RU2101353C1 - Thiomarinol b and a method of its preparing (variants) - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: thiomarinol B is prepared by culturing microorganism of species Alteromonas rova on nutrient medium containing carbon, nitrogen and mineral salts source under aerobic conditions followed by its isolation. Thiomarinol B is obtained by oxidation of thiomarinol. Thiomarinol B shows antibacterial and antimycoplasmial properties. EFFECT: improved method of preparing. 8 cl, 3 tbl

Description

Изобретение относится к некоторым новым производным тиомаринола и к способам их получения, описывает методы и композиции для использования их в качестве антибактериальных агентов. The invention relates to some new derivatives of thiomarinol and to methods for their preparation, describes methods and compositions for using them as antibacterial agents.

Тиомаринол описан, например, в Европейской заявке на патент N 512824. Он может быть представлен следующей формулой:

Его получают ферментацией микроорганизмов вида Alteromonas, в частности Alteromonas rava штамм SANK 73390. Мы обнаружили два производных тиомаринола, которые проявляют сходный тип бактерицидной активности, что и оригинальный тиомаринол.Thiomarinol is described, for example, in European Patent Application No. 512824. It can be represented by the following formula:

It is obtained by fermentation of microorganisms of the species Alteromonas, in particular Alteromonas rava strain SANK 73390. We found two derivatives of thiomarinol, which exhibit a similar type of bactericidal activity as the original thiomarinol.

Организмы вида Alteromonas могут быть выделены из морской воды и, как было показано, некоторые из них способны производить соединения, которые потенциально пригодны для использования в терапевтических целях. Так, например, соединение, известное под названием бесукаберин, было получено из одной из разновидностей Alteromonas и, как было показано, обладает противоопухолевой активностью (Японская заявка на патент N Sho 63-27484). Organisms of the Alteromonas species can be isolated from seawater and, as shown, some of them are capable of producing compounds that are potentially suitable for therapeutic use. For example, a compound known as besucaberin was obtained from one of the varieties of Alteromonas and has been shown to have antitumor activity (Japanese Patent Application No. Sho 63-27484).

Что касается структуры тиомаринола, то известно несколько антибиотиков, имеющих сходную структуру, которые можно разбить на четыре группы. As for the structure of thiomarinol, several antibiotics are known that have a similar structure, which can be divided into four groups.

В первую группу входят псевдомоновые кислоты, впервые выделенные из микроорганизмов Pseudomonas spp. Она включает псевдомоновую кислоту A [продуцируемую видом Pseudomonas fluorescens, описанным в J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 294 (1977)] псевдомоновую кислоту B [там же, 318 (1977)] псевдомоновую кислоту C [там же, 2827 (1982)] и псевдомоновую кислоту D [там же, 2655 (1983)] Псевдомоновая кислота A выпускается под названием "бактробан" (торговый знак фирмы Beecham) в форме 2%-ной кожной мази для антибактериального использования. Однако эти, известные из области техники соединения, имеют более слабую антибактериальную активность, чем производные тиомаринола по изобретению. The first group includes pseudomonoic acids, first isolated from microorganisms Pseudomonas spp. It includes pseudomonic acid A [produced by the species Pseudomonas fluorescens described in J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 294 (1977)] pseudomonoic acid B [ibid., 318 (1977)] pseudomonoic acid C [ibid., 2827 (1982)] and pseudomonoic acid D [ibid., 2655 (1983)] Pseudomonoic acid A is sold under the name Bactroban (a trademark of Beecham) in the form of a 2% skin ointment for antibacterial use. However, these compounds known in the art have weaker antibacterial activity than the thiomarinol derivatives of the invention.

Вторую группу веществ, имеющих сходную структуру с соединениями по изобретению, составляют такие антибиотики, как холомицин [Helv. Chim. Acta, vol. 42, 563 (1959)] пирротин [J. Am. Chem. Soc. vol. 77, 2861 (1955)] тиолутин [Angew. Chem. Bd. 66, 745 (1954)] ауреотрицин [J. Am. Chem. Soc, vol. 74, 6304, (1952)] и другие. Эти антибиотики обычно продуцируются актиномицитами и характеризуются тем, что имеют в своем составе серусодержащий хромофор. Ксенорхабдины I-Y являются веществами, родственными холомицину, и были также выделены из бактерий (описано в патенте WO/01775). The second group of substances having a similar structure with the compounds of the invention are antibiotics such as holomycin [Helv. Chim. Acta, vol. 42, 563 (1959)] pyrrhotite [J. Am. Chem. Soc. vol. 77, 2861 (1955)] thiolutin [Angew. Chem. Bd. 66, 745 (1954)] aureotricin [J. Am. Chem. Soc, vol. 74, 6304, (1952)] and others. These antibiotics are usually produced by actinomycetes and are characterized in that they contain a sulfur-containing chromophore. Xenorhabdins I-Y are substances related to cholomycin and have also been isolated from bacteria (described in patent WO / 01775).

Были проведены многочисленные исследования производных соединений, входящих в две эти группы, однако, мы не располагаем какими-либо сведениями об описании соединений, имеющих молекулярную структуру, сходную со структурой тиомаринола, или обладающих аналогичными свойствами. Numerous studies have been conducted on derivatives of the compounds in these two groups, however, we do not have any information on the description of compounds having a molecular structure similar to the structure of thiomarinol, or having similar properties.

Третья группа соединений описана в таких публикациях, как Японские заявки Kokai NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 и 54-125672. Ее составляют производные псевдомоновой кислоты, в которых концевая карбоксильная группа замещена амидноЙ группой. Эти соединения не проявляют сравнимую антибактериальную активность и не обладают широким спектром антибактериальной активности. Фактически эти соединения обладают меньшей антибактериальной активностью, чем первоначальная псевдомоновая кислота. A third group of compounds is described in publications such as Japanese Applications Kokai NN 52-102279, 54-12375, 54-90179, 54-103871 and 54-125672. It consists of derivatives of pseudomonic acid, in which the terminal carboxyl group is replaced by an amide group. These compounds do not exhibit comparable antibacterial activity and do not have a wide spectrum of antibacterial activity. In fact, these compounds have less antibacterial activity than the original pseudomonoic acid.

Четвертая группа включает соединение, сходное с тиомаринолом в том, что оно является физиологическим продуктом, происходящим из морских бактерий [Рефераты статей 200 Ежегодной конференции Американского химического общества (26-31 августа 1990), часть 2, N 139] Однако гетероциклической группой, присоединенной к концевой карбонильной группе данного соединения, является 2-оксо-3-пиперидильная группа. Как недавно было показано, она обладает антимикробной активностью [Experimentia, vol. 48, pp. 1165-169 (1992)]
Однако представляется, что наиболее близким известным соединением является псевдомоновая кислота A, а все из тиомаринолов, то есть первоначальный тиомаринол, тиомаринол B и тиомаринол C обладают значительно более сильной антибактериальной активностью, чем псевдомоновая кислота A.The fourth group includes a compound similar to thiomarinol in that it is a physiological product derived from marine bacteria [Abstracts of Articles 200 of the American Chemical Society Annual Conference (August 26-31, 1990), Part 2, No. 139] However, a heterocyclic group attached to the terminal carbonyl group of this compound is a 2-oxo-3-piperidyl group. As recently shown, it has antimicrobial activity [Experimentia, vol. 48, pp. 1165-169 (1992)]
However, it seems that the closest known compound is pseudomonic acid A, and all of the thiomarinols, i.e., the initial thiomarinol, thiomarinol B and thiomarinol C, have significantly stronger antibacterial activity than pseudomonic acid A.

Целью изобретения является предоставление некоторых новых производных тиомаринола. The aim of the invention is the provision of some new derivatives of thiomarinol.

Следующей и более конкретной целью изобретения является предоставление соединений, которые обладают превосходной антибактериальной и антимикоплазменной активностью. A further and more specific objective of the invention is the provision of compounds that have excellent antibacterial and antimycoplasmic activity.

Другие цели и преимущества станут понятны при рассмотрении описания изобретения. Other objectives and advantages will become apparent upon consideration of the description of the invention.

В изобретении предлагается новое производное тиомаринола, которое является s,s-диоксопроизводным и далее обозначается как "тиомаринол B". The invention provides a novel thiomarinol derivative, which is s, s-dioxo derivative, and is hereinafter referred to as “thiomarinol B”.

В настоящее время установлено, что структура тиомаринола B является следующей:

Тиомаринол B характеризуется следующими физико-химическими свойствами:
1) Внешний вид: порошок желтого цвета.It has now been found that the structure of thiomarinol B is as follows:

Thiomarinol B is characterized by the following physicochemical properties:
1) Appearance: yellow powder.

2) Молекулярная формула C₃₀H₄₄N₂O₁₁S₂.2) The molecular formula is C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₁₁ S ₂ .

3) Молекулярная масса: 672 (по данным FAB масс-спектрометрии); FAB масс-спектрометрия масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами. 3) Molecular mass: 672 (according to FAB mass spectrometry); FAB mass spectrometry fast atom bombardment mass spectrometry.

4) Масс-спектрометрия высокого разрешения;
C₃₀H₄₄N₂O₁₁S₂ [(M+H)⁺; по данным FAB масс-спектрометрии]
Найдено 673,2468.4) High resolution mass spectrometry;
C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₁₁ S ₂ [(M + H) ⁺ ; according to FAB mass spectrometry]
Found 673.2468.

Вычислено 673,2465. Calculated 673.2465.

5) Элементный анализ. 5) Elemental analysis.

C₃₀H₄₄N₂O₁₁S₂ + H₂O.C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₁₁ S ₂ + H ₂ O.

Вычислено, C 52,16; H 6,71; N 4,06; S 9,28. Calculated, C 52.16; H 6.71; N, 4.06; S 9.28.

Найдено, C 52,34; H 6,79; N 3,92; S 9,02%
6) ИК-спектр: ν_max см^-1.Found, C, 52.34; H 6.79; N, 3.92; S 9.02%
6) IR spectrum: ν _max cm ^-1 .

ИКспектр, измеренный по методу с диском бромистого калия, представлен ниже: 3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063, 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553. The IR spectrum, measured by the method with a potassium bromide disk, is presented below: 3660, 3503, 3318, 3075, 2966, 2928, 2870, 1704, 1653, 1509, 1467, 1381, 1349, 1299, 1217, 1199, 1152, 1112, 1063 , 1047, 1019, 975, 949, 884, 839, 764, 730, 660, 609, 553.

7) УФ-спектр: λ_max нм (s).7) UV spectrum: λ _max nm (s).

УФ спектр, измеренный в 1-пропаноле, представлен ниже:
377(2900), 301(13000), 215(21000)
УФ-спектр, измеренный в смеси 1-пропанол + соляная кислота, представлен ниже:
377(2900), 301(13000), 223(17000).The UV spectrum measured in 1-propanol is presented below:
377 (2900), 301 (13000), 215 (21000)
The UV spectrum, measured in a mixture of 1-propanol + hydrochloric acid, is presented below:
377 (2900), 301 (13000), 223 (17000).

УФ-спектр, измеренный в смеси 1-пропанол + едкий натр, представлен ниже:
377(2900), 301(13000), 223(19000).The UV spectrum, measured in a mixture of 1-propanol + sodium hydroxide, is presented below:
377 (2900), 301 (13000), 223 (19000).

