TW200948969A - Expression-linked gene discovery - Google Patents
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Description
200948969 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於分子生 地說,係關;^序^ 技叙領域,更明確 列。更特定@ ^ ^ ,和銓〜在基因組DNA中的核酸序
yj 文将疋而言,本發明尨Sfl从W Μ Έι, 4t it ^ '、關於將一方法應用在鑑認及/或 偵測核苷酸序列,1处主丄4 # ^ 八代表在基因組中大部分的經轉錄區及 其周圍且其係關於各式 锝錄&及 太路明m Λ各樣㈣傳特性、基因及其組合。 工的式h、 來源(可以是植物、動物、人類、人 " 之分子標記的高通量偵測和鑑認的領域中。 【先前技術】 育種技術已經從可异拉M雜βο 攸』見特性的簡早篩選發展成使用 標記偵測多基因特性的务隹 的先進方法。原則上,在雜交族群之 不同品系之間的每個遺傳差異均可代表經改變的特性。然 而歸因於大多數基因組的複雜性,不可能鑑認出現在 因組之間的每一個差異並將其與特殊特性連結。理論上, 定序完整的基因組會揭露在基因組之間的所有差異。然 =,以目前的U技術,這在實際上、時間和成本效益上' 是不可能實行的。因此’傾測遺傳差異的方法主要是基於 複雜度簡化之原則,其涉及定序得自不同個體之基因組 DNA之有限但經完全界定的部分。隨著定序技術的進步, 對某些應用而言(像是轉錄譜(transcript〇me,其代表所有 經表現之基因序列)的分析),複雜度簡化變得較不重要。 儘管如此,範圍從數千萬到數億個鹼基的真核生物基因組 200948969 之尺寸仍超出規私* ^ 見仃之尚通量定序技術的能力。 核生物中絕大多數的基因组膽 . 尺寸者)對於★接 、疋"有較大基因組 夫矣規计㈤、目的並未提供有價值的資訊,因為其從 -“現並因此似乎對特性的表現沒有貢 = 分子標記,聚隹/A m 此爲鑑遇 …、土因組中3玄等較傾向會顯露盘特性穷+77 .相關之分子標記的部分的方法,相較於僅分析;;= 电尺…ί 機選擇的方法具有優點。當基因 、、且尺寸增加時,兮卩 π ❹在心 所描述之方法使測定 土 Α之所選擇部分(其代表大多數經表現Α 編碼區及其黧衣兄丞因之 ——圍)中的序列成為可能。比較在不同個體之 選擇部分允許鑑認多形位置,其在經表現基因 、“或與其緊鄰。因為多形性的頻率在非編碼區中是較
Hi利用現行的技術可指出更多的多形性與經表現基因 、11、。@且可針對圍繞在較保守之基因周®的大型非編 ^刀2多形性的存在。這最後可能導致每個特性發現至 ❸少一個標記。本發明之方法藉著在不同個體和生物間(甚 至:在具有複雜和大量基因組之生物中)指點基因組之徹 -疋義的。p刀’使&焦在基因編碼區和基因調節區的 偵測成為可能。 核芽酸序列多形性(像是SNp)被廣泛地應用在建構 基因組輿圖上。在多形性於稱為基因作圖的過程中與表現 垔聯、之後,可在標記協助性育種技術中使用這類多形性 作為標記,以偵測在發育任何階段的特殊表現型。核苷酸 序列夕形性通常是在基因組DNA中鑑認。因為所有真核 200948969 物的基因組尺寸都遠遠超過 J矛J用現行之南通量定岸括名奸 :析㈣酸數目,故需要複雜度簡化的可再現程序: 刀析元整基因組的所逆禮却八 々 所~擇°卩分,以發現在個體之間可用於 基因組作圖的遺傳差異。鈇 ^ 吳J而,目前應用之複雜度簡化方 法的統計學性質,# 一^ 、3不&些方法無法當場揭露那些可與單
"一表現型聯結或與斜特姓矣Ϊ目丨一 Λ A h 、料殊表現財貢獻之基因很接近的遺 傳差異。 為了數個理由,現行技術極力地聚焦在發現單一核普 酸多形 J± (single nucleotide polymorphism,SNP广 SNp 比任 何其他類里的多形性更常出現在基因組中、sNp允許同形 ^子和異形合子對偶基因的精確偵測、·可應用在高通 量應用且許多卫業平台是可得的,其使得在任何想要的應 用規模下的SNP偵測都能符合成本效益。雖然SNp發現在 :中出現低水平多形性之狀況下(像是密切相關個體之保 守基因編碼區和基因組)會是精選的方法,但因為多形性 固有的低水平,在密切相關之個體中使用EST銀行於SNp 發現卻可能是較無效的。 總之,SNP發現方法理想上應該揭露在物理上與所關 注的特性有關聯的所有出現的SNP ,但不應該因為其等出 現在基因組的基因編碼區而受到較低水平之多形性妨礙, 或受到任何對於基因組序列知識之需求妨礙。因此需要在 沒有基因組或轉錄譜序列的先前知識下,可再現地測定在 代表大多數的基因編碼區及其等周圍區的基因組DNa之區 域中的伴隨序列的方法。 200948969 【發明内容】 . 現在,本發明之發明人已發現分析生物之基因組區域 . 的方法,其包括四大部分。 第一部分涉及從所選擇之生物分離mRNA,其係用於製 備小型單股的DNA片段,而該DNA片段帶有含親和力標 • 記的連接物(adaPtor)。這些DNA片段係在第三部分中^ 用。在第二部分中,基因組^^係從相同或有關的生物分 離。將該基因組DNA片段化並與連接物分子連接。在第三 部分中,使這些基因組片段與得自第一部分的單股dna 7 - 段雜交,並使用在該過程中形成的雜交產物合成DNA片 -段。這些片段會在第四部分中使用,而該部分涉及使用可 得的高通量定序方法之一,定序這些片段。 因此該鑑認樣本中之基因組DNA的方法,包括 驟: 灭
a) 從生物之組織樣本分離並純化mRNA ; b) 使用該mRNA作為模板,合成cDNa ; c) 可視需要簡化該cdna的複雜度; d) 片段化該cDNA ; e) °』視需要以尺寸挑選 f) 可視需要藉著與經鏈黴菌抗生物素蛋白塗 力珠子結合,移除含有聚A的片段; "σ g) 挞光該cDNA片段; h) 使該片段與一個包括罕見限 J坪京之辨識位置的連 7 200948969 接物和另一個含有生物素標記的連接物連接; l) 可視需要以尺寸挑選該片段; j) 修補該片段的缺口; k) 選擇含有兩種連接物序列的該片段; i 用與在步驟描述之連接物序列煉合的引子擴增 -亥片奴’其中一個引子與具有罕見限制位置之連接物互 補,而另一個引子則含有生物素標記; m) 使该片段與經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈的 子結合; )使用相對應限制酵素,自該片段移除含有罕見限制位 置之連接物; 〇)從與親和力珠子附接的雙股舰片段移除未藉著生 物素-鏈黴g抗生物素蛋白交互作用與親和力珠子附接的單 股; P)分離並純化基因組DNA,例如從步驟a的生物; q) 片段化該基因組DNA ; r) 可視需要拋光該基因組DNA ; 0使該基因組DNA與—個單__類型的連㈣或與兩個 不同類型的連接物連接; t) 將該基因組DNA解鏈成單股DNA ; u) 使得自步驟t)之基因組DNA與得自步驟〇)在珠子上 的cDNA雜交; v) 藉著洗務移除未結合的基因組Dna ; w) 藉著聚合酶延伸cDNA_基因組DNA雜交產物以創造 200948969 雙股模板; X)對該基因組DNA_cDNA雜交產物進行pcR; y) 從該pcr中挑選超過大約1〇〇個驗基對的片段; z) 可視需要純化該片段,以及 aa)高通量定序該片段。 法 在另-具體態樣中’該方法係延伸至鐘認多形性的方 其包括根據申請專利範圍之方法的所有步驟,並額外 ❹ 地比較得自二或多個樣本的序列數據,以鑑認多形性。 定義 在下列的說明和實施例中使用了許多名詞。為了提供 說明書和巾請專利錢(包括料類名㈣供之範圍)清 :且-致的了冑,提供下列的定義。除非在本文中另行定 義’所有的技術和科學名詞均具有與本發明所屬之技術領 =中具有通常知識者所一般了解者相同意義。所有出版 、專利申清案、專利案和其他參考文獻的揭示内容全部 以引用方式納入本文中。
核酸.根據本發明之核酸可包括哺咬和嗓吟驗基(較 的刀别疋胞嘯η疋、胸腺嘴。定和尿喷〇定,以及腺。票吟和鳥 嗓吟)的任何聚合物或募聚物(參I Αΐ_ L
Principles of Biochemistry, ^ 793.800(W〇rth Pub. 1982)) = 發月考慮到任何去氧核醣核#酸、核耱核#酸或狀核酸 、且伤及其任何化學變體,如這些鹼基的經甲基化、經羥 或、星糖基化形式、以及類似者。聚合物或募聚物可 以在組合物中是異質的或同質的,並可從天然存在的來源 9 200948969 中分離,4可以是以人工或經合成方式產生的。此外,核 酸可以疋DNA或RNA、或其混合物,並可永久地或過渡性 地以单股或雙股形式(包括同源雙鏈(hGm〇dupiex)、異源雙 鏈(heteroduplex)和雜交產物狀態)存在。 SNP:單一核苷酸多形性是在特定位點’在物種成員之 間(或在個體的成對染色體之間),在基因組中單一核皆酸 •A、T、C或G-相異時發生的DNA序列變異。sNp是最常 見的遺傳變異類型。SNP可落在基因的編碼序列、基因的 非編碼區或在基因之間的基因間區。因為遺傳密碼的簡 併,在編碼序列内的SNP不一定會改變所產生之蛋白質的 胺基酸序列。其中兩種形式皆導致相同多肽序列的SNp稱 為同義的’且若產生不同的多肽序列則稱之為非同義的。 因為SNP在演化上是保守’可使用其等作為定量特性位點 (q_itative trait loci ’ QTL)分析以及在相關研究中的標 記。 内含子:内含子是基因的非編碼部分,其在叫做剪接 的過程中從前mRNA移出以產生功能性mRNA。 外顯子:外顯子是任何在基因内被轉錄成最後的信使 RNA(mRNA)分子(而不是像内含子從經轉錄之rna分子被 剪掉)的DNA的區域。 a cDNA:CDNA*使用RNA分子作為模板,藉著逆轉錄 酶酵素合成的人工形式之DNA。 、 自然」狀態衍 其荨就像會在自 基因組DNA :基因組DNA —詞代表從 生的DNA。這意指基因組DNA帶有序列, 200948969 然界中被發現的一樣,例如包含内含子和調節序列。基因 組DNA可衍生自不同的來源,像染色體,但亦可來自染色 體外的來源’如粒線體、葉綠體和質體。
Cot-1 DNA :用以測定任何基因組之序列複雜性的技術 涉及DNA的變性和復性。DNA係藉著加熱而變性,且這解 開了 Η鍵並使DNA成為單股。若將DNA迅速地冷卻,則 .DNA會保持單股。但若允許DNA慢慢地冷卻,互補的序列 會發現彼此且最後再度鹼基配對。DNA再煉合的速率(復性 © 的另外一種稱呼)是從其中DNA被分離之物種的函數,亦確 認為「Cot」曲線❶具有高c〇t值的DNA是高度重複的DNA, 而具有低Cot值的DNA僅能獲得低副本數或為唯一的。在 該方法中,吾人使用具有1之Cot值的DNA,其為富含高 度重複的DNA序列的總基因組DNA的部分。 標註:cDNA序列的標註包括兩個步驟。將所得的序列 與可在(公開)資料庫中獲得的核苷酸及/或胺基酸序列相比 較。用於比較目的的序列排比之方法為在技術領域中已熟 © 知的。典型地借助程式(像是由Altschul等人,1990描述的 NCBI Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)進行此比 較。可從數個來源(包括國家生物學資訊中心(Nati〇nai
