RU2266002C2 - Method for obtaining animal being distinct against a man with a certain mutated gene, method for testing substance to be applied for treating alzheimer's disease (variants), plasmid (variants), method for obtaining primary cell culture or subcultivated cell - Google Patents
Method for obtaining animal being distinct against a man with a certain mutated gene, method for testing substance to be applied for treating alzheimer's disease (variants), plasmid (variants), method for obtaining primary cell culture or subcultivated cell Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266002C2 RU2266002C2 RU2000120677/13A RU2000120677A RU2266002C2 RU 2266002 C2 RU2266002 C2 RU 2266002C2 RU 2000120677/13 A RU2000120677/13 A RU 2000120677/13A RU 2000120677 A RU2000120677 A RU 2000120677A RU 2266002 C2 RU2266002 C2 RU 2266002C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- presenilin
- amino acid
- gene
- animal
- mutant
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 114
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 39
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 claims description 152
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 116
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 claims description 103
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 78
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 78
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 69
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 56
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 54
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 34
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 claims description 23
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 claims description 13
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 11
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006399 behavior Effects 0.000 claims description 4
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 4
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 4
- 101100433464 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) BA71V-013 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 claims description 3
- 102200001906 rs104894322 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200136864 rs397516183 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058102 rs63749824 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058106 rs63749967 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058176 rs63750004 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058165 rs63750306 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058168 rs63750306 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058149 rs63750322 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058147 rs63750353 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058144 rs63750522 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058131 rs63750601 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058143 rs63750800 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058150 rs63751106 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200058156 rs63751272 Human genes 0.000 claims description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 2
- 102200061530 rs63749835 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061617 rs63749836 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061486 rs63749925 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061599 rs63750053 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200058123 rs63750450 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200058171 rs63750590 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061473 rs63750646 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061611 rs63750799 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061538 rs63750900 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061493 rs63751223 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061615 rs63751309 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200061470 rs63751416 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims 1
- -1 isoleucine amino acid Chemical class 0.000 claims 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 102200017280 rs267606661 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061590 rs63749885 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061540 rs63750301 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061534 rs63750526 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061543 rs63750543 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061532 rs63751163 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061544 rs63751229 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061526 rs63751420 Human genes 0.000 claims 1
- 102200061469 rs661 Human genes 0.000 claims 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 84
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 67
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 57
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 46
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 30
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 24
- 102100022036 Presenilin-2 Human genes 0.000 description 22
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 17
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 16
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 16
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 15
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 15
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 15
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 15
- 108091007270 mouse presenilin 1 Proteins 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 101000617546 Homo sapiens Presenilin-2 Proteins 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 101150089079 PS1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 3
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 3
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N (3r,4s,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC=O VRYALKFFQXWPIH-PBXRRBTRSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 101100074828 Caenorhabditis elegans lin-12 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100478118 Caenorhabditis elegans spe-4 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N alpha-D-ara-dHexp Natural products OCC1OC(O)CC(O)C1O PMMURAAUARKVCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 101150036876 cre gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 101150079312 pgk1 gene Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102400000269 Amyloid protein A Human genes 0.000 description 1
- 101710144835 Amyloid protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 101100465890 Caenorhabditis elegans sel-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 101150115433 SLC26A5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 1
- 210000000625 blastula Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000037308 hair color Effects 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 102000055060 human PSEN1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001682 neurofibril Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102220288729 rs1553826739 Human genes 0.000 description 1
- 102200061580 rs17125721 Human genes 0.000 description 1
- 102200061553 rs63750231 Human genes 0.000 description 1
- 102200061555 rs63750231 Human genes 0.000 description 1
- 102200061547 rs63751139 Human genes 0.000 description 1
- 102200061551 rs63751235 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 101150112575 sel-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение касается трансгенных животных. Более конкретно, настоящее изобретение касается животного, трансгенного по пресенилину, содержащего внесенный мутантный ген пресенилина, обусловливающий болезнь Альцгеймера у человека.The invention relates to transgenic animals. More specifically, the present invention relates to an animal transgenic for presenilin containing the introduced mutant presenilin gene causing human Alzheimer's disease.
Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Симптомом болезни Альцгеймера является прогрессирующее слабоумие. Ее патогистология характеризуется возникновением огромного количества сенильных бляшек в головном мозге и нарастающей дегенерацией нейрофибрилл в нейронах. Данное заболевание является нейродегенеративным, при котором нейроны постепенно гибнут. Как правило, болезнь Альцгеймера развивается в пожилом возрасте, а ее встречаемость растет со старением. В настоящее время надежное лечение болезни Альцгеймера невозможно. Следовательно, с точки зрения подготовки к резкому возрастанию пожилого населения в будущем желательной является как можно скорейшая разработка способов терапевтического и профилактического лечения болезни Альцгеймера и разработка эффективного лекарственного средства, предназначенных для профилактического и терапевтического лечения данного заболевания.A symptom of Alzheimer's is progressive dementia. Its pathology is characterized by the occurrence of a huge number of senile plaques in the brain and increasing degeneration of neurofibrils in neurons. This disease is neurodegenerative, in which neurons gradually die. As a rule, Alzheimer's disease develops in old age, and its incidence increases with aging. Reliable treatment for Alzheimer's is currently not possible. Therefore, from the point of view of preparation for a sharp increase in the elderly population in the future, it is desirable to develop as soon as possible the methods of therapeutic and prophylactic treatment of Alzheimer's disease and the development of an effective drug intended for the prophylactic and therapeutic treatment of this disease.
Сенильная бляшка является отложением вещества вне нейронов, состоящим из различных компонентов, а их основным компонентом является пептид, состоящий из 39-42 аминокислотных остатков, называемый β-амилоидным белком (Аβ). Амилоидный белок-предшественник (АРР) расщепляется с участием протеаз, которые предположительно называют β-секретазой и γ-секретазой, в результате чего образуется зрелый β-амилоидный белок. В сенильной бляшке β-амилоид откладывается в виде регидного образования, обладающего β-складчатой структурой. Такая сенильная бляшка вначале образуется в виде пятноподобного отложения, называемого диффузной сенильной бляшкой. На этом этапе нейродегенеративные процессы еще не происходят. Считается, что по мере того, как диффузная сенильная бляшка превращается в более жесткое отложение, происходит и дегенерация или гибель нейронов, в результате чего проявляются такие симптомы болезни Альцгеймера, как деменция. Существуют Аβ40, состоящий из 40 аминокислотных остатков, и Аβ42, состоящий из 42 аминокислотных остатков, такой как амилоид β. Большая часть амилоида-β, вырабатываемого клетками, представлена изоформой Аβ40, и при этом присутствует лишь небольшое количество Аβ42. Однако Аβ42 характеризуется свойствами более интенсивной агрегируемости, и, таким образом, Аβ42 играет более выраженную роль в образовании сенильной бляшки по сравнению с Аβ40 (Tamaoka, Naika, Intern. Med., vol. 77, P843, 1996).Senile plaque is a deposition of matter outside neurons that consists of various components, and their main component is a peptide consisting of 39-42 amino acid residues, called the β-amyloid protein (Aβ). Amyloid precursor protein (APP) is cleaved with the participation of proteases, which are supposedly called β-secretase and γ-secretase, resulting in the formation of mature β-amyloid protein. In the senile plaque, β-amyloid is deposited in the form of a solid formation with a β-folded structure. Such a senile plaque is initially formed in the form of a stain-like deposit called a diffuse senile plaque. At this stage, neurodegenerative processes do not yet occur. It is believed that as the diffuse senile plaque becomes more severe deposition, degeneration or death of neurons also occurs, resulting in symptoms of Alzheimer's disease such as dementia. There are Aβ40, consisting of 40 amino acid residues, and Aβ42, consisting of 42 amino acid residues, such as amyloid β. Most of the amyloid-β produced by the cells is represented by the Aβ40 isoform, and only a small amount of Aβ42 is present. However, Aβ42 is characterized by more intensive aggregation properties, and thus Aβ42 plays a more pronounced role in the formation of senile plaque compared to Aβ40 (Tamaoka, Naika, Intern. Med., Vol. 77, P843, 1996).
При болезни Альцгеймера имеет место семейное развитие по аутосомно-доминантному типу наследования. Ген, который был в 1991 году первым идентифицирован в качестве гена, обусловливающего семейную манифестацию болезни Альцгеймера, - это мутантный ген АРР: этот ген локализован в 21 хромосоме, а в аминокислотной последовательности мутация обусловливала замену валина на изолейцин в 717-м положении (A.Goate et al., 1991, Nature, vol. 349, p.704).In Alzheimer's disease, there is a family development in an autosomal dominant mode of inheritance. The gene that was first identified in 1991 as the gene for the familial manifestation of Alzheimer's disease is the mutant APP gene: this gene is located on chromosome 21, and in the amino acid sequence, the mutation led to the replacement of valine with isoleucine at position 717 (A. Goate et al., 1991, Nature, vol. 349, p. 704).
В качестве причины, как причины болезни Альцгеймера, были идентифицированы и другие мутанты АРР такие как обусловливающие замену указанного аминокислотного остатка в положении 717 на фенилаланин (J.Murrell et al., 1991, Science, vol. 254, р.97); обусловливающие замену аминокислотного остатка в том же положении на глицин (Chartier, Harlin et al., 1991, Nature, vol. 353, p.844); обусловливающие замену двух аминокислотных остатков - лизин - метионин на аспарагин-лейцин (M.Mullan et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p.345); и обусловливающие замену аланина на глицин в 692-м положении (L.Hendrisk et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p.218), и подобные.As a cause, as causes of Alzheimer's disease, other APP mutants have also been identified, such as causing a replacement of the indicated amino acid residue at position 717 with phenylalanine (J. Murrell et al., 1991, Science, vol. 254, p. 97); causing the replacement of the amino acid residue in the same position with glycine (Chartier, Harlin et al., 1991, Nature, vol. 353, p.844); causing the replacement of two amino acid residues - lysine - methionine with asparagine-leucine (M. Mullan et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p. 345); and causing the substitution of alanine for glycine at position 692 (L. Hendrisk et al., 1992, Nature Genet., vol. 1, p. 218), and the like.
В 1993 году сообщалось что аполипопротеин-Е (аро Е), является этиологическим фактором или фактором риска развития семейной болезни Альцгеймера. У пациентов с болезнью Альцгеймера аллель ароЕ4, в котором аминокислотный остаток в положении 112 представляет собой аргинин, и аминокислотный остаток в положении 158 представляет собой аргинин, идентифицируется с существенно большей частотой по сравнению со здоровыми лицами среди других аллелей ароЕ, гены которых локализованы в 19 хромосоме (E.H.Corder et al., 1993, Science, vol. 261, p.921).In 1993, it was reported that apolipoprotein-E (apo E) is an etiological factor or risk factor for the development of familial Alzheimer's disease. In patients with Alzheimer's disease, the apoE4 allele, in which the amino acid residue at position 112 is arginine, and the amino acid residue at position 158 is arginine, is identified with a significantly higher frequency compared to healthy individuals among other apoE alleles whose genes are located on chromosome 19 (EH Corder et al., 1993, Science, vol. 261, p. 921).
После этого мутация в гене «пресенилина-1» (PS1, исходно обозначавшегося как S182), картированном в 14 хромосоме (R.Sherrington et al., 1995, vol. 375, р. 754), и мутация в гене «пресенилина-2» (PS2, исходно обозначавшегося как Е5-1 или STM-2), картированном в 1 хромосоме (B.Sherrington et al.. Nature, 1995, vol. 375, р. 754), были в 1995 году идентифицированы как новые гены, вызывающие болезнь Альцгеймера (в данной заявке каждый из этих генов определен как «ген пресенилина-1» и «ген пресенилина-2», соответственно, а каждый из продуктов этих генов обозначается как «белок пресенилин-1» и «белок пресенилин-2», или «PS1» и «PS2», соответственно).After that, the mutation in the presenilin-1 gene (PS1, originally designated as S182) mapped to chromosome 14 (R. Sherrington et al., 1995, vol. 375, p. 754), and the mutation in the presenilin-2 gene "(PS2, originally designated E5-1 or STM-2) mapped to chromosome 1 (B. Sherrington et al .. Nature, 1995, vol. 375, p. 754), were identified in 1995 as new genes, causing Alzheimer's disease (in this application, each of these genes is defined as “presenilin-1 gene” and “presenilin-2 gene,” respectively, and each of the products of these genes is designated as “presenilin-1 protein” and “protein presenilin in-2 ", or" PS1 "and" PS2 ", respectively).
Белок пресенилин-1 и белок пресенилин-2, состоящие, соответственно, из 467 и 448 аминокислотных остатков, включают семи- или восьмискладчатую трансмембранную структуру: следовательно, они предположительно являются мембранными белками. Гомология этих двух белков на уровне аминокислотных последовательностей существенна - 67% общей и 84% только по трансмембранным доменам. Что касается функций пресенилин-1, существует предположение, что функции данного белка схожи с таковыми белка sel-12 нематоды или с белка SPE-4, на что указывает высокая гомология данных белков. Белок SPE-4 участвует в процессах сперматогенеза у нематоды, и предполагается, что он вовлечен в транспортировку и запасание белков.The presenilin-1 protein and presenilin-2 protein, consisting of, respectively, 467 and 448 amino acid residues, include a seven- or eight-folded transmembrane structure: therefore, they are presumably membrane proteins. The homology of these two proteins at the level of amino acid sequences is significant - 67% of the total and 84% only for transmembrane domains. Regarding the functions of presenilin-1, there is an assumption that the functions of this protein are similar to those of the sel-12 nematode protein or the SPE-4 protein, as indicated by the high homology of these proteins. The SPE-4 protein is involved in the processes of spermatogenesis in the nematode, and it is assumed that it is involved in the transportation and storage of proteins.
Соответственно, считается, что пресенилин-1, по-видимому, участвует в процессинге мембранных белков, таких как АРР, аксоплазматическом транспорте и слиянии мембранных пузырьков с мембранами. Для гена sel-12 было установлено, что он устраняет эмбриональную аномалию, вызванную мутацией lin-12, которая подавляет развитие нематоды. Считается, что lin-12 вовлечен в межклеточную передачу сигнала, следовательно, также существует предположение, что белок пресенилин-1 участвует в определенной стадии внутриклеточной передачи сигналов.Accordingly, presenilin-1 is thought to be involved in the processing of membrane proteins such as APP, axoplasmic transport, and the fusion of membrane vesicles with membranes. For the sel-12 gene, it was found that it eliminates the embryonic abnormality caused by the lin-12 mutation, which inhibits the development of the nematode. It is believed that lin-12 is involved in intercellular signal transduction; therefore, there is also an assumption that the presenilin-1 protein is involved in a certain stage of intracellular signal transduction.
В первом же описании белка пресенилин-1 было указано на то, что мутации, обусловливающие проявление семейной болезни Альцгеймера, являются заменами аминокислотных остатков по пяти положениям. После этого сообщения гены, мутантные по различным их участкам, были идентифицированы во многих семьях с диагнозом семейной болезни Альцгеймера, включая OS-2 (замена изолейцина на треонин в 213-м положении) и OS-3 (замена валина на фенилаланин в 96-м положении), причем обе эти мутации описаны авторами настоящего изобретения (K.Kamino et al., 1996, Neurosci. Lett., vol. 208, р.195), а к настоящему времени известно более 40 различных вариантов аминокислотных замен более чем по 30 положениям (Hardy, 1997, TINS, vol. 20, р.154).In the very first description of the protein presenilin-1, it was pointed out that the mutations causing the manifestation of Alzheimer's familial disease are substitutions of amino acid residues at five positions. After this report, mutant genes at various sites were identified in many families with a diagnosis of Alzheimer's familial disease, including OS-2 (replacing isoleucine with threonine at position 213) and OS-3 (replacing valine with phenylalanine at 96 position), both of these mutations described by the authors of the present invention (K. Kamino et al., 1996, Neurosci. Lett., vol. 208, p. 195), and to date, more than 40 different variants of amino acid substitutions are known in more than 30 regulations (Hardy 1997, TINS, vol. 20, p. 154).
В настоящее время 70-80%. случаев семейной болезни Альцгеймера, как считается, обусловливается мутациями в белке пресенилин-1. Сообщалось о мутациях мутации по двум сайтам белка пресенилин-2. Как объяснялось выше, генетический анализ подтвердил, что мутации пресенилин-1 и пресенилин-2 самым непосредственным образом вовлечены в этиологию семейной болезни Альцгеймера.Currently 70-80%. cases of familial Alzheimer's disease are thought to be due to mutations in the presenilin-1 protein. Mutation mutations were reported at two sites of the presenilin-2 protein. As explained above, genetic analysis has confirmed that mutations of presenilin-1 and presenilin-2 are most directly involved in the etiology of familial Alzheimer's disease.
