду, отличному от Т, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту в положении 213.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что животное содержит мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг аминокислоты в положении 213 в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1 мутирована с получением следующей последовательности:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3',
причем N соответствует С, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту в положении 213.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что животное содержит мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг аминокислоты в положении 213 в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1 мутирована с получением следующей последовательности:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3',
причем XYZ представляет триплетный кодон, кодирующий отличную от изолейцина аминокислоту, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту в положении 213.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что сверхэкспрессия β-амилоидного белка вызвана мутантным геном пресенилина-1.
11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что животное способно экспрессировать мутантный белок пресенилин и что экспрессия указанного белка индуцирует продукцию β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующего нервного заболевания в периферическом отделе коры головного мозга млекопитающего.
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что животное является грызуном.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что животное является мышью.
14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что уровень экспрессии амилоидного белка в ткани головного мозга, индуцируемой геном пресенилина-1, достаточен для обусловливания нарушенного поведения в тесте на тренировку памяти по сравнению с нормальным животным и достаточен для индуцирования аномальной нейропатии в периферическом отделе коры головного мозга и гиппокампе животного.
15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что животное содержит ДНК, содержащую мутантный ген пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, в составе которого одна или несколько аминокислот заменены на отличные аминокислоты, наряду с ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую маркерный белок.
16. Способ тестирования вещества на применимость для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что предусматривает стадию сравнения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-15, которому введено тестируемое вещество, с указанным генетически мутированным животным, которому тестируемое вещество не введено, и что указанное сравнение проводят между внеклеточной концентрацией Aβ 42(43) в головном мозге животного, которому введено тестируемое вещество, и головном мозге животного, которому тестируемое вещество не введено.
17. Способ тестирования вещества на применимость для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что предусматривает стадию сравнения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-15, которому введено тестируемое вещество, с указанным генетически мутированным животным, которому тестируемое вещество не введено, и что указанное сравнение проводят с использованием теста на тренировку памяти или патологического теста.
18. Способ тестирования вещества на применимость для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что предусматривает стадию сравнения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-15, которому введено тестируемое вещество, с указанным генетически мутированным животным, которому тестируемое вещество не введено, и что указанное сравнение проводят с использованием патологического теста, основанного на нейропатологии в периферическом отделе коры головного мозга.
19. Способ тестирования вещества на применимость для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера, отличающийся тем, что предусматривает стадию сравнения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-15, которому введено тестируемое вещество, с указанным генетически мутированным животным, которому тестируемое вещество не введено, и что указанное сравнение проводят по одному или нескольким показателям, выбранным из группы, состоящей из периода выживаемости, исследовательского поведения и миграционного поведения.
20. Плазмида, применимая в способе получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном по любому из пп.1-7, содержащая ДНК или ее часть, функционально связанные с регуляторными последовательностями, причем указанная ДНК имеет последовательность мутантного гена пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг аминокислоты в положении 213 в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1, является следующей последовательностью:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3',
причем N соответствует A, G или С, М соответствуют Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту в положении 213.
21. Плазмида, применимая в способе получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном по любому из пп.1-3, 5 или 9, содержащая ДНК или ее часть, причем указанная ДНК имеет последовательность мутантного гена пресенилина-1, кодирующего и мутантный белок пресенилин-1, где аминокислота в положении 213 заменена отличной от изолейцина аминокислотой, и содержит последовательность ДНК, кодирующую участок вокруг аминокислоты в положении 213 белка пресенилина-1, является следующей последовательностью:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3',
причем М соответствует Т или С, XYZ представляет собой триплетный кодон, кодирующий отличную от изолейцина аминокислоту, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту в положении 213.
22. Плазмида, применимая в способе получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном по любому из пп.1-3 или 5, содержащая ДНК, причем сайт Sau3AI встроен в нуклеотидную последовательность, содержащую полноразмерную или мутированную часть кДНК или хромосомной ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, в котором аминокислота в положении 213 заменена на отличную от изолейцина аминокислоту.
23. Плазмида по п.22, отличающаяся тем, что аминокислотной заменой является замена изолейцина в положении 213 на треонин.
24. Плазмида по п.20 или 21, где последовательность ДНК характеризуется следующей нуклеотидной последовательностью:
5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3',
в которой М соответствует Т или С.
25. Способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки, применимых для идентификации вещества, применимого для терапевтического и/или профилактического лечения болезни Альцгеймера, причем указанный способ предусматривает выделение клетки из генетически мутированного животного, полученного в соответствии со способом по любому из пп.1-15, и культивирование указанной клетки методами тканевых культур.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP219198 | 1998-01-08 | ||
JP10/2191 | 1998-01-08 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2000120677A RU2000120677A (ru) | 2002-10-20 |
RU2266002C2 true RU2266002C2 (ru) | 2005-12-20 |
Family
ID=11522482
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000120677/13A RU2266002C2 (ru) | 1998-01-08 | 1999-01-07 | Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, способ тестирования вещества на применимость для лечения болезни альцгеймера (варианты), плазмида (варианты), способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7022893B1 (ru) |
EP (1) | EP1044605B1 (ru) |
JP (1) | JP4290329B2 (ru) |
KR (1) | KR100646816B1 (ru) |
CN (1) | CN1292638A (ru) |
AU (1) | AU1784499A (ru) |
CA (1) | CA2317809A1 (ru) |
DE (1) | DE69935903T2 (ru) |
HK (1) | HK1031983A1 (ru) |
NO (1) | NO20003495L (ru) |
RU (1) | RU2266002C2 (ru) |
TW (2) | TWI240752B (ru) |
WO (1) | WO1999034670A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2757114C1 (ru) * | 2020-08-05 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Способ получения линии гуманизированных мышей, трансгенных по hACE2 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6284944B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-09-04 | Cephalon, Inc, | Gene-targeted non-human mammal with a human fad presenilin mutation and generational offspring |
AU7699501A (en) * | 2000-07-20 | 2002-02-05 | Cephalon Inc | Gene-targeted non-human mammal with human fad presenilin mutation and generational offspring |
AUPR446701A0 (en) | 2001-04-18 | 2001-05-17 | Gene Stream Pty Ltd | Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies |
KR100462180B1 (ko) * | 2001-11-20 | 2004-12-16 | (주) 디지탈바이오텍 | 알츠하이머병 병인 유전자로 형질전환된 동물 및 그 제조방법 |
KR100584914B1 (ko) * | 2004-03-30 | 2006-05-30 | 주식회사 뉴로테크 | 돌연변이 app를 발현하는 알츠하이머병 유발 형질전환마우스 |
US8124831B2 (en) * | 2006-07-06 | 2012-02-28 | Duke University | Transgenic mice carrying functional single nucleotide polymorphisms in brain-specific tryptophan hydroxylase |
CN105494263B (zh) * | 2015-12-25 | 2018-11-30 | 哈尔滨医科大学 | 一种产生ho-1/app/psen1三转基因阿尔茨海默病小鼠模型的方法 |
AU2018272068A1 (en) * | 2017-05-25 | 2020-01-16 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Method and composition for generating basal forebrain cholinergic neurons (BFCNs) |
US10463029B1 (en) * | 2018-06-07 | 2019-11-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of steel syndrome |
EP4054324A1 (en) | 2019-11-05 | 2022-09-14 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | A murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
US11266129B2 (en) | 2019-11-05 | 2022-03-08 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | Murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
KR102584857B1 (ko) * | 2020-09-23 | 2023-10-06 | 재단법인대구경북과학기술원 | 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도 |
KR20230009140A (ko) * | 2021-07-08 | 2023-01-17 | 주식회사 엠케이바이오텍 | Human mutant Presenilin-1 발현 인지장애 모델 개의 생산 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0415958B1 (en) | 1988-04-15 | 1997-05-21 | The Du Pont Merck Pharmaceutical Company | A p1 bacteriophage cloning system for dna fragments as large as 95 kb |
US5650550A (en) * | 1993-10-01 | 1997-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mutant mice having a deficit of functional estrogen receptors |
US5877399A (en) | 1994-01-27 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University | Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease |
US5986054A (en) * | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
WO1998051781A1 (en) * | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Merck & Co., Inc. | Transgenic animal expressing non-native wild-type and familial alzheimer's disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background |
-
1999
- 1999-01-07 CN CN998037990A patent/CN1292638A/zh active Pending