Center for Biological Information, NCBI,Bethesa Md.))以 及在網際網路(HTTP://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上獲 得該程式。該程式比較經鑑認的cDNA/EST(經表現序列標 籤(Expressed Sequence Tags))序列與出現在資料庫中的序 列,並基於某些分數和或然率參數提交結果。此程式可選 11 200948969 出該等具有該或然率參數之某個預定下限的cdna/est序 列曰然後在第二個步驟中,經選出之cDna/est序列隨標 註提供(即連結到出現在資料庫中的序列)。這類標註稱為 「電子標註,。 眾類 ❹ ‘詞意指透過二或多個核苷酸序列的 =對比較並根據短段或長段相同或類似核苷酸的存在挑 l建立群具有類似性之序列的聚集。數個用於排比核 苷酸序列的方法為在技術領域中已,且在下文中會進 一步解釋。有時術語「裝配」或「排比」制作為同義字。 鑑認子(identifier):可加在連接物或引子上或納入其序 列中或否則用作為標記以提供獨特的鐘認子的短序列。這 類序列鑑認子可為獨特的驗基序列,其具有多變但經界定 的獨特地用來鐘認特定的核酸樣本的長度。例如,卿標藏 允許4(指數4)=256個不同的標藏。典型的實例為ζιρ序列, =在技術領域中已知為經常用於藉著雜交而獨特谓測的標 籤⑽n_ 專人 Cyt〇metry 39:131_14〇, 2〇〇〇)。使用如此鑑 〇 ^子,可在進-步加工後敎PCR樣本㈣源。在結合起 源自^同核酸樣本之經加工產物的情況下,通常使用不同 的鐘涊子鑑認不同的核酸樣本。 定序··定序-詞意指測定在核酸樣本(例如觀 T酸的順序(驗基序列)β高通量筛選(經 成) 為特別與生物學和化學領域有關之科學實驗的方法。透過) 現代自動技#和其他專門實驗室硬體的組合, 有效地同時辉選大*的樣本,更明確地說,此為定·序研:街者 12 200948969 如在本文中其他地方揭示的(來自454 Life Sciences, www.454.com 和 Illumina,www.illumina.cQmV ^ iuumina ' S〇lexa定序法依賴將隨機片段化的基因組DNA附接到平 - 面、光學透明的表面以及固相擴增以創造具有>1千萬叢簇 的超高密度定序流槽孔,其各含有每平方公分大約1〇〇〇個 模板副本。此等模板係使用強健的四色DNA藉合成定序技 術(robust four-color DNA sequencmg-by-synthesis technology) 定序,此技術使用帶有可移除螢光的可逆性終止子。該方 法確保高精確性,並避免具有同元聚合性重複的人工製 品。高敏感性螢光偵測係使用雷射激發和總内部反射光學 . 達成。 • 限制核酸内切酶:限制核酸内切酶或限制酵素是辨識 在雙股DNA分子中特定核苦酸序列(目標位置)的酵素,並 會在每個目標位置處或在其附近剪切dna分子的兩股。 限制片段.藉著以限制核酸内切酶消化而產生的DNa ❿刀子稱為限制片奴。任何給定的基因組(或核酸,無論其來 源)均會被特殊的限制核酸内切酶消化成一系列不連續的限 制片段。由F艮制核酸内切酶剪切產生的DNA片段可進一步 用在各種技術中,並可藉著例如凝膠電泳侦測。 連接:藉著連接酶酵素催化的酵素反應(其令兩個雙股 職分子被共價連接在-起)稱為連接。通常,兩DNA股 被共價連接在-起,但亦可能透過兩股之一股之一端的化 學或酵素修改防止該股& $ 丄 _ 版的連接。在那個情況下,共價連接 會只發生在兩DNA股之一中。 、 13 200948969 合成的寡核苷酸:的單股DNA分子(較佳是從大約j〇 到大約5 0個鹼基其可化學地合成)稱為合成的寡核苷酸。通 常,將些合成的DNA分子設計成具有獨特或想要的核苷 · 酸序列,雖然也可能合成具有相關序列的分子的家族且其 在核苷酸序列内的特定位置處具有不同的核苷酸組份◦術 語合成的寡核苷酸會用以稱呼具有經設計或想要之核苷酸 序列的DNA分子。 連接物:具有有限數目的鹼基對(例如長度大約丨〇到大 約30個鹼基對)的短的雙股DNA分子,其等經過設計而得 0 以將其等連接到限制片段的末端。連接物通常由兩個合成 的募核苷酸構成,其等具有彼此部分互補的核苷酸序列。 田在/合液中在適當條件下混合兩個合成的寡核苷酸時,其 等會彼此煉合形成雙股的結構。在煉合之後,設計連接物 -分子的一端,使該端得以與限制片段的末端相容,並可與 其連接;可設計連接物的另一端,使該端不能連接,但此 為非必須(經雙重連接的連接物)。 經連接連接物之限制片段:已經藉著連接物加帽的限 〇 制片段。 弓I子.通常’引子一詞意指DNA股,其可引發DNA 的合成。DNA聚合酶沒有引子就不能重新合成Dna :其只 能在其中使用互補股作為模板以指揮欲裝配之核苷酸順序 的反應中’延伸已存在的DNA股。吾人會把用在聚合酶連 鎖反應(p〇lymerase chain reacti〇n,PCR)中的合成寡核苷酸 14 200948969 DNA擴增:d>ja媳描 PCR ^ ^ μ 擴、一詞會被典型地用以表示使用 P C R次相虽的擴增系站*山 ㈢系統在喊管内合成雙股DNA分子。注意 到存有其他的擴增方法, 、 並可將此等擴增方法用在本發明 I。本發明之方法原則上可藉著使則壬何核酸擴增方法進 仃士聚口酶連鎖反應(PCR ; MulHs 1987,美國專利第 別3,202號和4,8G(),159號)或藉著使用諸如 連接酶連鎖反應(Ligase Chain Reaeti〇n,LCR;如辦 1991, ❹ ❹
Proc_ Natl. Acad. Sci. USA 88:1 89_193 ;歐洲申請案第 320,308號)、自我維持性序列複製(Self_Sustained
Replication, 3SR; Guatelli f A, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、股置換擴增(Strand Displacement Amplification,SDA;美國專利第 5,27〇,184 號和 5,455,166 號)、轉錄擴增系統(Transcriptional Amplification System, TAS ,Kwoh 等人,proc Natl. Acad. Sci· USA 86:1 1 73-1 177) 、Q-冷複製酶(Lizardi 等人,1988, Bio/Technology 6:1197)、滾環擴增(R〇iung Circle Amplification,RCA ;美國專利第5,871,921)、基於核酸序 列的擴增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NAS BA)、裂解酶(cl eavase)片段長度多形性(美國專利第 5,719,028號)、等溫和嵌合型引子起始性核酸擴増 (Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid , ICAN)、 分歧-延伸擴增方法 (Ramification-extension Amplification Method, RAM ;美國 專利第5,719,028號和5,942,391)的擴增反應進行,或其他 15 200948969 適合的DNA擴增方法進行。為了擴增對一或多個擴增弓I子, 有小數目配錯的舰,可在降低嚴格度的條件下進行擴辦 反應,使用38t之煉合溫度,或在35mMMgcl2存在4 的PCR擴增)。熟習此項技術者能夠選擇具有適當嚴格 條件。 . 抛光(亦稱為末端修補)意指將具有非純端之dna轉變 為具有鈍端之DNA 〇 在的存在下利用DNA酶】拋光消化基因組, DNA(gDNA)模板會產生具有純端或具有突出末端(長度為❹ -或兩個核普酸)的DNA片段。同樣地,藉著機械方法片段 化DNA會提供具有鈍端或突出端之片段的組合。無論是以 酵素或機械方式產生,這些DNA片段,均可使用下述的程. 序「拋光j 。 - 在方法中,拋光可藉著以單股專一性外切核酸酶(如 BAL32核酸酶或綠豆核酸酶)處理3,_突出片段進行。通 常,核酸酶應該在使用之前先校準。 在另一方法中,鈍端係利用pfu DNA聚合酶或利用其 ❹ 他的DNA聚合酶(如T4 DNA聚合酶或Klen〇w dna聚合酶) 創造。可使用「拋光」或鈍化末端的pfu以增加在利用dna 酶I消化基因組模板之後所產生之具有鈍端物種的量。pfu DNA聚合酶填滿5’突出。此外,pfu DNA聚合酶展現3, 至5外切核酸酶活性。因此,該酵素可用以移除單和雙核 苷酸延伸以進一步增加可用於連接物連接的具有鈍端dna 片段的量(參見,例如Costa,G丄和Μ ρ· Weiner,1994,選 16 200948969 殖和分析具有鈍端之經PCR產生之DNA片段的方案 (Protocols for cloning and analysis of blund-ended PCR-generated DNA fragments) ° PCR Methods Appl 3(5): S95 ; Costa, G.L.、A. Grafsky ❹ ❹ 和分析經PCR產生之DNA片段(Cloning and analysis of PCR-generated DNA fragments)。 PCR Methods Appl 3(6): 338 ; Costa,G.L.和 M_P. Weiner, 1994,以 T4 或 Pfu 聚合酶 拋光,增加了選殖PCR產物的效率(p〇iishing with T4 or Pfu polymerase increases the efficiency of cloning of PCRproducts)。Nucleic Acid Res. 22(12):2423)。 本發明之發明人已經發現藉著提供基因組D N a並藉著 使用經連接連接物之CDNA衍生的片段以作為擴增基心:美片因段Λ引子,似乎有可能偵測到在實際上經轉錄區域 卜的基因組序列,即啟動子、内含子和終止子序列 此結合迅速鑑認在基因 ,、口 的可能性中多個^ ㈣心⑽a片段 υ、τ多個樣本可在單一反庫中 區域周圍之基因組膽A片段的可能2 ^研究這些段、内含子片段和涵p 及在基因編碼片 變異的可能性。 周即基因組序列之片段中 更進一步的優點是本發明 適用於所有生物。事前 去疋H遍可應用的,即 資訊。另-優點”士而要任何基因組或基因❸且”的 使定序“發明的方法中不需要、壁 使疋序編竭毒性物質或 不$要選殖步驟。這 則是不可能的,因基“.蛋質的序列成為可能,此否 偵測遺傳 因為其φ上 传°'^能,此否、如此序列會被選殖#罝並表現的宿主 17 200948969 生物會不能或不易存活 選殖時會產生問題的序 可能在選殖排程中產生 同樣的道理,現在亦可處理會在 列且不梵限於序列的長度,其亦 問題。 更進一步的優點是本發明的方法不需要全長的 cD=,但可使用較短的序列。這在分析大型 自球莖植物)時是特別有料,因為接著可保持聚隹在^ 組之最受關注或相關的區域 …、土 的方法可產生用於所有經表現之 1负、生表現之DNA序列的引子,這竟味
可能從經表現之序列獲得基因組數據。 〜、 【實施方式】 在一方面,本發明係關於鑑認在樣本中之基因組DNA ' 的方法’其包括4個不同的部分。 - 第1部分: 在此部分中,從cDNA產製小型序列,該序列在第3 部分中會用來作為引發序列。本部分由下列步驟組成:
