KR100584914B1 - Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머병 유발 형질전환 동물에 관한 것으로, 구체적으로는, 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터 및 이를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환 마우스는 인지능력 감소, 기억력 감소 및 불안감 증가와 같은 알츠하이머병 임상적 특징을 나타내어 알츠하이머병을 연구하기 위한 모델 동물로 유용하다.The present invention relates to an Alzheimer's disease-induced transgenic animal, specifically, an Alzheimer's disease-induced transformation vector comprising a gene encoding a mutant human amyloid beta precursor protein and an Alzheimer's disease induced by transplanting the same into a nucleus of a fertilized egg The present invention relates to a transgenic mouse. Transgenic mice of the present invention exhibit clinical characteristics of Alzheimer's disease, such as decreased cognition, decreased memory and increased anxiety, and thus are useful as model animals for studying Alzheimer's disease.

Description

돌연변이 ＡＰＰ를 발현하는 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스{Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP} Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP             

도 1a는 본 발명에서 제조한 형질전환벡터 PDGF-APP(Sw, V717F)-pA 및 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-pA를 나타낸 모식도이다. Figure 1a is a schematic diagram showing the transformation vector PDGF-APP (Sw, V717F) -pA and PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA prepared in the present invention.

도 1b는 본 발명에서 제조한 형질전환 동물 Tg-APP/B6(-intron) 및 Tg-APP/B6(+intron)에 돌연변이 APP751 유전자가 삽입되었는지 확인한 서던블랏 분석 사진이다. 도면에서 화살표는 SpeI에 의해 절단된 2.3 kb APP751 절편을 나타낸다. 1B is a Southern blot analysis photograph confirming that the mutant APP751 gene is inserted into the transgenic animals Tg-APP / B6 (-intron) and Tg-APP / B6 (+ intron) prepared in the present invention. Arrows in the figure indicate 2.3 kb APP751 segments cut by Spe I.

도 1c는 본 발명에서 제조한 형질전환 동물 Tg-APP/B6(-intron) 및 Tg-APP/B6(+intron)에서 돌연변이 APP751 유전자가 발현되는지 확인한 노던블랏 분석 사진이다. 도면에서 위쪽 화살표는 내부에 존재하는 APP 전사체를 나타내고, 아래쪽 화살표는 본 발명의 돌연변이 APP 전사체를 나타낸다. Figure 1c is a Northern blot analysis picture confirming that the mutant APP751 gene is expressed in the transgenic animals Tg-APP / B6 (-intron) and Tg-APP / B6 (+ intron) prepared in the present invention. In the figure, the up arrow represents the APP transcript present therein, and the down arrow represents the mutant APP transcript of the present invention.

도 2a는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 APP751 단백질을 생산하는지 확인한 웨스턴 블랏 분석 사진이다. 윗패널은 모노클로날 APP751 항체, 아랫패널은 폴리클로날 APP751 항체를 사용하여 분석한 것이고, 짧은 화살표는 내부 발현된 APP 단백질의 위치, 긴 화살표는 돌연변이 APP751 단백질의 위치를 나타낸다. Figure 2a is a Western blot analysis picture confirming that the Tg-APP / B6 transgenic mouse of the present invention produces APP751 protein. The top panel is analyzed using a monoclonal APP751 antibody, the bottom panel is a polyclonal APP751 antibody, the short arrow indicates the position of the internally expressed APP protein, and the long arrow indicates the position of the mutant APP751 protein.

도 2b는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 인간 APP의 Aβ부위 단백질(6E10)을 생산하는지와 호모 및 헤테로 형질전환 마우스에서의 인간 APP의 Aβ 단백질의 발현양이 변화하는지를 비교한 웨스턴 블랏 분석 사진이다. FIG. 2b is a comparison of the Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention producing Aβ site protein (6E10) of human APP and whether the expression level of Aβ protein of human APP in homo and heterotransfected mice is changed. Blot analysis picture.

도 2c는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 βCTF 및 αCTF 단백질을 발현하는지 확인한 웨스턴 블랏 분석(왼쪽)과 이를 수치화한 그래프(오른쪽)이다. FIG. 2C is a Western blot analysis (left) and a graph (quantitative right) confirming that Tg-APP / B6 transgenic mice express βCTF and αCTF proteins.

도 2d는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 대뇌 피질(CX) 및 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 돌연변이 APP751 단백질이 발현하는 것을 확인한 면역조직학적 분석사진이다. Figure 2d is an immune tissue confirmed that the expression of mutant APP751 protein in the CA1 and CA3 site and dentate gyrus (DG) site in the cerebral cortex (CX) and hippocampus (HP) of the Tg-APP / B6 transgenic mouse brain of the present invention Analytical photograph

도 3은 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 정상 마우스에 비해 칼비딘의 발현 감소, 파브알부민과 칼레티닌의 발현 유지된 것을 나타낸 면역조직학적 분석사진이다. Figure 3 shows the reduction of the expression of calvidin in the CA1 and CA3 site and the dentate gyrus (DG) site in the hippocampus (HP) of the Tg-APP / B6 transgenic mouse brain of the present invention, Fabalbumin and calletinin Immunohistochemical analysis showing that expression was maintained.

도 4는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 뇌의 해마(HP)에 있는 CA1과 CA3 부위 및 치상회(DG) 부위에서 정상 마우스에 비해 c-랜의 발현량이 감소한 것을 나타낸 면역조직학적 분석사진이다. 4 is an immunohistochemical expression of the expression level of c-LAN in the CA1 and CA3 sites and the dentate gyrus (DG) site in the hippocampus (HP) of the Tg-APP / B6 transgenic mouse brain of the present invention, compared to normal mice. Analysis picture.

도 5는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(호모 및 헤테로)를 이용하여 운동성 불균형을 분석한 개방 범위 분석 및 로타-로드 분석 결과이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다. 5 is an open range analysis and rota-rod analysis results of motility imbalance using Tg-APP / B6 transgenic mice (homo and hetero) of the present invention. * In the graph indicates that the student t-test has a significance of p <0.05 in each experimental group.

도 6은 7개월령 및 14개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(헤테로)를 이용하여 인지능력 불균형을 분석한 모리스 물 미로 실험, 수동적 회피 실험 결과이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다. 6 is a Morris water maze experiment, passive avoidance test results of analyzing cognitive imbalance using the Tg-APP / B6 transgenic mice (hetero) of the present invention at 7 months and 14 months of age. * In the graph indicates that the student t-test has a significance of p <0.05 in each experimental group.

도 7은 17개월령 및 13개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스(호모 및 헤테로)를 이용하여 불안감 증가 현상을 분석한 증가된 플러스 미로 실험 결과(그래프 및 운동 이미지 그림)이다. 그래프에서 *는 스튜던트 t-테스트를 통해 각 실험군에서 p<0.05의 유의성을 가지는 것을 나타낸다. 운동 이미지 그림에서 CA는 닫혀진 통로, OA는 열려진 통로이다. FIG. 7 shows the results of an increased plus labyrinth experiment (graph and exercise image plot) analyzing anxiety increase using 17-month-old and 13-month-old Tg-APP / B6 transgenic mice (homo and hetero) of the present invention. * In the graph indicates that the student t-test has a significance of p <0.05 in each experimental group. In the motion image, CA is a closed passage and OA is an open passage.

도 8은 마이크로어레이 분석을 통해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스에서 발현량이 변화된 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다. 8 is a result of analyzing the expression amount of the gene expression changes in the Tg-APP / B6 transgenic mouse of the present invention through the microarray analysis through RT-PCR.

본 발명은 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 도입하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스에 관한 것이다.The present invention relates to Alzheimer's disease-induced transgenic mice, and more particularly, to Alzheimer's disease-induced transgenic mice prepared by introducing a mutant human amyloid beta precursor protein.

알츠하이머 병(Alzheimer's disease, AD)은 대뇌의 아밀로이드 침착, 신경섬유 농축, 뇌에서의 시냅스 및 뉴런의 소실과 같은 생화학적 및 조직학적 변화로 특징된다. 인간 알츠하이머 병 환자는 기억력 감퇴 및 증가된 불안과 과민 반응을 포함하는 심신적 비정상과 같은 심리적 증후를 보임으로써 복합적 인지력 결함을 보인다. 알츠하이머병과 관계된 유전자, 즉 APP(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527; Hsiao et al., Science, 1996, 274:99-102; Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13287-13292; Moechars et al., J Biol Chem, 1999, 274:6483-6492; Chishti et al., J Biol Chem, 2001, 276:21562-21570), 프리세닐린 1(presenilin 1, PS1)(Duff et al., Nature, 1996, 383:710-713; Begley et al., J Neurochem, 1999, 72:1030-1039; Barrow et al., Neurobiol Dis, 2000, 7:119-126) 또는 PS2(Oyama et al., N Neurochem, 1998, 71;313-322)에 돌연변이를 유도하여 제조한 돌연변이 유전자를 과발현하는 형질전환 마우스는 β-아밀로이드증(β-amyloidosis), 타우 병변(tauopathy), 신경세포성 소실(neuronal loss), 신경교증(gliosis) 및 인지능력 부족(cognitive defict)을 포함하는 광범위한 특성을 모방(mimic)하는 것으로 나타났다. 그러나, 실제 존재하는 어떠한 모델 동물도 알츠하이머병 징후의 완전한 범위를 전체적으로 반복하지는 못하였으며, 개발된 모델 동물을 가지고 실시한 실험에서 알츠하이머병의 징후는 개별적인 마우스 라인(line)에서만 나타나는 한계가 있었다. 따라서, 알츠하이머병 유사 뇌질환의 특성을 나타낼 수 있는 새로운 형질전환 마우스를 개발하는 것이 필요한 실정이다.Alzheimer's disease (AD) is characterized by biochemical and histological changes such as amyloid deposition in the cerebrum, nerve fiber enrichment, loss of synapses and neurons in the brain. Human Alzheimer's disease patients show complex cognitive deficits by showing psychological symptoms such as mental and mental abnormalities including memory loss and increased anxiety and irritability. Genes associated with Alzheimer's disease, namely APP (Games et al., Nature , 1995, 373: 523-527; Hsiao et al., Science , 1996, 274: 99-102; Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA , 1997, 94: 13287-13292; Moechars et al., J Biol Chem , 1999, 274: 6483-6492; Chishti et al., J Biol Chem , 2001, 276: 21562-21570), presenilin 1 1, PS1) (Duff et al., Nature , 1996, 383: 710-713; Begley et al., J Neurochem , 1999, 72: 1030-1039; Barrow et al., Neurobiol Dis , 2000, 7: 119- 126) or transgenic mice overexpressing a mutant gene prepared by inducing a mutation in PS2 (Oyama et al., N Neurochem , 1998, 71; 313-322) are β-amyloidosis and tauopathy. ), Mimics a wide range of properties including neuronal loss, gliosis and cognitive deficits. However, none of the model animals actually present fully repeat the full range of signs of Alzheimer's disease, and in experiments with developed model animals, the signs of Alzheimer's disease were limited to individual mouse lines. Therefore, there is a need to develop a new transgenic mouse that can exhibit the characteristics of Alzheimer's disease-like brain disease.