8) Удельное вращение плоскости поляризации:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = +7,7^° (c = 1,0; 1 - пропанол).
9) Жидкостная хроматография высокого разрешения:
разделительная колонка: Senshu-Pak ODS H-2151 (диаметр колонки 6 мм, длина 150 мм, торговая марка фирмы Senshu Scientific Co. Ltd.);
растворитель: 40 об. водный ацетонитрил;
скорость подачи элюента: 1,5 мл/мин;
время удерживания: 8,4 мин;
10) ¹H-ЯМР-спектр: ( δ м.д,);
ЯМР-спектр (360 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта, представлен ниже:
0,92(3H, дублет, J=6,9 Гц), 0,96(3 H, дублет, J=6,3 Гц);
1,25(2H), 1,30(2H), 1,32(2H), 1,50(2H), 1,58(2H);
1,61(1H), 2,02(3H, синглет), 2,03(1H), 2,09(1H),
2,12(1H), 2,43(2H, триплет, J=7,3 Гц), 3,35(1H, дублет,
J=10,9 Гц), 3,51(1H), 3,54(1H), 3,61(1H), 3,64(1H),
3,74(1H, широкий синглет), 4,02(2H, триплет, J=6,6 Гц),
4,18(1H, дублет, J=7,2 Гц), 4,28(1H, дублет, J=3,6 Гц),
4,43(1H, дублет, J=7,2 Гц), 4,61(1H, широкий синглет),
4,88(1H, дублет, J=7,5 Гц), 5,37(2H, мультиплет),
5,97 (1H, синглет), 7,23 (1H, синглет), 10,47 (1H, синглет)
11,28 (1H, широкий синглет).8) Specific rotation of the plane of polarization:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = +7.7 ^° (c = 1.0; 1 - propanol).
9) High Resolution Liquid Chromatography:
dividing column: Senshu-Pak ODS H-2151 (column diameter 6 mm, length 150 mm, trademark of Senshu Scientific Co. Ltd.);
solvent: 40 vol. aqueous acetonitrile;
eluent feed rate: 1.5 ml / min;
retention time: 8.4 min;
10) ¹ H-NMR spectrum: (δ ppm,);
NMR spectrum (360 MHz), measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as an internal standard, is presented below:
0.92 (3H, doublet, J = 6.9 Hz); 0.96 (3 H, doublet, J = 6.3 Hz);
1.25 (2H), 1.30 (2H), 1.32 (2H), 1.50 (2H), 1.58 (2H);
1.61 (1H), 2.02 (3H, singlet), 2.03 (1H), 2.09 (1H),
2.12 (1H), 2.43 (2H, triplet, J = 7.3 Hz), 3.35 (1H, doublet,
J = 10.9 Hz), 3.51 (1H), 3.54 (1H), 3.61 (1H), 3.64 (1H),
3.74 (1H, broad singlet), 4.02 (2H, triplet, J = 6.6 Hz),
4.18 (1H, doublet, J = 7.2 Hz), 4.28 (1H, doublet, J = 3.6 Hz),
4.43 (1H, doublet, J = 7.2 Hz), 4.61 (1H, broad singlet),
4.88 (1H, doublet, J = 7.5 Hz), 5.37 (2H, multiplet),
5.97 (1H, singlet), 7.23 (1H, singlet), 10.47 (1H, singlet)
11.28 (1H, broad singlet).

11) ¹³C-ЯМР спектроскопия: ( d м.д.).11) ¹³ C-NMR spectroscopy: (d ppm).

ЯМР-спектр (90 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта, представлен ниже:
15,6 (квартет), 15,7 (квартет), 20,0 (квартет),
24,5 (триплет), 25,3 (триплет), 28,1 (триплет),
28,2 (триплет), 28,3 (триплет), 31,9 (триплет),
34,7 (триплет), 42,2 (дублет), 43,2 (дублет),
63,0 (триплет), 63,9 (дублет), 64,3 (триплет),
69,3 (дублет), 69,6 (дублет), 72,4 (дублет),
76,2 (дублет), 109,4 (дублет), 114,4 (дублет),
115,2 (синглет), 123,3 (синглет), 127,8 (дублет),
134,2 (дублет), 143,2 (синглет), 160,8 (синглет),
165,7 (синглет), 166,1 (синглет), 173,5 (синглет).NMR spectrum (90 MHz), measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as an internal standard, is presented below:
15.6 (quartet), 15.7 (quartet), 20.0 (quartet),
24.5 (triplet), 25.3 (triplet), 28.1 (triplet),
28.2 (triplet), 28.3 (triplet), 31.9 (triplet),
34.7 (triplet), 42.2 (doublet), 43.2 (doublet),
63.0 (triplet), 63.9 (doublet), 64.3 (triplet),
69.3 (doublet), 69.6 (doublet), 72.4 (doublet),
76.2 (doublet), 109.4 (doublet), 114.4 (doublet),
115.2 (singlet), 123.3 (singlet), 127.8 (doublet),
134.2 (doublet), 143.2 (singlet), 160.8 (singlet),
165.7 (singlet), 166.1 (singlet), 173.5 (singlet).

12) Растворимост. 12) Solubility.

Растворим в спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, хлороформе, этилацетате, ацетоне и диэтиловом эфире. Нерастворим в гексане и воде. It is soluble in alcohols such as methanol, ethanol, propanol and butanol, as well as in dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, chloroform, ethyl acetate, acetone and diethyl ether. Insoluble in hexane and water.

13) Тонкослойная хроматография. 13) Thin layer chromatography.

Величина R_f 0,52
Адсорбент: силикагель (фирма Merck Co. Inc. Art. 715).The value of R _f 0,52
Adsorbent: silica gel (Merck Co. Inc. Art. 715).

Элюент: хлористый метилен:метанол 85:15 по объему. Eluent: methylene chloride: methanol 85:15 by volume.

Изобретение предоставляет также способ получения тиомаринола B, который состоит в культивировании тиомаринолпродуцирующего микроорганизма рода Alteromonas и выделении тиомаринола B из культуры. The invention also provides a method for producing thiomarinol B, which consists in culturing a thiomarin-producing microorganism of the genus Alteromonas and isolating thiomarinol B from the culture.

Изобретение предоставляет также способ получения тиомаринола B окислением тиомаринола. The invention also provides a process for the preparation of thiomarinol B by oxidation of thiomarinol.

Описывается также фармакологическая композиция, включающая антибактериальный или антимикоплазменный агент в смеси с фармакологически приемлемым носителем или разбавителем, в которой антибактериальным или антимикоплаэменным агентом является тиомаринол B. Also described is a pharmacological composition comprising an antibacterial or antimycoplasmic agent in admixture with a pharmacologically acceptable carrier or diluent, in which the thiomarinol B is an antibacterial or antimycoplastic agent.

Метод лечения или профилактики бактериальных или микоплазменных инфекций с использованием соединения изобретения состоит в назначении млекопитающему, которым может быть человек, страдающему от инфекции или подверженному воздействию таких инфекций, эффективного количества антибактериального или антимикоплазменного агента. A method of treating or preventing bacterial or mycoplasma infections using a compound of the invention is to administer to a mammal, which may be a person suffering from or exposed to such infections, an effective amount of an antibacterial or antimycoplasmic agent.

Из представленной формулы видно, что тиомаринол в содержит ряд асимметрических атомов углерода и несколько кратных связей. В частности, возможна изомеризация в альфа-, бета-ненасыщенном карбонильном фрагменте тиомаринолов. Таким образом, тиомаринол B может образовывать различные стерео- и геометрические изомеры. Хотя все они представлены здесь в виде одной молекулы, изобретение включает в себя как индивидуальные, выделенные изомеры, так и их смеси, включая рацематы. В том случае, если проводится стереоспецифический синтез либо исходные соединения являются оптически активными, индивидуальные изомеры можно получить непосредственно в результате синтеза; с другой стороны, если получена смесь изомеров, то индивидуальные изомеры могут быть получены обычными методами расщепления. From the presented formula it is seen that thiomarinol in contains a number of asymmetric carbon atoms and several multiple bonds. In particular, isomerization in the alpha, beta unsaturated carbonyl fragment of thiomarinols is possible. Thus, thiomarinol B can form various stereo and geometric isomers. Although all of them are presented here as a single molecule, the invention includes both individual, isolated isomers, and mixtures thereof, including racemates. If stereospecific synthesis is carried out or the starting compounds are optically active, individual isomers can be obtained directly from the synthesis; on the other hand, if a mixture of isomers is obtained, then individual isomers can be obtained by conventional cleavage methods.

Однако поскольку тиомаринолы, как правило, получают с помощью ферментации или химической манипуляции с продуктом ферментации, они имеют тенденцию приобретать стандартную оптическую конфигурацию. Поэтому, хотя предоставляются и другие конфигурации, природная конфигурация является предпочтительной. However, since thiomarinols are usually obtained by fermentation or chemical manipulation of the fermentation product, they tend to acquire a standard optical configuration. Therefore, although other configurations are provided, a natural configuration is preferred.

Тиомаринол B можно получить путем выращивания продуцирующего тиомаринол организма рода Alteromonas, и затем сбора желаемого тиомаринола из культуральной среды. Разновидности тиомаринола B с требуемой антибактериальной активностью могут быть получены аналогично из других штаммов или видов Alteromonas, которые производят целевое соединение, или же их можно получить, модифицируя подходящим образом соединение, выделенное в процессе указанной ферментации, или же их можно получить прямым химическим синтезом. Thiomarinol B can be obtained by growing a thiomarinol producing organism of the genus Alteromonas, and then collecting the desired thiomarinol from the culture medium. Varieties of thiomarinol B with the required antibacterial activity can be obtained similarly from other strains or species of Alteromonas that produce the target compound, or they can be obtained by suitably modifying the compound isolated during this fermentation, or they can be obtained by direct chemical synthesis.

В частности, представляется особенно предпочтительным использовать в качестве микроорганизма вид Alteromonas rava и особенно недавно выделенный штамм Alteromonas rava, которому мы дали обозначение SANK 73390. Штамм SANK 73390 является морским организмом, который выделен из морской воды, собранной у побережья Коина, Минами-Изу Мати, префектура Сизуока, Япония, и указанный штамм депонирован в Депозитарном институте, Исследовательском институте ферментации Агентства прикладных наук и технологии Министерства международной торговли и промышленности, Япония, 30 апреля 1991 г. с регистрационным номером FERM BP-3381, в соответствии с Будапештским договором. In particular, it seems particularly preferable to use the species Alteromonas rava and the particularly recently isolated strain Alteromonas rava, which we gave the designation SANK 73390. Strain SANK 73390 is a marine organism that is isolated from sea water collected off the Coin coast, Minami-Izu Mati , Shizuoka Prefecture, Japan, and the strain is deposited at the Depository Institute, Fermentation Research Institute of the Agency for Applied Sciences and Technology of the Ministry of International Trade and Industry, Japan, April 30 In 1991, with registration number FERM BP-3381, in accordance with the Budapest Treaty.

Таксономические характеристики Alteromonas rava штамма SANK 73390 представлены ниже. The taxonomic characteristics of Alteromonas rava strain SANK 73390 are presented below.

1. Морфологические характеристики. 1. Morphological characteristics.

Alteromonas rava штамм SANK 73390 выращивался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Последовательные микроскопические наблюдения показали, что клетки имеют палочкообразную форму с диаметром 0,8-1,0 мкм и длиной 2,0-3,6 мкм. Данный штамм является грамотрицательным и перемещается с помощью полярных бактериальных жгутиков.Alteromonas rava strain SANK 73390 was grown at 23 ^° C for 24 hours on marine agar (Difco). Successive microscopic observations showed that the cells have a rod-shaped shape with a diameter of 0.8-1.0 μm and a length of 2.0-3.6 μm. This strain is gram-negative and moves with the help of polar bacterial flagella.

2. Рост на морском агаре. 2. Growth on marine agar.

SANK 73390 выращивался при 23^oC в течение 24 ч на морском агаре (Difco). Полученные колонии имеют бледный серо-зеленый цвет, непрозрачны, плоские, сплошные и имеют кольцевую форму.SANK 73390 was grown at 23 ^° C for 24 hours on marine agar (Difco). The resulting colonies have a pale gray-green color, are opaque, flat, solid and have a ring shape.

Водорастворимый пигмент не образуется. Water-soluble pigment is not formed.

3. Физиологические свойства. 3. Physiological properties.

(1) Требования к морской воде: SANK 73390 требует для своего роста морскую воду. (1) Sea water requirements: SANK 73390 requires sea water for its growth.

(2) Окислительно-ферментативный тест (метод Хью-Лейфсона) [J. Bact. vol. 66, 2426 (1953)] в среде, приготовленной из искусственной морской воды: не оказывает воздействия на углевод. (2) Oxidative-enzymatic test (Hugh-Leifson method) [J. Bact. vol. 66, 2426 (1953)] in an environment prepared from artificial sea water: does not affect the carbohydrate.

