KR100584914B1

KR100584914B1 - 돌연변이 ａｐｐ를 발현하는 알츠하이머병 유발 형질전환마우스

Info

Publication number: KR100584914B1
Application number: KR1020040021512A
Authority: KR
Inventors: 한평림; 이강우; 양승돈; 송진숙
Original assignee: 주식회사 뉴로테크
Priority date: 2004-03-30
Filing date: 2004-03-30
Publication date: 2006-05-30
Also published as: WO2006004287A1; KR20050096347A

Abstract

본 발명은 알츠하이머병 유발 형질전환 동물에 관한 것으로, 구체적으로는, 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터 및 이를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 마우스는 인지능력 감소, 기억력 감소 및 불안감 증가와 같은 알츠하이머병 임상적 특징을 나타내어 알츠하이머병을 연구하기 위한 모델 동물로 유용하다.

Description

돌연변이 ＡＰＰ를 발현하는 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스{Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP}

도 1a는 본 발명에서 제조한 형질전환벡터 PDGF-APP(Sw, V717F)-pA 및 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-pA를 나타낸 모식도이다.

도 1b는 본 발명에서 제조한 형질전환 동물 Tg-APP/B6(-intron) 및 Tg-APP/B6(+intron)에 돌연변이 APP751 유전자가 삽입되었는지 확인한 서던블랏 분석 사진이다. 도면에서 화살표는 SpeI에 의해 절단된 2.3 kb APP751 절편을 나타낸다.

도 1c는 본 발명에서 제조한 형질전환 동물 Tg-APP/B6(-intron) 및 Tg-APP/B6(+intron)에서 돌연변이 APP751 유전자가 발현되는지 확인한 노던블랏 분석 사진이다. 도면에서 위쪽 화살표는 내부에 존재하는 APP 전사체를 나타내고, 아래쪽 화살표는 본 발명의 돌연변이 APP 전사체를 나타낸다.

도 2a는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 APP751 단백질을 생산하는지 확인한 웨스턴 블랏 분석 사진이다. 윗패널은 모노클로날 APP751 항체, 아랫패널은 폴리클로날 APP751 항체를 사용하여 분석한 것이고, 짧은 화살표는 내부 발현된 APP 단백질의 위치, 긴 화살표는 돌연변이 APP751 단백질의 위치를 나타낸다.

도 2b는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 인간 APP의 Aβ부위 단백질(6E10)을 생산하는지와 호모 및 헤테로 형질전환 마우스에서의 인간 APP의 Aβ 단백질의 발현양이 변화하는지를 비교한 웨스턴 블랏 분석 사진이다.

도 2c는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 βCTF 및 αCTF 단백질을 발현하는지 확인한 웨스턴 블랏 분석(왼쪽)과 이를 수치화한 그래프(오른쪽)이다.

도 2d는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 대뇌 피질(CX) 및 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 돌연변이 APP751 단백질이 발현하는 것을 확인한 면역조직학적 분석사진이다.

도 3은 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 정상 마우스에 비해 칼비딘의 발현 감소, 파브알부민과 칼레티닌의 발현 유지된 것을 나타낸 면역조직학적 분석사진이다.

도 4는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 정상 마우스에 비해 c-랜의 발현량이 감소한 것을 나타낸 면역조직학적 분석사진이다.

도 5는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(호모 및 헤테로)를 이용하여 운동성 불균형을 분석한 개방 범위 분석 및 로타-로드 분석 결과이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다.

도 6은 7개월령 및 14개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(헤테로)를 이용하여 인지능력 불균형을 분석한 모리스 물 미로 실험, 수동적 회피 실험 결과이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다.

도 7은 17개월령 및 13개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(호모 및 헤테로)를 이용하여 불안감 증가 현상을 분석한 증가된 플러스 미로 실험 결과(그래프 및 운동 이미지 그림)이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다. 운동 이미지 그림에서 CA는 닫혀진 통로, OA는 열려진 통로이다.

도 8은 마이크로어레이 분석을 통해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스에서 발현량이 변화된 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다.

본 발명은 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 도입하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것이다.

알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 대뇌의 아밀로이드 침착, 신경섬유 농축, 뇌에서의 시냅스 및 뉴런의 소실과 같은 생화학적 및 조직학적 변화로 특징된다. 인간 알츠하이머 병 환자는 기억력 감퇴 및 증가된 불안과 과민 반응을 포함하는 심신적 비정상과 같은 심리적 증후를 보임으로써 복합적 인지력 결함을 보인다. 알츠하이머병과 관계된 유전자, 즉 APP(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527; Hsiao et al., Science, 1996, 274:99-102; Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13287-13292; Moechars et al., J Biol Chem, 1999, 274:6483-6492; Chishti et al., J Biol Chem, 2001, 276:21562-21570), 프리세닐린 1(presenilin 1, PS1)(Duff et al., Nature, 1996, 383:710-713; Begley et al., J Neurochem, 1999, 72:1030-1039; Barrow et al., Neurobiol Dis, 2000, 7:119-126) 또는 PS2(Oyama et al., N Neurochem, 1998, 71;313-322)에 돌연변이를 유도하여 제조한 돌연변이 유전자를 과발현하는 형질전환 마우스는 β-아밀로이드증(β-amyloidosis), 타우 병변(tauopathy), 신경세포성 소실(neuronal loss), 신경교증(gliosis) 및 인지능력 부족(cognitive defict)을 포함하는 광범위한 특성을 모방(mimic)하는 것으로 나타났다. 그러나, 실제 존재하는 어떠한 모델 동물도 알츠하이머병 징후의 완전한 범위를 전체적으로 반복하지는 못하였으며, 개발된 모델 동물을 가지고 실시한 실험에서 알츠하이머병의 징후는 개별적인 마우스 라인(line)에서만 나타나는 한계가 있었다. 따라서, 알츠하이머병 유사 뇌질환의 특성을 나타낼 수 있는 새로운 형질전환 마우스를 개발하는 것이 필요한 실정이다.

