RU1837772C

RU1837772C - Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR кURSтакI дл получени инсектицидного препарата

Info

Publication number: RU1837772C
Application number: SU894742274A
Authority: RU
Inventors: С.Трейверз Рассел; А.В.Мартин Филлис
Original assignee: Соединенные Штаты Америки, Представленные Министром Торговли
Priority date: 1987-05-18
Filing date: 1989-10-13
Publication date: 1993-08-30
Also published as: CA1308376C; WO1988009371A1; JPH02503510A; ES2052716T3; IL86367A0; AU1790888A; BR8807451A; AU609827B2; RU1837773C; US4950471A; EP0292272B1; HUT53791A; DE3874608D1; DE3874608T2; EP0292272A1; ZA883509B; KR890701723A; ATE80656T1; HU204173B; IL86367A

Abstract

Использование: производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретени : штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. Kurstaki выделен из окружающей среды. Депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хоз йства США, Пеори Иллинойс , под № NRRLB-1897. Штамм обладает ауксотрофностью, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина дл роста, спорул ции и продуцировани кристаллов. 1 табл.

Description

Изобретение касаетс получени новой инсектицидной композиции, содержащей Hot ый штамм Bacillus thurlngiensis var. Kurstaki NRRLB-18197 в качестве активного ингредиента.

Инсектицидна композици используетс дл борьбы с видами насекомых отр да Met уекрылых, в частности, TRICHOPLUSIA Ml (совка ни), совка капустна и ARTOGEIA RAPAE импортированные мермитиды.

Спорообразующий микроорганизм В. thu inglensls был изолирован свыше 80 лет TON у назад, и с тех пор стал коммерчески изЈвстным в отношении биологической 6of ьбы с вредител ми. Спорообразующие клегки В. thuringiensis кажда продуцирует спс ру (эндоспору) и ромбовидный белковый крусталл (параспору или клеточное включение ). Энфомоцидные свойства приписываютс исключительно б-эндотоксину, который вл етс основным компонентом пар аспорального кристалла. Когда кристалл пер еходит в растворимое состо ние в кишке насекомого, он вызывает образование протоксина , который активизируетс в результате протеолитического расщеплени .

Явл сь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и москитов, В. thuringiensis вл етс безвредной к невосприимчивым отр дам насекомых, животных и человека. В насто щее врем в США В. thuringiensis разновидности Kurstaki включает в себ инсектицидные продукты В. thuringiensis наиболее широко используемые дл борьбы с этими вредител ми. Однако по отношению к этим продуктам отсутствует эффективный контроль на экономических уровн х применени .

С другой стороны, синтетические пи- ретроиды вл ютс химическими инсектицидными агентами, наиболее широко используемыми дл борьбы с Чешуекрылыми вредител ми. Пиретроиды вл ютс высокоэффективными и обеспечивают более сильные средства борьбы с вредител ми по сравнению и с используемыми в насто щее врем инсектицидными продуктами В. thuringiensis. Однако недостаток, св занЁ

00

VJ

V4 VI

ю

СА)

ный с использованием пиретроидов, состоИТ 9 ТОМ, ЧТО ОНИ ЯВЛЯЮТСЯ ТОКСИЧНЫМИ В

отношении не подлежащих уничтожению беспозвоночных, тем самым представл опасность дл окружающей водной жизни. Поэ гому существует потребность в ,зффекг тивиых инсектицидах, активных против Чешуекрылых , которые безопасны, дл окружающей среды, эффективны по стоимости и которые дублируют эффективности синтетических пиретроидов. v

Цель изобретени состоит в получении новой инсектицидной композиции, содержащей новый штамм В. thurlngiensls var. Kurstakl NRRL B-18197 о качестве активного ингредиента, который может быть использован дл борьбы з частности с Trichoplusia ni и Asiogeia rapal с насекомыми отр да Чешуекрылых.

Нос ый штамм F3. thuringiensls NRRL В- 18197 был депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хоз йства США, Пеори , ИллиноЛс 61604.