Механизмы, по которым мутантные белки пресенилин-1 и пресенилин-2 вызывают начало болезни Альцгеймера, в настоящее время интенсивно изучаются. Было сообщено, что белок AJ340 находится на том же уровне, что и уровни белков пресенилин-1 и пресенилин-2, в то время как количество Аβ42 в существенной степени увеличивается по сравнению с нормальными уровнями пресенилин-1 и пресенилин-2 в сыворотке или в культуральной среде культуры фибробластов кожи, взятых у пациента с болезнью Альцгеймера, при наличии указывавшихся выше мутаций (D.Scheuner et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p.864), в культуральной среде клеточной линии, трансформированной мутантными вариантами белков пресенилин-1 и пресенилин-2 (W.Xia et al., 1997, J. Biol. Chem., vol. 272, p.7977; D.R.Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17, p.1005; M. Citron et al., 1997, Nature Med., vol. 3, p.67) и в ткани головного мозга у пациента с диагнозом семейной болезни Альцгеймера, несущего мутантный белок пресенилин-1 (C.A.Lemere et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p.1146).The mechanisms by which the mutant proteins presenilin-1 and presenilin-2 cause the onset of Alzheimer's disease are currently being intensively studied. It was reported that the AJ340 protein is at the same level as the levels of protein presenilin-1 and presenilin-2, while the amount of Aβ42 is significantly increased compared to normal levels of presenilin-1 and presenilin-2 in serum or culture medium of a culture of skin fibroblasts taken from a patient with Alzheimer's disease, in the presence of the above mutations (D.Scheuner et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p.864), in the culture medium of a cell line transformed with mutant variants proteins presenilin-1 and presenilin-2 (W.Xia et al., 1997, J. Biol. Che m., vol. 272, p. 7977; DR Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17, p. 1005; M. Citron et al., 1997, Nature Med., vol. 3, p. 67) and in brain tissue in a patient diagnosed with familial Alzheimer's disease carrying a mutant protein presenilin-1 (CALemere et al., 1996, Nature Med., vol. 2, p. 11466).
В этих сообщениях было показано, что мутации белков пресенилин-1 и пресенилин-2, которые обусловливают семейную болезнь Альцгеймера, по-видимому, обеспечивают манифестацию болезни Альцгеймера за счет обусловливания повышения количества белка Аβ42, что, как считается, играет существенную роль в образовании сенильных бляшек. Трансгенная мышь, несущая ген, который кодирует мутантный белок пресенилин-1, была ранее создана (К.Duff et al., 1996, Nature, vol. 383, р.710; D.R.Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17, p.1005; M.Citron et al., 1997, Nature Med., vol, 3, p.67). Было сообщено, что содержание Аβ42 в головном мозге такой трансгенной мыши селективно возрастало. Эти данные несомненно подтвердили вероятность того, что мутации в белках пресенилин-1 и пресенилин-2 обусловливают проявление семейной болезни Альцгеймера вследствие обусловливания увеличения количества Aβ42, который предположительно играет важную роль в образовании сенильных бляшек, тем самым инициируя болезнь Альцгеймера. Однако не было опубликовано данных о гистологических параметрах головного мозга упоминавшихся выше трансгенных мышей: считается, что причиной этого является отсутствие существенных гистологических изменений в головном мозге таких трансгенных мышей.In these reports, it was shown that mutations of the presenilin-1 and presenilin-2 proteins that cause Alzheimer's familial disease apparently provide for the manifestation of Alzheimer's disease by causing an increase in the amount of Aβ42 protein, which is believed to play a significant role in the formation of senile plaques. A transgenic mouse carrying a gene that encodes a mutant presenilin-1 protein was previously created (K. Duff et al., 1996, Nature, vol. 383, p. 710; DR Borchelt et al., 1996, Neuron, vol. 17 , p. 1005; M. Citron et al., 1997, Nature Med., vol. 3, p. 67). It was reported that the content of Aβ42 in the brain of such a transgenic mouse selectively increased. These data undoubtedly confirmed the likelihood that mutations in the presenilin-1 and presenilin-2 proteins cause the manifestation of Alzheimer's familial disease due to an increase in the number of Aβ42, which supposedly plays an important role in the formation of senile plaques, thereby initiating Alzheimer's disease. However, no data were published on the histological parameters of the brain of the transgenic mice mentioned above: it is believed that the reason for this is the absence of significant histological changes in the brain of such transgenic mice.
В целом, трансгенные животные применимы в качестве моделей анализа функций гена-мишени in vivo. Однако технически весьма затруднительно проконтролировать экспрессию перенесенного гена на количественном уровне, оценить тканеспецифичность и специфичность в ходе индивидуального развития. Также существует проблема в том, что два генных продукта присутствуют в смеси в организме трансгенных животных, потому что ген, наследуемый этими животными, сохраняет нормальную экспрессию, а функции переносимого гена не могут быть достоверно проанализированы. Более того, когда переносимый ген подвергается избыточному экспрессированию, то функции, в норме не наследуемые in vivo, могут возникать у трансгенного животного, в результате чего образовавшийся дефект может привести к недостоверности в анализе животных, несущих мутантный ген.In general, transgenic animals are applicable as models for analyzing the function of a target gene in vivo. However, it is technically very difficult to control the expression of the transferred gene at a quantitative level, to evaluate tissue specificity and specificity during individual development. There is also a problem that two gene products are present in the mixture in the body of transgenic animals, because the gene inherited by these animals maintains normal expression, and the functions of the transferred gene cannot be reliably analyzed. Moreover, when a transferred gene is overexpressed, functions normally not inherited in vivo can occur in a transgenic animal, as a result of which a defect can lead to an inaccuracy in the analysis of animals carrying the mutant gene.
Помимо трансгенных животных нокаут-животные также могут быть использованы в качестве модели для изучения функций гена-мишени. У нокаут-животных ген-мишень, в норме наследуемый данным животным, искусственным путем выводится из строя таким образом, чтобы стать полностью нефункциональным (т.е. «выключается»). Подробный анализ нокаут-животных может помочь установить функции гена-мишени in vivo. Однако конкретные изменения у нокаут-животных, являющихся гомозиготами, иногда не проявляются, поскольку функции других генных продуктов у нокаут-животных могут заменять функции «выключенных» разрушенных генных продуктов. Более того, также существует проблема в том, что гомозиготное животное может иногда оказываться летальным из-за того, что генный продукт существен с точки зрения индивидуального развития и роста данного животного, в результате чего анализ функций гена у животного являющегося жизнеспособной гетерозиготой, практически невозможен.In addition to transgenic animals, knockout animals can also be used as a model to study the functions of the target gene. In knockout animals, the target gene, normally inherited by these animals, is artificially disabled in such a way as to become completely non-functional (ie, “turned off”). A detailed knockout analysis of animals can help establish the function of the target gene in vivo. However, specific changes in knockout animals that are homozygotes sometimes do not occur, since the functions of other gene products in knockout animals can replace the functions of “off” destroyed gene products. Moreover, there is also the problem that a homozygous animal can sometimes be fatal due to the fact that the gene product is significant from the point of view of the individual development and growth of the animal, as a result of which analysis of the gene functions in an animal that is a viable heterozygous is practically impossible.
Описание настоящего изобретенияDescription of the present invention
Объектом настоящего изобретения является получение (с точки зрения создания животной патогенетической модели болезни Альцгеймера) животного, являющегося патогенетической моделью, патологические свойства которой близки к таковым у пациента с болезнью Альцгеймера, вместо трансгенного животного, для которого свойственны указанные выше недостатки. Более конкретно объектом настоящего изобретения является получение генетически мутированного животного, способного экспрессировать мутантный белок пресенилин в их головном мозге, путем переноса мутантного гена пресенилина, который, как считается, является причиной болезни Альцгеймера (мутантный пресенилиновый ген) с использованием процесса гомологичной рекомбинации. Другим объектом настоящего изобретения является представление способа получения указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, плазмиды, применимой для упомянутого выше способа получения, и способа оценки субстанции или агента, эффективного с точки зрения профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера с использованием указанного выше генетически мутированного животного.The object of the present invention is to obtain (from the point of view of creating an animal pathogenetic model of Alzheimer's disease) an animal that is a pathogenetic model, the pathological properties of which are similar to those of a patient with Alzheimer's disease, instead of a transgenic animal, which is characterized by the above disadvantages. More specifically, it is an object of the present invention to provide a genetically mutated animal capable of expressing a mutant presenilin protein in their brain by transferring a mutant presenilin gene, which is believed to be the cause of Alzheimer's disease (mutant presenilin gene) using a homologous recombination process. Another object of the present invention is to provide a method for producing said genetically mutated animal carrying a mutant gene, a plasmid applicable to the aforementioned preparation method, and a method for evaluating a substance or agent effective from the point of view of preventing and (or) treating Alzheimer's disease using the above genetically mutated animal.
С целью установления роли пресенилин-1 и выяснения механизма манифестации болезни Альцгеймера в ответ на мутацию гена пресенилина-1 заявители настоящего изобретения создали нокин-мышь, у которой нормально наследуемый ген пресенилина-1 заменен на указанный выше ген пресенилина-1, включающий мутацию OS-2. В результате заявителями было установлено, что мышь, несущая мутантный ген, успешно избегает дефектов, характерных для трансгенной мыши и нокаут-мыши, а также то, что животное применимо для исследований причин и патологии болезни Альцгеймера, обусловливаемой мутацией в гене пресенилина-1. Далее заявители продолжили исследования и пришли к описываемому далее изобретению.In order to establish the role of presenilin-1 and to elucidate the mechanism of manifestation of Alzheimer's disease in response to a mutation of the presenilin-1 gene, the applicants of the present invention created a mouse nokin in which the normally inherited presenilin-1 gene is replaced by the above presenilin-1 gene, including the OS-
Таким образом настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, а более предпочтительно настоящее изобретение относится к генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей белок пресенилин-1, в последовательности которого одна аминокислота заменена на другую аминокислоту.Thus, the present invention relates to a non-human genetically mutated animal carrying a mutant gene of presenilin-1, and more preferably the present invention relates to a genetically mutated animal carrying a mutant gene of presenilin-1, which includes a DNA characterized by a sequence encoding a protein presenilin-1 in the sequence of which one amino acid is replaced by another amino acid.
Также настоящее изобретение относится кThe present invention also relates to
отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает последовательность ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, характеризующийся аминокислотной последовательностью, в составе которой одна или большее число аминокислот по положениям, которые выбирают из группы, включающей следующие аминокислотные положения - 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 и 436, - заменены на другую(ие) аминокислоту(ы) в последовательностях пресенилин-1, предпочтительно являющегося белком пресенилин-1 мыши; иto a non-human genetically mutated animal carrying a mutant presenilin-1 gene, which includes a DNA sequence characterized by a sequence encoding a mutant presenilin-1 protein, characterized by an amino acid sequence comprising one or more amino acids at positions selected from the group consisting of the following amino acid positions are 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269, 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 and 436, are replaced by another amino acid (s) ( ) In the sequences of presenilin-1 protein is preferably a mouse presenilin-1; and
отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, который включает последовательность ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого имеется одна или несколько мутаций, выбираемых из группы, включающей A79V, V82L, V96F, У115Н, У115С, Е120К, E120D, N135D, M139V, М139Т, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, Н163У, H163R, G209V, I213T, А231Т, A231V, L235P, А246Е, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269H, Е280А, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, С410У, А426Р и P436S, в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, более предпочтительно являющегося белком пресенилин-1 мыши (каждая буква алфавита соответствует аминокислоте, обозначаемой однобуквенным символом, а каждый номер соответствует номеру положения аминокислоты, считая от N-конца полипептида пресенилин-1, а применяемое описание указывает на то, что аминокислота дикого типа, отмеченная слева от цифры, заменяется на аминокислоту, обозначенную справа от номера. В данной заявке мутантный белок пресенилин-1 и мутантный белок пресенилин-2 охарактеризованы одинаковым образом).a non-human genetically mutated animal carrying a mutant presenilin-1 gene, which includes a DNA sequence characterized by a sequence encoding a mutant presenilin-1 protein, which contains one or more mutations selected from the group comprising A79V, V82L, V96F, Y115H , U115S, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163U, H163R, G209V, I213T, A231T, A231V, L235P, A24626, S26426, S2 ,26 ,26 ,26, P2 , R269H, E280A, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410U, A426P and P436S, in the amino acid sequence of presenilin-1 protein, more than which is clearly a mouse presenilin-1 protein (each letter of the alphabet corresponds to an amino acid denoted by a single-letter symbol, and each number corresponds to an amino acid position number, counting from the N-terminus of presenilin-1 polypeptide, and the description used indicates that the wild-type amino acid is marked on the left from the number, is replaced by the amino acid indicated to the right of the number. In this application, the mutant protein presenilin-1 and the mutant protein presenilin-2 are characterized in the same way).
Далее настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему, мутантный ген пресенилина-1, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого изолейцин по положению 213 белка пресенилин-1 заменен на отличную от изолейцина аминокислоту, а также отличное от человека генетически мутированное животное, несущее мутантный ген пресенилина-1, включающий ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-1, в составе которого изолейцин по 213-му положению в аминокислотной последовательности пресенилин-1 заменен на треонин.Further, the present invention relates to a non-human genetically mutated animal carrying a mutant presenilin-1 gene, which includes a DNA characterized by a sequence encoding a mutant presenilin-1 protein, in which isoleucine at position 213 of the presenilin-1 protein is replaced by a different one from isoleucine an amino acid, as well as a non-human genetically mutated animal carrying a mutant presenilin-1 gene, including DNA, characterized by a sequence encoding a mutant pres protein enilin-1, in which isoleucine at the 213rd position in the amino acid sequence of presenilin-1 is replaced by threonine.
Предпочтительные варианты указанных выше вариантов изобретения относятся к:Preferred variants of the above variants of the invention relate to:
указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует любому нуклеотиду кроме Т, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении, указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует С, М соответствуют Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении, иthe aforementioned genetically mutated animal carrying the mutant presenilin-1 gene, wherein the DNA sequence encoding the region around the 213rd amino acid in the amino acid sequence of presenilin-1 is mutated to form the sequence 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3 ', with N corresponding any nucleotide other than T, M corresponds to T or C, and the underlined nucleotides encode an amino acid located at position 213, the above genetically mutated animal carrying the mutant presenilin-1 gene, wherein the DNA sequence encoding the region around the 213th amino acid in the amino acid sequence of presenilin-1 is mutated to form such a sequence - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3 ', with N corresponding to C, M corresponding to T or C, and underlined nucleotides encode the amino acid, located in the 213rd position, and
указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-й аминокислоты в аминокислотной последовательности пресенилин-1, мутирована с образованием такой последовательности - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCXYZCACTGGAAAGGCCC-3', причем XYZ представляет триплет (кодон), кодирующий отличную от изолейцина, аминокислоту, М соответствует Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении.the aforementioned genetically mutated animal carrying the mutant presenilin-1 gene, wherein the DNA sequence encoding the region around the 213th amino acid in the amino acid sequence of presenilin-1 is mutated to form the sequence 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCXYZCACTGGAAAGGCCC-3 ', wherein XYZ represents codon) encoding an amino acid other than isoleucine, M corresponds to T or C, and underlined nucleotides encode an amino acid at position 213.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к отличному от человека генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенелина-2, который включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей белок, в котором аминокислоты по положениям 141 и (или) 436 заменены иными аминокислотами в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-2. Предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к указанному выше отличному от человека генетически мутированному животному, причем мутантный ген пресенелина-2, включает ДНК, характеризующуюся последовательностью, кодирующей мутантный белок пресенилин-2, который включает мутацию N141I и (или) M239V в аминокислотной последовательности белка пресенилин-2.In another aspect, the present invention relates to a non-human genetically mutated animal carrying a mutant gene presenelin-2, which includes a DNA characterized by a sequence encoding a protein in which the amino acids at positions 141 and (or) 436 are replaced by other amino acids in the amino acid sequence protein presenilin-2. A preferred embodiment of the present invention relates to the aforementioned non-human genetically mutated animal, wherein the mutant gene presenelin-2 comprises a DNA characterized by a sequence encoding a mutant protein presenilin-2, which comprises a mutation N141I and / or M239V in the amino acid sequence of the presenilin-
Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к указанному выше генетически мутированному животному, несущему мутантный ген причем сверхэкспрессия β-амилоидного белка обусловливается мутантным геном пресенилина-1 и (или) мутантным геном пресенилина-2; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген которое способно экспрессировать мутантный белок пресенилин, причем экспрессия упомянутого белка индуцирует выработку β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующей нейропатии в периферических отделах коры головного мозга данного животного; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген причем животное является грызуном, предпочтительно мышью; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген, причем, указанный выше мутантный ген преселин-1 и (или) указанный выше мутантный ген преселин-2 переносят с применением гомологичной рекомбинации; указанное выше генетически мутированное животное, несущее мутантный ген, причем количество амилоидного белка, экспрессируемого в ткани головного мозга под влиянием указанного выше гена пресенилина-1, достаточно для того, чтобы обусловить снижение ответа в тесте на тренировку памяти по сравнению с нормальным животным с индукцией нейропатии в периферических отделах коры головного мозга и гиппокампа головного мозга данного животного; и указанному выше генетически мутированному животному, несущему ДНК, которая включает мутантный ген пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, в составе которого одна или несколько аминокислот заменены на отличающиеся аминокислоты в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, наряду с ДНК, характеризующейся нуклеотидной последовательностью, кодирующей маркерный белок.Preferred embodiments of the present invention relate to the aforementioned genetically mutated animal carrying a mutant gene, wherein overexpression of the β-amyloid protein is due to the mutant gene of presenilin-1 and (or) the mutant gene of presenilin-2; the aforementioned genetically mutated animal carrying a mutant gene that is capable of expressing a mutant protein presenilin, wherein expression of said protein induces the production of β-amyloid protein in an amount sufficient for the development of progressive neuropathy in the peripheral parts of the cerebral cortex of the animal; the above genetically mutated animal carrying a mutant gene, wherein the animal is a rodent, preferably a mouse; the aforementioned genetically mutated animal carrying a mutant gene, wherein the aforementioned mutant gene Preselin-1 and (or) the above mutant gene Preselin-2 is transferred using homologous recombination; the aforementioned genetically mutated animal carrying a mutant gene, and the amount of amyloid protein expressed in brain tissue under the influence of the aforementioned presenilin-1 gene is sufficient to cause a decrease in the response to the memory training test compared to normal animals with induction of neuropathy in the peripheral parts of the cerebral cortex and hippocampus of the brain of this animal; and the aforementioned genetically mutated animal that carries DNA, which contains the mutant gene presenilin-1, encoding a mutant protein presenilin-1, in which one or more amino acids are replaced by different amino acids in the amino acid sequence of the protein presenilin-1, along with DNA characterized a nucleotide sequence encoding a marker protein.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к плазмиде, включающей ДНК характеризующуюся последовательностью мутантного гена пресенилина-1, причем последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-го аминокислотного положения пресенилин-1 следующая - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCANCCACTGGAAAGGCCC-3', причем N соответствует A, G или С, М соответствуют Т или С, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении; иIn another aspect, the present invention relates to a plasmid comprising a DNA characterized by a sequence of the mutant gene presenilin-1, wherein the DNA sequence encoding the region around the 213rd amino acid position of presenilin-1 is 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC ANC CACTGGAAAGGCCC-3 ', wherein N corresponds A, G or C, M correspond to T or C, and the underlined nucleotides encode an amino acid at position 213; and
плазмиде, включающей ДНК, характеризующуюся последовательностью мутантного гена пресенилина-1, который кодирует мутантный белок пресенилин-1, причем, аминокислота в 213-м положении заменена на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности белка пресенилин -1, а последовательность ДНК, кодирующая участок вокруг 213-го аминокислотного положения в составе пресенилин -1 такова - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCXYZCACTGGAAAGGCCC-3', причем М соответствует Т или С, XYZ представляет триплет (кодон), кодирующий отличную от изолейцина аминокислоту, а подчеркнутые нуклеотиды кодируют аминокислоту, находящуюся в 213-м положении. Кроме того, настоящее изобретение относится к геномной (хромосомной) ДНК, включающей 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, причем аминокислота в 213-м положении заменена на отличную от изолейцина аминокислоту в составе аминокислотной последовательности белка пресенилин-1.a plasmid comprising a DNA characterized by a sequence of the mutant gene presenilin-1, which encodes a mutant protein presenilin-1, moreover, the amino acid at position 213 is replaced by a different amino acid from isoleucine in the amino acid sequence of the protein presenilin -1, and the DNA sequence encoding the region around 213th position in the amino acid composition is presenilin -1 - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3 'wherein M represents T or C, XYZ represents triplet (codon) coding for an amino acid other than isoleucine, and under erknutye bases encode the amino acid located in position 213. In addition, the present invention relates to genomic (chromosomal) DNA, including the 8th exon of the mutant gene presenilin-1, encoding the mutant protein presenilin-1, and the amino acid at position 213 is replaced by an amino acid other than isoleucine in the amino acid sequence of the presenilin protein -1.
