RU2089548C1 - Thiomarinol c and a method of its preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmacy. SUBSTANCE: product: derivative of thiomarinol that shows antibacterial and antimycoplasmic properties. Thiomarinol is prepared from microorganisms of genus Alteromonas as "thiomarinol C". EFFECT: improved method of preparing. 2 cl, 3 tbl

Description

Изобретение относится к некоторым новым производным тиомаринола, предоставляет способ их получения и касается способов и композиций для использования их в качестве антибактериальных агентов. The invention relates to some new derivatives of thiomarinol, provides a method for their preparation and relates to methods and compositions for use as antibacterial agents.

Тиомаринол описан, например, в Европейской заявке на патент N 512824, которая опубликована до подачи данной заявки, но позже даты ее приоритета. Он может быть представлен следующей формулой:

Его получают ферментацией микроорганизмов вида Alteromonas, в частности Alteromonas rava штамм SANK 73390. Обнаружено два производных тиомаринола, которые проявляют сходный тип антибактериальной активности, что и первоначальный тиомаринол.Thiomarinol is described, for example, in European Patent Application No. 512824, which is published prior to the filing of this application, but later than its priority date. It can be represented by the following formula:

It is obtained by fermentation of microorganisms of the species Alteromonas, in particular Alteromonas rava strain SANK 73390. Two derivatives of thiomarinol were found that exhibit a similar type of antibacterial activity as the original thiomarinol.

Организмы рода Alteromonas могут выть выделены из морской воды и, как было показано, некоторые из них способны производить соединения, которые потенциально пригодны для использования в терапевтических целях. Так, например, соединение, известное под названием бисукаберин было получено из одного вида рода Alteromonas и, как было показано, обладает противоопухолевой активностью (Японская патентная заявка Кокаи N Sho 63-27484). Organisms of the genus Alteromonas can be isolated from seawater and, as has been shown, some of them are capable of producing compounds that are potentially suitable for therapeutic use. For example, a compound known as bisucaberin was obtained from one species of the genus Alteromonas and has been shown to have antitumor activity (Kokai Japanese Patent Application No. Sho 63-27484).

Что касается структуры тиомаринола, то известно несколько антибиотиков, имеющих сходную структуру, которые можно разбить на четыре группы. As for the structure of thiomarinol, several antibiotics are known that have a similar structure, which can be divided into four groups.

В первую группу входят псевдомоновые кислоты, впервые выделенные из микроорганизмов Pseudomonas spp. Они включают псевдомоновую кислоту A [продуцируемую видом Pseudomonas fluorescens, описанным в J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 294 (1997)] псевдомоновую кислоту B [там же, 318 (1977)] псевдомоновую кислоту C [там же, 2827 (1982)] и псевдомоновую кислоту D [там же, 2655 (1983)] Псевдомоновая кислота A выпускается под названием "бактробан" (торговый знак фирмы Beecham) в форме 2%-ной кожной мази для антибактериального использования. Однако все из этих известных из области техники соединений имеют более слабую антибактериальную активность, чем производные тиомаринола по настоящему изобретению. The first group includes pseudomonoic acids, first isolated from microorganisms Pseudomonas spp. These include pseudomonic acid A [produced by the species Pseudomonas fluorescens described in J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 294 (1997)] pseudomonic acid B [ibid., 318 (1977)] pseudomonoic acid C [ibid., 2827 (1982)] and pseudomonoic acid D [ibid., 2655 (1983)] Pseudomonoic acid A manufactured under the name "bactroban" (a Beecham trademark) in the form of a 2% skin ointment for antibacterial use. However, all of these compounds known in the art have weaker antibacterial activity than the thiomarinol derivatives of the present invention.

Вторую группу веществ, имеющих сходство по структуре с соединениями по настоящему изобретению, составляют такие антибиотики, как холомицин (Helv. Chim, Acta, vol. 42, 563 (1959)] пирротин [J. Am. Shem. Soc. vol. 77, 2861 (1955)] тиолутин [Angew. Chem, Bd. 66, 745 (1954)] лауреотрицин [J. Am. Chem. Soc. vol. 74, 6304 (1952)] и другие. Эти антибиотики обычно продуцируются актиномицитами и отличаются тем, что имеют в своем составе серусодержащий хромофор. Ксенорхабдины I-V являются веществами, родственными холомицину, и были также выделены из бактерий (описанных в WO /01775). The second group of substances that are similar in structure to the compounds of the present invention are antibiotics such as cholomycin (Helv. Chim, Acta, vol. 42, 563 (1959)] pyrrhotite [J. Am. Shem. Soc. Vol. 77, 2861 (1955)] thiolutin [Angew. Chem, Bd. 66, 745 (1954)] laureotricin [J. Am. Chem. Soc. Vol. 74, 6304 (1952)] and others. These antibiotics are usually produced by actinomycetes and are distinguished by that have a sulfur-containing chromophore in their composition Xenorhabdins IV are substances related to cholomycin and have also been isolated from bacteria (described in WO / 01775).

Были проведены многочисленные исследования производных этих двух групп соединений, однако у нас нет каких-либо сведений о соединениях, имеющих молекулярную структуру, сходную со структурой тиомаринолов, или обладающих аналогичными свойствами. Numerous studies of derivatives of these two groups of compounds have been carried out, however, we do not have any information about compounds having a molecular structure similar to the structure of thiomarinols, or having similar properties.

Третья группа соединений описана в таких публикациях, как патентные заявки Японии Кокаи NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 и 54-125672. Ее составляют производные псевдомоновой кислоты, в которых концевая карбоксильная группа заменена амидной группой. Эти соединения не проявляют сравнимую антибактериальную активность и не обладают широким спектром антибактериальной активности. Фактически эти соединения имеют тенденцию обладать меньшей антибактериальной активностью, чем исходная псевдомоновая кислота. A third group of compounds is described in publications such as Japan's Coca patent application NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 and 54-125672. It consists of pseudomonoic acid derivatives in which the terminal carboxyl group is replaced by an amide group. These compounds do not exhibit comparable antibacterial activity and do not have a wide spectrum of antibacterial activity. In fact, these compounds tend to have less antibacterial activity than the original pseudomonoic acid.

Четвертая группа включает соединение, сходное с тиомаринолом в том, что оно является физиологическим продуктом жизнедеятельности морских бактерий [Рефераты статей 200 Ежегодной конференции Американского химического общества (26-31 августа 1990), часть 2, N 139] Однако гетероциклической группой, присоединенной к концевой карбоксильной группе этого соединения, является 2-оксо-3-пиперидильная группа. Как недавно было показано, она обладает антимикробной активностью [Experimentia, Vol 48, pp. 1165-169, 1992]
Однако считается, что наиболее близким известным соединением является псевдомоновая кислота A, а все тиомаринолы, т.е. сам тиомаринол, тиомаринол B и тиомаринол C, обладают значительно более сильной антибактериальной активностью, чем псевдомоновая кислота A.The fourth group includes a compound similar to thiomarinol in that it is a physiological waste product of marine bacteria [Abstracts of Articles 200 of the American Chemical Society Annual Conference (August 26-31, 1990), part 2, No. 139] However, a heterocyclic group attached to the terminal carboxyl the group of this compound is a 2-oxo-3-piperidyl group. As recently shown, it has antimicrobial activity [Experimentia, Vol 48, pp. 1165-169, 1992]
However, it is believed that the closest known compound is pseudomonoic acid A, and all thiomarinols, i.e. thiomarinol itself, thiomarinol B and thiomarinol C, have significantly stronger antibacterial activity than pseudomonoic acid A.

Целью настоящего изобретения является предоставление некоторых новых производных тиомаринола. The aim of the present invention is the provision of some new derivatives of thiomarinol.