. Новый штамм вл етс спорогенным, крпсталлооразующим мутантным штаммом выделенных из окружающей среды В, thuringiensis и имеет способность продуци- рошпь бипирамидальные кристаллы, состо щие из токсичного белка, и вл етс уникальным в том отношении, что обладает ауксотрофносл ь;о, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина дл роста, слсрул цин и продуцировани кристаллов. В противоположность этому.ранее наблю- даемыз штаммы В, thuringiensis про вл ли ауксотрофность.не затрагивающую потребность в аминокислотах K.W.Nickerion et al., Appl. Microbiology, 28, 1 1;24-128, 1974,

Дл целей изобретени термин ауксот- рофность здесь означает потребность в питательных ееществах, необходимых дл роста, спорул ции и продуцировани кристаллов микроорганизма.

Фраза аминокислотный комплекс пи- тательной среды употребл етс здесь дл обозначени питательной среды, содержащей комбинацию двух или более аминокислот .

Новый штамм NRRL B-18197 размно- жен из почпе.чного сло с использованием неклассического способа отбора посредством ацетата натри и тепла. В соответствии с этим способом водна питательна среда буферизуетс примерно до 0,25 М ацетатом натри , чтобы допустить размножение только пежелоюпьных спорообразующих организмов , присутствующих в образце окружающего почвенного сло . Затем выращенные спорообразующие организмы и неспорообразующие организмы в образце убивали путем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей агаровой питательной среде дл получени нового штамма согласно изобретению. Не прибега к какой-либо конкретно теории, предполагаетс , что новый штамм согласно изобретени образуютс во врем процесса отбора в результате мутагенеза природных штаммов В. thuringiensis с последующей обработкой ацетатом натри и теплом.

Примером способа селекции вл етс следующий: 0,5 грамма почвы было добавлено в 10 мл L-бульона (100 мл воды, 1 г тритона, 0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 г хлористого натри ) в 125 мл.дефлекторной колбе, L-бульон был буферизован до 0,25 М ацетатом натри . Смесь встр хивалась в течение 4 часов при 250 об./мин. и 30°С. После использовани проточного теплового устройства пастеризации смесь нагревалась при 80°С в течение 3 минут. Термооб- работаина смесь высеивалась на чашки с L-агаром (L-бульон, отвержденный с помощью 1,5% агара) и инкубировалась в течение ночи (16 часов) при 30°С.

Штамм NRRL B-18196 имеет следующие характеристики: колонии вл ютс круглыми , цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2-7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки вл ютс аэробными, грам- положительными, подвижными палочками размеров 1-1,2 мкм на 3-5 мкм. Концевые (верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спорангий и составл ют от 33 до 50% вегетативных палочек. Клетки вл ютс положительными по катализе фермента глюкозы гидролизу казеина, но вопреки таксономическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В. thuringiensis, штамм согласно изобретению не использует цитраты. Новый штамм не ферментирует маннит, арабинозу и кислозу.

Дополнительно штамм NRRL B-18197 гидролизовал крахмал, использовал эску- лин, продуцировал лецитиназу и ферментировал салицин; клетки не продуцировали уреазу и не ферментировали маннозу или сахарозу. Штамм вл етс стойким по отношению к антибиотикам пеницилинового типа , к таким как нафициллин и метициллин, м вл етс стойким по отношению к низким уровн м, т.е. около 10 г/мл, неомицина, ка- намицина и бромида этида, Как сказано выше , продуцирование спор и белковых кристаллов В. thuringiensis NRRL B-J8197 требует водной питательной среды, котора содержит лейцин-валиновый аминокислотныС комплекс. Дл оптимального образо- вани кристалла бактери ми согласно изобретению предпочитаемый состав специальной питательной среды следующий:

{ триптона, 0,2 % триптозы, 0,45 % дрож- ого экстракта, полученного из буфера фата натри 0,01 М при рН 6,8 с добав0 ,3 же фо MgSCM и MnS04 после

,-9

обр

аботки в автоклаве. Примером предпочтит льной среды роста вл етс среда ТЗ, содержаща следующие ингредиенты: 0,3% триптона, 0,2% триптозы, 0,15% дрожжево- кстракта (или 0,65% пептона Bacillus), 1 М натрий фосфатного буфера с рН