현재 개발된 알츠하이머병 모델 중에서, 특정 마우스 라인은 알츠하이머병의 병리생리학적 특성을 훌륭하게 나타내고 있으며, 이에 대해 많은 연구실에서 연구가 진행중이다. PDAPP 마우스는 혈소판-유도된 성장 인자(platelet-derived growth factor)-β유전자 프로모터의 조절아래 V717F 돌연변이를 포함하는 인간 APP 유전자(695, 751 및 770)를 발현한다. 상기 마우스는 6 내지 15개월령에서 세포외 아밀로이드 플라그, 시냅스세포 결손, 신경교증 증가 및 공간 지각력 부족과 같은 증상을 나타내었다(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527; Irizary et al., J Neurosci, 1997, 17:7053-7059; Chen et al., Nature, 2000, 408:975-979). Tg2576 마우스는 햄스터 프리온(prion) 단백질(PrP) 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디쉬(Swedish) 이중 돌연변이(K670, M671L)를 포함하는 인간 APP695 유전자를 발현한다. 9 내지 18 개월령의 Tg2576 마우스는 Aβ42의 상승, 아밀로이드 침착, 신경염적(neuritic) 감소, 염증성 변화 및 기억력 부족의 증상을 나타내었다. 그러나, 운동성은 정상이거나 심각하지 않은 결함을 나타내었고, 17개월령의 Tg2576 마우스에서는 불안증이 억제되었다(Hsiao et al., Science, 1996, 274:99-102; Benzing et al., Neurobiol Aging, 1999, 20:581-589; King et al., Behav Brain Res, 1999, 103:145-162; King et al., Physiol Behav, 2002, 75:627-642; Kawarabayashi et al., J Neurosci, 2001, 15:372-381; Terai et al., Neuroscience, 2001, 104:299-310; Lalonde et al., Brain Res, 2003, 977:38-45). TgCRND8 마우스는 햄스터 PrP 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디시 및 런던돌연변이를 포함하는 APP695 유전자를 발현한다. 상기 마우스는 3개월령에서 이른 시점에 나타나는 Aβ 플라그의 침착 및 공간 지각력 부족을 나타내었다(Janus et al., Nature, 2000, 408:979-982; Chishti et al., J Biol Chem, 2001, 276:21562-21570). APP23 마우스는 마우스 thy-1 유전자 프로모터의 조절 아래 스웨디시 돌연변이를 포함하는 인간 APP695 유전자를 발현한다. 상기 마우스는 6개월령에 Aβ 침착, 시냅스 세포 결손 및 공간 지각력에 있어서 불균형을 나타내었지만(Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13287-13292; Sturchler-Pierrat et al., Ann NY Acad Sci, 2000, 920:134-139), 16개월령 까지 불안감과 운동성은 변하지 않았다(Lalonde et al., Brain Res, 2002, 956:36-44). 또한, APP와 PS1 또는 tau 단백질을 발현하는 다른 형질전환 마우스가 개발되었으며, 이들은 알츠하이머병 뇌에서 나타나는 플라그 발병기전(pathogenesis)과 타우 병변(taupathy)을 동시에 나타내었다(Borchelt et al., Neuron, 1997, 19:939-945; Holcomb et al., Nature Med, 1998, 4:97-100; Dewachter et al., J Neurosci, 2000, 20:6452-6458; Lewis et al., Science, 2001, 293:1487-1491; Oddo et al., J Neurochem, 2003, 71:313-322). 현재까지 개발된 대부분의 알츠하이머병 모델 동물은 유전적 배경이 되는 마우스의 혼합으로 제조되었으며, 그 예로는 Swiss Webster 및 C57BL/6과 DBA/2의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 PDAPP 마우스; C57BL/6와 SJL의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 Tg2576 마우스; C3H와 C57BL/6의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 TgCRND8 마우스; 및 C57BL/6와 DBA2의 하이브리드를 유전적 배경으로 하여 제조된 APP23 마우스가 있다.Among the models of Alzheimer's disease currently being developed, certain mouse lines have excellent pathophysiological characteristics of Alzheimer's disease, and many laboratories are working on this. PDAPP mice express human APP genes (695, 751 and 770) comprising the V717F mutation under the control of platelet-derived growth factor-β gene promoters. The mice showed symptoms such as extracellular amyloid plaques, synaptic cell defects, increased gliosis and lack of spatial perception at 6 to 15 months of age (Games et al., Nature , 1995, 373: 523-527; Irizary et al. , J Neurosci , 1997, 17: 7053-7059; Chen et al., Nature , 2000, 408: 975-979). Tg2576 mice express human APP695 gene, including Swedish double mutations (K670, M671L) under the control of the hamster prion protein (PrP) gene promoter. Tg2576 mice 9-18 months of age showed symptoms of elevated Aβ 42, amyloid deposition, neuritic reduction, inflammatory changes and memory deficiency. However, motility showed normal or non-severe defects, and anxiety was suppressed in 17-month-old Tg2576 mice (Hsiao et al., Science , 1996, 274: 99-102; Benzing et al., Neurobiol Aging , 1999, 20: 581-589; King et al., Behav Brain Res , 1999, 103: 145-162; King et al., Physiol Behav , 2002, 75: 627-642; Kawarabayashi et al., J Neurosci , 2001, 15 Terai et al., Neuroscience , 2001, 104: 299-310; Lalonde et al., Brain Res , 2003, 977: 38-45). TgCRND8 mice express the APP695 gene, including Swedish and London mutations under the control of the hamster PrP gene promoter. The mice showed deposition and spatial perception deficiency of Aβ plaques appearing early at 3 months of age (Janus et al., Nature , 2000, 408: 979-982; Chishti et al., J Biol Chem , 2001, 276: 21562-21570). APP23 mice express human APP695 genes, including Swedish mutations under the control of the mouse thy-1 gene promoter. The mice showed an imbalance in Aβ deposition, synaptic cell defects and spatial perception at 6 months of age (Sturchler-Pierrat et al., Proc Natl Acad Sci USA , 1997, 94: 13287-13292; Sturchler-Pierrat et al., Ann NY Acad Sci, 2000, 920: 134-139), anxiety and motility did not change until 16 months of age (Lalonde et al., Brain Res, 2002, 956: 36-44). In addition, other transgenic mice expressing APP and PS1 or tau proteins have been developed, which simultaneously show plaque pathogenesis and taupathy in Alzheimer's disease brain (Borchelt et al., Neuron , 1997). , 19: 939-945; Holcomb et al., Nature Med , 1998, 4: 97-100; Dewachter et al., J Neurosci , 2000, 20: 6452-6458; Lewis et al., Science , 2001, 293: 1487-1491; Oddo et al., J Neurochem , 2003, 71: 313-322). Most Alzheimer's disease model animals developed to date have been produced with a mixture of mice of genetic background, such as PDAPP mice produced with a genetic background of Swiss Webster and hybrids of C57BL / 6 and DBA / 2; Tg2576 mice prepared with a hybrid of C57BL / 6 and SJL as the genetic background; TgCRND8 mice prepared with a hybrid of C3H and C57BL / 6 as the genetic background; And APP23 mice prepared with a hybrid of C57BL / 6 and DBA2 as the genetic background.

이에, 본 발명자들은 알츠하이머병의 임상적 특징을 효과적으로 나타낼수 있는 모델 동물의 부족을 개선하기 위해 노력하던 중, 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질을 돌연변이 유도하여 제조한 단백질을 수정란의 핵에 이식하여 제조한 형질전환 마우스가 알츠하이머병의 임상적 특징을 효과적으로 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors are trying to improve the shortage of model animals that can effectively represent the clinical characteristics of Alzheimer's disease, the traits produced by transplanting the protein produced by mutation-induced human amyloid beta precursor protein into the nucleus of the fertilized egg The present invention was completed by confirming that the converting mouse effectively represents the clinical characteristics of Alzheimer's disease.

본 발명의 목적은 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터 및 이를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a transforming vector for inducing Alzheimer's disease and an Alzheimer's disease-inducing transformed mouse prepared by transplanting the same into a nucleus of an fertilized egg.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a transformation vector for inducing Alzheimer's disease comprising a gene encoding a mutant human amyloid beta precursor protein (APP).

또한, 본 발명은 상기 형질전환 벡터를 마우스 수정란의 핵에 이식하여 제조한 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스를 제공한다.The present invention also provides an Alzheimer's disease-induced transgenic mouse prepared by transplanting the transgenic vector into the nucleus of a mouse fertilized egg.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)을 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병 유발용 형질전환벡터를 제공한다.The present invention provides a transformation vector for inducing Alzheimer's disease comprising a gene encoding a mutant human amyloid beta precursor protein (APP).

상기 돌연변이 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(APP)은 서열번호 2로 기재되는 APP751 단백질의 670번째 아미노산 리신(K)을 아스파라긴(N)으로 치환하고, 671번째 아미노산 메티오닌(M)을 루이신(L)으로 치환하며, 717번째 아미노산 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환한 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질인 것이 바람직하다. 상기에서 서열번호 2로 기재되는 APP751 단백질의 670번째 아미노산 리신(K)을 아스파라긴(N)으로 치환하고, 671번째 아미노산 메티오닌(M)을 루이신(L)으로 치환하는 것은 스웨디시 돌연변이(Swedish mutation)이라 하고, 상기에서 717번째 아미노산 발린(V)을 페닐알라닌(F)으로 치환하는 것을 V717F 돌연변이라 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기에서 제시한 대로 돌연변이 APP 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하고, 이를 "hAPP(Sw, V717F)"라 명명하였다.The mutant human amyloid beta precursor protein (APP) replaces the 670th amino acid lysine (K) of the APP751 protein of SEQ ID NO: 2 with asparagine (N) and the 671th amino acid methionine (M) with leucine (L). It is preferable that the protein has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3 in which the 717th amino acid valine (V) is substituted with phenylalanine (F). Substituting the 670th amino acid lysine (K) of the APP751 protein described in SEQ ID NO: 2 with asparagine (N) and replacing the 671th amino acid methionine (M) with leucine (L) is a Swedish mutation. ), And the substitution of the 717th amino acid valine (V) with phenylalanine (F) is called a V717F mutation. In a preferred embodiment of the present invention, a gene encoding a mutant APP protein as described above was prepared and named "hAPP (Sw, V717F)".

또한, 본 발명의 형질전환벡터는 PDGF-β프로모터 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 돌연변이 유전자의 앞에는 번역 효율을 높이기 위해 코작 서열(Kozac sequence)를 추가로 포함시킬 수도 있다. 본 발명에서는 PDGF-β프로모터 유전자, 코작 서열, 서열번호 3으로 기 재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하도록 형질전환벡터를 제조하고, 이를 "PDGF-APP(Sw, V717F)-polyA"라 명명하였다(도 1a 참조).In addition, the transformation vector of the present invention preferably includes a mutant gene (hAPP (Sw, V717F)) and an SV40 polyadenylation gene, which encode the PDGF-β promoter gene, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In front of the mutant gene may further include a Kozak sequence (Kozac sequence) to improve the translation efficiency. In the present invention, a transformation vector is prepared to include a mutant gene (hAPP (Sw, V717F)) and an SV40 polyadenylation gene, which encode a PDGF-β promoter gene, a Kozak sequence, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and It was named "PDGF-APP (Sw, V717F) -polyA" (see FIG. 1A ).

또한, 본 발명의 형질전환벡터는 PDGF-β프로모터 유전자와 hAPP751(Sw, V717F)유전자 유전자 사이에 추가로 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자는 돌연변이 유전자의 발현 효율을 증가시키고, 전사 안정도를 증가시키기 위해 삽입한 것으로서, 본 발명에서는 PDGF-β프로모터 유전자, 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자, 코작 서로, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는, 돌연변이 유전자(hAPP751(Sw, V717F)) 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하도록 형질전환벡터를 제조하고, 이를 "PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA"라 명명하였다(도 1a 참조).In addition, the transformation vector of the present invention preferably comprises an intron B gene derived from the human β-globin gene between the PDGF-β promoter gene and the hAPP751 (Sw, V717F) gene gene. The intron B gene derived from the human β-globin gene is inserted to increase the expression efficiency of the mutant gene and increase the transcriptional stability. In the present invention, the intron derived from the PDGF-β promoter gene and the human β-globin gene Transformation vectors were prepared to contain the mutant gene (hAPP751 (Sw, V717F)) and the SV40 polyadenylation gene, which encode the B gene, Kozak, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and were termed "PDGF-intron- APP (Sw, V717F) -polyA "( see FIG. 1A ).

또한, 본 발명은 상기 형질전환벡터를 마우스에 도입하여 제조한 알츠하이머 병 유발 형질전환 마우스를 제공한다.In addition, the present invention provides an Alzheimer's disease-induced transgenic mouse prepared by introducing the transgenic vector into a mouse.

본 발명의 형질전환 마우스에 도입되는 형질전환벡터는 PDGF-APP(Sw,V717F)-polyA 또는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA인 것이 바람직하며, PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA인 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 PDGF-APP(Sw,V717F)-polyA 또는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터를 각각 C75BL/6 마우스의 미수정란의 전핵에 미세주입하고, 이를 대리모에 이식하여 출생한 자손 및 이를 근교배하여 출생한 자손들에서 발현되는 APP(Sw, V717F) 돌연변이 유전자의 발현 양상을 비교한 결과, 인트론이 도입된 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터로 도입된 형질전환 마우스에서 훨씬 높은 발현을 나타내어 본 발명의 APP(Sw, V717F) 돌연변이 유전자를 효율적으로 도입시키고 높은 발현을 나타내기 위해서는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터로 도입하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.The transformation vector introduced into the transgenic mouse of the present invention is preferably PDGF-APP (Sw, V717F) -polyA or PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -polyA, and PDGF-intron-APP (Sw, V717F more preferably))-polyA. In a preferred embodiment of the present invention, the PDGF-APP (Sw, V717F) -polyA or PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -polyA transformation vector is microinjected into the pronucleus of unfertilized eggs of C75BL / 6 mice, respectively, As a result of comparing the expression pattern of APP (Sw, V717F) mutant gene expressed in progeny born by transplanting it into surrogate mother and progeny born by crossbreeding, PDGF-intron-APP (Sw, V717F) with intron was introduced. PDGF-intron-APP (Sw, V717F)-in order to efficiently express and express high expression of the APP (Sw, V717F) mutant gene of the present invention by expressing much higher expression in transgenic mice introduced with a polyA transformation vector. It was found that it is preferable to introduce into a polyA transformation vector.

본 발명에서는 PDGF-intron-APP(Sw, V717F)-polyA 형질전환벡터를 수정란의 핵에 이식하여 제조한 형질전환 마우스를 "Tg-APP/B6"라 명명하고, 상기 마우스에 서 APP 유전자의 발현 및 APP 단백질의 발현 수준을 분석한 뒤 본 발명의 돌연변이 APP 유전자가 효과적으로 도입되어 단백질 수준까지 발현이 됨을 확인하여 2004년 3월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10608BP).In the present invention, a transgenic mouse prepared by transplanting the PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -polyA transgenic vector into the nucleus of the fertilized egg is named "Tg-APP / B6", and the expression of the APP gene in the mouse is expressed. After analyzing the expression level of the APP protein and confirming that the mutant APP gene of the present invention is effectively introduced and expressed to the protein level, it was deposited on March 10, 2004 with the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank (Accession Number: KCTC 10608BP). ).

본 발명의 알츠하이머병 유발 형질전환 마우스(Tg-APP/B6)는 알츠하이머병의 임상적 특징인 운동성의 감소, 기억력 및 인지능력의 소실, 불안증세의 증가를 나타낸다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 알츠하이머병의 임상적 특징을 나타내는지 확인하기 위해 개방범위(Open field) 테스트, 로타-로드(Rota-rod) 테스트, 모리스 물 미로(Morris water maze) 테스트, 상승된 플러스 미로(elevated plus maze) 테스트, 수동적 회피(Passive avoidance) 테스트를 수행하였다. 그 결과, 개방범위 테스트에서는 정상마우스와 이동 능력에 있어서 별차이가 없었으나(도 5a 참조), 로타-로드 테스트에서는 정상마우스에 비해 운동 조정 능력과 운동 학습 능력이 감소되었고(도 5b 참조), 모리스 물 미로 테스트에서는 정상마우스에 비해 인지능력이 떨어져 기억력이 감소되는 결과를 나타내었으며(도 6a 내지 도 6d 참조), 상승된 플러스 미로 테스트에서는 정상마우스에 비해 불안감이 상당히 증가하였고(도 7c 및 도 7d 참조), 수동적 회피 테스트에서는 기억력 유지 능력이 감소되었다(도 7e 및 도 7f 참조). 따라서, 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 기억력 및 인지능력 감소, 불안감 증가와 같은 알츠하이머병의 임상적 특징을 그대로 나타냄을 알 수 있었다.Alzheimer's disease-induced transgenic mice of the present invention (Tg-APP / B6) show a decrease in motility, loss of memory and cognition, and anxiety, which are clinical features of Alzheimer's disease. In a preferred embodiment of the present invention, the open field test, Rota-rod test, Morris to determine whether the Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention exhibit clinical characteristics of Alzheimer's disease A Morris water maze test, an elevated plus maze test, and a passive avoidance test were performed. As a result, in the open range test, there was no difference between the normal mouse and the moving ability (see FIG. 5A ), but in the rota-rod test, the motor coordination ability and the exercise learning ability were reduced compared to the normal mouse (see FIG. 5B ). In the Morris water maze test, the cognitive ability was lowered compared to the normal mouse, resulting in a decrease in memory (see FIGS . 6A to 6D ), and in the elevated plus maze test, anxiety was significantly increased compared to the normal mouse ( FIG. 7C and FIG. In the passive avoidance test, the memory retention ability was reduced (see FIGS . 7E and 7F ). Therefore, it was found that the transgenic mice produced in the present invention exhibit clinical characteristics of Alzheimer's disease such as decreased memory, cognitive ability, and increased anxiety.