Следующей и более специфической целью настоящего изобретения является предоставление соединений, которые обладают превосходной антибактериальной и антимикоплазменной активностью. A further and more specific objective of the present invention is the provision of compounds that have excellent antibacterial and antimycoplasmic activity.

Другие цели и преимущества станут понятны при рассмотрении описания изобретения. Other objectives and advantages will become apparent upon consideration of the description of the invention.

В общем смысле настоящее изобретение предоставляет два новых производных тиомаринола, одно из которых является S,S-диоксо производным и далее обозначается как "тиомаринол B", и является объектом рассмотрения в заявке N 93053043/13, из которой выделена данная, а второе является дезоксипроизводным и далее обозначается как "тиомаринол C". In a general sense, the present invention provides two new derivatives of thiomarinol, one of which is an S, S-dioxo derivative and is hereinafter referred to as “thiomarinol B”, and is the subject of consideration in application N 93053043/13, from which this is isolated, and the second is a deoxy derivative hereinafter referred to as "thiomarinol C".

Более конкретно настоящее изобретение предоставляет соединение тиомаринол C, который может быть представлен следующей формулой:

Изобретение предоставляет также способ получения тиомаринола C, который предусматривает культивирование продуцирующих тиомаринол микроорганизмов вида Alteromonas и выделение тиомаринола C из культуры.More specifically, the present invention provides a compound thiomarinol C, which may be represented by the following formula:

The invention also provides a process for the preparation of thiomarinol C, which comprises culturing thiomarinol producing microorganisms of the Alteromonas species and isolating thiomarinol C from the culture.

Из представленной выше формулы видно, что тиомаринол C содержит ряд асимметрических атомов углерода и несколько кратных связей. В частности, возможна изомеризация в α,b-ненасыщенном карбонильном фрагменте тиомаринола. Таким образом, тиомаринол может образовывать различные стерео- и геометрические изомеры. Хотя все они представлены здесь одной молекулярной формулой, настоящее изобретение включает в себя как индивидуальные, выделенные изомеры, так и их смеси, включая рацематы. При получении смеси изомеров индивидуальные изомеры могут быть получены обычными методами расщепления. From the above formula it is seen that thiomarinol C contains a number of asymmetric carbon atoms and several multiple bonds. In particular, isomerization in the α, b-unsaturated carbonyl fragment of thiomarinol is possible. Thus, thiomarinol can form various stereo and geometric isomers. Although they are all represented here in one molecular formula, the present invention includes both individual, isolated isomers and mixtures thereof, including racemates. In preparing a mixture of isomers, individual isomers can be obtained by conventional cleavage methods.

Однако поскольку тиомаринолы, как правило, получают ферментацией или химическими манипуляциями с продуктами ферментации, они имеют тенденцию приобретать стандартную оптическую конфигурацию. Поэтому, хотя предоставляются и другие конфигурации, предпочтительной является природная конфигурация. However, since thiomarinols are usually obtained by fermentation or chemical manipulation of the fermentation products, they tend to acquire a standard optical configuration. Therefore, although other configurations are provided, a natural configuration is preferred.

Тиомаринол C может быть охарактеризован следующими физико-химическими свойствами:
1. Характер и внешний вид: порошок желтого цвета.Thiomarinol C can be characterized by the following physicochemical properties:
1. Character and appearance: yellow powder.

2. Молекулярная формула C₃₀H₄₄N₂O₈S₂.2. The molecular formula is C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₈ S ₂ .

3. Молекулярная масса: 624 (по данным FAB масс-спектрометрии). 3. Molecular mass: 624 (according to FAB mass spectrometry).

4. Элементный анализ:
Вычислено для C₃₀H₄₄N₂O₈S₂ + H₂O, C 56,05, H 7,21, N 4,36, S 9,97.4. Elemental analysis:
Calculated for C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₈ S ₂ + H ₂ O, C 56.05, H 7.21, N 4.36, S 9.97.

Найдено, C 56,48, H 7,23, N 4,30, S 9,11. Found, C 56.48, H 7.23, N 4.30, S 9.11.

5. ИК спектр: n_max см^-1.5. IR spectrum: n _max cm ^-1 .

ИК спектр, снятый для образца в виде таблетки с бромистым калием: 3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225, 1151, 1104, 1052, 974, 820, 712. IR spectrum recorded for the sample in the form of a tablet with potassium bromide: 3256, 3068, 2928, 2858, 1645, 1596, 1530, 1455, 1384, 1287, 1225, 1151, 1104, 1052, 974, 820, 712.

6. УФ спектр: λ_max, нм (ε).6. UV spectrum: λ _max , nm (ε).

УФ спектр, измеренный в метаноле или смеси метанол + соляная кислота: 388 (9600), 300 (2700), 215 (17000). UV spectrum measured in methanol or a mixture of methanol + hydrochloric acid: 388 (9600), 300 (2700), 215 (17000).

УФ спектр, измеренный в смеси метанол + едкий натр: 386 (8600), 205 (49000). UV spectrum, measured in a mixture of methanol + sodium hydroxide: 386 (8600), 205 (49000).

7. Удельное вращение плоскости поляризации:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = -1,4^° (с 1,0, метанол).7. Specific rotation of the plane of polarization:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = -1.4 ^° (c 1.0, methanol).

8. Жидкостная хроматография высокого разрешения:
Разделительная колонка: Senshu-Pak ODS H-2151 (диаметр колонки 6 мм, длина 150 мм, Senshu Scientific Co. Ltd.).8. High-performance liquid chromatography:
Separation column: Senshu-Pak ODS H-2151 (column diameter 6 mm, length 150 mm, Senshu Scientific Co. Ltd.).

Растворитель: 40 об. водный ацетонитрил. Solvent: 40 vol. aqueous acetonitrile.

Скорость потока элюента: 1,5 мл/мин. Eluent flow rate: 1.5 ml / min.

Время удерживания: 11,3 мин. Retention time: 11.3 minutes

9. ¹H-ЯМР спектр: ( δ м.д.).9. ¹ H-NMR spectrum: (δ ppm).

ЯМР спектр (360 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта: 0,91 (3H, дублет, J 6,9 Гц), 0,95 (3H, дублет, J 6,3 Гц), 1,26 (2H), 1,29 (2H), 1,30 (2H), 1,51 (2H, мультиплет), 1,56 (2H, мультиплет), 1,63 (1H, мультиплет), 2,06 (2H), 2,08 (1H), 2,11 (3H, синглет), 2,15 (1H), 2,34 (2H, триплет, J 7,3 Гц), 2,56 (1H, широкий дублет, J 14,2 Гц), 3,18 (1H, широкий мультиплет), 3,35 (1H), 3,49 (1H), 3,58 (1H), 3,62 (1H), 3,67 (1H), 4,01 (2H, триплет, J 6,6 Гц), 4,32 (1H, дублет, J 4,3 Гц), 4,55 (1H, широкий мультиплет), 4,64 (1H, широкий синглет), 5,33 (1H, мультиплет), 5,37 (1H, мультиплет), 5,68 (1H, синглет), 7,05 (1H, синглет), 9,81 (1H, синглет), 10,70 (1H, синглет). NMR spectrum (360 MHz) measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as the internal standard: 0.91 (3H, doublet, J 6.9 Hz), 0.95 (3H, doublet, J 6.3 Hz), 1 26 (2H), 1.29 (2H), 1.30 (2H), 1.51 (2H, multiplet), 1.56 (2H, multiplet), 1.63 (1H, multiplet), 2.06 (2H), 2.08 (1H), 2.11 (3H, singlet), 2.15 (1H), 2.34 (2H, triplet, J 7.3 Hz), 2.56 (1H, wide doublet , J 14.2 Hz), 3.18 (1H, broad multiplet), 3.35 (1H), 3.49 (1H), 3.58 (1H), 3.62 (1H), 3.67 ( 1H), 4.01 (2H, triplet, J 6.6 Hz), 4.32 (1H, doublet, J 4.3 Hz), 4.55 (1H, broad multiplet), 4.64 (1H, wide singlet), 5.33 (1H, multiplet), 5.37 (1H, multiplet), 5.68 (1H, singlet), 7.05 (1H, syn lithium), 9.81 (1H, singlet), 10.70 (1H, singlet).

