JP2004526453A - ヌクレオチド分析のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、一般に、核酸配列分析の分野に関する。特定の実施形態では、分析は、遺伝子型決定(genotyping)である。特定の実施形態では、分析は、分析は、1ヌクレオチド多型(SNP)を検出することを含む。本発明はまた、核酸分析のための方法、キットおよびコンピュータソフトウェアに関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
核酸分析についての種々の方法が存在する。1つの方法は、制限フラグメント長多型(RFLP)の使用を含む。別の方法は、増幅フラグメント長多型(AFLP)を用いる。
【0003】
個体間の対立遺伝子の相違の分析は、核酸分析の1領域である。特定の適用では、1ヌクレオチド多型(SNP)を検出する。約2.9×106のSNPが、ヒトゲノムにおいてマッピングされており、そして配列決定されている。これは、約3×109塩基対を包含する。効率的かつ迅速な規模での個体ゲノムの有効な分析は、非常に有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本願は、米国仮出願第60/284,409号(2001年4月16日出願)の優先権を主張する。米国仮出願第60/284,409号は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【0005】
(発明の要旨)
特定の実施形態では、核酸分析の方法が提供される。特定のこのような実施形態は、核酸標的配列の複数のフラグメントを、この標的配列を少なくとも1つの制限酵素で消化することによって作製する工程、および第1のプライマーセットを用いてこの複数のフラグメントを増幅して、複数の増幅フラグメントを作製する工程を包含する。
【0006】
特定の実施形態によれば、この方法は、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットの少なくとも1つについてのヌクレオチドを検出する工程をさらに包含する。特定の実施形態によれば、この増幅する工程は、第2のプライマーセットを用いて、複数の増幅フラグメントのサブセットを増幅して、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットを作製することを含み、この第2のプライマーセットは、第1のプライマーセットの3’末端に少なくとも1つのさらなるヌクレオチドを含む。
【0007】
特定の実施形態では、この増幅する工程は、1以上の引き続くプライマーセットを使用して、増幅フラグメントの1以上のサブセットを連続して作製することを含み、このプライマーセットは、第1のプライマーセットの3’末端に少なくとも1つのさらなるヌクレオチドを含む。
【0008】
特定の実施形態では、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットは、複数の増幅フラグメントの増幅されたサブセットの少なくとも1つについてのヌクレオチドを検出する前に非対称に増幅されて、一本化DNAが作製される。
【0009】
特定の実施形態によれば、1塩基伸長反応を実施する方法は、等温で提供される。
【0010】
特定の実施形態によれば、一本鎖テンプレートは、1塩基伸長反応における使用のために調製される。特定の実施形態では、一本鎖テンプレートは、非対称PCR(asymmetric PCR)によって調製される。
【0011】
特定の実施形態によれば、さらなる増幅は、第1のプライマー対由来の1つのプライマー、および検出されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む少なくとも1つのプライマーを用いて実施される。特定の実施形態によれば、第1のプライマー対に由来する過剰なプライマーを添加して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ここで、長いプライマーの3’末端は、検出されるべきヌクレオチドに近位である。これらの実施形態のうちの特定のものにおいて、標識した配列ターミネーターを反応容器に添加し、そして1塩基伸長(すなわち、微小配列決定)反応を実施する。特定の実施形態では、微小配列決定反応の産物は、長いオリゴヌクレオチドの長さに従って分離される。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温で実施される。
【0012】
本発明の特定の実施形態によれば、キットが提供される。特定の実施形態では、このようなキットは、AFLPの増幅のための第1のプライマー対を含む。第1のプライマー対は、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む。このようなキットは、第2のプライマーセットをさらに含み、ここで、第2のセットのプライマーは、AFLPを作製するために用いられるプライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、第1のプライマーセットのプライマーの3’末端に付加された1ヌクレオチドを含む。
【0013】
特定の実施形態によれば、ソフトウェアが提供される。特定の実施形態では、このソフトウェアは、電子データベースから既知のSNPを同定し、既知のSNPに直接隣接する領域の配列を含むプライマーを設計し、このプライマーの融解温度を計算し、そしてプライマーを、計算された融解温度に基づいて選択する。
【0014】
(発明の特定の実施形態の詳細な説明)
本明細書中で用いた節の見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載される主題を限定するとは解釈されるべきでない。特許、特許出願、論文、書籍および学術論文を含むがこれらに限定されない、本願に引用した全ての文書は、明らかに、その全体があらゆる目的のために参考として援用される。
【0015】
(定義)
用語「アダプター」とは、連結反応を通して別のポリヌクレオチドの末端へと連結されるオリゴヌクレオチドをいう。アダプターは、一本鎖または二本鎖であり得る。代表的には、アダプターは、ポリヌクレオチドの末端に対して有用な特徴を与え得る。このような特徴としては、制限酵素部位または独特の配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。特定の実施形態では、独特の配列は、そのアダプターに特異的な増幅プライマーのための部位として用いられ得る。
【0016】
「等温条件」は、プライマーオリゴヌクレオチドの改変または重合が本発明に従って行われる、実質的に均一または一定な温度である。温度は、プライマーオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを用いて形成される二重鎖が、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズしていないポリヌクレオチドとほぼ平衡であるように選択される。ほぼ平衡な状態は、ポリヌクレオチドと二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドが、温度サイクルなしに、解離し得、そして再度一本化し得る状態である。特定の実施形態では、少なくとも1%、特定の実施形態では、20〜80%、そして特定の実施形態では95%未満のポリヌクレオチドが、等温条件下でプライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。従って、等温条件下では、プライマーオリゴヌクレオチドまたはその一部分とハイブリダイズし、そして動的平衡においては、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない分子とハイブリダイズするポリヌクレオチドが存在する。等温条件は、温度の何らかの変動を含み得る。特定の実施形態によれば、温度の変動は、±2℃であり得る。
【0017】
従って、用語「等温条件」は、変動する温度(例えば、特にランダムまたは未制御の温度変動)の使用を包含する。それゆえ、この用語は、熱サイクリング(これは、いくつかの公知の増幅手順(例えば、PCR)において用いられる)と呼ばれるタイプの温度変動を排除する。
【0018】