Далее настоящее изобретение относиться к плазмиде, включающей ДНК, в состав которой Sau2АI-сайт внесен в нуклеотидную последовательность, включающую полную или мутировавшую часть кДНК или геномной ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, в аминокислотной последовательности которого аминокислота по 213-му положению заменена на отличную от изолейцина аминокислоту. Также изобретение относится к указанной выше плазмиде, причем замена аминокислоты по 213-му положению является заменой изолейцина на треонин, а также плазмиде, включающей ДНК, представленную следующей нуклеотидной последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3', - в которой М соответствует Т или С.Further, the present invention relates to a plasmid comprising DNA, in which the Sau2AI site is inserted into a nucleotide sequence comprising the complete or mutated portion of the cDNA or genomic DNA of the mutant presenilin-1 gene encoding the mutant presenilin-1 protein, in the amino acid sequence of which 213 amino acid -th position is replaced by an amino acid different from isoleucine. The invention also relates to the above plasmid, wherein replacing the amino acid at position 213 is a substitution of isoleucine for threonine, as well as a plasmid comprising the DNA represented by the following nucleotide sequence - 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3 ', in which M corresponds to T or C .
В дополнение к указанным выше вариантам настоящее, изобретение относится к гену, кодирующему мышиный мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности пресенилин-1 мыши, а также указанный выше ген, причем такой заменой является замена изолейцина на треонин. Также относится к плазмиде, включающей: (1) ген, кодирующий мышиный мутантный белок пресенилин-1 в котором изолейцин по 213-му положению заменен на отличную от изолейцина аминокислоту в аминокислотной последовательности пресенелин-1 мыши и (2) неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную последовательностями loxPs; а также указанную выше плазмиду, причем заменой является замена изолейцина на треонин (loxPs представляются открытой японской патентной публикацией N4-501501, стр.4).In addition to the above options, the present invention relates to a gene encoding a murine mutant protein presenilin-1, wherein isoleucine at position 213 is replaced by a different amino acid from isoleucine in the amino acid sequence of mouse presenilin-1, as well as the above gene, such the replacement is the replacement of isoleucine with threonine. Also relates to a plasmid comprising: (1) a gene encoding a murine mutant protein presenilin-1 in which isoleucine at position 213 is replaced by an amino acid different from isoleucine in the amino acid sequence of mouse presenelin-1 and (2) a neomycin expression cassette flanked by sequences loxPs; as well as the above plasmid, the replacement being the replacement of isoleucine with threonine (loxPs are presented by Japanese Open Patent Publication N4-501501, p. 4).
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к эмбриону, несущему плазмиду, включающую ДНК, представленную нуклеотидной последовательностью 5'- TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3', в которой М соответствует Т или С; эмбрион, полученный путем гомологичной рекомбинации с использованием каждой из упоминавшихся выше плазмид; и указанный выше эмбрион, представляющий вид грызунов, предпочтительно эмбрион мыши. Также настоящее изобретение относится к первичной клеточной культуре или пересеваемой клетке, полученным путем выделения клетки от указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, и культивированию клетки по типу тканевой культуры; способу получения отличного от человека генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, причем такой способ включает этап внесения мутантного гена пресенилина-1 с помощью гомологичной рекомбинации в эмбрион животного, причем мутантный ген пресенилина-1 способен экспрессировать мутантный белок пресенилин-1, индуцируя тем самым выработку β-амилоидного белка в количестве, достаточном для развития прогрессирующей нейропатии в периферических отделах коры головного мозга; и указанный выше метод получения, причем мутантный белок пресенилин-1, который может быть экспрессирован, включает замену изолейцина в 213-м положении на отличную от изолейцина аминокислоту.In accordance with another aspect, the present invention relates to an embryo carrying a plasmid comprising the DNA represented by the nucleotide sequence 5'-TGTGGTCGGGATGATMGCCACCCACTGGAAAGGCCC-3 ', in which M corresponds to T or C; an embryo obtained by homologous recombination using each of the plasmids mentioned above; and the above embryo representing a species of rodents, preferably a mouse embryo. The present invention also relates to a primary cell culture or a transplanted cell obtained by isolating a cell from said genetically mutated animal carrying a mutant gene, and culturing the cell as a tissue culture; a method for producing a non-human genetically mutated animal carrying a mutant gene, the method comprising the step of introducing a mutant gene of presenilin-1 using homologous recombination into the embryo of an animal, the mutant gene of presenilin-1 capable of expressing the mutant protein presenilin-1, thereby inducing production β-amyloid protein in an amount sufficient for the development of progressive neuropathy in the peripheral parts of the cerebral cortex; and the aforementioned preparation method, wherein the mutant protein presenilin-1, which can be expressed, involves replacing isoleucine at position 213 with an amino acid other than isoleucine.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу оценки средства, применяемого для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, который включает этап обработки указанного генетически мутированного животного, несущего мутантный ген, которому вводят тест-средство с целью сравнения с генетически мутированным животным, несущим мутантный ген, которому такое тест-соединение не вводили. Типичным примером способа оценки является тест-скрининг. Предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к указанному выше способу оценки, в котором для сравнения используется тест на тренировку памяти, указанному выше способу оценки, причем сравнение осуществляется в патогенетическом тесте; указанному выше способу оценки, в котором для сравнения применяется патогенетический тест, основанный на параметрах невропатологии периферических отделов коры головного мозга; указанному выше способу оценки, причем для сравнения используется невропатологический тест при сравнении с одним или несколькими такими тестами, выбираемыми из группы, которая включает подавление снижения интенсивности глиоза (разрастания астроглии) в периферических отделах коры головного мозга, подавление снижения поглощения 2-дезоксиглюкозы в периферических отделах коры головного мозга и подавление снижения доступности 2-дезоксиглюкозы в периферических отделах коры головного мозга; а также указанному выше способу оценки, в котором сравнение осуществляется по ряду параметров, выбираемых из группы, которая включает продолжительность выживания, параметры поискового и двигательного поведения.In addition, the present invention relates to a method for evaluating an agent used to treat and / or prevent Alzheimer's disease, which comprises the step of treating said genetically mutated animal carrying the mutant gene, to which a test agent is administered for comparison with a genetically mutated animal carrying the mutant a gene to which such a test compound has not been administered. A typical example of an evaluation method is test screening. Preferred embodiments of the present invention relate to the aforementioned evaluation method, in which a memory training test is used for comparison, the aforementioned evaluation method, wherein the comparison is carried out in a pathogenetic test; the above assessment method, in which a pathogenetic test based on the neuropathology parameters of the peripheral parts of the cerebral cortex is used for comparison; the above assessment method, and for comparison, a neuropathological test is used when comparing with one or more of these tests selected from the group that includes suppressing a decrease in gliosis intensity (overgrowth of astroglia) in the peripheral parts of the cerebral cortex, suppressing a decrease in the absorption of 2-deoxyglucose in the peripheral parts cerebral cortex and suppression of reduced availability of 2-deoxyglucose in the peripheral parts of the cerebral cortex; as well as the aforementioned evaluation method, in which the comparison is carried out according to a number of parameters selected from the group that includes the duration of survival, the parameters of the search and motor behavior.
Еще, кроме того, настоящее изобретение относится к способу оценки лекарственного средства, предназначенного для лечения болезни Альцгеймера, который включает этап культивирования первичной клеточной культуры или пересеваемой клетки in vitro в присутствии тестируемого соединения; способу диагностики болезни Альцгеймера или риска развития болезни Альцгеймера, который включает использование частичной нуклеотидной последовательности мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный пресенилин-1, вариант OS-2; субстанцию, применяемую для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, выбираемую с применением любого из указанных выше способов; и лекарственное средство, предназначенное для лечения и (или) профилактики болезни Альцгеймера, включающее указанную выше субстанцию в качестве активного компонента.Still further, the present invention relates to a method for evaluating a medicament for treating Alzheimer's disease, which comprises the step of culturing a primary cell culture or a transplanted cell in vitro in the presence of a test compound; a method for diagnosing Alzheimer's disease or a risk of developing Alzheimer's disease, which comprises using a partial nucleotide sequence of a mutant presenilin-1 gene encoding mutant presenilin-1, an OS-2 variant; a substance used to treat and (or) prevent Alzheimer's disease, selected using any of the above methods; and a drug intended for the treatment and / or prevention of Alzheimer's disease, comprising the above substance as an active component.
Также настоящее изобретение относится к генетически мутированному животному, несущему мутантный ген пресенилина-1, причем это животное является гибридным животным или его потомством, получаемыми в результате скрещивания указанного выше генетически мутированного животного, несущего мутантный ген с животным, несущим ген, который кодирует мутантный амилоидный белок-предшественник, характеризующимся высоким уровнем выработки β-амилоидного белка, а более предпочтительно это животное является гибридом мыши или его потомством, которое получают в результате скрещивания или которое рождается в результате указанного скрещивания. Предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к указанному выше генетически мутированному животному, причем животное несет ген, кодирующий мутантный амилоидный белок-предшественник, характеризуется высоким уровнем выработки β-амилоидного белка и является PS1-мутантной мышью.The present invention also relates to a genetically mutated animal carrying a mutant gene of presenilin-1, and this animal is a hybrid animal or its offspring resulting from the cross of the above genetically mutated animal carrying a mutant gene with an animal carrying a gene that encodes a mutant amyloid protein a precursor characterized by a high level of production of β-amyloid protein, and more preferably this animal is a mouse hybrid or its progeny, which uchayut by mating or which is born as a result of this crossing. A preferred embodiment of the present invention relates to the aforementioned genetically mutated animal, wherein the animal carries a gene encoding a mutant amyloid precursor protein, is characterized by a high level of β-amyloid protein production and is a PS1 mutant mouse.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг.1 показана рестрикционная карта Pα-фрагмента геномной ДНК, включающего 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши, который был получен путем клонирования геномной клонотеки мыши.Figure 1 shows a restriction map of the Pα fragment of genomic DNA, including the 8th exon of the mouse presenilin-1 gene, which was obtained by cloning the genomic mouse clonotheque.
На фиг.2 показана схема способа конструирования плазмиды ртХ-1, включающей сегмент 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши, в составе которого находится участок, в который с применением методов направленного мутагенеза была внесена мутация OS-2.Figure 2 shows a diagram of a method for constructing the RTX-1 plasmid, including the segment of the 8th exon of the mouse presenilin-1 gene, which contains the region into which the OS-2 mutation was introduced using directed mutagenesis methods.
На фиг.3 показан способ конструирования направляющего вектора.Figure 3 shows a method for constructing a guide vector.
На фиг.4 показан способ конструирования направляющего вектора.Figure 4 shows a method for constructing a guide vector.
На фиг.5 показан способ конструирования направляющего вектора.5 shows a method for constructing a guide vector.
На фиг.6 показан способ конструирования направляющего вектора.6 shows a method for constructing a guide vector.
На фиг.7 показан способ конструирования направляющего вектора и структура направляющего вектора pOS-2 neoloxP.7 shows a method for constructing a guide vector and the structure of the guide vector pOS-2 neoloxP.
На фиг.8 показаны результаты применения электрофореза в 1%-ном агарозном геле в отношении продукта ПЦР, полученного после скрещивания мыши №2 (самец), несущей мутантный по OS-2 ген пресенилина-1, с мышью CAG-cre, №13 в F4 (самка), отрезания кусочка ткани хвоста у полученного потомка, выделения ДНК из этого образца и проведения ПЦР в соответствии с описанным в примере 10. Как видно, у мышей, которым соответствуют 2-я и 4-я дорожки, считая справа, не проявляют экспрессии гена neo с их геномной ДНК. На этой фигуре крайняя левая дорожка соответствует маркеру молекулярной массы. [А] отмечены бэнды, характерные для дефицита neo в составе геномной ДНК. [В] отмечены бэнды, соответствующие ДНК дикого типа. И [С] показывает бэнды, соответствующие присутствию гена neo в составе хромосомной (геномной) ДНК.On Fig shows the results of the use of electrophoresis in a 1% agarose gel in relation to the PCR product obtained after crossing the mouse No. 2 (male), carrying the OS-2 mutant gene presenilin-1, with a mouse CAG-cre, No. 13 in F 4 (female), cutting off a piece of tail tissue from the resulting descendant, isolating DNA from this sample and performing PCR as described in Example 10. As can be seen, in mice that correspond to the 2nd and 4th lanes, counting from the right, do not show neo gene expression with their genomic DNA. In this figure, the leftmost track corresponds to the molecular weight marker. [A] marked bands characteristic of neo deficiency in the composition of genomic DNA. [B] marked bands corresponding to wild-type DNA. And [C] shows the bands corresponding to the presence of the neo gene in the chromosomal (genomic) DNA.
Наилучший способ осуществления настоящего изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Мутантным геном пресенилина, используемым для получения генетически мутированного животного по настоящему изобретению, является ген, кодирующий мутантный белок пресенилин, а по использованию в данном тексте термин «мутантный ген пресенилина» обозначает как мутантный ген пресенилина-1 и мутантный ген пресенилина-2 в отдельности, так и их оба вместе, а термин «мутантный белок пресенилин» обозначает как мутантный белок пресенилин-1 и мутантный белок пресенилин-2 в отдельности, так и их оба вместе. Свойством мутантного гена пресенилина является обеспечение повышенного уровня выработки β-амилоидного белка. Генетически мутированным животным по настоящему изобретению является млекопитающее, трансформированное с использованием указанного выше мутантного гена пресенилина, для чего используется, например, гомологичная рекомбинация. Мутацией, происходящей в составе мутантного белка, предпочтительно является замена аминокислотных остатков. Число таких мутаций не ограничивается, а предпочтительно оно равно 1.The mutant presenilin gene used to produce the genetically mutated animal of the present invention is a gene encoding a mutant presenilin protein, and as used herein, the term “mutant presenilin gene” means both the mutant presenilin-1 gene and the mutant presenilin-2 gene separately, both of them together, and the term “mutant protein presenilin” means both the mutant protein presenilin-1 and the mutant protein presenilin-2 separately, and both of them together. The property of the mutant presenilin gene is to provide an increased level of production of β-amyloid protein. A genetically mutated animal of the present invention is a mammal transformed using the above mutant presenilin gene, for which homologous recombination is used, for example. The mutation occurring in the composition of the mutant protein, preferably is the replacement of amino acid residues. The number of such mutations is not limited, and preferably it is 1.
Полноразмерная последовательность пресенилина-1 млекопитающего описана, например, у Е.Levy-Lahad et al., 1995, Science, 269, pp.973-977. Полноразмерные последовательности белков пресенилин-1 человека и мыши и примеры последовательностей ДНК, которые кодируют эти белки, показаны в SEQ ID NO 1-4. Например, сайтом для мутирования пресенилина-1 мыши предпочтительно может быть сайт, выбираемый из положений №№79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250, 260, 263, 264, 267, 269. 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 и 436.The full-length sequence of the mammalian presenilin-1 is described, for example, in E. Levy-Lahad et al., 1995, Science, 269, pp. 973-977. Full-length human and mouse presenilin-1 protein sequences and examples of DNA sequences that encode these proteins are shown in SEQ ID NOs 1-4. For example, a site for mutating a mouse presenilin-1 may preferably be a site selected from positions Nos. 79, 82, 96, 115, 120, 135, 139, 143, 146, 163, 209, 213, 231, 235, 246, 250 , 260, 263, 264, 267, 269. 280, 285, 286, 290, 318, 384, 392, 410, 426 and 436.