10. ¹³C-ЯМР спектроскопия: ( d м.д.).10. ¹³ C-NMR spectroscopy: (d ppm).

ЯМР спектр (90 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта: 15,7 (квартет), 18,6 (квартет), 20,0 (квартет), 24,9 (триплет), 25,2 (триплет), 28,1 (триплет), 28,3 (триплет), 28,4 (триплет), 32,1 (триплет), 34,6 (триплет), 42,0 (дублет), 42,5 (триплет), 43,1 (дублет), 63,0 (триплет), 64,0 (триплет), 68,1 (дублет), 69,2 (дублет), 69,3 (дублет), 74,4 (дублет), 110,4 (дублет), 115,3 (синглет), 116,5 (дублет), 127,6 (дублет), 133,6 (синглет), 133,9 (синглет), 134,2 (дублет), 157,9 (синглет), 165,7 (синглет), 167,9 (синглет), 171,8 (синглет). NMR spectrum (90 MHz) measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as the internal standard: 15.7 (quartet), 18.6 (quartet), 20.0 (quartet), 24.9 (triplet), 25.2 (triplet), 28.1 (triplet), 28.3 (triplet), 28.4 (triplet), 32.1 (triplet), 34.6 (triplet), 42.0 (doublet), 42.5 ( triplet), 43.1 (doublet), 63.0 (triplet), 64.0 (triplet), 68.1 (doublet), 69.2 (doublet), 69.3 (doublet), 74.4 (doublet ), 110.4 (doublet), 115.3 (singlet), 116.5 (doublet), 127.6 (doublet), 133.6 (singlet), 133.9 (singlet), 134.2 (doublet) , 157.9 (singlet), 165.7 (singlet), 167.9 (singlet), 171.8 (singlet).

11. Растворимость. Растворим в спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, хлороформе, этилацетате, ацетоне и диетиловом эфире. Нерастворим в гексане и воде. 11. Solubility. Soluble in alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol, as well as in dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, chloroform, ethyl acetate, acetone and diethyl ether. Insoluble in hexane and water.

12. Тонкослойная хроматография. 12. Thin layer chromatography.

Величина R_f 0,66.The value of R _f 0,66.

Адсорбент: силикагель (фирма Merck Co. Inc. Art. 5719). Adsorbent: silica gel (Merck Co. Inc. Art. 5719).

Элюент: хлористый метилен:метанол 85:15 по объему. Eluent: methylene chloride: methanol 85:15 by volume.

Тиомаринол C можно получить путем культивирования продуцирующих тиомаринол организмов вида Alteromonas и выделения целевого тиомаринола из культуральной среды. Разновидности тиомаринола C с требуемой антибактериальной активностью могут быть получены аналогично из других штаммов или видов Alteromonas, которые продуцируют целевое соединение, или же их можно получить, модифицируя подходящим образом соединение, выделенное в процессе указанной выше ферментации, или же их можно получить прямым химическим синтезом. Thiomarinol C can be obtained by culturing thiomarinol producing organisms of the Alteromonas species and isolating the desired thiomarinol from the culture medium. Varieties of thiomarinol C with the desired antibacterial activity can be obtained similarly from other strains or species of Alteromonas that produce the target compound, or they can be obtained by suitably modifying the compound isolated during the above fermentation, or they can be obtained by direct chemical synthesis.

В частности, нам представляется более предпочтительным использовать в качестве микроорганизма вид Alteromonas rava и особенно недавно выделенный штамм Alteromonas rava, которому мы дали обозначение SANK 73390. Штамм SANK 73390 является морским организмом, который выделен из морской воды, собранной у побережья Коина, Минамата, префектура Сизуока, Япония, и указанный штамм депонирован в Депозитарном институте, Исследовательском институте ферментации, Агентство промышленной науки и технологии, Министерства международной торговли и промышленности, Япония, 30 апреля 1991 г. депозитарный номер FERM BP-3381, в соответствии с Будапештским соглашением. In particular, it seems to us more preferable to use the species Alteromonas rava and the especially recently isolated strain Alteromonas rava, which we gave the designation SANK 73390. Strain SANK 73390 is a marine organism that is isolated from sea water collected off the coast of Coin, Minamata, prefecture Sizuoka, Japan, and the strain is deposited with the Depository Institute, Fermentation Research Institute, Industrial Science and Technology Agency, Ministry of International Trade and Industry, Japan, April 30 I 1991 deposit number FERM BP-3381, according to the Budapest Treaty.

Таксономические характеристики Alteromonas rava штамм SANK 73390 представлены ниже. The taxonomic characteristics of Alteromonas rava strain SANK 73390 are presented below.

1. Морфологические характеристики. 1. Morphological characteristics.

Alteromonas rava штамм SANK 73390 культивировался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Последовательные микроскопические наблюдения показали, что клетки имеют палочкообразную форму с диаметром 0,8 1,0 мкм и длиной 2,0 3,6 мкм. Этот штамм является грамотрицательным и перемещается с помощью бактериальных жгутиков.Alteromonas rava strain SANK 73390 was cultured at 23 ^° C for 24 hours on marine agar (Difco). Subsequent microscopic observations showed that the cells have a rod-shaped shape with a diameter of 0.8 to 1.0 μm and a length of 2.0 to 3.6 μm. This strain is gram-negative and is transported using bacterial flagella.

2. Рост на морском агаре. 2. Growth on marine agar.

SANK 73390 культивировался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Полученные колонии имеют бледный серо-зеленый цвет, непрозрачны, плоские, сплошные и имеют кольцевую форму.SANK 73390 was cultured at 23 ^° C. for 24 hours on marine agar (Difco). The resulting colonies have a pale gray-green color, are opaque, flat, solid and have a ring shape.

Водорастворимый пигмент не образуется. Water-soluble pigment is not formed.

3. Физиологические свойства. 3. Physiological properties.

(1) Требования к морской воде: SANK 73390 требует для своего роста морскую воду. (1) Sea water requirements: SANK 73390 requires sea water for its growth.

(2) Окислительно-ферментативный тест (метод Хью-Лейфсона [J. Bact. vol. 66, 2426, 1953] в среде, приготовленной из искусственной морской воды, не оказывает воздействия на углевод. (2) Oxidative-enzymatic test (Hugh-Leifson method [J. Bact. Vol. 66, 2426, 1953] in a medium prepared from artificial sea water does not affect the carbohydrate.

(3) Оксидаза: +
(4) Каталаза: +
(5) Потребность в кислороде: аэробный.(3) Oxidase: +
(4) Catalase: +
(5) Oxygen Demand: Aerobic.

(6) Восстановление нитратов: -
(7) Гидролиз крахмала: +
(8) Разложение агара: -
(9) Разжижение желатина: +
(10) Продуцирование дифосфопиридиновой нуклеотидазы (ДНазы): +
(11) Продуцирование липазы: +
(12) Температура для роста: плохой рост при 4^oC, хороший рост в интервале 17 26^oC, отсутствие роста при 35^oC.(6) Nitrate reduction: -
(7) Hydrolysis of starch: +
(8) Agar degradation: -
(9) Gelatin Liquefaction: +
(10) Production of diphosphopyridine nucleotidase (DNase): +
(11) Lipase Production: +
(12) Temperature for growth: poor growth at 4 ^o C, good growth in the range 17 26 ^o C, no growth at 35 ^o C.