等温条件としては、40℃と80℃との間の温度で、プライマーを標的ポリヌクレオチド配列に対して可逆的にハイブリダイズすることが挙げられる。特定の実施形態では、等温温度は、本方法を異なる温度で実施し、そして最適温度を決定して、この方法の必要条件に最も適した増幅を得ることによって経験的に到達される。コンピュータモデルをまた用いて、適切な温度を選択し得る。重合反応における等温条件の使用は、例えば、米国特許第5,882,867号に記載されている。
【0019】
用語「微小配列決定」反応とは、配列ターミネーターを用いた、ある種の1塩基伸長配列決定反応をいう。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、遊離の1ヌクレオチドの実質的に非存在下で実施して、配列ターミネーターによって配列決定される1ヌクレオチドを超えて核酸の重合を最少化または防止する。特定の実施形態では、配列ターミネーターは、蛍光色素で標識され、その結果、各ヌクレオチド(A、G、T、またはC)が、蛍光標識の色によって同定可能である。例示的な配列ターミネーターおよびこれらを用いる反応は、例えば、米国特許第5,498,523号;および同第4,994,372号に記載される。
【0020】
用語「移動度モディファイヤー(modifier)」とは、核酸の移動度および移動特性を変更する、因子および化学物質(核酸を含むがこれらに限定されない)をいう。移動度モディファイヤーの例は、例えば、米国特許第5,703,222号;同第5,470,705号;同第5,777,096号;同第5,514,543号;および同第5,703,096号に記載されている。
【0021】
用語「多重」とは、同じ反応容器中で生じる複数の反応をいう。特定の実施形態では、反応は、複数の核酸標的についてまたは複数の核酸標的を用いて実施される。
【0022】
用語「1ヌクレオチド多型」または「SNP」とは、対立遺伝子が1ヌクレオチド異なる遺伝子座での多型または対立遺伝子バリエーションをいう。
【0023】
用語「独特の配列アイデンティファイヤー(identifier)」とは、サンプル中の他のオリゴヌクレオチド配列とは実質的に異なるオリゴヌクレオチド配列をいう。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーは、好ましくは、サンプル核酸または他の独特の配列アイデインティファイヤーとほとんどまたは全く交差反応性がないことを実証する。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーは、標的ポリヌクレオチドを相補することが公知のオリゴヌクレオチドへと結合され得る。特定の実施形態では、独特の配列アイデンティファイヤーおよび任意の結合した核酸は、独特の配列アイデンティファイヤーに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて単離され得る。
【0024】
特定の実施形態では、次いで、独特の配列アイデンティファイヤーを用いて、標的ポリヌクレオチドを選択的に結合し得るかまたはサンプルから除去し得る。これは、得られる核酸二重鎖が、独特の配列アイデンティファイヤーに相補的な別の選択的オリゴヌクレオチドへと選択的に結合され得る場合、達成される。特定の実施形態では、他の選択的オリゴヌクレオチドは、基材へと結合されて、標的ポリヌクレオチドの精製が容易にされ得る。このような独特の配列アイデンティファイヤーは、例えば、米国特許第5,981,176号;およびPCT公報WO 97/31256に記載されている。
【0025】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらのα−アノマー形態などを含め、ヌクレオチドモノマーのポリマー(このようなポリマーのアナログを含む)を意味する。オリゴヌクレオチドをどのようにして合成するかの説明は、他の箇所の中でも、米国特許第4,373,071号;同第4,401,796号;同第4,415,732号;同第4,458,066号;同第4,500,707号;同第4,668,777号;同第4,973,679号;同第5,047,524号;同第5,132,418号;同第5,153,319号;および同第5,262,530号に見出され得る。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり得る。
【0026】
「プライマー」は、プライマーおよび少なくとも1つのさらなるヌクレオチドの重合を容易にするための反応において用いられる配列を含むオリゴヌクレオチドである。重合は、増幅、プライマー伸長、および/または配列決定の目的のために実施され得る。本発明によるプライマーとは、標的ポリヌクレオチドまたは増幅産物の一部と配列特異的様式でハイブリダイズするように設計されて、プライマー伸長、増幅および/または配列決定反応のためのプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドをいう。
【0027】
配列特異的プライマーを設計するための基準は、当業者に周知である。配列特異的アニーリングを提供するプライマー設計の詳細な説明は、他の箇所の中でも、DiffenbachおよびDveksler,PCR Primer,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,1995、ならびにKwokら(Nucl.Acid Res.18:999−1005,1990)に見出され得る。プライマーの配列特異的部分は、適切に、連結産物および増幅産物中の相補的配列への特異的アニーリングを可能にするに充分な長さのものである。
【0028】
多くの型の増幅は、本発明の種々の実施形態のために用いられ得る。例示的な増幅方法としては、PCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Q−βレプリカーゼベースのシステム、NASBA、3SRおよびローリングサークル複製が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、PCRが、用いられる増幅方法である。
【0029】
増幅反応を最適化する方法は、当業者に周知である。例えば、アニーリング、重合および変性のための時間および温度を変更すること、ならびに反応組成物中の緩衝液、塩および他の試薬を変更することによって、PCRが最適化され得ることが周知である。最適化はまた、用いられる増幅プライマーの設計によってもたらされ得る。例えば、プライマーの長さ、ならびにG−C:A−T比は、プライマーアニーリングの効率を変化させ得、従って、増幅反応を変化させ得る。James G.Wetmur,「Nucleic Acid Hybrids,Formation and Structure」,Molecular Biology and Biotechnology,605−8頁(Robert A.Meyers編,1995)を参照のこと。
【0030】
図2は、AFLPフラグメントが、制限酵素消化および徐々に伸長したプライマーを選択的にビンに入れることによって作製される方法を例示する。例示の目的のために、図3は、プライマーの3’末端で3ヌクレオチド伸長されたプライマーによって増幅された、選択されたビンの中のマッピングされたSNPおよびAFLPフラグメントの見積もり数を示す。
【0031】
(AFLP)
本発明の特定の実施形態によれば、増幅フラグメント長多型、すなわち、AFLPが作製される。AFLPの使用は、例えば、PCT公報WO 96/22388および米国特許第5,874,215号;および同第6,045,994号に以前に記載されている。特定の実施形態では、AFLPは、少なくとも1つの制限酵素による消化にゲノムDNA全体を最初に供することによって、ゲノムDNA全体から作製される。特定の実施形態では、2つの制限酵素を用いて、ゲノムDNAを消化する。これらの実施形態の特定のものでは、制限酵素消化から作製されるフラグメントは、アダプターに連結される。特定の実施形態では、制限酵素消化後に残存する独特の一本鎖突出DNAを使用して、アダプターをフラグメントへと連結する。特定の実施形態では、独特の配列は、アダプターに特異的な増幅プライマーのための部位として用いられ得る。図1を参照のこと。
【0032】
特定の実施形態では、プライマーは、フラグメントを増幅するためにフラグメントに添加される。特定の実施形態では、プライマーは、特定の実施形態において用いられる、連結したアダプターを相補するように設計され得る。特定の実施形態では、プライマーは、DNAを消化するために用いられる制限酵素の部位の全てまたは一部に対して相補的であり得る。特定の実施形態では、これらのプライマーは、第1のプライマー対を含み、この対はさらに、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む。特定の実施形態では、この第1のプライマー対の第1のプライマーおよび第1のプライマー対の第2のプライマーは、異なる配列を含む。
【0033】
本発明の特定の実施形態では、フラグメントの増幅は、複数の反応において生じ、複数の反応容器中で同じAFLPを作製する。
【0034】
(AFLPフラグメントをビンに入れること)
本発明の特定の実施形態によれば、伸長されたプライマーは、異なるフラグメントをビンに入れること、または異なるフラグメントの間を識別するために用いられる。特定の実施形態によれば、伸長されたプライマーは、AFLPを作製するために用いられる第1のプライマーおよび第2のプライマーに同一である配列を含み、そしてプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に付加された1ヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、反応容器は、どの伸長されたプライマーがその反応に添加されたかに従って分割される。
【0035】
例えば、反応容器の一部、すなわち、「ビン」は、添加され伸長されたプライマーを有し得、このプライマーは、プライマーの3’末端に付加されたアデニン(「A」)ヌクレオチドを有する、第1のプライマー対の第1のプライマーの配列を含む。反応容器の別のビンは、第1のプライマー対の第1のプライマーの配列を含むプライマーを有し得るが、グアニン(「G」)ヌクレオチドが、プライマーの3’末端に付加されている。
【0036】
従って、増幅後、第1のビンにおいて増幅された増幅フラグメントのサブセットは、全てが、第1のプライマーのヌクレオチド(ならびに相補的配列)の3’末端に直接隣接してヌクレオチド「A」を有するはずである。また、増幅後、第2のビンにおいて増幅された増幅フラグメントのサブセットは、全て、第1のプライマーのヌクレオチド(ならびに相補的配列)の3’末端に直接隣接してヌクレオチド「G」を有するはずである。
【0037】
同様に、第1のプライマー対の第2のプライマーの3’末端で伸長されたヌクレオチド(A、G、T、またはC)によってビンに入れられる、第1のプライマーセットの1、2、3または4つの異なる伸長された第2のプライマーを用い得る。従って、特定の実施形態によれば、第1の伸長されたプライマーおよび第2の伸長されたプライマーの16の異なる組合せを有する16の異なるビンを用い得る。このような実施形態では、このようなビンにおける増幅は、フラグメントのいずれかの側の制限部位のヌクレオチドに直接隣接する1ヌクレオチドの16の異なる可能な組合せを有するフラグメントを分離すべきである。
【0038】
ビンへのフラグメントの連続する回の細分は、さらなる伸長されたプライマーを用いて実施され得る。例えば、第2の細分のために、第1の伸長されたプライマーの第1の伸長されたヌクレオチドに直接隣接する3’末端に4つの可能な伸長されたヌクレオチド(A、G、C、またはT)を含む第2の伸長されたプライマーを用いる。従って、16の異なる第1の伸長されたプライマー対および16の異なる第2のプライマー対が存在する場合、フラグメントのいずれかの末端の制限部位に隣接する2つのヌクレオチドの256の異なる組合せを有する256の異なるビンが存在する。連続した回のビンに入れられることによって、各ビン中の異なるフラグメントの数を減らす。
【0039】
特定の実施形態では、伸長されたプライマーは、3回伸長され、そして最後のAFLP増幅は、第1のプライマーの配列および第2のプライマーの配列を含み、かつプライマーの3’末端に結合した3ヌクレオチドをさらに含むプライマーを用いて行われる。図2を参照のこと。特定の実施形態では、反応容器は、1,000ビンを超えるまで細分される。
【0040】
(一本鎖テンプレート調製)
特定の実施形態では、数コピーの一本鎖AFLPが、非対称PCRによって作製される。特定の実施形態では、これは、他の増幅プライマーよりも不均衡に多い量の1つの増幅プライマーを添加することによって生じる。より多い量の増幅によるDNAプライマー鎖は、相補鎖がプライマーから外れてもはや複製しない後でも、増幅し続ける。作製される鎖は、どの増幅プライマーがより多い量で添加されるかによって決定される。
【0041】
特定の実施形態では、非対称PCRは、AFLP増幅の最後の回の間に生じる。
【0042】
特定の実施形態では、一本鎖テンプレートは、二本鎖核酸の一方の鎖の酵素消化によって作製され得る。このような実施形態は代表的に、酵素のエキソヌクレアーゼ活性によって実施される。このような実施形態において、二本鎖核酸の一方の鎖は、ヌクレアーゼ活性に対して無防備にされるか、または他方の鎖がヌクレアーゼ活性から保護される。
【0043】
特定の実施形態では、一本化テンプレートは、二本鎖ポリヌクレオチドから一方の鎖を捕獲することによって作製される。特定の実施形態では、捕獲は、ビオチン標識ヌクレオチドを用いて実施される。特定の実施形態では、捕獲は、一方の鎖に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施される。特定の実施形態では、捕獲は、二本鎖ポリヌクレオチドについて実施され、次いでこの二本鎖ポリヌクレオチドは、変性され、そして洗浄される。特定の実施形態では、一方の鎖は、捕獲されたままであり、そして他方の鎖は、洗浄によって除去される。
【0044】
(検出)
特定の実施形態では、各反応容器中のAFLPの数を、SNPを含むAFLPの算出数まで減少させた後、SNPが検出される。特定の実施形態では、1塩基伸長を用いて、AFLP後にヌクレオチドを検出する。特定の実施形態では、1塩基伸長を用いて、一本鎖テンプレート上のヌクレオチドを検出する。
【0045】
特定の実施形態では、SNPでの特定のヌクレオチドは、蛍光インジケーターを用いて検出され得る。特定の実施形態では、この蛍光インジケーターは、特定のオリゴヌクレオチドによってクエンチング分子へと連結された、蛍光を発する色素であり得る。これらとしては、5’−ヌクレアーゼ蛍光インジケーターおよび分子ビーコンが挙げられるがこれらに限定されない。このようなシステムの例は、例えば、米国特許第5,538,848号および同第5,723,591号に記載される。特定の実施形態では、互いに区別され得る4つのインジケーターを使用し、この4つのインジケーターの各々は、特定のヌクレオチド(A、T、G、またはC)に対応する。
【0046】
特定の実施形態では、微小配列決定反応を用いて、SNPを検出する。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温条件下で実施される。
【0047】
(長いオリゴヌクレオチドプライマー)
特定の実施形態によれば、AFLPは、以前に記載されたとおりに作製される。特定の実施形態では、さらなる増幅は、ビンの材料の一部、第1のプライマー対由来のプライマー、およびSNPに直接隣接する領域の配列を含む少なくとも1つのSNP特異的プライマーを用いて実施される。特定の実施形態では、SNPに直接隣接する領域の配列を含む少なくとも1つのSNP特異的プライマーは、SNPに近位の5’末端を有する。図4を参照のこと。過剰の、第1のプライマー対由来の以前に用いられたプライマーを添加して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、ここで、長いオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端は、SNPに近位である。図4を参照のこと。特定の実施形態では、所定のフラグメントまたはビン内のフラグメント内の異なるSNPに対応する、複数の異なる長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製し得る。各異なるSNPに直接隣接する領域の配列を含む異なるSNP特異的プライマーを用い得る。これらの実施形態では、異なるSNP特異的プライマーを用いた増幅は、異なるSNPに特異的な異なる長いオリゴヌクレオチドプライマーをもたらす。このような長いオリゴヌクレオチドプライマーは、SNPと第1のプライマー(伸長されていないプライマー)の末端との距離に依存した、異なる長さのものである。
【0048】