,0,01% 1 М сульфата магни и 0,001% 1

го

10 6,

М фльфата марганца. Продуцирование клеток производитс в аэробных услови х при лю ой температуре, удовлетворительной

дл

ни

чи

27

ды

кул

но

в/

но

пр

cot

де

ни

ле(

ку;

ваь

роста микробов. Согласно изобрете- ), т.е. примерно от 10°С до 40°С; предпо- аемый диапазон температуры между С и 32°С. Величина рН питательной сресоответствующей дл выращивани

туры В. thurlnglensls близка к нейтраль- ти, т.е. рН от 6,7 до 7,2. Врем инкубации етс временем необходимым дл пол- о освобождени спор и кристалла и дпочтительно составл ет от 18 до 24 ча- , Клетки могут выращиватьс в любой лекторной встр хиваемой колбе в тече- небольших опытов. Дл операций в бо- крупных масштабах удобно выращивать -.туру в резервуаре, примен помеши- ие и аэрацию в отношении инркулиро- ваАной жидкой питательной среды. После ин субации клетки собираютс традици- он шм способом седиментации, как, на- , центрифугированием или фильтрованием. Клетки могут использо- ва ьс как таковые или в замороженном ви- де дл последующего использовани . Штамм вы держивают при 30°С и 250 об./мин в 2-х ли ровых конических колбах Эрленместера с т юйными перегородками при объеме 25% и хран т при температуре 25°С на среде ТЗ, от|ержденной 1,5% агаром.

Чтобы получить инсектицидную компо- зи ию с В. thuringiensis var. Kurstakl NRRL В- 8197 в качестве активного ингредиента штамм, составл ющий до 30% общего объ- емз смешивают с инертными ингредиентами , которые составл ют оставшийс объем, ъе. по крайней мере, 70% объема. Инерт- ньи ингредиент может быть разбавителем, ка с, например, вода. Другие инертные инг- ре :;иенты представл ют консерванты, агенты , регулирующие текучесть, агенты, способствующие прилипанию, спредеры, Э№ульгаторы, поверхностно-активные вещества , экстендеры и буфер. Используемый

5

0

5 0 5 0 5

0

5

интервал доз дл штамма составл ет от 1,1 х 1010до5х 1012 спор на 0,405 га. Инсектицид , содержащий мутант В.thurlnglensls NRRL B-18197 в качестве активного ингредиента в указанных дозах, вл етс высокоэффективным в уничтожении насекомых отр да Чешуекрылых, в частности совки капустной и импортированными мермитида- ми (см. таблицу).

Пример способа получени инсектицидной композиции включает смешение - через воздушное измельчение дл обеспечени частиц определенного размера и гомогенности - штамма NRRL В-18197, составл ющего до 30% общегд объема, с инертными ингредиентами, которые составл ют оставшийс объем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, 2 поверхностно активных вещества, агент, регулирующий текучесть , разбавитель и буфер. Смесь затем гранулируетс и упаковываетс в герметичные и влагонепроницаемые контитперы. Инсектицидные композиции могут распыл тьс с использованием соответствующих методов распылени и устройств. Новый инсектицид также может быть инкапусилиро- ван или заключен в соответствующий инкапсулирующий материал, такой как органический полимер, и примен тьс в порошковой форме. Также предусматриваетс , что генетический материал дл дельта- эндотоксина нового штамма В. thuringiensis NRRL B-18197 может переноситьс с помощью техники рекомбинантных ДНК в другие бактерии и растени дл обеспечени усиленной борьбы против вредителей. Лзо- бретение иллюстрируетс следующим примером .

П р и м е р. В полевых испытани х эффективность инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента NRRL B- 18197, в отношении совки капустной и импортированных мермитидов сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид ПИДРИН (Pydrln) и инсектицидный продукт В. thuringiensis разновидности Курста- ки ДИПЕЛЬ (Dlpel). ПИДРИН вл етс товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Шелл корпорейшен, и содержит 30% циано (3-феноксифенил)метил-4-хлор- альфа(1-метил)бензолацетата и 70% инертный ингредиентов. ДИПЕЛЬ вл етс товарным знаком продукта, продаваемого фирмой Абботт лабораториз и содержит 3,2% В. thuringiensis разновидности Кур- стаки и 98,8% инертных ингредиентов. Также испытывались две других инсектицидных композиции, содержащих в качестве активных ингредиентов В. thurlnglensls

var. Kurstaki NRRL B-18195 и В. thuringiensis var, morrisoni NRRL B-18196. Инсектициды, содержащие в качестве активных ингредиентов новые штаммы NRRL В-18197, В- 18195 и В-18196, содержали 5,5 х 109 спор на 0,5 л воды, 0,01 % общего объема составл л жидкий детергент (добавленный как спредер) и остальной объем составл ла вода .;

