RU2009128067A - Варианты липаз для их применения в фармацевтике - Google Patents

Abstract

1. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанная липаза: ! (a) имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 2; ! (b) обладает липазной активностью; и ! (c) по сравнению с последовательностью аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2 имеет замены N33Q, T231R и N233R, а также по меньшей мере одну дополнительную замену, выбранную из нижеследующих замен: E1*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S; N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V; G91,A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95*; D96*,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; K98I,T; E99D; N101Q; D102E,G,Y; R108M; G109A; D111A,E,N,S; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H; H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S,T; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R; N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; I255A,F; P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y и L269F,H. ! 2. Липаза по п.1, которая по сравнению с эталонной липазой, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, обладает улучшенными расщепляющими свойствами in vitro и имеет нижеследующие замены: N33Q+T231R+N233R. ! 3. Способ определения расщепляющих свойств липазы in vitro по сравнению с эталонной липазой, где указанный способ включает следующие стадии: ! a) выбора эталонной липазы; ! b) смешивания 100 ч./об. корма с 20 ч./об. пепсина и 30 ч./об. липазы или эталонной липазы соответственно; ! c) добавления i) 0 или ii) 10 ч./об. буфера (0,8 M MES, 0,8 M ацетата натрия, 0,8 M имидазола, pH 7,0), где стадия i) может представлять собой стадию выделения желудочного сока при pH 3, а стадия ii) может представлять собой стадию выделения желудочного сока при pH 5; ! d) инкубирования в течение 1 �

Claims (32)

1. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанная липаза:

(a) имеет последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 2;

(b) обладает липазной активностью; и

(c) по сравнению с последовательностью аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2 имеет замены N33Q, T231R и N233R, а также по меньшей мере одну дополнительную замену, выбранную из нижеследующих замен: E1*,D,N; Q4H,P,R; D5E; N8L,Q; Q9H; F10L; N11C,D,H,L,P,Q,R,S; G23E; N26A,H,I; D27I,N,Q,R,S,V; P29T; A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; E43K; K46M; A49T; L52I,R; E56K,Q,R,S; D57G,N; V60E,S; G61R; V63R; A68V; L69I; N71I,S; N73Q,Y; I76T; R84E; I86F,L; E87A,H,K,R; I90L,V; G91,A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y; L93*,F; N94*,K,Q,R,S; F95*; D96*,E,G,N,R,S,W,Y; L97M,Q; K98I,T; E99D; N101Q; D102E,G,Y; R108M; G109A; D111A,E,N,S; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H; H135D; P136H; Y138F; V141E,L; A150V; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S,T; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; D167E; V168M; V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W; G177A; R179T; L185M; G190C,D; N200Q,S; R205I; L206F; E210D,R,V,Y; S216P; E219D; G225P; T226N; L227F,G; P229R; E239D; G240L; D242E; T244S; G246A; Q249R; N251Q,S; D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y; I255A,F; P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y и L269F,H.

2. Липаза по п.1, которая по сравнению с эталонной липазой, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, обладает улучшенными расщепляющими свойствами in vitro и имеет нижеследующие замены: N33Q+T231R+N233R.

3. Способ определения расщепляющих свойств липазы in vitro по сравнению с эталонной липазой, где указанный способ включает следующие стадии:

a) выбора эталонной липазы;

b) смешивания 100 ч./об. корма с 20 ч./об. пепсина и 30 ч./об. липазы или эталонной липазы соответственно;

c) добавления i) 0 или ii) 10 ч./об. буфера (0,8 M MES, 0,8 M ацетата натрия, 0,8 M имидазола, pH 7,0), где стадия i) может представлять собой стадию выделения желудочного сока при pH 3, а стадия ii) может представлять собой стадию выделения желудочного сока при pH 5;

d) инкубирования в течение 1 ч при 37°С со встряхиванием;

e) добавления 20 ч./об. солей желчных кислот, а также i) 25 или ii) 15 ч./об. буфера (0,8 M MES, 0,8 M ацетата натрия, 0,8 M имидазола, pH 7,0), где стадия i) соответствует стадии выделения желудочного сока при рН 3, и стадия ii) соответствует стадии выделения желудочного сока при pH 5;

f) инкубирования в течение 2 ч при 37°С с перемешиванием;

g) добавления 50 ч./об. 10%-ного тритона-X100 в 1 M фосфорной кислоты;

h) определения количества свободных жирных кислот;

i) построения кривой «доза-ответ» по следующей формуле:

FFA = FFAmax·[E]/([E] + K),

где FFA представляет собой количество высвобождаемых свободных жирных кислот, FFAmax представляет собой максимальное количество свободных жирных кислот, которые липаза может высвобождать из корма, [E] представляет собой концентрацию липазы, а K представляет собой концентрацию липазы, которая высвобождает половину от количества FFAmax; и

j) вычисления коэффициента улучшения свойств (IF) по следующей формуле:

IF = K(эталон.)/K(липаза),

где K(эталон.) представляет собой концентрацию эталонной липазы, которая высвобождает половину от количества FFAmax, а K(липаза) представляет собой концентрацию липазы, которая высвобождает половину от количества FFAmax.