- 1999-01-07 WO PCT/JP1999/000015 patent/WO1999034670A1/ja active IP Right Grant
- 1999-01-07 EP EP99900133A patent/EP1044605B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 US US09/581,528 patent/US7022893B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 RU RU2000120677/13A patent/RU2266002C2/ru active
- 1999-01-07 AU AU17844/99A patent/AU1784499A/en not_active Abandoned
- 1999-01-07 CA CA002317809A patent/CA2317809A1/en not_active Abandoned
- 1999-01-07 KR KR1020007007576A patent/KR100646816B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-01-07 DE DE69935903T patent/DE69935903T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 JP JP2000527142A patent/JP4290329B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-08 TW TW088100217A patent/TWI240752B/zh not_active IP Right Cessation
- 1999-01-08 TW TW094110822A patent/TW200529742A/zh unknown
-
2000
- 2000-07-07 NO NO20003495A patent/NO20003495L/no not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-04-17 HK HK01102706A patent/HK1031983A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
K.DUFF et al., "Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1", Nature, vol.383, p.710-713, 1996.. D.R.BORCHELT et al., "Familia 1 Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta 1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo". Neuron, vol. 17, p.1005-1013, 1996. К.KAMINO et al., "Three different mutations of presenilin 1 gene in earlyonset Aizheimer's disease families", Neuroscience Letters, vol. 208. p.195-198, 1996. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2757114C1 (ru) * | 2020-08-05 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | Способ получения линии гуманизированных мышей, трансгенных по hACE2 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20003495D0 (no) | 2000-07-07 |
KR20010040330A (ko) | 2001-05-15 |
AU1784499A (en) | 1999-07-26 |
EP1044605A1 (en) | 2000-10-18 |
TWI240752B (en) | 2005-10-01 |
DE69935903D1 (de) | 2007-06-06 |
TW200529742A (en) | 2005-09-16 |
US7022893B1 (en) | 2006-04-04 |
EP1044605A4 (en) | 2003-05-07 |
CA2317809A1 (en) | 1999-07-15 |
NO20003495L (no) | 2000-09-07 |
WO1999034670A1 (fr) | 1999-07-15 |
EP1044605B1 (en) | 2007-04-25 |
HK1031983A1 (en) | 2001-07-06 |
DE69935903T2 (de) | 2008-01-10 |
CN1292638A (zh) | 2001-04-25 |
JP4290329B2 (ja) | 2009-07-01 |
KR100646816B1 (ko) | 2006-11-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Von Koch et al. | Generation of APLP2 KO mice and early postnatal lethality in APLP2/APP double KO mice | |
AU671093B2 (en) | Transgenic animal models for alzheimer's disease | |
US6187992B1 (en) | Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene | |
RU2266002C2 (ru) | Способ получения отличного от человека животного с мутированным нокин-геном, способ тестирования вещества на применимость для лечения болезни альцгеймера (варианты), плазмида (варианты), способ получения первичной культуры клеток или субкультивируемой клетки | |
WO1997048792A9 (en) | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease | |
EP0904349A1 (en) | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease | |
JPH07132033A (ja) | アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物 | |
JP2001517065A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
JP4302158B2 (ja) | アルツハイマー病用のトランスジェニック動物モデル | |
US6452065B2 (en) | Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background | |
Loring et al. | Rational design of an animal model for Alzheimer's disease: introduction of multiple human genomic transgenes to reproduce AD pathology in a rodent | |
US6593512B1 (en) | Transgenic mouse expressing human tau gene | |
US20070022483A1 (en) | Transgenic animal model for Alzheimer's disease | |
JP2003504015A (ja) | 神経変性疾患のモデルとしてのトランスジェニック動物 | |
JP4938956B2 (ja) | 神経変性性障害のトランスジェニック動物モデル | |
KR100699453B1 (ko) | 신경퇴행성 질환용 모델로서의 형질전환 동물 | |
US7432414B2 (en) | Transgenic mouse having an amyloid precursor protein with a modified beta secretase cleavage site | |
US20080295186A1 (en) | Neurotrypsin overexpressing animal | |
Wadsworth et al. | Transgenic mouse expressing APP 770 | |
Von Koch | Molecular analysis of a homologue of the mouse beta-amyloid precursor protein, APLP2: Isolation of APLP2cDNA, characterization of the APLP2 gene promoter and gene targeting of APLP2 |