На Восточном Берегу Мэриленда капу- ста листова была пр мо высажена семенами в 4-р дных дел нках по 30,48 см длины 07 июл 1986 г. Растени отсто ли друг от друга на 5 см в р ду и 91,5 см между р дами. Обработки были организованы по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами. Каждый р д был буферизован защитным р дом . Почва была супесчаной почвой Норфолк А. Все обработки опрыскиванием включали 5,5 109 спор в 0,5 литров воды, в которую добавл лось 0,01 % жидкого детергента в качестве распыливающего вещества (спредера), Опрыскивани производились с помощью садового опрыскивател тромбо- нового типа, калиброванного дл подачи 113,55 л состава на 0,405 га.

Р ды обрабатывались опрыскиванием 11,18 и 25 августа и 2 сент бр и 8 сент бр . 15 сент бр производились оценки повреж- денной листвы и количества насекомых. По- вреждени вследствие естественно происход щего нашестви совки капустной и импортированных мермитидов было умеренным . Оценки повреждени листвы были в диапазоне от 1-5 и индексировались следующим образом: (1) 0-3% повреждени - случайные отверсти на листь х; (2) 4- 10% повреждени - несколько листьев с отверсти ми; (3) 11-25% повреждени - среднее/умеренное число листьев с отверсти ми; (4) 26-50% повреждени - большинство листьев с отверсти ми; и (5) 51-100% повреждени - повреждение корневой шейки и/или все листь с отверсти - ми.

Данные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значени выдел лись с помощью испытани множественного р да Дункана (DMRT) при Р 0,05 уровн (Дункан 1951). Результаты приведены в таблице ниже.

Таблица сно показывает отличные инсектицидные свойства нового штамма согласно изобретению в отношении совки капустной и импортированных мермитидов. Штамм В. thuringiensis В-18197 обеспечил статистически ту же защиту капусты листовой , как и ПИДРИН. Инсектицидные композиции , содержащие штаммы NRRL В-18195 и NRRL BH8196, в качестве активных ингредиентов, показывающие идентичные уровни защиты от совки капустной и импортированных мермитид в выражении среднего повреждени листьев, вл ютс статистически менее эффективными, чём ПИДРИН. Однако эти инсектициды обеспечивают 10-кратное увеличение активности по сравнению с промышленным инсектицидом В. thuringiensis ДИПЕЛЬ. Такое увеличение хорошо демонстрировалось , когда обработки веществом ДИПЕЛЬ показывали идентичный уровень борьбы (повреждение менее 10%), как и штамм В-18195 при разбавлении 1:10 первоначального состава.

(1)Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительно не отличаютс (Р 0,05) DMRT.

(2)Распыление производилось 11,18,25 августа и 2, 8 сент бр .

(3)Вред, причиненный, главным образом , совкой капустной и импортированными мермитидами.

(4)ДИПЕЛ 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 г.

(5)Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 г,

Claims

Формула изобретени Штамм бактерий Bacillus thuringiensis

var. Kurstaki NRRL В-18197 дл получени

инсектицидного препарата.

Продолжение таблицы

(1)

Среднее количество

совки капустной на

10 растений, 15сент бр

В. thuringlensis

В-18195(5) В. thurlngiensis

В-18196(5)

1/10 В-18195(5)

Дипел 376,93 г (4)

Необрабатываема

контрольна гр дка

(1)

Среднее количество мермитид импортированных на 10 расте- ний, 15 сент бр

(1,2.3)

Средн оценка повреждени листвы 15 сент бр

2,00 b

2,00 b 2,75 ede 2,50 bee

4,0 g