RU2010142289A - Обнаружение связанных с экспрессией генов - Google Patents

Abstract

1. Способ идентификации геномной ДНК в образце, включающий ! - выделение мРНК из выбранного организма и получение из указанной мРНК малых одноцепочечных фрагментов кДНК с одним адаптором, содержащим аффинную метку; ! - выделение геномной ДНК из того же самого или родственного организма и получение из указанной геномной ДНК одноцепочечных фрагментов геномной ДНК, лигированных с адапторными молекулами; ! - гибридизацию указанных одноцепочечных фрагментов геномной ДНК с указанными одноцепочечными фрагментами кДНК и амплификацию указанных гибридов; и ! - высокопроизводительное секвенирование указанных гибридов. ! 2. Способ по п.1, предусматривающий стадии: ! a) выделения и очистки мРНК из образцов ткани организма; ! b) синтеза кДНК с использованием указанной мРНК в качестве матрицы; ! c) необязательно уменьшения сложности указанной кДНК; ! d) фрагментации указанной кДНК; ! e) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов; ! f) необязательно удаления полиА-содержащих фрагментов связыванием с покрытыми стрептавидином аффинными гранулами; ! g) шлифовки указанных фрагментов кДНК; ! h) лигирования указанных фрагментов с одним адаптором, содержащим сайт узнавания для редко-щепящего фермента, и другим адаптором, содержащим биотиновую метку; ! i) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов; ! j) ник-репарации указанных фрагментов; ! k) отбора указанных фрагментов, которые содержат последовательности обоих адапторов; ! l) амплификации указанных фрагментов с использованием праймеров, отжигающихся с адапторными последовательностями, описанными на стадии h), где один праймер является комплементарным адаптору с �

Claims (23)

1. Способ идентификации геномной ДНК в образце, включающий

- выделение мРНК из выбранного организма и получение из указанной мРНК малых одноцепочечных фрагментов кДНК с одним адаптором, содержащим аффинную метку;

- выделение геномной ДНК из того же самого или родственного организма и получение из указанной геномной ДНК одноцепочечных фрагментов геномной ДНК, лигированных с адапторными молекулами;

- гибридизацию указанных одноцепочечных фрагментов геномной ДНК с указанными одноцепочечными фрагментами кДНК и амплификацию указанных гибридов; и

- высокопроизводительное секвенирование указанных гибридов.

2. Способ по п.1, предусматривающий стадии:

a) выделения и очистки мРНК из образцов ткани организма;

b) синтеза кДНК с использованием указанной мРНК в качестве матрицы;

c) необязательно уменьшения сложности указанной кДНК;

d) фрагментации указанной кДНК;

e) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов;

f) необязательно удаления полиА-содержащих фрагментов связыванием с покрытыми стрептавидином аффинными гранулами;

g) шлифовки указанных фрагментов кДНК;

h) лигирования указанных фрагментов с одним адаптором, содержащим сайт узнавания для редко-щепящего фермента, и другим адаптором, содержащим биотиновую метку;

i) необязательно отбора по размеру указанных фрагментов;

j) ник-репарации указанных фрагментов;

k) отбора указанных фрагментов, которые содержат последовательности обоих адапторов;

l) амплификации указанных фрагментов с использованием праймеров, отжигающихся с адапторными последовательностями, описанными на стадии h), где один праймер является комплементарным адаптору с редким рестрикционным сайтом, а другой праймер содержит биотиновую метку;

m) связывания указанных фрагментов с покрытыми стрептавидином аффинными гранулами;

n) удаления адапторов, содержащих редкий рестрикционный сайт, с использованием соответствующего рестрикционного фермента из указанных фрагментов;

о) удаления одиночных цепей, не присоединенных к аффинным гранулам взаимодействием биотин-стрептавидин, из двухцепочечных фрагментов ДНК, присоединенных к аффинным гранулам через взаимодействие биотин-стрептавидин, приводящего к одиночным цепям ДНК, связанным со стептавидиновыми аффинными гранулами;