(13) Требования к факторам роста: на основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), SANK 73390, требует добавления свободной от витаминов казамино-кислоты. (13) Requirements for growth factors: on the main nutrient medium described in J. Bact. vol. 107, 268 (1971), SANK 73390, requires the addition of vitamin-free casamino acid.

(14) Ассимиляция источников углерода: на основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), дополнительно содержащей 0,1% вес. /об. свободную от витаминов казамино-кислоту, при встряхивании культуры (см. табл. 1). (14) Assimilation of carbon sources: on the main nutrient medium described in J. Bact. vol. 107, 268 (1971), additionally containing 0.1% weight. /about. vitamin-free casamino acid when shaking the culture (see table. 1).

4. Хемотаксономические характеристики. 4. Chemotaxonomic characteristics.

(1) Мол. гуанина и цитозина (содержание Г+Ц) в ДНК: 43,4% ( по данным жидкостной хроматографии высокого разрешения). (1) Mol. guanine and cytosine (G + C content) in DNA: 43.4% (according to high resolution liquid chromatography).

(2) Хиноновая система: убихинон Q-8. (2) Quinone system: ubiquinone Q-8.

Принимая во внимание приведенные выше таксономические характеристики, Alteromonas rava штамм SANK 73390 сравнивали со штаммами, описанными в Bergey's Manual of Systematik Bacteriology, Vol. 1 (1984), а также со штаммами, описанными в последних выпусках International Journal of Bacteriology. Обнаружено, что Alteromonas rava штамм SANK 73390 в некоторой степени обнаруживается сходство с Alteromonas citrea, который также является морским организмом. Проведено выращивание и сравнение свойств SANK 73390 и Alteromonas citrea, АТСС 29719 (стандартный штамм). Given the above taxonomic characteristics, Alteromonas rava strain SANK 73390 was compared with the strains described in Bergey's Manual of Systematik Bacteriology, Vol. 1 (1984), as well as with the strains described in the latest issues of the International Journal of Bacteriology. It was found that Alteromonas rava strain SANK 73390 is somewhat similar to Alteromonas citrea, which is also a marine organism. The properties of SANK 73390 and Alteromonas citrea, ATCC 29719 (standard strain) were grown and compared.

В сравнении с бледно-серовато-желтого цвета SANK 73390, колонии АТСС 29719 имели зеленовато-желтый цвет. SANK 73390 отличается от Alteromonas citrea скоростью роста при 4^oC и способностью усваивать трегалозу и пропионат натрия в качестве источников углерода. Следовательно, штамм Alteromonas rava SANK 73390 является новым штаммом нового вида Alteromonas rava и отличается по своим важнейшим характеристикам от ближайшего аналога, депонированного под номером АТСС 29719.Compared with the pale grayish yellow SANK 73390, the ATCC 29719 colonies were greenish yellow. SANK 73390 differs from Alteromonas citrea in its growth rate at 4 ^° C and in its ability to absorb trehalose and sodium propionate as carbon sources. Therefore, the strain Alteromonas rava SANK 73390 is a new strain of the new species Alteromonas rava and differs in its most important characteristics from the nearest analogue, deposited under the number ATCC 29719.

Приведенные выше характеристики являются типичными для SANK 73390. Однако, как известно, характеристики образцов Alteromonas spp. могут меняться как естественным, так и искусственным путем. Приведенные выше характеристики определяют штамм Alteromonas rava в том виде, в котором он был депонирован, но необязательно типичным для других видов рода Alteromonas или штаммов Alteromonas rava, которые обладают способностью продуцировать тиомаринол или его встречающиеся в природе варианты. Все такие штаммы включены в объем притязаний по настоящему изобретению. The above characteristics are typical for SANK 73390. However, as you know, the characteristics of the samples Alteromonas spp. can change both naturally and artificially. The above characteristics determine the strain of Alteromonas rava in the form in which it was deposited, but not necessarily typical of other species of the genus Alteromonas or strains of Alteromonas rava, which have the ability to produce thiomarinol or its naturally occurring variants. All such strains are included in the scope of the claims of the present invention.

Понятно, что SANK 73390 или любой другой штамм, способный продуцировать тиомаринол или одну из его разновидностей, может быть подвергнут субкультивированию, изменен биотехнологическим путем или модифицирован с целью продуцирования организма с различными характеристиками. Единственным требованием к получаемому организму является способность продуцировать требуемое соединение. It is understood that SANK 73390 or any other strain capable of producing thiomarinol or one of its varieties can be subcultured, biotechnologically modified, or modified to produce an organism with different characteristics. The only requirement for the resulting organism is the ability to produce the desired compound.

Такие изменения или модификации могут принимать любую желаемую форму или же могут, например, зависеть от условий выращивания культуры. Штаммы можно так изменить при выращивании и выбрать таким образом, чтобы получить образцы, обладающие такими свойствами, как увеличенная скорость роста, рост при более высоких или более низких температурах. Such changes or modifications may take any desired form, or may, for example, depend on the growing conditions of the culture. Strains can be changed during cultivation and selected in such a way as to obtain samples with such properties as an increased growth rate, growth at higher or lower temperatures.

Биотехнологические модификации, как правило, осуществляют намеренно, и могут вводить селективные характеристики, такие как, например, устойчивость или восприимчивость к бактериостату или их комбинацию, чтобы поддержать чистоту, или обеспечивать возможность очистки культуры, особенно элитных культур. Biotechnological modifications, as a rule, are carried out intentionally, and can introduce selective characteristics, such as, for example, resistance or susceptibility to a bacteriostat, or a combination thereof, to maintain purity, or to enable the purification of cultures, especially elite cultures.

Другими характеристиками, которые могут быть введены при генетических манипуляциях, являются любые из тех, что допустимы в случае Alteromonas spp. Например, можно ввести плазмиды, кодирующие сопротивляемость, или удалить любые природные плазмиды. Наибольшие преимущества предоставляют те плазмиды, которые обладают способностью образовывать штаммы мутанта растущего организма. Плазмиды можно получить из любого удобного источника или сформировать методами генной инженерии, выделив природную плазмиду Alteromonas и вводя в нее нужный ген или гены из другого источника. Природные плазмиды можно также модифицировать любым другим желаемым образом. Other characteristics that can be introduced during genetic manipulation are any of those that are acceptable in the case of Alteromonas spp. For example, you can enter plasmids encoding resistance, or remove any natural plasmids. The greatest advantages are provided by those plasmids that have the ability to form mutant strains of a growing organism. Plasmids can be obtained from any convenient source or generated by genetic engineering by isolating the natural Alteromonas plasmid and introducing the desired gene or genes from another source into it. Natural plasmids can also be modified in any other desired manner.

Для того чтобы получить тиомаринол C из культуры подходящего микроорганизма, микроорганизмы необходимо подвергнуть ферментации в подходящей среде. Такие среды, как правило, хорошо известны из области техники и часто используются при производстве других ферментативных продуктов. In order to obtain thiomarinol C from a culture of a suitable microorganism, the microorganisms must be fermented in a suitable medium. Such media are generally well known in the art and are often used in the manufacture of other enzymatic products.

Обычно такая среда должна содержать любую комбинацию источника углерода, источника азота и одной или более неорганических солей, которые усваиваются соответствующим микроорганизмом. Минимальным требованием к среде является то, что она должна содержать такие ингредиенты, которые необходимы для роста микроорганизма. Typically, such a medium should contain any combination of a carbon source, a nitrogen source, and one or more inorganic salts that are absorbed by the corresponding microorganism. The minimum requirement for the environment is that it must contain such ingredients as are necessary for the growth of the microorganism.