현재 개발된 알츠하이머병 모델 중에서, 특정 마우스 라인은 알츠하이머병의 병리생리학적 특성을 훌륭하게 나타내고 있으며, 이에 대해 많은 연구실에서 연구가 진행중이다. PDAPP 마우스는 혈소판-유도된 성장 인자(platelet-derived growth factor)-β유전자 프로모터의 조절아래 V717F 돌연변이를 포함하는 인간 APP 유전자(695, 751 및 770)를 발현한다. 상기 마우스는 6 내지 15개월령에서 세포외 아밀로이드 플라그, 시냅스세포 결손, 신경교증 증가 및 공간 지각력 부족과 같은 증상을 나타내었다(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527; Irizary et al., J Neurosci, 1997, 17:7053-7059; Chen et al., Nature, 2000, 408:975-979). Tg2576 마우스는 햄스터 프리온(prion) 단백질(PrP) 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디쉬(Swedish) 이중 돌연변이(K670, M671L)를 포함하는 인간 APP695 유전자를 발현한다. 9 내지 18 개월령의 Tg2576 마우스는 Aβ42의 상승, 아밀로이드 침착, 신경염적(neuritic) 감소, 염증성 변화 및 기억력 부족의 증상을 나타내었다. 그러나, 운동성은 정상이거나 심각하지 않은 결함을 나타내었고, 17개월령의 Tg2576 마우스에서는 불안증이 억제되었다(Hsiao et al., Science, 1996, 274:99-102; Benzing et al., Neurobiol Aging, 1999, 20:581-589; King et al., Behav Brain Res, 1999, 103:145-162; King et al., Physiol Behav, 2002, 75:627-642; Kawarabayashi et al., J Neurosci, 2001, 15:372-381; Terai et al., Neuroscience, 2001, 104:299-310; Lalonde et al., Brain Res, 2003, 977:38-45). TgCRND8 마우스는 햄스터 PrP 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디시 및 런던돌연변이를 포함하는 APP695 유전자를 발현한다. 상기 마우스는 3개월령에서 이른 시점에 나타나는 Aβ 플라그의 침착 및 공간 지각력 부족을 나타내었다(Janus et al., Nature, 2000, 408:979-982; Chishti et al., J Biol Chem, 2001, 276:21562-21570). APP23 마우스는 마우스 thy-1 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디시 돌연변이를 포함하는 인간 APP695 유전자를 발현한다. 상기 마우스는 6개월령에 Aβ 침착, 시냅스 세포 결손 및 공간 지각력에 있어서 불균형을 나타내었지만(Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13287-13292; Sturchler-Pierrat et al., Ann NY Acad Sci, 2000, 920:134-139), 16개월령 까지 불안감과 운동성은 변하지 않았다(Lalonde et al., Brain Res, 2002, 956:36-44). 또한, APP와 PS1 또는 tau 단백질을 발현하는 다른 형질전환 마우스가 개발되었으며, 이들은 알츠하이머병 뇌에서 나타나는 플라그 발병기전(pathogenesis)과 타우 병변(taupathy)을 동시에 나타내었다(Borchelt et al., Neuron, 1997, 19:939-945; Holcomb et al., Nature Med, 1998, 4:97-100; Dewachter et al., J Neurosci, 2000, 20:6452-6458; Lewis et al., Science, 2001, 293:1487-1491; Oddo et al., J Neurochem, 2003, 71:313-322). 현재까지 개발된 대부분의 알츠하이머병 모델 동물은 유전적 배경이 되는 마우스의 혼합으로 제조되었으며, 그 예로는 Swiss Webster 및 C57BL/6과 DBA/2의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 PDAPP 마우스; C57BL/6와 SJL의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 Tg2576 마우스; C3H와 C57BL/6의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 TgCRND8 마우스; 및 C57BL/6와 DBA2의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 APP23 마우스가 있다.

이에, 본 발명자들은 알츠하이머병의 임상적 특징을 효과적으로 나타낼수 있는 모델 동물의 부족을 개선하기 위해 노력하던 중, 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 돌연변이 유도하여 제조한 단백질을 수정란의 핵에 이식하여 제조한 형질전환 마우스가 알츠하이머병의 임상적 특징을 효과적으로 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터 및 이를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 벡터를 마우스 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터를 제공한다.

상기 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)은 서열번호 2로 기재되는 APP751 단백질의 670번째 아미노산 리신(K)을 아스파라긴(N)으로 치환하고, 671번째 아미노산 메티오닌(M)을 루이신(L)으로 치환하며, 717번째 아미노산 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환한 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것이 바람직하다. 상기에서 서열번호 2로 기재되는 APP751 단백질의 670번째 아미노산 리신(K)을 아스파라긴(N)으로 치환하고, 671번째 아미노산 메티오닌(M)을 루이신(L)으로 치환하는 것은 스웨디시 돌연변이(Swedish mutation)이라 하고, 상기에서 717번째 아미노산 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환하는 것을 V717F 돌연변이라 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 제시한 대로 돌연변이 APP 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하고, 이를 "hAPP(Sw, V717F)"라 명명하였다.

또한, 본 발명의 형질전환벡터는 PDGF-β프로모터 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 돌연변이 유전자의 앞에는 번역 효율을 높이기 위해 코작 서열(Kozac sequence)를 추가로 포함시킬 수도 있다. 본 발명에서는 PDGF-β프로모터 유전자, 코작 서열, 서열번호 3으로 기 재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하도록 형질전환벡터를 제조하고, 이를 "PDGF-APP(Sw, V717F)-polyA"라 명명하였다(도 1a 참조).

또한, 본 발명의 형질전환벡터는 PDGF-β프로모터 유전자와 hAPP751(Sw, V717F)유전자 유전자 사이에 추가로 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자는 돌연변이 유전자의 발현 효율을 증가시키고, 전사 안정도를 증가시키기 위해 삽입한 것으로서, 본 발명에서는 PDGF-β프로모터 유전자, 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자, 코작 서로, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP751(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하도록 형질전환벡터를 제조하고, 이를 "PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA"라 명명하였다(도 1a 참조).

또한, 본 발명은 상기 형질전환벡터를 마우스에 도입하여 제조한 알츠하이머 병 유발 형질전환 마우스를 제공한다.

본 발명의 형질전환 마우스에 도입되는 형질전환벡터는 PDGF-APP(Sw,V717F)-polyA 또는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA인 것이 바람직하며, PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 PDGF-APP(Sw,V717F)-polyA 또는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터를 각각 C75BL/6 마우스의 미수정란의 전핵에 미세주입하고, 이를 대리모에 이식하여 출생한 자손 및 이를 근교배하여 출생한 자손들에서 발현되는 APP(Sw, V717F) 돌연변이 유전자의 발현 양상을 비교한 결과, 인트론이 도입된 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터로 도입된 형질전환 마우스에서 훨씬 높은 발현을 나타내어 본 발명의 APP(Sw, V717F) 돌연변이 유전자를 효율적으로 도입시키고 높은 발현을 나타내기 위해서는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터로 도입하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

본 발명에서는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 형질전환 마우스를 "Tg-APP/B6"라 명명하고, 상기 마우스에 서 APP 유전자의 발현 및 APP 단백질의 발현 수준을 분석한 뒤 본 발명의 돌연변이 APP 유전자가 효과적으로 도입되어 단백질 수준까지 발현이 됨을 확인하여 2004년 3월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10608BP).

본 발명의 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스(Tg-APP/B6)는 알츠하이머병의 임상적 특징인 운동성의 감소, 기억력 및 인지능력의 소실, 불안증세의 증가를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 알츠하이머병의 임상적 특징을 나타내는지 확인하기 위해 개방범위(Open field) 테스트, 로타-로드(Rota-rod) 테스트, 모리스 물 미로(Morris water maze) 테스트, 상승된 플러스 미로(elevated plus maze) 테스트, 수동적 회피(Passive avoidance) 테스트를 수행하였다. 그 결과, 개방범위 테스트에서는 정상마우스와 이동 능력에 있어서 별차이가 없었으나(도 5a 참조), 로타-로드 테스트에서는 정상마우스에 비해 운동 조정 능력과 운동 학습 능력이 감소되었고(도 5b 참조), 모리스 물 미로 테스트에서는 정상마우스에 비해 인지능력이 떨어져 기억력이 감소되는 결과를 나타내었으며(도 6a 내지 도 6d 참조), 상승된 플러스 미로 테스트에서는 정상마우스에 비해 불안감이 상당히 증가하였고(도 7c 및 도 7d 참조), 수동적 회피 테스트에서는 기억력 유지 능력이 감소되었다(도 7e 및 도 7f 참조). 따라서, 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 기억력 및 인지능력 감소, 불안감 증가와 같은 알츠하이머병의 임상적 특징을 그대로 나타냄을 알 수 있었다.

