JPH0515364A

JPH0515364A - 新規なバシラス菌株及び害虫防除剤

Info

Publication number: JPH0515364A
Application number: JP3168435A
Authority: JP
Inventors: Toshihiko Iizuka; 敏彦飯塚; Michito Tagawa; 道人田川; Sachiko Yajima; 佐智子矢島; Masao Kuwabara; 正雄桑原; Yasushi Haruyama; 裕史春山; Toshiyuki Umehara; 利之梅原
Original assignee: Nissan Chemical Corp
Current assignee: Nissan Chemical Corp
Priority date: 1991-07-09
Filing date: 1991-07-09
Publication date: 1993-01-26
Also published as: EP0522836A3; EP0522836A2; US5266483A; CA2073373A1; US5516514A

Abstract

(57)【要約】【構成】その試料が、受託番号微工研菌寄第12289号
（FERM P-12289）、受託番号微工研菌寄第12291号（FER
M P-12291）及び受託番号微工研菌寄第12290号（FERM P
-12290）で寄託されているバシラス・チューリンゲンシ
ス（Bacillus thuringiensis）No.145株、バシラス・チ
ューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）No.116株
及びバシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuring
iensis）No.161株。【効果】この新菌株は、殺虫性結晶毒素を産生し、害虫
防除剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な細菌株に関し、特
に細菌バシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuri
ngiensis）の新規菌株及びその利用法に関する。すなわ
ち、本発明は、農耕地、非農耕地及び森林の植物に重大
な被害をもたらす鱗翅目害虫を、市販の薬剤よりも効果
的に防除する事の出来る殺虫性結晶毒素を有する新規菌
株並びにこれら新規菌株及び新規菌株の産生する結晶毒
素を含有する鱗翅目害虫撲滅用殺虫剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】細菌バ
シラス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensi
s）はグラム陽性の桿状菌で対数増殖末期の胞子形成期
に結晶蛋白質を産生する。この結晶蛋白質を昆虫が経口
的に消化管内に取り入れたとき、消化液中でアルカリ分
解、酵素分解を受け初めて腸管麻痺並びに全身麻痺を伴
う殺虫活性を示すことからδ−エンドトキシンとも呼ば
れる（Heimpel, A. M.; Ann. Rev., Entomology 12, 28
7-322, 1967)。

【０００３】バシラス・チューリンゲンシスの産生する
結晶蛋白質は、一般にダイヤモンド型（diamond-shape
d）、重ピラミッド型（bipyramidal）、偏菱型立方体
（rhomboidal）と呼ばれる形態をしている。結晶蛋白質
は、芽胞嚢内で、芽胞とならんで形成され、芽胞嚢の時
期を経て芽胞とともに菌体外に遊離する（Hannay, C.
L.; Nature 172, 1004, 1953 ）。

【０００４】バシラス・チューリンゲンシスの分類は、
De Barjac and Bonefoi（Entomophaga 7, 5-31, 1962
）の提案による鞭毛抗原（H-antigen）に基づいて行わ
れており、血清型１から23までの亜種ならびに鞭毛抗原
を持たないwuhanensis亜種と併せて24亜種（33菌株）が
報告されている（飯塚敏彦; 化学と生物 27, 287-302,1
989）。しかし、同じ血清型（セロタイプ：serotype）
の中にも異なる性質を持った菌株が見いだされている
（Krywienczyk, J., et al; J. Invertebr. Pathol.;3
1, 372-375, 1978、Iizuka, T., et al; J. Sericult.
Sci. Japan;50, 120-133, 1981）。

【０００５】バシラス・チューリンゲンシスの各菌株の
産生する結晶蛋白は、一般に鱗翅目昆虫に対して選択的
に殺虫活性を示すことが知られている。しかし、近年、
通常の重ピラミッド型結晶蛋白以外に、不定形立方体
（irregular）、並びに、立方体型（cuboidal）の結晶
を産生する亜種が次々と見いだされている（秋葉芳夫;
応動昆 30, 99-105, 1986 、Ohba, M., et al; J. Inve
rtebr. Pathol. 38, 307-309, 1981）。これらの中に
は、蚊の幼虫に強い活性を示す株やハムシ類に活性を示
す株も報告されている（Hall, I. M., et al; Mosquito
news 37, No.2, 1977）。

【０００６】バシラス・チューリンゲンシスの結晶蛋白
質遺伝子（Crystal Protein gene :CP gene）は、通常
菌体内の複数のプラスミッドDNAにコードされており、
既に幾つかの亜種で結晶蛋白質遺伝子がクローニングさ
れ、塩基配列も決定されている（飯塚敏彦;化学と生物
27, 287-302, 1989）。更に、クローニングされたCPgen
e を植物体に導入する研究が盛んに行われ、タバコ等幾
つかの植物に於いて成功例が報告されている（Vaeck,
M., etal;Nature 328, 33-37, 1987）。その為、より殺
虫性の高い遺伝子の検索が強く望まれている。