또한, 상기에서 확인한 불안감의 증가가 어떠한 원인으로 나타나는지 확인하기 위해 마이크로어레이 분석을 한 결과, TNF-α, T-LAK 세포-유도된 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 스타니오칼신, 칼모듈린 4, 사이토크롬 c, 17형 전구콜라겐 알파 1, 프로미닌 1 및 트랜스티레틴의 발현량이 증가하였으며, RT-PCR로 재확인한 실험에서도 같은 결과를 나타내어(도 8 참조), 이는 종래 발표된 문헌의 내용과도 일치하였다. 즉, 인간 재조합 TNF-α를 대뇌실(cerebroventricle)에 주입한 결과, 상승된 플러스 미로 테스트에서 불안감 유사 증세를 유발하였으며(Connor et al., Neuroscience, 1998, 84:923-933), T- LAK 세포-유래된 단백질 키나제는 TNF 수용체 활성과 관계있었다(Abe et al., J Leukoc Biol, 1995, 57:462-468). 또한, 높은 혈장 레닌(rennin) 활성은 증가된 불안감과 관계있다(Perini et al., J Hypertens, 1994, 12:601-607).In addition, microarray analysis was performed to determine what causes the increase in anxiety identified above. As a result, TNF-α, T-LAK cell-induced protein kinase, hematopoietic stem cell specific Lyn substrate 1, stanicalcin, and cal The expression levels of modulin 4, cytochrome c, type 17 procollagen alpha 1, prominin 1, and transthyretin were increased, and the same results were also confirmed in the experiments confirmed by RT-PCR (see FIG. 8 ). It is consistent with the contents of the literature. Injecting human recombinant TNF-α into the cerebroventricle resulted in anxiety-like symptoms in an elevated plus maze test (Connor et al., Neuroscience , 1998, 84: 923-933), T-LAK Cell-derived protein kinases have been associated with TNF receptor activity (Abe et al., J Leukoc Biol , 1995, 57: 462-468). In addition, high plasma rennin activity is associated with increased anxiety (Perini et al., J Hypertens , 1994, 12: 601-607).

따라서, 증가된 불안감이 인간 알츠하이머병의 가장 문제가 되는 증세이기 때문에(Folstein and Bylsma, 1999, In Alzheimer Disease(Eds by Terry et al.,) 2^nd. Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia), 불안감의 증가 증세를 나타내는 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 알츠하이머병 모델 동물로서 유용하게 사용될 수 있고, APP 단백질 관련 연구와 나이 의존적 증가되는 불안감을 연구하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, because of increased uncertainty because the symptoms are the most problematic of human Alzheimer's disease (Folstein and Bylsma, 1999, In Alzheimer Disease (Eds by Terry et al.,) 2 nd. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia), increased anxiety Transgenic mice produced in the present invention exhibiting symptoms can be usefully used as Alzheimer's disease model animals, and can be useful for studying APP protein-related studies and increasing age-dependent anxiety.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질 cDNA 유전자의 확보 및 APP 돌연변이 유전자의 제조Example 1 Acquisition of human amyloid beta precursor protein cDNA gene and production of APP mutant gene

<1-1> 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질 cDNA 유전자의 확보<1-1> Acquisition of the human amyloid beta precursor protein cDNA gene

서열번호 1로 기재되는 인간 아밀로이드 베타 전구 단백질(homo sapiens amyloid beta precursor protein, 이하 'APP'라 약칭함) 751의 cDNA 유전자(NCBI 유전자은행 기탁번호 NM_000484)는 인간 뇌에서 만들어진 마라톤-레디 라이브러리(Marathon-Ready cDNA library)(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로부터 PCR 증폭하여 제조하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머로는 서열번호 4로 기재되는 app-1f 프라이머 및 서열번호 5로 기재되는 app-1r 프라이머 쌍 및 서열번호 6으로 기재되는 app-2f 프라이머 및 서열번호 7로 기재되는 app-2r 프라이머 쌍을 각각 사용하였으며, 95℃에서 1분 동안 열변성, 55℃에서 1분 동안 프라이머 결합, 72℃에서 1분동안 길이연장 반응을 32회 반복하는 조건으로 PCR 반응을 실시하였다. APP cDNA에는 아미노산 잔기의 갯수에 따라 세 가지 이성체, 즉 APP770, APP751 및 APP695가 존재한다. APP770을 기준으로 개방판독틀(open reading frame, ORF)의 크기는 약 2.3 kb이다. APP695와 APP751의 전체 길이 cDNA를 PCR 방법으로 증폭하여 서브클로닝(subcloning)한 후 DNA 염기서열 분석을 통해 PCR 증폭 과정에서 의도하지 않게 생긴 염기 치환의 착오가 없는 것을 최종적으로 확인하였다.The cDNA gene (NCBI GenBank Accession No. NM_000484) of human amyloid beta precursor protein (hereinafter abbreviated as 'APP') 751 described in SEQ ID NO: 1 is a marathon-ready library (Marathon) It was prepared by PCR amplification from -Ready cDNA library (Clontech, Palo Alto, CA, USA). Primers used for PCR amplification include app-1f primers as shown in SEQ ID NO: 4 and app-1r primer pairs as shown in SEQ ID NO: 5 and app-2f primers as shown in SEQ ID NO: 6 and app-2r as shown in SEQ ID NO: 7 Primer pairs were used, respectively, and PCR reactions were performed under conditions including 32 times of thermal denaturation at 95 ° C., primer binding at 55 ° C. for 1 minute, and length extension reaction at 72 ° C. for 1 minute. There are three isomers in APP cDNA, namely APP770, APP751 and APP695, depending on the number of amino acid residues. Based on APP770, the size of the open reading frame (ORF) is about 2.3 kb. The full length cDNAs of APP695 and APP751 were amplified by subcloning by PCR, and finally DNA sequence analysis confirmed that there was no error in unintended base substitution during PCR amplification.

<1-2> APP751 돌연변이 유전자의 제조<1-2> Preparation of APP751 Mutant Gene

APP751 cDNA에 PCR 방법으로 "Swedish" 이중 돌연변이(서열번호 2로 기재되는 APP770 이성체 아미노산을 기준으로 할 때 K670N, M671L 돌연변이)와 "V717F 돌연변이(서열번호 2로 기재되는 APP770 이성체를 기준으로 V717F 돌연변이)을 각각 도입하였다. 구체적으로 상기 두가지 돌연변이의 유도는 서열번호 8로 기재되는 app-swe 프라이머와 서열번호 9로 기재되는 app-717-r 프라이머 쌍 및 서열번호 10으로 기재되는 app717-f 프라이머와 서열번호 5로 기재되는 app-1r 프라이머 쌍을 사용하였으며, 95℃에서 1분 동안 열변성, 57℃에서 40초 동안 프라이머 결합, 72℃에서 1분동안 길이연장 반응을 32회 반복하는 조건으로 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 상기 두가지 돌연변이가 도입되어 제조된 서열번호 3으로 기재되는 APP751 돌연변이 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 APP751 돌연변이 유전자를 "APP(Sw, V717F)"라 명명하였다. 돌연변이된 APP(Sw, V717F) 유전자의 염기서열은 DNA 염기서열 분석을 통해 확인하였다."Swedish" double mutant (K670N, M671L mutant based on APP770 isomeric amino acid as set out in SEQ ID NO: 2) and "V717F mutant (V717F mutant based on APP770 isomer as set out in SEQ ID NO: 2) by PCR method in APP751 cDNA) Specifically, the induction of the two mutations was carried out by the app-swe primer of SEQ ID NO: 8 and the app-717-r primer pair of SEQ ID NO: 9, and the app717-f primer and SEQ ID NO: 10, respectively. App-1r primer pair described in No. 5 was used, and PCR reaction was performed under conditions such as thermal denaturation at 95 ° C. for 1 minute, primer binding at 57 ° C. for 40 seconds, and length extension reaction at 72 ° C. for 1 minute. As a result, the APP751 mutation encoding the amino acid sequence of the APP751 mutant protein set forth in SEQ ID NO: 3 prepared by introducing the two mutations was performed. The gene was named "APP (Sw, V717F)". Sequencing of the mutated APP (Sw, V717F) gene was confirmed by DNA sequencing.

<실시예 2> APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트의 제조<Example 2> Preparation of the expression cassette for transformation containing the APP751 mutant gene

알츠하이머성 치매 동물 모델을 생산하기 위해 APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트를 제조하였다. 구체적으로, 프로모터로는 PDGF-β유전자의 프로모터 유전자(1.55 kb)(Games et al., Nature, 1995, 373:523-527)를 사용하였고, 수정란의 핵에 이식될 유전자로는 상기 실시예 1에서 제조한 APP(Sw, V717F) 유전자를 사용하였으며, 번역이 시작되는 ATG 코돈 앞에 코작 서열(Kozak sequence, GACC)을 삽입하여 번역 효율을 높이고자 하였다. 돌연변이 유전자의 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 신호를 위해 SV40-pA(SV40 late polyadenylation signal) 유전자(247 bp)는 pGK-neo-pA 벡터(Lee et al., J Neurosci, 2002, 15:7931-7940)로부터 분리하여 사용하였다. 돌연변이 유전자 뒷부분에 도입하였다. 최종적으로 PDGF-β프로모터-APP751(Sw, V717F)-pA의 순으로 발현 카세트를 제작하였으며, 이를 "PDGF-APP(Sw, V717F)-pA"라 명명하였다(도 1a).In order to produce an Alzheimer's dementia animal model, a transgenic expression cassette was prepared comprising the APP751 mutant gene. Specifically, a promoter gene (1.55 kb) (Games et al., Nature , 1995, 373: 523-527) of the PDGF-β gene was used as a promoter, and the gene to be transplanted into the nucleus of the fertilized egg was described in Example 1 The APP (Sw, V717F) gene was prepared and the Kozak sequence (Kozak sequence, GACC) was inserted in front of the ATG codon to start the translation to improve the translation efficiency. For polyadenylation signal of mutant gene, SV40 late polyadenylation signal (SV40-pA) gene (247 bp) is a pGK-neo-pA vector (Lee et al., J Neurosci , 2002, 15: 7931-7940) Used separately from. It was introduced later in the mutant gene. Finally, an expression cassette was prepared in the order of PDGF-β promoter-APP751 (Sw, V717F) -pA, which was named “PDGF-APP (Sw, V717F) -pA” ( FIG. 1A ).

<실시예 3> 인트론과 APP751 돌연변이 유전자를 포함하는 형질전환용 발현 카세트의 제조Example 3 Preparation of Transformation Expression Cassette Comprising Intron and APP751 Mutant Gene

인트론(intron)은 돌연변이 유전자의 발현 효율을 증가시키고, 전사 안정도를 증가시킨다. 이에, 본 발명의 돌연변이 유전자를 보다 효율적으로 동물에 도입시키기 위해 인간 β-글로빈 유전자(human β-globin gene)로부터 유도된 인트론 B 유전자(918 bp)(Choi et al., Molecular and cellular biology, June 1991, 3070-3074; Palmiter et al., PNAS, 1991, 88:478-482)를 상기 실시예 2에서 제조한 발현용 카세트에 도입하였다. 구체적으로, 인간 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주 SH-SY5Y로부터 게노믹 DNA를 분리한뒤, 서열번호 11로 기재되는 hglob-f 프라이머와 서열번호 12로 기재되는 hglob-r 프라이머 쌍을 사용하여 인간 β-글로빈 유 전자의 인트론 B 유전자를 증폭하였다. 증폭된 인간 β-글로빈 유전자의 인트론 B 유전자 산물(918 bp)을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 서브클로닝하고, 이를 상기 실시예 2에서 제조한 PDGF-APP(Sw,V717F)-pA 발현용 카세트의 PDGF-β프로모터 유전자와 APP(Sw, V717F)유전자 사이에 삽입시켰다. 이렇게 제조된 형질전환용 발현벡터를 "PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA"라 명명하였다(도 1a).Introns increase the expression efficiency of mutant genes and increase transcriptional stability. Therefore, intron B gene (918 bp) derived from human β-globin gene (Choi et al ., Molecular and cellular biology , June) for introducing the mutant gene of the present invention into an animal more efficiently. 1991, 3070-3074; Palmiter et al ., PNAS , 1991, 88: 478-482) were introduced into the expression cassette prepared in Example 2 above. Specifically, the genomic DNA was isolated from the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, and then human β- using a hglob-f primer set forth in SEQ ID NO: 11 and a hglob-r primer pair shown in SEQ ID NO: 12. The intron B gene of the globin gene was amplified. The intron B gene product (918 bp) of the amplified human β-globin gene was subcloned into a pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA), and the PDGF-APP prepared in Example 2 (Sw, It was inserted between the PDGF-β promoter gene of the cassette for V717F) -pA expression and the APP (Sw, V717F) gene. The expression vector for transformation thus prepared was named "PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA" ( FIG. 1A ).