a) 從生物之組織樣本分離並純化mRNA ; Q b) 使用該mRNA作為模板,合成cDNA ; c) 可視需要簡化該cDNA的複雜度; d) 片段化該cDNA ; e) 可視需要以尺寸挑選該片段; f) 可視需要藉著與(經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈之)親和 力珠子結合,移除含有聚A的片段; g) 拋光該cDNA的片段; 18 200948969 限制酵素之辨識位置的 連接物連接; h)將該片段與第一個包括罕見 連接物和帛ϋ固含有生物素標記的 0可視需要以尺寸挑選該片段 j)修補該片段的缺口; k) 選擇含有兩種連接物序列的該片段; l) 使用與在步驟h中描述之連接 該片段;固引子盘且古 序列煉合的引子擴增 ❹ 另-個引子則含有生物素標記;*之連接物互補,而 m) 使該片段與經鏈黴菌抗生 子結合; 机主物素蛋白塗佈的親和力珠 二使用相對應限制酵素,自該片段移除含有罕見限制位 置之連接物; 從與親和力珠子附接的雙股DNA片段移除未藉著生 物素铺菌抗生物素蛋白交互作用與親和力珠子附接的單 股。 響 A步驟產生了與鏈黴菌抗生物素蛋白親和力珠子結合 的單股DNA ; 第2部分: P)分離並純化基因組DNA,例如從步驟a)之生物; q) 片段化該基因組DNA ; r) 可視需要拋光該基因組dnA ; s) 使該基因組DNA與一個單一類型的連接物或與兩個 不同類型的連接物(較佳)連接; t) 將該基因組DNA解鏈成單股DNa 19 200948969 第3部分: u)使得自步D之基因,组驗與得自 的cDNA雜交; V)藉著洗滌移除未結合的基因組DNA ; 雙股=著聚合酶延伸eDNA·基因組爾雜交產物以創造 X)對該基因組DNA_cDNA雜交產物進行pcR; ❹ y)藉者尺寸分級分離,從該PCR中挑選超過大約剛 個驗基對的片段; Z)可視需要純化該片段 第4部分: ㈣使用在步驟Z)中獲得的,根據製造商高通量定 序。 此外,當業已測定基因組DNA之序列時,可跟著進行 一步驟以鑑認在二或多個樣本之序列中的改變:ab)比較二 或多個樣本的數據,以鑑認多形性。 藉著以此方式處理樣本核酸,有可能在沒有任何關於 〇 生物基因組之結構或内容物的資訊下,可再現地分析該生 物的基因組區(涵蓋基因編碼和關連區)。當定序方案允許連 接物帶有鍟認子時,可在單一的定序反應中混合多個樣本。 該方法始於從生物分離並純化mRNA之樣本。以此方 式獲得mRNA的樣本是現今的例行程序。 同樣地,對下一個步驟,其中_藉著酵素逆轉錄酶的幫 助-DNA副本(即cDNA)係從在樣本中的RNA來製造。該 20 200948969 CDNA包括爾從其中衍生之細胞的轉錄譜,代表在取得 樣本時已經轉錄的全部遺傳資訊。因此,依據該細胞的類 型、從其中該細胞被衍生的組織、該細胞的年齡、該細胞 之發育階段和環境條件,相同生物每個細胞的轉錄譜都會 疋不冋的,且甚至來自相同的細胞’當在不同時間及/或不 同條件下採樣時,會獲得不同的轉錄譜。在原始樣本中的
核酸通常會是mRNA之形m,衍生自其他來源的RNA ❹ ❹ 或DNA亦可能是有用的,如衍生自基因庫的舰或職。 在樣本中的核酸可為雙股、單股的,並將雙股DNA變性成 為單股魏。樣本可來自任何生物’無論是植物、動物、 合成的或人類。應了解若獲得DNA樣本,便不需要逆轉錄 酶反應。 由於樣本(若其衍生自完整細胞mRNA)含有全部的轉 錄譜,有時會想要僅取用它的亞組。這可以數個方式達成·· 一種可能的方式是以eDNA的尺寸區別,例如藉著超高速 離心。該方法的基本原理稱為複雜度簡化。複雜度簡化的 其他選擇為例如選擇豐富或不豐富的轉錄本的雜交方法, 或例如捕捉特定轉錄本以從CDNA分子池移除其等或選擇 其等以用於進一步分析的方法,或例如藉著限制消化創造 cDNA分子池的亞組的像cDNA AFLp的方法。 一旦獲得想要的cDNA樣本,便將cDNA片段化,其可 以酵素或機械方式進行。以至少一個限制核酸内切酶消化 核酸樣本提供-組限制片段。在某些具體態樣中,可使用 二或多個核酸内切酶以獲得限制片段。核酸内切酶可以是 21 200948969 頻繁切割者(3·5個鹼基對的辨識序列,如Msel)或稀疏切割 者(>5個鹼基對的辨識序列,如Ec〇RI) ^在某些較佳的具體 態樣中,稀疏和頻繁切割者之組合是較佳的。在某些具體 態樣中,特別是在樣本含有或衍生自相對上較大的基因組 時,使用第二個酵素(稀疏或頻繁切割者)以獲得較大組的具 有較短尺寸之限制片段可能是較佳的。 作為限制核酸内切酶,任何核酸内切酶會足夠。典型 地,第ϋ型核酸内切酶是較佳的,如Ec〇RI、Msd、psu等 ❹ 等。在某些具體態樣中,可使用第Π型核酸内切酶,即其 辨識序列遠離限制位置的核酸内切酶,即像是Aceni 了 Bbv卜 BbvII、Bbsi、㈣、細如、以⑷、_、Bim、㈣、
Bsg 卜 BsmAI、Bsmn、BspMI、Esp3I、—卜 F〇k卜 、
Hga卜 Mb〇II、Mmel' MnII、Sap卜奶犯、Taqji 與 z⑽出。 可藉著剪切cDNA進行機械片段化,纟中剪切的強度 和期間決定了片段化的量。一種這類剪切方法是霧化。霧
’疋j 塑料裝置’其使用壓縮空氣以霧化液體。很 容易其等改裝以用於剪士刀DNA,極為有效並用法簡便 (Surzycki, S. 2000, Basic Methods in Molecular Biology, ΝΥγ SPnnger Verlag)。其等可從不同來源購買(例如
Invitrogen Corporation)。
可視需要藉著尺寸挑選,再廑料斗 、 丹度間化该經片段化之DNA 的複雜度。可藉著以尺寸挑選Η p , ^ 、 丁挑選片奴(例如藉著電泳)獲得視需 要的複雜度簡化。此外,或另外 ^ t 飞乃外可藉著與經鏈黴菌抗生 物素蛋白塗佈的親和力管柱結合而移除聚A片段。 22 200948969 在該方法的下一個步驟中,使cDNA片段具有純端, 亦稱為「拋光」的過程。插人抛光係、用以從限制酵素產生 #>PC:R'產生之DNA片段或經剪切的DNA片段移除3’突 出核芽酸或填滿5, φ φ妨 it J6A -Γ m , 5犬出核苷酸。可貝到拋光用的套組(例 如 QU1Ck 鈍化套組,New England Biolabs Inc.)。
、在本發明方法的下-個步射,透過連接反應提供具 有連接物# cDNA片段。在此反應中將兩個不同類型的連 接物連㈣eDNA片段的混合物。—個連接物帶有生物素 標記。另-個連接物含有第立型限制酵素的限制位置,該 限制酵素t切其辨識序列外面的位置。該酵素之實例是 SaPI,㈣識GCTCTTC麗應相。輯素$切序 列’在5’端留下NNN突出物。以此方式可自該片段移除 含有限制辨識序列的完整連接物序列。报重要,應使用為 稀疏切割者的酵素以避免因為在片段_中較頻繁地出現 辨識序列而縮短該片段。 再次,在此階段,可視需要依據片段的尺寸藉著例如 電泳選擇其等。 在連接連接物和片段之後,修補該片段之缺口,以填 滿在DNA主鍵中任何可能因連接物之連接而產生的間隙。、 可如在由M· Margulies等人在Nature 437,第376_3的 頁,2005發表之附圖!中(圖3)所描述者,選擇僅含有兩種 連接物的片段。然後可擴增含有兩種連接物的片段。在該 步驟中U用與互補連接物序列之一煉合的引子組合攜帶 生物素分子(其與另一個互補連接物序列煉合)的引子D,進行 23 200948969 PCR擴增反應。在使用這組引子進行擴增步驟之後,可在 - 鍵徽涵抗生物素蛋白親和力珠子上捕捉經擴增之雙股Dna 片段,同時從該反應混合物移除其他的反應產物。 在下一個步驟中,以不對稱的核酸内切酶處理在其等 5 ’和3 ’端具有不同連接物序列的經結合dnA月段,該酵 素以從片段一端移除完整連接物序列的方式剪切該片段, 如同猶早所描述的,因此提供了與基因組DNA完美互補的 一偭片段末端。在該限制步驟之後,藉著在鹼性條件下從 珠子中沖提而移除自由單股形式的片段,產生了一組與鏈 ❹ 黴菌抗生物素蛋白珠子結合的單股核酸片段。另一種從雙 股片段中產生單股片段的方法是利用λ外切核酸酶酵素處 理。λ外切核酸酶從雙股DNA分子中降解具有經磷酸化5, 末端者,留下完整的具有5’ 〇Η末端的單股。因為片段的 · 5 ’端之一是藉著與鏈黴菌抗生物素蛋白結合的生物素標 記保護’故以λ外切核酸酶處理亦產生與鏈黴菌抗生物素 蛋白珠子結合的單股DNA片段。這些單股DNA片段會在 之後的步驟中使用。 〇 在上述步驟之後,在第二部分中從生物分離基因組 DNA。β亥生物可以是與從其中被分離者相同的(在相 同或不同的條件下培養),或其可以是不同的生物(不同品 系 '不同物種)’且其甚至可以是基因組DNA的聚集(例如 BAC殖系庫)。分離基因組DNA的程序在該領域中是標準 的,並在例如以下者中描述:Ausubel等人(從植物組織中 製備基因組 DNA(Preparation of genomic DNA from plant 24 200948969 ⑴獄).第2.3.】.2.3.7頁,在細⑽等人,編輯分子生 物干的最新方案(curreiu Proi〇c〇Js in M〇lecular 肠⑽乂) J〇hn Wl〗ey & Sons,he. BudeHer. 1993)。在分離之後,按 照上述,藉著酵素或機械片段化程序片段化該基因組 DNA。若使用限制酵素消化,所得之片段係以具有與在該 月段末端之不同限制位置突出物相配的連接物而提供。與 基因組DNA片段附接的連接物分子具有與第^部分之經 cDNA衍生片段附接的連接物分子不同的序列。 若使用機械片段化,將不同的連接物連接到基因組 DNA片段’並根據先前對於cDNA片段描述的程序⑽如可 應用搬光步驟)選擇在5’和3’末端具有不同連接物的片 段。 或者,也可將一個單一的連接物連接至該基因組片 段。在那個情況下’帶有銷柄的連接物序列可用以防止在 之後步驟中的非專一性擴增(D H J〇nes和s c如, PCR Methods Appl. 1993 2:197-203)。 可視需要按照上述以尺寸挑選經片段化之基因組dna 片段。 為獲得單股基因組DNA片段,提供解鏈步驟。 在如此提供經片段化基因組單股DNA的適當樣本之 後’將得自第i部分的單股cDNA片段(其攜帶具有生物素 標記之單一連接物分子,該生物素標記可視需要與鏈黴菌 抗生物素蛋白親和力珠子結合)混合,較佳以莫耳過量,以 與帶有不同連接物分子之經片段化基因組dna(第3部分) 25 200948969
雜交。在變性步驟之後, 物雙股基因組DNA-eDNA 應用煉合條件以允許形成雜交產 分子。 细箱2程序可包㈣用未Μ段化GDNA(無連接物)的短 '口^藉著降低衍生自豐富轉錄本之較高濃度CD· 又的景少響,仏準化雜交反應。作為可視需要之修改, Cot 1 DNA可用在預煉合步驟中,以降低因在基因組ο· 中之序列重覆所引起的可能異常。
在該步驟中,CDNA片段會在與所採樣之mRNA同源或 相同的地方,煉合基因組dna。 在藉著聚合酶延伸eDNA_基因組舰雜交產物之後 製造出雙股模板。 現在可藉著PCR反應,使用一個與cDNA連接物互補 的引子和另一個與基因组dna連接物之一互補的引子,而 擴增經煉合之雙股片段。可視f要將經煉合之材料分成不 同的兩份,以亦使用cDNA連接物和另一個與基因组DNA 連接物互補的引子。該擴增提供了 PCR片段,其不僅含有 原始採樣核酸之基因組DNA相對應部分的副本,還含有未 經轉錄之序列,如調節序列和内含子。 在PCR擴增之後,透過尺寸分級分離選出具有超過_ 個鹼基對的片段,較佳的是超過大約2〇〇個鹼基對,甚至 佳的是超過大約300個鹼基對,且最佳的是大約4〇〇個鹼 基對或更多的片段。可視需要,根據符合本發明方法下一 個步驟的需求’純化這些片段。 在下一個部分中(第4部分)定序該片段。經擴增之經連 26 200948969 接連接物片段的定序,至少對經連接連接物之片段和位在 3側之基因組序列的部分提供了序列資訊。在經連接物衍 生之部分中所含有的資訊,包含有關從其中獲得該片段之 樣本的資訊(若連接物帶有樣本專一性標籤),而得自該片段 本身(鑑認子序列)的序列資訊則提供了有關該片段的資
訊,並允許鑑認該片段。此在片段上之序列資訊可用以鑑 涊片段,而其準確性視經測定之核苷酸的數目和在經擴增 之經連接連接物片段組中的片段數目而定。 為對在樣本之間在轉錄本頻率上的採樣變異的問題 (其影響藉著定序一組多個片段所含者而鑑認分子標記的 準確性)提供解決,本發明之發明人已經發現經由定序來 偵測標記,較佳的是充分過剩地(深度)採樣所有的片段至少 一次,並伴隨著解決有關所唤起之基因型準確性的採樣變 異的問題的統計方法來進行。為了增加準確性,較佳的是 擴增步驟進行定序步驟。在㈣的擴增循環之後,㈣增 經連接連接物之限制片段的過剩至少$ 6,較佳的是至少 7’更佳岐至少8,且最佳的是至少9。因此,在較佳的 具體態樣中,測定每個經連接連接物之限制片段的序列至 少6倍,較佳的是至少7倍,更佳的是至少8倍,且最佳 的是至少9倍。在某些具體態樣中,選擇過剩(假定整體 有50/50機會正確地鏗認位點為同形合子的)以使正確鐘認 位點的機會超過95%、96%、97%、98%、99%、%作。 經連接連接物之限制片段的擴增導致一組。 連接連接物的限制片段,有時稱之為擴增區(ampn叫、。 27 200948969 使擴增區(或其至少一部分)接受至少包括測定樣本專一鑑 - 認子之序列的步驟,以測定該片段和該限制片段之序列之 部分的起源。實際上此亦等於測定位在像是限制核酸内切 酶之辨識序列的殘餘部分之間的部分。藉著定序樣本專一 性鑑認子以及位置與經連接物衍生之序列相鄰的部分片 - 段,有可能獨特地鑑認出限制片段及其等3,侧基因組序 列。從該資訊中有可能恢復完整基因的基因組遺傳資訊。 在本發明中使用的高通量定序是一種用於科學實驗 (尤其是有關於生物學和化學領域)的方法。 ❹ 較佳的是’使用高通量定序法進行定序,如在以下者 中所揭示:WO 03/004690、W0 03/054142、w〇 2004/069849、W0 2004/070005 ' WO 2004/070007、與 WO ' 2005/003375 (全部以 454 Life Sciences 之名義)、以〇 等人-(2004) Proc. Natl. Acad. Sci USA 1〇1:5488 93,以及
Helios、Solexa、US Genomics、等等的技術,其等係以引 用方式納入本文中。 所描述之技術允許在單一行程中定序4千萬個鹼基, 〇 並比競爭性技術快且便宜100倍。定序技術大略由5個步 驟,.且成.1)片/又化DNA並連接專一連接物,以創造單股 DNA(ssDNA)庫,2)煉合ssDNA與珠子,在油包水微型反應 器中乳化珠子,並進行乳劑PCR以擴增在珠子上個別的 ssDNA刀子,3)挑選或富集在其表面上含有經擴增ssDNA 分子的珠子,4)使攜帶DNA的珠子沉降在pic〇Titer™盤 中,並5)藉著產生焦磷酸根光信號,在1〇〇,〇〇〇個槽孔中同 28 200948969 時定序。在下文中會更詳細地解釋該方法。 在此一方面,下列的計算可作為例證:如同在本文其 .他地方描述的Hina Solexa之定序技術,對大約每25bp 提供4〇.000.000次判讀,在單一行程中總計交錯10億bp。 假定知樣過剩1〇倍,可在—個行程中評估4.麵謂個獨 特的片&。結合100個樣本,允許對每個樣本定彳4〇 〇⑽ 個片段。 I較佳的具體態樣中,定序包括下列步驟:⑷將經修 改之片U合至珠子’每個珠子煉合_個經修改之片段;⑻ 在油包水微型反應器中乳化珠子,每個油包水微型反應器 包括—個珠子;⑷將珠子裝㈣槽孔中,每個槽孔包括-• 個珠子;並產生焦磷酸根信號。 在第一個步驟⑷中,將定序連接物連接到組合庫内的 片段。該定序連接物包括至少—個用以煉合珠子的「關鍵」 區、定序引子區和PCR引子區。如此,獲得經修改之片段。 〇在第-個步財,冑經修改之片段煉合到珠子,每個珠子 與-個經修改片段煉合。在經修改之片段池中加入過量的 珠子,以確保對於大多數的珠子而言,每個珠子煉合一個 經修改片段(帕松(Poisson)分布)。在下一個步驟中,在油包 水微型反應器中乳化珠子,每個油包水微型反應器包括一 個料。存在油包水微型反應器中的pcR試劑允許在微型 反應器中發生PCR反應。隨後,打破微型反應器,並富集 包含DNA的珠子(DNA陽性珠子)。 在接下來的步驟中,將珠子裝栽到槽孔中,每槽孔包 29 200948969 括一個珠子。較佳的是該槽孔為允許同時定序大量片段之 PicoTiter™盤的一部分。在加入攜帶酵素的珠子之後,使用 焦定序(pyrosequencing)測定片段的序列。在後續的步驟 中,使PicoTiter™盤以及在其中的珠子和酵素珠子,在習 知定序試劑的存在下接受不同的去氧核醣核苷酸,並記錄 在併入去氧核醣核苷酸後產生的光信號。併入正確的核苷 酸會產生可偵測的焦定序信號。 焦定序本身為在技術領域中已知的,並特別被描述在 www.biotagebio.com ; www.pyrosequencing.com/切片技術 上。該技術被進一步應用在例如以下者:W0 03/004690、 W0 03/054142、W0 2004/069849、WO 2004/070005 ' W0 2004/070007、與 W0 2005/003 3 75 (全部以 454 Life Sciences 之名義)。在本發明中,珠子較佳裝有能夠結合擴增區的引 子(結合)序列或其一部分,視情況而定。在其他的具體態樣 中,擴增時使用的引子(例如在其5’ -端)裝有允許擴增區與 珠子結合的序列,以在定序之後允許後續的乳劑聚合化。 或者,可在連接至珠子或表面之前先將擴增區與定序連接 物連接。經定序之擴增區會揭露鑑認子的身分,並因此揭 露在樣本中有或沒有限制片段。
Illumina-Solexa 技術 一種高通量定序方法可從 Illumina, 英國 (www.illumina.co.uk)獲得,並特別在以下中描述: W00006770、W00027521 ' W00058507、W00123610、 WO0157248 ' WO0157249、W002061127、W003016565、 200948969 WO03048387 、 W02004018497 > W02004018493 、 W02004050915 、W02004076692 、W02005021786 、 . W02005047301 、 W02005065814 、 W02005068656 、 W02005068089與W02005078130。基本上,該方法以基因 組DNA的經連接連接物之片段開始。將經連接連接物之 DN A隨機附接至引子的密坪(dense lawn )上,其附接在固 體表面,典型地在流動槽孔中。經連接連接物之片段的另 一端與在表面上互補的引子雜交。在所謂的固相橋擴增 〇 中,在核苷酸和聚合酶的存在下延伸該引子以提供雙股片 段。該固相橋擴增可以是選擇性擴增。 - 固相橋擴增的變性和重複產生分布在整個表面上的經 擴增片段之緊密叢簇。藉著將四個以不同方式標示之可逆 終止子核苷酸、引子和聚合酶加至流動槽孔中開始定序。 在第一回合的引子延伸之後,偵測該標記,記錄第一次所 併入之鹼基的身分’並阻斷3’末端,然後從經併入之鹼基 移除螢光團。然後以相同之方式測定第二個鹼基的身分, 胃並以相同方式繼續定序。 在本發明中’使經連接連接物之限制片段或擴增區經 由引子結合序列或引子序列與表面結合。根據概述測定該 序列’包括鑑認子序列和限制片段。目前可得的Solexa技 術允許定序大約3 0個鹼基對的片段。藉著連接物和表面結 合引子的聰明設計’定序步驟讀透樣本鑑認子與限制核酸 内切酶所使用之辨識序列的剩餘部分。例如,當使用3bp 的樣本鑑認子並存在稀疏切割者EcoRI的剩餘部分 31 200948969 AACCT)時’可使用7bp之限制片段的内部序列以獨特地 鑑過在樣本中之限制片段。在基於以上nlumina_solex 序技術的較佳具體態樣中,利用在其3,端含有最多一 擇性核《,較佳的是在其3,毅有選擇性核㈣的引 子’即該引子僅與連接物互補㈣引子),進行經連接 物之限制片段的擴增。
在針對本文㈣之定序方法之可供選擇的具體態樣 中,在擴增時使用的引子可含有用在後續之定序步驟中以 使經連接物加帽之限制片段或擴增區與表面結合的特殊部 分(作為本文描述之引子或引子結合序列的另一選擇)。通常 將此部分描述為關鍵區或5’ ·引子可相容的序列。
在本發明之一具體態樣中,核酸樣本係以至少一個限 制酵素消化並連接至少-個連接物(其包括第Η限制核酸 内切酶之辨識序列w遺後利用第π龍制核酸内切酶消化 經連接連接物之限制m以因為在第n型料之辨識和 限制位置之間的距離是相對上較短的(最多大約3〇個核苷 酸)’產生較短和較長的限制片段,而第n型限制位置之可 相容連接物可與其連接。典型地,第π型限制位置的突出 物是未知的,以致於可使用一組連接物,其在突出物中被 簡併。在(選擇性)擴增之後,可定序擴增區。通常可將在此 具體態樣令的連接物序列敘述成:5,_引子結合位置-樣本 鐘認子序列-簡併第Π型黏性末端序列_3’ 。經相關pcR引 子通常如下:引子序列-樣本鑑認子序列_簡併第n型黏性末 端·選擇性核苷酸-3,。然後用以發動藉合成定序的引子 32 200948969 通常具有結構:5,_引;社人〜w 与丨子、、、。π位置_3,。尺寸挑選步驟在以 Π酵素消化之後可能县缸^土 & 此疋較佳的,以移除較小的片段。因為 •在此具體態樣中對於此類型酵素之限制位置的剩餘部分典 ^也疋2 4t>P的等級,此組合6bp樣本鑑認子造成15_17bp 之限制片段的定序中。 ,因此,本發明之方法完全適合在沒有關於該細胞及/或 從其中該細胞破衍生之生物的任何最初之序列資訊或先前 的遺傳知識下,鑑認屬於細胞或生物的轉錄譜之基因的調 節基因組序列。因此,可根據本方法鑑認經表現基因的啟 動子區、前導序列和其他5,UTR區、内含子和外顯子、3, • TR彳列和終止序列。因為不涉及選殖步驟,亦可能測定 在選殖步驟中引起問題的基因之基因組序列,例如對宿主 生物有毒的基因、編碼調節蛋白質的基因及/或否則在選殖 時引起問題的基因。 而且,有可能基於該資訊直接分析與經表現基因之對 ❹偶基因有關的所有多形性(包括SNp),無論這些多形性出現 在基因的編碼序列或在非編碼序列中。因此,可能偵測出 在引起基因表現調節之啟動子序列中的異常,也有可能偵 測出在内含子中有可引起不同的剪接變體的多形性的突變 種,等等。 為了增加對經定序核酸序列和在其中發現之差異的正 確解釋,可對經定序片段或片段重疊群(contig)進行自動 標註。 Π樣地了使用所獲付的序列資訊比較序列與得自e s τ 33 200948969 庫的序列。以此方式可鑑認内含子序列或基因内部的非編 — 碼序列,以及啟動子序列和3,與5,UTR°EST庫可取自 相同生物或取自相關之物種。 在另外的方面中,本發明係關於可進行本發明之方法 的套組。除了擴增套組本身的習知組份(像是dNTP、聚合酶 等等)之外’這類套組可包括一或多種連接物與可視需要的 一或多種與該連接物互補的引子、連接酶、及/或專一剪切 該連接物的限制酵素。而且,套組應該提供使用說明書, 其中有實行本發明之方法的操作指南》 ❹ 此外’本發明發現該方法可應用於鑑認分子標記、定 出基因型、大量隔離分析、基因作圖、標記輔助性回交 (marker-assisted back-crossing)、定量性特性位點的作圖、 連鎖不平衡作圖(linkage disequilibrium mapping)、和測定 甲基化圖形等等上。 實施例 cDNA程序 分離RNA並合成cdna ❹ 依據Chang等人(1993)的方法,從蘋果果實(建志蘋 果 Malus X domestica,cultivar Kanzi))的表皮分離總 RNA。蘋果衍生自4個不同的果園,並在$個不同的時間 點(從2007年8月初到9月底)摘採。將等量的得自此20 個樣本之總RNA集合成一個樣本,並根據製造者的說明 書’以 RNeasy Plus Micro 套組(qIAGEN,Hilden,Ge_ny, 74034)純化,以移除基因組DNA污染。 34 200948969 利用2微克總RNA作為輸入物,根據製造者的說明書 使用 Mint cDNA 合成套組(Evrogen,Moscow, Russia, SK001) . 進行第一股cDNA合成。使用Mint cDNA合成套組最適宜 的1 8次循環,進行藉由PCR擴增的雙股(ds)cDNA合成。 使用(^1人91141^?€1^純化管柱((^1人〇£1^,28104)純化所得的 ds cDNA,並以分光光度計測量濃度。在1 %瓊脂糖凝膠上 分析 cDNA。ds cDNA 範圍從 200 到 2000bp。 cDNA純化、0酸化、序連(concatenation)和霧化 ❿ 使用 Quick BluntingTM 套組(New England Biolabs,