【０００７】バシラス・チューリンゲンシスの産生する
結晶毒素を摂取した鱗翅目害虫は数時間後に摂食行動を
止め、植物に対する損傷が停止される。ほとんどの種は
結晶毒物による中毒により約24〜72時間後に死亡する。
これには胞子の存在による敗血症を伴う事がある。この
様に、主たる効果は幼虫の中腸内に於ける結晶毒素の溶
解後にのみ作用する結晶によるものである。この様な結
晶毒素蛋白質の作用性、及び結晶毒素が易分解性のポリ
ペプチドであることから、ヒト、ペット類、鳥類、魚
類、或いは植物に対しては悪影響が知られていない。よ
って、バシラス・チューリンゲンシス並びにバシラス・
チューリンゲンシスの産生する結晶性毒素蛋白質は、環
境を汚染しない微生物農薬（ＢＴ剤）として、特に鱗翅
目害虫に対する殺虫剤として非常に有用であり、実際
に、バシラス・チューリンゲンシスの１種又は２種以上
の菌株は長い間農業用殺虫剤として使用されてきた。

【０００８】市販品として、最も一般に使用されている
バシラス・チューリンゲンシスの菌株はバシラス・チュ
ーリンゲンシス・バラエティ・クルスタキHD-1（Bacill
us thuringiensis var. kurstaki HD-1、以後HD-1と略
称する。）である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは今般公知の
菌株HD-1に、菌の形態は概ね似た性質を有するが、一連
の鱗翅目・双翅目の害虫に対して向上した殺虫活性を有
し、しかも有益鱗翅目昆虫である蚕には低い殺虫活性を
示す事によってHD-1と明確に区別されるバシラス・チュ
ーリンゲンシスの新規菌株を見い出した。

【００１０】本発明は、通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所にそれぞれ受託番号微工研菌寄第12289号
（FERM P-12289）、受託番号微工研菌寄第12291号（FER
M P-12291）、及び受託番号微工研菌寄第12290号（FERM
P-12290）として寄託された、バシラス・チューリンゲ
ンシス（Bacillus thuringiensis、以後Btと略称する）
の新規菌株バシラス・チューリンゲンシス・バラエティ
・クルスタキ（Bacillus thuringiensis var. kurstak
i）No.145株、No.116株及びNo.161株（以後各々No.145
株、No.116株及びNo.161株と略称する）に関する。

【００１１】本発明の別の要旨に於いては、前記の新規
菌株No.145、No.116及びNo.161によって産生された殺虫
性結晶毒素を主成分として含有することを特徴とする新
規殺虫剤組成物が提供されるものであり、更に害虫の被
害から植物を保護する方法であって、該害虫に前記の新
規菌株No.145、No.116及びNo.161によって産生された殺
虫性結晶毒素を摂食させること、或いは、害虫の被害を
受ける前に、又は被害を受けている間に植物に上記殺虫
性結晶毒素の害虫防除有効量を処理することからなる害
虫の被害から植物を保護する方法が提供されるものであ
る。

【００１２】本発明の新規菌株No.145、No.116及びNo.1
61は何れも北海道地方の土壌から単離した。本発明の新
規菌株No.145、No.116及びNo.161は、一般的な菌の形態
学的性状に於いては公知の菌株HD-1に類似している。

【００１３】〔本発明の新規菌株No.145の特性〕集落形態・・・・・・・・・・・・・・Btに典型的な大集落で、表面はくすんでいる。増殖期の細胞形態・・・・・・Btに典型的。鞭毛の血清型・・・・・・・・・・3a3b3c、クルスタキ（kurstaki）。細胞内含有物・・・・・・・・・・胞子形成細胞は菱型結晶を作り、この結晶が時に部分的に小さめの立方形結晶を含む。プラスミッド・・・・・・・・・・本菌のプラスミッドのアガロースゲル電気泳動は、HD-1 、Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-73( 以後 HD-73 と略称する) 、並びにBacillus thuringiensis v ar. kurstaki HD-263(以後HD-263と略称する) 等の公知のkurstaki菌株と明らかに異なっている。アルカリ可溶性蛋白・・・・本菌株は、125,000ダルトン付近に泳動される蛋白と60 ,000ダルトン付近に泳動される蛋白を持っている。活性・・・・・・・・・・・・・・・・・・本菌株は、試験された全ての鱗翅目害虫を殺虫し、その活性は市販のBt製剤や公知のHD-1に比べ５〜100倍高い活性を有している。しかしながら、有益鱗翅目昆虫である蚕には市販のBt製剤や公知のHD-1に比べ約20倍程低い活性を有している。又、双翅目害虫の蚊にも公知のHD-1 に比べ強い活性を示す。