또한, 상기에서 확인한 불안감의 증가가 어떠한 원인으로 나타나는지 확인하기 위해 마이크로어레이 분석을 한 결과, TNF-α, T-LAK 세포-유도된 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 스타니오칼신, 칼모듈린 4, 사이토크롬 c, 17형 전구콜라겐 알파 1, 프로미닌 1 및 트랜스티레틴의 발현량이 증가하였으며, RT-PCR로 재확인한 실험에서도 같은 결과를 나타내어(도 8 참조), 이는 종래 발표된 문헌의 내용과도 일치하였다. 즉, 인간 재조합 TNF-α를 대뇌실(cerebroventricle)에 주입한 결과, 상승된 플러스 미로 테스트에서 불안감 유사 증세를 유발하였으며(Connor et al., Neuroscience, 1998, 84:923-933), T- LAK 세포-유래된 단백질 키나제는 TNF 수용체 활성과 관계있었다(Abe et al., J Leukoc Biol, 1995, 57:462-468). 또한, 높은 혈장 레닌(rennin) 활성은 증가된 불안감과 관계있다(Perini et al., J Hypertens, 1994, 12:601-607).

따라서, 증가된 불안감이 인간 알츠하이머병의 가장 문제가 되는 증세이기 때문에(Folstein and Bylsma, 1999, In Alzheimer Disease(Eds by Terry et al.,) 2^nd. Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia), 불안감의 증가 증세를 나타내는 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 알츠하이머병 모델 동물로서 유용하게 사용될 수 있고, APP 단백질 관련 연구와 나이 의존적 증가되는 불안감을 연구하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질 cDNA 유전자의 확보 및 APP 돌연변이 유전자의 제조

<1-1> 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질 cDNA 유전자의 확보

서열번호 1로 기재되는 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(homo sapiens amyloid beta precursor protein, 이하 'APP'라 약칭함) 751의 cDNA 유전자(NCBI 유전자은행 기탁번호 NM_000484)는 인간 뇌에서 만들어진 마라톤-레디 라이브러리(Marathon-Ready cDNA library)(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 PCR 증폭하여 제조하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머로는 서열번호 4로 기재되는 app-1f 프라이머 및 서열번호 5로 기재되는 app-1r 프라이머 쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 app-2f 프라이머 및 서열번호 7로 기재되는 app-2r 프라이머 쌍을 각각 사용하였으며, 95℃에서 1분 동안 열변성, 55℃에서 1분 동안 프라이머 결합, 72℃에서 1분동안 길이연장 반응을 32회 반복하는 조건으로 PCR 반응을 실시하였다. APP cDNA에는 아미노산 잔기의 갯수에 따라 세 가지 이성체, 즉 APP770, APP751 및 APP695가 존재한다. APP770을 기준으로 개방판독틀(open reading frame, ORF)의 크기는 약 2.3 kb이다. APP695와 APP751의 전체 길이 cDNA를 PCR 방법으로 증폭하여 서브클로닝(subcloning)한 후 DNA 염기서열 분석을 통해 PCR 증폭 과정에서 의도하지 않게 생긴 염기 치환의 착오가 없는 것을 최종적으로 확인하였다.

<1-2> APP751 돌연변이 유전자의 제조

APP751 cDNA에 PCR 방법으로 "Swedish" 이중 돌연변이(서열번호 2로 기재되는 APP770 이성체 아미노산을 기준으로 할 때 K670N, M671L 돌연변이)와 "V717F 돌연변이(서열번호 2로 기재되는 APP770 이성체를 기준으로 V717F 돌연변이)을 각각 도입하였다. 구체적으로 상기 두가지 돌연변이의 유도는 서열번호 8로 기재되는 app-swe 프라이머와 서열번호 9로 기재되는 app-717-r 프라이머 쌍 및 서열번호 10으로 기재되는 app717-f 프라이머와 서열번호 5로 기재되는 app-1r 프라이머 쌍을 사용하였으며, 95℃에서 1분 동안 열변성, 57℃에서 40초 동안 프라이머 결합, 72℃에서 1분동안 길이연장 반응을 32회 반복하는 조건으로 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 상기 두가지 돌연변이가 도입되어 제조된 서열번호 3으로 기재되는 APP751 돌연변이 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 APP751 돌연변이 유전자를 "APP(Sw, V717F)"라 명명하였다. 돌연변이된 APP(Sw, V717F) 유전자의 염기서열은 DNA 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

<실시예 2> APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트의 제조

알츠하이머성 치매 동물 모델을 생산하기 위해 APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트를 제조하였다. 구체적으로, 프로모터로는 PDGF-β유전자의 프로모터 유전자(1.55 kb)(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527)를 사용하였고, 수정란의 핵에 이식될 유전자로는 상기 실시예 1에서 제조한 APP(Sw, V717F) 유전자를 사용하였으며, 번역이 시작되는 ATG 코돈 앞에 코작 서열(Kozak sequence, GACC)을 삽입하여 번역 효율을 높이고자 하였다. 돌연변이 유전자의 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호를 위해 SV40-pA(SV40 late polyadenylation signal) 유전자(247 bp)는 pGK-neo-pA 벡터(Lee et al., J Neurosci, 2002, 15:7931-7940)로부터 분리하여 사용하였다. 돌연변이 유전자 뒷부분에 도입하였다. 최종적으로 PDGF-β프로모터-APP751(Sw, V717F)-pA의 순으로 발현 카세트를 제작하였으며, 이를 "PDGF-APP(Sw, V717F)-pA"라 명명하였다(도 1a).

<실시예 3> 인트론과 APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트의 제조

인트론(intron)은 돌연변이 유전자의 발현 효율을 증가시키고, 전사 안정도를 증가시킨다. 이에, 본 발명의 돌연변이 유전자를 보다 효율적으로 동물에 도입시키기 위해 인간 β-글로빈 유전자(human β-globin gene)로부터 유도된 인트론 B 유전자(918 bp)(Choi et al., Molecular and cellular biology, June 1991, 3070-3074; Palmiter et al., PNAS, 1991, 88:478-482)를 상기 실시예 2에서 제조한 발현용 카세트에 도입하였다. 구체적으로, 인간 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주 SH-SY5Y로부터 게노믹 DNA를 분리한뒤, 서열번호 11로 기재되는 hglob-f 프라이머와 서열번호 12로 기재되는 hglob-r 프라이머 쌍을 사용하여 인간 β-글로빈 유 전자의 인트론 B 유전자를 증폭하였다. 증폭된 인간 β-글로빈 유전자의 인트론 B 유전자 산물(918 bp)을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 서브클로닝하고, 이를 상기 실시예 2에서 제조한 PDGF-APP(Sw,V717F)-pA 발현용 카세트의 PDGF-β프로모터 유전자와 APP(Sw, V717F)유전자 사이에 삽입시켰다. 이렇게 제조된 형질전환용 발현벡터를 "PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA"라 명명하였다(도 1a).