特定の実施形態では、微小配列決定反応において長いオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特定のSNPを同定する。特定の実施形態によれば、異なる長いオリゴヌクレオチドプライマー、AFLPフラグメントの最初のビンの一部(長いオリゴヌクレオチドプライマー調製前)、および配列ターミネーターを用いて反応を実施する。特定の実施形態では、ターミネーターの4つのヌクレオチド(A、T、G、およびC)の各々について異なるインジケーターを各々含む、4つの異なる配列ターミネーターが用いられる。特定の実施形態によれば、反応物中の1ヌクレオチドがポリメラーゼ反応において重合しないように、これらの1ヌクレオチドを実質的に除去または改変しようとする。配列ターミネーターを用いて1塩基伸長反応を実施して、長いオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチドおよび付加された標識ヌクレオチド(SNP部位に対応する)を含むSNP含有配列を作製する。次いで、そのサイズに基づいてSNP含有配列を分離して、異なるSNP部位間を区別し得る。SNP含有配列上の区別可能なインジケーターを考慮して、各SNP部位で特異的ヌクレオチドをまた決定し得る。特定の実施形態では、微小配列決定反応は、等温で実施される。
【0049】
移動度によってフラグメントまたは長いオリゴヌクレオチドプライマーを区別することは、種々の方法によって達成され得る。特定の実施形態では、1塩基伸長プライマーは、電気泳動によって分離される。
【0050】
(独特な配列アイデンティファイアーおよび移動度モディファイアー)
特定の実施形態では、一本鎖DNAを生成するために、AFLPの増幅および非対称PCRを、記載のようにして実施する。特定の実施形態によれば、反応物中の単一ヌクレオチドを実質的に除去または変更することが試みられ、その結果、そのヌクレオチドは、ポリメラーゼ反応において重合化しない。特定の実施形態では、SNPにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを、反応に添加する。これらのプライマーは、そのプライマーの3’末端がSNPに近接するように設計される。特定の実施形態では、標識化された配列ターミネーターを反応容器に加え、そしてSNPにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーで微小配列決定反応を実施して、そのプライマーと、付加された標識化ヌクレオチドとを含む配列を含有するSNPを得る。特定の実施形態では、異なる標識(指示薬)を、各々異なるヌクレオチドターミネーター(A、C、GまたはT)について使用する。図5を参照のこと。特定の実施形態では、微小配列決定(minisequencing)反応を、等温で実施する。
【0051】
移動度によるフラグメントまたはプライマーの識別は、種々の方法によって達成され得る。特定の実施形態では、一塩基伸長プライマーが、電気泳動によって分離される。
【0052】
特定の実施形態では、SNPにすぐ隣接するがSNPを含まない領域の配列を含むプライマーはさらに、SNPにすぐ隣接するがSNPを含まない領域の配列の5’末端に、独特のアイデンティファイアー配列を含む。図5を参照のこと。特定の実施形態では、異なるSNP部位に対応して、複数の異なる独特のアイデンティファイアー配列が使用される。特定の実施形態では、この独特のアイデンティファイアー配列は、アレイ上の異なる位置の異なる配列に対して相補的である。次いで、異なるSNP部位間を区別するために、アレイ上の異なる位置への結合に基づいて、SNP含有配列が分離され得る。また、SNP含有配列における識別可能な指示薬に鑑みて、各SNP部位における特定のヌクレオチドが決定され得る。
【0053】
特定の実施形態では、SNPにすぐ隣接する領域の配列を含むプライマーはさらに、移動度モディファイアーを含む。特定の実施形態では、分析される各々異なるSNP部位について、複数の異なる移動度モディファイアーが使用される。移動度モディファイアーを有するプライマーのヌクレオチドと、付加された標識化ヌクレオチド(これがSNP部位に対応する)とを含むSNP含有配列を生成するために、標識化された配列ターミネーターを使用して、一塩基伸長反応が実施される。次いで、異なるSNP部位についての異なる移動度に基づいて、SNP含有配列が分離され得る。また、SNP含有配列における識別可能な指示薬に鑑みて、各SNP部位における特定のヌクレオチドが決定され得る。
【0054】
特定の実施形態では、各々の独特な配列アイデンティファイアーは、増幅生成物の独特な配列アイデンティファイアー部分に対して相補的なタグと、移動度に依存する分析技術(例えば、電気泳動)において特定の移動度をもたらすためのテイル(tail)とを含む、特定の移動度モディファイアーに対して相補的である。例えば、1999年3月15日付けで出願された米国特許出願番号09/522,640号を参照のこと。
【0055】
(オリゴヌクレオチド連結アッセイ)
特定の実施形態では、SNPは、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(oligonucleotide ligation assay(OLA))によって検出される。OLAは、例えば、米国特許第5,185,243号に記載されている。特定の実施形態では、AFLPを増幅し、そして非対称PCRを実施して、一本鎖DNAを生成する。特定の実施形態では、SNPにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを反応容器に加える。(i)SNPの他方の側にすぐ隣接した領域、および(ii)SNPに対して相補的な、異なるあり得るヌクレオチドを含む、異なるプライマーを、反応容器に加える。特定の実施形態では、SNPの他方の側にすぐ隣接する領域を含む、およびSNPに対して相補的な、異なるあり得るヌクレオチドを含む、異なるプライマーは、移動度モディファイアーによってか、プライマーの異なる長さによってか、または異なる標識によって識別される。連結反応を実施し、そしてSNPに対して相補的なヌクレオチドを含むプライマーを、連結生成物の存在によって検出する。
【0056】
特定の実施形態では、プライマーのいずれかまたは両方を、フラグメント内における異なるSNP部位の区別化を可能にするように設計し得る。例えば、プライマーの一方または両方が、各SNP部位について異なる配列アイデンティファイアーおよび/または移動度モディファイアーを含み得、この配列アイデンティファイアーおよび/または移動度モディファイアーが、異なるSNP部位間の区別を可能にする。SNP部位の特定のヌクレオチドに対して相補的なあり得るヌクレオチドを含むプライマーはまた、特定のSNP相補的ヌクレオチドに特異的な指示薬を含み得る。このようにしてまた、各々区別化されるSNP部位の特定のヌクレオチドが決定され得る。
【0057】
本発明の特定の実施形態によれば、キットが提供される。特定の実施形態では、このようなキットは、AFLPの増幅のための第一のプライマー対を備える。この第一のプライマー対は、第一プライマーおよび第二プライマーを含む。このようなキットはさらに、伸長されたプライマーを備え、ここでこの伸長されたプライマーは、AFLPを生成するために使用されるプライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、そのプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に付加された単一ヌクレオチドを含む。
【0058】
特定の実施形態では、このキットはさらに、いくつかのプライマー対を備え、ここで各プライマー対は、AFLPを生成するために使用される第一プライマーおよび第二プライマーと同一の配列を含み、そしてさらに、そのプライマーオリゴヌクレオチドの3’末端に付加された1つ以上のヌクレオチドを含み、その結果、連続的により長いプライマーで増幅されたAFLPは、複数の双対(bin)に再分配され得る。
【0059】
特定の実施形態では、このキットはさらに、SNPにすぐ隣接した領域の配列を含む少なくとも1つのプライマーを備える。特定のさらなる実施形態では、SNPにすぐ隣接した領域の配列を含むこの少なくとも1つのプライマーはさらに、独特の配列アイデンティファイアーを含む。特定のさらなる実施形態では、SNPにすぐ隣接した領域の配列を含むこの少なくとも1つのプライマーはさらに、移動度モディファイアーを含む。特定の実施形態では、このキットはさらに、標識化配列ターミネーターを備える。
【0060】