【００１４】〔本発明の新規菌株No.116の特性〕集落形態・・・・・・・・・・・・・・Btに典型的な大集落で、表面はくすんでいる。増殖期の細胞形態・・・・・・Btに典型的。鞭毛の血清型・・・・・・・・・・3a3b3c、クルスタキ（kurstaki）。細胞内含有物・・・・・・・・・・胞子形成細胞は菱型結晶を作り、この結晶が時に部分的に小さめの立方形結晶を含む。プラスミッド・・・・・・・・・・本菌のプラスミッドのアガロースゲル電気泳動は、HD-1 、 HD-73、並びにHD-263等の公知のkurstaki菌株と明らか異なっている。アルカリ可溶性蛋白・・・・本菌株は、130,000ダルトン付近に泳動される蛋白と60 ,000ダルトン付近に泳動される蛋白を持っている。活性・・・・・・・・・・・・・・・・・・本菌株は、試験された全ての鱗翅目害虫を殺虫し、その活性は市販のB.t.製剤や公知のHD-1に比べ５〜80倍高い活性を有している。又、双翅目害虫の蚊にも公知のバシラス・チューリンゲンシス・バラエティ・イスラレンシス（Bacillus thuringiensis var. israelensis、以後 israelensisと略称する）とほぼ同等の活性を示す。

【００１５】〔本発明の新規菌株No.161の特性〕集落形態・・・・・・・・・・・・・・Btに典型的な大集落で、表面はくすんでいる。増殖期の細胞形態・・・・・・Btに典型的。鞭毛の血清型・・・・・・・・・・3a3b3c、クルスタキ（kurstaki）。細胞内含有物・・・・・・・・・・胞子形成細胞は菱型結晶を作り、この結晶が時に部分的に小さめの立方形結晶を含む。プラスミッド・・・・・・・・・・本菌のプラスミッドのアガロースゲル電気泳動は、HD-1 、HD-73 、並びにHD-263等の公知のkurstaki菌株と明らかに異なっている。アルカリ可溶性蛋白・・・・本菌株は、130,000ダルトン付近に泳動される蛋白と60 ,000ダルトン付近に泳動される蛋白を持っている。活性・・・・・・・・・・・・・・・・・・本菌株は、試験された全ての鱗翅目害虫を殺虫し、その活性は市販のBt製剤や公知のHD-1に比べ２〜50倍高い活性を有している。又、双翅目害虫の蚊にも公知のHD-1に比べ強い活性を示す。

【００１６】しかしながら、上記の様な類似性があるに
も関わらず、本発明の新規菌株No.145、No.116及びNo.1
61が一連の鱗翅目害虫や双翅目害虫に対してHD-1と比べ
て著しく高い殺虫活性を示した。一方、有益鱗翅目昆虫
である蚕に対しては、HD-1と比べて低い殺虫活性を示し
た。

【００１７】又、産生される毒素蛋白の蛋白質分解酵素
や各種昆虫中腸消化液に対する切断パターンも公知の菌
株であるHD-1と比べ異なっている。例えば、蛋白質分解
酵素であるトリプシンを用いた実験によれば、公知のHD
-1由来の毒素蛋白は、トリプシン処理によって130Kd蛋
白が低分子化されるが、本発明のNo.145、No.116および
No.161は低分子化され難く、しかも低分子化された際の
泳動パターンがHD-1と異なっている（図１参照）。

【００１８】更に、本発明の新規菌株No.145、No.116及
びNo.161と公知菌株HD-1の保持するプラスミッドを常法
により調製し、アガロースゲル電気泳動により比較を行
ったところ、公知菌株HD-1の保持するプラスミッドパタ
ーンとは異なったパターンを示すことが判明した。

【００１９】以上のような事実から、本発明のNo.145、
No.116及びNo.161の菌株は、菌株並びに菌株の産生する
毒素蛋白が公知菌株であるHD-1と明らかに異なることか
ら、新規菌株と判断し、本発明を完成するに至った。

【００２０】本菌株であるバシラス・チューリンゲンシ
ス・バラエティ・クルスタキ（Bacillus thuringiensis
var. kurustaki)No.145 株、No.116株及びNo.161株
（以後各々No.145株、No.116株及びNo.161株と略称す
る）は、標準的な既知培地と発酵手段を用いて培養出来
る。すなわち、培地は、炭素源としては、例えば、蔗
糖、麦芽糖、グルコース、フラクトース、糖蜜、可溶性
デンプン等が利用できる。