Ipswich, MA, USA, E1201S)鈍化並磷酸化 ds cDNA。將 38 . 微升cDNA(8微克)與5微升lOx鈍化緩衝溶液、5微升ImM 去氧核醋核苦酸溶液混合物(Deoxynucleotide Solution Mix) 和2微升純化酵素混合物(Blunting Enzyme Mix)混合,並在 室溫培養30分鐘,接著在70°C培養1 〇分鐘。 隨後,藉著將48微升此cDNA鈍化混合物與10微升 10xT4 DNA連接酶反應緩衝溶液、5微升T4 DNA連接酶(兩 者均得自 New England Biolabs, M0202S, 400,000 單位 / 毫 升)、25微升40%(重量/體積)聚乙二醇8000和12微升水混 合而將其序連。在室溫培養該連接混合物2小時,並藉著 瓊脂糖凝膠分析證實序連。藉著在65°C培養10分鐘使T4 連接酶失活。 藉著霧化剪切經序連之cDNA。將100微升cDNA連接 混合物與650微升霧化緩衝溶液(10mM Tris-HCl、ImM EDTA、50%甘油,pH8.0)混合,並吸移至霧化器(Invitrogen, 35 200948969
Paisley,UK, K7025-5)内。根據製造者的說明書,以48 psi 使用氮氣 5.0(Praxair,Danbury,CT,USA)進行霧化 15 分
鐘。在短暫離心霧化器之後’將所收集之經霧化cDNA移 至微量離心管,並藉著加入2微升肝糖(sigma_Aldrich,st. Louis,MO, USA,20毫克/毫升,G1767)、〇」份體積的— 乙酸鈉pH5.2和1份體積的異丙醇,並在_8〇〇c培養ι〇分鐘 使其沉澱。藉著以20,800g離心15分鐘,使cDNA形成小 球’以70%乙醇洗滌,乾燥並溶解於5〇微升i〇mM
Tris-HCl、IMm EDTA, ρΗ8·0 中。 測定cDNA尺寸和鈍化 在65°C培養經剪切之cDNA 10分鐘,加入凝膠裝載緩 衝溶液,並將cDNA分配到2%瓊脂糖凝膠(在Tris-醋酸鹽 (TAE)緩衝溶液中)的5個溝槽上(Sambrook等人,1989)。在 電泳之後,使用GenElute凝膠萃取套組(sigma_Aldrich, NA1111) ’從凝膠分離1〇〇_4〇〇bp的cDNA片段。在凝膠上 檢查經純化cDNA的少量樣本’並發現為低濃度。因此, 重複數次上述的cDNA鈍化、磷酸化、序連、霧化和凝膠 純化程序,利用Mint cDNA合成套組,總共獲得24微克 ds cDNA。藉著乙醇沉澱,並溶解於19微升分子生物學-等 級的水中,濃縮100-400bp的cDNA片段。 藉著與得自 Quick Blunting™ 套組(New England
Biolabs,E1201S)的2.5微升l〇x鈍化缓衝溶液、2 5微升 ImM去氧核醣核苷酸溶液混合物和1微升鈍化酵素混合物 混合,並在室溫培養3〇分鐘,接著在7(rc培養i〇分鐘, 200948969 鈍化並磷酸化經剪切 cDNA的磨損端。隨後,使用 MinElute®PCR 純化套組(QIAGEN,28004)純化 cDNA。 連接連接物和修補缺口 藉著煉合部分互補之募核苷酸ELTD-引子-C(5 ’ -AGTCCGTCGCATCGCTCTTC-3 ’ )和 ELTD-AdC2 (5 ’ -GAAGAGCGATGCGACG-3’ ),製備連接物 ELTD-AdC。 該連接物一邊是鈍端,並在另一邊具有4nt(AGTC)的5’ -突起物,以獲得與cDNA連接的方向性,並防止多個連接 ® 物與cDNA連接。ELTD-AdC連接物亦含有稀疏切割者SapI 限制位置:
GCTCTTCN/NNN CGAGAAGNNNN/ 該限制位置能夠在該方案之較晚步驟的期間,從cDNA 移除ELTD-AdC。藉著煉合部分互補之寡核苷酸ELTD-引子 -D(5’ -生物素-TEG-AGTGGGTGTCCTGGGTCAA C-3,)和 ELTD-AdD2(5’ -GTTGACCC AGGAC ACC-3 ’ ),製備連接 物ELTD-AdD。該連接物亦在一邊具有4nt(AGTG)的5’ -突起物,其經由四-乙二醇(TEG)間隔臂以生物素標示。該生 物素標記能夠在該方案之較晚步驟的期間,將cDNA固定 在經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈的珠子上。所有的寡核苷酸 均是從Sigma-Aldrich訂購,為經HPLC純化的,並溶解於 ImM Tris-HCn、O.lmM EDTA,pH8.0 中。藉著混合每個適 當的寡核苷酸(400uM)各50微升與1〇〇微升2x煉合緩衝溶 液(20mM Tris-HCl、l〇〇mM NaCl、2mM EDTA,ρΗ7·6), 37 200948969 在 95 °C 在加熱塊(thermoblock) (Thermomixer Compact, Eppendrof,Hamburg,Germany)中培養該混合物5分鐘,然 後關掉加熱塊,允許樣本内部慢慢地冷卻至30°C以下(花費 3小時),製備連接物。這產生1 OOuM濃度的雙股連接物 ELTD-AdC 和 ELTD-AdD。 在下列的反應中將兩個連接物連接到cDNA : 9.2微升 得自MinElute純化管柱的cDNA、1.25微升水、0.4微升連 揍物 ELTD-AdC(lOOuM)、0.4 微升連接物 ELTD-AdD (100uM)、12.5微升2xQuick連接反應缓衝溶液和1.25微升 Quick T4 DNA 連接酶(Quick Ligation™ 套組,New England Biolabs, M2200S)。在25°C培養該連接混合物20分鐘,並 使用 GenElute P'CR Clean-Up 套組(Sigma-Aldrich,NA1020) 純化。 在下列的反應中修補經連接連接物之cDNA的缺口 : 47微升得自 GenElute純化管柱的 cDNA、8微升 1 OxThermo Pol 反應缓衝溶液(New England Biolabs)、8 微升 1毫克/毫升BSA、2微升10mM dNTP、1微升8單位/微升 Bst DNA 聚合酶、大片段(New England Biolabs,M0275)和 14微升水。在65°C培養該修補缺口反應30分鐘,並使用 QIAquick PCR純化管柱純化,產生50微升100-400bp的經 連接連接物之cDNA。
擴增經連接連接物之cDNA 在含有下列者的PCR反應中利用高忠實性DNA聚合酶 擴增cDNA : 10微升得自QIAquick PCR純化管柱之cDNA、 200948969 10 微升 5 X Phusion™ HF 緩衝溶液、i 微升 1〇niM dNTP、 2.5 微升 10uM ELTD-引子-C、2·5 微升 lOuM ELTD-引子 -〇、0·5微升2單位/微升Phusion熱啟動DNA聚合酶 (Finnzymes,Espoo, Finland,F-540)和 23.5 微升水。首先, 進行測試以測定最適合CDNA擴增的pcr循環次數。將反 應混合物放在熱循環器中,在98。〇變性3〇秒,隨後接受5 次變性-煉合-延伸循環:在981 5秒,在6(TC 10秒,在 Ο Ο 72°C 15秒。然後從該反應混合物中移出5微升,並保持在 冰上(在5次循環之後的樣本)。使剩下的反應混合物接受再 三次如上的PCR循環,並移出5微升及保持在冰上(在8次 循環之後的樣本)。重複以上循環再5次,直到已經達成總 計23次循環為止。在i 5%瓊脂糖凝膠上分析$、8、1丄、 14、1 7、20和23次循環的5微升樣本。測定出最適宜的循 環次數為17次循環,之後達到高原期,因為更多的循環會 導致在預期尺寸的cDNA上出現拭跡(smear)。為製造更 多cDNA ’如上述製備兩個pcR反應混合物,其分別帶有 1〇微升_Α °將反應混合物放在熱循環H中,在變 性30秒’隨後接受17次變性_煉合_延伸循環··在9代$ 秒,在60。(: 10秒,在饥15秒。接著是在饥$分鐘 的最終延伸步驟。使用QIAquiek pCR純化管柱純化經擴増 之 CDNA,接著使用 GenElute PCR Clean_Up 管柱 (Sigma-Aldrich)以移除引子和可能的引子二聚體。
分離經單股CD-修改之cdnA 接下來’藉著與經鏈黴菌抗生物素蛋白重佈之珠子結 39 200948969 合、洗滌和鹼性沖提,針對在一端攜帶ELTD-Ad-C並在另 一端攜帶ELTD-Ad-D的分子,富集在先前步驟中獲得的 cDNA。在兩端都攜帶ELTD-Ad-C的cDNA分子(從現在起 稱為CC分子)不能與鏈黴菌抗生物素蛋白結合,並從珠子 中被洗掉。在兩端都攜帶ELTD-Ad-D的cDNA分子(從現在 起稱為DD分子)在鹼性沖提期間會繼續與珠子結合,因為 兩股都經生物素基化了。在一端攜帶ELTD-Ad-C且在另一 端攜帶ELTD-Ad-D的cDNA分子(從現在起稱為CD分子) 的經生物素基化的股會繼續與珠子結合,而未經生物素基 化的另一股會藉著以NaOH處理而沖提。 徹底再懸浮經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈的順磁性 Dynabeads® M-270(Invitrogen, 653.05),並將 50 微升(相當 於0.5毫克)珠子移至石夕化之微量離心管(Sigma-Aldrich, T4816)。以 100 微升 lxB&W 緩衝溶液(5mM Tris_HCh0.5mM EDTA、1M NaCl,pH7.5)洗滌珠子三次,依據製造者的說 明書使用 Dynal磁性台架(MPC®-E-1, Invitrogen)分離珠 子。將珠子再懸浮於100微升含有0.02%吐溫(Tween)-20的 2xB&W缓衝溶液中,以降低非專一性結合。接下來,將與 55微升水混合45微升經PCR擴增和純化之cDNA,加至該 珠子懸浮液中。允許cDNA在室溫結合1 5分鐘,並溫和地 旋轉該試管。將該試管放在磁性台架上以分離珠子和上清 液,將後者移到新的試管中。將該溶離份稱為AB(在結合 後),並含有未與珠子結合的cDNA。隨後,如下洗務珠子 小球:以200微升含有0.02%吐溫-20的2xB&W缓衝溶液 40 200948969 洗條一次’以500微升含有0.02。/。吐溫_2〇的2xB&w緩衝 溶液洗滌一次,並以500微升水洗滌兩次。在將珠子再懸 ' 浮於水中第二次之後,將珠子移到新的矽化試管,然後移 到磁鐵上。最後,將珠子再懸浮於250微升新近製備的〇1M NaOH中,並溫和地旋轉試管2_3分鐘。此上清液代表第一 個沖提物。再度將珠子再懸浮於250微升〇.1M Na〇H中, 並溫和地旋轉2-3分鐘,此上清液代表第二個沖提物。將沖 提物分別與1250微升PBI緩衝溶液(QlAquick pcR純化套 © 組)和7·2微升20%醋酸混合,並在QIAquickpci^4化管柱
上純化。再者,在QIAquick PCR純化管柱上純化AB溶離 份。以200微升水洗務剩下的珠子一次,以200微升1 〇mM
Tris-HCl、ImM EDTA ’ pH8.0 洗滌一次,再度以 2〇〇 微升 水洗滌一次,最後再懸浮於5 0微升水中並儲存在4。〇。 在1.5%瓊脂糖凝膝上檢查5微升AB溶離份和兩種鹼 性沖提物。在AB溶離份和第一個鹼性沖提物中找到 cDNA,但在第二個鹼性沖提物中則無,將其拋棄。對1微 升AB溶離份、第一個驗性沖提物和珠子(總體積各5 〇微升) 進行對照組PCR反應。分別與12_5微升REDTaq®ReadyMix TM (Sigma-Aldnch,R2523)、1 微升 1〇uM ELTD_ 引子 _c 或 1微升1 OuM ELTD-引子-D或[1微升丨〇uM ELTD_引子_c和 1微升10uM ELTD-引子-D]和水混合至25微升之總體積。 PCR條件為:在94C 1分鐘,(在94»c 3〇秒,在5〇t 3〇 秒,在72它3〇秒)持續6、9、12和15次循環,在72。(:5 分鐘。將每個反應各5微升裝載到15%瓊脂糖凝膠上。結 41 200948969 果顯示如同預期,在AB溶離份中有比DD和CD-分子更多 的CC分子,因為CC分子不能與珠子結合。在鹼性沖提物 和珠子溶離份中出現:CC<DD<CD。結論如同預期,在鹼 性沖提物中富含CD分子,但仍出現CC且尤其是DD分子, 或許是因為CC的非專一性結合和DD分子對珠子的不完全 結合。將鹼性沖提物(經QIAquick-純化的)稱為富含單股CD 之 cDNA。