<실시예 4> 형질전환동물 생산Example 4 Transgenic Animal Production

상기 실시예 2에서 제조한 PDGF-APP(Sw,V717F)-pA 발현 카세트와 상기 실시예 3에서 제조한 PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA 발현 카세트를 제한효소 BssHⅡ로 절단하여 약 5.0 kb 크기의 선형화된 절단산물을 수득한뒤 근교배(inbred) C57BL/6 마우스의 수정란(fertilized egg)의 전핵(pronuclei)에 미세주입(microinjection)하였다. 주입된 수정란은 ICR 대리모 마우스의 난관(oviduct)으로 전달되었다. 본 발명에서 사용한 미세주입 방법과 같은 형질전환 동물 제작 과정은 일반적인 방법에 따라 수행하였다(Games et al., Nature, 1995; Hisao et al., Science, 1996).The PDGF-APP (Sw, V717F) -pA expression cassette prepared in Example 2 and the PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA expression cassette prepared in Example 3 were digested with restriction enzyme BssH II. A 5.0 kb linearized cleavage product was obtained and then microinjected into the pronuclei of fertilized eggs of inbred C57BL / 6 mice. Infused fertilized eggs were delivered to the oviduct of ICR surrogate mice. The transgenic animal production process such as the microinjection method used in the present invention was performed according to a general method (Games et al ., Nature , 1995; Hisao et al ., Science , 1996).

<실시예 5> 돌연변이 유전자의 마우스 수정란의 핵 이식의 확인Example 5 Confirmation of Nuclear Transplantation of Mouse Embryos of Mutant Genes

상기 실시예 4에서 실시한 형질전환 동물 제작을 통해 출생한 자손(F1)의 꼬리로부터 게노믹 DNA를 분리한 뒤 게노믹 PCR 증폭을 통해 돌연변이 유전자의 수정란의 핵에 이식을 확인하였다. 구체적으로, 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손의 분석에는 서열번호 13으로 기재되는 APP(-intron)-f 프라이머와 서열번호 14로 기재되는 APP(-intron)-r 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭 반응을 실시하였으며, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손의 분석에는 서열번호 15로 기재되는 APP(+intron)-f 프라이머와 서열번호 16으로 기재되는 APP(+intron)-r 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭 반응을 실시하였다.Genomic DNA was isolated from the tail of the offspring (F1) born through the production of the transgenic animals carried out in Example 4, and then transplanted into the nucleus of the fertilized egg of the mutant gene through genomic PCR amplification. Specifically, the analysis of progeny born by introducing the expression cassette (PDGF-APP (Sw, V717F) -pA) that does not include introns was performed using the APP (-intron) -f primer as set forth in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14. PCR amplification reactions were performed using the described APP (-intron) -r primer pairs, and the expression cassette (PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA) containing the intron was introduced for analysis of progeny born. PCR amplification reactions were performed using an APP (+ intron) -f primer set forth in SEQ ID NO: 15 and an APP (+ intron) -r primer pair set forth in SEQ ID NO: 16.

그 결과, 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도 입하여 출생한 자손은 총 43마리였으며, PCR 방법을 통해 19 마리가 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였고, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손은 총 8마리에서 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다.As a result, 43 progeny were born by introducing the expression cassette (PDGF-APP (Sw, V717F) -pA) containing no intron, and 19 were confirmed that the expression cassette was introduced by PCR. The offspring born by introducing an expression cassette (PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA) containing an intron were confirmed that the expression cassette was introduced in a total of eight.

다음으로, 서던 블랏 분석을 통해 본 발명의 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4에서 실시한 형질전환 동물 제작을 통해 출생한 자손(F1)의 꼬리로부터 게노믹 DNA를 분리한 뒤 15 ㎍의 게노믹 DNA를 제한효소 SpeI으로 절단하였다. 절단된 게노믹 DNA를 아가로즈 젤에 전기영동한뒤 나이트로셀룰로스 멤브레인에 전달시키고, APP cDNA의 C 말단 BglⅡ/SpeI 절편(320 bp)을 ³²P로 동위원소 표지시킨 프로브를 사용하여 혼성화반응을 실시한 뒤 X-ray 필름에 현상하였다.Next, it was confirmed that the expression cassette of the present invention was introduced through Southern blot analysis. Specifically, the genomic DNA was isolated from the tail of the offspring (F1) born through the production of the transgenic animal in Example 4, and 15 μg of the genomic DNA was cut with restriction enzyme Spe I. The cleaved genomic DNA was electrophoresed on an agarose gel and then transferred to a nitrocellulose membrane, and hybridized using a probe that isotopically labeled with ³² P of the C-terminal Bgl II / Spe I fragment of APP cDNA (320 bp). After the reaction, it was developed on an X-ray film.

그 결과, 상기 RT-PCR에서 분석한 바와 같이 인트론을 포함하지 않은 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입한 마우스에서는 총 19 마리가 상기 발현 카세트가 도입되었고, 인트론을 포함하는 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입한 마우스에서는 총 8마리에서 상기 발현 카세트가 도입됨을 확인하였다(도 1b).As a result, in the mice in which the expression cassette (PDGF-APP (Sw, V717F) -pA) which did not contain an intron as analyzed by RT-PCR, a total of 19 expression cassettes were introduced and the intron was included. In the mouse introduced with the expression cassette (PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA), it was confirmed that the expression cassette was introduced in a total of 8 mice ( FIG. 1B ).

<실시예 6> 수정란의 핵에 이식된 유전자의 발현 분석Example 6 Expression Analysis of a Gene Transplanted into the Nucleus of a Fertilized Egg

본 발명에서 제조한 형질전환 동물에 APP 돌연변이 유전자가 도입되어 유전자가 발현하는지 확인하기 위해, 수정란의 핵에 이식이 확인된 마우스의 뇌로부터 전체 RNA를 분리한 뒤 노던블랏 분석을 하였다. 노던블랏 분석 방법은 이 등의 방법(Lee et al., J Neurosci, 2002, 15:7931-7940)에 따라 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4 및 실시예 5에서 돌연변이 APP 유전자가 수정란의 핵에 이식되었음을 확인한 4개월령 내지 5개월령 가량의 마우스 및 정상 마우스로부터 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA는 트리졸 용액(Trizol reagent)(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 분리하였으며, 분리한 30 ㎍의 전체 RNA를 1% 변성(denaturing) 아가로즈 젤(1% 아가로즈, 6.2% formaldehyde in 1 ㅧMOPS)에서 전기영동하였다. 전기영동된 아가로즈 젤의 RNA를 나이트로셀룰로스 멤브레인에 전달시킨 뒤 상기 실시예 5의 서던 블랏 분석에서 사용한 APP cDNA의 C 말단 BglⅡ/SpeI 절편(320 bp)을 ³²P로 동위원소 표지시킨 프로브를 사용하여 혼성화반응을 실시한 뒤 X-ray 필름에 현상하였다. 상기 프로브 DNA는 내부 APP 전사체(~3.5 kb) 및 돌연변이 APP 전사체(~2.6 kb)를 모두 인식할수 있는 프로브이다.In order to check whether the APP mutant gene is introduced into the transgenic animal prepared in the present invention and expresses the gene, total RNA was isolated from the brain of the mouse whose transplantation was confirmed in the nucleus of the fertilized egg and then subjected to Northern blot analysis. Northern blot analysis was performed according to Lee et al., J Neurosci , 2002, 15: 7931-7940. Specifically, total RNA was isolated from 4 to 5 month old mice and normal mice confirmed that the mutant APP gene was implanted into the nucleus of the fertilized egg in Examples 4 and 5. Total RNA was isolated using Trizol reagent (Sigma, St. Louis, Mo., USA), and 30 μg of the total RNA was separated by 1% denaturing agarose gel (1% agarose, 6.2% formaldehyde in 1 ㅧ MOPS) was electrophoresed. The electrophoresis the agarose gel was behind the C-terminal Bgl Ⅱ / Spe I fragment of APP cDNA used in the Southern blot analysis of Example 5 passed the RNA nitro cellulose membrane of the (320 bp) was labeled with ³² P Hybridization was performed using a probe and then developed on an X-ray film. The probe DNA is a probe capable of recognizing both internal APP transcript (˜3.5 kb) and mutant APP transcript (˜2.6 kb).

그 결과, 돌연변이 APP 유전자가 형질도입된 마우스는 내부 APP 유전자의 발현에 비해 돌연변이 APP 유전자의 전사체 발현이 2.6 ㅁ0.1배 정도 높게 나타났다. 또한, 인트론을 포함하지 않는 돌연변이 발현 카세트(PDGF-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손에 비해 인트론을 포함하는 돌연변이 발현 카세트(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-pA)를 도입하여 출생한 자손은 돌연변이 APP 유전자의 발현이 훨씬 증가하였으며, 유전자 유도된 전사체의 안정도도 증가함을 확인하였다(도 1c). 이에, 높은 수준의 돌연변이 APP 유전자를 발현하는 형질전환 마우스(PDGF-intron- APP(Sw,V717F)-pA)를 이후의 실험에 사용하기로 하고 이 마우스를 "Tg-APP/B6"라 명명하였다.As a result, the mice transduced with the mutant APP gene showed 2.6 占 0.1-fold higher transcript expression of the mutant APP gene than the expression of the internal APP gene. In addition, mutant expression cassettes (PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA containing introns compared to progeny born by introducing a mutant expression cassette (PDGF-APP (Sw, V717F) -pA) not containing introns were introduced. The offspring born with) were found to have significantly increased expression of the mutant APP gene and increased stability of the gene-derived transcripts ( FIG. 1C ). Therefore, transgenic mice expressing high levels of mutant APP genes (PDGF-intron-APP (Sw, V717F) -pA) were used for later experiments and were named "Tg-APP / B6". .

또한, 상기 형질전환 마우스 Tg-APP/B6를 2004년 3월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10608BP).In addition, the transgenic mouse Tg-APP / B6 was deposited to the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank on March 10, 2004 (accession number: KCTC 10608BP).

<실시예 7> 형질도입된 유전자로부터 생산되는 단백질의 확인Example 7 Identification of Proteins Produced from Transduced Genes

상기 실시예 6에서 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 동물이 APP 돌연변이 유전자를 발현하는 것을 확인하여, 이렇게 발현된 유전자가 단백질로 생산되는지 확인하기 위해 4개월령 내지 5개월령의 Tg-APP/B6 마우스 및 대조군 정상 마우스의 뇌로부터 전체 단백질을 분리한 뒤 웨스턴 블랏 분석을 하였다. 웨스턴 블랏 분석은 이 등의 방법(Lee et al., Brain Res Mol Brain Res, 1999, 70:116-124)에 따라 수행하였다. 구체적으로, 마우스의 뇌조직을 적출한 뒤 1 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 프로테아제 억제제 칵테일(CompleteTM; Roche, Mannheim, Germany)를 포함하는 4℃에서 보관된 용해 완충액(50 mM Tris- HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트)에 넣어 균질화시켰다. 균질화된 뇌 샘플을 13,000 rpm에서 4℃로 20분동안 원심분리한 후 상등액을 수득하였다. 상등액에 포함된 단백질을 BCA 정량 킷트(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 측정하였다. 30 ㎍의 단백질을 아크릴아마이드 젤에 전기영동시킨 뒤 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 전달시켰다. 단백질이 전달된 멤브레인은 5% 탈지분유, 2% BSA, 4% FBS, 4% 말형청 및 4% 염소 혈청을 포함하는 Tris-완충된 식염수 및 0.1% Tween 20에서 블라킹(blocking)시켰다. 돌연변이 APP 단백질의 생성을 확인하기 위한 항체로는 폴리클로날 또는 모노클로날 항-APP 항체(Zymed, San Francisco, CA, USA)(폴리클로날 항체:51-2700, 모노클로날 항체:13-0200)를 사용하여 면역 반응시켰다. 상기 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 각각 인간 APP의 N 말단 및 C-말단을 인식하는 항체이다. 또한, 면역분석은 ECL 검출 시약(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하여 검출하였다.In Example 6 to confirm that the Tg-APP / B6 transgenic animal of the present invention expresses the APP mutant gene, Tg-APP / B6 of 4 months to 5 months old to confirm whether the expressed gene is produced as a protein Whole proteins were isolated from the brains of mice and control normal mice and subjected to Western blot analysis. Western blot analysis was performed according to this method (Lee et al., Brain Res Mol Brain Res , 1999, 70: 116-124). Specifically, lysate buffer (50 mM Tris) stored at 4 ° C containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and a protease inhibitor cocktail (CompleteTM; Roche, Mannheim, Germany) after the brain tissue of the mouse was extracted Homogenized in HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate). Homogenized brain samples were centrifuged at 13,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes to obtain supernatants. Proteins contained in the supernatants were measured using a BCA quantitative kit (Sigma, St. Louis, MO, USA). 30 μg of protein was electrophoresed on acrylamide gels and then delivered to PVDF membranes (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). The protein-delivered membrane was blocked in Tris-buffered saline containing 5% skim milk powder, 2% BSA, 4% FBS, 4% horseshoe and 4% goat serum and 0.1% Tween 20. Antibodies to confirm the production of mutant APP proteins include polyclonal or monoclonal anti-APP antibodies (Zymed, San Francisco, CA, USA) (polyclonal antibodies: 51-2700, monoclonal antibodies: 13- 0200) for immune response. The monoclonal and polyclonal antibodies are antibodies that recognize the N- and C-terminus of human APP, respectively. In addition, immunoassays were detected using ECL detection reagents (Santa Cruz, CA, USA).