【００２１】窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、綿実粉、酵母エキス、大豆粉、
カゼイン水解物等が挙げられる。又、ミネラル及びビタ
ミンは、糖蜜、酵母エキス等の有機炭素源及び窒素源で
代用する事ができ、必要に応じては、無機塩類、ビタミ
ン等を更に添加しても良い。pHは、５〜８が好ましく、
培養温度は、好ましくは25〜30℃、培養日数は２〜５日
間が良い。培養方法は、好気的条件下での通気攪拌培養
が好ましい。大量培養する場合は、深部通気攪拌培養が
望ましい。

【００２２】培養終了後、培養液から結晶性毒素含有部
分を分離採取する場合、通常の遠心分離法、濾過法等を
利用する。又、培養終了後菌体及び／又は遊離結晶毒素
等を含有する培養液を、濃縮又は乾燥させて粉末にする
場合も、結晶性毒素活性を阻害しない範囲に於いて通常
の濃縮法や乾燥法（例えば噴霧乾燥法等）を用いれば良
い。

【００２３】上記方法で得た結晶毒素が生菌を含有する
場合、必要に応じて通常用いる事の出来る殺菌方法を利
用して殺菌する。例えば、熱処理、超音波処理、ゴーリ
ンホモジナイザー処理、放射線照射等の物理的殺菌法、
ホルマリン、過酸化水素、亜硫酸塩類、塩素化合物、β
−プロピオラクトン、界面活性剤、エチレンオキサイ
ド、プロピレンオキサイド等の化学的殺菌法、自己溶
解、ファージ処理、リゾチーム処理等の生物的殺菌法等
が挙げられるが工業的には、熱処理法、ゴーリンホモジ
ナイザー処理法、化学的殺菌法が利用し易い。この際
に、結晶性毒素活性を阻害しない範囲で用いることは云
うまでもない。

【００２４】得られた結晶毒素含有成分を害虫防除剤と
して使用するに当たっては、一般に適当な担体、例えば
タルク、カオリン等の天然の鉱物繊維や、軽石、ベント
ナイト、珪藻土等の固体担体或いは水等のような液体担
体と混用して適用することができ、所望により乳化剤、
分散剤、懸濁剤、浸透剤、展着剤、安定剤等を添加し、
水和剤、粉剤、粒剤、フロアブル剤等任意の剤型として
実用に供することができる。

【００２５】又、必要に応じて製剤時又は散布時に、結
晶性毒素活性を阻害しない範囲に於いて他種の除草剤、
各種殺虫剤、殺菌剤、植物生長調節剤、共力剤、誘引
剤、植物栄養剤、肥料等と混合使用することもできる。

【００２６】本発明の結晶毒素含有成分の施用薬量は適
用場面、施用時期、施用方法、対象病害虫、栽培作物等
により差異はあるが、一般には有効成分組成として、通
常、0.1〜99%、好ましくは0.5〜50%程度が適当である。

【００２７】次に、本発明の各種製剤の配合割合及び種
類の例を下記に記載する。 ─────────────────────────────────── 有効成分担体界面その他の成分活性剤（補助剤） ─────────────────────────────────── 水和剤 1〜70 15〜93 3〜10 0〜5 粉剤 0.01〜30 67〜99.5 0〜3 粒剤（ベイト剤） 0.01〜30 67〜99.5 0〜8 フロアブル剤 1〜70 10〜90 1〜20 0〜10 ─────────────────────────────────── 上記の表中の数値は、重量%を示す。

【００２８】施用に際しては、水和剤及びフロアブル剤
では所定量の水で希釈して散布し、粉剤及び粒剤は水で
希釈することなく、そのまま直接散布する。次に、上記
の各製剤中の各成分の例を挙げる。

【００２９】〔水和剤〕有効成分：本発明の結晶毒素含有物担体：炭酸カルシウム、カオリナイト、ジーク
ライトＤ、ジークライトＰＥＰ、珪藻土、タルク界面活性剤：ソルポール、リグニンスルホン酸カルシ
ウム、ルノックスその他の成分：カープレックス＃８０

【００３０】〔粉剤〕有効成分：本発明の結晶毒素含有物担体：炭酸カルシウム、カオリナイト、ジーク
ライトＤ、珪藻土、タルクその他の成分：ジイソプロピルホスフェート、カープレ
ックス＃８０

【００３１】〔粒剤ベイト剤〕有効成分：本発明の結晶毒素含有物担体：小麦粉、フスマ、コーン・グリット、ジ
ークライトＤその他の成分：パラフィン、大豆油

【００３２】〔フロアブル剤〕有効成分：本発明の結晶毒素含有物担体：水界面活性剤：ソルポール、リグニンスルホン酸ソー
ダ、ルノックス、ニッポールその他の成分：エチレングリコール、プロピレングリコ
ール

【００３３】次に、本発明の結晶毒素含有物を有効成分
とする害虫防除剤の製剤例を示すが、本発明はこれらに
限定されるものではない。尚、以下の製剤例に於いて、
「部」は重量部を意味する。