Более предпочтительными мутациями являются одна или большее число мутаций, выбираемых из группы, которая включает мутации A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, Е120К, E120D, N135D, M139V, М139Т, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H163Y, H163R, G209V, I213T, А231Т, A231V, L235P, А246Е, L250S, A260V, C263R, P264L, P267S, R269G, R269H, Е280А, E280G, A285V, L286V, S290C, E318G, G384A, L392V, C410Y, А426Р и P436S в аминокислотной последовательности белка пресенилина-1, а более предпочтительно - аминокислотной последовательности белка пресенилин-1 мыши. Среди этих мутаций, в частности, предпочтительными являются замены 213-й аминокислоты на другую аминокислоту (в ряде разделов настоящего текста они обозначаются как «мутации типа OS-2»). Например, наиболее предпочтительной является мутация, в результате которой изолейцин в 213-м положении заменяется на какую-либо иную аминокислоту, кроме изолейцина, или мутация, в результате которой изолейцин-213 заменяется на треонин.More preferred mutations are one or more mutations selected from the group which includes mutations A79V, V82L, V96F, Y115H, Y115C, E120K, E120D, N135D, M139V, M139T, M139I, I143F, I143T, M146L, M146V, H16 . the sequence of the presenilin-1 protein, and more preferably the amino acid sequence of the mouse presenilin-1 protein. Among these mutations, in particular, substitutions of the 213rd amino acid with another amino acid are preferred (in a number of sections of this text, they are referred to as “OS-2 mutations”). For example, a mutation is preferred that results in replacing isoleucine at position 213 with an amino acid other than isoleucine, or a mutation resulting in replacing isoleucine-213 with threonine.
Полноразмерная последовательность белка пресенилин-2 млекопитающего описана, например, в Science, 1995, 269, pp.973-977. Предпочтительными сайтами мутирования являются 141-я и (или) 436-я аминокислоты, а в последовательности мыши более предпочтительными являются мутации N141I и M239V. Одна или большее число мутаций могут иметь место либо в одном из белков пресенилин (-1 или -2), или в обоих этих белках.The full-length sequence of the mammalian presenilin-2 protein is described, for example, in Science, 1995, 269, pp. 973-977. The preferred mutation sites are the 141st and / or 436th amino acids, and N141I and M239V mutations are more preferred in the mouse sequence. One or more mutations can occur either in one of the presenilin proteins (-1 or -2), or in both of these proteins.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется наличием одной из вышеуказанных мутаций гена пресенилина-1 и (или) гена пресенилина-2 в составе его геномной ДНК. Генетически мутированное животное не ограничено ни чем иным, кроме того, что оно является млекопитающим, а вид животного при этом специально не ограничивается. Например, пригодным для использования является вид грызунов. В частности, предпочтительным видом является мышь. Генетически мутированное животное по настоящему изобретению может быть получено путем конструирования плазмиды с использованием ДНК, характеризующейся последовательностью длиной примерно 10 тысяч пар нуклеотидов, включающей мутантный пресенилиновый ген, с последующим внесением этой плазмиды в эмбриональную стволовую клетку, что тем самым обусловливает прохождение внутриклеточной гомологичной рекомбинации.The genetically mutated animal of the present invention is characterized by the presence of one of the above mutations of the presenilin-1 gene and / or the presenilin-2 gene in its genomic DNA. A genetically mutated animal is not limited by anything other than the fact that it is a mammal, and the species of the animal is not specifically limited. For example, a species of rodent is suitable for use. In particular, a mouse is a preferred species. The genetically mutated animal of the present invention can be obtained by constructing a plasmid using DNA with a sequence of approximately 10 thousand pairs of nucleotides in length, including a mutant presenilin gene, followed by the introduction of this plasmid into the embryonic stem cell, thereby causing the passage of intracellular homologous recombination.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется тем, что аминокислотная мутация имеет место в основном в единственном сайте в результате внесения указанных выше мутантных генов пресенилина-1 и (или) пресенилина-2 с применением гомологичной рекомбинации. В случае так называемого «трансгенного животного» последовательность ДНК, включающая мутантный сегмент, вносится в состав геномной ДНК случайным образом, а по множеству различных сайтов оказываются внесенными десятки копий повторяющейся последовательности. Генетически мутированное животное по настоящему изобретению позволяет избежать такой проблемы: возможным является точный анализ патогенеза болезни Альцгеймера на генетическом уровне. Когда ДНК, включающая маркер или подобное, вносится в организм генетически мутированного животного по настоящему изобретению, такое животное может иметь маркерный сайт и последовательность для внесения такого маркера. Например, для внесения по сайту, распознаваемому рестриктазой Sau3AI, может быть заменен один нуклеотид, а такая замена может быть проверена путем расщепления ПЦР-продукта рестриктазой Sau3AI с последующим анализом полученных фрагментов электрофоретически и подобным образом.The genetically mutated animal of the present invention is characterized in that the amino acid mutation occurs mainly in a single site as a result of introducing the above mutant genes of presenilin-1 and (or) presenilin-2 using homologous recombination. In the case of the so-called “transgenic animal,” the DNA sequence, including the mutant segment, is randomly introduced into the genomic DNA, and dozens of copies of the repeating sequence appear at many different sites. The genetically mutated animal of the present invention avoids such a problem: it is possible to accurately analyze the pathogenesis of Alzheimer's disease at the genetic level. When DNA, including a marker or the like, is introduced into the body of a genetically mutated animal of the present invention, such an animal may have a marker site and a sequence for introducing such a marker. For example, for insertion at a site recognized by the Sau3AI restriction enzyme, one nucleotide can be replaced, and such a replacement can be verified by cleaving the PCR product with the Sau3AI restriction enzyme followed by analysis of the obtained fragments electrophoretically and the like.
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется своеобразным свойством вырабатывать β-амилоидный белок в большом количестве по сравнению с животным дикого типа в результате генетической мутации. Увеличенное количество β-амилоидного белка, достигаемое у генетически мутированного животного по настоящему изобретению, ни чем специально не ограничивается: предпочтительно это количество должно быть достаточным для установления отчетливой разницы в оценках степени нарушения памяти, патологических параметров и различных невропатологии по сравнению с нормальными животными.The genetically mutated animal of the present invention is characterized by a peculiar property of producing large amounts of β-amyloid protein compared to a wild-type animal as a result of a genetic mutation. The increased amount of β-amyloid protein achieved in the genetically mutated animal of the present invention is not specifically limited: preferably, this amount should be sufficient to establish a clear difference in the estimates of the degree of memory impairment, pathological parameters and various neuropathology compared to normal animals.
ДНК, плазмиды, клеточные культуры и эмбрионы млекопитающих, представляемые настоящим изобретением, характеризуются наличием мутантного гена пресенилина-1 и (или) мутантного гена пресенилина-2. Например, в объем настоящего изобретения попадают кДНК или полноразмерная геномная ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, предпочтительно мутантный по мутации OS-2 белок пресенилин-1, или последовательность ДНК, включающая один или несколько мутантных сайтов; плазмида, включающая ДНК, которая является указанной выше кДНК или полноразмерной геномной ДНК, или указанной выше ДНК, включающей один или несколько мутантных сайтов, в которую дополнительно встроен рестрикционный Sаu3АI-сайт; геномная ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующей мутантный белок пресенилин-1 с мутацией OS-2. Далее настоящее изобретение охватывает указанный выше ген или ДНК, которые дополнительно включают один или больше, а предпочтительно от 1 до 20, а более предпочтительно от 1 до нескольких нуклеотидных замен.The DNA, plasmids, cell cultures and mammalian embryos of the present invention are characterized by the presence of a mutant gene of presenilin-1 and (or) a mutant gene of presenilin-2. For example, cDNA or the full-length genomic DNA of a mutant presenilin-1 gene encoding a mutant presenilin-1 mutant protein, preferably an OS-2 mutant presenilin-1 mutant protein, or a DNA sequence comprising one or more mutant sites; a plasmid comprising DNA, which is the aforementioned cDNA or full-length genomic DNA, or the aforementioned DNA, comprising one or more mutant sites, in which the restriction Sau3AI site is additionally inserted; genomic DNA, including the 8th exon of the mutant gene presenilin-1, encoding a mutant protein presenilin-1 with a mutation OS-2. The present invention further encompasses the aforementioned gene or DNA, which further includes one or more, and preferably from 1 to 20, and more preferably from 1 to several nucleotide substitutions.
Примерами ДНК и плазмид по настоящему изобретению являются:Examples of DNA and plasmids of the present invention are:
1) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, кодирующий мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении пресенилин-1 заменен на треонин, или плазмида, включающая упомянутую ДНК;1) DNA, including the mutant presenilin-1 gene encoding the mutant presenilin-1 protein, wherein isoleucine at position 213 of presenilin-1 is replaced with threonine, or a plasmid comprising the aforementioned DNA;
2) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислоты вокруг 213-го остатка аминокислотной последовательности мутантного белка пресенилин-1, является следующей последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3', - при том, что N соответствует любому нуклеотиду кроме Т, а М соответствуют Т или С, или плазмида, включающая упомянутую ДНК;2) DNA containing the presenilin-1 mutant gene, the nucleotide sequence encoding the amino acids around the 213rd residue of the presenilin-1 mutant protein amino acid sequence is the following sequence - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCCA N CCACTGGAAAGGCCC-3 ', that N corresponds to any nucleotide other than T, and M correspond to T or C, or a plasmid comprising said DNA;
3) ДНК, включающая мутантный ген пресенилина-1, причем нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая аминокислоты вокруг 213-го остатка аминокислотной последовательности мутантного по OS-2 белка пресенилина-1, является следующей последовательностью - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3', причем М соответствует Т или С, XYZ соответствует кодону, кодирующему аминокислоту, отличную от изолейцина, или плазмида, включающая эту ДНК;3) DNA comprising the presenilin-1 mutant gene, the nucleotide sequence of the DNA encoding amino acids around the 213rd amino acid sequence residue of the OS-2 mutant presenilin-1 protein, is the following sequence - 5'-TGTGGTCGGGATGAT M GCC XYZ CACTGGAAAGGCCC-3 ' wherein M corresponds to T or C, XYZ corresponds to a codon encoding an amino acid other than isoleucine, or a plasmid comprising this DNA;
4) любая ДНК или плазмида, включающая упомянутые ДНК, соответствующие упомянутым выше пп.(1)-(4), причем в их состав внесен рестрикционный Sаu3АI-сайт;4) any DNA or plasmid comprising the aforementioned DNA corresponding to the above (1) to (4) above, wherein the restriction Sau3AI site is introduced in their composition;
5) ДНК или плазмида, включающая упомянутую ДНК, причем рестрикционный Sаu3АI-сайт вносят в последовательность, включающую полноразмерную кДНК или геномную ДНК мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на треонин в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, или в состав мутантного сегмента упомянутой последовательности;5) a DNA or plasmid comprising the aforementioned DNA, wherein the restriction Sau3AI site is introduced into a sequence comprising the full-length cDNA or genomic DNA of the mutant presenilin-1 gene encoding the mutant protein presenilin-1, with isoleucine at position 213 replaced with threonine in amino acid presenilin-1 protein sequences, or as part of a mutant segment of said sequence;
6) ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1 мыши, кодирующего мутантный по OS-2 белок пресенилин-1, и неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную loxP, или плазмида, включающая упомянутую ДНК; и6) DNA, including the 8th exon of the mouse presenilin-1 mutant gene encoding the OS-2 mutant presenilin-1 protein, and a neomycin expression cassette flanked by loxP, or a plasmid comprising the aforementioned DNA; and
7) ДНК, включающая 8-й экзон мутантного гена пресенилина-1, кодирующего мутантный белок пресенилин-1, причем изолейцин в 213-м положении заменен на треонин в аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, и неомициновую экспрессионную кассету, фланкированную loxP, или плазмида, включающая упомянутую ДНК. Однако масштаб настоящего изобретения не ограничивается этими конкретными примерами.7) DNA, including the 8th exon of the mutant gene presenilin-1, encoding the mutant protein presenilin-1, and isoleucine at position 213 is replaced by threonine in the amino acid sequence of the protein presenilin-1, and a neomycin expression cassette flanked by loxP, or plasmid including said DNA. However, the scope of the present invention is not limited to these specific examples.
Эмбрионы или клетки, представляемые настоящим изобретением, включают эмбрион или клетку, в которые внесена указанная плазмида, например плазмида, включающая нуклеотидную последовательность PRL-104 или PRL-105. Предпочтительными клетками по настоящему изобретению являются те клетки, которые трансформированы геном, кодирующим мутантный белок пресенилин, который характеризуется мутацией в 213-м положении аминокислотной последовательности белка пресенилин-1, путем гомологичной рекомбинации с использованием указанной выше плазмиды. Типы эмбрионов и клеток ни чем не ограничены, кроме того, чтобы они были производными от млекопитающего, а предпочтительными являются те, которые производны от грызуна, предпочтительно от мыши.Embryos or cells of the present invention include an embryo or cell into which said plasmid is introduced, for example, a plasmid comprising the nucleotide sequence of PRL-104 or PRL-105. Preferred cells of the present invention are those cells that are transformed with a gene encoding a mutant presenilin protein, which is characterized by a mutation at the 213 position of the amino acid sequence of presenilin-1 protein, by homologous recombination using the above plasmid. The types of embryos and cells are not limited to anything except that they are derived from a mammal, and those derived from a rodent, preferably from a mouse, are preferred.
Получение генетически мутированного животногоGetting a genetically mutated animal
После получения ДНК, кодирующей мутантный пресенилин человека, генгетически мутированное животное по настоящему изобретению, несущее мутантный ген пресенилина, может быть получено в соответствии со способом, описанным здесь далее. Приводимый пример выстроен таким образом, что используемым млекопитающим является мышь, а используемым мутантным геном пресенилина является мутантный ген пресенилина-1 человека. Однако генетически мутированное животное по настоящему изобретению не ограничивается теми животными, которые получаются с использованием указанных компонентов. Далее, данный способ является примером способа получения генетически мутированного животного по настоящему изобретению, а сам способ по настоящему изобретению не ограничивается описываемым далее способом. Основываясь на базовом способе, описываемом далее, и на конкретных способах, описанных в примерах, путем подходящего модифицирования или изменения этих способов, если это оказывается необходимым, специалист в данной области техники легко сможет получить генетически мутированное животное по настоящему изобретению.After obtaining the DNA encoding the mutant human presenilin, the genetically mutated animal of the present invention carrying the mutant presenilin gene can be obtained in accordance with the method described hereinafter. The given example is arranged in such a way that the mouse used is the mouse, and the mutant gene for presenilin used is the mutant gene for human presenilin-1. However, the genetically mutated animal of the present invention is not limited to those animals that are obtained using these components. Further, this method is an example of a method for producing a genetically mutated animal of the present invention, and the method of the present invention is not limited to the method described below. Based on the basic method described below and on the specific methods described in the examples, by appropriate modification or alteration of these methods, if necessary, one skilled in the art can easily obtain the genetically mutated animal of the present invention.
С целью конструирования зонда, предназначаемого для использования в методе ПЦР, фрагмент ДНК, который включает сайт для мутирования 8-го экзона гена пресенилина-1, производного от того животного, получение которого осуществляется, получают на материале геномной клонотеки мыши. Может быть использована геномная клонотека ДНК мышей любой линии, включая геномную клонотеку мыши линии 129, описываемой в примерах. Когда мышь является тем животным, в геном которого вносят мутацию, то используют 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши. Когда используют другие виды животных, то необходимо подобрать соответствующий сегмент.In order to construct a probe intended for use in the PCR method, a DNA fragment that includes a site for mutation of the 8th exon of the presenilin-1 gene, derived from the animal that is being obtained, is obtained on the material of the genomic mouse cell library. A genomic DNA clonoteque of mice of any line can be used, including the mouse genomic clone library of line 129 described in the examples. When the mouse is the animal whose mutation is introduced into the genome, the 8th exon of the mouse presenilin-1 gene is used. When using other types of animals, it is necessary to choose the appropriate segment.
После того, как полученный в описанном выше способе фрагмент ДНК помечают (32Р) методом случайного прайминга, скрининг геномной клонотеки осуществляют с использованием помеченного зонда, а затем клонируют фрагмент геномной ДНК, включающий 8-й экзон клонированного гена пресенилина-1. Далее субклонируют предназначенный для мутирования сегмент 8-го экзона клонированного гена пресенилина-1, а затем вносят мутацию.After the DNA fragment obtained in the above-described method is tagged ( 32 P) by random priming, the genomic clonothek is screened using a labeled probe, and then the genomic DNA fragment including the 8th exon of the cloned presenilin-1 gene is cloned. Next, the segment of the 8th exon of the cloned gene of presenilin-1 is intended for mutation, and then the mutation is introduced.