<실시예 4> 형질전환동물 생산

상기 실시예 2에서 제조한 PDGF-APP(Sw,V717F)-pA 발현 카세트와 상기 실시예 3에서 제조한 PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA 발현 카세트를 제한효소 BssHⅡ로 절단하여 약 5.0 kb 크기의 선형화된 절단산물을 수득한뒤 근교배(inbred) C57BL/6 마우스의 수정란(fertilized egg)의 전핵(pronuclei)에 미세주입(microinjection)하였다. 주입된 수정란은 ICR 대리모 마우스의 난관(oviduct)으로 전달되었다. 본 발명에서 사용한 미세주입 방법과 같은 형질전환 동물 제작 과정은 일반적인 방법에 따라 수행하였다(Games et al., Nature, 1995; Hisao et al., Science, 1996).

<실시예 5> 돌연변이 유전자의 마우스 수정란의 핵 이식의 확인

상기 실시예 4에서 실시한 형질전환 동물 제작을 통해 출생한 자손(F1)의 꼬리로부터 게노믹 DNA를 분리한 뒤 게노믹 PCR 증폭을 통해 돌연변이 유전자의 수정란의 핵에 이식을 확인하였다. 구체적으로, 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손의 분석에는 서열번호 13으로 기재되는 APP(-intron)-f 프라이머와 서열번호 14로 기재되는 APP(-intron)-r 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭 반응을 실시하였으며, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손의 분석에는 서열번호 15로 기재되는 APP(+intron)-f 프라이머와 서열번호 16으로 기재되는 APP(+intron)-r 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭 반응을 실시하였다.

그 결과, 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도 입하여 출생한 자손은 총 43마리였으며, PCR 방법을 통해 19 마리가 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였고, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손은 총 8마리에서 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다.

다음으로, 서던 블랏 분석을 통해 본 발명의 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4에서 실시한 형질전환 동물 제작을 통해 출생한 자손(F1)의 꼬리로부터 게노믹 DNA를 분리한 뒤 15 ㎍의 게노믹 DNA를 제한효소 SpeI으로 절단하였다. 절단된 게노믹 DNA를 아가로즈 젤에 전기영동한뒤 나이트로셀룰로스 멤브레인에 전달시키고, APP cDNA의 C 말단 BglⅡ/SpeI 절편(320 bp)을 ³²P로 동위원소 표지시킨 프로브를 사용하여 혼성화반응을 실시한 뒤 X-ray 필름에 현상하였다.

그 결과, 상기 RT-PCR에서 분석한 바와 같이 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입한 마우스에서는 총 19 마리가 상기 발현 카세트가 도입되었고, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입한 마우스에서는 총 8마리에서 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다(도 1b).

<실시예 6> 수정란의 핵에 이식된 유전자의 발현 분석

본 발명에서 제조한 형질전환 동물에 APP 돌연변이 유전자가 도입되어 유전자가 발현하는지 확인하기 위해, 수정란의 핵에 이식이 확인된 마우스의 뇌로부터 전체 RNA를 분리한 뒤 노던블랏 분석을 하였다. 노던블랏 분석 방법은 이 등의 방법(Lee et al., J Neurosci, 2002, 15:7931-7940)에 따라 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4 및 실시예 5에서 돌연변이 APP 유전자가 수정란의 핵에 이식되었음을 확인한 4개월령 내지 5개월령 가량의 마우스 및 정상 마우스로부터 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA는 트리졸 용액(Trizol reagent)(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 분리하였으며, 분리한 30 ㎍의 전체 RNA를 1% 변성(denaturing) 아가로즈 젤(1% 아가로즈, 6.2% formaldehyde in 1 ㅧMOPS)에서 전기영동하였다. 전기영동된 아가로즈 젤의 RNA를 나이트로셀룰로스 멤브레인에 전달시킨 뒤 상기 실시예 5의 서던 블랏 분석에서 사용한 APP cDNA의 C 말단 BglⅡ/SpeI 절편(320 bp)을 ³²P로 동위원소 표지시킨 프로브를 사용하여 혼성화반응을 실시한 뒤 X-ray 필름에 현상하였다. 상기 프로브 DNA는 내부 APP 전사체(~3.5 kb) 및 돌연변이 APP 전사체(~2.6 kb)를 모두 인식할수 있는 프로브이다.

그 결과, 돌연변이 APP 유전자가 형질도입된 마우스는 내부 APP 유전자의 발현에 비해 돌연변이 APP 유전자의 전사체 발현이 2.6 ㅁ0.1배 정도 높게 나타났다. 또한, 인트론을 포함하지 않는 돌연변이 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손에 비해 인트론을 포함하는 돌연변이 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손은 돌연변이 APP 유전자의 발현이 훨씬 증가하였으며, 유전자 유도된 전사체의 안정도도 증가함을 확인하였다(도 1c). 이에, 높은 수준의 돌연변이 APP 유전자를 발현하는 형질전환 마우스(PDGF-intron- APP(Sw,V717F)-pA)를 이후의 실험에 사용하기로 하고 이 마우스를 "Tg-APP/B6"라 명명하였다.

또한, 상기 형질전환 마우스 Tg-APP/B6를 2004년 3월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10608BP).

<실시예 7> 형질도입된 유전자로부터 생산되는 단백질의 확인

상기 실시예 6에서 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 동물이 APP 돌연변이 유전자를 발현하는 것을 확인하여, 이렇게 발현된 유전자가 단백질로 생산되는지 확인하기 위해 4개월령 내지 5개월령의 Tg-APP/B6 마우스 및 대조군 정상 마우스의 뇌로부터 전체 단백질을 분리한 뒤 웨스턴 블랏 분석을 하였다. 웨스턴 블랏 분석은 이 등의 방법(Lee et al., Brain Res Mol Brain Res, 1999, 70:116-124)에 따라 수행하였다. 구체적으로, 마우스의 뇌조직을 적출한 뒤 1 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 프로테아제 억제제 칵테일(CompleteTM; Roche, Mannheim, Germany)를 포함하는 4℃에서 보관된 용해 완충액(50 mM Tris- HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트)에 넣어 균질화시켰다. 균질화된 뇌 샘플을 13,000 rpm에서 4℃로 20분동안 원심분리한 후 상등액을 수득하였다. 상등액에 포함된 단백질을 BCA 정량 킷트(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 측정하였다. 30 ㎍의 단백질을 아크릴아마이드 젤에 전기영동시킨 뒤 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전달시켰다. 단백질이 전달된 멤브레인은 5% 탈지분유, 2% BSA, 4% FBS, 4% 말형청 및 4% 염소 혈청을 포함하는 Tris-완충된 식염수 및 0.1% Tween 20에서 블라킹(blocking)시켰다. 돌연변이 APP 단백질의 생성을 확인하기 위한 항체로는 폴리클로날 또는 모노클로날 항-APP 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA)(폴리클로날 항체:51-2700, 모노클로날 항체:13-0200)를 사용하여 면역 반응시켰다. 상기 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 각각 인간 APP의 N 말단 및 C-말단을 인식하는 항체이다. 또한, 면역분석은 ECL 검출 시약(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하여 검출하였다.