(3) Оксидаза: +
(4) Каталаза: +
(5) Потребность в кислороде: аэробный.(3) Oxidase: +
(4) Catalase: +
(5) Oxygen Demand: Aerobic.

(6) Восстановление нитратов: -
(7) Гидролиз крахмала: +
(8) Разложение агара: -
(9) Разжижение желатина: +
(10) Производство дифосфопиридиновой нуклеотидазы: +
(11) Производство липазы: +
(12) Температура для роста: медленный рост при 4^oC, хороший рост в интервале от 17^oC до 26^oC, прекращение роста при 35^oC.(6) Nitrate reduction: -
(7) Hydrolysis of starch: +
(8) Agar degradation: -
(9) Gelatin Liquefaction: +
(10) Production of diphosphopyridine nucleotidase: +
(11) Lipase Production: +
(12) Temperature for growth: slow growth at 4 ^o C, good growth in the range from 17 ^o C to 26 ^o C, termination of growth at 35 ^o C.

(13) Требования к факторам роста: на основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), SANK 73390 требует добавления свободной от витаминов казамино кислоты. (13) Requirements for growth factors: on the main nutrient medium described in J. Bact. vol. 107, 268 (1971), SANK 73390 requires the addition of vitamin-free casamino acid.

(14) Усвоение источников углерода: в основной питательной среде, описанной в J. Bact. vol. 107, 268 (1971), дополнительно содержащей 0,1 мас./об. свободной от витаминов казамино кислоты, при встряхивании культуры. Данные приведены в табл. 1. (14) Assimilation of carbon sources: in the basic nutrient medium described in J. Bact. vol. 107, 268 (1971), additionally containing 0.1 wt./about. Vitamin-free casamino acid when shaking the culture. The data are given in table. one.

4. Хемотаксономические характеристики. 4. Chemotaxonomic characteristics.

(1) Мол. гуанина и цитозина (содержание Г+Ц) в ДНК: 43,4% (по данным жидкостной хроматографии высокого разрешения). (1) Mol. guanine and cytosine (G + C content) in DNA: 43.4% (according to high resolution liquid chromatography).

(2) Хиноновая система: убихинон Q-8. (2) Quinone system: ubiquinone Q-8.

Принимая во внимание приведенные таксономические характеристики, Alteromonas rava штамм SANK 73390 сравнивался со штаммами, описанными в Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1 (1984), а также со штаммами, описанными в последних выпусках International Journal of Bacteriology. Обнаружено, что Alteromonas rava штамм SANK 73390 имеет некоторое сходство с Alteromonas citrea, еще одним морским организмом. Проведено выращивание и сравнивание свойств SANK 73390 и Alteromonas citrea, ATCC 29719 (стандартный штамм). Given the taxonomic characteristics given, Alteromonas rava strain SANK 73390 was compared with the strains described in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1 (1984), as well as with the strains described in the latest issues of the International Journal of Bacteriology. Alteromonas rava strain SANK 73390 was found to have some similarities with Alteromonas citrea, another marine organism. The properties of SANK 73390 and Alteromonas citrea, ATCC 29719 (standard strain) were grown and compared.

В отличие от бледного серовато-зеленого цвета SANK 73390 колонии ATCC 29719 имели желто-зеленый цвет. SANK 73390 отличается от Alteromonas citrea также по скорости роста при 4^oC и по способности утилизировать трегалозу и пропионат натрия в качестве источников углерода. Соответственно, Alteromonas rava штамм SANK 73390 является новым штаммом нового вида Alteromonas rava и отличается по своим важнейшим характеристикам от ближайшего известного вида, депонированного под регистрационным номером ATCC 29719.In contrast to the pale grayish-green color of SANK 73390, ATCC 29719 colonies were yellow-green in color. SANK 73390 differs from Alteromonas citrea also in growth rate at 4 ^o C and in its ability to utilize trehalose and sodium propionate as carbon sources. Accordingly, Alteromonas rava strain SANK 73390 is a new strain of the new species Alteromonas rava and differs in its most important characteristics from the nearest known species deposited under registration number ATCC 29719.

Приведенные характеристики являются типичными для SANK 73390. Однако хорошо известно, что характеристики Alteromonas spp. являются изменчивыми как естественным, так и искусственным путем. Приведенные характеристики определяют штамм Alteromonas rava, как он был депонирован, но они необязательно являются типичными для других видов Alteromonas или штаммов Alteromonas rava, которые способны продуцировать тиомаринол или его встречающиеся в природе варианты. Все такие штаммы включены в объем притязаний по изобретению. The characteristics given are typical for SANK 73390. However, it is well known that the characteristics of Alteromonas spp. are volatile in both natural and artificial ways. These characteristics determine the Alteromonas rava strain as it was deposited, but they are not necessarily typical of other Alteromonas species or Alteromonas rava strains that are capable of producing thiomarinol or its naturally occurring variants. All such strains are included in the scope of the claims of the invention.

Понятно, что SANK 73390 или любой другой штамм, способный продуцировать тиомаринол, или один из его вариантов может субкультивироваться или биотехнологически изменяться, или модифицироваться, давая организмы с отличными характеристиками. Единственным требованием к получаемому организму является способность продуцировать или вырабатывать требуемое соединение. It is understood that SANK 73390 or any other strain capable of producing thiomarinol, or one of its variants, can be subcultured, biotechnologically modified, or modified to produce organisms with excellent characteristics. The only requirement for the resulting organism is the ability to produce or produce the desired compound.

Такие изменения и модификации могут принимать любую желаемую форму или же могут, например, зависеть от условий выращивания культуры. Штаммы могут модифицироваться культурой, и поэтому селекционируются таким образом, чтобы проявлять такие свойства, как усиленный рост или рост при более высоких или более низких температурах. Such changes and modifications may take any desired form or may, for example, depend on the growing conditions of the culture. The strains can be modified by culture, and therefore are selected in such a way as to exhibit properties such as enhanced growth or growth at higher or lower temperatures.

Биотехнологические модификации обычно являются преднамеренными и могут вводить селекционируемые характеристики, такие как, например, устойчивость или восприимчивость к бактериостату или их комбинацию для того, чтобы поддерживать чистоту, или время от времени обеспечить возможность очистки культур, особенно элитных культур. Biotechnological modifications are usually intentional and may introduce breeding characteristics, such as, for example, resistance or susceptibility to a bacteriostat, or a combination thereof, to maintain purity, or from time to time to allow the purification of crops, especially elite crops.

Другими характеристиками, которые могут вводиться с помощью генетических манипуляций, являются любые, которые допустимы для Alteromonas spp. Например, могут встраиваться плазмиды, колирующие сопротивляемости плазмидам, или любые природные плазмиды могут удаляться. Наибольшие преимущества представляют те плазмиды, которые обеспечивают ауксотрофию. Плазмиды могут получаться из любого подходящего источника или могут формироваться методами генной инженерии с помощью выделения природной плазмиды Alteromonas и включения в нее нужного гена или генов из другого источника. Природные плазмиды можно также модифицировать любым другим желаемым образом. Other characteristics that can be introduced through genetic manipulation are any that are valid for Alteromonas spp. For example, plasmids can be inserted that tint the resistance of plasmids, or any natural plasmids can be deleted. The greatest advantages are those plasmids that provide auxotrophy. Plasmids can be obtained from any suitable source or can be generated by genetic engineering by isolating the natural Alteromonas plasmid and incorporating the desired gene or genes from another source. Natural plasmids can also be modified in any other desired manner.

Для того, чтобы получить тиомаринол B из культуры подходящего микроорганизма, микроорганизм необходимо подвергнуть ферментации в подходящей среде. Такие среды, как правило, хорошо известны из области техники и часто используются при производстве других ферментативных продуктов. In order to obtain thiomarinol B from a culture of a suitable microorganism, the microorganism must be fermented in a suitable medium. Such media are generally well known in the art and are often used in the manufacture of other enzymatic products.

Обычно такая среда должна включать любую комбинацию источника углерода, источника азота и одной или более неорганических солей, которые усваиваются соответствующим микроорганизмом. Минимальным требованием к среде является то, чтобы она содержала ингредиенты, существенные для роста микроорганизма. Typically, such an environment should include any combination of a carbon source, a nitrogen source, and one or more inorganic salts that are absorbed by the corresponding microorganism. The minimum requirement for the environment is that it contains ingredients that are essential for the growth of the microorganism.

Подходящими источниками углерода являются глюкоза, фруктоза, мальтоза, сахароза, маннит, глицерин, декстран, овсяная мука, рожь, кукурузный крахмал, картофель, пшеничная мука, соевая мука, хлопковое масло, патока, лимонная кислота и винная кислота, любой из которых может применяться самостоятельно или же в сочетании с одним или более других источников углерода. Типичные количества составляют примерно от 1 до 10 мас./об. от количества среды, хотя это количество может меняться, если необходимо, и в соответствии с желаемым результатом. Suitable carbon sources are glucose, fructose, maltose, sucrose, mannitol, glycerin, dextran, oat flour, rye, corn starch, potato, wheat flour, soy flour, cottonseed oil, molasses, citric acid and tartaric acid, any of which can be used alone or in combination with one or more other carbon sources. Typical amounts are from about 1 to 10% w / v. on the amount of medium, although this amount may vary, if necessary, and in accordance with the desired result.

Подходящими источниками азота могут быть любые вещества, которые, например, содержат белок. Типичными примерами источников азота являются органические источники азота, получаемые из животных и растений, это могут быть экстракты из таких природных источников, как соевая мука, отруби, арахисовая мука, мука из семян хлопчатника, гидролизат казеина, фермамин, рыбная мука, кукурузный экстракт, пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт; и неорганические источники азота, такие как нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. Так же, как и в случае источников углерода, их можно использовать отдельно или же в сочетании друг с другом. Типичные количества составляют 0,1-6 мас./об. от количества среды. Suitable nitrogen sources can be any substance that, for example, contains protein. Typical examples of nitrogen sources are organic nitrogen sources obtained from animals and plants, these can be extracts from natural sources such as soybean flour, bran, peanut flour, cottonseed flour, casein hydrolyzate, farmin, fish meal, corn extract, peptone , meat extract, yeast, yeast extract, malt extract; and inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate, ammonium nitrate and ammonium sulfate. As in the case of carbon sources, they can be used separately or in combination with each other. Typical amounts are 0.1-6 wt./about. on the amount of medium.

Подходящими питательными неорганическими солями являются соли, которые наряду с основными компонентами соли содержат следы других элементов. Соли должны преимущественно содержать такие ионы, как ионы натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, фосфат-, сульфат-, хлорид- и карбонатионы. Могут также присутствовать следы металлов, таких как кобальт, марганец и стронций, или соли, способные давать такие ионы, как бромид-, фторид-, борат- или силикатионы. Suitable nutritious inorganic salts are salts which, along with the basic components of the salt, contain traces of other elements. Salts should preferably contain ions such as sodium, potassium, ammonium, calcium, magnesium, iron, phosphate, sulfate, chloride and carbonation ions. Traces of metals such as cobalt, manganese and strontium, or salts capable of producing ions such as bromide, fluoride, borate or silications can also be present.

Alteromonas rava встречается в природе в морской воде, поэтому, если специально не оговорено, условия для выращивания этих организмов должны идеально соответствовать условиям морской среды. Так, следы ионов, содержащихся в морской воде, преимущественно включаются в любую среду, используемую для выращивания Alteromonas. В частности, микроорганизмы должны предпочтительно выращиваться в присутствии морской волы, искусственной морской воды или компонентов, соответствующих составу морской воды. Alteromonas rava is found in nature in sea water, therefore, unless expressly agreed, the conditions for the cultivation of these organisms should ideally correspond to the conditions of the marine environment. So, traces of ions contained in seawater are mainly included in any medium used to grow Alteromonas. In particular, microorganisms should preferably be grown in the presence of sea water, artificial sea water or components corresponding to the composition of the sea water.

Если микроорганизмы ферментатируют в виде жидкой культуры, то предпочтительно использовать пеногасители, такие как силиконовое масло или растительное масло или другие подходящие поверхностно-активные вещества. If the microorganisms are fermented as a liquid culture, it is preferable to use antifoam agents such as silicone oil or vegetable oil or other suitable surfactants.