Направляющий вектор конструируют таким образом, чтобы он включал геномную ДНК, включающую 8-й экзон гена пресенилина-1 мыши, в последовательность которого была внесена мутация. В качестве селективного маркера экспрессионную кассету neo вносят в состав направляющего вектора с целью облегчения того, чтобы те клетки, геном которые не включил данный вектор, уничтожались после добавления антибиотика G418 в культуральную среду. После того, как направляющий вектор был внесен в клетки ES с применением метода электропорации или с помощью какого-либо иного метода, служащего для доставки гена в клетку, клетки ES культивируют в присутствие и отбирают образующиеся колонии. Каждую из полученных колоний разделяют на две части. Одну из половин оставляют для культивирования, пересева или замораживания. Другую половину используют для анализа клеток ES, в геном которых желаемая мутация 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши вносится с помощью гомологичной рекомбинации. Запасенную половину колонии клеток ES, несущую желаемую внесенную мутацию, отбирают и используют в процессе, описанном ниже.The guide vector is designed to include genomic DNA, including the 8th exon of the mouse presenilin-1 gene, into the sequence of which the mutation was introduced. As a selective marker, the neo expression cassette is introduced into the guide vector in order to facilitate that cells whose genome did not include this vector are destroyed after adding the G418 antibiotic to the culture medium. After the guide vector has been introduced into ES cells using the electroporation method or using any other method used to deliver the gene to the cell, ES cells are cultured in the presence and the resulting colonies are selected. Each of the obtained colonies is divided into two parts. One of the halves is left for cultivation, reseeding or freezing. The other half is used to analyze ES cells in the genome of which the desired mutation of the 8th exon of the mouse mouse presenilin-1 gene is introduced using homologous recombination. The stored half of the ES cell colony carrying the desired introduced mutation is selected and used in the process described below.
У беременной самки мыши выделяют эмбрион на стадии 8 бластомеров. На этот эмбрион наносят примерно 20 указанных выше сохраненных клеток ES и затем реимплантируют в матку самки мышей с ложной беременностью. Среди родившегося потомства отбирали мышат с мозаичной окраской шерсти. Мозаичную (химерную) мышь скрещивали с мышью линии C57DL/6, а особь, несущая желаемую мутацию, может быть получена в результате отбора среди полученного потомства мышат тех особей, у которых имеется окраска дикого типа («агути»). Полученная в потомстве мышь является гетерозиготной по отношению ко внесенному гену пресенилина-1 с мутацией, в то время как аллель гена пресенилина-1 на другой хромосоме представлен диким типом и лишен мутации.In a pregnant female mouse, an embryo is isolated at the stage of 8 blastomeres. About 20 of the aforementioned preserved ES cells are applied to this embryo and then reimplanted into the uterus of a female mice with a miscarriage. Among the offspring born, mice with mosaic hair coloring were selected. A mosaic (chimeric) mouse was crossed with a mouse of the C57DL / 6 line, and an individual carrying the desired mutation can be obtained by selecting among those offspring mice those individuals that have a wild-type color (“agouti”). The progeny mouse is heterozygous for the introduced presenilin-1 gene with a mutation, while the allele of the presenilin-1 gene on the other chromosome is wild-type and lacks mutation.
В качестве исходных материалов для конструирования зонда, необходимого для клонирования геномной ДНК, включающей последовательность 8-го экзона гена пресенилина-1 мыши из состава геномной клонотеки мыши может быть использована кДНК гена пресенилина-1, который является производным от млекопитающего, отличного от мыши и человека, нуклеотидная последовательность которой известна, равно как и те фрагменты, которые, в частности, упомянуты в примерах. В качестве методов получения фрагмента ДНК, используемого в качестве зонда, может быть применен метод крупномасштабного воспроизводства плазмиды, которая включает геномную ДНК мыши, включающую сегмент, соответствующий 8-му экзону гена пресенилина-1 геномной ДНК, или кДНК гена пресенилина-1, производного от млекопитающего, отличного от мыши и человека, или подобное, нуклеотидная последовательность чего известна, равно как применены и ПЦР-амплификация, описанная в примерах. Далее, после того, как плазмиду расщепили рестриктазой, желательный фрагмент ДНК может быть получен путем отделения части, являющейся фрагментом ДНК, с применением электрофореза в агарозном геле и подобного.As the starting materials for constructing the probe necessary for cloning genomic DNA, including the sequence of the 8th exon of the mouse presenilin-1 gene from the composition of the mouse genomic clonothek, presenilin-1 cDNA can be used, which is derived from a mammal other than mouse and human , the nucleotide sequence of which is known, as well as those fragments that are, in particular, mentioned in the examples. As methods for producing a DNA fragment used as a probe, a large-scale method for reproducing a plasmid that includes mouse genomic DNA, including a segment corresponding to the 8th exon of the presenilin-1 gene of genomic DNA, or cDNA of the presenilin-1 gene derived from a mammal other than mouse and human, or the like, the nucleotide sequence of which is known, as well as the PCR amplification described in the examples. Further, after the plasmid has been digested with the restriction enzyme, the desired DNA fragment can be obtained by separating the part that is the DNA fragment using agarose gel electrophoresis and the like.
В качестве метода мечения ДНК-фрагмента могут быть использованы такие методы, как те, которые основаны на ПЦР в присутствие 132P-dNTP, равно как и метод случайного прайминга, описанного в примерах. Далее, метка может быть внесена с помощью ПЦР или случайного прайминга с использованием в качестве затравки предварительно помеченного олигонуклеотида. Также для мечения может быть использована хемолюминесценция на основе комплекса авидинабиотина или щелочной фосфатазы или подобного, равно как и радиоактивные изотопы, описанные в примерах. Фрагмент РНК, помеченный с использованием РНК-полимераз нечетных фагов Т3 или Т7, также может быть использован в качестве зонда. Кроме указанных выше известны и другие методы конструирования зонда, и желательный зонд может быть получен с применением любого из этих методов.As a method for labeling a DNA fragment, methods such as those based on PCR in the presence of 132 P-dNTP can be used, as well as the random priming method described in the examples. Further, the label can be introduced by PCR or random priming using a pre-labeled oligonucleotide as a seed. Also, chemoluminescence based on a complex of avidinabiotin or alkaline phosphatase or the like can be used for labeling, as well as the radioactive isotopes described in the examples. An RNA fragment labeled using odd T3 or T7 phage RNA polymerases can also be used as a probe. In addition to the above, other methods for constructing the probe are known, and the desired probe can be obtained using any of these methods.
Для внесения в ДНК желательной мутации могут быть применены методы, описанные, в частности, в примерах. Кроме того, плазмиду, производную от бактериофага, такого как фаг М13, или плазмиду, дуплицированную с использованием ung- Escherichia coli, связывают комплементарным образом с олигонуклеотидом, синтезированным с целью внесения мутации по желательному сайту (нуклеотиды того сайта, по которому собственно вносится мутация, не являются комплементарными), а полученный в результате комплекс используют в качестве затравки для получения гетеродуплексной плазмиды с применением ДНК-полимеразы, а затем ung-позитивные клетки Escherichia coli трансформируют с использованием полученной в результате плазмиды с получением плазмиды, включающей желаемую мутацию. Применяется и другой подход («кассетный метод») для получения плазмиды, несущей желаемую мутацию: он включает этапы синтеза двух олигонуклеотидов, которые характеризуются модификацией нуклеотидов таким образом, чтобы внести желаемую мутацию и способны пройти отжиг по комплементарному типу, будучи сконструированными таким образом, чтобы внести рестрикционные сайты, и лигирование олигонуклеотида на плазмиду с целью внесения мутации, для чего используется ДНК-лигаза. В ряде случаев искомый результат может быть достигнут с большей эффективностью путем внесения подходящих модификаций или изменений в описанные выше методы в зависимости от конкретной поставленной цели. Кроме того, в качестве метода внесения мутации в данной области техники известны различные доступные методы: следовательно, любой из таких методов может быть применен для достижения указанного результата.To introduce the desired mutation into the DNA, the methods described in particular in the examples can be applied. In addition, a plasmid derived from a bacteriophage, such as M13 phage, or a plasmid duplicated using ung - Escherichia coli is complementaryly coupled to an oligonucleotide synthesized to introduce a mutation at a desired site (nucleotides of the site on which the mutation is actually introduced, are not complementary), and the resulting complex is used as a seed to obtain a heteroduplex plasmid using DNA polymerase, and then ung-positive Escherichia coli cells are transformed with mations resulting plasmid to obtain a plasmid comprising the desired mutation. Another approach (the "cassette method") is used to obtain a plasmid carrying the desired mutation: it involves the steps of synthesizing two oligonucleotides that are characterized by a modification of the nucleotides in such a way as to introduce the desired mutation and are able to undergo annealing according to the complementary type, being designed so that to introduce restriction sites, and ligation of the oligonucleotide on a plasmid in order to introduce mutations, for which DNA ligase is used. In some cases, the desired result can be achieved with greater efficiency by making suitable modifications or changes to the methods described above, depending on the specific goal. In addition, as a method for introducing mutations, various available methods are known in the art: therefore, any of these methods can be applied to achieve the indicated result.
Направляющий вектор предпочтительно может включать экспрессионную кассету селективного маркера, рассматриваемую в качестве необходимого компонента, который включает фрагмент геномной ДНК мыши, включающий мутацию, ДНК-фрагмент, кодирующий селективный маркер, промотор, обеспечивающий их транскрипцию, и терминатор. Фрагмент геномной ДНК мыши, включающий мутацию, является необходимой частью с точки зрения обеспечения гомологичной рекомбинации в клетках ES, причем также необходимы фрагменты геномной ДНК мыши, фланкирующие мутационный сайт по обеим сторонам от него. Следовательно, направляющий вектор включает фрагмент ДНК, в составе которого только мутировавшие нуклеотиды отличаются от нативной нуклеотидной последовательности генома мыши. Длина такого фрагмента предпочтительно может составлять 10 тысяч пар нуклеотидов: в принципе, допустимы и некоторые его удлинение или укорочение. Однако, если данный фрагмент оказывается слишком коротким, то частота гомологичной рекомбинации иногда может снижаться.The guide vector may preferably include an expression marker cassette, considered as a necessary component, which includes a mouse genomic DNA fragment including a mutation, a DNA fragment encoding a selective marker, a transcription promoter, and a terminator. A fragment of mouse genomic DNA, including the mutation, is a necessary part from the point of view of ensuring homologous recombination in ES cells, and fragments of mouse genomic DNA flanking the mutation site on either side of it are also required. Therefore, the guide vector includes a DNA fragment in which only the mutated nucleotides are different from the native nucleotide sequence of the mouse genome. The length of such a fragment can preferably be 10 thousand pairs of nucleotides: in principle, some elongation or shortening are also acceptable. However, if this fragment is too short, the frequency of homologous recombination can sometimes decrease.
В качестве селективных маркеров известны позитивные селективные маркеры, такие как ген резистентности к неомицину и ген резистентности к гигромицину, и негативные селективные маркеры, такие как ген тимидинкиназы простого герпесвируса и фрагмент А генома дифтерийного токсина. В приложении к клеткам ES они могут быть использованы при культивировании клеток в качестве маркеров. В случае использования негативного селективного маркера необходимо размещать его за пределами фрагмента геномной ДНК мыши в составе направляющего вектора. При использовании позитивного селективного маркера необходимо встраивать его экспрессионную кассету в последовательность интрона фрагмента геномной ДНК мыши в составе направляющего вектора. При встраивании гена позитивного маркера в последовательность экзона встроенный ген обычно утрачивает свои функции, и поэтому иногда не удается получить особей, которые можно было бы тестировать по влиянию анализируемой мутации в качестве заключительной цели анализа.As selective markers, positive selective markers, such as the neomycin resistance gene and hygromycin resistance gene, and negative selective markers, such as the herpes simplex thymidine kinase gene and diphtheria toxin genome A, are known as selective markers. When applied to ES cells, they can be used in cell culture as markers. In the case of using a negative selective marker, it is necessary to place it outside the mouse genomic DNA fragment in the guide vector. When using a positive selective marker, it is necessary to integrate its expression cassette into the sequence of the intron of the mouse genomic DNA fragment in the guide vector. When a positive marker gene is inserted into an exon sequence, the built-in gene usually loses its functions, and therefore it is sometimes not possible to obtain individuals that could be tested by the influence of the analyzed mutation as the final goal of the analysis.
Что касается линии клеток Е3, то обычно используются клеточные линии, производные от мышей линии 129. Клетки ES являются производными от указанной линии мыши: могут быть использованы такие клетки ES (т.е. эмбриональные стволовые клетки), как клетки D3, ССЕ, J1 и АВ1, равно как и клетки R1, описанные в примерах. Например, производные от мыши клетки ES, такой как линия мышей C57BL/6, также могут быть использованы помимо клеток мышей линии 129. Что касается методов внесения направляющего вектора в клетки ES, то в принципе может быть применен метод электропорации в соответствии с описанным в примерах. Может быть применен любой метод, лишь бы он обеспечивал проникновение плазмиды внутрь находящейся в культуре клетки, например метод осаждения с фосфатом кальция или липосомный метод. Когда клетки ES, в которые был внесен направляющий вектор, культивируют в присутствие селективного маркера, то те клетки ES, которые сохраняют жизнеспособность и образуют колонии, по-видимому, претерпели гомологичную рекомбинацию. Метод ПЦР обычно применяется для установления того, произошла ли гомологичная рекомбинация в тех клетках ES, которые образовали колонии. В качестве зонда могут быть использованы фрагмент ДНК, фрагмент РНК, синтетический олигонуклеотид, антитело или подобное.Regarding the E3 cell line, cell lines derived from line 129 mice are usually used. ES cells are derived from the indicated mouse line: ES cells (i.e., embryonic stem cells) such as D3, CCE, J1 cells can be used and AB1, as well as R1 cells described in the examples. For example, mouse-derived ES cells, such as the C57BL / 6 mouse line, can also be used in addition to 129 mouse cells. With regard to methods for introducing a guide vector into ES cells, in principle, electroporation can be applied as described in the examples . Any method can be applied, if only it ensures the penetration of the plasmid into the cell located in the culture, for example, the precipitation method with calcium phosphate or the liposome method. When ES cells into which the guide vector has been introduced are cultured in the presence of a selectable marker, those ES cells that remain viable and form colonies appear to have undergone homologous recombination. PCR is usually used to determine if homologous recombination has occurred in those ES cells that have formed colonies. As the probe, a DNA fragment, an RNA fragment, a synthetic oligonucleotide, an antibody or the like can be used.
После того, как клетки ES смешивают с оплодотворенной яйцеклеткой на ранних стадиях ее развития с последующим продолжением этого развития, может быть получена мышь от спермия или яйца, производного от клетки ES. Для смешивания клеток ES, в которых произошла гомологичная рекомбинация, с оплодотворенной яйцеклеткой на ранней стадии ее развития может быть применен метод, описанный в примерах. Кроме того, также может быть применен метод, который включает этапы выделения оплодотворенной яйцеклетки на стадии бластулы из тела беременной самки мыши, инъецирование 10-20 клеток ES в полученное яйцо с помощью микропипетки, реимплантации проинъецированного яйца в матку ложнобеременной самки с последующим продолжением развития до рождения мышонка.After ES cells are mixed with a fertilized egg in the early stages of its development followed by continued development, a mouse can be obtained from sperm or an egg derived from an ES cell. To mix ES cells in which homologous recombination has occurred with a fertilized egg at an early stage of its development, the method described in the examples can be used. In addition, a method can also be applied that includes the steps of isolating a fertilized egg at the blastula stage from the body of a pregnant female mouse, injecting 10-20 ES cells into the obtained egg using a micropipette, reimplanting the injected egg into the uterus of the false-pregnant female, followed by development until birth the mouse.
Оплодотворенное яйцо на ранней стадии развития, предназначенное для использования в смешивании с клетками ES, может быть выделено из самок мышей любой линии. С целью облегчения установления того, попали ли в тела потомков клетки ES, предпочтительным является использование оплодотворенного яйца линии мышей, характеризующейся отличающейся окраской шерсти от окраски шерсти у тех мышей, на материале которых были получены клетки ES. Например, клетки ES, используемые в примерах, происходят от мышей линии 129, характеризующихся окраской шерсти «агути» (дикий тип), а мыши, от которых получают оплодотворенные яйцеклетки (линия C57BL/6), окрашены в черный цвет. При использовании такого материала возможным становится проведение простого отбора мышат, несущих клетки, производных от клеток ES, путем отбора потомков с мозаичной окраской. В этом случае мышата, характеризующиеся наибольшей долей окраски дикого типа, являются наиболее вероятными носителями половых клеток, производных от клеток ES. В качестве ложнобеременных самок мышей можно использовать мышей любой линии.An early-stage fertilized egg intended for use in mixing with ES cells can be isolated from female mice of any strain. In order to facilitate the determination of whether ES cells have entered the bodies of descendants, it is preferable to use a fertilized egg from a line of mice characterized by a different coat color from the coat color in those mice on the material of which ES cells were obtained. For example, the ES cells used in the examples are descended from line 129 mice characterized by the color of the agouti coat (wild type), and the mice from which the fertilized eggs are received (line C57BL / 6) are colored black. When using such material, it becomes possible to carry out a simple selection of mice bearing cells derived from ES cells by selecting offspring with a mosaic color. In this case, the mice, characterized by the largest proportion of wild-type coloration, are the most likely carriers of germ cells derived from ES cells. As pseudopregnant female mice, mice of any line can be used.
Мышью, которую используют для получения путем скрещивания потомств, несущих желательную встроенную мутацию и являющихся искомыми мозаиками, предпочтительно может быть мышь такой линии, которая характеризуется окраской шерсти, отличной от таковой у мышей линии, от которой были получены клетки ES. Обычно мозаичных самцов мыши скрещивают с самкой отличающейся линии: если получают потомство с окраской шерсти дикого типа, то это значит, что полученные в результате мыши несут желаемую мутацию в гетерозиготном состоянии. Если мышь, несущая мутацию OS-2 в мутантном гене пресенилина-1, также несет экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP, то возможным является получить мышь, у которой экспрессионная кассета neo удалена: для этой цели осуществляют скрещивание с трансгенной мышью, несущей встроенный ген cre.The mouse used to cross-breed offspring carrying the desired built-in mutation and which are the desired mosaics may preferably be a mouse of a line that is characterized by a coat color different from that of the mice of the line from which ES cells were obtained. Usually mosaic male mice are crossed with a female of a different line: if offspring are obtained with the coloring of wild-type wool, this means that the resulting mice carry the desired mutation in the heterozygous state. If a mouse carrying the OS-2 mutation in the mutated presenilin-1 gene also carries a neo expression cassette flanked by loxP sequences, then it is possible to obtain a mouse whose neo expression cassette is deleted: for this purpose, a cross is carried out with a transgenic mouse carrying the integrated gene cre.