擴增富含CD之cDNA 在測試最適宜的PCR條件之後,如下擴增富含單股CD 之cDNA。建立十六個PCR反應,分別含有:0.5微升經 QIAquick管柱純化之上述Dynabeads的第一個驗性沖提 物、10微升5xPhusion™ HF缓衝溶液、1微升1 OmM dNTP、 2.5 微升 10uM ELTD-引子-C、2.5 微升 10uM ELTD-引子 -D、0.5微升2單位/微升Phusion熱啟動DNA聚合酶 (Finnzymes,F-540)和3 3微升水。將該反應混合物放在熱循 環器中,在98°C變性30秒,隨後接受11次變性-煉合-延 伸的循環:在98°C 5秒,在60°C 10秒,在72°C 15秒。 接著是在72°C 5分鐘的最後延伸步驟。使用三個平行的 QIAquick PCR純化管柱純化經擴增之cDNA。在1.2%瓊月旨 糖凝膠上分析經純化的cDNA,並以分光光度計測量濃度。 總共獲得27.5微克富含雙股CD之cDNA。 富含CD之cDNA對Dynabeads的結合 使用5微克得自先前步驟的富含雙股CD之cDNA,與 Dynabeads M-270結合。上文在「分離經單股CD-修改之 200948969 cDNA」之下描述了該程序,並有以下的修改。將27.32微 升的量(相當於5微克)的富含CD之cDNA與水混合,至 . 體積總共1 〇〇微升,並將該混合物加至在100微升含有 0.02%吐溫-20之2xB&W缓衝溶液中的珠子中。在cDNA結 合並以含有0.02%吐溫-20之2xB&W緩衝溶液洗滌和以水 洗蘇之後,以200微升 ΙχΝΕ緩衝溶液4(New England Biolabs)洗滌珠子2次。最後,將與cDNA結合的珠子再懸 浮於100微升1χΝΕ4緩衝溶液中,並移至新的矽化微量離 心試管。
以SapI消化富含CD之cDNA-珠子製劑 . 以SapI消化在珠子上、富含CD之cDNA,以從cDNA 分子移除連接物ELTD-AdC,同時cDNA仍經由經生物素基 化之連接物ELTD-AdD與珠子附接。將五微升Sapl(2單位/ 微升,New England Biolabsm, R0569)加至 cDNA-珠子懸浮 液中,並在37°C培養1.5小時。每10分鐘以1400rpm旋轉 該珠子,以保持其等在該步驟期間為懸浮液。接下來,將 V 珠子放在磁性台架上1分鐘以分離珠子,拋棄上清液並以 500微升含有0.02%吐溫-20之2xB&W緩衝溶液洗滌珠子兩 次,然後以500微升水洗滌兩次。 驗性沖提以製備富含單股CD之cDNA-珠子庫 將珠子小球再懸浮於250微升0.1 M NaOH(新近製備的) 中,並溫和地旋轉試管2-3分鐘。將試管放在磁性台架上1 分鐘,並將上清液(=鹼性沖提物)移至新的試管。將鹼性沖 提物與1250微升PBI缓衝溶液(QIAquick PCR純化套組)和 43 200948969 7.2微升20%醋酸混合,並在QIAquick PCR純化管柱上純 化。以200微升水洗滌剩下的珠子一次,以200微升10mM Tris-HCl、ImM EDTA,ρΗ8·0 洗滌一次,再度以 200 微升 水洗滌一次,最後再懸浮於50微升水中並儲存在4°C。這 是富含單股CD之cDNA-珠子庫,準備好用於與基因組DNA 雜交。 在1.2%瓊脂糖凝膠上分析該經純化之鹼性沖提物,以 及之後來自「富含CD之cDNA對Dynabeads的結合」的結 合溶離份,以及具有已知濃度、得自「擴增經連接連接物 之cDNA」之連續稀釋的雙股cDNA。在AB溶離份中發現 大約2微克的cDNA,並沒有與Dynabeads結合。該驗性沖 提物顯示預期尺寸的拭跡。以分光光度計測量鹼性溶離份 的濃度,並發現已經從珠子中沖提出41 0毫微克的單股 cDNA。在理論上,在富含單股CD之cDNA-珠子庫中應該 有等量的互補cDNA股,假定平均尺寸為300nt,相當於大 約4微微莫耳。
基因組DNA
分離基因組DNA 依據Kobayashi等人(1998)的方案,從建志蘋果葉分離 基因組DNA(gDNA)。在根據Kobayashi等人(199 8)的RNA 酶處理之後,藉著加入三分之二份體積的5M NaCl和兩份 體積之乙醇(p.a.)以高-鹽使gDNA沉澱以移除雜質,接著以 20.000g離心15分鐘,以70%乙醇洗滌小球,乾燥並將小 球溶解於 10mM Tris-HCl、ImM EDTA,pH8_0 中。 200948969
限制酵素消化gDNA 藉著限制酵素消化片段化gDNA,以創造未部分重疊的 - 片段。部分重疊的片段可能干擾在方案中較晚的雜交步 驟,導致雜交片段網狀物。選擇限制消化,使其主要產生 l-3kb 的片段。以 Hindlll/BstYl 並以 EcoRI/BstYI 消化 gDNA,產生兩組不同的片段。藉著加入1 〇微升NE緩衝溶 液 2、3 微升 EcoRI(New England Biolabs,20 單位 /微升, R0101)或 1 微升 HindIII(New England Biolabs,100 單位 / 微 © 升’ 104)和水,直到總體積1〇〇微升,接著在37°C培養 1小時,消化二十微克gDNA。隨後,在每個試管中加入6 . 微升 BstYI(New England Biolabs,10 單位 /微升,R0523), 接著在60°C培養1小時。將經消化之DNA裝入1 %瓊脂糖 凝膠的4條跑道中並分離。從凝膠中切下1到3kb之間的 片段,並使用 GenElute凝膠萃取套組(Sigma-Aldrich, ΝΑΙ 11 1)純化。重複以上的程序一次,以產生足夠的DNA 片段。將 EcoRI/EstYI(EB)和 HindIII/EstYI(HB)基因組片段 w 連接到連接物 ELTD-AdE-Eco、ELTD-AdE-Hind 和 ELTD-AdF-Bst。 gDNA與連接物連接 藉著煉合部分互補之寡核苷酸ELTD-AdE-Ecol (5’ -CTTGTAGGGCACGGGTCGAGAG-3’ )和 ELTD-AdE-Eco2 (5’ -AATTCTCTCGACCCGTGCCCTA-3 ’ ),製備連接物 ELTD-AdE-Eco。該連接物在一邊具有5’ -AATT突出物, 其可與gDNA片段之EcoRI-突出物相容,並在另一邊具有 45 200948969
5’ -CTTG突出物。這些突出物獲得與gDNA連接的方向 性,並防止多個連接物與gDNA連接。藉著煉合部分互補 之寡核苷酸 ELTD-AdE-Hindl (5’ -CTTGTAGGGCACGGGT CGGAGA-3’ )和 ELTD-AdE-Hind2 (5’ -AGCTTCTCCGAC CCGTGCCCTA-3’),製備連接物 ELTD-AdE-Hind。類似 ELTD-AdE-Eco,ELTD-AdE-Hind 連接物在一邊具有 Hindlll-可相容之5’ -AGCT突出物,並在另一邊具有5 ’ -CTTG 突出物。藉著煉合部分互補之寡核苷酸 ELTD-AdF-Bstl (5 ’ -GAATGGCTGGGAGAGTGCTGAG-3’ )和 ELTD-AdF-Bst2 (5’ -GATCCTCAGCACTCTCCC AGCC-3’ ,製備連接物 ELTD-AdF-Bst。類似 ELTD-AdE -Eco, ELTD-AdF-Bst連接物在一邊具有BstYI-可相容之5’ -GATC突出物,並在另一邊具有5’ -GAAT突出物。所有 的寡核苷酸均是從Sigma-Aldrich訂購,為經HPLC純化 的,並溶解於 ImM Tris-HCl ' O.lmM EDTA,ρΗ8·0 中。 藉著將每種適當的寡核苷酸(800uM)各15微升與60微 升 2x 煉合緩衝溶液(20mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA,pH7.6)和3 0微升水混合,並在95°C在加熱塊中培 養該混合物5分鐘,然後關掉加熱塊允許樣本内部慢慢地 冷卻至30°C以下(花費3小時),以製備連接物。這產生 100uM 濃度的雙股連接物 ELTD-AdE-Eco、ELTD-AdE-Hind 和 ELTD-AdF-Bst 〇 在下列的反應中將連接物 ELTD-AdE-Eco 和 ELTD-AdF-Bst 連接到 EcoRI/BstYI(EB)l-3kb 之 gDNA 片 200948969 段:1.3微克EB片段、0.4微升連接物ELTD-AdE-Eco (lOOuM)、0.4 微升連接物 ELTD-AdF-Est (100uM)、40 微升 • 2xQuick連接反應緩衝溶液、4微升Quick T4 DNA連接酶 (Quick Ligation™ 套組,New England Biolabs,M2200S)和 水,至總體積 80微升。在下列的反應中將連接物 ELTD-AdE-Hind 和 ELTD-AdF-Bst 連接到 Hindlll/BstYI (HB)l-3kb之gDNA片段:1_0微克HB片段、0.4微升連接 物 ELTD-AdE-Hind(lOOuM) 、 0.4 微升連接物 © ELTD-AdF-Est(lOOuM)、40 微升 2xQuick 連接反應緩衝溶 液、4 微升 Quick T4 DNA 連接酶(Quick Ligation™ 套組, . New England Biolabs,M2200S)和水,至總體積 80 微升。在 25°C培養該連接混合物20分鐘,並使用 GenElute PCR Clean-Up 套組(Sigma-Aldrich,NA1020)純化。 修補EB和HB gDNA之缺口和純化之 在下列的反應中修補經連接連接物之gDNA’ s的缺 口 : 40微升得自 GenElute純化管柱的 gDNA、8微升 w lOxThermoPol反應緩衝溶液、8微升1毫克/毫升BSA、2 微升10mM dNTP、3微升8單位/微升Bst DNA聚合酶、大 片段(New England Biolabs, M0275)和 19 微升水。在 65°C 培 養該修補缺口反應30分鐘,並使用GenElute PCR Clean-Up 套組(Sigma-Aldrich, ΝΑ 1020)純化。這產生50微升0.02微 克/微升(ΕΒ)和0.014微克/微升(ΗΒ)的經連接連接物之 gDNA,其準備好用於與富含單股CD之cDNA-珠子庫雜交。 藉著PCR檢查連接物-連接步驟。在PCR反應中,使 47 200948969 用一毫微克經連接連接物並經修補缺口之EB製劑作為模 板,使用引子ELTD-AdE-Ecol或ELTD-AdF-Bstl或兩者之 組合(分別為E、F、EF)。類似地,在PCR反應中,使用經 連接連接物之 HB 製劑作為模板,使用引子 ELTD-AdE-Hindl或ELTD-AdF-Bstl或兩者之組合(分別為 E、F、EF)。關於EB和HB,PCR反應如預期得到在l-3kb 區域中的拭跡。 雜交並擴增所選擇之基因組DNA片段 cDNA-珠子庫與gDNA片段的雜交 首先對螢火蟲蟲螢光素酶(Luc)基因片段測試雜交條 件。簡言之,帶有ELTD-AdC和ELTD-AdD的單股200nt Luc 片段(Luc200),經由ELTD-AdD的生物素標記與Dynabeads M-270結合。使該 Luc-珠子製劑與連接 ELTD-AdE和 -AdF(與非專一性之1400nt對照組DNA月段混合)的1600nt Luc片段雜交。在雜交和洗條之後,藉著驗性處理沖提出與 Luc200探針結合的片段,並藉著PCR擴增該片段。發現在 比非專一性、未雜交之對照組片段高很多的濃度下,沖提 出1600nt的Luc片段。在PCR期間,在這些片段的顯露 之間有24次循環差異(假定100%PCR效力,224= 1·7χ107 倍的富含Lucl600)。對cDNA-珠子庫和gDNA使用相同的 雜交和洗務條件。 