【００３４】製剤例１水和剤本発明の結晶毒素含有物・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２５部ジークライトＰＥＰ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・６６部（カオリナイトとセリサイトの混合物：ジークライト工業（株）商品名）ソルポール５０３９・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・４部（アニオン性界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名）カープレックス＃８０・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３部（ホワイトカーボン：塩野義製薬（株）商品名）リグニンスルホン酸カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２部以上を均一に混合粉砕して水和剤とする。

【００３５】使用に際しては、上記水和剤を500 〜2000
倍に希釈して本発明の結晶毒素含有成分量がヘクタール
当たり0.1〜５kgになるように散布する。

【００３６】製剤例２粉剤本発明の結晶毒素含有物・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３．０部クレー・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・９５部燐酸ジイソプロピル・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１．５部カープレックス＃８０・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５部（ホワイトカーボン：塩野義製薬（株）商品名）以上を均一に混合粉砕して粉剤とする。

【００３７】使用に際しては、上記粉剤を本発明の結晶
毒素含有成分量がヘクタール当たり0.1〜５kgになるよ
うに散布する。

【００３８】製剤例３フロアブル剤本発明の結晶毒素含有物・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３５部ルノックス１０００Ｃ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．５部（陰イオン界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名）ソルポール３３５３・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１０部（非イオン性界面活性剤：東邦化学工業（株）商品名）１％ザンタンガム水溶液・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０部（天然高分子）水・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・３４．５部本発明の結晶毒素含有成分を除く上記の成分を均一に
溶解し、次いで本発明の結晶毒素含有物を加えて良く攪
拌した後、サンドミルにて湿式粉砕してフロアブル剤を
得る。

【００３９】使用に際しては、上記フロアブル剤を50〜
2000倍に希釈して本発明の結晶毒素含有成分量がヘクタ
ール当たり 0.1〜５kgになるように散布する。

【００４０】更に、バシラス・チューリンゲンシスの産
生する毒素蛋白は、菌株の有する巨大プラスミッド中に
含有されている遺伝子によりコードされている事が広く
知られている。よって、公知の遺伝子組換え技術によっ
て、殺虫性結晶毒素遺伝子をクローニングし、該毒素遺
伝子を大腸菌やシュードモナス属菌等の細菌、或いは鱗
翅目害虫の標的となる植物中に導入し、目的の鱗翅目害
虫の撲滅に使用する事も可能である。

【００４１】本発明の鱗翅目害虫による虫害から植物を
保護する方法は、一般に害虫が蔓延した植物に又は蔓延
しそうな植物を水のような希釈剤で希釈した上記の殺虫
剤組成物で処理する（例えば噴霧する）ことによって行
う。該殺虫剤の有効成分は有毒性のδ−菌体内毒素であ
る。所望ならば、該殺虫剤は有毒性のδ−菌体内毒素を
産生する細菌から独立して、植物に又は蔓延する害虫に
施用することが出来る。しかし、前記の細菌から結晶性
蛋白を分離することは一般に必要ではない。

【００４２】本発明の鱗翅目害虫による被害から植物を
保護する方法を実施する一つの方法は、害虫の被害に感
受性の植物がその生体内の現場でδ−エンドトキシンを
産生するように植物を調製する事である。これは新規菌
株No.145、No.116又はNo.161株からδ−エンドトキシン
の遺伝子を公知の方法でクローニングし、植物体内に該
遺伝子の発現を起こさせるような適当なプロモーター
（例えばCaMV35S プロモーター）を該遺伝子に具備さ
せ、次いで植物を公知の方法（例えばTiプラスミッドや
エレクトロポーレーション法等の使用）で形質転換する
ことによって行われる。上記のことを具現させるような
方法は既に公知の文献等に詳しく示されている。

【００４３】本発明の方法で撲滅し得る害虫は鱗翅目
（Lepidoptera）例えば以下の、ハスモンヨトウ（Spodo
ptera litura）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exi
gua）等のヨトウガ（Mamestra brassicae）類、コナガ
（Plutella xylostella）、コブノメイガ（Cnaphalocro
cis medinalis）、ニカメイガ（Chilo suppressali
s）、イチモンジセセリ（Parnara guttata）、モンシロ
チョウ（Pieris rapae crucivora）、イラガ（Monema f
lavescens）、キアゲハ（Papilio machaon hippocrate
s）等の害虫及び双翅目（Diptera）例えばネッタイシマ
カ（Aedes aegipti）、アカイエカ（Culex pipiens pal
lens）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）シナハマ
ダラカ（Anopheles hyrcanus sinensis）等の害虫が挙
げられる。