그 결과, Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌에서는 약 120 kb 크기의 APP751 단백질이 검출되었다(도 2a). 또한, 본 발명의 돌연변이 유전자가 동형접합체로 삽입된 마우스(이하 "호모"라 약칭함) 및 이형접합체로 삽입된 마우스(이하 "헤테로"라 약칭함)의 돌연변이 유전자 도입 차이를 비교하기 위해 인간 APP의 Aβ부위에 특이적인 모노클로날 항체(6E10)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏 분석한 결과, 호모 돌연변이 마우스는 헤테로 돌연변이 마우스에 비해 2배 이상 APP 발현이 증가되었다(도 2b). 또한, 본 발명의 돌연변이 APP 유전자 도입에 의해 제조된 Tg-APP/B6 돌연변이 마우스의 뇌에서는 β-세크레타제(secretase) 및 α-세크레타제에 의해 절단된 C-말단 절편(각각 βCTF 및 αCTF)의 생산이 대조군 정상 마우스의 CTF에 비해 각각 2.55 ㅁ0.18배 및 2.3 ㅁ0.43배 증가하였다(도 2c).

<실시예 8> 형질전환 마우스의 면역조직학적 분석

면역조직학적 분석을 하기 위해 마우스는 0.9% 생리식염수로 상행 대동맥으로 환류시켰으며, 이어 4% 파라포름알데히드를 포함하는 0.1 M 인산 완충액(이하 "PB"라 약칭함, pH 7.4)을 환류시켰다. 이어, 뇌를 적출한 뒤 4℃에서 고정 용액에 고정시켰다. 고정된 뇌는 절단기(vibratome)를 이용하여 40 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 섹션(section)을 0.1 M PB(pH 7.4)에 녹여진 3% 과산화수소 용액에서 30분 동안 반응시키고, PB로 세척하였다. 세척된 섹션은 5% 정상 염소 혈청, 2% BSA, 2% FBS 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 용액에서 2시간동안 상온에서 블로킹시켰다. 블로킹 완충액에 일차 항체를 넣은뒤 4℃에서 밤새 반응시켰다. PB 용액으로 세척한 뒤 1:200배로 희석한 바이오틴화된 이차 항체를 넣고, 다음으로 1:100배로 희석한 아비딘 및 바이오틴화된 HRP 복합체(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 난 후 발색 반응을 유도하기 위해 0.05% 3.3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 및 0.001% 과산화수소를 포함하는 0.1 M Tris(pH 7.4) 용액을 처리하였다. 분석한 뇌조직으로는 대뇌피질(cerebral cortex, 이하 "CX"라 약칭함), CA1 내지 CA3 부위의 피라밋 세포(이하 "CA1" 내지 "CA3"라 약칭함), 해마(hipocampus, 이하 "HP"라 약칭함), 치상회(dentate gyrus, 이하 "DG"라 약칭함) 부위를 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 대뇌피질 및 해마 부위를 포함하는 뇌 전체에 APP751이 발현되었다(도 2d). 그러나, 12개월령 내지 18개월령 헤테로 형질전환 마우스 및 14개월령 헤테로 형질전한 마우스의 뇌에서는 확실한 플라그 유사 Aβ-침착을 확인할 수 없었다.

또한, 내부 APP 수준에 비해 약 5.6배의 APP를 발현하는 돌연변이 APP695를 발현하는 Tg2576 형질전환 마우스는 C57BL/6 근교배를 한 경우 출생후 150일이 되기 전에 사망하였다(Carlson et al., Hum Mol Genet, 1997, 6:1957-1959). 그러나, 본 발명의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 내부 APP 수준에 비해 각각 2.6배 및 5.2배 정도 높은 수준으로 APP를 발현하였다. 본 발명의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 상기 형질전환 마우스와 동일하게 C57BL/6 근교배를 하였으며, 대조군 정상 마우스에 비해 사산 확률이 높긴 하지만 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 83% 정도는 420일 까지도 생존하여 본 발명의 형질전환 동물이 동물모델로서 훨씬 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 9> 형질전환 마우스 뇌에서의 다른 단백질의 발현 변화 분석

돌연변이 APP 단백질의 도입에 의해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌에서 발현의 영향을 받은 단백질을 분석하고자 하였다. 이에, 상기 실시예 8에 기재된 조직면역학적 분석 방법과 동일하게 뇌의 CA1 내지 CA3 부위의 피라밋 세포(CA1 내지 CA3), 해마(HP), 치상회(dentate gyrus, DG) 부위를 사용하여 조직면역학적 분석을 하였다. 분석시 사용한 항체로는 항-칼빈딘(calbindin) 항체(C9848; Sigma, St. Louis, MO, USA), 항-파브알부민(parvalbumin)(P3088; Sigma, St. Louis, MO, USA), 항-칼레티닌(calretinin) 항체(AB5054; Chemi-Con, Temecula, CA, USA), 항-c-Fos 항체(sc-52; Santa Cruz Bio-Technology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다.

그 결과, 13개월령 내지 15개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 CA1 부위 및 DG 부위에서는 칼슘 결합 단백질인 칼빈딘의 발현량이 동일연령의 대조군 정상 마우스에 비해 감소하였다. 또한, 파브알부민과 칼레티닌의 발현은 Tg-APP/B6 형질전환 마우스와 대조군 정상 마우스의 HP 부위에서와 동일한 수준의 발현량을 보였다(도 3). 또한, c-Fos는 신경작용의 마커로 사용되는 초기 유전자로서 세포내부의 칼슘, 사이클릭 AMP 또는 다른 이차 메신저의 양이 증가함에 따라 뉴런에서 합성된다. 이러한, c-Fos의 발현은 대조군 정상 마우스에 비해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌 전체 부위에서 감소하는 경향을 보였다(도 4).

<실시예 10> 형질전환 마우스의 인지기능 분석

알츠하이머병 환자의 조직병리학적 특징은 (1) 세포외 세닐 플라그(extracellular senile plaques)의 침착, (2) 세포내 신경원 섬유 농축체(intracellular neurofibrillary tangle)의 형성, (3) 신경세포의 돌기 및 시냅스의 퇴화 및 신경세포의 소실 등을 들 수 있으며, 이와 같은 특징들은 조직학적 방법으로 검사 가능하다. 알츠하이머병의 또 다른 생리적 특징은 (4) 신경세포 소실에 따른 뇌기능의 상실이며, 특히 인지기능의 상실은 알츠하이머병의 가장 특징적이고 중요한 외형적, 임상적 증상으로 간주된다. 따라서, 가장 이상적인 알츠하이머병 치매 동물 모델이 갖추어야 할 부분은 세닐 플라그의 침착과 같은 조직학적 특징도 중요하지만 인지기능이 저하되는 특징을 보이는 것도 중요하다. 이에, 본 발명자들은 치매 모델의 후보 동물의 인기지능의 상실 유무를 판정하는데 사용하기 위하여 모리스 물 미로(Morris water maze) 테스트, 수동적 회피(passive avoidance) 테스트, 개방 범위(open field) 테스트 등을 적용하여 조사하였다.