그 결과, Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌에서는 약 120 kb 크기의 APP751 단백질이 검출되었다(도 2a). 또한, 본 발명의 돌연변이 유전자가 동형접합체로 삽입된 마우스(이하 "호모"라 약칭함) 및 이형접합체로 삽입된 마우스(이하 "헤테로"라 약칭함)의 돌연변이 유전자 도입 차이를 비교하기 위해 인간 APP의 Aβ부위에 특이적인 모노클로날 항체(6E10)를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏 분석한 결과, 호모 돌연변이 마우스는 헤테로 돌연변이 마우스에 비해 2배 이상 APP 발현이 증가되었다(도 2b). 또한, 본 발명의 돌연변이 APP 유전자 도입에 의해 제조된 Tg-APP/B6 돌연변이 마우스의 뇌에서는 β-세크레타제(secretase) 및 α-세크레타제에 의해 절단된 C-말단 절편(각각 βCTF 및 αCTF)의 생산이 대조군 정상 마우스의 CTF에 비해 각각 2.55 ㅁ0.18배 및 2.3 ㅁ0.43배 증가하였다(도 2c).As a result, approximately 120 kb of APP751 protein was detected in the brain of Tg-APP / B6 transgenic mice ( FIG. 2A ). In addition, human APP to compare the difference between the mutant gene introduced between the mouse inserted into the homozygous (hereinafter referred to as "homo") and the mouse inserted into the heterozygote (hereinafter referred to as "hetero") mutant gene of the present invention Western blot analysis using the monoclonal antibody (6E10) specific for the Aβ site of the same method as described above, homo mutant mice increased the expression of APP more than two times compared to hetero mutant mice ( Fig. 2b ). In addition, in the brains of Tg-APP / B6 mutant mice prepared by the introduction of the mutant APP gene of the present invention, C-terminal fragments (βCTF and αCTF, respectively) cleaved by β-secretase and α-secretase, respectively. ) Increased 2.55 ㅁ 0.18 fold and 2.3 ㅁ 0.43 fold, respectively, compared to CTF of control normal mice ( FIG. 2C ).

<실시예 8> 형질전환 마우스의 면역조직학적 분석Example 8 Immunohistochemical Analysis of Transgenic Mice

면역조직학적 분석을 하기 위해 마우스는 0.9% 생리식염수로 상행 대동맥으로 환류시켰으며, 이어 4% 파라포름알데히드를 포함하는 0.1 M 인산 완충액(이하 "PB"라 약칭함, pH 7.4)을 환류시켰다. 이어, 뇌를 적출한 뒤 4℃에서 고정 용액에 고정시켰다. 고정된 뇌는 절단기(vibratome)를 이용하여 40 ㎛ 두께로 절단하였다. 절단된 섹션(section)을 0.1 M PB(pH 7.4)에 녹여진 3% 과산화수소 용액에서 30분 동안 반응시키고, PB로 세척하였다. 세척된 섹션은 5% 정상 염소 혈청, 2% BSA, 2% FBS 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 용액에서 2시간동안 상온에서 블로킹시켰다. 블로킹 완충액에 일차 항체를 넣은뒤 4℃에서 밤새 반응시켰다. PB 용액으로 세척한 뒤 1:200배로 희석한 바이오틴화된 이차 항체를 넣고, 다음으로 1:100배로 희석한 아비딘 및 바이오틴화된 HRP 복합체(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 난 후 발색 반응을 유도하기 위해 0.05% 3.3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 및 0.001% 과산화수소를 포함하는 0.1 M Tris(pH 7.4) 용액을 처리하였다. 분석한 뇌조직으로는 대뇌피질(cerebral cortex, 이하 "CX"라 약칭함), CA1 내지 CA3 부위의 피라밋 세포(이하 "CA1" 내지 "CA3"라 약칭함), 해마(hipocampus, 이하 "HP"라 약칭함), 치상회(dentate gyrus, 이하 "DG"라 약칭함) 부위를 사용하였다.Mice were refluxed into the ascending aorta with 0.9% physiological saline for immunohistochemical analysis, followed by refluxing 0.1 M phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde (hereinafter abbreviated as "PB", pH 7.4). The brains were then harvested and fixed in fixative solution at 4 ° C. The fixed brain was cut to 40 μm thickness using a vibratome. The cut sections were reacted for 30 minutes in 3% hydrogen peroxide solution dissolved in 0.1 M PB pH 7.4 and washed with PB. The washed sections were blocked at room temperature for 2 hours in a solution containing 5% normal goat serum, 2% BSA, 2% FBS and 0.1% Triton X-100. The primary antibody was added to blocking buffer and reacted overnight at 4 ° C. After washing with PB solution, the biotinylated secondary antibody diluted 1: 200-fold was added, and then the avidin and biotinylated HRP complex (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluted 1: 100-fold was added and reacted for 1 hour. . Then, 0.1 M Tris (pH 7.4) solution containing 0.05% 3.3'-diaminobenzidine and 0.001% hydrogen peroxide was treated to induce a color reaction. The brain tissues analyzed were cerebral cortex (abbreviated as "CX"), pyramidal cells of CA1 to CA3 sites (hereinafter abbreviated as "CA1" to "CA3"), and hippocampus ("HP"). D) abbreviation), dentate gyrus (hereinafter abbreviated as "DG") site was used.

그 결과, 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 대뇌피질 및 해마 부위를 포함하는 뇌 전체에 APP751이 발현되었다(도 2d). 그러나, 12개월령 내지 18개월령 헤테로 형질전환 마우스 및 14개월령 헤테로 형질전한 마우스의 뇌에서는 확실한 플라그 유사 Aβ-침착을 확인할 수 없었다.As a result, in the Tg-APP / B6 transgenic mouse of the present invention, APP751 was expressed in the whole brain including the cerebral cortex and hippocampal region ( FIG. 2D ). However, no apparent plaque-like Aβ-deposition was found in the brains of 12 to 18 month old heterotransfected mice and 14 month old heterotransfected mice.

또한, 내부 APP 수준에 비해 약 5.6배의 APP를 발현하는 돌연변이 APP695를 발현하는 Tg2576 형질전환 마우스는 C57BL/6 근교배를 한 경우 출생후 150일이 되기 전에 사망하였다(Carlson et al., Hum Mol Genet, 1997, 6:1957-1959). 그러나, 본 발명의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 내부 APP 수준에 비해 각각 2.6배 및 5.2배 정도 높은 수준으로 APP를 발현하였다. 본 발명의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 상기 형질전환 마우스와 동일하게 C57BL/6 근교배를 하였으며, 대조군 정상 마우스에 비해 사산 확률이 높긴 하지만 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 83% 정도는 420일 까지도 생존하여 본 발명의 형질전환 동물이 동물모델로서 훨씬 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.In addition, Tg2576 transgenic mice expressing mutant APP695 expressing approximately 5.6-fold APP relative to internal APP levels died before 150 days of birth in C57BL / 6 cross-breeding (Carlson et al., Hum Mol Genet , 1997, 6: 1957-1959. However, the hetero and homo Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention expressed APP at a level 2.6 times higher and 5.2 times higher than the level of internal APP, respectively. The hetero and homo Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention were cross-crossed to C57BL / 6 in the same manner as the transgenic mice, and the stillbirth probability of homo Tg-APP / B6 transgenic mice was higher than that of control mice. About 83% survived up to 420 days, indicating that the transgenic animals of the present invention can be used more effectively as animal models.

<실시예 9> 형질전환 마우스 뇌에서의 다른 단백질의 발현 변화 분석Example 9 Analysis of Expression Changes of Other Proteins in Transgenic Mouse Brain

돌연변이 APP 단백질의 도입에 의해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌에서 발현의 영향을 받은 단백질을 분석하고자 하였다. 이에, 상기 실시예 8에 기재된 조직면역학적 분석 방법과 동일하게 뇌의 CA1 내지 CA3 부위의 피라밋 세포(CA1 내지 CA3), 해마(HP), 치상회(dentate gyrus, DG) 부위를 사용하여 조직면역학적 분석을 하였다. 분석시 사용한 항체로는 항-칼빈딘(calbindin) 항체(C9848; Sigma, St. Louis, MO, USA), 항-파브알부민(parvalbumin)(P3088; Sigma, St. Louis, MO, USA), 항-칼레티닌(calretinin) 항체(AB5054; Chemi-Con, Temecula, CA, USA), 항-c-Fos 항체(sc-52; Santa Cruz Bio-Technology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다.The introduction of a mutant APP protein was intended to analyze the proteins affected by expression in the brain of the Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention. Thus, tissue immunization using pyramid cells (CA1 to CA3), hippocampus (HP), and dentate gyrus (DG) regions of the CA1 to CA3 region of the brain is performed in the same manner as the tissue immunoassay method described in Example 8. Analytical analysis was performed. Antibodies used in the assay include anti-calbindin antibodies (C9848; Sigma, St. Louis, MO, USA), anti-valvalbumin (P3088; Sigma, St. Louis, MO, USA), anti -Calretinin antibody (AB5054; Chemi-Con, Temecula, CA, USA) and anti-c-Fos antibody (sc-52; Santa Cruz Bio-Technology, Santa Cruz, CA, USA) were used.

그 결과, 13개월령 내지 15개월령의 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 CA1 부위 및 DG 부위에서는 칼슘 결합 단백질인 칼빈딘의 발현량이 동일연령의 대조군 정상 마우스에 비해 감소하였다. 또한, 파브알부민과 칼레티닌의 발현은 Tg-APP/B6 형질전환 마우스와 대조군 정상 마우스의 HP 부위에서와 동일한 수준의 발현량을 보였다(도 3). 또한, c-Fos는 신경작용의 마커로 사용되는 초기 유전자로서 세포내부의 칼슘, 사이클릭 AMP 또는 다른 이차 메신저의 양이 증가함에 따라 뉴런에서 합성된다. 이러한, c-Fos의 발현은 대조군 정상 마우스에 비해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 뇌 전체 부위에서 감소하는 경향을 보였다(도 4).As a result, the expression level of the calcium binding protein Calvindine in the CA1 region and the DG region of the Tg-APP / B6 transgenic mice of the 13 to 15 months of age of the present invention was reduced compared to control mice of the same age. In addition, the expression of FabAlbumin and calretinin showed the same level of expression as in the HP site of Tg-APP / B6 transgenic mice and control normal mice ( FIG. 3 ). In addition, c-Fos is an early gene used as a marker of neuronal activity and synthesized in neurons as the amount of intracellular calcium, cyclic AMP or other secondary messengers increases. This, c-Fos expression showed a tendency to decrease in the whole brain region of the Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention compared to the control normal mice ( Fig. 4 ).

<실시예 10> 형질전환 마우스의 인지기능 분석Example 10 Cognitive Function Analysis of Transgenic Mice

알츠하이머병 환자의 조직병리학적 특징은 (1) 세포외 세닐 플라그(extracellular senile plaques)의 침착, (2) 세포내 신경원 섬유 농축체(intracellular neurofibrillary tangle)의 형성, (3) 신경세포의 돌기 및 시냅스의 퇴화 및 신경세포의 소실 등을 들 수 있으며, 이와 같은 특징들은 조직학적 방법으로 검사 가능하다. 알츠하이머병의 또 다른 생리적 특징은 (4) 신경세포 소실에 따른 뇌기능의 상실이며, 특히 인지기능의 상실은 알츠하이머병의 가장 특징적이고 중요한 외형적, 임상적 증상으로 간주된다. 따라서, 가장 이상적인 알츠하이머병 치매 동물 모델이 갖추어야 할 부분은 세닐 플라그의 침착과 같은 조직학적 특징도 중요하지만 인지기능이 저하되는 특징을 보이는 것도 중요하다. 이에, 본 발명자들은 치매 모델의 후보 동물의 인기지능의 상실 유무를 판정하는데 사용하기 위하여 모리스 물 미로(Morris water maze) 테스트, 수동적 회피(passive avoidance) 테스트, 개방 범위(open field) 테스트 등을 적용하여 조사하였다.Histopathological features of Alzheimer's disease include (1) the deposition of extracellular senile plaques, (2) the formation of intracellular neurofibrillary tangles, (3) the projections and synapses of neurons. Degeneration and neuronal loss, and such features can be examined by histological methods. Another physiological feature of Alzheimer's disease is (4) loss of brain function following neuronal loss, and in particular loss of cognitive function is considered the most characteristic and important external and clinical symptom of Alzheimer's disease. Therefore, the most desirable Alzheimer's disease dementia animal model should have histological characteristics such as seil plaque deposition, but it is also important to show cognitive deterioration. Accordingly, the present inventors apply a Morris water maze test, a passive avoidance test, an open field test, and the like, for use in determining whether the dementia model has lost the popularity of candidate animals. Was investigated.

인지기능 분석을 하기 위한 생쥐는 온도 및 습도 조절된 환경에서, 12시간 간격의 낮/밤 사이클(아침 7시에 점등)을 맞추어 주고 동물의 사육은 이화여자 의과대학의 동물 사육 지침에 따라 수행하였다. 컴퓨터화된 비디오-트래킹 시스템(SMART; Panlab S. I., Barcelona, Spain)을 사용하여 마우스의 행동을 평가하였다.Mice for cognitive function analysis were subjected to day / night cycles (lighted up at 7 am) at 12-hour intervals in a temperature and humidity-controlled environment, and animal breeding was performed according to the animal breeding guidelines of Ewha Womans University School of Medicine. . The behavior of the mice was evaluated using a computerized video-tracking system (SMART; Panlab S. I., Barcelona, Spain).

모든 실험을 수행하고 난뒤 2가지 샘플의 결과를 비교하기 위해서는 스튜던트 t-테스트를 수행하였고, 복합 비교를 하기 위해서는 단일 방향 ANOVA 테스트를 수행하고 뉴만-클(Newman-Keuls) 복합 범위 테스트를 뒤이어 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ㅁS.E.M.으로 나타내었고, 통계적 차이점은 다른 것이 표시되지 않는한 5% 수준에서 수용하였다.After performing all the experiments, a student's t-test was performed to compare the results of the two samples, followed by a unidirectional ANOVA test followed by the Newman-Keuls complex range test for a composite comparison. . All data are expressed as mean S.E.M. and statistical differences were accepted at the 5% level unless otherwise indicated.