特定の実施形態によれば、ソフトウェアが提供される。特定の実施形態では、このソフトウェアは、電子データベースから既知のSNPを同定し、既知のSNPにすぐ隣接した領域の配列を含むプライマーを設計し、そのプライマーの融解温度を算出し、そして算出された融解温度に基づいてプライマーを選択する。
【0061】
特定の実施形態では、このソフトウェアは、特定の第一プライマー配列で開始し、そして特定の第二プライマー配列で終結する、ゲノム内の配列を同定する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、予期される緩衝液において使用される特定の塩濃度の、融解温度に対する効果を算出する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、分析から、反復配列由来の10塩基対のSNPまたは10塩基対よりも短いSNPを排除する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、プライマー選択のための判断基準として、アニーリング温度での二本鎖配列のパーセントを使用する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、ゲノム中においてSNPについての単一の位置が存在するか否かを決定する。特定の実施形態では、このソフトウェアは、選択されたプライマーを長さによって分類し、そしてそのプライマーの末端にオリゴヌクレオチドを付加する。
【実施例】
【0062】
(実施例1)
(A.AFLPテンプレート混合物の調製)
異なる長さの12個の異なるAFLPフラグメントを、Celera(Foster City,California)から入手した。このフラグメントは、ラットのゲノムDNAを、BstYIおよびMseIで消化することによって生成された。この消化生成物を、オリゴヌクレオチドアダプターに連結した。次いで、この生成物を、Ms000およびBs000プライマー(表2に示す)を使用して増幅した。次いで、これらの増幅の生成物を、表4に示すプライマーの組み合わせにより増幅した。最後に、このフラグメントを、表1に同定されたこれらのプライマーにより増幅した。その配列を、表2に示す。フラグメントの長さは、50塩基対から435塩基対まで異なった。この12個の個々のフラグメントは、Celera(Foster City,California)によって単離および精製された。
【0063】
次いで、これらの12個の精製されたフラグメントを、一緒に混合した。これらのフラグメントの混合物を、モデルAFLPテンプレート混合物として使用した。表1は、混合物中における各フラグメントのコピー数およびフラグメント長を示す。
【0064】
上記AFLP(各々107〜108コピー)のモデルAFLP混合物の1μlを、AmpliTaq GoldTM(Roche Molecular Systems,Inc.から入手可能)を使用して、100μlのPCR反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー(Bs000およびMs000)は、アダプターを有するMseI−BstYIフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表2に規定されている:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 10μl
2.5mM 各dNTP 8μl
25mM MgCl2 8μl
AmpliTaq GoldTM 1μl
Bs000(プライマー) 5μl
Ms000(プライマー) 5μl
AFLPテンプレート混合物 1μl
水 62μl。
【0065】
この増幅反応を、以下のパラメーターに従って、15サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0066】
増幅後、4μlの反応生成物を、エビのアルカリホスファターゼ(SAP)およびエキソヌクレアーゼIで処理した。このホスファターゼは、遊離の単一ヌクレオチドからリン酸を取り除き、それらが配列決定反応の間に重合化しないようにする。この工程は、決定することが意図される単一ヌクレオチドを超えて、配列決定反応が伸長しないようにするのに役立つ。エキソヌクレアーゼは、終了まで伸長しなかった未重合オリゴヌクレオチドを破壊する。SAPおよびエキソヌクレアーゼIは両方とも、USB Corp.(それぞれ、部品番号70092Zおよび70073Z)から入手可能である。この反応を、以下のように実施した:
SAP(1単位/μl) 2μl
エキソヌクレアーゼI(10単位/μl) 0.2μl
水 6μl
増幅生成物 4μl。
【0067】
【表1】
この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させて、AFLPテンプレート混合物から増幅生成物を得た。エキソヌクレアーゼIの1単位の定義は、標準的な条件下で37℃にて30分間において、変性DNAから10nmoleの酸可溶性ヌクレオチドを放出するのを触媒する酵素の量である。SAPの1単位の定義は、グリシン/NaOH緩衝液(pH10.4)中において37℃にて、1分間あたり1μmoleのp−ニトロフェニルホスフェートの加水分解を触媒する酵素の量である。
【0068】
(B.検出プライマーの調製)
各フラグメントの中央部付近の無作為な領域を選択した。これらの領域に相補的なプライマーを設計した。これらのプライマーを合成した。各プライマーは、特定のフラグメントに対して相補的な23ヌクレオチドを有し、そして3つのプライマーは、以下のように、プライマーの5’末端に付加された多数のTを有した:
130bp AFLPフラグメント 0個のT
179bp AFLPフラグメント 4個のT
184bp AFLPフラグメント 8個のT
224bp AFLPフラグメント 12個のT。
【0069】
これらのプライマーの正体を、表3に示す。
【0070】
(C.一塩基対伸長による微小配列決定)
微小配列決定反応を、以下のように4つのすべてのプライマーを使用して、「多重化(multiplex)」実験のために実施した:
Ready Mix 5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例1A)からの
SAP処理増幅生成物 1μl
130bp、179bp、184bpおよび224bpの
フラグメント(0個のT、4個のT、8個のTおよび12個のT)
についてのプライマーを各々1μl(5μM) 合計4μl
水 0μl。
【0071】
Ready Mixは、酵素、配列決定ターミネーターおよび緩衝液を含み、そしてSNaPshotキット(Applied Biosystems,部品番号4323154および4312163)の一部として、入手可能である。配列ターミネーターは蛍光標識されており、その結果、各ヌクレオチドは異なる色の標識を有し、電気泳動分離の間または後における蛍光検出の間にそれらを識別させる。
【0072】
4つの別々の「単一化(singleplex)」微小配列決定反応を、以下のように別々の反応において、上記のプライマーの各々を用いて実施した:
Ready Mix 5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例1A)からの
SAP処理増幅生成物 1μl
プライマー(0個のT、4個のT、8個のTまたは12個のT)(5μM)1μl
水 3μl。
【0073】
すべての反応を、以下のようなパラメーターを使用して、25サイクルで熱サイクルした:
96℃ 10秒間
50℃ 5秒間
60℃ 30秒間。
【0074】
次いで、各サンプルを、37℃で1時間にわたって0.5単位のSAPで処理し、次いで、72℃で15分間処理した。すべての反応を、ABI Prism(登録商標)310において分析した。
【0075】
すべての反応が、予期されたシグナルを示した。このことは、多重化の一塩基伸長微小配列決定反応が可能であることを示す。この多重化反応の結果を、図6に示す。
【0076】
(実施例2)
(A.非対称テンプレートの調製)
実施例1からの12個のAFLP(各々107〜108コピー)のモデルAFLP混合物の1μlを、AmpliTaq GoldTM(Roche Molecular Systems,Inc.から入手可能)を使用して、100μlのPCR反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー(Bs000およびMs000)は、アダプターを有するMseI−BstYIフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表2に規定されている。以下のような反応において3つの異なる濃度のBs000プライマーを使用して3つの別々の反応を実施し、一本鎖テンプレートを生成した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 10μl