Подходящими источниками углерода являются глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, маннит, глицерин, декстрин, овсяная мука, рожь, кукурузный крахмал, картофель, кукурузная мука, соевая мука, хлопковое масло, патока, лимонная кислота и винная кислота, каждый из которых может применяться самостоятельно или же в сочетании с одним или более других источников углерода. Типичные количества составляют 1 10% вес./об. от количества среды, хотя эта величина может изменяться в зависимости от потребности и в соответствии с желаемым результатом. Suitable carbon sources are glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerin, dextrin, oat flour, rye, corn starch, potato, corn flour, soy flour, cottonseed oil, molasses, citric acid and tartaric acid, each of which can be used alone or in combination with one or more other carbon sources. Typical amounts are 1 10% w / v. on the amount of medium, although this value may vary depending on the need and in accordance with the desired result.

Подходящими источниками азота могут быть любые вещества, которые содержат, например, белок. Типичными примерами источников азота являются органические источники азота, получаемые от животных и растений, это могут быть экстракты, выделенные из таких природных источников, как соевая мука, отруби, арахисовая мука, мука из семян хлопчатника, гидролизат казеина, фермамин, рыбная мука, кукурузный экстракт, пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, и неорганические источники азота, такие как нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. Так же как и в случае источников углерода, их можно использовать отдельно или же в сочетании друг с другом. Типичные количества составляют 0,1 6% вес./об. от количества среды. Suitable nitrogen sources can be any substance that contains, for example, protein. Typical examples of nitrogen sources are organic nitrogen sources obtained from animals and plants, these can be extracts extracted from natural sources such as soy flour, bran, peanut flour, cottonseed flour, casein hydrolyzate, fermine, fish meal, corn extract , peptone, meat extract, yeast, yeast extract, malt extract, and inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate, ammonium nitrate and ammonium sulfate. As with carbon sources, they can be used alone or in combination with each other. Typical amounts are 0.1 to 6% w / v. on the amount of medium.

Подходящими питательными неорганическими солями являются те, которые обеспечивают микроэлементы, а также основные солевые составляющие. Соли должны преимущественно содержать такие ионы, как ионы натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, фосфат-, сульфат-, хлорид- и карбонат-ионы. Могут также присутствовать следы таких металлов (или микроэлементов) как кобальт, марганец или стронций, или соли, способные давать такие ионы, как бромид-, фторид-, борат- и силикат-ионы. Suitable nutritious inorganic salts are those that provide trace elements, as well as basic salt components. Salts should preferably contain ions such as sodium, potassium, ammonium, calcium, magnesium, iron, phosphate, sulfate, chloride and carbonate ions. Traces of metals (or trace elements) such as cobalt, manganese or strontium, or salts capable of producing ions such as bromide, fluoride, borate and silicate ions may also be present.

Alteromonas rava встречается в природе в морской воде, поэтому, если специально не оговорено, условия для выращивания этих организмов должны идеально соответствовать условиям морской среды обитания. Так, ионы, которые в виде следов содержатся в морской воде, преимущественно включаются в любую среду, используемую для выращивания Alteromonas. В частности, микроорганизмы должны предпочтительно выращиваться в присутствии морской воды, искусственной морской воды или компонентов, соответствующих составу морской воды. Alteromonas rava is found in nature in sea water, therefore, unless expressly agreed, the conditions for the cultivation of these organisms should ideally correspond to the conditions of the marine habitat. So, ions that are contained in seawater in the form of traces are mainly included in any medium used to grow Alteromonas. In particular, microorganisms should preferably be grown in the presence of sea water, artificial sea water or components corresponding to the composition of sea water.

Если микроорганизм ферментатируют в виде жидкой культуры, то желательно использовать пеногасители, такие как силиконовое масло или растительное масло или другие подходящие поверхностно-активные вещества. If the microorganism is fermented as a liquid culture, then it is desirable to use antifoam agents such as silicone oil or vegetable oil or other suitable surfactants.

При использовании штамма Alteromonas rava SANK 73390 для получения тиомаринола кислотность среды для выращивания должна преимущественно поддерживаться 5,0 8,0 pH, хотя единственным требованием является то, чтобы кислотность среды не препятствовала росту микроорганизма или вредно и необратимо не влияла на выход целевого продукта. Для прекращения ферментации можно добавлять избыток кислоты или щелочи. Alteromonas rava SANK 73390, как правило, растет при температуре 4 32^oC, хорошо растет при температуре 17 26^oC. Можно работать и при других температурах, которые не попадают в указанный интервал, в том случае, если выделен штамм, способный расти при более низких или высоких температурах. Для получения тиомаринола C интервал температуры должен преимущественно составлять 20 26^oC.When using the Alteromonas rava SANK 73390 strain for the production of thiomarinol, the acidity of the growth medium should preferably be maintained at 5.0-8.0 pH, although the only requirement is that the acidity of the medium does not interfere with the growth of the microorganism or adversely and irreversibly affect the yield of the target product. To stop fermentation, an excess of acid or alkali can be added. Alteromonas rava SANK 73390, as a rule, grows at a temperature of 4 32 ^o C, grows well at a temperature of 17 26 ^o C. You can work at other temperatures that do not fall in the specified interval, if a strain capable of growing at lower or higher temperatures. To obtain thiomarinol C, the temperature range should preferably be 20 26 ^o C.

Тиомаринол C идеально получается при аэробном культивировании, и можно применять любую методику аэробного выращивания, например, твердую культуру, встряхиваемую культуру или перемешиваемую воздухом культуру. Thiomarinol C is ideally obtained by aerobic cultivation, and any aerobic cultivation technique can be applied, for example, solid culture, shake culture or air-mixed culture.

Если культивирование проводят в небольшом масштабе, то обычно более предпочтительна встряхиваемая культура, которую ферментатируют в течение нескольких дней при температуре 20 26^oC.If the cultivation is carried out on a small scale, then a shake culture, which is fermented for several days at a temperature of 20 26 ^o C., is usually preferred.

Для начала ферментативного выращивания предпочтительно использовать методику с использованием исходного инокулюма, приготовленного в одну или две стадии, например, в колбе Эрленмейера. Для культуральной среды можно использовать комбинацию источника углерода и источника азота. Колбу с посевным материалом встряхивают в термостатируемом инкубаторе при 23^oC в течение 1 3 дней или же до тех пор, пока не начнется ощутимый рост. Полученную посевную культуру можно далее использовать для высева второй посевной культуры или продуцирующей культуры. Если проводят повторный высев, его можно осуществлять обычным способом, а часть использовать для инокуляции продуцентной среды. Среду, в которую помещается посевной материал, встряхивают при соответствующей температуре в течение необходимого количества времени, например от 1 до 3 дней, или же до тех пор, пока не начнется заметное образование продукта, как это описано выше. После окончания инкубационного периода содержимое колбы разделяют центрифугированием или фильтрованием.To begin the enzymatic growth, it is preferable to use the method using the initial inoculum prepared in one or two stages, for example, in an Erlenmeyer flask. For the culture medium, a combination of a carbon source and a nitrogen source can be used. The flask with inoculum is shaken in a thermostatic incubator at 23 ^o C for 1 to 3 days or until a tangible growth begins. The resulting seed crop can then be used to plant a second seed crop or production crop. If repeated seeding is carried out, it can be carried out in the usual way, and some can be used to inoculate a production medium. The medium in which the seed is placed is shaken at the appropriate temperature for the required amount of time, for example from 1 to 3 days, or until a noticeable formation of the product begins, as described above. After the incubation period, the contents of the flask are separated by centrifugation or filtration.