【００４４】本発明の方法は鱗翅目害虫が蔓延し易い広
範囲の植物を保護するのに使用することが出来る。本発
明の方法で保護される植物は具体例に挙げた、カンラン
等に代表される野菜類の他、カリフラワー等の果菜類、
柑橘・落葉果樹及び花樹である。又、植林地及び公園等
の非農耕地の樹木等や森林の樹木等が挙げられる。

【００４５】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４６】実施例１本発明のバシラス・チューリン
ゲンシス・バラエティ・クルスタキNo.145、No.116及び
No.161各株の単離北海道内の各地方（No.145株は芽室地方、No.116株は道
南地方、No.161株は母子里地方）で採取した土壌を試料
とし、その土壌１ｇを三角フラスコに入れ10mlの滅菌蒸留水
を注入し30分間振盪した後、暫時静置した。その上澄み
液２mlを採り直ちに98℃で10分間加熱した。加熱液は10
倍、100倍の２段階希釈し、各々１mlを普通栄養寒天培
地（肉エキス0.3%、ペプトン0.3%、寒天1.5%、pH 7.0）
と共に９cmのペトリ皿で、30℃、24〜48時間培養した。
得られたコロニーは全て普通斜面培地に植え30℃、４日
〜６日間培養し、芽胞と結晶の識別染色を行った後、位
相差顕微鏡（油浸レンズを使用し1500倍の倍率）により
結晶蛋白質産生の有無を観察した。結晶蛋白質は通常は
重ピラミッド型 (bipyramidal)であるが、必ずしも重ピ
ラミッド型とは限らない。

【００４７】結晶が認められた陽性（crystal-positiv
e）コロニーは、純培養物を確実に取得する為に、普通
栄養寒天平板培地上に画線塗抹し、30℃で３日間培養し
た。結晶の存在を確認し且つ純度を調べる為に識別染色
法を反復した。純化したコロニーは寒天斜面に移植し、
保存した。

【００４８】実施例２結晶毒素蛋白質の精製本発明の菌株を普通栄養寒天培地に播き、30℃で培養し
た。適当な時期に、菌株を一部採取し染色後、位相差顕
微鏡（1500倍）を用いて結晶毒素の産生を確かめた。そ
の後、平板培地に50mMのトリス−塩酸緩衝液（pH 8.0）
を加え集菌し、遠心分離して菌体並びに結晶の混合ペレ
ットを回収した。更に溶出してくる夾雑物と胞子の除去
の為に、山本等の方法（山本敬司等；蛋白質核酸酵素 2
9, 444-454, 1984）に従い、ペレットに１Ｍ食塩水を加
え、浮遊液を強く振盪し発泡させ、表面に浮遊してくる
芽胞が多数含まれる泡を除去、再び遠心分離して上澄み
液を捨てる一連の手順を３回繰り返した。続いて、滅菌
蒸留水で洗浄、遠心分離後、少量の滅菌水を加え懸濁
後、飯塚等によるパーコール処理法により結晶毒素を単
離した。

【００４９】実施例３結晶毒素蛋白質のトリプシンに
よる切断パターンの検討実施例２で得られた結晶毒素蛋白質をアルカリ溶液で可
溶化後、トリプシンを加え、37℃で一定時間インキュベ
ートした処理液を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ泳動パターンを調べた。尚、対照と
しては、HD-1を実施例２と同様に培養、処理を行い本実
験に用いた。

【００５０】結果を図１に示した。

【００５１】実施例４菌株の培養本発明の菌株を一白金耳とり、５mlの普通栄養液体培地
を含んだ試験管に植菌し、30℃で12〜24時間往復振盪培
養を行い種培養液を得た。種培養液を終濃度1%となるよ
うに100mlのポテト−デキストロース液体培地（Potato-
Dextrose培地；ポテトインフージョン 20%、デキストロ
ース 2%、pH 7.0）を含んだ500ml容三角フラスコに植菌
し、30℃で50〜70時間、200rpmで回転振盪培養を行っ
た。次いで、細胞、胞子及び結晶を遠心分離によって回
収した。得られたペレットに適当量の水を加えて超音波
破砕を行い、遠心分離後、凍結乾燥した。得られた乾燥
物を秤量し濃度調製後、以下の各殺虫試験に用いた。

【００５２】実施例５本発明菌株のハスモンヨトウ
（Spodopteralitura）に対する殺虫試験所定濃度の本発明菌株調製溶液（実施例４の方法で調
製）に展着剤を加え、カンランの葉を約10秒間浸漬し、
風乾後、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れ
た。この中に、ハスモンヨトウ２齢幼虫をカップ当たり
10頭放虫し、孔の開いた蓋をして、25℃の恒温器に収容
した。放虫より３日経過後の死虫率を下記の計算式から
求めた。尚、試験は２区制で行った。又、活性の比較の
為、HD-1を実施例４と同様に培養、処理を行い本実験に
供した。