上述的EB和HB gDNA製劑係藉著加熱而變性。首先, 在離心真空濃縮器中將13微升EB和12微升HB減少至5 微升。EB的量相當於0.26微克或大約0.2微微莫耳的平均 200948969 2kb片段。HB的量相當於〇17微克或大約〇13微微莫耳的 平均2kb片段。然後在加熱塊中,在95t:使樣本變性5分 - 鐘’並直接放在冰上。 將上述的富含單股CD之cDNA-珠子庫分配到兩個矽 化試管内(各25微升珠子)。以2〇〇微升6xSSC/〇1%sds (預 先加溫至6(TC )洗滌珠子三次,然後再懸浮於1〇〇微升 6XSSC/O.1〇/〇SDS中並保持6(rc。在一個試管中加入卽 gDNA,並在另一個試管中加入HB gDNA。在6CTC培養該 試管4小時並溫和地旋轉。以5〇〇微升預先加溫的 6XSSC/0. P/oSDsaot )快速洗滌珠子兩次,以5〇〇微升在6〇 -°0的6xSSC/0_1%SDS隨旋轉洗滌三次15分鐘,以5〇〇微升 - 在室溫的6xSSC隨旋轉洗滌兩次5分鐘,並以500微升水 快速洗滌一次。 延伸雜交產物並以PCR擴增所選擇之gDNA片段 使用經雜交之gDNA作為模板,使用在珠子上形成之 ❹ cDNA/gDNA雜交產物進行3’ cDNA端的延伸。在最後的 水洗滌步驟之後,將珠子直接再懸浮於77微升水和2〇微 升5xPhusi〇n™ HF緩衝溶液的混合物中’並移至新的矽化 試管。接下來加入:2微升10mM dNTp和i微升2單位/ 微升 Phusion 熱啟動 DNA 聚合酶(Finnzymes,F_54〇)。在 72 °C延伸2分鐘。將珠子保持在〇〇c隔夜。 用於PCR擴增的珠子具有不同的引子組合。利用下列 的引子組擴增與EB gDNA雜交的珠子: l)ELTD-AdE-Ecol 和 ELTD-AdF-Bstl 49 200948969 2)ELTD-AdE-Ecol 3ELTD-AdF-Bstl。 利用下列的引子組擴增與HB gDNA雜交的珠子: 4) ELTD-AdE-Hind3 和 ELTD-AdF-Bstl 5) ELTD-AdE-Hind3 6) ELTD-AdF-Bstl。 ELTD-引子 E-Hind3 具有卞^列的序列:5 ’ -GTAGGGCACGGGTCGGAGAAGC-3’ 。其與 ELTD-AdE-Hindl的大部分相同,並在3’端多3個nt(AGC)以吻合在 經連接連接物和gDNA之間的Hindlll位置,並以在煉合期 間對目標賦予較強的3’端結合。 PCR反應包括1微升EB或HB珠子、10微升5xPhusion ™ HF緩衝溶液、1微升10mM dNTP、2_5微升(10uM)的每 種引子、0.5微升2單位/微升的Phusion熱啟動DNA聚合 酶(Finnzymes, F-540)和水,至終體積50微升。為測定最適 宜的循環次數,將反應混合物分配到五個0.2毫升PCR試 管中(各」0微升),以礦物油覆蓋,放在熱循環器中,在98 °C變性30秒,隨後接受11、14、17、20和23次變性-煉合 -延伸循環:在98°C 5秒,在60°C 10秒,在72°C 2分鐘。 接著是在72°C 5分鐘的最後延伸步驟。在1.2%瓊脂糖凝膠 上分析每個反應各2.5微升。
在利用ELTD-AdE及/或ELTD-AdF引子的PCR反應 中,具有範圍從l-3kb之片段(如對gDNA片段所預期的) 發現拭跡。兩種引子之組合在1 7次循環時便已經得到EB 200948969 和HB樣本的PCR產物。僅利用ELTD-AdE,在23次循環 之後發現產物,而利用ELTD-AdF引子在20次循環之後發 • 現相同強度的產物。這歸因於在基因組中出現比EcoRI-或
Hindlll-位置(GAATTC或AAGCTT)多的BstYI-限制位置(辨 識位置:RGATCY)。 擴增經雜交產物選擇之gDNA以用於高通量定序 利用 HB gDNA 連同弓丨子 ELTD-AdE-Hind3 寺口 ELTD-AdF-Bstl以及20次循環的PCR反應,得到最佳的結果: © 範圍從l-3kb的均一拭跡。製備下列的PCR反應混合物20 倍,以增加足夠供高通量定序之DNA : 1微升HB珠子、10 . 微升 5xPhusion™ HF 緩衝溶液、1 微升 1 OmM dNTP、2,5 微升 ELTD-AdE-Hind3(10uM)、2.5 微升 ELTD-AdF-Bstl (10uM)、0.5微升2單位/微升Phusion熱啟動DNA聚合酶 和水,至終體積50微升。將該反應混合物放在熱循環器中, 在98°C變性30秒,隨後接受變性-煉合-延伸的20次循環: 在98°C 5秒,在60°C 10秒,在72°C 2分鐘。接著是在
® 72°C 5分鐘的最終延伸步驟。使用兩個平行QIAquick PCR 純化管柱,純化該所謂的經雜交產物選擇和經擴增HB gDNA。以分光光度計測量到產量為14·8微克。高通量定序 一部分經雜交產物選擇之HB gDNA。使用另一部分進行選 殖和Sanger定序。 擴增cDNA以用於高通量定序 為增加足夠的富含CD之cDNA以用於高通量定序,製 備20倍下列的PCR反應混合物:0.5微升經QIAquick管柱 51 200948969 純化的在「分離經單股CD-修改之cDNA」之下描述的 Dynabeads之第一個鹼性沖提物、10微升5xPhusionTM HF 緩衝溶液、1微升10mM dNTP、2.5微升10uM ELTD-引子 -C、2.5微升10uM ELTD-引子-D-NB、0.5微升2單位/微升 Phusion 熱啟動 DNA 聚合酶(Finnzymes,F-540)和 33 微升 水。ELTD-引子D-NB具有與ELTD-引子D相同的序列,但 在5 ’端不含生物素標記。將該反應混合物放在熱循環器 中,在98°C變性30秒,隨後接受變性-煉合-延伸的11次 循環:在98°C 5秒,在60°C 10秒,在72°C 15秒。接著 是在72°C 5分鐘的最終延伸步驟。使用四個平行QIAquick PCR純化管柱純化經擴增之cDNA。在1.2%瓊脂糖凝膠上 分析經純化之cDNA,並以分光光度計測量濃度。獲得總共 29微克富含雙股CD之cDNA。高通量定序該cDNA。 經捕捉之基因組DNA分子的序列分析 在以cDNA珠子捕捉基因組DNA之後,使用帶有 cDNA-gDNA雜交產物的珠子進行PCR擴增,其使用基因組 DNA 專一性引子組 ELTD-AdE-Hind3 和 ELTD-AdF-Bstl。 選殖一部分基因組DNA,並交付800個殖系進行Sanger定 序(平均讀值長度781bp)。使另一部分的基因組DNA接受 高通量定序技術,產生具有平均長度337bp的序列讀值。 詳細地分析由Έ00個個別Sanger序列和1 370個高通量 序列讀值組成的兩個序列數據組,並與在公開的數據庫中 所有可得之蘋果EST (NCBI,在2009年3月 9日登記 262.41 1)相比較。使用程式 BLASTN(S.F. Altschul 等人 52 200948969
NAR 25:3389-3402, 1997)進行基因組DNA序列與蘋果EST 序列的全面排比。 • 從8〇〇個Sanger序列,488個顯示與得自在公開資料 庫中之蘋果EST收集的序列和得自1 37〇個基因組dna序 列之隨機組的序列有顯著的類似性(e值i 〇-ιο),765個展現 出明顯的類似性(e值1〇 10),顯示與cDNA相關性基因組 DNA的專一性捕捉是成功的。此外,這些基因組序列 的局部排比顯示這些序列經常從5’或3’ CDNA邊界或内 ❹含子區延伸,顯示該技術能夠鑑認非編碼區域。若考慮已 經僅從一邊定序片段,片段的尺寸在1Kb到3Kb之間變化, -且超過5〇%的序列與EST序列有可鑑認的類似性,似乎很 明顯如果在與公開EST序列數據排比之前已經完全定序片 段並建造入片段重疊群,會發現高很多百分比的序列吻合。 因為蘋果基因組之尺寸大約為75〇Mb且在植物基因組 中的基因數目為大約3G_而平均長度15曝p在基因組上 藝產生4 5 M b的編碼序列,這意味著藉著隨機定序僅能夠標註 6%的基因組片段’而利用所描述之方法吾人發現超過別% 的標註。 從以上的實施例描述跨越EST邊界之基因組DNA片段 的三個案例。 實施例的三個案例之說明 在圖4以及下文的序列排比中,出示利用本發明之 法發現的三個顏果基因組序列之案例。 案例1. 53 200948969 蘋果基因組序列FRA8S6E02IN5QW與從7個EST序列 (GenBank 登錄編號:C0899363 ' C0419003、CO052855、 C0752637、CO901846、CN927506 和 CO066317)建造之蘋 果片段重疊群〇§89845〖_846_7的一部分顯示98.9%同一性。 命中擬南芥(Arabidopsis thaliana )的片段重疊群 cg8984st_846_7 的最佳 BLASTX (S.F. Altschul 等人 NAR 25:3389-3402, 1997)為基因AT 1G70160(基因組位點標籤, 擬南芥資訊來源(The Arabidopsis Information Resource), http://www.arabidopsis.org),具有 e-值 2e·104。三個序列排 比顯示FRA8S6E02IN5QW含有具有未知功能之蛋白質的一 部分蛋白質編碼序列(CDS),其與片段重疊群 cg8984st_846_7部份重疊。在圖4,圖A中圖解出示該序列, 並在下面出示此序列之相關部分的序列排比。 FRA8S6E02IN5QW的蛋白質編碼序列亦與AT1G70160有 77.8%相同,但在序列之5’ ·端與在AT 1G70160中之内含 子相同位置的被内含子打斷(圊4,圖A和序列排比)。在該 區域中在FRA8S6E02IN5QW和AT1G70160之間的同一性 很低,為37.5%。在AT 1G70160中,内含子比在蘋果中者 更小(在序列排比中以粗體字指出此一内含子的5 ’ -邊 界)。在FRA8S6E02IN5QW中,在内含子序列的所有三個讀 框中都有終止密碼子,且 BLAST 搜尋指出 FRA8S6E02IN5QW的CDS是與其他植物物種之類似蛋白質 同源的,但在内含子區中卻喪失了該同源性。這表示 FRA8S6E02IN5QW確實是基因組序列,含有打斷性内含子 54 200948969 序列。此外,此處保守性低很多的内含子序列表示内含子 序列含有比外顯子多的SNP。 案例2 蘋果基因組殖系FRA8SE02HOH39對從21個EST序列 (GenBank 登錄編號:CN930585、CV525017、CN873920、 EB149394、EB121634、EB116211、CN909797、EB1 15871、 EB154300、 CN877800、 EB121026、 CN932122、 CN860924 、 EB1 10988、C0865849、CN488473、CN497072、CN90391 8、 〇 CN903 403、DR996731與CN8943 3 0)建造之蘋果片段重疊群 cgl2357st_1428_21 顯示同源性。片段重疊群 . cgl2357st_1428_21含有對ATP-依賴性Clp蛋白酶蛋白水解 次單元(最佳的BLASTX命中 EEF49880,蓖麻(Ricinus communis),分數3e·128)具有類似性的蛋白質的完整編碼序 列。 FRA8SE02HOH39 與 cgl2357st_1428_21 的 3’ -未經轉 譯區部份重疊,並延伸越過聚A尾進入未經轉錄之基因組 DNA内,如同在圖4,圖B和下文的序排比列中所示。 因此,FRA8SE02HOH39是含有經轉錄區3’ -側序列之 基因組序列的實例。 案例3 蘋果基因組序列02-H03與40個蘋果EST之5’ -部分 部份重疊,對乙烯反應因子具有類似性(最佳的BLASTX命 中 AAV66332,胡瓜(Cucumis sativus),分數 6e-34)。在圖 4, 圖C中對EST91044950圖解顯示此(GenBank登錄編號: 55 200948969 EB 155368)。其他的EST具有類似的5’端。在下文中出示 序列之相關部分的排比。基因組序列自基因之轉譯起始密 碼子(ATG)上游744bp延伸。對在02-H03中編碼區外面的 任何基因,沒有發現序列類似性,證實這是基因組序列。 在轉錄起始上游的保守性序列,為TATA匣。在EST之起 始上游39bp處發現推定的TATA-匣(TATAAA)。 參考文獻