Как было охарактеризовано выше в данном тексте, считается, что мутация белка пресенилина-1 и пресенилина-2 способствует образованию сенильных бляшек в результате повышения выработки амилоидного белка Аβ42, тем самым приводя к развитию болезни Альцгеймера. В группе трансгенных мышей, которым был внесен ген, кодирующий мутантный АРР, обусловливающий семейную болезнь Альцгеймера, у некоторых мышей отмечалось отложение амилоидных белков в головном мозге (D.Games et al., 1995, Nature, vol. 373, р.523; K.Hsiao et al., 1996, Science, vol. 274, p.99; С.Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p.13287). Предполагается, что у таких трансгенных мышей амилоидные отложения индуцируют повышение количества белка Аβ, вырабатываемого в головном мозге.As described above in this text, it is believed that the mutation of the protein presenilin-1 and presenilin-2 contributes to the formation of senile plaques as a result of increased production of amyloid protein Aβ42, thereby leading to the development of Alzheimer's disease. In a group of transgenic mice that were introduced with a gene encoding mutant APP causing Alzheimer's familial disease, some mice showed deposition of amyloid proteins in the brain (D.Games et al., 1995, Nature, vol. 373, p. 523; K Hsiao et al., 1996, Science, vol. 274, p. 99; C. Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, p.13287). In such transgenic mice, amyloid deposits are thought to induce an increase in the amount of Aβ protein produced in the brain.
Путем скрещивания трансгенного животного, трансформированного геном, кодирующим мутантный белок-предшественник АРР, способного проявлять амилоидные отложения в головном мозге (это животное может быть гомо- или гетерозиготным по отношению ко внесенному трансгену), с животным по настоящему изобретению, несущим мутантный ген пресенилина-1 (это животное может быть гомо- или гетерозиготным по отношению ко внесенному трансгену), может быть получено гибридное животное. Такое животное предпочтительно является мышью. Для использования в скрещивании любое из указанных выше животных может быть самцом.By crossing a transgenic animal transformed with a gene encoding a mutant APP precursor protein capable of showing amyloid deposits in the brain (this animal may be homo- or heterozygous for the introduced transgene), with the animal of the present invention carrying the mutant presenilin-1 gene (this animal may be homo- or heterozygous for the introduced transgene), a hybrid animal may be obtained. Such an animal is preferably a mouse. For use in crossbreeding, any of the above animals may be male.
У потомства отрезают кусочек ткани хвоста, на материале которого экстрагируют геномную (хромосомную) ДНК. Используя эту экстрагированную ДНК в качестве субстрата, осуществляют ПЦР с использованием в качестве затравок двух олигонуклеотидов, нуклеотидная последовательность каждого из которых выстраивается таким образом, чтобы фланкировать мутируемый сайт гена, кодирующего мутантный АРР, и двух олигонуклеотидов, характеризующихся нуклеотидной последовательностью, фланкирующей сайт мутирования мутантного гена пресенилина-1.A piece of tail tissue is cut off from the offspring, on whose material genomic (chromosomal) DNA is extracted. Using this extracted DNA as a substrate, PCR is performed using two oligonucleotides as seeds, the nucleotide sequence of each of which is aligned so as to flank the mutated site of the gene encoding the mutant APP, and two oligonucleotides characterized by the nucleotide sequence flanking the mutant gene mutation site presenilin-1.
Возможным является определение того, попали ли в состав экстрагированной ДНК ген, кодирующий мутантный АРР, и мутантный ген пресенилина-1 по настоящему изобретению, для чего ПЦР-продукт разгоняют методом электрофореза в агарозном геле с последующим выявлением, например, присутствия или отсутствия бэндов и оценки подвижности бэндов в геле, анализируя конкретный бэнд, соответствующий данной мутации, путем гибридизации с использованием олигонуклеотида, нуклеотидная последовательность которого включает данную мутацию. ПЦР может быть осуществлена в соответствии с методом, описанным в примере 8. Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов, используемых в качестве затравок для ПЦР, могут иметь произвольную длину, лишь бы они позволяли детектировать ген, кодирующий мутантный АРР или мутантный ген PS1. Основываясь на результатах ПЦР, животное, у которого оба этих гена находятся в гетерозиготном состоянии, может быть получено путем отбора животных, несущих ген, кодирующий мутантный АРР, и мутантный ген пресенилина-1 по настоящему изобретению.It is possible to determine whether the gene encoding the mutant APP and the mutant presenilin-1 gene of the present invention were included in the extracted DNA, for which the PCR product was accelerated by agarose gel electrophoresis, followed by, for example, the presence or absence of bands and evaluation the mobility of the bands in the gel by analyzing a particular band corresponding to a given mutation by hybridization using an oligonucleotide whose nucleotide sequence includes this mutation. PCR can be carried out in accordance with the method described in example 8. The nucleotide sequences of the oligonucleotides used as primers for PCR can be of arbitrary length, as long as they allow the detection of a gene encoding a mutant APP or mutant PS1 gene. Based on the results of PCR, an animal in which both of these genes are in a heterozygous state can be obtained by selection of animals carrying the gene encoding mutant APP and the mutant presenilin-1 gene of the present invention.
С целью получения животных, несущих оба гена, кодирующих мутантный АРР и мутантный пресенилин-1 по настоящему изобретению, находящихся в гомозиготном состоянии, отдельное животное, у которого оба этих гена гомозиготны, выбирают из потомства, полученного от скрещивания самца и самки, отобранных в группе животных, характеризующихся гетерозиготностыо этих генов. Для подтверждения того, что ген, кодирующий мутантный АРР, находится в гомозиготном состоянии, кусочек ткани хвоста такого потомства отбирают для экстрагирования из него геномной ДНК, а после расщепления этой геномной ДНК рестриктазами проводят электрофорез в агарозном геле или полиакриламидном геле. Затем ДНК промакивают на мембранный фильтр и проводят Саузерн-блоттинг с использованием в качестве зонда олигонуклеотида, последовательность которого обеспечивает специфичное связывание с геном, кодирующим мутантный АРР; затем анализируют плотность полученных в результате бэндов.In order to obtain animals carrying both genes encoding the mutant APP and mutant presenilin-1 of the present invention in a homozygous state, a separate animal in which both of these genes are homozygous is selected from the offspring obtained from the cross of a male and a female, selected in the group animals characterized by heterozygosity of these genes. To confirm that the gene encoding the mutant APP is in a homozygous state, a piece of tail tissue of such progeny is selected to extract genomic DNA from it, and after digestion of this genomic DNA with restrictase enzymes, agarose gel or polyacrylamide gel electrophoresis is performed. DNA is then blotted onto a membrane filter and Southern blotting is performed using an oligonucleotide as a probe, the sequence of which provides specific binding to a gene encoding mutant APP; then analyze the density of the resulting bands.
Аналогично указанным выше процессам может быть проверено присутствие в гомозиготном состоянии мутантного гена пресенилина-1 по настоящему изобретению. Олигонуклеотиды, применяемые в качестве зондов в методе Саузерн-блоттинга, могут быть использованы после их мечения в соответствии со способами, принятыми для прописей Саузерн-блоттинга, например, с помощью радиоактивного изотопа и флуоресцентного красителя. Таким образом может быть получена мышь, несущая оба гена, кодирующих мутантный АРР и мутантный пресенилин-1 по настоящему изобретению. Гибридная мышь, полученная с помощью описанного выше способа, характеризуется высоким уровнем выработки β-амилоидных белков в головном мозге и ускоренным амилоидным отложением.Similarly to the above processes, the presence of the mutant Presenilin-1 mutant gene of the present invention in a homozygous state can be verified. Oligonucleotides used as probes in Southern blotting can be used after labeling in accordance with methods adopted for Southern blotting, for example, using a radioactive isotope and fluorescent dye. In this way, a mouse carrying both genes encoding mutant APP and mutant presenilin-1 of the present invention can be obtained. The hybrid mouse obtained using the method described above is characterized by a high level of production of β-amyloid proteins in the brain and accelerated amyloid deposition.
С использованием генетически мутированного животного, клеток, трансформированных мутантным геном пресенилина, плазмиды, включающей мутантный ген пресенилина, и подобного возможным является осуществлять скрининг субстанций, применяемых для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера и для оценки их применимости. Накопление β-амилоидных белков у здорового млекопитающего прогрессирует очень медленно, в то время как генетически мутированному животному по настоящему изобретению свойственен высокий уровень выработки β-амилоидных белков. Следовательно, путем введения различных тестируемых субстанций генетически мутированному животному по настоящему изобретению и сравнения с животным, которым их не вводили, или с животными, которым вводили контрольные субстанции, возможным является оценить эти субстанции по их применимости для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера. Типичным примером такой оценки является скрининг тест-субстанций, и такому анализу могут быть подвергнуты условия, патологические параметры, фармакологические тесты и подобное.Using a genetically mutated animal, cells transformed with a mutant presenilin gene, a plasmid containing a mutant presenilin gene, and the like, it is possible to screen substances used to prevent and (or) treat Alzheimer's disease and to evaluate their applicability. The accumulation of β-amyloid proteins in a healthy mammal progresses very slowly, while the genetically mutated animal of the present invention is characterized by a high level of production of β-amyloid proteins. Therefore, by administering various test substances to the genetically mutated animal of the present invention and comparing it with an animal that has not been administered, or with animals that have been given control substances, it is possible to evaluate these substances for their prevention and / or treatment of Alzheimer's disease. A typical example of such an assessment is the screening of test substances, and conditions, pathological parameters, pharmacological tests and the like may be subjected to such an analysis.
В случае использования клеток по настоящему изобретению эти клетки выделяют из тела животного по настоящему изобретению и ставят в первичную культуру, а затем эти клетки могут быть стабилизированы и пересеяны в субкультуру с помощью иммортализации первичной клеточной культуры путем обработки соответствующим вирусом или подобного, пересеяны путем выделения фрагмента полученной культуры и далее прокультивированы с использованием свежей порции культуральной среды. Клетки по настоящему изобретению включают первичные культивируемые клетки, такие как нервные клетки, выделенные из тела генетически мутированного животного, равно как и пересеянные клетки, например, т.н. «клеточные линии», получаемые в результате постоянного пересева (субкультивирования) исходной первичной культуры. Когда нервная клетка используется в качестве клетки по настоящему изобретению, эта клетка экспрессирует высокий уровень β-амилоидных белков в результате экспрессии этой клеткой мутантного белка пресенилин-1. Субстанция, которая предотвращает или задерживает гибель нервной клетки вследствие накопления β-амилоидных белков, может быть протестирована, а также может быть оценена ее применимость путем добавления тестируемой субстанции в культуральную систему in vitro таких нервных клеток с последующим сравнением, например, продолжительности выживания клеток или числа выживаемых клеток через некоторый период времени.In the case of using the cells of the present invention, these cells are isolated from the body of the animal of the present invention and put into the primary culture, and then these cells can be stabilized and subcultured by immortalizing the primary cell culture by treatment with the appropriate virus or the like, transplanted by isolating a fragment the resulting culture and further cultivated using a fresh portion of the culture medium. The cells of the present invention include primary cultured cells, such as nerve cells isolated from the body of a genetically mutated animal, as well as transplanted cells, for example, so-called "Cell lines" obtained as a result of constant reseeding (subculturing) of the initial primary culture. When a nerve cell is used as the cell of the present invention, the cell expresses a high level of β-amyloid proteins as a result of the expression of the presenilin-1 mutant protein by this cell. A substance that prevents or delays nerve cell death due to the accumulation of β-amyloid proteins can be tested, and its applicability can be assessed by adding the test substance to the in vitro culture system of such nerve cells and then comparing, for example, cell survival time or number surviving cells after a period of time.
ПримерыExamples
Настоящее изобретение может быть более детально охарактеризовано с помощью примеров. Однако, масштаб настоящего изобретения не ограничивается этими примерами. В нижеследующих примерах ген пресенилина-1 иногда обозначается как PS1.The present invention can be described in more detail using examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples. In the following examples, the presenilin-1 gene is sometimes referred to as PS1.
Пример 1Example 1
Клонирование геномной ДНК, включающей 8-й экзон гена пресенилина-1 (PS1) мышиCloning of genomic DNA, including the 8th exon of mouse presenilin-1 (PS1) gene
Для конструирования зонда, предназначенного для выделения геномной ДНК, включающей 8-й экзон гена PS1 мыши, были синтезированы следующие два олигонуклеотида:To construct a probe designed for isolation of genomic DNA, including the 8th exon of the mouse PS1 gene, the following two oligonucleotides were synthesized:
PR-8-U: 5'-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3' (25);PR-8-U: 5'-GGAATTTTGGTGTGGTCGGGATGAT-3 '(25);
PR-8-L: 5'-GGTCCATTCGGGGAGGTACTTGA-3' (23).PR-8-L: 5'-GGTCCATTCGGGGAGAGTACTTGA-3 '(23).
ПЦР осуществляли с использованием этих двух олигонуклеотидов в качестве затравок, а ДНК экстрагировали из геномной клонотеки мышей линии 129/SVJ (Stratagene) с получением амплифицированного ДНК-фрагмента длиной примерно 130 пар нуклеотидов. Затем этот фрагмент помечали методом случайного прайминга в присутствие 32Р-дЦТФ и затем использовали в качестве зондов для скрининга геномной клонотеки мышей линии 129/SVJ. Полученные в результате позитивные фаговые клоны были протестированы с подтверждением того, что они включают желаемую геномную ДНК, включающую последовательность 8-го экзона гена PS1 мыши. Клонированную ДНК обозначили как Рα и подвергали рестрикционному картированию (фиг.1).PCR was performed using these two oligonucleotides as seeds, and the DNA was extracted from the genomic clonothe of 129 / SVJ mice (Stratagene) to obtain an amplified DNA fragment with a length of approximately 130 nucleotides. This fragment was then labeled by random priming in the presence of 32 P-dTCP and then used as probes for screening the genomic clonotheque of 129 / SVJ mice. The resulting positive phage clones were tested to confirm that they include the desired genomic DNA, including the sequence of the 8th exon of the mouse PS1 gene. Cloned DNA was designated as Pα and subjected to restriction mapping (FIG. 1).
Пример 2Example 2
Конструирование плазмиды, предназначенной для внесения мутацииConstruction of a plasmid designed for introducing mutations
ДНК была экстрагирована из клонированного фага, несущего Рα, и расщеплена рестриктазой Sall и затем подвергнута электрофорезу в 1%-ном геле с целью отбора фрагмента Рα. После расщепления рестриктазами PstI и Xbal полученный продукт подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с целью сбора ДНК-фрагмента длиной примерно 600 пар нуклеотидов, включая нуклеотидную последовательность, которая кодирует изолейцин по 213-му положению последовательности PS1 мыши. Полученный ДНК-фрагмент был обозначен как Х-1. Фрагмент Х-1 лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+ (Stratagene), которую предварительно расщепляли рестриктазами PstI и XbaI, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды рХ-1.The DNA was extracted from a cloned phage carrying Pα and digested with Sall restriction enzyme and then electrophoresed on a 1% gel to select the Pα fragment. After digestion with restriction enzymes PstI and Xbal, the resulting product was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to collect a DNA fragment of approximately 600 pairs of nucleotides, including the nucleotide sequence that encodes isoleucine at the 213rd position of the mouse PS1 sequence. The resulting DNA fragment was designated as X-1. Fragment X-1 was ligated using T4 DNA ligase to plasmid pBluescript II KS + (Stratagene), which was previously digested with restriction enzymes PstI and XbaI, and then used to transform E. coli cells to obtain plasmid pX-1.
Пример 3Example 3
Внесение мутации OS-2Mutation of OS-2
Мутация OS-2 и рестрикционный Sau3AI-сайт были «заново» внесены в состав плазмиды рХ-1 с использованием следующих двух олигонуклеотидов - PRL-104 и PRL-105. Олигонуклеотиды PRL-104 и PRL-105 были 36-нуклеотидными и комплементарными друг другу:The OS-2 mutation and the restriction Sau3AI site were "newly" introduced into the pX-1 plasmid using the following two oligonucleotides - PRL-104 and PRL-105. The oligonucleotides PRL-104 and PRL-105 were 36-nucleotide and complementary to each other:
PRL-104: 5'-TGTGGTCGGGA TGATC* GCCA С CCACTGGAAAGGCCC-3';PRL-104: 5'-TGTGGTCGGGA TGATC * GCCA WITH CCACTGGAAAGGCCC-3 ';
PRL-105: 5'-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG* ATCATCCCGACCACA-3'.PRL-105: 5'-GGGCCTTTCCAGTGG G TGGCG * ATCATCCCGACCACA-3 '.
(Подчеркнутый нуклеотид изменен по отношению к последовательности дикого типа с целью внесения мутации OS-2: а именно дикий тип соответствует Т для PRL-104 и А для PRL-105. Нуклеотиды, отмеченные звездочкой, изменены по отношению к последовательности дикого типа с целью внесения рестрикционного Sau3AI-сайта: а именно, дикий тип соответствует Т для PRL-104 и А для PRL-105).(The underlined nucleotide is modified with respect to the wild-type sequence in order to introduce the OS-2 mutation: namely, the wild type corresponds to T for PRL-104 and A for PRL-105. The nucleotides marked with an asterisk are changed with respect to the wild-type sequence with the aim of introducing restriction Sau3AI site: namely, the wild type corresponds to T for PRL-104 and A for PRL-105).