<10-1> 개방 범위 테스트(Open field test)<10-1> Open field test

이동성 능력은 흰색의 플렉시글라스(Plexiglas) 챔버(45 ㅧ45 ㅧ45 ㎝)의 개방 범위에서 측정하였다. 챔버의 조명은 70 럭스(lux)로 조정하였다. 마우스를 개방 범위에 노출시키기 30분 전에 동일한 환경에 위치하도록 하였다. 각 마우스는 개별적으로 개방 범위의 중앙에 위치하도록 하였으며 60분 동안 이동을 기록하였다. 수평적 이동 활동력은 마우스의 이동 거리를 통해 판단하였다. 내부 30% 범위는 중앙 부분으로 판단하였다.Mobility capacity was measured in the open range of the white Plexiglas chamber (45 x 45 x 45 cm). Illumination of the chamber was adjusted to 70 lux. Mice were placed in the same environment 30 minutes prior to exposure to the open range. Each mouse was individually centered in the open range and the movement recorded for 60 minutes. Horizontal movement activity was determined by the distance of the mouse. The internal 30% range was considered to be the central part.

그 결과, 본 발명의 13개월령의 호모(homozygous) 및 헤테로(heterozygous) Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 운동성이나 총 이동한 거리 등은 유사 연령의 대조군 정상 마우스와 큰 차이가 없었다(도 5a). 또한, 개방 범위의 중앙에 접근하는 정도(불안감에 대한 지표의 하나)의 경우도 큰 차이를 보이지 않았다.As a result, the motility and total distance of the 13-month-old homo (homozygous) and hetero (heterozygous) Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention was not significantly different from control mice of similar age ( Fig. 5a ) . There was also no significant difference in the degree of approaching the center of the open range (one of the indicators of anxiety).

<10-2> 로타-로드 테스트(Rota-rod test)<10-2> Rota-rod test

운동 조정 능력(motor coordination)과 운동 학습 능력(motor learning)은 로타-로드(rota-rod) 테스트를 통해 측정되었다. 로타-로드는 속도 조절기를 가지는 회전 실린더(직경: 4.5 ㎝)로 구성되어 있다. 마우스는 단단한 쥘수있는것(grip)이 제공되는 실린더의 맨 위에 위치시켰다. 로타-로드는 5 내지 20 rpm의 속도로 고정하여 회전시켰으며, 점진적으로 속도를 높이는 상태에 마우스를 놓이게 함으로써 테스트를 수행하게 하였다. 컷-오프(cut-off) 시간은 3분으로 하고, 내부의-시도 간격은 60분으로 하였다. 떨어지지 않고 로드에서 머무르는 시간의 지속을 측정하였다.Motor coordination and motor learning were measured by the rota-rod test. The rota-rod consists of a rotating cylinder (diameter: 4.5 cm) with a speed regulator. The mouse was placed on top of the cylinder provided with a rigid grip. The rota-rod was rotated at a fixed speed of 5 to 20 rpm and allowed to perform the test by placing the mouse in a progressively higher speed. The cut-off time was 3 minutes and the internal-trial interval was 60 minutes. The duration of time to stay on the rod without falling off was measured.

그 결과, 11개월령의 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 15 rpm 이상의 빠른 속도에서는 오랫동안 머무르지 못하였다(도 5b).As a result, 11-month-old homo Tg-APP / B6 transgenic mice did not stay long at high speeds above 15 rpm ( FIG. 5B ).

<10-3> 모리스 물 미로 테스트(Morris water maze test)<10-3> Morris water maze test

모리스 물 미로 테스트는 먼 거리의 자극 및 숨겨진 탈출 플랫폼 사이의 관계를 학습하고 기억하는 동물의 능력에 의존하는 해마-의존적 수행방법이다(Morris et al., 1982, Nature, 297, 701). 즉, 모리스 물 미로 테스트는 마우스가 강제 수영을 하거나 플랫폼에 안착하여 있는 동안 기억한 주변의 공간적인 지표를 이용하여 플랫폼의 위치를 얼마나 빨리 찾는지를 측정함으로써 마우스의 공간인지 능력을 플랫폼을 찾기까지 수영하는 동안 운동한 거리 또는 시간을 측정하여 정량적으로 비교하는 방법이다. 이 경우 필요에 따라 마우스가 물통에 진입하는 위치를 바꾸기도 하며, 기존에 위치하던 좌표에서 다른 좌표로 플랫폼의 위치를 변화시키고 공간적인 지표의 위치를 그대로 둔 채 기억력의 검색만을 할 수 있다. 구체적으로, 물 미로 기구는 90 ㎝ 직경의 실린더 풀(pool)로 구성되어 있으며, 풀에는 22℃의 우유를 푼 물을 채워 육안으로는 보이지 않게 하였다. 불투명한 물의 표면으 로부터 사분원(quadrant)의 1.5 ㎝ 아래에 10 ㎝ 직경의 플랫폼을 숨겨두었다. 풀은 수많은 조건의 환경 및 창문, 의자 및 포스터를 포함하는 인위적 암시(cue)를 가지는 방에 위치시켰다. 매일의 테스트 과정에서, 마우스는 각각의 사분면에 성공적으로 도달하도록 하였고, 최대 90초 동안 수영하도록 하였다. 플랫폼에 도착하면, 마우스는 다음 훈련을 시작하기 전까지 플랫폼에서 30초 동안 쉬도록 허락하였다. 상기 두 개의 각 훈련에서 플랫폼을 찾기까지의 잠복기 및 훈련의 평균을 기록하였다.The Morris Water Maze test is a hippocampus-dependent method that relies on the animal's ability to learn and remember the relationship between distant stimuli and hidden escape platforms (Morris et al ., 1982, Nature , 297, 701). In other words, the Morris Water Maze test measures how quickly the platform finds the location of the platform using the spatial indicators it remembers while the mouse is forced to swim or rest on the platform. It is a method of quantitatively comparing the distance or time worked during the exercise. In this case, if necessary, the mouse may change the position of entering the bucket, and the position of the platform may be changed from the existing coordinate to another coordinate, and the memory may be searched with the spatial index as it is. Specifically, the water maze mechanism is composed of a cylinder pool of 90 cm diameter, the pool was filled with milk with milk at 22 ℃ to make it invisible to the naked eye. A 10 cm diameter platform was hidden below 1.5 cm of the quadrant from the surface of the opaque water. The pool was placed in a room with artificial cues containing numerous conditions and windows, chairs and posters. During the daily test, mice were allowed to reach each quadrant successfully and swim for up to 90 seconds. Upon arriving at the platform, the mouse was allowed to rest on the platform for 30 seconds before starting the next training. The incubation period and the average of the trainings until finding the platform in each of the two trainings were recorded.

그 결과, 7개월령의 대조군 정상 마우스는 모리스 물 미로에 있는 숨겨진 플랫폼의 위치하는 좌표를 인식할 수 있었으며, 이러한 과업은 훈련의 횟수에 비례하여 인식 능력이 증가하였다. 7개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 경우 모리스 물 미로에 있는 숨겨진 플랫폼이 위치하던 좌표를 인식하는 능력이 대조군 정상 마우스와 동일하게 나타났다(도 6a). 그러나, 14개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 마우스에 비해 좌표를 인식하는 시간이 많 이 지체되었다(도 6b).As a result, 7-month-old control mice were able to recognize the location of the hidden platform in the Morris water labyrinth, and this task increased recognition ability in proportion to the number of training sessions. For 7-month-old hetero Tg-APP / B6 transgenic mice, the ability to recognize the coordinates where the hidden platform in the Morris water maze was located was the same as the control normal mice ( FIG. 6A ). However, hetero Tg-APP / B6 transgenic mice at 14 months of age were delayed in recognizing the coordinates compared to control mice of the same age ( FIG. 6B ).

또한, 7개월령 및 14개월령의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 수영 속도는 대조군 마우스와 차이가 없었다(도 6c 및 도 6d). 따라서, 상기 결과를 통해 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 나이-의존적으로 인지능력의 결함이 증가함을 알 수 있었다. In addition, the swimming speed of Tg-APP / B6 transgenic mice at 7 months and 14 months of age was not different from the control mice ( FIGS. 6C and 6D ). Therefore, the results show that Tg-APP / B6 transgenic mice have an increased cognitive deficit in age-dependent manner.

<10-4> 상승된 플러스 미로 테스트(Elevated plus maze test)<10-4> Elevated plus maze test

인간 알츠하이머 질환 환자의 가장 문제가 되는 증상의 하나는 불안감이 증가한다는 것이다(Folstein and Bylsma, 1999, Alzheimer Disease(Eds by Terry et al.,) 2nd. Lippincott Williams ＆ Wilkins, Philadelphia). 이에, 본 발명자들은 Tg-APP/B6 형질전환 마우스의 불안감이 APP 돌연변이 유전자의 도입에 의해 변화하는 것인지 확인하고자 하였다. 상승된 플러스 미로 테스트는 검은 플렉시글라스로 만들었다. 미로 장치는 오른쪽 모서리에서 하나의 다른쪽 방향으로 네 개의 통로(arms)(30 ㅧ7 ㎝)를 위치시켰으며, 이는 바닥으로부터 50 ㎝ 위쪽에 위치시켰 다. 두 개의 통로는 20 ㎝의 높은 벽을 가지고 있었으며(닫혀진 통로), 나머지 두 개는 벽을 가지고 있지 않았다(열려진 통로). 중심에서의 밝기는 40 럭스(lux)로 맞춰두었다. 테스트를 하기위해, 마우스는 처음에는 플랫폼의 중앙에 위치시켰으며 5분동안 통로를 경험하게 하였다. 열려진 지역과 닫혀진 지역에 진입하는 횟수와 진입하는데 걸리는 시간의 퍼센트를 기록하였다. 마우스가 모든 네 개의 발로 각각의 섹터(sector)로 들어가는 일(event)로서 각각의 통로로의 진입을 점수화하였다.One of the most problematic symptoms of human Alzheimer's disease is increased anxiety (Folstein and Bylsma, 1999, Alzheimer Disease (Eds by Terry et al., 2nd) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia). Thus, the present inventors attempted to determine whether the anxiety of Tg-APP / B6 transgenic mice is changed by the introduction of the APP mutant gene. The elevated plus maze test was made with black plexiglass. The maze device placed four arms (30 ㅧ 7 cm) in one direction from the right edge, 50 cm above the floor. The two passages had 20 cm high walls (closed passages) and the other two had no walls (open passages). The brightness at the center was set at 40 lux. To test, the mouse was initially placed in the center of the platform and allowed to experience the passage for 5 minutes. The number of entry and exit times for open and closed areas was recorded. The entry into each passage was scored as the event in which the mouse enters each sector with all four feet.

그 결과, 7개월령의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 정상 마우스와 유사하게 열려진 통로 및 닫혀진 통로에서의 과업 수행을 하였다(도 7a 및 도 7b). 그러나, 13개월령의 헤테로 및 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 동일 연령의 대조군 정상 마우스에 비해 열려진 통로로 진입하는데 시간이 많이 지체되었고, 닫혀진 통로에서 보내는 시간이 많아졌다(도 7c 및 도 7d). 따라서, 이를 통해 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 증가된 불안감을 나타 냄을 알 수 있었다.As a result, 7-month-old hetero Tg-APP / B6 transgenic mice performed tasks in the open and closed passages similarly to control normal mice of the same age ( FIGS. 7A and 7B ). However, hetero and homo Tg-APP / B6 transgenic mice at 13 months of age had delayed entry into the open passage compared to control normal mice of the same age, and spent more time in the closed passage ( FIG. 7C and FIG. 7D). ). Therefore, it was found that the Tg-APP / B6 transgenic mouse of the present invention showed increased anxiety.

<10-5> 수동적 회피 테스트(Passive avoidance test)<10-5> Passive Avoidance Test

마우스는 어두운 곳을 선호하는 성질이 있어 밝은 챔버와 어두운 챔버 중 하나를 선택하게 하면 재빠르게 어두운 챔버로 이동해 가게 된다. 마우스가 밝은 챔버에 있다가 어두운 챔버로 이동해 간 후 강한 전기 자극을 주고(즉, 훈련 후) 다시 밝은 챔버와 어두운 챔버 중 하나를 선택하게 하면 정상 동물의 경우 좋아하는 어두운 챔버로 들어가지 않고 계속 싫어하지만 전기자극이 없었던 밝은 챔버에 남으려는 행동을 보인다. 이와 같이 수동적 회피 테스트를 통한 인지기능의 측정은 밝은 챔버와 어더운 챔버라는 공간적 정보와 전기자극이라는 사건을 연계시키는 학습 및 기억이 유지되는지를 측정하는 것이다.Mice prefer a dark place, allowing you to choose between a bright chamber and a dark chamber to quickly move to the dark chamber. If the mouse is in a bright chamber, then moves to a dark chamber and gives a strong electrical stimulus (i.e. after training) and then selects one of the bright and dark chambers again, normal animals do not enter the favorite dark chamber and continue to hate However, he tries to remain in a bright chamber where there was no electrical stimulation. The measurement of cognitive function through the passive avoidance test is to measure whether the learning and memory are linked to the spatial information of the bright and hot chambers and the event of electrical stimulation.

구체적으로, 본 발명의 수동적 회피 테스트는 밝은 챔버와 어두운 챔버(각각의 용적은 15 ㅧ15 ㅧ15 ㎝)로 구성되어 있으며, 두 개의 챔버 사이에 있는 복도와 문에는 쇼크-격자를 장치시켰다. 첫 번째 테스트 날 동안, 각 마우스는 밝은 챔버 에 놓아 두었으며, 밝은 방 및 어두운 방을 찾을수 있게 하기 위해 각 챔버에서 5분동안 경험하게 하였다. 두 번째 날, 마우스는 밝은 챔버에 놓아 두었다. 30초 후에 중간 문을 연뒤에 마우스가 어두운 챔버에 들어가는데까지 지체되는 시간을 측정하였다. 마우스가 어두운 방에 들어가게 되면, 문을 닫아 버리고 격자-바닥을 통해 연속적인 전기 발바닥-쇼크(100 V, 0.3 mA, 2초)를 전달시켰다. 훈련을 시킨 다음, 마우스는 살고있던 케이지로 되돌려 주었다. 24시간 후에 각각의 마우스는 다시 밝은 챔버에 놓아 두었으며, 어두운 챔버로 들어가는데 지체되는 시간을 측정하였다.Specifically, the passive avoidance test of the present invention consists of a light chamber and a dark chamber (each volume 15 × 15 × 15 cm), and a shock-lattice is installed in the corridor and the door between the two chambers. During the first test day, each mouse was placed in a bright chamber and allowed to experience for 5 minutes in each chamber to be able to find the bright and dark rooms. On the second day, the mice were placed in bright chambers. After 30 seconds the middle door was opened and the time to delay for the mouse to enter the dark chamber was measured. When the mouse entered the dark room, the door was closed and a continuous electric sole-shock (100 V, 0.3 mA, 2 seconds) was delivered through the grid-bottom. After training, the mouse was returned to the cage in which it lived. After 24 hours each mouse was again placed in the bright chamber and the time to delay entering the dark chamber was measured.