Если выращивание проводят в больших масштабах, то предпочтительно использовать культуру, перемешиваемую воздухом в ферментере. В этом случае питательную среду можно приготовить прямо в ферментере. После стерилизации при 125^oC полученную среду охлаждают и засевают инокулюмом, предварительно приготовленным в стерильной среде. Выращивание проводят при перемешивании и аэрации при температуре 20 26^oC. Эта методика пригодна для получения соединения в больших количествах.If the cultivation is carried out on a large scale, it is preferable to use a culture mixed with air in a fermenter. In this case, the nutrient medium can be prepared directly in the fermenter. After sterilization at 125 ^° C., the resulting medium is cooled and inoculated with inoculum previously prepared in a sterile medium. Cultivation is carried out with stirring and aeration at a temperature of 20 26 ^o C. This technique is suitable for the preparation of compounds in large quantities.

Количество тиомаринола, вырабатываемого культурой, можно время от времени контролировать с помощью, например, жидкостной хроматографии высокого разрешения. Как правило, количество продуцированного тиомаринола C достигает максимума в интервале времени 19 200 ч, а количество продуцированного тиомаринола достигает максимума в интервале времени 19 96 ч. The amount of thiomarinol produced by the culture can be controlled from time to time by, for example, high-performance liquid chromatography. Typically, the amount of thiomarinol C produced reaches a maximum in a time interval of 19,200 hours, and the amount of thiomarinol C produced reaches a maximum in a time interval of 19 to 96 hours.

По истечении подходящего времени выращивания тиомаринол C можно выделить и очистить любыми известными способами. Например, либо количество C, оставшееся в бульоне с культурой, можно получить отфильтровыванием твердых веществ, например используя в качестве материала для фильтрования диатомную землю, или центрифугированием с последующей экстракцией жидкости над осадком и очисткой в соответствии с физико-химическими свойствами тиомаринола C. Например, тиомаринол C, находящийся в фильтрате или в остатке после центрифугирования, можно экстрагировать несмешиваемыми с водой органическими растворителями, такими как этилацетат, хлороформ, хлористый этилен, хлористый метилен или смесь указанных растворителей в нейтральных или кислых условиях, а затем очистить. After a suitable growing time, thiomarinol C can be isolated and purified by any known means. For example, either the amount of C left in the culture broth can be obtained by filtering off solids, for example, using diatomaceous earth as a filter material, or by centrifugation followed by extraction of the liquid over the precipitate and purification in accordance with the physicochemical properties of thiomarinol C. For example, thiomarinol C, which is in the filtrate or in the residue after centrifugation, can be extracted with water-immiscible organic solvents such as ethyl acetate, chloroform, ethyl chloride n, methylene chloride or a mixture of these solvents under neutral or acidic conditions, and then cleaned.

Альтернативно в качестве адсорбента можно использовать активированный уголь или адсорбирующие смолы, такие как Amberlit (торговый знак) XAD -2, XAD -4 (фирма Rohm Haas) или Diaion (торговый знак) HP-10, Hp-20, CHP-20, HP-50 (фирма Mitsubishi Kasei Corporation). Примеси можно удалить после адсорбции, пропуская жидкость, содержащую тиомаринол C, через тонкий слой адсорбента, тиомаринол C можно также очистить после адсорбции элюированием подходящим растворителем, например, водным метанолом, водным ацетоном или смесью бутанол/вода. Alternatively, activated carbon or adsorbent resins such as Amberlit (trademark) XAD -2, XAD -4 (Rohm Haas) or Diaion (trademark) HP-10, Hp-20, CHP-20, HP can be used as adsorbent. -50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Impurities can be removed after adsorption by passing a liquid containing thiomarinol C through a thin layer of adsorbent, thiomarinol C can also be purified after adsorption by elution with a suitable solvent, for example, aqueous methanol, aqueous acetone or a mixture of butanol / water.

Внутриклеточный тиомаринол C можно очистить экстракцией подходящим растворителем, например, водным ацетоном или водным метанолом, который предпочтительно имеет концентрацию 50 90 об. и удалением органического растворителя с последующей экстракцией, как это описано ранее для фильтрата или жидкости над осадком. Intracellular thiomarinol C can be purified by extraction with a suitable solvent, for example, aqueous acetone or aqueous methanol, which preferably has a concentration of 50 to 90 vol. and removing the organic solvent, followed by extraction, as previously described for the filtrate or liquid above the precipitate.

Дальнейшую очистку тиомаринола C можно осуществить с помощью хорошо известных методов, а именно:
адсорбционной колоночной хроматографией, используя такие носители, как силикагель или магний-силикагель, например, поставляемый в продажу под торговым названием "флорисил";
распределительной колоночной хроматографией, используя такие адсорбенты, как Sephadex LH-20 (торговое название продукта фирмы Pharmacia);
жидкостной хроматографией высокого разрешения с использованием колонок с нормальными или обращенными фазами.Further purification of thiomarinol C can be carried out using well-known methods, namely:
adsorption column chromatography using carriers such as silica gel or magnesium silica gel, for example, marketed under the trade name "Florisil";
distribution column chromatography using adsorbents such as Sephadex LH-20 (trade name for the product from Pharmacia);
high performance liquid chromatography using normal or reverse phase columns.

Как хорошо известно из области техники, эти способы выделения и очистки можно осуществлять отдельно или в любом удобном сочетании, а если необходимо, и многократно с целью выделения и очистки целевого продукта. As is well known from the technical field, these methods of isolation and purification can be carried out separately or in any convenient combination, and if necessary, and repeatedly for the purpose of isolation and purification of the target product.

Поскольку тиомаринол C обладает антибактериальным воздействием на грампозитивные и грамнегативные бактерии и микоплазмы в животных организмах (в частности человека, собаки, кошки и кролика), его можно самыми разнообразными способами в зависимости от природы инфекции использовать для лечения или профилактики бактериальных или микоплазменных инфекций. Since thiomarinol C has an antibacterial effect on gram-positive and gram-negative bacteria and mycoplasmas in animal organisms (in particular humans, dogs, cats and rabbits), it can be used in a variety of ways, depending on the nature of the infection, to treat or prevent bacterial or mycoplasma infections.

В том случае, если соединение по настоящему изобретению предполагается использовать в терапевтических целях, его можно назначать самостоятельно или в виде фармацевтической композиции, содержащей, помимо активного соединения, один или два стандартных разбавителя, носителя, инертных наполнителя или вспомогательных соединений. Форма композиции, естественно, будет зависеть от способа приема лекарства. Для орального назначения соединение преимущественно преобразуется в форму препарата в виде порошков, гранул, таблеток, капсул или сиропов. Для парентерального назначения оно преимущественно приготавливается в виде инъекционных препаратов (которые могут быть внутривенными, внутримышечными или подкожными), капель, свечей, мазей или линиментов. In the event that the compound of the present invention is intended to be used for therapeutic purposes, it can be administered alone or in the form of a pharmaceutical composition containing, in addition to the active compound, one or two standard diluents, carriers, inert excipients or auxiliary compounds. The form of the composition will naturally depend on the method of administration of the drug. For oral administration, the compound is advantageously converted into the form of a preparation in the form of powders, granules, tablets, capsules or syrups. For parenteral administration, it is predominantly prepared in the form of injectable preparations (which may be intravenous, intramuscular or subcutaneous), drops, suppositories, ointments or liniment.