Внесение данной мутации было осуществлено с использованием набора реактивов Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) в соответствии с рекомендациями производителя. Секвенирование полученного продукта подтвердило точное внесение данной мутации. Фрагмент Х-1, несущий мутацию, был обозначен как тХ-1, а плазмиду, несущую mX-1, обозначили как pmX-1 (фиг. 2).The introduction of this mutation was carried out using the Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) reagent kit in accordance with the manufacturer's recommendations. Sequencing of the resulting product confirmed the exact introduction of this mutation. Fragment X-1 carrying the mutation was designated as TX-1, and a plasmid carrying mX-1 was designated as pmX-1 (Fig. 2).
Пример 4Example 4
Конструирование геномной ДНК, несущей мутацию OS-2Construction of genomic DNA carrying the OS-2 mutation
Полученный в примере 1 фрагмент Рα, включающий 8-й экзон гена PS1 мыши, расщепляли рестриктазой NcoI и затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 в присутствии 4 типов дезоксирибонуклеотидов (dNTP) с получением «тупых концов». Полученный фрагмент далее расщепляли рестриктазой Asp718I и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с целью отбора включающего 8-й экзон фрагмента ДНК длиной примерно 5 тысяч пар нуклеотидов. Этот фрагмент лигировали с использованием' ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+ (Stratagene), которую предварительно расщепляли рестриктазами SamI и Asp718l, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды pSB-0. Плазмиду pSB-0 полностью расщепляли рестриктазой XbaI с последующим частичным расщеплением рестриктазой PstI. Плазмиду pmX-1 расщепляли рестриктазами Xbal и Pstl и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с отбором mX-1. Этот фрагмент mX-1 лигировали на PstI-фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации клеток E.coli. Колонии трансформированной E.coli тестировали с целью отбора колонии, несущей такую плазмиду, в составе которой фрагмент Х-1 плазмиды pSB-0 заменен на фрагмент mX-1. Эту отобранную плазмиду обозначили как pmSB-0 (фиг.3).The Pα fragment obtained in Example 1, including the 8th exon of the mouse PS1 gene, was digested with restriction enzyme NcoI and then treated with T4 DNA polymerase in the presence of 4 types of deoxyribonucleotides (dNTP) to give blunt ends. The resulting fragment was further digested with restriction enzyme Asp718I and then subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to select an exon 8th DNA fragment of about 5 thousand pairs of nucleotides long. This fragment was ligated using T4 DNA ligase to plasmid pBluescript II KS + (Stratagene), which was previously digested with restriction enzymes SamI and Asp718l, and then used to transform E. coli cells to obtain plasmid pSB-0. Plasmid pSB-0 was completely digested with restriction enzyme XbaI followed by partial digestion with restriction enzyme PstI. Plasmid pmX-1 was digested with restriction enzymes Xbal and Pstl and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel with selection of mX-1. This mX-1 fragment was ligated into the PstI fragment using T4 DNA ligase and then used to transform E. coli cells. Colonies of transformed E. coli were tested to select a colony bearing such a plasmid, in which the X-1 fragment of the plasmid pSB-0 was replaced by the mX-1 fragment. This selected plasmid was designated as pmSB-0 (FIG. 3).
Отдельно фрагмент Рα расщепляли рестриктазами BamHI и SalI и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 8 тысяч пар нуклеотидов, включающего 8-й экзон. Этот фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 лигировали в состав плазмиды pBluescript II KS+, которую предварительно расщепляли рестриктазами BamHI и Sall, а затем использовали для трансформации клеток E.coli с получением плазмиды pSB-1. Плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазой NcoI и обрабатывали ДНК-полимеразой в присутствие 4 типов dNTP с образованием «тупых концов». Полученный в результате фрагмент далее расщепляли рестриктазой XbaI и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Выделяли фрагмент ДНК длиной примерно 2200 пар нуклеотидов - XN, - включающий 8-й экзон: затем этот фрагмент и плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазами XbaI и PstI и после этого полученные продукты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Выделенный фрагмент ДНК длиной примерно 2300 пар нуклеотидов - РХ, - не включающий 8-й экзон, лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4. Этот лигированный фрагмент далее лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+, которую предварительно расщепляли рестриктазой Xbal, «затупляли» концы с помощью ДНК-полимеразы Т4 в присутствие 4 типов dNTP, религировали с использованием ДНК-лигазы Т4 и расщепляли рестриктазами SmaI и PstI. После этого полученную плазмиду использовали для трансформации E.coli. Колонии трансформированных клеток тестировали с целью получения плазмиды pmSB-0', несущей только один фрагмент ДНК, в котором ДНК-фрагменты XN и ХР были лигированы по Xbal-сайту (фиг.4).Separately, the Pα fragment was digested with restriction enzymes BamHI and SalI and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to isolate a DNA fragment of approximately 8 thousand pairs of nucleotides, including the 8th exon. This fragment using T4 DNA ligase was ligated into the plasmid pBluescript II KS +, which was previously digested with restriction enzymes BamHI and Sall, and then used to transform E. coli cells to obtain plasmid pSB-1. Plasmid pSB-1 was digested with restriction enzyme NcoI and treated with DNA polymerase in the presence of 4 types of dNTP with the formation of "blunt ends". The resulting fragment was further digested with restriction enzyme XbaI and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel. A DNA fragment of approximately 2200 nucleotides XN, including the 8th exon, was isolated: then this fragment and plasmid pSB-1 were digested with restriction enzymes XbaI and PstI, and then the resulting products were subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel. An isolated DNA fragment with a length of approximately 2300 pairs of nucleotides — PX — not including the 8th exon, was ligated using T4 DNA ligase. This ligated fragment was further ligated using T4 DNA ligase into the plasmid pBluescript II KS +, which was previously digested with Xbal restriction enzyme, “blunted” the ends with T4 DNA polymerase in the presence of 4 types of dNTP, religionized using T4 DNA ligase and digested with restriction enzymes SmaI and PstI. After that, the obtained plasmid was used to transform E. coli. Colonies of transformed cells were tested to obtain pmSB-0 'plasmid carrying only one DNA fragment in which the XN and XP DNA fragments were ligated to the Xbal site (Fig. 4).
Пример 5Example 5
Конструирование основной части направляющего вектораThe construction of the main part of the guide vector
Для внесения рестрикционного EagI-сайта по XbaI-сайту плазмиды pmSB-0' был синтезирован олигонуклеотид, характеризующийся следующей 12-нуклеотидной последовательностью:To introduce the restriction EagI site at the XbaI site of plasmid pmSB-0 ', an oligonucleotide was synthesized, characterized by the following 12-nucleotide sequence:
5'-CTAGACGGCCGT-3' (12).5'-CTAGACGGCCGT-3 '(12).
Этот олигонуклеотид способен отжигаться на нуклеотидную последовательность, характеризующуюся комплементарностью по участку CGGCCG с образованием следующей нуклеотидной последовательности после ее внесения по сайту, распознаваемому рестриктазой XbaI:This oligonucleotide is able to anneal to a nucleotide sequence characterized by complementarity in the CGGCCG region with the formation of the following nucleotide sequence after its introduction at the site recognized by XbaI restriction enzyme:
5'-TCTAGACGGCCGTCTAGA-3'5'-TCTAGACGGCCGTCTAGA-3 '
3'-AGATCTGCCGGCAGATCT-3'3'-AGATCTGCCGGCAGATCT-3 '
----------------------------------
XbaI EagI XbaIXbaI EagI XbaI
После расщепления плазмиды pmSB-0' рестриктазой XbaI указанный выше олигонуклеотид добавляли к продукту и лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4, а затем использовали для трансформации E.coli с целью получения плазмиды pmSB-0'eag, в последовательности которой EagI-сайт был встроен по XbaI-сайту плазмиды pmSB-0'. После расщепления плазмиды pmSB-0' рестриктазами NcoI и SalI полученные в результате фрагменты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 5300 пар нуклеотидов - SN, - включающего 8-й экзон. Отдельно плазмиду pSB-1 расщепляли рестриктазами BamHI и NcoI и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением ДНК-фрагмента длиной примерно 2 тысячи пар нуклеотидов - NB, не включающего 8-й экзон. Фрагменты SN и NB лигировали друг на друга с использованием ДНК-лигазы Т4 и обрабатывали рестриктазами BamHI и SalI с получением фрагмента ДНК, в составе которого оба ДНК-фрагмента лигированы по Ncol-сайту. Этот фрагмент ДНК далее лигировали в состав плазмиды pBluescript II KS+ с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации клеток E.coli с целью получения плазмиды рА (фиг. 5), при том, что предварительно плазмиды pBluescript II KS+ расщепляли рестриктазой NotI, «затупляли» концы с использованием нуклеазы фасоли-мунго, религировали с использованием ДНК-лигазы Т4 с разрушением NotI-сайта и EagI-сайта, перекрывающихся в данном сайте, с последующим расщеплением рестриктазами BamHI и SalI.After digestion of the plasmid pmSB-0 with XbaI restriction enzyme, the above oligonucleotide was added to the product and ligated using T4 DNA ligase, and then used to transform E. coli to obtain the plasmid pmSB-0'eag, in the sequence of which the EagI site was inserted at the XbaI site of plasmid pmSB-0 '. After digestion of the plasmid pmSB-0 'with restriction enzymes NcoI and SalI, the resulting fragments were subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to isolate a DNA fragment with a length of approximately 5300 pairs of SN nucleotides, including the 8th exon. Separately, the plasmid pSB-1 was digested with restriction enzymes BamHI and NcoI and then subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to isolate a DNA fragment with a length of about 2 thousand pairs of nucleotides — NB, not including the 8th exon. Fragments SN and NB were ligated onto each other using T4 DNA ligase and digested with BamHI and SalI restriction enzymes to obtain a DNA fragment in which both DNA fragments were ligated at the Ncol site. This DNA fragment was further ligated into the pBluescript II KS + plasmid using T4 DNA ligase and then used to transform E. coli cells to obtain plasmid pA (Fig. 5), while the plasmids pBluescript II KS + were first digested with NotI restriction enzyme, “Blunted” the ends using bean-mungo nuclease, religion using T4 DNA ligase with destruction of the NotI site and EagI site overlapping at this site, followed by cleavage with restriction enzymes BamHI and SalI.
Пример 6Example 6
Конструирование направляющего вектораConstruction of the guide vector
Плазмиду pPNT (L.J.Victor et al., 1991, Cell, 65, р.1153) расщепляли рестриктазами XhoI и BamHI и затем обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с целью получения «тупых концов» и подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Отобранный ДНК-фрагмент, включающий экспрессионную кассету neo, лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBS246 (Gibco BRL), которую предварительно расщепляли рестриктазой BamHI и обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 с целью «затупления» концов, а затем использовали для трансформации E.coli с целью получения плазмиды pBS246neo. Эту плазмиду расщепляли рестриктазой NotI и затем подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК длиной примерно 2 тысячи пар нуклеотидов, включающего экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP. Выделенный ДНК-фрагмент с использованием ДНК-лигазы Т4 лигировали в состав плазмиды рА, которую предварительно расщепляли рестриктазой EagI, а затем использовали для трансформации клеток E.coli. Колонии трансформированных клеток затем тестировали на присутствие плазмиды рВ, в составе которой ген neo и ген PS-1 ориентированы одинаково (фиг.6).Plasmid pPNT (L.J. Victor et al., 1991, Cell, 65, p. 1153) was digested with restriction enzymes XhoI and BamHI and then treated with T4 DNA polymerase to obtain "blunt ends" and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel. The selected DNA fragment, including the neo expression cassette, was ligated using T4 DNA ligase into plasmid pBS246 (Gibco BRL), which was previously digested with BamHI restriction enzyme and treated with T4 DNA polymerase to “blunt” the ends, and then used to transform E .coli to obtain plasmid pBS246neo. This plasmid was digested with NotI restriction enzyme and then subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to isolate a DNA fragment of approximately 2 thousand pairs of nucleotides in length, including a neo expression cassette flanked by loxP sequences. The isolated DNA fragment using T4 DNA ligase was ligated into the plasmid pA, which was previously digested with restriction enzyme EagI, and then used to transform E. coli cells. The colonies of the transformed cells were then tested for the presence of the plasmid pB, in which the neo gene and the PS-1 gene are oriented identically (Fig. 6).
После расщепления плазмиды рВ рестриктазами BamHI и SalI полученные в результате фрагменты подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК - С, - включающего мутацию OS-2 и экспрессионную кассету neo, фланкированную последовательностями loxP. Сходным образом фрагмент Pα расщепляли рестриктазами SalI и BamHI и полученный в результате фрагмент ДНК длиной примерно 6,5 тысяч пар нуклеотидов субклонировали в состав плазмиды pBluescript II KS+ с получением плазмиды pSB-2, которую затем расщепляли рестриктазами HindIII и BamHI подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле с выделением фрагмента ДНК длиной примерно 4 тысячи пар нуклеотидов - D. Фрагменты ДНК С и D лигировали друг на друга с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем полученный продукт расщепляли рестриктазами HindIII и SalI с получением фрагмента ДНК, в составе которого фрагменты С и D лигированы по BamHI-сайту. Полученный ДНК-фрагмент далее был лигирован с использованием ДНК-лигазы Т4 в состав плазмиды pBluescript II KS+, которая предварительно была обработана рестриктазами HindIII и Sail, а затем использован для трансформации клеток E.coli с целью получения направляющего вектора pOS-2neoloxP (фиг.7).After digestion of the plasmid pB with restriction enzymes BamHI and SalI, the resulting fragments were subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel to isolate the DNA fragment C, including the OS-2 mutation and the neo expression cassette flanked by loxP sequences. Similarly, the Pα fragment was digested with restriction enzymes SalI and BamHI and the resulting DNA fragment of approximately 6.5 thousand pairs of nucleotides was subcloned into the plasmid pBluescript II KS + to obtain plasmid pSB-2, which was then digested with restriction enzymes HindIII and BamHI was subjected to electrophoresis in 1% - agarose gel with the isolation of a DNA fragment with a length of about 4 thousand pairs of nucleotides — D. DNA fragments C and D were ligated onto each other using T4 DNA ligase and then the resulting product was digested with restriction enzymes HindIII and SalI to obtain a DNA fragment, in which fragments C and D are ligated at the BamHI site. The obtained DNA fragment was further ligated using T4 DNA ligase into the plasmid pBluescript II KS +, which was previously treated with restriction enzymes HindIII and Sail, and then used to transform E. coli cells to obtain the pOS-2neoloxP guide vector (Fig. 7 )
Пример 7Example 7
Внесение направляющего вектора в клетки ESThe introduction of a guide vector in ES cells
Здесь и далее в описываемых примерах культуры ставили в инкубаторе при 37°С при 5% содержании углекислоты. Направляющий вектор вносили в клетки ES с помощью электропорации (линия R1), которые культивировали в среде DMEM, дополненной 15% плодной телячьей сывороткой и 1000 ед./мл LIF (ESGRO) (культуральная среда DMEM здесь и далее обозначается как среда ES). Культуральную среду заменяли на свежую среду ES за сутки до проведения электропорации и клетки R1 отбирали и промывали с использованием электропорационного буфера (20 мМ HEPES - рН=7,05, 137 мМ NaCI, 5 мМ KCl, 0,7 мМ Na2HPO4, 6 мМ декстрозы). Клетки R1 (107 клеток) смешивали с 25 мкг направляющего вектора pOS-2neoloxP, который предварительно был линеаризован с использованием рестриктазы NotI, а также 0,8 мл линеаризационного буфера с кювете для электропорации. Через 1-2 минуты клетки были подвергнуты обработке на пульсаторе Bio-Rad GenePilser (Bio-Rad) при параметрах пульса 240 В и 500 мкФ. Клетки ES отбирали центрифугированием и суспендировали в 30 мл культуральной среды ES. Суспензию клеток ES (по 2 мл) помещали на каждую из культуральных чашек, в которых размещались клетки-«кормилицы», находящиеся в 8 мл среды ES. К культуре добавляли антибиотик G418 (титр, 150 мкг/мл) через 12-18 часов, после чего культивирование вели неделю. В качестве клеток-«кормилиц» использовали фибробласты, введенные в культуру заявителями, которые были выделены из тел 12-13-дневных эмбрионов, развивающихся после скрещивания «нокаут» по HS1 мышей (I.Taniuchi et al., 1995, EMBO J., vol. 14, p.3664) и мышей линии ICR дикого типа.Hereinafter in the described examples, the cultures were set in an incubator at 37 ° C at 5% carbon dioxide content. The guide vector was introduced into ES cells by electroporation (line R1), which was cultured in DMEM supplemented with 15% fetal calf serum and 1000 units / ml LIF (ESGRO) (DMEM culture medium is hereinafter referred to as ES medium). The culture medium was replaced with fresh ES medium one day before electroporation and R1 cells were selected and washed using electroporation buffer (20 mM HEPES - pH = 7.05, 137 mM NaCI, 5 mM KCl, 0.7 mM Na 2 HPO 4 , 6 mM dextrose). R1 cells (10 7 cells) were mixed with 25 μg of the pOS-2neoloxP guide vector, which was previously linearized using NotI restriction enzyme, as well as 0.8 ml of linearization buffer with electroporation cuvette. After 1-2 minutes, the cells were processed on a Bio-Rad GenePilser (Bio-Rad) pulsator with a pulse parameters of 240 V and 500 μF. ES cells were selected by centrifugation and suspended in 30 ml of ES culture medium. A suspension of ES cells (2 ml) was placed on each of the culture plates in which the “nurse” cells were placed in 8 ml of ES medium. G418 antibiotic (titer, 150 μg / ml) was added to the culture after 12-18 hours, after which the cultivation was conducted for a week. Fibroblasts introduced into the culture by the applicants, which were isolated from the bodies of 12-13-day-old embryos developing after knockout crosses on HS1 mice (I. Taniuchi et al., 1995, EMBO J., vol. 14, p. 3664) and wild-type ICR mice.