그 결과, 13개월령의 대조군 정상 마우스의 경우는 훈련을 하고 난 후 어두운 챔버로 이동하는 것을 강하게 억제하는데 비하여, 13개월령의 본 발명의 헤테로 Tg-APP/B6 형질전환 마우스는 훈련을 하고 난 후에도 어두운 챔버로 이동하는 것을 억제시키지 못하였다(도 7e 및 도 7f). 또한, 13개월령의 본 발명의 호모 Tg-APP/B6 형질전환 마우스도 상기 헤테로 마우스와 동일하게 인지능력이 떨어지는 결 과를 나타내었다.As a result, the control group of 13-month-old control mice were strongly inhibited from moving to the dark chamber after training, whereas the hetero-tg-APP / B6 transgenic mouse of the 13-month-old invention was dark even after training. It did not inhibit movement to the chamber ( FIGS. 7E and 7F ). In addition, homo-Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention at 13 months of age showed the same cognitive decline as the hetero mouse.

<실시예 11> 불안증상을 나타내는 매커니즘 분석Example 11 Mechanism Analysis Indicating Anxiety Symptoms

<11-1> 마이크로어레이(Microarray) 분석<11-1> Microarray Analysis

상기 실시예 10을 통해 본 발명의 형질전환 마우스는 불안 증상을 나타냄을 확인하였다. 이에, 본 발명의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스가 나타내는 증가하는 불안 증상에 필수적인 작용 메커니즘을 확인하기 위해 형질전환 마우스의 소뇌편도(amyglada)에서 유도되는 게노믹 DNA 상의 변화를 마이크로어레이 분석으로 조사하였다. 본 발명에서 사용한 cDNA 마이크로어레이 칩으로는 14,000개의 마우스 유전자(알려진 유전자: 9,052개)를 포함하는 cDNA 마이크로어레이 칩(Digital Genomics, Seoul, Korea)을 사용하였다. 본 발명의 형질전환 마우스 5마리와 대조군 정상 마우스 5마리로부터 각각 소뇌편도를 제거한 뒤 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 마이크로어레이 분석에 사용할 샘플로는 각각의 마우스로부터 분리한 전체 RNA 15 ㎍을 사용하였다. 아미노알릴(aminoallyl)-dUTP(Sigma, Mo, USA)는 형 광염료를 이용하여 RNA 샘플을 간접적으로 표지시키는데 사용하였다. Cy3/Cy5 형광염료(AmershamPharmacia, NJ, USA) 표지 및 혼성화 반응은 제조사의 방침에 따라 수행하였다(Digital Genomics, Seoul, Korea). Cy3 및 Cy5에 의해 표지된 프로브(probe)를 사용하여 혼성화된 후 나타나는 신호는 스캔어레이(ScanArray 3.0; Packard, USA)를 사용하여 532 nm 및 635 nm에서 측정하였다. 신호가 나타난 이미지 데이터는 진픽스 프로(GenePix Pro 4.0; Axon Instrument, Inc., CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 대조군 정상 마우스와 본 발명의 돌연변이 마우스의 샘플 사이에서 나타나는 유전자의 발현 변화 차이 분석은 하 등의 방법(Ha et al., Toxicol Lett, 2003)에 따라 수행하였다.In Example 10, the transgenic mouse of the present invention was confirmed to exhibit anxiety symptoms. Thus, microarray analysis of changes in genomic DNA induced in cerebellar amygdala (amyglada) of transgenic mice was performed to identify the mechanism of action essential for the increasing anxiety symptoms of Tg-APP / B6 transgenic mice of the present invention. It was. As a cDNA microarray chip used in the present invention, a cDNA microarray chip (Digital Genomics, Seoul, Korea) containing 14,000 mouse genes (known genes: 9,052) was used. Cerebellar tonsils were removed from each of 5 transgenic mice and 5 control normal mice, and total RNA was isolated therefrom. As a sample to be used for microarray analysis, 15 μg of total RNA isolated from each mouse was used. Aminoallyl-dUTP (Sigma, Mo, USA) was used to indirectly label RNA samples using fluorescent dyes. Cy3 / Cy5 fluorescent dyes (Amersham Pharmacia, NJ, USA) labeling and hybridization reactions were carried out according to the manufacturer's policy (Digital Genomics, Seoul, Korea). Signals after hybridization using probes labeled by Cy3 and Cy5 were measured at 532 nm and 635 nm using ScanArray 3.0 (Packard, USA). Signaled image data was analyzed using GenePix Pro 4.0 (Axon Instrument, Inc., CA, USA). Analysis of differences in expression of genes appearing between control normal mice and samples of mutant mice of the present invention was performed according to Ha et al., Toxicol Lett, 2003.

그 결과, 본 발명의 형질전환 마우스의 소뇌편도에서는 대조군 정상 마우스의 소뇌편도에 비해 TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제(T-LAK cell-originated protein kinase), 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1(hematopoietic cell specific Lyn substrate 1), 스태니오칼신(staniocalcin), 칼모듈린 4(calmodulin 4), 사이토크롬 c(cytochrome c), 17형 프로콜라겐 알파 1(type ⅩⅦ procollagen alpha 1), 프로미닌 1(prominin 1) 및 트랜스티래틴(transthyretin)의 발현이 2배 이상 증가하였다. 반면, X-(불활성)-특이적 전사(X-(inactive)-specific transcript), 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 합성효소 1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1), 크룩 넥-유사 1(crooked neck-like 1), 디스트로핀-연관된 당단백질 알파-사코글리칸(dystrophin-associated glycoprotein alpha-sarcoglycan), 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6(chemokine(C-C motif) ligand 6), 인테그린 알파 Ⅴ(integrin alpha Ⅴ), 큘린 4B(cullin 4B), 클로토(klotho), 사이클린 F(cyclin F), 아미노산 N-아실트랜스퍼라제(amino acid N-acyltransferase) 및 프로스타글란딘 D2 합성효소(prostaglandin D2 synthase)의 발현은 대조군 정상 마우스에 비해 감소하였다.As a result, TNF-α, T-LAK cell-originated protein kinase (T-LAK cell-originated protein kinase), hematopoietic stem cell-specific Lyn in the cerebellar amygdala of the transgenic mouse of the present invention compared to the cerebellar amygdala of the control mouse Hematopoietic cell specific Lyn substrate 1, staniocalcin, calmodulin 4, cytochrome c, type ⅩⅦ procollagen alpha 1, pro The expression of minin 1 and transthyretin increased more than twofold. In contrast, X- (inactive) -specific transcript, prostaglandin-endoperoxide synthase 1, crooked neck-like 1 Dystrophin-associated glycoprotein alpha-sarcoglycan, chemokine (CC motif ligand 6), integrin alpha V, and curin 4B (cullin 4B), klotho, cyclin F, amino acid N-acyltransferase and prostaglandin D2 synthase decreased expression compared to control mice It was.

<11-2> RT-PCR을 통한 발현 변화 유전자의 확인<11-2> Identification of expression change gene through RT-PCR

상기 실시예 <11-1>에서 분석한 마이크로어레이 분석 결과를 다시한번 확인 하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 13개월령의 Tg-APP/B6 형질전환 마우스 및 같은 연령의 대조군 정상 마우스의 소뇌편도로부터 전체 RNA를 분리하였다. TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 트랜스티래틴, X-(불활성)-특이적 전사, 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6 및 큘린 4B를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 당업자에게 공지된 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. RNA의 량을 정량하기 위해 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다.RT-PCR was performed to confirm the microarray analysis results analyzed in Example <11-1> again. Specifically, total RNA was isolated from cerebellar tonsils of Tg-APP / B6 transgenic mice at 13 months of age and control normal mice of the same age. To amplify TNF-α, T-LAK cell-source protein kinases, hematopoietic stem specific Lyn substrate 1, transtyratin, X- (inactive) -specific transcription, chemokine (CC motif) ligand 6 and curin 4B RT-PCR was performed by methods known to those of skill in the art using primer pairs. RT-PCR was performed using primer pairs capable of amplifying GAPDH to quantify the amount of RNA.

그 결과, 본 발명의 형질전환 마우스는 TNF-α, T-LAK 세포-원천의 단백질 키나제, 조혈모세포 특이적 Lyn 기질 1, 트랜스티래틴의 발현량이 정상 마우스에 비해 증가하였고, X-(불활성)-특이적 전사, 키모카인(C-C 모티프) 리간드 6 및 큘린 4B의 발현량이 정상 마우스에 비해 감소하여 상기 실시예 <11-1>의 마이크로어레이 분석결과와 동일하게 나왔다(도 8).As a result, in the transgenic mice of the present invention, the expression levels of TNF-α, T-LAK cell-source protein kinase, hematopoietic stem cell-specific Lyn substrate 1, and transtyratin were increased compared to normal mice, and X- (inactive) The expression levels of -specific transcription, chemokine (CC motif) ligand 6 and curin 4B were reduced compared to normal mice, and the same results as in the microarray analysis of Example 11 were obtained ( FIG. 8 ).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제조한 형질전환 마우스는 인지능력 감소, 기억력 감소 및 불안감 증가와 같은 알츠하이머병의 임상적 특징을 나타내어 알츠하이머병 모델 동물로서 유용함을 알 수 있다.As described above, the transgenic mice produced in the present invention exhibit clinical characteristics of Alzheimer's disease such as decreased cognitive ability, decreased memory and increased anxiety, and thus are useful as Alzheimer's disease model animals.