2.5mM 各dNTP 8μl
25mM MgCl2 8μl
AmpliTaq GoldTM 1μl
Bs000(プライマー)
(5μM、1μMおよび0.1μM濃度中) 5μl
Ms000(プライマー)(5μM) 5μl
AFLPテンプレート混合物 1μl
水 62μl。
【0077】
これらの反応を、以下のパラメーターに従って、15サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0078】
増幅後、4μlの反応生成物を、以下の反応においてSAPで処理した:
SAP(1単位/μl) 2μl
水 6μl
増幅生成物 4μl。
【0079】
(B.等温での一塩基対伸長による微小配列決定)
微小配列決定を、実施例1の4つのフラグメント(130bp(0個のT)、179bp(4個のT)、184bp(8個のT)および224bp(12個のT))のプライマーを使用することによって実施した。微小配列決定反応を、以下のように4つすべてのプライマーを使用して、「多重化」実験のために実施した:
Ready Mix 5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例2A)からの
SAP処理増幅生成物 1μl
プライマー(5μM)(130(0個のT)、179(4個のT)、
184(8個のT)および224(12個のT))を各々1μl 合計4μl
水 0μl。
【0080】
4つの「単一化」微小配列決定反応を、以下のように別々の反応において、上記のプライマーの各々を用いて実施した:
Ready Mix 5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例2A)からの
SAP処理増幅生成物 1μl
プライマー(5μM)(130(0個のT)、179(4個のT)、
184(8個のT)または224(12個のT))を各々1μl 1μl
水 3μl。
【0081】
すべての反応を、サイクルさせずに、1時間65℃でインキュベートした。次いで、各サンプルを、37℃で1時間にわたって0.5単位のSAPで処理し、次いで、72℃で15分間処理した。すべての反応を、ABI Prism(登録商標)310において分析した。
【0082】
この結果により、1:5の比率のBs000/Ms000プライマー比が、最も強いシグナルを与え、一方、より小さな比率(1:10および1:100)は、より弱いシグナルを与えることが示された。対称PCR(1:1の比率のプライマーを使用する)は、ほとんど全くシグナルを与えなかった。データは示さない。多重化反応の1つを、図6に示す。弱い「緑色」のシグナルは、その反応において使用された特定のプライマー配列の結果である可能性がある。
【0083】
(実施例3)
(A.AFLPテンプレート混合物の調製)
実施例1からの12個のAFLP(各々107〜108コピー)のモデルAFLP混合物の1μlを、AmpliTaq GoldTM(Roche Molecular Systems,Inc.から入手可能)を使用して、100μlのPCR反応において増幅した。この反応において使用されたプライマー(Bs000およびMs000)は、アダプターを有するMse I−Bst YIフラグメントを一般に増幅するように設計され、そして表2に規定されている。増幅を、以下の成分を用いて実施した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 10μl
2.5mM 各dNTP 8μl
25mM MgCl2 8μl
AmpliTaq GoldTM 1μl
Bs000(プライマー) 5μl
Ms000(プライマー) 5μl
AFLPテンプレート混合物 1μl
水 62μl。
【0084】
この反応を、以下のパラメーターに従って、40サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0085】
増幅後、4μlの反応生成物を、SAPおよびエキソヌクレアーゼIで処理した。この反応は、以下の通りであった:
SAP(1単位/μl) 2μl
エキソヌクレアーゼI(10単位/μl) 0.2μl
水 6μl
増幅生成物 4μl。
【0086】
この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させた。
【0087】
(B.非対称PCRによる、長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製)
12個のフラグメントのうちの10個における10個の選択されたヌクレオチドの各々に隣接する領域を選択し、そしてプライマーを、これらの領域に対して相補的に設計した。これらのプライマーを合成した。プライマーの各々の配列を、表3に示す。長さが50塩基対および435塩基対のフラグメントに対応するフラグメントは、合成されなかった。図7は、「モデルSNP」部位(×)に隣接する対応のフラグメントにおける、表3の6つのプライマーの相対的配置を示す。10個のプライマーを、各々のプライマーについての最終濃度が0.5μMで、一緒に混合した。1μlのこの混合物(各々のプライマーの0.5pmoleに対応する)を、以下の反応において、非対称PCRのために使用した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 2μl
2.5mM 各dNTP 1.6μl
25mM MgCl2 1.6μl
AmpliTaq GoldTM 0.2μl
プライマー混合物 1μl
Ms000(5μM濃度中) 3μl
AFLPテンプレート混合物 0.2μl
水 10.4μl。
【0088】
この反応を、以下のパラメーターで、40サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0089】
12μlの得られた増幅生成物を、以下の反応に使用した:
SAP(1単位/μl) 12μl
水 12.6μl
増幅生成物 12μl。
【0090】
この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させた。
【0091】
(C.一塩基伸長による微小配列決定)
微小配列決定反応を、以下のように実施した:
Ready Mix 5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例3A)からの
SAP処理増幅生成物 2.5μl
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物(実施例3B) 2.5μl。
【0092】
この反応を、以下のパラメーターを使用して、25サイクルで熱サイクルに供した:
96℃ 10秒間
50℃ 5秒間
60℃ 30秒間。
【0093】
SAP(0.75単位)を、サイクルが完了した後で反応物に加え、そして37℃で1時間インキュベートした。次いで、反応物を75℃に15分間供し、そして、ABI Prism(登録商標)310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)において分析した。この結果を、図8に示す。
【0094】
(実施例4)
(A.長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製)
融解温度において異なった2つのプライマーを設計および合成した。一方は60Fと名付け、60℃でアニールし、一方で65Fは65℃でアニールする。65Fプライマーが60Fプライマーと比較して5’末端に2個のさらなるヌクレオチドを含むことを除いて、両方のプライマーは同じ配列を含む。60Fおよび65Fの配列を、表2に示す。2つの異なる別々の反応において、20μlの増幅反応中で、1pmoleの60Fまたは65Fのいずれかを、15pmoleのMs000と組み合わせた。この反応物を、以下のように構成した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 2μl
2.5mM 各dNTP 1.6μl
25mM MgCl2 1.6μl
AmpliTaq GoldTM 0.2μl
60Fプライマーまたは65Fプライマー(1μM) 1μl
Ms000(5μM濃度中) 3μl
AFLPテンプレート混合物 0.2μl