При использовании Alteromonas rava штамм SANK 73390 для получения тиомаринола B показатель pH культуральноЙ среды предпочтительно поддерживается в интервале pH 5,0-8,0, хотя единственным требованием является то, чтобы показатель pH среды не препятствовал росту микроорганизма или не оказывал вредного и необратимого влияния на качество целевого продукта. Для прекращения ферментации можно добавлять избыток кислоты или щелочи. When using Alteromonas rava strain SANK 73390 to obtain thiomarinol B, the pH of the culture medium is preferably maintained in the range of pH 5.0-8.0, although the only requirement is that the pH of the medium does not interfere with the growth of the microorganism or have a harmful and irreversible effect on quality of the target product. To stop fermentation, an excess of acid or alkali can be added.

Штамм Alteromonas rava SANK 73390 обычно растет при 4-32^oC, и хорошо растет при температуре 17-26^oC. Другие температуры, которые не попадают в указанный интервал, могут быть применимы, когда разработан штамм, способный расти при более низких или более высоких температурах. Для получения тиомаринола B предпочтительный интервал температур составляет между 20 и 26^oC.The strain Alteromonas rava SANK 73390 usually grows at 4-32 ^o C, and grows well at a temperature of 17-26 ^o C. Other temperatures that do not fall within this range may be applicable when a strain capable of growing at lower or more is developed high temperatures. To obtain thiomarinol B, the preferred temperature range is between 20 and 26 ^o C.

Тиомаринол B идеально получается при аэробном выращивании и можно использовать любую подходящую методику аэробного выращивания, такую как твердую культуру, встряхиваемую культуру или перемешиваемую аэрируемую культуру. Thiomarinol B is ideally obtained by aerobic cultivation and any suitable aerobic cultivation technique can be used, such as a solid culture, a shake culture or a stirred aerated culture.

Если выращивание проводят в небольшом масштабе, то обычно предпочтительна встряхиваемая культура, которую ферментатируют в течение нескольких дней при 20-26^oC.If the cultivation is carried out on a small scale, then a shake culture, which is fermented for several days at 20-26 ^o C., is usually preferred.

Для начала ферментативного культивирования предпочтительно применять методику с использованием начального инокулюма, приготавливаемого в одну или две стадии, например, в колбе Эрленмейера. Для культуральной среды можно использовать комбинацию источника углерода и источника азота. Колбу с посевом встряхивают в термостатируемом инкубаторе при 23^oC в течение 1-3 дней или же до тех пор, пока не будет наблюдаться ощутимый рост. Полученную посевную культуру можно далее использовать для инокулирования второй посевной культуры или продуцирующей культуры. Если проводят повторный высев, его можно осуществлять обычным способом, а часть использовать для инокуляции производящей среды, колба, в которую помещается посевной материал, встряхивается в течение подходящего периода времени, например, 1-3 дней, или же до тех пор, пока не будет получена максимальная производительность, при подходящей температуре, например, как описано выше. После окончания инкубационного периода содержимое колбы может быть собрано центрифугированием или фильтрованием.To start the enzymatic cultivation, it is preferable to apply the method using the initial inoculum prepared in one or two stages, for example, in an Erlenmeyer flask. For the culture medium, a combination of a carbon source and a nitrogen source can be used. The flask with inoculation is shaken in a thermostatic incubator at 23 ^o C for 1-3 days or until there is a noticeable growth. The resulting seed culture can be further used to inoculate a second seed culture or production culture. If repeated seeding is carried out, it can be carried out in the usual way, and part can be used to inoculate the production medium, the flask in which the seed is placed is shaken for a suitable period of time, for example, 1-3 days, or until maximum productivity obtained at a suitable temperature, for example, as described above. After the incubation period, the contents of the flask can be collected by centrifugation or filtration.

Если выращивание проводят в больших масштабах, то может быть предпочтительной культура в подходящем ферментере с аэрированием -перемешиванием. В этом случае питательную среду можно приготовить прямо в ферментере. После стерилизации при 125^oC среду охлаждают и высевают инокулят, предварительно приготовленный в стерилизованной среде. Выращивание проводят при перемешивании и аэрации при 20-26^oC. Данная процедура является подходящей для получения соединения в больших количествах.If the cultivation is carried out on a large scale, it may be preferable to culture in a suitable fermenter with aeration-mixing. In this case, the nutrient medium can be prepared directly in the fermenter. After sterilization at 125 ^° C., the medium is cooled and the inoculum previously prepared in a sterilized medium is seeded. Cultivation is carried out with stirring and aeration at 20-26 ^o C. This procedure is suitable for obtaining compounds in large quantities.

Количество тиомаринола B, продуцируемого культурой, можно время от времени контролировать с помощью, например, жидкостной хроматографии высокого разрешения. Обычно количество произведенного тиомаринола B достигает максимума после периода времени 19-200 ч. The amount of thiomarinol B produced by the culture can be controlled from time to time by, for example, high-performance liquid chromatography. Typically, the amount of thiomarinol B produced reaches a maximum after a period of 19-200 hours.

После подходящего времени выращивания тиомаринол B можно выделить и очистить любыми известными способами. Например, любое количество тиомаринола B, оставшееся в бульоне с культурой, можно выделить, отфильтровывая твердые вещества, например используя в качестве материала для фильтрования диатомитовую землю, или центрифугированием с последующей экстракцией надосадочной жидкости и очисткой в соответствии с физико-химическими свойствами тиомаринола B. Например, тиомаринол B, находящийся в фильтрате или в остатке после центрифугирования, можно экстрагировать не смешиваемыми с водой органическими растворителями, такими как этилацетат, хлороформ, хлористый этилен, хлористый метилен или смесь указанных растворителей в нейтральных или кислых условиях, а затем очистить. After a suitable growing time, thiomarinol B can be isolated and purified by any known means. For example, any amount of thiomarinol B remaining in the culture broth can be isolated by filtering off solids, for example using diatomaceous earth as a filter material, or by centrifugation followed by extraction of the supernatant and purification in accordance with the physicochemical properties of thiomarinol B. For example , thiomarinol B, which is present in the filtrate or in the residue after centrifugation, can be extracted with water-immiscible organic solvents such as ethyl acetate, chlorofor m, ethylene chloride, methylene chloride or a mixture of these solvents under neutral or acidic conditions, and then clean.

Альтернативно в качестве адсорбента можно использовать активированный уголь или адсорбирующую смолу, такую как Amberlit (торговый знак) XAD-2, XAD-4 (фирма Rohm Haas) или Diaion (торговый знак) HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50 (фирма Mitsubishi Kasei Corporation). Примеси можно удалить после адсорбции, пропуская жидкость, содержащую тиомаринол B, через тонкий слой адсорбента; тиомаринол B можно также очистить после адсорбции элюированием подходящим растворителем, например, водным метанолом, водным ацетоном или смесью бутанол/вода. Alternatively, activated carbon or an adsorption resin such as Amberlit (trademark) XAD-2, XAD-4 (Rohm Haas) or Diaion (trademark) HP-10, HP-20, CHP-20, HP can be used as adsorbent. -50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Impurities can be removed after adsorption by passing a liquid containing thiomarinol B through a thin layer of adsorbent; thiomarinol B can also be purified after adsorption by elution with a suitable solvent, for example, aqueous methanol, aqueous acetone or a mixture of butanol / water.

Внутриклеточный тиомаринол B может быть очищен экстракцией подходящим растворителем, например, водным ацетоном или водным метанолом, который предпочтительно имеет концентрацию 50-90 об. и удалением органического растворителя с последующей экстракцией, как это описано ранее для фильтрата или надосадочной жидкости. Intracellular thiomarinol B can be purified by extraction with a suitable solvent, for example, aqueous acetone or aqueous methanol, which preferably has a concentration of 50-90 vol. and removing the organic solvent, followed by extraction, as described previously for the filtrate or supernatant.

Получающийся тиомаринол B может быть дополнительно очищен с помощью хорошо известных методов, а именно:
адсорбционной колоночной хроматографией, используя такие носители, как силикагель или магний-силикагель, например, поставляемый в продажу под торговым названием "флорисил";
распределительной колоночной хроматографией, используя такие адсорбенты, как Sephadex LH-20 (торговое название продукта фирмы Pharmacia);
жидкостной хроматографией высокого разрешения с использованием колонок с нормальной или обращенной фазой. Как хорошо известно из области техники, эти способы выделения и очистки можно осуществлять отдельно или в любом удобном сочетании, а, если необходимо, и многократно с целью выделить и очистить целевой продукт.The resulting thiomarinol B can be further purified using well-known methods, namely:
adsorption column chromatography using carriers such as silica gel or magnesium silica gel, for example, marketed under the trade name "Florisil";
distribution column chromatography using adsorbents such as Sephadex LH-20 (trade name for the product from Pharmacia);
high performance liquid chromatography using normal or reverse phase columns. As is well known in the art, these methods of isolation and purification can be carried out separately or in any convenient combination, and, if necessary, and repeatedly in order to isolate and purify the target product.

Тиомаринол B можно получить также окислением тиомаринола, причем этот способ является предпочтительным, поскольку при ферментации тиомаринол B образуется лишь в небольших количествах. Thiomarinol B can also be obtained by oxidation of thiomarinol, and this method is preferred since only small amounts of thiomarinol B are formed during fermentation.

Окисление предпочтительно проводят, позволяя окислителю воздействовать на тиомаринол в присутствии растворителя и в присутствии или отсутствии основания. The oxidation is preferably carried out by allowing the oxidizing agent to act on thiomarinol in the presence of a solvent and in the presence or absence of a base.

Природа используемого окислительного агента не имеет большого значения для способа по изобретению, и с одинаковым успехом в данном случае может быть применен любой обычно используемый окислительный агент. Примерами таких окислительных агентов являются: перманганат калия; хроматы, такие как дихромат калия (бихромат калия), дихромат натрия (бихромат натрия), оксид хрома (YI), хлористый хромил и трет-бутилхромат; тетраоксид рутения; галогены, такие как хлор, бром и иод; озон; кислород; перекись водорода; органические перекиси, такие как бис(триметилсилил)пероксид, гидроперекись кумола и гидроперекись трет-бутила; диоксираны, такие как диоксиран, метилдиоксиран, диметилдиоксиран, диэтилдиоксиран, этилметилдиоксиран, метилпропилдиоксиран, бутилметилдиоксиран, фтордиоксиран, метилфтордиоксиран, дифтордиоксиран, бис(трифторметил)диоксиран, метилтрифторметилдиоксиран и трифторметилхлордифторметилдиоксиран; органические надкислоты и их соли, такие как надуксусная кислота, надмуравьиная кислота, м-хлорнадбензойная кислота; и пероксисерные кислоты и их соли, такие как пероксимоносерная кислота, пероксидисульфат калия и пероксимоносульфат калия (особенно выпускаемые фирмой Aldrich Chemical Co. под торговым названием "оксон"). Предпочтительные примеры окислительных агентов включают перекись водорода, органические надкислоты и их соли, органические перекиси, диоксираны или пероксисерные кислоты и их соли, а наиболее предпочтительными примерами являются перекись водорода, диметилдиоксиран и пероксисерные кислоты и их соли. The nature of the oxidizing agent used is not very significant for the process of the invention, and with the same success, any commonly used oxidizing agent can be used in this case. Examples of such oxidizing agents are: potassium permanganate; chromates such as potassium dichromate (potassium dichromate), sodium dichromate (sodium dichromate), chromium oxide (YI), chromyl chloride and tert-butyl chromate; ruthenium tetroxide; halogens such as chlorine, bromine and iodine; ozone; oxygen; hydrogen peroxide; organic peroxides such as bis (trimethylsilyl) peroxide, cumene hydroperoxide and tert-butyl hydroperoxide; dioxiranes such as dioxirane, methyldioxirane, dimethyldioxirane, diethyl dioxirane, ethylmethyldioxirane, methylpropyldioxyran, butylmethyldioxirane, fluorodioxirane, methylfluorodioxyran, difluorodioxirane, bis (trifluoromethyl) dioxirane, methyl trifluoromethyldimethyldioxi tri di; organic peracids and their salts, such as peracetic acid, formic acid, m-chloroperbenzoic acid; and peroxysulfuric acids and their salts, such as peroxymonosulfuric acid, potassium peroxydisulfate and potassium peroxymonosulfate (especially those sold by the company Aldrich Chemical Co. under the trade name "Oxon"). Preferred examples of oxidizing agents include hydrogen peroxide, organic peroxides and their salts, organic peroxides, dioxiranes or peroxysulfuric acids and their salts, and most preferred examples are hydrogen peroxide, dimethyldioxirane and peroxysulfuric acids and their salts.