<110> EWHA HAKDANG INCOPORATED EDUCATIONAL INSTITUTION <120> Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP <130> 3p-10-32 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3579 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(3579) <223> Homo sapiens amyloid beta precursor protein(APP) complete cds <400> 1 agtttcctcg gcagcggtag gcgagagcac gcggaggagc gtgcgcgggg gccccgggag 60 acggcggcgg tggcggcgcg ggcagagcaa ggacgcggcg gatcccactc gcacagcagc 120 gcactcggtg ccccgcgcag ggtcgcgatg ctgcccggtt tggcactgct cctgctggcc 180 gcctggacgg ctcgggcgct ggaggtaccc actgatggta atgctggcct gctggctgaa 240 ccccagattg ccatgttctg tggcagactg aacatgcaca tgaatgtcca gaatgggaag 300 tgggattcag atccatcagg gaccaaaacc tgcattgata ccaaggaagg catcctgcag 360 tattgccaag aagtctaccc tgaactgcag atcaccaatg tggtagaagc caaccaacca 420 gtgaccatcc agaactggtg caagcggggc cgcaagcagt gcaagaccca tccccacttt 480 gtgattccct accgctgctt agttggtgag tttgtaagtg atgcccttct cgttcctgac 540 aagtgcaaat tcttacacca ggagaggatg gatgtttgcg aaactcatct tcactggcac 600 accgtcgcca aagagacatg cagtgagaag agtaccaact tgcatgacta cggcatgttg 660 ctgccctgcg gaattgacaa gttccgaggg gtagagtttg tgtgttgccc actggctgaa 720 gaaagtgaca atgtggattc tgctgatgcg gaggaggatg actcggatgt ctggtggggc 780 ggagcagaca cagactatgc agatgggagt gaagacaaag tagtagaagt agcagaggag 840 gaagaagtgg ctgaggtgga agaagaagaa gccgatgatg acgaggacga tgaggatggt 900 gatgaggtag aggaagaggc tgaggaaccc tacgaagaag ccacagagag aaccaccagc 960 attgccacca ccaccaccac caccacagag tctgtggaag aggtggttcg agaggtgtgc 1020 tctgaacaag ccgagacggg gccgtgccga gcaatgatct cccgctggta ctttgatgtg 1080 actgaaggga agtgtgcccc attcttttac ggcggatgtg gcggcaaccg gaacaacttt 1140 gacacagaag agtactgcat ggccgtgtgt ggcagcgcca tgtcccaaag tttactcaag 1200 actacccagg aacctcttgc ccgagatcct gttaaacttc ctacaacagc agccagtacc 1260 cctgatgccg ttgacaagta tctcgagaca cctggggatg agaatgaaca tgcccatttc 1320 cagaaagcca aagagaggct tgaggccaag caccgagaga gaatgtccca ggtcatgaga 1380 gaatgggaag aggcagaacg tcaagcaaag aacttgccta aagctgataa gaaggcagtt 1440 atccagcatt tccaggagaa agtggaatct ttggaacagg aagcagccaa cgagagacag 1500 cagctggtgg agacacacat ggccagagtg gaagccatgc tcaatgaccg ccgccgcctg 1560 gccctggaga actacatcac cgctctgcag gctgttcctc ctcggcctcg tcacgtgttc 1620 aatatgctaa agaagtatgt ccgcgcagaa cagaaggaca gacagcacac cctaaagcat 1680 ttcgagcatg tgcgcatggt ggatcccaag aaagccgctc agatccggtc ccaggttatg 1740 acacacctcc gtgtgattta tgagcgcatg aatcagtctc tctccctgct ctacaacgtg 1800 cctgcagtgg ccgaggagat tcaggatgaa gttgatgagc tgcttcagaa agagcaaaac 1860 tattcagatg acgtcttggc caacatgatt agtgaaccaa ggatcagtta cggaaacgat 1920 gctctcatgc catctttgac cgaaacgaaa accaccgtgg agctccttcc cgtgaatgga 1980 gagttcagcc tggacgatct ccagccgtgg cattcttttg gggctgactc tgtgccagcc 2040 aacacagaaa acgaagttga gcctgttgat gcccgccctg ctgccgaccg aggactgacc 2100 actcgaccag gttctgggtt gacaaatatc aagacggagg agatctctga agtgaagatg 2160 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 2220 gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 2280 atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 2340 catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 2400 atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaactag 2460 acccccgcca cagcagcctc tgaagttgga cagcaaaacc attgcttcac tacccatcgg 2520 tgtccattta tagaataatg tgggaagaaa caaacccgtt ttatgattta ctcattatcg 2580 ccttttgaca gctgtgctgt aacacaagta gatgcctgaa cttgaattaa tccacacatc 2640 agtaatgtat tctatctctc tttacatttt ggtctctata ctacattatt aatgggtttt 2700 gtgtactgta aagaatttag ctgtatcaaa ctagtgcatg aatagattct ctcctgatta 2760 tttatcacat agccccttag ccagttgtat attattcttg tggtttgtga cccaattaag 2820 tcctacttta catatgcttt aagaatcgat gggggatgct tcatgtgaac gtgggagttc 2880 agctgcttct cttgcctaag tattcctttc ctgatcacta tgcattttaa agttaaacat 2940 ttttaagtat ttcagatgct ttagagagat tttttttcca tgactgcatt ttactgtaca 3000 gattgctgct tctgctatat ttgtgatata ggaattaaga ggatacacac gtttgtttct 3060 tcgtgcctgt tttatgtgca cacattaggc attgagactt caagcttttc tttttttgtc 3120 cacgtatctt tgggtctttg ataaagaaaa gaatccctgt tcattgtaag cacttttacg 3180 gggcgggtgg ggaggggtgc tctgctggtc ttcaattacc aagaattctc caaaacaatt 3240 ttctgcagga tgattgtaca gaatcattgc ttatgacatg atcgctttct acactgtatt 3300 acataaataa attaaataaa ataaccccgg gcaagacttt tctttgaagg atgactacag 3360 acattaaata atcgaagtaa ttttgggtgg ggagaagagg cagattcaat tttctttaac 3420 cagtctgaag tttcatttat gatacaaaag aagatgaaaa tggaagtggc aatataaggg 3480 gatgaggaag gcatgcctgg acaaaccctt cttttaagat gtgtcttcaa tttgtataaa 3540 atggtgtttt catgtaaata aatacattct tggaggagc 3579 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(770) <223> Homo sapiens amyloid beta precursor protein <400> 2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 3 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(770) <223> APP mutant protein represented by APP(Swe,V717F) <220> <221> MUTAGEN <222> (670)..(671) <223> 670th amino acid K mutated to N and 671th amino acid M mutated to L <220> <221> MUTAGEN <222> (717) <223> 717th amino acid V mutated to F <400> 3 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Phe Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-1f primer <400> 4 gcagggtcgc gatgctgccc ggtttg 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-1r primer <400> 5 gggggactag ttctgcatct gctc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-2f primer <400> 6 cctacaacag cagccagtac ccctg 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-2r primer <400> 7 gacattctct ctcggtgctt ggcc 24 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-swe primer <400> 8 aggagatctc tgaagtgaat ctggatgcaa 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-717-r primer <400> 9 caaggtgatg aagatcactg tcgc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-717-f primer <400> 10 gcgacagtga tcttcatcac cttg 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hglob-f primer <400> 11 gatcctgaga acttcagg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hglob-r primer <400> 12 tctttgccaa agtgatgg 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP(-intron)-f primer <400> 13 gcttgatatc gaattcctgc agc 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP(-intron)-r primer <400> 14 gaggaggaac agcctgcaga g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP(+intron)-f primer <400> 15 aatgtatcat gcctctttgc acc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP(+intron)-r primer <400> 16 gcacttgtca ggaacgagaa ggg 23 <110> EWHA HAKDANG INCOPORATED EDUCATIONAL INSTITUTION <120> Transgenic mice inducing Alzheimer's disease expressing mutant APP <130> 3p-10-32 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3579 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene (222) (1) .. (3579) Homo sapiens amyloid beta precursor protein (APP) complete cds <400> 1 agtttcctcg gcagcggtag gcgagagcac gcggaggagc gtgcgcgggg gccccgggag 60 acggcggcgg tggcggcgcg ggcagagcaa ggacgcggcg gatcccactc gcacagcagc 120 gcactcggtg ccccgcgcag ggtcgcgatg ctgcccggtt tggcactgct cctgctggcc 180 gcctggacgg ctcgggcgct ggaggtaccc actgatggta atgctggcct gctggctgaa 240 ccccagattg ccatgttctg tggcagactg aacatgcaca tgaatgtcca gaatgggaag 300 tgggattcag atccatcagg gaccaaaacc tgcattgata ccaaggaagg catcctgcag 360 tattgccaag aagtctaccc tgaactgcag atcaccaatg tggtagaagc caaccaacca 420 gtgaccatcc agaactggtg caagcggggc cgcaagcagt gcaagaccca tccccacttt 480 gtgattccct accgctgctt agttggtgag tttgtaagtg atgcccttct cgttcctgac 540 aagtgcaaat tcttacacca ggagaggatg gatgtttgcg aaactcatct tcactggcac 600 accgtcgcca aagagacatg cagtgagaag agtaccaact tgcatgacta cggcatgttg 660 ctgccctgcg gaattgacaa gttccgaggg gtagagtttg tgtgttgccc actggctgaa 720 gaaagtgaca atgtggattc tgctgatgcg gaggaggatg actcggatgt ctggtggggc 780 ggagcagaca cagactatgc agatgggagt gaagacaaag tagtagaagt agcagaggag 840 gaagaagtgg ctgaggtgga agaagaagaa gccgatgatg acgaggacga tgaggatggt 900 gatgaggtag aggaagaggc tgaggaaccc tacgaagaag ccacagagag aaccaccagc 960 attgccacca ccaccaccac caccacagag tctgtggaag aggtggttcg agaggtgtgc 1020 tctgaacaag ccgagacggg gccgtgccga gcaatgatct cccgctggta ctttgatgtg 1080 actgaaggga agtgtgcccc attcttttac ggcggatgtg gcggcaaccg gaacaacttt 1140 gacacagaag agtactgcat ggccgtgtgt ggcagcgcca tgtcccaaag tttactcaag 1200 actacccagg aacctcttgc ccgagatcct gttaaacttc ctacaacagc agccagtacc 1260 cctgatgccg ttgacaagta tctcgagaca cctggggatg agaatgaaca tgcccatttc 1320 cagaaagcca aagagaggct tgaggccaag caccgagaga gaatgtccca ggtcatgaga 1380 gaatgggaag aggcagaacg tcaagcaaag aacttgccta aagctgataa gaaggcagtt 1440 atccagcatt tccaggagaa agtggaatct ttggaacagg aagcagccaa cgagagacag 1500 cagctggtgg agacacacat ggccagagtg gaagccatgc tcaatgaccg ccgccgcctg 1560 gccctggaga actacatcac cgctctgcag gctgttcctc ctcggcctcg tcacgtgttc 1620 aatatgctaa agaagtatgt ccgcgcagaa cagaaggaca gacagcacac cctaaagcat 1680 ttcgagcatg tgcgcatggt ggatcccaag aaagccgctc agatccggtc ccaggttatg 1740 acacacctcc gtgtgattta tgagcgcatg aatcagtctc tctccctgct ctacaacgtg 1800 cctgcagtgg ccgaggagat tcaggatgaa gttgatgagc tgcttcagaa agagcaaaac 1860 tattcagatg acgtcttggc caacatgatt agtgaaccaa ggatcagtta cggaaacgat 1920 gctctcatgc catctttgac cgaaacgaaa accaccgtgg agctccttcc cgtgaatgga 1980 gagttcagcc tggacgatct ccagccgtgg cattcttttg gggctgactc tgtgccagcc 2040 aacacagaaa acgaagttga gcctgttgat gcccgccctg ctgccgaccg aggactgacc 2100 actcgaccag gttctgggtt gacaaatatc aagacggagg agatctctga agtgaagatg 2160 gatgcagaat tccgacatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 2220 gcagaagatg tgggttcaaa caaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 2280 atagcgacag tgatcgtcat caccttggtg atgctgaaga agaaacagta cacatccatt 2340 catcatggtg tggtggaggt tgacgccgct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 2400 atgcagcaga acggctacga aaatccaacc tacaagttct ttgagcagat gcagaactag 2460 acccccgcca cagcagcctc tgaagttgga cagcaaaacc attgcttcac tacccatcgg 2520 tgtccattta tagaataatg tgggaagaaa caaacccgtt ttatgattta ctcattatcg 2580 ccttttgaca gctgtgctgt aacacaagta gatgcctgaa cttgaattaa tccacacatc 2640 agtaatgtat tctatctctc tttacatttt ggtctctata ctacattatt aatgggtttt 2700 gtgtactgta aagaatttag ctgtatcaaa ctagtgcatg aatagattct ctcctgatta 2760 tttatcacat agccccttag ccagttgtat attattcttg tggtttgtga cccaattaag 2820 tcctacttta catatgcttt aagaatcgat gggggatgct tcatgtgaac gtgggagttc 2880 agctgcttct cttgcctaag tattcctttc ctgatcacta tgcattttaa agttaaacat 2940 ttttaagtat ttcagatgct ttagagagat tttttttcca tgactgcatt ttactgtaca 3000 gattgctgct tctgctatat ttgtgatata ggaattaaga ggatacacac gtttgtttct 3060 tcgtgcctgt tttatgtgca cacattaggc attgagactt caagcttttc tttttttgtc 3120 cacgtatctt tgggtctttg ataaagaaaa gaatccctgt tcattgtaag cacttttacg 3180 gggcgggtgg ggaggggtgc tctgctggtc ttcaattacc aagaattctc caaaacaatt 3240 ttctgcagga tgattgtaca gaatcattgc ttatgacatg atcgctttct acactgtatt 3300 acataaataa attaaataaa ataaccccgg gcaagacttt tctttgaagg atgactacag 3360 acattaaata atcgaagtaa ttttgggtgg ggagaagagg cagattcaat tttctttaac 3420 cagtctgaag tttcatttat gatacaaaag aagatgaaaa tggaagtggc aatataaggg 3480 gatgaggaag gcatgcctgg acaaaccctt cttttaagat gtgtcttcaa tttgtataaa 3540 atggtgtttt catgtaaata aatacattct tggaggagc 3579 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (770) <223> Homo sapiens amyloid beta precursor protein <400> 2 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg   1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro              20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln          35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp      50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu  65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn                  85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val             100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu         115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys     130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile                 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu             180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val         195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys     210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu                 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile             260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg         275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile     290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr                 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr             340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala         355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp     370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala                 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile             420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn         435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met     450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys                 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe             500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser         515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser     530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val                 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala             580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro         595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe     610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser                 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp             660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu         675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ily Gly     690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val                 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met             740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met         755 760 765 Gln asn     770 <210> 3 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE (222) (1) .. (770) <223> APP mutant protein represented by APP (Swe, V717F) <220> <221> MUTAGEN <222> (670) .. (671) <223> 670th amino acid K mutated to N and 671th amino acid M mutated to          L <220> <221> MUTAGEN <222> (717) 223 717th amino acid V mutated to F <400> 3 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg   1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro              20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln          35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp      50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu  65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn                  85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val             100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu         115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys     130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile                 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu             180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val         195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys     210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu                 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile             260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg         275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile     290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr                 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr             340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala         355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp     370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala                 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile             420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn         435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met     450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys                 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe             500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser         515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser     530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val                 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala             580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro         595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe     610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser                 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Asn Leu Asp             660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu         675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ily Gly     690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Phe Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val                 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met             740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met         755 760 765 Gln asn     770 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-1f primer <400> 4 gcagggtcgc gatgctgccc ggtttg 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-1r primer <400> 5 gggggactag ttctgcatct gctc 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-2f primer <400> 6 cctacaacag cagccagtac ccctg 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-2r primer <400> 7 gacattctct ctcggtgctt ggcc 24 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-swe primer <400> 8 aggagatctc tgaagtgaat ctggatgcaa 30 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-717-r primer <400> 9 caaggtgatg aagatcactg tcgc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> app-717-f primer <400> 10 gcgacagtga tcttcatcac cttg 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hglob-f primer <400> 11 gatcctgaga acttcagg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hglob-r primer <400> 12 tctttgccaa agtgatgg 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP (-intron) -f primer <400> 13 gcttgatatc gaattcctgc agc 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP (-intron) -r primer <400> 14 gaggaggaac agcctgcaga g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> APP (+ intron) -f primer <400> 15 aatgtatcat gcctctttgc acc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APP (+ intron) -r primer <400> 16 gcacttgtca ggaacgagaa ggg 23

Claims (7)

삭제delete 삭제delete 삭제delete PDGF-β프로모터 유전자, 인간 β-글로빈 유전자로부터 유도된 인트론 B 유전자, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 돌연변이 유전자 및 SV40 폴리아데닐레이션 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환벡터(PDGF-intron-APP(Sw,V717F)-polyA).Transformation vector (PDGF-) comprising a PDGF-β promoter gene, an intron B gene derived from a human β-globin gene, a mutant gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and an SV40 polyadenylation gene intron-APP (Sw, V717F) -polyA). 삭제delete 제 4항의 형질전환용 발현벡터를 도입하여 제조한 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스(Tg-APP/B6)(수탁번호: KCTC 10608BP).Alzheimer's disease model transgenic mouse (Tg-APP / B6) prepared by introducing the transforming expression vector of claim 4 (Accession No .: KCTC 10608BP). 제 6항의 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스는 알츠하이머병의 임상적 특징인 운동성의 감소, 기억력 및 인지능력의 소실, 불안증세의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 모델 형질전환 마우스.The Alzheimer's disease model transgenic mouse of claim 6 is characterized by a decrease in motility, loss of memory and cognitive ability, and anxiety, which are clinical features of Alzheimer's disease.

Images