р) выделения и очистки геномной ДНК, например из организма со стадии а);

q) фрагментации указанной геномной ДНК;

r) необязательно шлифовки указанной геномной ДНК;

s) лигирования указанной геномной ДНК с одним единственным типом адаптора или с двумя разными типами адапторов (предпочтительно);

t) плавления указанной геномной ДНК до одноцепочечной ДНК;

u) гибридизации геномной ДНК со стадии t) с кДНК на гранулах со стадии о);

v) удаления несвязанной геномной ДНК промыванием;

w) удлинения гибрида кДНК-геномная ДНК полимеразой с созданием двухцепочечной матрицы;

х) проведения ПЦР на указанном гибриде геномная ДНК-кДНК;

y) отбора фрагментов, больших, чем приблизительно 100 пар оснований, из указанной ПЦР фракционированием по размеру;

z) необязательно очистки указанных фрагментов и

аа) высокопроизводительного секвенирования указанных фрагментов.

3. Способ по п.2, в котором последовательности со стадии аа) объединяют в контиги перекрывающихся индивидуальных последовательностей.

4. Способ по п.3, в котором контиги аннотируют автоматическим аннотированием.

5. Способ по п.1, в котором последовательности получают из индивидуумов, принадлежащих к одному виду, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.

6. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов, принадлежащих к родственным видам, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.

7. Способ по п.1, в котором последовательности получают из двух или более индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.

8. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или нескольких индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.

9. Способ по п.1, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления консервативных участков в геномной ДНК.

10. Способ по п.1, в котором адаптор, содержащий сайт узнавания для редко-щепящего фермента со стадии h), содержит сайт узнавания для фермента Sapl.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором фрагментацию нуклеиновых кислот достигают распылением.

12. Способ идентификации полиморфизмов, предусматривающий все стадии способа по п.2 и дополнительно стадию ab) сравнения данных по последовательностям из двух или более образцов для идентификации полиморфизмов.

13. Способ по п.12, в котором последовательности со стадии аа) объединяют в контиги перекрывающихся индивидуальных последовательностей.

14. Способ по любому из пп.12-13, в котором последовательности со стадии ab) или контиги, охарактеризованные в п.13, аннотируют автоматическим аннотированием.

15. Способ по п.12, в котором последовательности получают из индивидуумов, принадлежащих к одному виду, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.

16. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов, принадлежащих к родственным видам, и сравнивают с доступными данными по EST для выявления некодирующих последовательностей, таких как последовательности интронов и внутренние некодирующие последовательности генов.

17. Способ по п.12, в котором последовательности получают из двух или более индивидуумов, принадлежащих к одному и тому же виду, и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.

18. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или нескольких индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления полиморфных сайтов.

19. Способ по п.12, в котором последовательности получают из одного или более индивидуумов из различных видов и сравнивают для выявления консервативных участков в геномной ДНК.

20. Способ по п.12, в котором адаптор, содержащий сайт узнавания для редко-щепящего фермента со стадии h), содержит сайт узнавания для фермента SapI.

21. Способ по п.12, в котором фрагментацию нуклеиновых кислот достигают распылением.

22. Набор для осуществления способа по п.1 или 2, содержащий один или несколько адапторов и инструкции по применению и необязательно один или несколько праймеров, комплементарных указанным адапторам, лигазу и/или рестрикционные ферменты, которые являются специфическими в отношении разрезания этих адапторов, общепринятые компоненты для наборов для амплификации per se, такие как dNTP и полимераза.

23. Набор по п.22, в котором адаптеры получают отжигом олигонуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из:

5'-AGTCCGTCGCATCGCTCTTC-3'

5'-GAAGAGCGATGCGACG-3

5'-Биотин-TEG-AGTGGGTGTCCTGGGTCAAC-3'

5'-GTTGACCCAGGACACC-3'

5'-CTTGTAGGGCACGGGTCGAGAG-3'

5'-AATTCTCTCGACCCGTGCCCTA-3'

5'-CTTGTAGGGCACGGGTCGGAGA-3'

5'-AGCTTCTCCGACCCGTGCCCTA-3'

5'-GAATGGCTGGGAGAGTGCTGAG-3'

5'-GATCCTCAGCACTCTCCCAGCC-3' и

5'-GTAGGGCACGGGTCGGAGAAGC-3'.