Аналогично не существует никаких особых ограничений относительно природы используемых в этой реакции оснований за исключением того, что они не должны оказывать вредного воздействия на ход реакции и на участвующие в ней реагенты. Предпочтительными примерами таких оснований являются: неорганические соли, например карбонаты щелочных металлов (такие как карбонат натрия, карбонат калия или карбонат лития), кислые карбонаты щелочных металлов (такие как бикарбонат натрия, бикарбонат калия и бикарбонат лития), гидриды щелочных металлов (такие как гидрид лития, гидрид натрия или гидрид калия), гидроокиси щелочных металлов (такие как гидроокись натрия, гидроокись калия, гидроокись бария или гидроокись лития) и фториды щелочных металлов (такие как фторид натрия, фторид калия или фторид цезия); органические соли, например алкоксиды щелочных металлов (такие как метоксид натрия, этоксид натрия, трет-бутоксид калия или метоксид лития), алкилсульфиды щелочных металлов (такие как метилсульфид натрия или этилсульфид натрия); и соединения азота (такие как триэтиламин, трибутиламин, ди-изо-пропилэтиламин, N-метилморфолин, пиридин, 4- (N,N-диметиламино) пиридин, N,N-диметиланилин, N,N-диэтиланилин, 1,5-диаэабицило[4,3,0] нон-5-eн(DBN), 1,4-диазабицило[2,2,2]октан (DABCO) и 1,8-диазабицило[5,4,0]ундец-7-ен (DBU). Наиболее предпочтительными являются карбонаты щелочных металлов и кислые карбонаты щелочных металлов. Similarly, there are no particular restrictions on the nature of the bases used in this reaction, except that they should not adversely affect the course of the reaction and the reagents involved. Preferred examples of such bases are inorganic salts, for example, alkali metal carbonates (such as sodium carbonate, potassium carbonate or lithium carbonate), acidic alkali metal carbonates (such as sodium bicarbonate, potassium bicarbonate and lithium bicarbonate), alkali metal hydrides (such as hydride lithium, sodium hydride or potassium hydride), alkali metal hydroxides (such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, barium hydroxide or lithium hydroxide) and alkali metal fluorides (such as sodium fluoride, potassium fluoride I or cesium fluoride); organic salts, for example alkali metal alkoxides (such as sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide or lithium methoxide), alkali metal alkyl sulfides (such as sodium methyl sulfide or sodium ethyl sulfide); and nitrogen compounds (such as triethylamine, tributylamine, di-iso-propylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 4- (N, N-dimethylamino) pyridine, N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, 1,5-diaaabicylo [4.3.0] non-5-en (DBN), 1,4-diazabicylo [2.2.2] octane (DABCO) and 1,8-diazabicylo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) Most preferred are alkali metal carbonates and acidic alkali metal carbonates.

Реакцию обычно и предпочтительно проводят в присутствии растворителя, природа которого большой роли не играет, за исключением того, что он не должен оказывать вредного воздействия на ход реакции, но должен растворять реагенты по крайней мере до некоторой степени. Примерами приемлемых растворителей являются: вода; спирты, такие как метанол, этанол или пропанол; кетоны, такие как ацетон или метилэтилкетон; органические кислоты, такие как уксусная кислота или муравьиная кислота; сложные эфиры, такие как этилацетат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран; амиды, такие как диметилформамид или диметилацетамид; а также смеси любых двух или большего количества указанных растворителей. Предпочтительными являются спирты и смеси воды с кетонами, причем наиболее предпочтительной является смесь воды и ацетона. The reaction is usually and preferably carried out in the presence of a solvent, the nature of which does not play a big role, except that it should not have a harmful effect on the course of the reaction, but should dissolve the reagents at least to some extent. Examples of suitable solvents are: water; alcohols such as methanol, ethanol or propanol; ketones such as acetone or methyl ethyl ketone; organic acids such as acetic acid or formic acid; esters such as ethyl acetate; ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran; amides, such as dimethylformamide or dimethylacetamide; as well as mixtures of any two or more of these solvents. Alcohols and mixtures of water with ketones are preferred, with a mixture of water and acetone being most preferred.

Для того, чтобы ускорить реакцию, ее можно проводить в присутствии неорганического катализатора, такого как оксид платины или окись ванадия, хотя реакция протекает и без катализатора. In order to accelerate the reaction, it can be carried out in the presence of an inorganic catalyst, such as platinum oxide or vanadium oxide, although the reaction proceeds without a catalyst.

Реакцию можно осуществлять в широком интервале температур, и выбранное конкретное значение температуры не играет большой роли для данного изобретения. Установили, что в общем случае реакцию удобно проводить в интервале температур от -78^oC до 100^oC, наиболее предпочтительно от -10^oC до комнатной температуры. Время, необходимое для завершения реакции, также может варьироваться в зависимости от множества факторов, в том числе от температуры процесса и природы реагентов, в частности от используемых окислительного агента и основания. Однако в большинстве случаев достаточен период времени от 15 мин до 30 ч, а более предпочтительно от 15 мин до 2 ч.The reaction can be carried out in a wide temperature range, and the selected specific temperature value does not play a big role for this invention. It was found that in the General case, the reaction is conveniently carried out in the temperature range from -78 ^o C to 100 ^o C, most preferably from -10 ^o C to room temperature. The time required to complete the reaction may also vary depending on many factors, including the process temperature and the nature of the reagents, in particular the oxidizing agent and base used. However, in most cases, a period of from 15 minutes to 30 hours is sufficient, and more preferably from 15 minutes to 2 hours.

По завершении реакции целевое соединение можно выделить из реакционной смеси обычными способами. Например, удобная методика выделения включает следующие операции: выливают смесь в воду; экстрагируют водную фазу не смешиваемым с водой растворителем, таким как ароматический углеводород (например, бензол), простым эфиром (например, диэтиловым эфиром), сложным эфиром органической кислоты (например, этилацетатом) или галоидированным углеводородом (например, хлористым метиленом); и удалением растворителя из экстракта. Полученное таким способом целевое соединение в случае необходимости подвергают дополнительной очистке обычными способами, например, с использованием различных хроматографических методов или препаративной тонкослойной хроматографией. Upon completion of the reaction, the target compound can be isolated from the reaction mixture by conventional means. For example, a convenient isolation procedure includes the following operations: pour the mixture into water; extracting the aqueous phase with a water-immiscible solvent such as an aromatic hydrocarbon (e.g. benzene), ether (e.g. diethyl ether), an organic acid ester (e.g. ethyl acetate) or a halogenated hydrocarbon (e.g. methylene chloride); and removing the solvent from the extract. The target compound obtained in this way, if necessary, is subjected to further purification by conventional methods, for example, using various chromatographic methods or preparative thin layer chromatography.

Тиомаринол, который является исходным соединением в этой реакции окисления, можно получить ферментацией микроорганизмов вида Alteromonas, в частности штамма Alteromonas rava SANK 73390, описанного ранее относительно получения тиомаринола B. Thiomarinol, which is the starting compound in this oxidation reaction, can be obtained by fermenting microorganisms of the Alteromonas species, in particular the Alteromonas rava SANK 73390 strain, previously described with respect to the preparation of thiomarinol B.

Поскольку тиомаринол B обладает антибактериальным воздействием на грампозитивные и грамнегативные бактерии и микоплазмы в животных организмах (в частности человека, собаки, кошки и кролика), их можно самыми разнообразными способами, в зависимости от природы инфекции, использовать для лечения или профилактики бактериальных или микоплазменных инфекций. Since thiomarinol B has an antibacterial effect on gram-positive and gram-negative bacteria and mycoplasmas in animal organisms (in particular humans, dogs, cats and rabbits), they can be used in a variety of ways, depending on the nature of the infection, to treat or prevent bacterial or mycoplasma infections.

Когда соединения изобретения предполагается использовать в терапевтических целях, их можно назначать самостоятельно или в виде фармацевтической препаративной формы, содержащей помимо активного соединения один или два стандартных разбавителя, носителя, инертных наполнителя или вспомогательных соединений. Характер готовой препаративной формы конечно зависит от способа приема лекарства. Для орального назначения соединение предпочтительно формируется в виде порошков, гранул, таблеток, капсул или сиропов. Для парентерального назначения оно предпочтительно составляется в виде инъекций (которые могут быть внутривенными, внутримышечными или подкожными), капель, свечей, мазей или линиментов. When the compounds of the invention are intended to be used for therapeutic purposes, they can be administered alone or in the form of a pharmaceutical formulation containing, in addition to the active compound, one or two standard diluents, carriers, excipients or excipients. The nature of the finished formulation of course depends on the method of taking the medicine. For oral administration, the compound is preferably formed in the form of powders, granules, tablets, capsules or syrups. For parenteral administration, it is preferably formulated as injections (which may be intravenous, intramuscular or subcutaneous), drops, suppositories, ointments or liniment.

Данные готовые формы могут быть приготовлены известными способами, добавлением к активному соединению таких добавок, как носители, связующие, разрыхлители, смазки, стабилизаторы, модификаторы, солюбилизирующие агенты, ароматизирующие вещества, отдушки, суспендирующие агенты или агенты для покрытия. Хотя доза может зависеть от симптомов заболевания и возраста пациента, природы и степени тяжести инфекции, а также от способа назначения лекарств, в случае орального назначения взрослому больному, соединения по изобретению могут обычно приниматься в виде дневной дозы от 20 до 2000 мг. Соединения можно принимать в виде одной дозы или в виде раздельных доз, например, два или три раза в день. These formulations can be prepared by known methods by adding additives such as carriers, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, modifiers, solubilizing agents, flavoring agents, perfumes, suspending agents or coating agents to the active compound. Although the dose may depend on the symptoms of the disease and the age of the patient, the nature and severity of the infection, and the method of prescribing the drugs, in the case of oral administration to an adult patient, the compounds of the invention can usually be taken as a daily dose of 20 to 2000 mg Compounds can be taken in a single dose or in divided doses, for example, two or three times a day.

Получение соединений по изобретению далее поясняется следующими примерами, которые не ограничивают изобретение, а биологическая активность этих соединений иллюстрируется далее в примерах испытаний. В примере 6 приведен метод получения тиомаринола, который используется в качестве исходного соединения в окислительном способе получения тиомаринола B. The preparation of the compounds of the invention is further illustrated by the following examples, which do not limit the invention, and the biological activity of these compounds is illustrated further in the test examples. Example 6 shows a method for producing thiomarinol, which is used as a starting compound in the oxidative method for the preparation of thiomarinol B.

Пример 1. Получение тиомаринола B выращиванием в тенке. Example 1. Obtaining thiomarinol B by growing in tenka.

А) Культура. A) Culture.

Alteromonas rava штамм SANK 73390 выращивают в течение 3 дней при 22^oC на скошенном морском агаре (продукт компании Difco). Полученную культуру суспендируют в 3 мл стерилизованной искусственной морской волы. По 0,1 мл полученной суспензии инокулируют в каждую из двух колб Эрленмейера емкостью 500 мл каждая, содержащих по 100 мл стерилизованной среды, имеющей следующий состав:
Морской бульон (Difco) 37,4 г
Деионизованная вода 1000 мл
pH Не устанавливается.Alteromonas rava strain SANK 73390 was grown for 3 days at 22 ^° C on mown sea agar (Difco product). The resulting culture is suspended in 3 ml of sterilized artificial sea ox. 0.1 ml of the resulting suspension is inoculated into each of two Erlenmeyer flasks with a capacity of 500 ml each, containing 100 ml of sterilized medium having the following composition:
Sea broth (Difco) 37.4 g
Deionized Water 1000 ml
pH Not set.