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FRA8S6E02IN5QW
TATGTTGTGATAACCATATGGCTTCCCTGACATGCTC
TGAACATACTCCCATGCTGCAGTAGAGTTGAATTTTGCA
CGCACCTCTGGATGCAAGGGAAGCAAGGCTATTTGTGGA
TTAGAACTATCCTTGAGTGTCAACTCCCACCACTCATCCC
ATGGAATCACCGCTATAATTTCTTCACCCTGCAATATTAA 56 200948969
ATTATTAATAAATGTAAAAATCAACCAAAAAGAAAAGA ACTAACCACAATAAACTCTACAAAAAAGAAAAGAACTA . AAGCAAAGTTTAAAATAATTAAGAAATCTGTGCAAGATT
GTCATATATTTAATTTTGTCCCTAAACAAACGCTCATCAT ATGTTCATCACTACAATCCTGATTCAACTATTATTCCACT AAAGGCAAAGAACCAAAACATTTAGCTTAATTTCTATTC CTAATAAATCCCAAANACATGAAATGAGTTGCTTGCATA AGCATATACTCAATTGAAAAT ❹ FRA8S6E02HOH39
. CAGCGACCTGTTTACGTGCAAGGTTTGGATGGAAGA
GATTGAACAGTGATGCCAAATTGAATTGCCTCCAGAACA AATCTGAAGGGTGCAAAAAACATGTACTTTTTGAGAGTT GAAGAATGACGACACTTTCTTATGTTCTATATTATCTTGG TTAAGTTTTTTGCAGGACGGAATGAATCCTCGTCTTTTTT TTCCCTATCAAAAAGAAGAAAGCTGAGTTTTTATGTTTG w ATGTCTTGATGATGGATGACCTAGTGTTCAAGTGAAAAA TTCGACGGACAAAACGCTTGGCAATCCAATTTGTGCCGT GTATAATGTGTCACGTCCAAACGAGTTTCACATCGAAGA AA 02_H03
TGTTATTGTTTCATTGAAACATAACGTTACATAACA
ATATAGGNNNCATTTGGAACAACTTTTAAAATGGCTGAA 57 200948969
AACGCATTTTGTGAAAATGATTTTTAAACAGTTTTGAGTA
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TGTGCGCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCTCTCTCTT
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GATGAACGGTAACGGAAACGTGAAGGAGGTGCATTTTAG
AGGTGTGAGGAAGAGGCCGTGGGGGAGGTACGCCGCCG
AGATCAGA 200948969 【圖式簡單說明】 圖1 ·從mRNA創造小型單股DNA分子的圖解說明。C 為連接物,D為不同的連接物’B為生物素,p為磷酸鹽基 團’ bp為鹼基對,ds為雙股,ss為單股,re為限制酵素, SA為鏈黴菌抗生物素蛋白,LD-PCR為長距離PCR,NAB(30) 和 NVTpo)為根據國際生物化學聯盟命名委員會 (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry,NC-IUB)對於核苷酸之句法規則的核苦酸之 單字母碼’ Apo)和τ(3())分別代表具有30個A和30個T的 Ο 延伸。 圖2.創造基因組DNA片段以及後續與來自mRNA之小 型單股DN A分子(圖1)雜交的圖解說明。在數個步驟之後, 獲得可使用高通量定序方法定序的DNA片段。C和D為連 接物,亦在圖1中敘述。E和F為不同的連接物,b為生物 素,bp為驗基對,ds為雙股,ss為單股,且SA為鏈黴菌 抗生物素蛋白。 圖3 ·將未經鱗酸化之a和B連接物連接到經構酸化、 〇 經拋光之雙股基因組DNA片段的末端。A和B連接物核苷 酸序列和在B連接物上出現5’生物素標籤兩者方面有差 異。缺口出現在每個連接物的3’ -接合處且將片段藉著Bst DNA聚合酶的股_置換活性填滿。使用鏈黴菌抗生物素蛋白 -生物素交互作用以移除被同形合子連接物組(A/A和B/b) 包圍的片段,並以產生單股的庫模板。使片段與鏈黴菌抗 生物素蛋白珠子結合;洗掉未結合的材料(由同形合子a/a 62 200948969 J 連接物組構成,其缺乏生物素)。然後將經固定之片段變性; 透過經生物素基化之B連接物使B/B片段的兩股仍保持固 定’同時洗出A/B片段,並用在後續的步驟中。 圖4.ELGD計晝案例 1和2和3(powerpoint檔案)。圖 A.案例1.蘋果基因組序列FRA8S6E02IN5QW、蘋果EST片 段重疊群(contig) Cg8984st—846—7和***芥基因 AT1G70160(沒有畫刻度)排比的圖解說明。僅顯示 AT1G70160 的相關 3’ -部分。在 FRA8S6E02IN5QW 和 ❿ AT1G70160中,以白框代表内含子。在cg8984st一846一7中, 以細線顯示經剪接的内含子。以黑色顯示蛋白質編碼序列 (CDS)。以灰色顯示3,_未經轉譯區。以…#表示在 序列中的聚A尾。圖B.案例2·蘋果基因組序列 FRA8SE〇2HOH39和蘋果膽片段重養群 cgl2357st一 1428_21(沒有晝刻度)排比的圖解說明。以黑色顯 示蛋白質編碼序列(CDS)。以灰色顯示5, ·和3, ·未經轉譯 區。以⑷η表示在cDNA序列中的聚A尾。囷c.案例3.頻 果基因組序列02_H〇3和頻果EST 91〇4459〇(沒有畫刻度)排 ,的圖解說明。以黑色顯示蛋白f編碼序列仰〜以灰色 ^ 3 _未經轉譯區。以白色顯示在基因組序列中 之未經轉錄的啟動子區。 【主要元件符號說明】 無 63
Claims (1)
- 200948969 , 七、申請專利範圍·· 1.一種鑑認在樣本中之基因組DNA的方法,其包括 -從所選擇之生物分離mRNA’並從該mRNA製備小型 . 單股cDNA片段,其帶有一個含有親和力標記之連接物; ' -從相同或相關之生物分離基因、组DNA,隸該基因组 DNA製備與連接物分子連接的單股基因組dna片段; -使該單股基因組DNA片段與該單股cDNA片段雜交, 並擴增該雜交產物;以及 φ -高通量定序該雜交產物。 2.如申請專利範圍第!項之方法,其包括下列步驟: a) 從生物之組織樣本分離並純化; b) 使用該mRNA作為模板,合成cDNA ; c) 可視需要簡化該cDNA的複雜度; d) 片段化該cDNA ; e) 可視需要以尺寸挑選該片段; 〇可視需要藉著與經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈之親和 〇 力珠子結合’移除含有聚A的片段; g)拋光該cDNA片段; )使該片&與一個包括罕見限制酵素之辨識位置的連 接物和另一個含有生物素標記的連接物連接; 〇可視需要以尺寸挑選該月段; j) 修補該片段之缺口; k) 選擇含有兩種連接物序列的該片段; D使用與在步驟h中描述之連接物序列煉合的引子擴增 200948969 該片段,其中一個引子與具有罕見限制位置之連接物互 補’而另一個引子則含有生物素標記; m)使該片段與經鏈黴菌抗生物素蛋白塗佈的親和力珠 子結合; η)使用相對應限制酵素,從該片段移除含有罕見限制位 置之連接物; 〇)從經由生物素-鏈黴菌抗生物素蛋白交互作用而與親 和力珠子附接的雙股DNA片段移除並未藉著生物素_鏈黴 菌抗生物素蛋白交互作用與親和力珠子附接的單股產生 與鏈黴菌抗生物素蛋白親和力珠子結合的單股Dna ; P)分離並純化基因組DNA,例如從步驟&的生物; q) 片段化該基因組DNA ; r) 可視需要拋光該基因組dna ; s) 使該基因組DNA與—個單—類型的連接物或與兩個 不同類型的連接物(較佳)連接; t) 將該基因組DNA解鏈成單股DNA ; u) 使得自步驟t)之基因組DNA與得自步驟〇)在珠子上 的cDNA雜交; v) 藉著洗滌移除未結合的基因組dna ; w) 藉著聚合酶延伸cDNA_基因組職雜交產物以創造 雙股模板; X)對該基因組DNA_cDNA雜交產物進行pcR ; y)藉著尺寸分級分離,從該PCR中挑選超過大約⑽ 個鹼基對的片段;❹ 其中序列係得 以揭露多形位 200948969 * Z)可視需要純化該片段, aa)尚通置定序該片段。 3. —種鑑認多形性的方法,其包括如申請專利範圍之方 法的所有步驟且另外還有以下步驟: ab)比較得自二或多個樣本的序列數據,以鑑認多形性。 4. 如申請專利範圍帛2或3項之方法,其中得自步驟 aa)之序列被合入部分重叠之個別序列的片段重疊群 (contig )申。 5_如申請專利範圍第2_4項中任一項之方法其中得自 步驟ab)之序列或得自申請專利範圍第3項之片段重疊群係 藉由自動標註而標註。 ' 6. 如前述申請專利範圍中任一項之方法,其中序列係得 自屬於-物種之個體,並與可獲得的EST數據比較,以揭 露非編碼^ ’如内含子插人和基因内部的非編碼序列。 7. 如刖述申請專利範圍中任一項之方法,其中序列係得 自屬於相關物種之—或多個個體,並與可獲得的贿數 比較’揭露非編碼序列,如内含子序列和基因内部的非編 8.如則述申睛專利範圍中任一項之方法 自屬於相同物種夕-_V、夕 稷之一或多個個體並被比較 置0 9.如前述申过奎』丨_ m 叫專利範圍中任一項之方法,其中 自來自不同物種夕.^ , 丁斤夕U 禮之—或多個個體並被比較,揭 3 200948969 I 〇.如前述申請專利範圍中任一項之方法,其中序列係 得自來自不同物種之一或多個個體並被比較,以揭露在基 因組DNA中的保守區域。 II ·如前述申請專利範圍中任一項之方法,其中得自步 驟h)之包括罕見限制酵素之辨識位置的連接物包括酵素 SapI的辨識位置。 12.如前述申請專利範圍中任一項之方法,其中核酸的 片段化係藉著霧化。 1 3 . —種進行如申請專利範圍第1或2項之方法的套 組,其包括一或多個連接物和使用說明書、以及可視需要 的一或多個與該連接物互補的引子、連接酶、及/或專一剪 切該連接物的限制酵素、擴增套組本身的習知組份,像 dNTP、和聚合酶。 14.如申請專利範圍第13項之套組,其中該連接物係選 自由以下者所組成之群組: 5’ -AGTCCGTCGCATCGCTCTTC-3’ 5’ -GAAGAGCGATGCGACG-3’ -生物素-TEG-AGTGGGTGTCCTGGGTCAAC-3’ 5’ -GTTGACCCAGGACACC-3’ 5, -CTTGTAGGGCACGGGTCGAGAG-3, -AATTCTCTCGACCCGTGCCCTA-3’ -CTTGTAGGGCACGGGTCGGAGA-3, -AGCTTCTCCGACCCGTGCCCTA-3’ 5’ -GAATGGCTGGGAGAGTGCTGAG-3’ 200948969 5’ -GATCCTCAGCACTCTCCCAGCC-3’ 與 5’ -GTAGGGCACGGGTCGGAGAAGC-3’ 八、圖式: (如次頁)5
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