Пример 8Example 8
Выделение клеток ES с помощью гомологичной рекомбинацииIsolation of ES cells by homologous recombination
Были отобраны колонии клеток ES, которые образовались в примере 7 в результате недельного культивирования после добавления G418. Каждую колонию разделяли на две части. Одну из этих частей ставили в дальнейшую культуру. Для отбора клонов, в которых имела место гомологичная рекомбинация, Другую часть промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), обрабатывали протеиназой-К и затем геномную ДНК отбирали и подвергали ПЦР с целью отбора клонов. Нуклеотидные последовательности синтетических затравок, использовавшихся в реакции ПЦР, были следующими:Colonies of ES cells were selected which were formed in Example 7 as a result of one week culture after addition of G418. Each colony was divided into two parts. One of these parts was put into further culture. To select clones in which homologous recombination took place, the Other part was washed with phosphate-buffered saline (PBS), treated with proteinase-K, and then genomic DNA was selected and subjected to PCR to select clones. The nucleotide sequences of the synthetic primers used in the PCR reaction were as follows:
Prsn-1-2: 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3' (нуклеотидная последовательность, находящаяся за пределами сконструированного направляющего вектора);Prsn-1-2: 5'-CCCAACTCTATTTCTACCCTCGTTCATCTG-3 '(nucleotide sequence outside the designed guide vector);
PKG-1: 5'-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3' (нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты neo).PKG-1: 5'-TAGTGAGACGTGCTACTTCCATTTGTCACG-3 '(nucleotide sequence of neo expression cassette).
Реакцию ПЦР проводили на протяжении 35 циклов при следующих условиях: 30 секунд при 93°С, 1 минута при 60°С и 3 минуты при 68°С в каждом цикле. Полученный ПЦР-продукт анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле с целью идентификации позитивного клона, который формирует бэнд в ожидаемом положении в геле. Оцененный в качестве позитивного клон далее подвергали ПЦР с использованием олигонуклеотидов PRL-101 и PRL-102. Полученный в результате ПЦР-продукт расщепляли рестриктазой Sau3AI и затем подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле. Внесение мутации проверяли с помощью расщепления бэндов и отбирали те клетки ES, в которых имела место желаемая гомологичная рекомбинация. Нуклеотидные последовательности PRL-101 и PRL-102 были следующими:The PCR reaction was carried out for 35 cycles under the following conditions: 30 seconds at 93 ° C, 1 minute at 60 ° C and 3 minutes at 68 ° C in each cycle. The resulting PCR product was analyzed by electrophoresis in a 1% agarose gel in order to identify a positive clone that forms a band at the expected position in the gel. Estimated as a positive clone was further subjected to PCR using oligonucleotides PRL-101 and PRL-102. The resulting PCR product was digested with restriction enzyme Sau3AI and then subjected to electrophoresis on a 2% agarose gel. The introduction of the mutation was checked by band digestion and those ES cells in which the desired homologous recombination took place were selected. The nucleotide sequences of PRL-101 and PRL-102 were as follows:
PRL-101: 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3';PRL-101: 5'-TGCTGGAGGAAAATGTGTTATTTAAGAGCA-3 ';
PRL-102: 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3'.PRL-102: 5'-TACTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCATGC-3 '.
Пример 9Example 9
Получение «нокин» мышиGetting mouse nokin
Клетки ES, для которых была подтверждена гомологичная рекомбинация, были далее прокультивированы в течение 4 дней и затем обработаны трипсином с целью отделения друг от друга. Из самок мышей линии BDF1 были выделены 8-клеточные эмбрионы (этих самок скрещивали с самцом линии BDF1), после чего удаляли вителлиновый слой (zona pellucida). Отделенные друг от друга клетки ES помещали на открытый безвителлиновый эмбрион (20 клеток ES в расчете на один 8-клеточный эмбрион). Обработанный эмбрион реимплантировали в матку ложнобеременной самки мыши и эмбриональное развитие продолжалось вплоть до появления мозаичной мыши. Полученного в результате мозаичного самца мыши скрещивали с самкой линии C57BL/6. Из потомства такого скрещивания отбирали мышей с окраской дикого типа «агути». Вырезали кусочек ткани хвоста и из каждого такого образца экстрагировали геномную ДНК. ПЦР проводили с использованием затравок PRL-101 и PRL-102 и полученный ПЦР-продукт расщепляли рестриктазой Sаu3АI и затем подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле. Присутствие расщепленных бэндов анализировали с целью подтверждения того, что отобранное потомство несет мутацию OS-2. Из проверенного потомства был отобран один самец, которого обозначили как №2.ES cells for which homologous recombination was confirmed were further cultured for 4 days and then trypsinized to separate from each other. 8-cell embryos were isolated from female BDF1 mice (these females were crossed with a male BDF1 line), after which the vitellin layer (zona pellucida) was removed. Separated ES cells were placed on an open bezvitelinovy embryo (20 ES cells per one 8-cell embryo). The treated embryo was reimplanted into the uterus of the maternal female mouse and embryonic development continued until a mosaic mouse appeared. The resulting mosaic male mice were crossed with a female C57BL / 6 line. Mice with wild-type agouti were selected from the offspring of this cross. A piece of tail tissue was cut out and genomic DNA was extracted from each such sample. PCR was performed using primers PRL-101 and PRL-102, and the resulting PCR product was digested with restriction enzyme Sau3AI and then subjected to electrophoresis on a 2% agarose gel. The presence of split bands was analyzed to confirm that the selected offspring carries an OS-2 mutation. One male was selected from the verified offspring, which was designated as No. 2.
Пример 10Example 10
«Нокин» особь №2, полученная в примере 9, характеризуется гетерозиготностью по экспрессионной кассете neo, фланкированной последовательностями loxP, происходящей из состава направляющего вектора. Эту мышь №2 (самец возраста примерно 4 месяца) скрещивали с самкой мыши трансгенной линии CAG-cre№13 в 4-м поколении (возраст 2 месяца, внесен ген cre, находящийся в гетерозиготном состоянии: K.Sakai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, p.318). ПЦР осуществляли с использованием олигонуклеотидов PRL-100, PRL-102 и PGK-1 с соблюдением условий, описанных в примере 8. Мышь, из генома которой была удалена экспрессионная кассета neo, была выбрана как мутантная по OS-2 «нокин» мышь, лишенная экспрессионной кассеты neo (фиг.8). Эта мышь была гетерозиготной по мутации OS-2 и несла единственную последовательность loxP. Нуклеотидные последовательности PRL-100, PRL-102 и PGK-1, использовавшиеся для проведения ПЦР, были следующими:“Nokin” specimen No. 2 obtained in Example 9 is characterized by heterozygosity for the neo expression cassette flanked by loxP sequences originating from the composition of the guide vector. This mouse No. 2 (a male about 4 months old) was crossed with a female mouse of the CAG-cre # 13 transgenic mouse in the 4th generation (
PRL-100: 5'-GGT ССА ТСС CAG СТТ САС АСА GAC AAG ТСТ-3'PRL-100: 5'-GGT CCA TCC CAG CTT CAC ACA GAC AAG TST-3 '
PRL-102: 5'-ТАС TGA ААТ САС AGC САА GAT GAG CCA TGC-3'PRL-102: 5'-TAC TGA AAT CAC AGC CAA GAT GAG CCA TGC-3 '
PKG-1: 5'-TAG TGA GAC GTG СТА СТТ ССА ТТТ GTC ACG-3'.PKG-1: 5'-TAG TGA GAC GTG STA CTT SSA TTT GTC ACG-3 '.
Промышленное применениеIndustrial application
Генетически мутированное животное по настоящему изобретению характеризуется наличием мутантного гена пресенилина-1 и высоким уровнем выработки β-амилоидного белка в результате наличия гена, отличающегося от такового у нормального животного, не имеющего такой мутации, следовательно, это животное проявляет симптомы болезни Альцгеймера, связанные с быстрой гибелью клеток или разрушением нейронов в гиппокампе головного мозга. Следовательно, скрининг субстанций, применимых для профилактики и (или) лечения болезни Альцгеймера, и оценка их применимости могут быть проведены с использованием генетически мутированного животного по настоящему изобретению.The genetically mutated animal of the present invention is characterized by the presence of a mutant presenilin-1 gene and a high level of β-amyloid protein production as a result of the presence of a gene different from that of a normal animal that does not have such a mutation, therefore, this animal exhibits Alzheimer's disease symptoms associated with rapid cell death or destruction of neurons in the hippocampus of the brain. Therefore, screening of substances useful for the prophylaxis and / or treatment of Alzheimer's disease and evaluation of their applicability can be carried out using the genetically mutated animal of the present invention.
Claims (25)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10/2191 | 1998-01-08 | ||
| JP219198 | 1998-01-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000120677A RU2000120677A (en) | 2002-10-20 |
| RU2266002C2 true RU2266002C2 (en) | 2005-12-20 |
Family
ID=11522482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000120677/13A RU2266002C2 (en) | 1998-01-08 | 1999-01-07 | Method for obtaining animal being distinct against a man with a certain mutated gene, method for testing substance to be applied for treating alzheimer's disease (variants), plasmid (variants), method for obtaining primary cell culture or subcultivated cell |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7022893B1 (en) |
| EP (1) | EP1044605B1 (en) |
| JP (1) | JP4290329B2 (en) |
| KR (1) | KR100646816B1 (en) |
| CN (1) | CN1292638A (en) |
| AU (1) | AU1784499A (en) |
| CA (1) | CA2317809A1 (en) |
| DE (1) | DE69935903T2 (en) |
| HK (1) | HK1031983A1 (en) |
| NO (1) | NO20003495L (en) |
| RU (1) | RU2266002C2 (en) |
| TW (2) | TW200529742A (en) |
| WO (1) | WO1999034670A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757114C1 (en) * | 2020-08-05 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | METHOD FOR OBTAINING A LINE OF HUMANISED MICE, TRANSGENIC BY hACE2 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6284944B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-09-04 | Cephalon, Inc, | Gene-targeted non-human mammal with a human fad presenilin mutation and generational offspring |
| AU2001276995C1 (en) * | 2000-07-20 | 2006-10-26 | Cephalon, Inc. | Gene-targeted non-human mammal with human fad presenilin mutation and generational offspring |
| AUPR446701A0 (en) | 2001-04-18 | 2001-05-17 | Gene Stream Pty Ltd | Transgenic mammals for pharmacological and toxicological studies |
| KR100462180B1 (en) * | 2001-11-20 | 2004-12-16 | (주) 디지탈바이오텍 | Transgenic animal with genes relating to Alzheimer's disease and the method of producing thereof |
| KR100584914B1 (en) * | 2004-03-30 | 2006-05-30 | 주식회사 뉴로테크 | Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP |
| US8124831B2 (en) * | 2006-07-06 | 2012-02-28 | Duke University | Transgenic mice carrying functional single nucleotide polymorphisms in brain-specific tryptophan hydroxylase |
| CN105494263B (en) * | 2015-12-25 | 2018-11-30 | 哈尔滨医科大学 | A method of generating tri- transgenosis Alzheimer disease mouse model of HO-1/APP/PSEN1 |
| CA3064864A1 (en) * | 2017-05-25 | 2018-11-29 | New York Stem Cell Foundation, Inc. | Method and composition for generating basal forebrain cholinergic neurons (bfcns) |
| US10463029B1 (en) * | 2018-06-07 | 2019-11-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodent model of steel syndrome |
| EP4054324A1 (en) | 2019-11-05 | 2022-09-14 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | A murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
| US11266129B2 (en) | 2019-11-05 | 2022-03-08 | Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. | Murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia |
| KR102584857B1 (en) * | 2020-09-23 | 2023-10-06 | 재단법인대구경북과학기술원 | Animal model for Alzheimer’s disease and uses thereof |
| KR20230009140A (en) * | 2021-07-08 | 2023-01-17 | 주식회사 엠케이바이오텍 | Generation of cognitive disorder dog model expressing human mutant Presenilin-1 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68928062T2 (en) | 1988-04-15 | 1997-10-09 | Du Pont Merck Pharma | P1 BACTERIOPHAGE CLONING SYSTEM FOR UP TO 95 KB SIZE DNA FRAGMENTS |
| US5650550A (en) * | 1993-10-01 | 1997-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mutant mice having a deficit of functional estrogen receptors |
| US5877399A (en) | 1994-01-27 | 1999-03-02 | Johns Hopkins University | Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease |
| US5986054A (en) * | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| JP2001514528A (en) * | 1997-05-14 | 2001-09-11 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | Transgenic animals expressing unnatural wild-type and familial Alzheimer's disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background |
-
1999
- 1999-01-07 AU AU17844/99A patent/AU1784499A/en not_active Abandoned
- 1999-01-07 RU RU2000120677/13A patent/RU2266002C2/en active
- 1999-01-07 KR KR1020007007576A patent/KR100646816B1/en not_active IP Right Cessation
- 1999-01-07 WO PCT/JP1999/000015 patent/WO1999034670A1/en active IP Right Grant
- 1999-01-07 CA CA002317809A patent/CA2317809A1/en not_active Abandoned
- 1999-01-07 US US09/581,528 patent/US7022893B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 DE DE69935903T patent/DE69935903T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 JP JP2000527142A patent/JP4290329B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 EP EP99900133A patent/EP1044605B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-07 CN CN998037990A patent/CN1292638A/en active Pending
- 1999-01-08 TW TW094110822A patent/TW200529742A/en unknown
- 1999-01-08 TW TW088100217A patent/TWI240752B/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-07-07 NO NO20003495A patent/NO20003495L/en not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-04-17 HK HK01102706A patent/HK1031983A1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| K.DUFF et al., "Increased amyloid-beta42(43) in brains of mice expressing mutant presenilin 1", Nature, vol.383, p.710-713, 1996.. D.R.BORCHELT et al., "Familia 1 Alzheimer's disease-linked presenilin 1 variants elevate Abeta 1-42/1-40 ratio in vitro and in vivo". Neuron, vol. 17, p.1005-1013, 1996. К.KAMINO et al., "Three different mutations of presenilin 1 gene in earlyonset Aizheimer's disease families", Neuroscience Letters, vol. 208. p.195-198, 1996. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757114C1 (en) * | 2020-08-05 | 2021-10-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук | METHOD FOR OBTAINING A LINE OF HUMANISED MICE, TRANSGENIC BY hACE2 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1784499A (en) | 1999-07-26 |
| HK1031983A1 (en) | 2001-07-06 |
| JP4290329B2 (en) | 2009-07-01 |
| US7022893B1 (en) | 2006-04-04 |
| NO20003495D0 (en) | 2000-07-07 |
| DE69935903D1 (en) | 2007-06-06 |
| WO1999034670A1 (en) | 1999-07-15 |
| EP1044605A1 (en) | 2000-10-18 |
| NO20003495L (en) | 2000-09-07 |
| TWI240752B (en) | 2005-10-01 |
| DE69935903T2 (en) | 2008-01-10 |
| EP1044605A4 (en) | 2003-05-07 |
| TW200529742A (en) | 2005-09-16 |
| CN1292638A (en) | 2001-04-25 |
| KR20010040330A (en) | 2001-05-15 |
| CA2317809A1 (en) | 1999-07-15 |
| EP1044605B1 (en) | 2007-04-25 |
| KR100646816B1 (en) | 2006-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Von Koch et al. | Generation of APLP2 KO mice and early postnatal lethality in APLP2/APP double KO mice | |
| AU671093B2 (en) | Transgenic animal models for alzheimer's disease | |
| US6187992B1 (en) | Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene | |
| RU2266002C2 (en) | Method for obtaining animal being distinct against a man with a certain mutated gene, method for testing substance to be applied for treating alzheimer's disease (variants), plasmid (variants), method for obtaining primary cell culture or subcultivated cell | |
| WO1997048792A9 (en) | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease | |
| EP0904349A1 (en) | Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease | |
| JPH07132033A (en) | Transgenic animal for alzheimer's disease model | |
| JP2001517065A (en) | Methods for identifying therapeutic agents for Alzheimer's disease using transgenic animal models | |
| JP4302158B2 (en) | Transgenic animal model for Alzheimer's disease | |
| US6452065B2 (en) | Transgenic mouse expressing non-native wild-type and familial Alzheimer's Disease mutant presenilin 1 protein on native presenilin 1 null background | |
| Loring et al. | Rational design of an animal model for Alzheimer's disease: introduction of multiple human genomic transgenes to reproduce AD pathology in a rodent | |
| US6593512B1 (en) | Transgenic mouse expressing human tau gene | |
| US20070022483A1 (en) | Transgenic animal model for Alzheimer's disease | |
| JP2003504015A (en) | Transgenic animals as models for neurodegenerative diseases | |
| JP4938956B2 (en) | Transgenic animal model of neurodegenerative disorder | |
| KR100699453B1 (en) | Transgenic animals as models for neurodegenerative disease | |
| US7432414B2 (en) | Transgenic mouse having an amyloid precursor protein with a modified beta secretase cleavage site | |
| US20080295186A1 (en) | Neurotrypsin overexpressing animal | |
| Wadsworth et al. | Transgenic mouse expressing APP 770 | |
| Von Koch | Molecular analysis of a homologue of the mouse beta-amyloid precursor protein, APLP2: Isolation of APLP2cDNA, characterization of the APLP2 gene promoter and gene targeting of APLP2 |