Культуру затем инкубируют в течение 24 ч при 23^oC при встряхивании со скоростью 210 об/мин, используя ротационную качалку. Всю полученную культуру затем инокулируют в 600-литровый аэрируемый тенк, снабженный мешалкой и содержащий 200 л среды, имеющей тот же состав, что и приведенный выше, которая была простерилизована отдельно. Смесь затем культивируют в течение 26 ч при 23^oC, при этом аэрирование культуры проводят воздухом со скоростью 0,5 об/об. мин (то есть "объем на объем в минуту": 1 об/об.мин означает, что количество воздуха, подаваемого за 1 мин, равняется объему воздуха в тенке), и устанавливают скорость вращения в интервале 82,5-170 об/мин так, чтобы поддерживать концентрацию растворенного кислорода на уровне 5,0 промилей.The culture is then incubated for 24 hours at 23 ^° C. with shaking at a speed of 210 rpm using a rotary shaker. The whole culture was then inoculated into a 600-liter aerated pan equipped with a stirrer and containing 200 L of medium having the same composition as above, which was sterilized separately. The mixture was then cultured for 26 hours at 23 ^° C., while the aeration of the culture was carried out with air at a speed of 0.5 v / v. min (that is, "volume per volume per minute": 1 rpm.min. means that the amount of air supplied in 1 min is equal to the volume of air in the tenk), and the rotation speed is set in the range 82.5-170 rpm so as to maintain a dissolved oxygen concentration of 5.0 ppm.

В) Выделение. C) Isolation.

К 230 л полученного раствора с культурой добавляют достаточное количество раствора соляной кислоты с тем, чтобы довести pH до 2,5. Затем добавляют 200 л ацетона и экстрагируют смесь при перемешивании в течение 0,5 ч. К смеси далее добавляют 4,0 кг целита 545 (торговое название продукта фирмы Johnes Manvill Project Corporation, США) в качестве фильтровального средства и смесь фильтруют. Фильтрат (430 л) экстрагируют один раз 200 л этилацетата, а затем дважды 100 л этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты промывают 200 л 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия, а затем 100 л насыщенного водного раствора хлористого натрия, после чего их сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха в вакууме, получая приблизительно 80 г масла. A sufficient amount of hydrochloric acid solution is added to 230 L of the resulting culture solution in order to bring the pH to 2.5. Then, 200 L of acetone was added and the mixture was extracted with stirring for 0.5 h. 4.0 kg of Celite 545 (trade name of the product from Johnes Manvill Project Corporation, USA) was added to the mixture as a filter medium, and the mixture was filtered. The filtrate (430 L) was extracted once with 200 L of ethyl acetate, and then twice with 100 L of ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts were washed with 200 L of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate and then with 100 L of a saturated aqueous solution of sodium chloride, after which they were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo to obtain approximately 80 g of an oil.

Все полученное на предыдущей стадии масло растворяют в хлористом метилене, и раствор помещают в колонку, содержащую 1,1 кг силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Раствор затем элюируют смесью хлористого метилена и этилацетата (1:1), затем одним этилацетатом и, наконец смесью этилацетата и метанола (9: 1), (полярность растворителя возрастает в указанном порядке). После того, как элюат фракционируют на порции по 500 мл каждая, собирают фракцию, содержащую тиомаринол B, который элюируют смесью этилацетата и метанола, и упаривают досуха при пониженном давлении, получая 60 г масла. All the oil obtained in the previous step is dissolved in methylene chloride, and the solution is placed in a column containing 1.1 kg of silica gel saturated with methylene chloride. The solution is then eluted with a mixture of methylene chloride and ethyl acetate (1: 1), then with ethyl acetate alone and finally with a mixture of ethyl acetate and methanol (9: 1) (the polarity of the solvent increases in this order). After the eluate was fractionated into 500 ml portions each, a fraction containing thiomarinol B, which was eluted with a mixture of ethyl acetate and methanol, was collected and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain 60 g of an oil.

Все полученное масло растворяют в 6 л 50%-ного водного раствора метанола, и полученный раствор помещают в колонку емкостью 2,3 л, наполненную носителем Diaion HP-20 (торговое название), насыщенным водой, после чего раствор масла подвергают градиентному элюированию водным раствором метанола, концентрацию которого увеличивают от 30 до 90 об. Более конкретно, после того как на колонку наносят по 4 л каждого из водного раствора, содержащего 30% метанола, 50% метанола, 60% метанола, 70% метанола, 80% метанола, колонку элюируют 90% -ным водным раствором метанола. Элюирование продолжают до тех пор, пока элюирование целевого соединения не будет больше наблюдаться, что контролируют с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения, при этом общее количество использованного при элюировании 90%-ного раствора метанола составляет 10 л. Фракцию, элюированную 90%-ным метанолом, собирают и упаривают досуха при пониженном давлении, получая 3,8 г порошка желтого цвета. Порошок подвергают хроматографии на колонке с 320 г носителя Sephadex LH-20, насыщенного смесью хлористого метилена, этилацетата и метанола (19: 19:2 по объему), элюируя смесью того же состава, для очистки. All the resulting oil was dissolved in 6 L of a 50% aqueous methanol solution, and the resulting solution was placed in a 2.3 L column filled with Diaion HP-20 support (trade name) saturated with water, after which the oil solution was subjected to gradient elution with an aqueous solution methanol, the concentration of which is increased from 30 to 90 vol. More specifically, after 4 L of each of an aqueous solution containing 30% methanol, 50% methanol, 60% methanol, 70% methanol, 80% methanol is applied to the column, the column is eluted with a 90% aqueous methanol solution. Elution is continued until the elution of the target compound is no longer observed, which is controlled by high-performance liquid chromatography, while the total amount of 90% methanol used in the elution is 10 l. The fraction eluted with 90% methanol was collected and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain 3.8 g of a yellow powder. The powder was subjected to column chromatography with 320 g of a Sephadex LH-20 support saturated with a mixture of methylene chloride, ethyl acetate and methanol (19: 19: 2 by volume), eluting with a mixture of the same composition for purification.

Полученный продукт далее очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения, используя колонку с обращенной фазой [Senshu-Pak ODS H-5251 (Размер колонки: диаметр 20 мм, длина 250 мм), торговая марка продукции фирмы Senshu Scientilic Co. Ltd. и 40 об. раствор ацетонитрила в воде в качестве элюента при скорости потока 15 мл/мин; контроль метода очистки осуществляют по поглощению при 220 нм. Поскольку тиомаринол B выходит в виде пика с временем удерживания 13-14 мин, эту фракцию собирают и упаривают досуха при пониженном давлении, выделяя 130 мг целевого соединения, которое имеет физико-химические свойства, приведенные выше. The resulting product was further purified by high-resolution liquid chromatography using a reverse phase column [Senshu-Pak ODS H-5251 (Column size: diameter 20 mm, length 250 mm), a trademark of Senshu Scientilic Co. Ltd. and 40 vol. a solution of acetonitrile in water as an eluent at a flow rate of 15 ml / min; the control of the cleaning method is carried out by absorption at 220 nm. Since thiomarinol B emerges as a peak with a retention time of 13-14 minutes, this fraction is collected and evaporated to dryness under reduced pressure, isolating 130 mg of the target compound, which has the physicochemical properties described above.

Пример 2. Получение тиомаринола B окислением тиомаринола. Example 2. Obtaining thiomarinol B by oxidation of thiomarinol.

100,9 мг тиомаринола (получают как описано в примере 5) растворяют в смеси 5 мл ацетона и 5 мл воды и охлаждают полученный раствор в ванне со льдом. Добавляют 112,2 мг оксона (торговое название продукта фирмы Aldrich Chemical Co. Inc.) и смесь перемешивают при охлаждении в ванне со льдом в течение 40 мин. По окончании указанного срока добавляют 1,2 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и смесь вновь перемешивают при охлаждении в ванне со льдом в течение 30 мин, добавляют 5 мл воды и экстрагируют смесью хлористого метилена и тетрагидрофурана 10: 1. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель затем удаляют с помощью перегонки при пониженном давлении. Остаток отделяют и очищают жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (используя колонку Senshu Pak ODS-5251-N и 40 об. водный раствор ацетонитрила в качестве элюента), получая 79,5 мг (выход 75%) тиомаринола B светло-желтого цвета, который имеет физико-химические параметры, приведенные выше. 100.9 mg of thiomarinol (prepared as described in Example 5) was dissolved in a mixture of 5 ml of acetone and 5 ml of water, and the resulting solution was cooled in an ice bath. 112.2 mg of oxone (trade name of a product from Aldrich Chemical Co. Inc.) was added and the mixture was stirred while cooling in an ice bath for 40 minutes. At the end of the indicated period, 1.2 ml of a saturated aqueous sodium bicarbonate solution are added, and the mixture is again stirred under cooling in an ice bath for 30 minutes, 5 ml of water are added and extracted with a mixture of methylene chloride and tetrahydrofuran 10: 1. The extract is dried over anhydrous sulfate sodium and the solvent are then removed by distillation under reduced pressure. The residue was separated and purified by reverse phase high-resolution liquid chromatography (using a Senshu Pak ODS-5251-N column and a 40 vol. Acetonitrile aqueous solution as eluent) to obtain 79.5 mg (75% yield) of light yellow thiomarinol B, which has the physico-chemical parameters given above.

Пример 3. Получение тиомаринола B окислением тиомаринола. Example 3. Obtaining thiomarinol B by the oxidation of thiomarinol.

100 мг тиомаринола (получают, как описано в примере 5) растворяют в смеси 15 мл ацетона и 7,5 мл воды, а затем добавляют 0,074 мл 35%-ного водного раствора перекиси водорода и 2 капли разбавленного водного раствора бикарбоната натрия. Полученную смесь перемешивают 5 мин и удаляют ацетон перегонкой при пониженном давлении. К остатку добавляют ацетонитрил, образование тиомаринола B подтверждается жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (с использованием колонки Senshu Pak ODS-H-5251 и 40 об. водного раствора ацетонитрила в качестве элюента). Растворитель удаляют перегонкой при пониженном давлении, остаток растворяют в 40%-ном водном ацетонитриле. Затем его отделяют и очищают жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (используя колонку Senshu Pak ODS-5251-N и 40 об. водный раствор ацетонитрила в качестве элюента), получая 43,2 мг (выход 41% ) тиомаринола B светло-желтого цвета, который имеет физико-химические параметры, приведенные выше. 100 mg of thiomarinol (prepared as described in Example 5) is dissolved in a mixture of 15 ml of acetone and 7.5 ml of water, and then 0.074 ml of a 35% aqueous solution of hydrogen peroxide and 2 drops of diluted aqueous sodium bicarbonate are added. The resulting mixture was stirred for 5 minutes and acetone was removed by distillation under reduced pressure. Acetonitrile was added to the residue, the formation of thiomarinol B was confirmed by reverse phase high-resolution liquid chromatography (using a Senshu Pak ODS-H-5251 column and 40 vol. Acetonitrile aqueous solution as eluent). The solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was dissolved in 40% aqueous acetonitrile. It is then separated and purified by reverse phase high-resolution liquid chromatography (using a Senshu Pak ODS-5251-N column and 40 vol. Acetonitrile aqueous solution as eluent) to give 43.2 mg (41% yield) of light yellow thiomarinol B , which has the physico-chemical parameters given above.

Пример 4. Получение тиомаринола B окислением тиомаринола. Example 4. Obtaining thiomarinol B by oxidation of thiomarinol.

100 г тиомаринола (полученного как описано в примере 5) растворяют в 40 мл ацетона и затем при охлаждении в ванне со льдом и при перемешивании добавляют к полученному раствору 134 мг м-хлорнадбензойной кислоты. Смесь далее перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч, экстрагируют хлористым метиленом и промывают три раза водой и затем один раз насыщенным водным раствором сульфата натрия. Экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель затем удаляют перегонкой при пониженном давлении. Остаток отделяют и очищают жидкостной хроматографией высокого разрешения с обращенной фазой (используя колонку Senshu Pak ODS-5251-N и 40 об. водный раствор ацетонитрила в качестве элюента), получая 8,5 мг (выход 8%) тиомаринола B светло-желтого цвета, который имеет физико-химические параметры, приведенные выше. 100 g of thiomarinol (obtained as described in Example 5) is dissolved in 40 ml of acetone and then, while cooling in an ice bath and with stirring, 134 mg of m-chloroperbenzoic acid are added to the resulting solution. The mixture was further stirred at room temperature for 1.5 hours, extracted with methylene chloride and washed three times with water and then once with a saturated aqueous solution of sodium sulfate. The extract was dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was then removed by distillation under reduced pressure. The residue was separated and purified by reverse phase high-resolution liquid chromatography (using a Senshu Pak ODS-5251-N column and a 40 vol. Acetonitrile aqueous solution as eluent) to give 8.5 mg (8% yield) of light yellow thiomarinol B, which has the physico-chemical parameters given above.

Пример 5. Ферментация тиомаринола в сосуде. Example 5. Fermentation of thiomarinol in a vessel.

А) Культура. A) Culture.

Штамм Alteromonas rava SANK 73390 выращивают в течение 3 дней при 22^oC на скошенном морском агаре (продукт компании Difco). Полученную культуру суспендируют в 3 мл искусственной морской воды. По 0,1 мл полученной суспензии вносят асептически в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл стерилизованной среды [37,4 г морского бульона (продукт компании Difco) в 1 л деионизованной воды, pH не устанавливается]
Колбу затем инкубируют в течение 24 ч при 23^oC при встряхивании со скоростью 200 об/мин (радиус вращения 70 мм), используя ротационную качалку. По прошествии указанного времени в каждый из четырех ферментеров кувшинного типа емкостью 30 л, содержащих по 15 л стерильной среды, описанной выше, инокулируют 15 мл культуры, взятой асептически из колбы Эрленмейера. Ферментеры инкубируют в течение 23 ч при 23^oC и перемешивают со скоростью 100 об/мин, скорость аэрирования составляет 7,5 л/мин.The strain Alteromonas rava SANK 73390 was grown for 3 days at 22 ^° C on mown sea agar (Difco product). The resulting culture is suspended in 3 ml of artificial sea water. 0.1 ml of the resulting suspension is aseptically added to a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of sterilized medium [37.4 g of sea broth (product of Difco) in 1 l of deionized water, pH is not established]
The flask is then incubated for 24 hours at 23 ^° C. with shaking at a speed of 200 rpm (rotation radius 70 mm) using a rotary shaker. After this time, 15 ml of culture taken aseptically from an Erlenmeyer flask are inoculated into each of the four jug-type fermenters with a capacity of 30 L, each containing 15 L of the sterile medium described above. The fermenters are incubated for 23 hours at 23 ^° C. and stirred at a speed of 100 rpm; the aeration rate is 7.5 l / min.

В) Выделение. C) Isolation.

Через 23 ч содержимое ферментеров объединяют, получая 60 л жидкости с культурой. Доводят pH жидкости до 3 с помощью соляной кислоты, а затем добавляют 60 л ацетона и смесь экстрагируют при перемешивании в течение 30 мин. Раствор фильтруют, используя 1,2 кг целита 545 (торговая марка продукции фирмы Johns Manville Co.) в качестве фильтровального средства. 110 л полученного фильтрата экстрагируют затем один раз 60 л этилацетата, а затем дважды по 30 л этилацетата. Экстракты в этилацетате объединяют, промывают 30 л 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия, а затем 30 л насыщенного водного раствора хлористого натрия, после чего их сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха в вакууме, получая 14 г маслянистого вещества. After 23 hours, the contents of the fermenters are combined to give 60 L of culture fluid. The pH of the liquid was adjusted to 3 with hydrochloric acid, and then 60 L of acetone was added and the mixture was extracted with stirring for 30 minutes. The solution was filtered using 1.2 kg of Celite 545 (a trademark of Johns Manville Co.) as a filter aid. 110 L of the obtained filtrate is then extracted once with 60 L of ethyl acetate, and then twice with 30 L of ethyl acetate. The extracts in ethyl acetate are combined, washed with 30 l of a 5% aqueous solution of sodium bicarbonate, and then with 30 l of a saturated aqueous solution of sodium chloride, after which they are dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo to obtain 14 g of an oily substance.

Все полученное на предыдущей стадии маслянистое вещество растворяют в хлористом метилене и раствор помещают в колонку, содержащую 200 г силикагеля, насыщенного хлористым метиленом. Элюируют раствор сначала смесью хлористого метилена и этилацетата (1:1), затем одним этилацетатом и, наконец, смесью этилацетата и метанола (9:1), полярность растворителя возрастает в указанном порядке. Элюент собирают в виде фракций по 18 мл и фракции, элюированные смесью этилацетата и метанола, которые содержат тиомаринол, сохраняют. All the oily substance obtained in the previous step is dissolved in methylene chloride and the solution is placed in a column containing 200 g of silica gel saturated with methylene chloride. The solution is eluted first with a mixture of methylene chloride and ethyl acetate (1: 1), then with ethyl acetate alone and finally with a mixture of ethyl acetate and methanol (9: 1), the polarity of the solvent increases in this order. The eluent was collected as 18 ml fractions and fractions eluted with a mixture of ethyl acetate and methanol, which contained thiomarinol, were retained.

Отделенные фракции упаривают в вакууме, получая 7 г маслянистого вещества, которое растворяют в 400 мл 50%-ного водного раствора метанола, и полученный раствор помещают в колонку емкостью 600 мл, наполненную носителем Diaion HP-20 (торговая марка продукции фирмы Mitsubishi Chem. Ind.), насыщенным водой. Колонку промывают 50%-ным водным раствором метанола и целевой продукт элюируют 90%-ным водным раствором метанола. С помощью упаривания при пониженном давлении из фракции получают 1 г порошка желтого цвета. Желтый порошок дополнительно элюируют на хроматографической колонке с Sephadex LH-20 смесью хлористого метилена, этилацетата и метанола (19:19:2). Из активных фракций выделяют 750 мг тиомаринола в виде порошка желтого цвета. The separated fractions were evaporated in vacuo to give 7 g of an oily substance, which was dissolved in 400 ml of a 50% aqueous methanol solution, and the resulting solution was placed in a 600 ml column filled with Diaion HP-20 support (trademark of Mitsubishi Chem. Ind .) saturated with water. The column is washed with a 50% aqueous methanol solution and the target product is eluted with a 90% aqueous methanol solution. By evaporation under reduced pressure, 1 g of a yellow powder is obtained from the fraction. The yellow powder was further eluted on a Sephadex LH-20 chromatographic column with a mixture of methylene chloride, ethyl acetate and methanol (19: 19: 2). 750 mg of thiomarinol are isolated from the active fractions in the form of a yellow powder.

Полученный тиомаринол имеет следующие характеристики. The obtained thiomarinol has the following characteristics.

1) Внешний вид: порошок желтого цвета. 1) Appearance: yellow powder.

2) Температура плавления: 84-89^oC.2) Melting point: 84-89 ^o C.

3) Молекулярная формула C₃₀H₄₄N₂O₉S₂.3) The molecular formula is C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₉ S ₂ .

4) Молекулярная масса: 640 (по данным FAB масс-спектрометрии). FAB масс-спектрометрия масс-спектрометрия с бомбардировкой быстрыми атомами. 4) Molecular mass: 640 (according to FAB mass spectrometry). FAB mass spectrometry fast atom bombardment mass spectrometry.

5) Масс-спектр высокого разрешения:
C₃₀H₄₄N₂O₉S₂ [N+H]⁺; по данным FAB масс-спектрометрии).5) High-resolution mass spectrum:
C ₃₀ H ₄₄ N ₂ O ₉ S ₂ [N + H] ⁺ ; according to FAB mass spectrometry).

Найдено 641,2567. Found 641.2567.

Вычислено 641,2585. Calculated 641.2585.

6) Элементный анализ. 6) Elemental analysis.

Вычислено, C 56,23; H 6,92; N 4,37; S 10,01. Calculated, C 56.23; H 6.92; N, 4.37; S 10.01.

Найдено, C, 55,92; H, 6,82; N, 4,23; S 9,90. Found, C, 55.92; H, 6.82; N, 4.23; S 9.90.

7) ИК-спектр: в ИК-спектре (метод с диском KBr, n_max см^-1) наблюдаются следующие пики:
3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.7) IR spectrum: in the IR spectrum (method with a KBr disk, n _max cm ^-1 ) the following peaks are observed:
3394, 2930, 1649, 1598, 1526, 1288, 1216, 1154, 1102, 1052.

8) УФ-спектр: λ_max нм (s).8) UV spectrum: λ _max nm (s).

УФ-спектр, измеренный в метаноле или смеси метанол+соляная кислота, представлен ниже:
387(12000), 300(3500), 214(26000).The UV spectrum, measured in methanol or a mixture of methanol + hydrochloric acid, is presented below:
387 (12000), 300 (3500), 214 (26000).

УФ-спектр, измеренный в смеси метанол+едкий натр, представлен ниже:
386(9600), 306(3200), 206(25000).The UV spectrum measured in methanol + sodium hydroxide mixture is presented below:
386 (9600), 306 (3200), 206 (25000).

9) Удельное вращение:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = +4,3^° (c = 1,0; метанол).
10) Жидкостная хроматография высокого разрешения.9) Specific rotation:
[α] $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{25}}{\text{D}}$ = + 4.3 ^° (c = 1.0; methanol).
10) High-performance liquid chromatography.

Разделительная колонка: Senshu-Pak ODS H-2151 (диаметр колонки 6 мм, длина 150 мм, продукция компании Senshu Scientific Co. Ltd.). Separation column: Senshu-Pak ODS H-2151 (column diameter 6 mm, length 150 mm, Senshu Scientific Co. Ltd.).

Растворитель: 40 об. водный ацетонитрил. Solvent: 40 vol. aqueous acetonitrile.

Скорость подачи элюента: 1,5 мл/мин. The flow rate of the eluent: 1.5 ml / min.

Длина волны: 220-350 нм (детектор фотодиодная матрица). Wavelength: 220-350 nm (detector photodiode array).

Время удерживания: 5,9 мин. Retention time: 5.9 minutes

11) ¹H-ЯМР спектроскопия ( δм.д.).11) ¹ H-NMR spectroscopy (δ ppm).

ЯМР-спектр (270 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта, представлен ниже:
0,91(3H, дублет, J=6,8 Гц), 0,95(3H, дублет, J=5,9 Гц),
1,30(6H, широкий мультиплет), 1,55(5H, широкий мультиплет), 2,03 (3H, синглет), 2,09 ( 3H, мультиплет),
2,34(2H, триплет, J=7,3 Гц), 3,33(1H, дублет, J=10,7 Гц),
3,52(2H, мультиплет), 3,64(2H, мультиплет), 3,73(1H, дублет дублетов), 4,02(2H, триплет, J=6,6 Гц), 4,18(1H, широкий дублет, J= 7,3 Гц), 4,30(1H, дублет, J= 4,4 Гц), 4,44(1H, дублет, J=7,8 Гц), 4,63(1H, дублет, J=3,4 Гц), 4,89(1H, дублет, J=7,3 Гц), 5,37(2H, мультиплет), 5,97(1H, широкий синглет), 7,04(1H, синглет), 9,80(1H, широкий синглет), 10,68(1H, широкий синглет).NMR spectrum (270 MHz), measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as an internal standard, is presented below:
0.91 (3H, doublet, J = 6.8 Hz), 0.95 (3H, doublet, J = 5.9 Hz),
1.30 (6H, broad multiplet), 1.55 (5H, wide multiplet), 2.03 (3H, singlet), 2.09 (3H, multiplet),
2.34 (2H, triplet, J = 7.3 Hz), 3.33 (1H, doublet, J = 10.7 Hz),
3.52 (2H, multiplet), 3.64 (2H, multiplet), 3.73 (1H, doublet of doublets), 4.02 (2H, triplet, J = 6.6 Hz), 4.18 (1H, wide doublet, J = 7.3 Hz), 4.30 (1H, doublet, J = 4.4 Hz), 4.44 (1H, doublet, J = 7.8 Hz), 4.63 (1H, doublet , J = 3.4 Hz), 4.89 (1H, doublet, J = 7.3 Hz), 5.37 (2H, multiplet), 5.97 (1H, broad singlet), 7.04 (1H, singlet), 9.80 (1H, broad singlet), 10.68 (1H, broad singlet).