Эти формы препаратов могут быть приготовлены известными способами добавлением к активному соединению таких добавок, как носители, связующие, разрыхлители, смазки, стабилизаторы, модификаторы, смачиватели, ароматизирующие вещества, отдушки, диспергаторы или материалы для покрытия оболочкой. Хотя доза может зависеть от симптомов заболевания и возраста пациента, природы и степени тяжести инфекции, а также от способа назначения лекарств, в случае орального назначения взрослому больному соединение по настоящему изобретению может обычно применяться в виде дневной дозы 20 2000 мг. Соединение можно принимать в виде разовой дозы или порциями, например два или три раза в день. These formulations can be prepared by known methods by adding additives such as carriers, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, modifiers, wetting agents, flavoring agents, perfumes, dispersants or coating materials to the active compound. Although the dose may depend on the symptoms of the disease and the age of the patient, the nature and severity of the infection, as well as the method of prescribing the drugs, in the case of oral administration to an adult patient, the compound of the present invention can usually be used as a daily dose of 20 2000 mg. The compound can be taken in a single dose or in portions, for example, two or three times a day.

Получение соединения по настоящему изобретению далее поясняется следующим примером, который не ограничивает настоящее изобретение, а биологическая активность соединения иллюстрируется далее в примерах испытаний. The preparation of the compound of the present invention is further illustrated by the following example, which does not limit the present invention, and the biological activity of the compound is illustrated further in the test examples.

Пример. Получение тиомаринола C выращиванием в тенке. Example. Obtaining thiomarinol C cultivation in tenka.

А) Культура. A) Culture.

Один скос морского агара (Difco), на котором высажен и выращен штамм Alteromonas rava SANK 73390, помещают в 10 мл стерилизованного морского бульона (Difco) для получения суспензии бактерий. One bevel of marine agar (Difco), on which the Alteromonas rava SANK 73390 strain is planted and grown, is placed in 10 ml of sterilized sea broth (Difco) to obtain a bacterial suspension.

30-литровый ферментер кувшинного типа, содержащий 15 л того же морского бульона, стерилизуют при нагревании, а затем в него высевают все количество бактериальной суспензии и выращивают в течение 24 ч при температуре 23^oC и скорости подачи воздуха 7,5 л/мин. Первоначальная скорость перемешивания составляет 100 об/мин, а затем ее подбирают таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода составляла 5 промилей.A 30-liter jug-type fermenter containing 15 liters of the same sea broth is sterilized by heating, and then the entire amount of the bacterial suspension is seeded and grown for 24 hours at a temperature of 23 ^° C and an air supply rate of 7.5 l / min. The initial mixing speed is 100 rpm, and then it is selected so that the concentration of dissolved oxygen is 5 ppm.

В каждый из 600-литровых тенков помещают по 300 л питательной среды, имеющей следующий состав,
Глюкоза 1,5
Бактопептон (Difco) 1,5
Бактодрожжевой экстракт (Difco) 0,2
NaCl 3,89
MgCl₂•6H₂O 2,52
Na₂SO₄ 0,648
CACl₂•2H₂O 0,4767
KCl 0,11
Na₂CO₃ 0,038
Цитрат железа 0,02
pH 7,6 до стерилизации.In each of the 600-liter tenks placed 300 l of nutrient medium having the following composition,
Glucose 1.5
Bactopeptone (Difco) 1.5
Bacter Yeast Extract (Difco) 0.2
NaCl 3.89
MgCl ₂ • 6H ₂ O 2.52
Na ₂ SO ₄ 0.648
CACl ₂ • 2H ₂ O 0.4767
KCl 0.11
Na ₂ CO ₃ 0,038
Iron Citrate 0.02
pH 7.6 before sterilization.

Тенки стерилизуют нагреванием, и затем в каждый из них высевают по 3 л культуры и выращивают в течение 29 ч при 23^oC и скорости подачи воздуха 150 л/мин. Первоначальная скорость перемешивания составляет 82 об/мин, а затем ее подбирают таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода составляла 5 промилей.Tenki are sterilized by heating, and then 3 l of culture are sown in each of them and grown for 29 hours at 23 ^° C and an air supply rate of 150 l / min. The initial mixing speed is 82 rpm, and then it is selected so that the concentration of dissolved oxygen is 5 ppm.

Б) Выделение. B) Isolation.

К 700 л полученного раствора с культурой добавляют достаточное количество водного раствора соляной кислоты с тем, чтобы довести pH дo 3. Затем к полученной смеси добавляют 700 л ацетона и экстрагируют смесь при перемешивании в течение 1 ч. Полученный экстракт, в свою очередь, экстрагируют один раз 700 л этилацетата, а затем дважды по 300 л этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты промывают сначала 300 л 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия, а затем 300 л насыщенного водного раствора хлористого натрия, после чего их сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме. В процессе упаривания добавляют 540 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха. A sufficient amount of aqueous hydrochloric acid solution is added to 700 L of the resulting culture solution in order to bring the pH to 3. Then, 700 L of acetone is added to the resulting mixture and the mixture is extracted with stirring for 1 hour. The obtained extract, in turn, is extracted with one times 700 l of ethyl acetate, and then twice 300 l of ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts are washed first with 300 L of a 5% aqueous sodium bicarbonate solution and then with 300 L of a saturated aqueous sodium chloride solution, after which they are dried over anhydrous sodium sulfate. The solvent was evaporated in vacuo. During the evaporation process, 540 g of silica gel is added, and then continue to evaporate to dryness.

Полученный таким образом остаток суспендируют в хлористом метилене, и полученную суспензию помещают в колонну с 4 кг силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Элюируют сначала смесью хлористого метилена и этилацетата (1: 1 по объему), затем одним этилацетатом и, наконец, смесью этилацетата и метанола (9:1), при этом полярность элюентов возрастает в указанном порядке. После того как элюат разделяют на порции по 2 л каждая, собирают фракцию, содержащую тиомаринол C, который элюируется смесью этилацетата и метанола, и упаривают ее досуха при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 50 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха. The residue thus obtained was suspended in methylene chloride, and the resulting suspension was placed in a column with 4 kg of silica gel saturated with methylene chloride. First, it is eluted with a mixture of methylene chloride and ethyl acetate (1: 1 by volume), then with ethyl acetate alone, and finally with a mixture of ethyl acetate and methanol (9: 1), and the polarity of the eluents increases in this order. After the eluate was divided into 2 L portions each, a fraction containing thiomarinol C, which was eluted with a mixture of ethyl acetate and methanol, was collected and evaporated to dryness under reduced pressure. During the evaporation process, 50 g of silica gel is added, and then continue to evaporate to dryness.

Остаток суспендируют в смеси гексана и ацетона, полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана и ацетона (1:1). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая, получая фракции 1 и 2, содержащие тиомаринол C. Фракцию 1 упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 25 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха. The residue was suspended in a mixture of hexane and acetone, the resulting suspension was placed on a column with 200 g of silica gel saturated with hexane, and eluted with a mixture of hexane and acetone (1: 1). The eluate was divided into 500 ml portions each, obtaining fractions 1 and 2 containing thiomarinol C. Fraction 1 was evaporated under reduced pressure. During the evaporation process, add 25 g of silica gel, and then continue to evaporate to dryness.

Полученный остаток суспендируют в смеси гексана, ацетона и этилацетата (1: 1: 2 по объему), полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана, ацетона и этилацетата (1: 1:2). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая и выделяют фракции, содержащие тиомаринол C. Эту фракцию объединяют с фракцией 2, полученной выше, и упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 20 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха. The resulting residue was suspended in a mixture of hexane, acetone and ethyl acetate (1: 1: 2 by volume), the resulting suspension was placed in a column with 200 g of silica gel saturated with hexane, and eluted with a mixture of hexane, acetone and ethyl acetate (1: 1: 2). The eluate was divided into 500 ml portions each and fractions containing thiomarinol C were isolated. This fraction was combined with fraction 2 obtained above and evaporated under reduced pressure. During the evaporation process, 20 g of silica gel is added, and then continue to evaporate to dryness.