【００５３】死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００５４】結果を、表１に示した。

【００５５】

【表１】

【００５６】実施例６本発明菌株のコナガ（Plutella
xylostella）に対する殺虫試験所定濃度の本発明菌株調製溶液（実施例４の方法で調
製）に展着剤を加え、カンランの葉を約10秒間浸漬し、
風乾後、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れ
た。この中に、コナガ２齢幼虫をカップ当たり10頭放虫
し、孔の開いた蓋をして、25℃の恒温器に収容した。放
虫より３日経過後の死虫率を下記の計算式から求めた。
尚、試験は２区制で行った。又、活性の比較の為、HD-1
を実施例４と同様に培養、処理を行い本実験に供した。

【００５７】死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００５８】結果を、表２に示した。

【００５９】

【表２】

【００６０】実施例７本発明菌株のシロイチモジヨト
ウ（Spodoptera exigua）に対する殺虫試験所定濃度の本発明菌株調製溶液（実施例４の方法で調
製）に展着剤を加え、カンランの葉を約10秒間浸漬し、
風乾後、湿った濾紙を入れたスチロールカップに入れ
た。この中に、シロイチモジヨトウ２齢幼虫をカップ当
たり10頭放虫し、孔の開いた蓋をして、25℃の恒温器に
収容した。放虫より３日経過後の死虫率を下記の計算式
から求めた。尚、試験は２区制で行った。又、活性の比
較の為、HD-1を実施例４と同様に培養、処理を行い本実
験に供した。

【００６１】死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００６２】結果を、表３に示した。

【００６３】

【表３】

【００６４】実施例８菌株の大量培養本発明の菌株を一白金耳とり、10mlの普通栄養液体培地
を含んだ100ml容三角フラスコに植菌し、30℃で12〜24
時間回転振盪培養（200rpm）を行い種培養液を得た。種
培養液を終濃度1%となるように1000mlのポテト−デキス
トロース液体培地（Potato-Dextrose 培地；ポテトイン
フージョン20%、デキストロース2% 、pH 7.0）を含んだ
5000ml容三角フラスコに植菌し、28℃で３〜５日間、14
0rpmで回転振盪培養を行った。次いで、細胞、胞子及び
結晶を遠心分離によって回収した。得られたペレットに
適当量の水を加えて超音波破砕を行い、遠心分離後、凍
結乾燥した。得られた乾燥物を秤量し濃度調製後、以下
の各殺虫試験に用いた。

【００６５】実施例９カンラン圃場に於けるモンシロ
チョウ（Pierisrapae crucivora）及びヨトウガ（Mames
tra brassicae）の幼虫に対する効果本発明のNo.145及びNo.161株の培養菌体処理物（実施例
８の方法で調製した。）の125ppm溶液及び市販のＢＴ製
剤トアロー水和剤（東亜合成化学工業株式会社商標）の
140ppmの薬液に展着剤を加え、カンラン圃場でモンシロ
チョウ及びヨトウガの幼虫に対する効果を検討した。試
験は１区10株２反復で行い、調査は、散布前、散布後４
日、６日、８日、及び10日に行った。

【００６６】結果を表４に示した。

【００６７】

【表４】

【００６８】実施例１０カンラン圃場に於けるモンシ
ロチョウ（Pieris rapae）及びコナガ（Plutella xylos
tella）の幼虫に対する効果本発明のNo.145及びNo.161株の培養菌体処理物（実施例
８の方法で調製した。）の100ppm溶液及び市販のＢＴ製
剤トアロー水和剤（東亜合成化学工業株式会社商標）の
140ppmの薬液に展着剤を加え、カンラン圃場でモンシロ
チョウ及びコナガの幼虫に対する効果を検討した。試験
は１区24株２反復で行い、調査は、散布前、散布後４日
及び８日に行った。

【００６９】結果を表５に示した。

【００７０】

【表５】

【００７１】実施例１１蚕（Bombyx mori）３齢幼虫
に対する活性本発明のNo.116、No.145及びNo.161の各菌株の培養菌体
処理物（実施例４の方法で調製）及びトアロー（7%WP）
を、蚕用人工飼料10ｇに重量／重量（weight/weight）
となるように均一に混ぜた。この飼料を、スチロールカ
ップ内に２〜３mmの厚さになるように入れ、蚕３齢、２
日幼虫を10頭づつ放虫した。その後、25℃の恒温器に収
容し、５日後に生死の調査を行い、以下の式で死虫率を
求めた。