4. Способ определения расщепляющих свойств липазы in vitro по сравнению с эталонной липазой, где указанный способ включает следующие стадии:

а) определения стабильности при рН 3 в присутствии пепсина путем:

i) отбора эталонной липазы;

ii) смешивания 5 ч./об. липазы или эталонной липазы соответственно с 5 ч./об.:

a) разбавителя, содержащего 0,01% тритона-X100 и 10 мМ NaCl, или

b) раствора для обработки пепсином, содержащего 150 мкг/мл пепсина, 4 мМ CaCl₂, 0,01% тритон-X100 и 50 мМ цитрата, pH 3,0, где:

a) относится к необработанному образцу, а b) относится к образцу, обработанному пепсином;

iii) инкубирования образцов стадии ii) в течение 3 ч при 20°С;

iv) добавления к каждому образцу стадии iii) 55 ч./об. субстрата, содержащего 1 мМ PNP-пальмитата, 1,2% тритона-X100, 4 мМ CaCl₂, 100 мМ триса, pH 8,0, вместе с

5 ч./об. раствора для обработки пепсином или

5 ч./об. разбавителя;

где (а) относится к необработанному образцу, а (b) относится к образцу, обработанному пепсином;

v) оценки уровня расщепления субстрата путем считывания OD₄₅₀ образцов iv) через определенные интервалы времени;

vi) сбора данных, полученных в стадии v), которые входят в линейный интервал значений, и вычисления активности липазы для образца, обработанного пепсином, и для необработанного образца соответственно в мOD (милли-OD)/час;

vii) вычисления % остаточной липазной активности (% RA) путем деления липазной активности обработанного пепсином образца на липазную активность необработанного образца, полученную как описано в стадии vi), и умножения полученного результата на 100; и если это необходимо,

viii) сравнения %RA липазы с %RA эталонной липазы;

и/или

b) определения активности при рН 5 в присутствии солей желчных кислот путем:

i) отбора эталонной липазы;

ii) смешивания 10 ч./об. липазы или эталонной липазы соответственно с 23 ч./об. a) воды или b) 20 мМ солей желчных кислот, где a) относится к необработанному образцу, и b) относится к образцу солей желчных кислот;

iii) добавления к каждому образцу стадии ii) 200 ч./об. субстрата, содержащего 1 мМ PNP-олеата в 25 мМ сукцината, 2 мМ CaCl₂, 1,2% тритона-X100, pH 5,0, и смешивания;

iv) удаления из каждого образца сразу после стадии iii) 60 ч./об. полученной смеси и 4-кратного переноса 15 ч./об. в четыре отдельных части;

v) добавления через 1, 2, 3, и 4 ч, 60 ч./об. 100 мМ триса, pH 8,0 в соответствующую часть из четырех частей стадии iv), непосредственного считывания OD₄₀₅, и исходя из результатов, полученных в линейном интервале через 1, 2, 3 и 4 ч, вычисления активности в мOD/ч;

vi) деления активности липазы, а также эталонной липазы, полученной как описано в стадии v), образцов солей желчных кислот на активность необработанного образца, также полученной как описано в стадии v) с получением коэффициентов стабильности липазы и эталонной липазы соответственно в образцах солей желчных кислот; и

vii) деления коэффициента стабильности липазы в присутствии солей желчных кислот на стабильность эталонной липазы в присутствии солей желчных кислот, где полученный коэффициент может быть определен как коэффициент улучшения свойств липазы.

5. Липаза по п.2, где расщепляющие свойства указанной липазы in vitro определяют способом по п. 3 или 4.

6. Липаза по любому из пп.1, 2 и 5, включающая серию замен, выбранных из нижеследующих замен:

7. Липаза, которая:

(а) имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2 содержит замены по меньшей мере в одном положении, выбранном из нижеследующих положений: 9, 30, 38, 39, 63, 112, 114, 115, 117, 122, 128, 130, 136, 154, 155, 156, 161, 163, 168, 185, 190, 239 и 246.

8. Липаза, которая:

(а) имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2 содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующих замен: E1N; Q4H; N8L,Q; Q9H; N11C,D,H,L,P,S; G23E; D27I, A30T,V; T37K,M; G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; N39H,S; D57N; G61R; V63R; N71I,S; N73Q,Y; I76T; I86F,L; E87H; G91F,K,L,M,V,Y; N94Q; F95*; D96*; N101Q; D111E; G112A; T114I; S115L; W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y; D122E,N; Q126L; V128A; D130H; H135D; P136H; V141E,L; V154F,I,L; A155V; G156R; G161A,E; N162G,S; G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; V168M; L185M; G190C,D; R205I; G246A; N251Q,S; и L269F,H.