인지기능 분석을 하기 위한 생쥐는 온도 및 습도 조절된 환경에서, 12시간 간격의 낮/밤 사이클(아침 7시에 점등)을 맞추어 주고 동물의 사육은 이화여자 의과대학의 동물 사육 지침에 따라 수행하였다. 컴퓨터화된 비디오-트래킹 시스템(SMART; Panlab S. I., Barcelona, Spain)을 사용하여 마우스의 행동을 평가하였다.

모든 실험을 수행하고 난뒤 2가지 샘플의 결과를 비교하기 위해서는 스튜던트 t-테스트를 수행하였고, 복합 비교를 하기 위해서는 단일 방향 ANOVA 테스트를 수행하고 뉴만-클(Newman-Keuls) 복합 범위 테스트를 뒤이어 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ㅁS.E.M.으로 나타내었고, 통계적 차이점은 다른 것이 표시되지 않는한 5% 수준에서 수용하였다.

<10-1> 개방 범위 테스트(Open field test)

이동성 능력은 흰색의 플렉시글라스(Plexiglas) 챔버(45 ㅧ45 ㅧ45 ㎝)의 개방 범위에서 측정하였다. 챔버의 조명은 70 럭스(lux)로 조정하였다. 마우스를 개방 범위에 노출시키기 30분 전에 동일한 환경에 위치하도록 하였다. 각 마우스는 개별적으로 개방 범위의 중앙에 위치하도록 하였으며 60분 동안 이동을 기록하였다. 수평적 이동 활동력은 마우스의 이동 거리를 통해 판단하였다. 내부 30% 범위는 중앙 부분으로 판단하였다.

그 결과, 본 발명의 13개월령의 호모(homozygous) 및 헤테로(heterozygous) Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 운동성이나 총 이동한 거리 등은 유사 연령의 대조군 정상 마우스와 큰 차이가 없었다(도 5a). 또한, 개방 범위의 중앙에 접근하는 정도(불안감에 대한 지표의 하나)의 경우도 큰 차이를 보이지 않았다.

<10-2> 로타-로드 테스트(Rota-rod test)

운동 조정 능력(motor coordination)과 운동 학습 능력(motor learning)은 로타-로드(rota-rod) 테스트를 통해 측정되었다. 로타-로드는 속도 조절기를 가지는 회전 실린더(직경: 4.5 ㎝)로 구성되어 있다. 마우스는 단단한 쥘수있는것(grip)이 제공되는 실린더의 맨 위에 위치시켰다. 로타-로드는 5 내지 20 rpm의 속도로 고정하여 회전시켰으며, 점진적으로 속도를 높이는 상태에 마우스를 놓이게 함으로써 테스트를 수행하게 하였다. 컷-오프(cut-off) 시간은 3분으로 하고, 내부의-시도 간격은 60분으로 하였다. 떨어지지 않고 로드에서 머무르는 시간의 지속을 측정하였다.

그 결과, 11개월령의 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 15 rpm 이상의 빠른 속도에서는 오랫동안 머무르지 못하였다(도 5b).

<10-3> 모리스 물 미로 테스트(Morris water maze test)

모리스 물 미로 테스트는 먼 거리의 자극 및 숨겨진 탈출 플랫폼 사이의 관계를 학습하고 기억하는 동물의 능력에 의존하는 해마-의존적 수행방법이다(Morris et al., 1982, Nature, 297, 701). 즉, 모리스 물 미로 테스트는 마우스가 강제 수영을 하거나 플랫폼에 안착하여 있는 동안 기억한 주변의 공간적인 지표를 이용하여 플랫폼의 위치를 얼마나 빨리 찾는지를 측정함으로써 마우스의 공간인지 능력을 플랫폼을 찾기까지 수영하는 동안 운동한 거리 또는 시간을 측정하여 정량적으로 비교하는 방법이다. 이 경우 필요에 따라 마우스가 물통에 진입하는 위치를 바꾸기도 하며, 기존에 위치하던 좌표에서 다른 좌표로 플랫폼의 위치를 변화시키고 공간적인 지표의 위치를 그대로 둔 채 기억력의 검색만을 할 수 있다. 구체적으로, 물 미로 기구는 90 ㎝ 직경의 실린더 풀(pool)로 구성되어 있으며, 풀에는 22℃의 우유를 푼 물을 채워 육안으로는 보이지 않게 하였다. 불투명한 물의 표면으 로부터 사분원(quadrant)의 1.5 ㎝ 아래에 10 ㎝ 직경의 플랫폼을 숨겨두었다. 풀은 수많은 조건의 환경 및 창문, 의자 및 포스터를 포함하는 인위적 암시(cue)를 가지는 방에 위치시켰다. 매일의 테스트 과정에서, 마우스는 각각의 사분면에 성공적으로 도달하도록 하였고, 최대 90초 동안 수영하도록 하였다. 플랫폼에 도착하면, 마우스는 다음 훈련을 시작하기 전까지 플랫폼에서 30초 동안 쉬도록 허락하였다. 상기 두 개의 각 훈련에서 플랫폼을 찾기까지의 잠복기 및 훈련의 평균을 기록하였다.

그 결과, 7개월령의 대조군 정상 마우스는 모리스 물 미로에 있는 숨겨진 플랫폼의 위치하는 좌표를 인식할 수 있었으며, 이러한 과업은 훈련의 횟수에 비례하여 인식 능력이 증가하였다. 7개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 경우 모리스 물 미로에 있는 숨겨진 플랫폼이 위치하던 좌표를 인식하는 능력이 대조군 정상 마우스와 동일하게 나타났다(도 6a). 그러나, 14개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 마우스에 비해 좌표를 인식하는 시간이 많 이 지체되었다(도 6b).

또한, 7개월령 및 14개월령의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 수영 속도는 대조군 마우스와 차이가 없었다(도 6c 및 도 6d). 따라서, 상기 결과를 통해 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 나이-의존적으로 인지능력의 결함이 증가함을 알 수 있었다.

<10-4> 상승된 플러스 미로 테스트(Elevated plus maze test)

인간 알츠하이머 질환 환자의 가장 문제가 되는 증상의 하나는 불안감이 증가한다는 것이다(Folstein and Bylsma, 1999, Alzheimer Disease(Eds by Terry et al.,) 2nd. Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia). 이에, 본 발명자들은 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 불안감이 APP 돌연변이 유전자의 도입에 의해 변화하는 것인지 확인하고자 하였다. 상승된 플러스 미로 테스트는 검은 플렉시글라스로 만들었다. 미로 장치는 오른쪽 모서리에서 하나의 다른쪽 방향으로 네 개의 통로(arms)(30 ㅧ7 ㎝)를 위치시켰으며, 이는 바닥으로부터 50 ㎝ 위쪽에 위치시켰 다. 두 개의 통로는 20 ㎝의 높은 벽을 가지고 있었으며(닫혀진 통로), 나머지 두 개는 벽을 가지고 있지 않았다(열려진 통로). 중심에서의 밝기는 40 럭스(lux)로 맞춰두었다. 테스트를 하기위해, 마우스는 처음에는 플랫폼의 중앙에 위치시켰으며 5분동안 통로를 경험하게 하였다. 열려진 지역과 닫혀진 지역에 진입하는 횟수와 진입하는데 걸리는 시간의 퍼센트를 기록하였다. 마우스가 모든 네 개의 발로 각각의 섹터(sector)로 들어가는 일(event)로서 각각의 통로로의 진입을 점수화하였다.

그 결과, 7개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 정상 마우스와 유사하게 열려진 통로 및 닫혀진 통로에서의 과업 수행을 하였다(도 7a 및 도 7b). 그러나, 13개월령의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 정상 마우스에 비해 열려진 통로로 진입하는데 시간이 많이 지체되었고, 닫혀진 통로에서 보내는 시간이 많아졌다(도 7c 및 도 7d). 따라서, 이를 통해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 증가된 불안감을 나타 냄을 알 수 있었다.

<10-5> 수동적 회피 테스트(Passive avoidance test)

마우스는 어두운 곳을 선호하는 성질이 있어 밝은 챔버와 어두운 챔버 중 하나를 선택하게 하면 재빠르게 어두운 챔버로 이동해 가게 된다. 마우스가 밝은 챔버에 있다가 어두운 챔버로 이동해 간 후 강한 전기 자극을 주고(즉, 훈련 후) 다시 밝은 챔버와 어두운 챔버 중 하나를 선택하게 하면 정상 동물의 경우 좋아하는 어두운 챔버로 들어가지 않고 계속 싫어하지만 전기자극이 없었던 밝은 챔버에 남으려는 행동을 보인다. 이와 같이 수동적 회피 테스트를 통한 인지기능의 측정은 밝은 챔버와 어더운 챔버라는 공간적 정보와 전기자극이라는 사건을 연계시키는 학습 및 기억이 유지되는지를 측정하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 수동적 회피 테스트는 밝은 챔버와 어두운 챔버(각각의 용적은 15 ㅧ15 ㅧ15 ㎝)로 구성되어 있으며, 두 개의 챔버 사이에 있는 복도와 문에는 쇼크-격자를 장치시켰다. 첫 번째 테스트 날 동안, 각 마우스는 밝은 챔버 에 놓아 두었으며, 밝은 방 및 어두운 방을 찾을수 있게 하기 위해 각 챔버에서 5분동안 경험하게 하였다. 두 번째 날, 마우스는 밝은 챔버에 놓아 두었다. 30초 후에 중간 문을 연뒤에 마우스가 어두운 챔버에 들어가는데까지 지체되는 시간을 측정하였다. 마우스가 어두운 방에 들어가게 되면, 문을 닫아 버리고 격자-바닥을 통해 연속적인 전기 발바닥-쇼크(100 V, 0.3 mA, 2초)를 전달시켰다. 훈련을 시킨 다음, 마우스는 살고있던 케이지로 되돌려 주었다. 24시간 후에 각각의 마우스는 다시 밝은 챔버에 놓아 두었으며, 어두운 챔버로 들어가는데 지체되는 시간을 측정하였다.

그 결과, 13개월령의 대조군 정상 마우스의 경우는 훈련을 하고 난 후 어두운 챔버로 이동하는 것을 강하게 억제하는데 비하여, 13개월령의 본 발명의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 훈련을 하고 난 후에도 어두운 챔버로 이동하는 것을 억제시키지 못하였다(도 7e 및 도 7f). 또한, 13개월령의 본 발명의 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스도 상기 헤테로 마우스와 동일하게 인지능력이 떨어지는 결 과를 나타내었다.

<실시예 11> 불안증상을 나타내는 매커니즘 분석

<11-1> 마이크로어레이(Microarray) 분석

상기 실시예 10을 통해 본 발명의 형질전환 마우스는 불안 증상을 나타냄을 확인하였다. 이에, 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 나타내는 증가하는 불안 증상에 필수적인 작용 메커니즘을 확인하기 위해 형질전환 마우스의 소뇌편도(amyglada)에서 유도되는 게노믹 DNA 상의 변화를 마이크로어레이 분석으로 조사하였다. 본 발명에서 사용한 cDNA 마이크로어레이 칩으로는 14,000개의 마우스 유전자(알려진 유전자: 9,052개)를 포함하는 cDNA 마이크로어레이 칩(Digital Genomics, Seoul, Korea)을 사용하였다. 본 발명의 형질전환 마우스 5마리와 대조군 정상 마우스 5마리로부터 각각 소뇌편도를 제거한 뒤 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 마이크로어레이 분석에 사용할 샘플로는 각각의 마우스로부터 분리한 전체 RNA 15 ㎍을 사용하였다. 아미노알릴(aminoallyl)-dUTP(Sigma, Mo, USA)는 형 광염료를 이용하여 RNA 샘플을 간접적으로 표지시키는데 사용하였다. Cy3/Cy5 형광염료(AmershamPharmacia, NJ, USA) 표지 및 혼성화 반응은 제조사의 방침에 따라 수행하였다(Digital Genomics, Seoul, Korea). Cy3 및 Cy5에 의해 표지된 프로브(probe)를 사용하여 혼성화된 후 나타나는 신호는 스캔어레이(ScanArray 3.0; Packard, USA)를 사용하여 532 nm 및 635 nm에서 측정하였다. 신호가 나타난 이미지 데이터는 진픽스 프로(GenePix Pro 4.0; Axon Instrument, Inc., CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 대조군 정상 마우스와 본 발명의 돌연변이 마우스의 샘플 사이에서 나타나는 유전자의 발현 변화 차이 분석은 하 등의 방법(Ha et al., Toxicol Lett, 2003)에 따라 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 형질전환 마우스의 소뇌편도에서는 대조군 정상 마우스의 소뇌편도에 비해 TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제(T-LAK cell-originated protein kinase), 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1(hematopoietic cell specific Lyn substrate 1), 스태니오칼신(staniocalcin), 칼모듈린 4(calmodulin 4), 사이토크롬 c(cytochrome c), 17형 프로콜라겐 알파 1(type ⅩⅦ procollagen alpha 1), 프로미닌 1(prominin 1) 및 트랜스티래틴(transthyretin)의 발현이 2배 이상 증가하였다. 반면, X-(불활성)-특이적 전사(X-(inactive)-specific transcript), 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 합성효소 1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1), 크룩 넥-유사 1(crooked neck-like 1), 디스트로핀-연관된 당단백질 알파-사코글리칸(dystrophin-associated glycoprotein alpha-sarcoglycan), 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6(chemokine(C-C motif) ligand 6), 인테그린 알파 Ⅴ(integrin alpha Ⅴ), 큘린 4B(cullin 4B), 클로토(klotho), 사이클린 F(cyclin F), 아미노산 N-아실트랜스퍼라제(amino acid N-acyltransferase) 및 프로스타글란딘 D2 합성효소(prostaglandin D2 synthase)의 발현은 대조군 정상 마우스에 비해 감소하였다.