水 10.4μl。
【0095】
この反応を、以下のパラメーターに従って、40サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0096】
得られた増幅生成物を、以下のようにしてSAP処理に供した:
SAP(1単位/μl) 2μl
水 6.2μl
増幅生成物 4μl。
【0097】
この反応を、37℃で1時間行い、次いで、75℃で15分間行った。
【0098】
(B.非対称PCR)
実施例4Aからの生成物を、以下のような非対称PCRにおいて、長いオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 2μl
2.5mM 各dNTP 1.6μl
25mM MgCl2 1.6μl
AmpliTaq GoldTM 0.2μl
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物 1μl
Bs000(5μM濃度中) 3μl
AFLPテンプレート混合物 0.2μl
水 10.4μl。
【0099】
この反応を、以下のパラメーターに従って、40サイクルで熱サイクルした:
95℃ 15秒間
64℃ 120秒間
75℃ 120秒間。
【0100】
得られた増幅生成物を、以下のようにしてSAP処理に供した:
SAP(1単位/μl) 2μl
水 6.2μl
非対称増幅生成物 4μl。
【0101】
この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させた。次いで、この非対称増幅生成物を、一本鎖テンプレートとして使用した。
【0102】
(C.一塩基伸長による微小配列決定)
微小配列決定反応を、以下のように実施した:
Ready Mix 5μl
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物(実施例4A) 2.5μl
SAP処理された非対称増幅生成物(実施例4B) 2.5μl。
【0103】
熱サイクルを、以下のようにして、75サイクル行った:
96℃ 10秒間
70℃ 30秒間。
【0104】
60Fプライマーおよび65Fプライマーは両方とも、検出された既知のヌクレオチドについて正確なシグナルを生じた。このシグナルは、正確な長さで現れた。図9を参照のこと。この結果は、60℃および65℃の両方のアニーリング温度で設計されたプライマーが、これらの条件下で、長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製物に対して機能することを実証する。
【0105】
(実施例5)
(A.AFLPテンプレート混合物の調製)
Bs244およびMs111と命名されたプライマー(表2に示される)を用いて増幅された、AFLP混合物のサブセットを、Celera(Foster City,California)から入手した。これらのプライマーは、3’末端に付加されたCTTを有するBs000プライマー配列、および3’末端に付加されたAAAを有するMs000プライマー配列を含んだ。これらのプライマーを、以下のような反応において使用した:
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 10μl
2.5mM 各dNTP 8μl
25mM MgCl2 8μl
AmpliTaq GoldTM 1μl
プライマー Bs244 5μl
プライマー Ms111 5μl
AFLP混合物のサブセット 20μl
水 43μl。
【0106】
熱サイクルを、以下のようなパラメーターを使用して、40サイクルで行った:
95℃ 15秒間
75℃ 240秒間。
【0107】
得られた生成物の半分を、水で希釈することなく、11μlのSAP(1単位/μl)に添加した。この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させた。
【0108】
(B.長いオリゴヌクレオチドプライマーの調製)
長いオリゴヌクレオチドプライマーを、表5に示されるような10個のフラグメント特異的プライマーを使用する別々の反応において生成した。この別々の反応混合物を、以下のようにして調製した。
【0109】
10×AmpliTaq GoldTM緩衝液 10μl
2.5mM 各dNTP 8μl
25mM MgCl2 8μl
AmpliTaq GoldTM 1μl
10個の特異的プライマーのうちの1つ(5μM) 1μl
Ms000(5μM) 5μl
AFLPテンプレート混合物 1μl
水 66μl。
【0110】
熱サイクルを、以下のようなパラメーターを使用して、40サイクルで行った:
95℃ 15秒間
64℃ 240秒間
75℃ 240秒間。
【0111】
各増幅反応の生成物全体を、水で希釈することなく、22μlのSAP(1単位/μl)を有する別々の容器に添加した。この混合物を、37℃で1時間反応させ、次いで、75℃で15分間反応させた。
【0112】
(C.一塩基伸長による微小配列決定)
微小配列決定反応を、前述された長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物の各々について、以下のように実施した:
Ready Mix 5μl
長いオリゴヌクレオチドプライマーの生成物(実施例5B) 2.5μl
AFLPテンプレート混合物(実施例5A)からの
SAP処理増幅生成物 2.5μl。
【0113】
この反応を、以下のパラメーターを使用して、75サイクルで熱サイクルした:
96℃ 15秒間
70℃ 120秒間。
【0114】
ABI Prism(登録商標)310 Genetic Analyzerで分析された場合に、10個の反応物の各々についてシグナルが生成された。図10は、10個の「単一化」反応のうちの5つの結果を示す。この結果は、すべてのプライマーが、一塩基伸長配列決定し得ることを示す。
【0115】
【表2】
【0116】
【表3】
【0117】
【表4】
【0118】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【0119】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成した少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を伴った本特許または特許出願の公報のコピーは、請求をして必要な料金を支払ったら、特許庁によって提供される。
【図1】図1は、制限酵素消化およびその後のアダプターの連結によるフラグメント作成を図示する。
【図2】図2は、本発明の特定の実施形態に記載されるAFLPの方法の代表を示す。フラグメントは、フラグメントを増幅するために用いられるプライマーの複雑さを増すことによって、徐々に小さくなるサブセットへと選択的にビンに入れられる。
【図3】図3は、増幅プライマーの3’の3つのさらなるヌクレオチドを用いて、見込みのあるビンにおいて、Mse IおよびBst YIを用いた制限消化によって作製されるAFLPフラグメントの評価数を示す。各ビン中の既知のSNPの数もまた示す。
【図4】図4は、1塩基伸長(SBE)配列決定反応において使用するための長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製するための非対称PCRにおいて用いられるプライマーの位置を図示する。
【図5】図5は、独特配列アイデンティファイヤーまたは移動度モディファイヤーを用いる1塩基伸長配列決定反応のためのフラグメント特異的配列決定プライマーの使用を図示する。
【図6】図6は、実施例1および2において使用される多重配列反応の結果を示す。
【図7】図7は、全フラグメントに対して実施例3および実施例5で用いられる特異的プライマーの位置を図示する。
【図8】図8は、実施例3の結果を示す。7つの1ヌクレオチド配列は、多重反応において正確に検出される。
【図9】図9は、実施例4の結果を示す。1ヌクレオチド配列の正確な同定を、60℃のTmを有するプライマーおよび65℃のTmを有するプライマーについて示す。
【図10】図10は、実施例5の結果を示す。特異的プライマーのうちの5つは、適切な部位でのヌクレオチド配列を実証した。
Claims (12)
- 標的配列内の少なくとも1つの標的ヌクレオチドを同定するための方法であって、以下:
少なくとも1つの制限酵素で該標的配列を消化することによって該標的配列の複数のフラグメントを作製する工程;