Полученный остаток суспендируют в смеси гексана, ацетона и этилацетата (1: 1: 1 по объему), полученную суспензию помещают в колонку с 200 г силикагеля, насыщенного гексаном, и элюируют смесью гексана, ацетона и этилацетата (1:1:1). Элюат разделяют на порции по 500 мл каждая, и выделяют фракции, содержащие тиомаринол C, и упаривают при пониженном давлении, получая маслянистое вещество. The resulting residue was suspended in a mixture of hexane, acetone and ethyl acetate (1: 1: 1 by volume), the resulting suspension was placed in a column with 200 g of silica gel saturated with hexane, and eluted with a mixture of hexane, acetone and ethyl acetate (1: 1: 1). The eluate was divided into 500 ml portions each, and fractions containing thiomarinol C were isolated and evaporated under reduced pressure to give an oily substance.

Все полученное маслянистое вещество подвергают дальнейшей хроматографической очистке, используя колонку с Sephadex LH-20 емкостью 200 мл, насыщенную смесью хлористого метилена, этилацетата и метанола (19:19:2 по объему), элюируя той же смесью растворителей. Собирают фракцию, содержащую тиомаринол C, которую упаривают при пониженном давлении. В процессе упаривания добавляют 25 г силикагеля, а затем продолжают упаривать досуха. All of the resulting oily substance was subjected to further chromatographic purification using a 200 ml Sephadex LH-20 column saturated with a mixture of methylene chloride, ethyl acetate and methanol (19:19: 2 by volume), eluting with the same solvent mixture. A fraction containing thiomarinol C was collected, which was evaporated under reduced pressure. During the evaporation process, add 25 g of silica gel, and then continue to evaporate to dryness.

Полученный таким образом остаток суспендируют в хлористом метилене, и полученную суспензию помещают в колонку с 250 г силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Элюируют смесью хлористого метилена и ацетона в соотношении, изменяющемся от 9:1 к 1:9 таким образом, чтобы полярность элюента постепенно возрастала. Элюат разделяют на порции по 1 л каждая, фракции, содержащие тиомаринол C, собирают и упаривают досуха при пониженном давлении, получая 150 мг тиомаринола C, который имеет физико-химические параметры, приведенные выше. The residue thus obtained was suspended in methylene chloride, and the resulting suspension was placed on a column of 250 g of silica gel saturated with methylene chloride. Elute with a mixture of methylene chloride and acetone in a ratio varying from 9: 1 to 1: 9 so that the polarity of the eluent gradually increases. The eluate is divided into portions of 1 l each, fractions containing thiomarinol C are collected and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain 150 mg of thiomarinol C, which has the physicochemical parameters described above.

Биологическая активность тиомаринола C подтверждается следующими примерами испытаний, в которых они сравниваются с псевдомоновой кислотой A и тиомаринолом. The biological activity of thiomarinol C is confirmed by the following test examples, in which they are compared with pseudomonic acid A and thiomarinol.

Пример испытаний 1. Антибактериальная активность тиомаринола C. Test Example 1. Antibacterial activity of thiomarinol C.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) тиомаринола, тиомаринола C и псевдомоновой кислоты A (обозначены, соответственно, через A, C и P), выраженную в мкг/мл, по отношению к грампозитивным и грамнегативным бактериям определяют методом разбавления агара, используя питательную агаровую среду (продукт компании Eiken Chemical Co. Ltd.). The minimum inhibitory concentration (MIC) of thiomarinol, thiomarinol C and pseudomonoic acid A (indicated by A, C and P, respectively), expressed in μg / ml, in relation to gram-positive and gram-negative bacteria is determined by agar dilution using nutrient agar medium ( product of Eiken Chemical Co. Ltd.).

Полученные результаты представлены в табл. 2. The results are presented in table. 2.

Пример испытаний 2. Антимикоплазменная активность тиомаринола C. Test Example 2. Antimycoplasmic activity of thiomarinol C.

По аналогичной методике, приведенной в примере испытаний 1, проводят количественное определение активности тиомаринола, тиомаринола C и псевдомоновой кислоты А (обозначены, соответственно, как A, C и P) по отношению к различным образцам микоплазмы. Результаты представлены в табл. 3. By a similar methodology described in Test Example 1, the activity of thiomarinol, thiomarinol C, and pseudomonoic acid A (quantified as A, C, and P, respectively) with respect to various mycoplasma samples is quantified. The results are presented in table. 3.

Инокулюм: 0,005 мл 10 CFU/мл. Inoculum: 0.005 ml 10 CFU / ml.

Среда для анализа: для всех типов микроорганизмов испытания тиомаринола C и псевдомоновой кислоты A проводят в среде Ченока (получают по методике, приведенной в P. N. A. S. v. 48, 41 49 (1962)) с добавлением 20% лошадиной сыворотки. Analysis medium: for all types of microorganisms, the tests of thiomarinol C and pseudomonoic acid A are carried out in Chenok's medium (obtained according to the procedure described in P. N. A. S. v. 48, 41 49 (1962)) with the addition of 20% horse serum.

Тиомаринол подвергают анализу в следующих средах:
M. Bovis и M. gallisepticum: среда Ченока (получают, как указано выше).Thiomarinol is analyzed in the following environments:
M. Bovis and M. gallisepticum: Chanock medium (prepared as described above).

M. hoysynoviae: агаровая среда с муцином PPLO (плевро-пневмониальноподобный организм) с добавлением 15% сыворотки лошади. M. hoysynoviae: agar medium with mucin PPLO (pleuro-pneumonia-like organism) supplemented with 15% horse serum.

PPLO бульон без CV (Difco) 21 г
Муцин бактериальный (Difco) 5 г
Вода дистиллированная 800 мл
Агар благородный (Difco) 12 г
Конская сыворотка 150 мл
25%-ный свежий дрожжевой экстракт 50 мл
Условия выращивания культуры: 37^oC, 5 дней, слегка аэробная среда (метод газового укутывания, выращивание в генераторе CO₂ одноразового использования фирмы Becton Dickinson Microbiology Systems, Коккисвиль, Мэриленд, США).PPLO broth without CV (Difco) 21 g
Bacterial mucin (Difco) 5 g
Distilled water 800 ml
Noble agar (Difco) 12 g
Horse serum 150 ml
25% fresh yeast extract 50 ml
The culture growing conditions: 37 ^o C, 5 days, slightly aerobic environment (gas wrapping method, growing in a disposable CO ₂ generator from Becton Dickinson Microbiology Systems, Coquisville, Maryland, USA).

Из представленных результатов ясно, что тиомаринол C проявляет превосходную антибактериальную и антимикоплазменную активность, которая по крайней мере не хуже, чем у тиомаринола, и в общем случае значительно выше, чем активность псевдомоновой кислоты А. From the presented results it is clear that thiomarinol C exhibits excellent antibacterial and antimycoplasmic activity, which is at least no worse than that of thiomarinol, and in the general case is significantly higher than the activity of pseudomonoic acid A.

Claims (1)

1. Тиомаринол С формулы

2. Способ получения тиомаринола С, отличающийся тем, что штамм микроорганизма Alteromonas rava FERM ВР-3381 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта.1. Thiomarinol C Formulas

2. The method of obtaining thiomarinol C, characterized in that the microorganism strain Alteromonas rava FERM BP-3381 is cultivated in a nutrient medium containing carbon, nitrogen and inorganic salts, under aerobic conditions, followed by isolation of the target product.

Images