12) ¹³C-ЯМР спектр: ( dм.д.).12) ¹³ C-NMR spectrum: (dpm).

ЯМР-спектр (68 МГц), измеренный в гексадейтерированном диметилсульфоксиде с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта, представлен ниже:
16,3 (квартет), 16,6 (квартет), 20,3 (квартет),
26,7 (триплет), 27,0 (триплет), 29,7 (триплет),
30,0 (триплет), 30,1 (триплет), 33,4 (триплет),
36,6 (триплет), 43,9 (дублет), 45,3 (дублет),
64,9 (триплет), 65,7 (дублет), 66,0 (триплет),
71,8 (дублет), 72,1 (дублет), 74,4 (дублет),
77,6 (дублет), 113,7 (дублет), 115,8 (синглет),
116,3 (дублет), 129,8 (дублет), 135,1 (синглет),
135,7 (дублет), 137,9 (синглет), 161,1 (синглет),
168,6 (синглет), 170,4 (синглет), 174,3 (синглет).NMR spectrum (68 MHz), measured in hexadeuterated dimethyl sulfoxide using tetramethylsilane as an internal standard, is presented below:
16.3 (quartet), 16.6 (quartet), 20.3 (quartet),
26.7 (triplet), 27.0 (triplet), 29.7 (triplet),
30.0 (triplet), 30.1 (triplet), 33.4 (triplet),
36.6 (triplet), 43.9 (doublet), 45.3 (doublet),
64.9 (triplet), 65.7 (doublet), 66.0 (triplet),
71.8 (doublet), 72.1 (doublet), 74.4 (doublet),
77.6 (doublet), 113.7 (doublet), 115.8 (singlet),
116.3 (doublet), 129.8 (doublet), 135.1 (singlet),
135.7 (doublet), 137.9 (singlet), 161.1 (singlet),
168.6 (singlet), 170.4 (singlet), 174.3 (singlet).

13) Растворимость. 13) Solubility.

Растворим в спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметилсульфоксиде, диметилформамиде, хлороформе, этилацетате, ацетоне и диэтиловом эфире; не растворим в гексане и воде. Soluble in alcohols, such as methanol, ethanol, propanol and butanol, as well as in dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, chloroform, ethyl acetate, acetone and diethyl ether; insoluble in hexane and water.

14) Цветные реакции. 14) Color reactions.

Положительные с серной кислотой, иодом и перманганатом калия. Positive with sulfuric acid, iodine and potassium permanganate.

15) Тонкослойная хроматография. 15) Thin layer chromatography.

Величина R_f 0,57.The value of R _f 0,57.

Адсорбент: силикагель (фирма Merck Co. inc. Art. 5719). Adsorbent: silica gel (Merck Co. inc. Art. 5719).

Элюент: хлористый метилен:метанол 85:15 по объему. Eluent: methylene chloride: methanol 85:15 by volume.

Биологическая активность. Biological activity.

Биологическая активность тиомаринола B подтверждается следующими примерами тестовых испытаний, в которых он сравнивается с псевдомоновой кислотой A и тиомаринолом. The biological activity of thiomarinol B is confirmed by the following test test examples, in which it is compared with pseudomonic acid A and thiomarinol.

Пример тестовых испытаний 1. Test Test Example 1.

Антибактериальная активность тиомаринола B. Antibacterial activity of thiomarinol B.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) тиомаринола, тиомаринола B и псевдомоновой кислоты A (обозначены, соответственно, через "A", "B" и "P"), выраженную в мкг/мл, по отношению к грампозитивным и грамнегативным бактериям, определяют методом разбавления агаровой среды, используя питательную агаровую среду (продукт компании Eiken Chemical Co. Ltd.). The minimum inhibitory concentration (MIC) of thiomarinol, thiomarinol B and pseudomonoic acid A (indicated by “A”, “B” and “P”, respectively), expressed in μg / ml, relative to gram-positive and gram-negative bacteria, is determined by dilution agar medium using nutrient agar medium (product of Eiken Chemical Co. Ltd.).

Полученные результаты представлены в табл. 2. The results are presented in table. 2.

Пример тестовых испытаний 2. Test Test Example 2.

Антимикоплазменная активность тиомаринола B. Antimycoplasmic activity of thiomarinol B.

По аналогичной методике, приведенной в примере тестовых испытаний 1, проводят количественное определение активности тиомаринола, тиомаринола B и псевдомоновой кислоты A (обозначены, соответственно, "A", "B" и "P") по отношению к различным образцам микоплазмы. Результаты представлены в табл. 3. By a similar methodology described in test test example 1, the activity of thiomarinol, thiomarinol B, and pseudomonoic acid A (designated “A”, “B”, and “P”, respectively) with respect to various mycoplasma samples is quantified. The results are presented in table. 3.

Инокулюм: 0,005 мл 10⁵ CFU/мл.Inoculum: 0.005 ml 10 ⁵ CFU / ml.

Среда для анализа. The environment for analysis.

Для всех микроорганизмов испытания тиомаринола B и псевдомоновой кислоты A проводят в среде Ченока (полученной по методике, приведенной в P.N.A.S. v. 48, 41-49 (1962) с добавлением 20% сыворотки лошади). For all microorganisms, tests of thiomarinol B and pseudomonoic acid A are carried out in Chenok's medium (obtained by the method described in P.N.A.S. v. 48, 41-49 (1962) with the addition of 20% horse serum).

Тиомаринол подвергают анализу в следующих средах. Thiomarinol is analyzed in the following media.

M. bovis и M. gallisepticum: среда Ченока (полученная, как указано выше). M. bovis and M. gallisepticum: Chanock medium (prepared as described above).

M. hyosynoviae: агаровая среда с муцином PPLO (*) (с добавлением 15% сыворотки лошади),
(*) PPLO плевро-пневмониеобразный организм
PPLO бульон без CV (Difco) 21 г
Муцин бактериологический (Difco) 5 г
Вода дистиллированная 800 мл
Агар благородный (Difco) 12 г
Лошадиная сыворотка 150 мл
25%-ный свежий дрожжевой экстракт 50 мл
Условия выращивания культуры: 37^oC, 5 дней, слегка аэробная среда (метод газового укутывания BBL [выращивание в генераторе CO₂ одноразового использования фирмы Becton Dickinson Microbiology Sysyems, Коккисвиль, Мэриленд, США]).M. hyosynoviae: agar medium with PPLO mucin (*) (supplemented with 15% horse serum),
(*) PPLO pleuro-pneumonia-like organism
PPLO broth without CV (Difco) 21 g
Bacteriological mucin (Difco) 5 g
Distilled water 800 ml
Noble agar (Difco) 12 g
Horse serum 150 ml
25% fresh yeast extract 50 ml
Culture conditions: 37 ^° C., 5 days, slightly aerobic medium (BBL gas wrap method [single-use CO ₂ generator from Becton Dickinson Microbiology Sysyems, Kokkisville, Maryland, USA]).

Из представленных результатов ясно, что тиомаринол B проявляет превосходную антибактериальную и антимикоплазменную активность, которая по крайней мере не хуже, чем у тиомаринола, и в общем случае значительно выше, чем активность псевдомоновой кислоты A. From the presented results it is clear that thiomarinol B exhibits excellent antibacterial and antimycoplasmic activity, which is at least no worse than that of thiomarinol, and in the general case is significantly higher than the activity of pseudomonoic acid A.

Claims (8)

1. Тиомаринол B формулы

2. Способ получения тиомаринола B, отличающийся тем, что микроорганизм вида Alteromonas rava культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганических солей, при аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта.1. Thiomarinol B Formulas

2. A method of producing thiomarinol B, characterized in that the microorganism of the species Alteromonas rava is cultured in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and inorganic salts, under aerobic conditions, followed by isolation of the target product. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивируют штамм Alteromonas rava SANK 73390, зарегистрированный под депозитарным номером FERM ВР-3381. 3. The method according to claim 2, characterized in that the strain Alteromonas rava SANK 73390 is cultivated, registered under depository number FERM BP-3381. 4. Способ получения тиомаринола B по п.1, отличающийся тем, что тиомаринол формулы

подвергают реакции с окисляющим агентом.4. The method of obtaining thiomarinol B according to claim 1, characterized in that the thiomarinol of the formula

subjected to reaction with an oxidizing agent. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что окисление проводят, используя окислительный агент, выбранный из группы, состоящей из перманганата калия, хроматов, тетраоксида рутения, галогенов, озона, кислорода, перекиси водорода, органических перекисей, диоксиранов, органических надкислот и их солей и надсерных (пероксисерных) кислот и их солей. 5. The method according to claim 4, characterized in that the oxidation is carried out using an oxidizing agent selected from the group consisting of potassium permanganate, chromates, ruthenium tetroxide, halogens, ozone, oxygen, hydrogen peroxide, organic peroxides, dioxiranes, organic peracids and their salts and supra-sulfuric (peroxysulfuric) acids and their salts. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют окислительный агент, выбранный из группы, состоящей из перекиси водорода, органических надкислот и их солей, органических перекисей, диоксиранов и надсерных кислот и их солей. 6. The method according to claim 4, characterized in that they use an oxidizing agent selected from the group consisting of hydrogen peroxide, organic peracids and their salts, organic peroxides, dioxiranes and sulfuric acids and their salts. 7. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют окислительный агент, выбранный из группы, состоящей из перекиси водорода, диметилдиоксирана и надсерных кислот и их солей. 7. The method according to claim 4, characterized in that they use an oxidizing agent selected from the group consisting of hydrogen peroxide, dimethyldioxirane and sulphurous acids and their salts. 8. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют окислительный агент, выбранный из группы, состоящей из перманганата калия, дихромата калия, дихромата натрия, оксида хрома (VI), хлористого хромила, трет-бутилхромата, тетраоксида рутения, хлора, брома, иода, озона, кислорода, перекиси водорода, бис(триметилсилил)пероксида, гидроперекиси кумила, гидроперекиси трет-бутила, диоксирана, метилдиоксирана, диметилдиоксирана, диэтилдиоксирана, этилметилдиоксирана, метилпропилдиоксирана, бутилметилдиоксирана, фтордиоксирана, метилфтордиоксирана, дифтордиоксирана, бис(трифторметил)диоксирана, метилтрифторметилдиоксирана, трифторметилхлордифторметилдиоксирана, надуксусной кислоты, надмуравьиной кислоты, м-хлорнадбензойной кислоты, пероксимоносерной кислоты, пероксидисульфата калия и пероксимоносульфата калия. 8. The method according to claim 4, characterized in that they use an oxidizing agent selected from the group consisting of potassium permanganate, potassium dichromate, sodium dichromate, chromium oxide (VI), chromyl chloride, tert-butyl chromate, ruthenium tetraoxide, chlorine, bromine , iodine, ozone, oxygen, hydrogen peroxide, bis (trimethylsilyl) peroxide, cumyl hydroperoxide, tert-butyl hydroperoxide, dioxirane, methyldioxirane, dimethyldioxirane, diethyl dioxirane, ethylmethyldioxirane, methylpropyldioxirane, butyloxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio-dioxydio ftordioksirana, bis (trifluoromethyl) dioxirane, metiltriftormetildioksirana, triftormetilhlordiftormetildioksirana, peracetic acid, performic acid, m-chloroperbenzoic acid, peroxymonosulfuric acid, potassium peroxydisulphate and potassium peroxymonosulphate. Приоритет по пунктам:
18.09.92 по пп.1 3.Priority on points:
09/18/92 according to claims 1 3. 05.11.92 по пп.4 8. 11/05/92 according to claims 4-8.

Images