該複数のフラグメントを、第1のプライマーセットを用いて増幅して、複数の増幅フラグメントを作製する工程であって、ここで、該第1のプライマーセットは、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む、工程;
第1の伸長されたプライマーセットを用いて、該複数の増幅フラグメントの少なくとも1つのサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの少なくとも1つの増幅されたサブセットを作製する工程であって、ここで、該第1の伸長されたプライマーセットは、該第1のプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第1の伸長されたプライマー、ならびに該第2のプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第2の伸長されたプライマーを含む、工程;ならびに
該複数の増幅フラグメントの少なくとも1つの該増幅されたサブセット内の該少なくとも1つの標的ヌクレオチドを同定することによって、標的配列内の該少なくとも1つの標的ヌクレオチドを同定する工程
を包含する、方法。 - 第2の伸長されたプライマーセットを用いて、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも1つのサブセットを増幅して、増幅フラグメントの少なくとも1つの第2のサブセットを作製する工程をさらに包含し、ここで、該第2の伸長されたプライマーセットは、前記第1の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに前記第2の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 伸長されたプライマーの第三のセットを用いて、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも1つの第2のサブセットを増幅して、増幅フラグメントの少なくとも1つの第三のサブセットを作製する工程をさらに包含し、ここで、該伸長されたプライマーの第三のセットが、該第三の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第五の伸長されたプライマー、ならびに該第四の伸長されたプライマーおよび3’末端の配列のさらに1ヌクレオチドを含む第六の伸長されたプライマーを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記標的配列の前記複数のフラグメントを作製する工程の後で、かつ、該複数のフラグメントを増幅する工程の前に、該標的配列の該複数のフラグメントの各末端にアダプターを連結する工程をさらに包含し、そしてここで、前記第1のプライマーが、該アダプターまたは該標的配列の該複数のフラグメントの一方の末端に相補的な配列を含み、そして前記第2のプライマーが、該標的配列の該複数のフラグメントの他方の末端の該アダプターに相補的な配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 標的配列内の前記少なくとも1つの標的ヌクレオチドを同定する前に、前記複数の増幅フラグメントの前記少なくとも1つの増幅されたサブセットを非対称的に増幅して、一本化テンプレートを作製する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記非対称的に増幅する工程が、前記第1のプライマーセットの前記プライマーの1つの配列を含むプライマー、および同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む少なくとも1つのプライマーを用いて増幅して、既知の長さの長いオリゴヌクレオチドプライマーを作製することを包含し;ここで、同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する領域に対応する配列を含む該少なくとも1つのプライマーと比較して過剰な、該第1のプライマーセットの該プライマーの1つの配列を含むプライマーが存在し、ここで、該長いプライマーの3’末端が、該同定されるべきヌクレオチドに直接隣接する、請求項5に記載の方法。
- 前記長いオリゴヌクレオチドプライマーおよび前記配列ターミネーターの特異的ヌクレオチドに特異的なインジケーターを有する配列ターミネーターを用いて1塩基伸長反応を実施して、一塩基伸長産物を作製する工程;ならびに同定されるべきヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
- 前記一塩基伸長産物を、前記長いオリゴヌクレオチドプライマーの長さに従って分離する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 移動度モディファイヤーを、前記一塩基伸長産物に結合させる工程および該一塩基伸長産物をその移動度によって分離する工程をさらに包含する、請求項7に記載の方法。
- 前記1塩基伸長反応が、等温で実施される、請求項7に記載の方法。
- 増幅フラグメント長多型の増幅のためのキットであって、以下:
増幅フラグメント長多型を作製するために使用される、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む第1のプライマーセット;ならびに
第1の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに第2の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、第1の伸長されたプライマーセット
を備える、キット。 - SNP部位でヌクレオチドを同定するための方法であって、以下:
ゲノムDNAを、2つの制限酵素で消化して、複数のフラグメントを作製する工程;
アダプターを、標的配列の複数のフラグメントの各末端に連結する工程;
第1のプライマーセットを用いて該複数のフラグメントを増幅して、複数の増幅フラグメント作製する工程であって、ここで、該第1のプライマーセットは、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含み、ここで、該第1のプライマーは、該アダプターに相補的な配列を、該標的配列の該複数のフラグメントの一方の末端に含み、そして該第2のプライマーは、該アダプターに相補的な配列を、該標的配列の該複数のフラグメントの他方の末端に含む、工程;
第1の伸長されたプライマーセットを添加する工程であって、ここで、該第1の伸長されたプライマーセットは、該第1のプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第1の伸長されたプライマー、ならびに該第2のプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第2の伸長されたプライマーを含む、工程;
該第1の伸長されたプライマーセットを用いて該複数の増幅フラグメントのサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの第1の増幅されたサブセットを作製する工程;
伸長されたプライマーの第2のセットを添加する工程であって、ここで、該伸長されたプライマーの第2のセットは、該第1の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第三の伸長されたプライマー、ならびに該第2の伸長されたプライマーおよび3’末端のさらに1ヌクレオチドの配列を含む第四の伸長されたプライマーを含む、工程;
伸長されたプライマーの該第2のセットを用いて該複数の増幅フラグメントの第2のサブセットを増幅して、該複数の増幅フラグメントの第2の増幅されたサブセットを作製する工程;
該複数の増幅フラグメントの該第2の増幅されたサブセットの非対称増幅を実施して、複数の一本鎖フラグメントを作製する工程;
該複数の一本鎖フラグメント、1塩基伸長プライマー、および該配列ターミネーターの特定のヌクレオチドに特異的なインジケーターを有する配列ターミネーターの少なくとも1つを用いて1塩基伸長反応を実施して、一塩基伸長産物を得る工程であって、ここで、該1塩基伸長プライマーは、(i)その3’末端で、該SNP部位に直接隣接するヌクレオチドに相補的な配列、および(ii)独特配列アイデンティファイヤーを含む、工程;ならびに
該特異的インジケーターから該SNP部位でのヌクレオチドを同定する工程
を包含する、方法。
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