<11-2> RT-PCR을 통한 발현 변화 유전자의 확인

상기 실시예 <11-1>에서 분석한 마이크로어레이 분석 결과를 다시한번 확인 하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 13개월령의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 및 같은 연령의 대조군 정상 마우스의 소뇌편도로부터 전체 RNA를 분리하였다. TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 트랜스티래틴, X-(불활성)-특이적 전사, 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6 및 큘린 4B를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 당업자에게 공지된 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. RNA의 량을 정량하기 위해 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 형질전환 마우스는 TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 트랜스티래틴의 발현량이 정상 마우스에 비해 증가하였고, X-(불활성)-특이적 전사, 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6 및 큘린 4B의 발현량이 정상 마우스에 비해 감소하여 상기 실시예 <11-1>의 마이크로어레이 분석결과와 동일하게 나왔다(도 8).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 인지능력 감소, 기억력 감소 및 불안감 증가와 같은 알츠하이머병의 임상적 특징을 나타내어 알츠하이머병 모델 동물로서 유용함을 알 수 있다.

<110> EWHA HAKDANG INCOPORATED EDUCATIONAL INSTITUTION <120> Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP <130> 3p-10-32 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3579 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(3579) <223> Homo sapiens amyloid beta precursor protein(APP) complete cds <400> 1 agtttcctcg gcagcggtag gcgagagcac gcggaggagc gtgcgcgggg gccccgggag 60 acggcggcgg tggcggcgcg ggcagagcaa ggacgcggcg gatcccactc gcacagcagc 120 gcactcggtg ccccgcgcag ggtcgcgatg ctgcccggtt tggcactgct cctgctggcc 180 gcctggacgg ctcgggcgct ggaggtaccc actgatggta atgctggcct gctggctgaa 240 ccccagattg ccatgttctg tggcagactg aacatgcaca tgaatgtcca gaatgggaag 300 tgggattcag atccatcagg gaccaaaacc tgcattgata ccaaggaagg catcctgcag 360 tattgccaag aagtctaccc tgaactgcag atcaccaatg tggtagaagc caaccaacca 420 gtgaccatcc agaactggtg caagcggggc cgcaagcagt gcaagaccca tccccacttt 480 gtgattccct accgctgctt agttggtgag tttgtaagtg atgcccttct cgttcctgac 540 aagtgcaaat tcttacacca ggagaggatg gatgtttgcg aaactcatct tcactggcac 600 accgtcgcca aagagacatg cagtgagaag agtaccaact tgcatgacta cggcatgttg 660 ctgccctgcg gaattgacaa gttccgaggg gtagagtttg tgtgttgccc actggctgaa 720 gaaagtgaca atgtggattc tgctgatgcg gaggaggatg actcggatgt ctggtggggc 780 ggagcagaca cagactatgc agatgggagt gaagacaaag tagtagaagt agcagaggag 840 gaagaagtgg ctgaggtgga agaagaagaa gccgatgatg acgaggacga tgaggatggt 900 gatgaggtag aggaagaggc tgaggaaccc tacgaagaag ccacagagag aaccaccagc 960 attgccacca ccaccaccac caccacagag tctgtggaag aggtggttcg agaggtgtgc 1020 tctgaacaag ccgagacggg gccgtgccga gcaatgatct cccgctggta ctttgatgtg 1080 actgaaggga agtgtgcccc attcttttac ggcggatgtg gcggcaaccg gaacaacttt 1140 gacacagaag agtactgcat ggccgtgtgt ggcagcgcca tgtcccaaag tttactcaag 1200 actacccagg aacctcttgc ccgagatcct gttaaacttc ctacaacagc agccagtacc 1260 cctgatgccg ttgacaagta tctcgagaca cctggggatg agaatgaaca tgcccatttc 1320 cagaaagcca aagagaggct tgaggccaag caccgagaga gaatgtccca ggtcatgaga 1380 gaatgggaag aggcagaacg tcaagcaaag aacttgccta 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tcatggtggg cggtgttgtc 2280 atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 2340 catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 2400 atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaactag 2460 acccccgcca cagcagcctc tgaagttgga cagcaaaacc attgcttcac tacccatcgg 2520 tgtccattta tagaataatg tgggaagaaa caaacccgtt ttatgattta ctcattatcg 2580 ccttttgaca gctgtgctgt aacacaagta gatgcctgaa cttgaattaa tccacacatc 2640 agtaatgtat tctatctctc tttacatttt ggtctctata ctacattatt aatgggtttt 2700 gtgtactgta aagaatttag ctgtatcaaa ctagtgcatg aatagattct ctcctgatta 2760 tttatcacat agccccttag ccagttgtat attattcttg tggtttgtga cccaattaag 2820 tcctacttta catatgcttt aagaatcgat gggggatgct tcatgtgaac gtgggagttc 2880 agctgcttct cttgcctaag tattcctttc ctgatcacta tgcattttaa agttaaacat 2940 ttttaagtat ttcagatgct ttagagagat tttttttcca tgactgcatt ttactgtaca 3000 gattgctgct tctgctatat ttgtgatata ggaattaaga ggatacacac gtttgtttct 3060 tcgtgcctgt tttatgtgca cacattaggc attgagactt caagcttttc tttttttgtc 3120 cacgtatctt tgggtctttg ataaagaaaa gaatccctgt tcattgtaag cacttttacg 3180 gggcgggtgg ggaggggtgc tctgctggtc ttcaattacc aagaattctc caaaacaatt 3240 ttctgcagga tgattgtaca gaatcattgc ttatgacatg atcgctttct acactgtatt 3300 acataaataa attaaataaa ataaccccgg gcaagacttt tctttgaagg atgactacag 3360 acattaaata atcgaagtaa ttttgggtgg ggagaagagg cagattcaat tttctttaac 3420 cagtctgaag tttcatttat gatacaaaag aagatgaaaa tggaagtggc aatataaggg 3480 gatgaggaag gcatgcctgg acaaaccctt cttttaagat gtgtcttcaa tttgtataaa 3540 atggtgtttt catgtaaata aatacattct tggaggagc 3579 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(770) <223> Homo sapiens amyloid beta precursor protein <400> 2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 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Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 3 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(770) <223> APP mutant protein represented by APP(Swe,V717F) <220> <221> MUTAGEN <222> (670)..(671) <223> 670th amino acid K mutated to N and 671th amino acid M mutated to L <220> <221> MUTAGEN <222> (717) <223> 717th amino acid V mutated to F <400> 3 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 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Claims

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PDGF-β프로모터 유전자, 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 돌연변이 유전자 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환벡터(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-polyA).
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제 4항의 형질전환용 발현벡터를 도입하여 제조한 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스(Tg-APP/B6)(수탁번호: KCTC 10608BP).
제 6항의 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스는 알츠하이머병의 임상적 특징인 운동성의 감소, 기억력 및 인지능력의 소실, 불안증세의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스.