【００７２】死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００７３】結果を表６に示した。

【００７４】

【表６】

【００７５】実施例１２ヒトスジシマカ（Aedes albo
pictus）に対する殺虫試験本発明のNo.116、No.145及びNo.161の各菌株の培養菌体
処理物（実施例４の方法で調製した）を脱イオン水で希
釈し、腰高シャーレに入れた。この中に、ヒトスジシマ
カ２齢幼虫10頭を放虫して、25℃の恒温器に収容した。
放虫より３日後の死虫率を下記の計算式から求めた。
尚、試験は２区制で行った。更に、対照として、Bacill
us thuringiensis kurstaki HD-1株並びにBacillus thu
ringiensisisraelensis株を上記と同様に処理した培養
処理物を用いた。

【００７６】死虫率（％）＝（死虫数／放虫数）×１００

【００７７】結果を表７に示した。

【００７８】

【表７】

【００７９】

【発明の効果】本発明は、農業上重大な被害を及ぼす害
虫を、従来の薬剤に比べより効果的に撲滅することが可
能である新規菌株並びに新規菌株を用いた害虫防除剤に
関し、本発明を実施することにより、農薬業界及び農業
の分野に広く貢献出来るものである。

【００８０】

【図面の簡単な説明】

【図１】Bacillus thuringiensis kurstaki No.145、Ba
cillus thuringiensis kurstaki No.116、Bacillus thu
ringiensis kurstaki No.161及びBacillus thuringiens
is kurstaki HD-1からのアルカリ可溶蛋白質のトリプシ
ン処理により得られた蛋白質のSDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のパターン

【符号の説明】１ Bacillus thuringiensis kurstaki No.116株由来の
結晶毒素タンパク質のトリプシン処理後の電気泳動パタ
ーン２ Bacillus thuringiensis kurstaki No.145株由来の
結晶毒素タンパク質のトリプシン処理後の電気泳動パタ
ーン３ Bacillus thuringiensis kurstakiNo.161株由来の
結晶毒素タンパク質のトリプシン処理後の電気泳動パタ
ーン４ Bacillus thuringiensis kurstakiHD-1株由来の結
晶毒素タンパク質のトリプシン処理後の電気泳動パター
ン５トリプシンの電気泳動パターン６泳動マーカー（上から200, 116, 97.4, 66, 45Kd）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者桑原正雄埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産化学工業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者春山裕史埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産化学工業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者梅原利之埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産化学工業株式会社生物科学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】その試料が、受託番号微工研菌寄第1228
9号（FERM P-12289）、受託番号微工研菌寄第12291号
（FERMP-12291）及び受託番号微工研菌寄第12290号（FE
RM P-12290）で寄託されているバシラス・チューリンゲ
ンシス（Bacillus thuringiensis）No.145株、バシラス
・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）No.1
16株及びバシラス・チューリンゲンシス（Bacillus thu
ringiensis）No.161株。
【請求項２】微生物がバシラス・チューリンゲンシス
・バラエティ・クルスタキ（Bacillus thuringiensis v
ar. kurstaki）No.145である請求項１記載の菌株。
【請求項３】微生物がバシラス・チューリンゲンシス
・バラエティ・クルスタキ（Bacillus thuringiensis v
ar. kurstaki）No.116である請求項１記載の菌株。
【請求項４】微生物がバシラス・チューリンゲンシス
・バラエティ・クルスタキ（Bacillus thuringiensis v
ar. kurstaki）No.161である請求項１記載の菌株。
【請求項５】請求項１記載のバシラス・チューリンゲ
ンシス菌株No.145株、No.116株及びNo.161株によって産
生された殺虫性結晶毒素を有効成分として含有する害虫
防除剤。
【請求項６】固体希釈剤及び／又は界面活性剤を含有
する請求項５記載の害虫防除剤。
【請求項７】害虫による被害から植物を保護する方法
であって、該害虫に請求項１記載のバシラス・チューリ
ンゲンシス菌株No.145株、No.116株及びNo.161株によっ
て産生された殺虫性結晶毒素を摂食させることからな
る、害虫による被害から植物を防除する方法。
【請求項８】害虫の被害を受ける前に、又は被害を受
けている間に植物に請求項５又は６の何れかに記載の害
虫防除剤の害虫防除有効量を処理することからなる請求
項７記載の方法。
【請求項９】害虫が鱗翅目害虫である請求項７又は８
の何れかに記載の方法。
【請求項１０】害虫が双翅目害虫である請求項７又は
８の何れかに記載の方法。
【請求項１１】殺虫性結晶毒素が請求項１記載のバシ
ラス・チューリンゲンシス菌株No.145株によって産生さ
れる請求項７又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１２】殺虫性結晶毒素が請求項１記載のバシ
ラス・チューリンゲンシス菌株No.116株によって産生さ
れる請求項７又は８の何れかに記載の方法。
【請求項１３】殺虫性結晶毒素が請求項１記載のバシ
ラス・チューリンゲンシス菌株No.161株によって産生さ
れる請求項７又は８の何れかに記載の方法。