9. Липаза, которая:

(а) имеет последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2; и

(b) обладает липазной активностью; и

(с) по сравнению с последовательностью из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2 содержит ряд замен, выбранных из нижеследующих замен:

10. Комбинация липазы по любому из пп.1, 2 и 5, 6 с протеазой или амилазой, используемая в качестве лекарственного препарата.

11. Комбинация липазы по любому из пп.1, 2 и 5, 6 с протеазой и амилазой, используемая в качестве лекарственного препарата.

12. Комбинация липазы с протеазой и/или амилазой по п.10 или 11, где:

(i) указанная протеаза по меньшей мере на 70% идентична протеазе, выбранной из группы, состоящей из:

а) протеазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-274 SEQ ID NO:3;

b) протеазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-188 SEQ ID NO:4, и

с) протеазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-188 SEQ ID NO:5;

(ii) указанная амилаза по меньшей мере на 70% идентична амилазе, выбранной из группы, состоящей из:

а) амилазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-481 SEQ ID NO:6;

b) амилазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-481 SEQ ID NO:7, и

с) амилазы, имеющей последовательность из аминокислот 1-483 SEQ ID NO:8.

13. Применение липазы или смеси липаз по любому одному из пп.1, 2 и 5, 6 для приготовления лекарственного препарата для лечения расстройств пищеварения, экзокринной недостаточности поджелудочной железы, панкреатита, кистозного фиброза, диабета типа I и/или диабета типа II.

14. Применение по п.13, дополнительно включающее применение протеазы или амилазы.

15. Применение по п.13, дополнительно включающее применение протеазы и амилазы.

16. Применение по п.14 или 15, где указанная протеаза и/или амилаза определена по п.12.

17. Липаза по п.1, которая может быть применена для лечения расстройств пищеварения, экзокринной недостаточности поджелудочной железы, панкреатита, кистозного фиброза, диабета типа I и/или диабета типа II.

18. Липаза по п.17 в комбинации с протеазой или амилазой.

19. Липаза по п.17 в комбинации с протеазой и амилазой.

20. Липаза по п.18 или 19, где указанная протеаза и/или амилаза определена по п.12.

21. Фармацевтическая композиция, содержащая липазу или смесь липаз по любому из пп.1, 2 и 5, 6, в комбинации по меньшей мере с одной фармацевтически приемлемой добавкой.

22. Композиция по п.21, дополнительно содержащая протеазу или амилазу.

23. Композиция по п.21, дополнительно содержащая протеазу и амилазу.

24. Композиция по п.22 или 23, где указанная протеаза и/или амилаза определена по п.12.

25. Способ лечения расстройств пищеварения, экзокринной недостаточности поджелудочной железы, панкреатита, кистозного фиброза, диабета типа I и/или диабета типа II, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества липазы или смеси липаз по любому из пп.1, 2 и 5, 6.

26. Способ по п.25, который дополнительно включает введение терапевтически эффективного количества протеазы или амилазы.

27. Способ по п.25, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества протеазы и амилазы.

28. Способ по п.26 или 27, где указанная протеаза и/или амилаза определена по п.12.

29. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанной липазой является вариант родительской липазы, который:

(а) по меньшей мере на 50% идентичен последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующих замен: N26I, D27Q, D27R, D27Y, P29T, A30T, A30V, T32I, N33Q, N33T, N33Y, P42L, E43D, E43K, E43M, E43V, A49T, E56A, E56K, E56R, E56S, D57A, D57G, D57N, V60L, L69I, E87K, G91A, G91E, G91N, G91R, G91S, G91T, G91V, G91W, L93F, N94K, N94R, N94S, D96E, D96G, D96L, D96N, D96S, D96V, D96W, D96Y, L97M, L97Q, K98I, E99D, E99K, E99P, E99S, E99T, D111A, D111S, T114I, L147S, G163K, E210D, S216P, L227G, T231R, N233R, D234K, E239V, Q249R, N251S, D254N, P256T, G263Q, L264A, I265T, G266D, T267A и L269N, где каждое положение соответствует положению аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2; и

(d) при условии, что указанным вариантом не является:

(i) липаза, имеющая аминокислоты 1-269 SEQ ID NO:1; и

(ii) вариант N33Q липазы (i).

30. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанной липазой является вариант родительской липазы, который:

(а) по меньшей мере на 50% идентичен последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) содержит по меньшей мере одну замену по меньшей мере в одном из положений 30, 42, 114 и/или 163, где каждое положение соответствует положению аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2.

31. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанной липазой является вариант родительской липазы, который:

(а) по меньшей мере на 50% идентичен последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующих замен: A30T, A30V, P42L, T114I и G163K, где каждое положение соответствует положению аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2.

32. Липаза, используемая в качестве лекарственного препарата, где указанной липазой является вариант родительской липазы, который:

(а) по меньшей мере на 50% идентичен последовательности из аминокислот 1-269 SEQ ID NO:2;

(b) обладает липазной активностью; и

(с) выбран из нижеследующих вариантов: