RU1709731C - Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека - Google Patents
Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человекаInfo
- Publication number
- RU1709731C RU1709731C SU904834066A SU4834066A RU1709731C RU 1709731 C RU1709731 C RU 1709731C SU 904834066 A SU904834066 A SU 904834066A SU 4834066 A SU4834066 A SU 4834066A RU 1709731 C RU1709731 C RU 1709731C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- properties
- human lymphotoxin
- lymphotoxin
- plt21
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биоте)(:ноло- гии, в частности к генетической инженерии, и позвол ет получать микробиологическим синтезом новый полипептид со свойствами лимфотоксина человека при упрощеннойтехнологии его получени . Целью изобретени вл етс повышение выхода пслипеп- тида со свойствами лимфотоксина человека. Создана нова рекомбинаитйа плазми.аа pLT21, кодирующа полипептид, представл ющий собой укороченный на 21 амино" кислотный остаток лимфотоксин человека и штамм Е.соП 20050/pLT21, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Рекомбинантн'а пла'змида pLT2T содержит полусинтетичёский ген полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Она состоит из Hind 1П Крп1 - фрагмента плазмиды pTNF31, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага 17, Терминатор трг.н.'.крипции фагаАи гены^-лактамазы и хлорамФенико- дацетйлтрансферазы. и Kpnl/Hind III -фрагмента, содержащего синтетический участок инициации трансл ции и мутантный геном лимфотоксина человека. Штамм Escherichla coli SG.20050/pLT21 обеспечивает высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека и упрощенной технологией его выделени . 2 с.п, ф-лы, 2 ил„
Description
Изобретение относитс к биотехнологии , а частности к генетической инженерии, и представ/1 ет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полусмнтетический ген лиМфотоксина чело-века, промоторы ранней области бактериоф га Т7 и синтетический участок инициации трансл ции, обусловливающий биосинтез полипептида с биологической активностью лимфотоксина человека , а также штамм Escherlchia coll - продуцент этого полипептида.
Лимфотоксин (ЛТ) представл ет собой гликопротеин с мол. м. около 25000 Да. 8 организме человека лимфотоксин главным образом продуцируетс ктипированными Т-лимфоцитами. В опытах in v.itro и in vivo было продемонстриров но. что природный (гЛикоЭилированный) и рекомбинантный (нег икозилированный) лимфотоксин вызывает геморрагический некроз некоторых видов солидных опухолей, ггричем как и 0 случае фактора Кекрбза опухоли особенно эффективно его цитотоксическа активнбсть прр вл етс на опухол х с повышенной |йалигнатностью. Как и фактор некроза опухоли лимфотоксин, вл сь иммуномодул тором широкого спектра дейстаи , про вл ет свою.цитотоксическую актианость .аьгсоко збирательно, воздейству лишь на опухопевые клетки и не затрагива здоровые , нетрансформироваиные клетки. Кроме того, следует отметить, что лимфотоксин обладает выраженным противовирусным действием по отношению к р ду ДНК- и РНК-содержа1цих вирусов. Все это делает медицинское применение лимфотоксина человека чрезвычайно перспективным.
Известен способ получени лимфотокейна человеке, основанный на культивироёанйи опухолевых линий клеток человека RPMI-I788 и АС5-ё. которые при инДукции форболовыми эфирами, бактериальными эндотоксинами и конканавалином А секретйруют лимфотоксии во .внеклеточную среду .
Недостатками этого метода вл ютс Чрезвычайно низкий выход целевого продукта , трудности крупномасштабного культивировани клеточных линий и, как следствие, высока стоимость препаратов ЛТ,.
Значительно более перспективным вл етс способ получени лимфотоксина микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получени целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого /сходного сырь . Использование при этом химического подхода позвол ет со13Ддть оптимальные дл бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регул торных элементов, контролирующих его экспрессию.
Известна рекомбинантна плазмида pLTtf р t, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в которой ген ЛТ экспрессируетс под контролем промотора триптофанового оперона. Сведени об уровне биосинтеза, лимфотоксииа штаммом Е.соИ. содержащий плазмиду pLTtrpt, отсутствуют .
Известна рекомбинантна плазмида pLT13tac6-8.2. кодирующа пол41пептид со свойствами лимфотоксина человека, сконструированна на основе плэзмидного вектора рКК223-3. П азмида pLTtac6-8.2 содержит укороченный ген, йодирующий Белок , у которого в отличие от природного белка вместо первых дес ти Ы-кйицевых аминокислотных остатков имеетс последовательность AspLeu. Така конструкци 8
штамме Е.соИ JM105 при индукции изопропилтио-/ -D- галактозидом (IPTG) обеспечивает экспрессию измененного гена ЛТ, причем биологически активный белок составл ет t% суммарного белка бактерий.
0 Недостатком плазмиды pLTtac6.8-2 вл етс недостаточно высокий уровень биосинтеза ЛТ, обеспечиваемый содержащим ее штаммом-продуцентом, а также необходимость в этом случае и в случае плазмидь
S pLTtrpI осуществлени нетехнологической стадии индукции биосинтеза при по. учении лимфотоксина, так как экспресси генов ЛТ в этих конструкци х индуцибельна.
Кроме того, недостатком известных
0 плазмид вл етс также то, что все они имеют малопригодную дл генно-инженерных операций рестриктную кэрту, что значительно затрудн ет дальнейшие операции по уЬовершенстеованиюплазмидных
5 конструкций с целью достижени макси- мальной экспрессии полусинтетического гена ЛТ.
Известна рекомбинантн плазмидна ДНК pLT9, кодирующа укороченный с
0 N-конца полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в котором 9 N-концевых аминокислот заменены остатком валина. Экспресси гена укороченного полипептида в плазмиде р1Тб контролируетс консти5 тутиаными промоторами А2-и A3 райней
области бактериофага Т и синтетическим
участком инициации трансл ций. Штамм
Е.соИ SG 20050, содержащий плазмиду
pLT9, обеспечивает вьлсокий уровень пол0 ипептида со свойствами лимфотоксина человека (свыше 4 X 10 ед/мл клеточной суспензии).
По .принципу конструировани рекомбинантна плазмида pLT9, содержаща измененный ген лимфотоксина, вл етс наиболее близким техническим решением к изобретению.
Целью изобретени вл етс повышение выхода полипептида со свойствами
0 лимфотоксина человека.
Поставленна цель достигаетс с помощью новой рекомбинантной плазмиды Р-1.Т21, кодирующей конститут-ивный синтез полипептиДа со свойствами димфотоксина
5 человека, и штамма E.coli SG 20050/pLT2t, обеспечивающего уровень экспрессии ЛТ2 X 10 efi./мп клеточной суспензии при плотности клеток 10 клоток/мп.
Рекомбинантнэ плл мидна ДНК OLT21, кодирующа пЬ-Имгл-гид со свойствами лимфотоксина человека, характеризуетс следующими признаками: кодирует аминокислотную последовдтепьность лимфотоксина человека, у которо го делегирован 21 М-концевоЛ аминокислотный остаток, имеет мол.м. 2,62 МДэ{4.02т.п,о.),: состоит из: Hfndlll/Kpni - фрагмента ДНК.плззми дырТМРЗ, содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области 6актерйрфэ а Т7, те|5минатортранскрипции фага л мбда, ген Д-лактамаэы и ген хлорамфениколацетилтрансферазы (3,4 Т.П.О.). Kpnl/Hindtll - фрагмента, coдepжaщёt i синтетический сайт инициации трансл ций и мутантный геном лимфотоксина человека (0.63 Т.П.О.). содержит: в качестве генетического маркера гём -лактамазы и ген хлорамфениколацетилтрансферазы , детерминирующие устойчивость трансформированных плазмидой pLT21 клеток Е.соИ к пенициллйноаым антибиотикам и хлорамфениколу. уникальные сайты узнавани рестрикционными эндонуклеазами. распрложеннь ми на следующих расстойии х впрйвр от сайта Kpnl: Gsul - 129 нуклеоТидоа. Salt 618 ну кл еоти До в. Н i п d 111 - 630 нукл ебтидоё, Ncol - 1181 нуклеотид. Ndel - 1955 нуклео .ТЙД08.- . . ,.., ,: ; .; ;;;,. Рекомбинантна плазмида pLT2l содержит полусинтетический мутангный гей лимфотоксина человека- Источником дл ее получени была рекомбинантна плазмида pLT16. содержаща полусинтетический геи, кодирующий последовательность приройного негликозилированного лимфотоксмна человека. На фиг. ,1 изображена частична CTpyie тура плазмиды pLT20 (нумераци аминокис лот по последовательности лимфотрксинэ)« схема.локализованного олигонуклёотид-направленного мутагенеза плазмйды ptT20; на фиг. 2 представлена структура полйпептида . крдируемого рекомбинантной лйзмй дойр1Л21 .: Дл получени бактериальногй штамма - продуцента полипептида с биологической активностью лимфотоксина челойека плазмидой pLT21 трансформируют хомпе тентные клетки Е.соН SG 20050. Полученный таким образом tUtaMM Е.соП SG 20050/PLT21 характеризуетс еле дующими признаками. Морфологические признаки .KfletKW мелкие, утолщенной палочковидной формы грамотрицательные. неспороносныв. ; Культуральные призн ки. Клетки хороши растут на простых питательных средах, При росте на агаре Дифко колонии круглые , гладкие, прижаты, мутные, блест щи серые, край ровный. При росте вжидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульонб) образуют интенсивную ровную муть. Физико-биологические признаки. Knetки растут при температуре 4 до 40С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0, В качестве источника азота используют как минеральные toли в аммонийной форме, так и органические, соед нени в виде пептона, триптона, , дрож)евого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода испопьзуют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к амтибиотикаМ.КлеткМ про вл ют устрйчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу ( до 500 мкг/мл). Ьбуслоаленную наличием плазмйды. а также k тeтpa циклинy (до 30 мкг/мл) благодар наличию Tpaffcno30Ha; Штамм Е,соН Sd 20050/pLT21 обуслойливает . конститутивный синтез полипептида (фиг. 2) со саойсгвами лимфотоксина человека на уровне2х10 ед/мл клеточной суспензии , что составл ет CBbiiue 25% тотального клеточного белка бактерий и превышает ho казатели известных штаммов E.coli - продуцентов лимфотоксина. П р и м ер 1. Химический синтез рлигонуклеотидоз . Синтез олигонуклеотидов выполн ют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System I (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от з-конца к 5-концу с помощью защищенных фосфамидитов -В-диметокситритилМ-ацил-2- дезоксинуклеозид-з- 0-(метоксид и из on роп иламино)-фосфитов. активированиы)тетразолом. Синтез провод т в масштабе 0.5-0,7 Мкмоль. использу в качестве носител пористое стекло (размер пор 500 А, р змер частиц 40-60 мхм), к которому через 3-сукцинатную св зь присоедин ют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют известный синтетический цикл с тем лишь отличием. что после реакций конденсации проэодпт промывку смолы смесью тетрагидрофуран пиридин- вода (5:3:2), После окончани синтеза защитные гру пь удал ют последоваельной обработкой тиофенолйтом риэтиламмон и коиц. аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотиа от носителе Б-Диметокситритильную руппу удал ют кислотной обработ1 :ой и лигонуклеотид очищают электрофорезом в
0% ЛААГ, содержащем 7М мочевину. Выод 1-5 о.е.
П р и мер 2- Конструирование рекомбиаитной плазмидной ДНК pLT21.
Дл приготовлени вектора ДНК ллазиды рТМРЗЗД(10мкг) обрабатывают в 70 кл буфера R {2Q мМ трис-ИС1, рН 7.5.10 мМ MgCi2. 50 мМ NaGI. 5 мМ меркаптоэтанол) рестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Реакционную смесь охлаждают до 10°С. прибавл ют четыре дезонкринуклеозид-5трйфосфата До концентрации 50 мкМ и 10 ед. ДИК полимеразы 1 Е.соП (фрагмент Кленова), инкубируют 1 ч при 10°С, после чего реакцию останавливают прибавлением EDTA до концентрации 25 мМ. Смесь депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией . ДНК высаживают этанолом. промывак т70%-ным этанолом, высушивают , раствор ют в 50 мкл буфера R и обрабатывают . зндонуклеазы HIndlil 2 ч при 37°G, Векторный фрагмент величиной 3.4 т.п.о. выдел ют злектрофорезом в 1 % LMP-агарозном геле4 Затем обрабатывают 90 мкг ДНК плазмиды pLTI6 в 500 мкл буфера R рестрйкционнОй зндонуклеазой EcoRI (100 ед.) в течение 1. 5ч при 37С. После этого прибавл ют 100 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-НС1; рН 8.0, 77 мМ NaCi; 5 мМ MgCl2 и10 мМ Дитиотрейт, и 50 ед.экзонуклеазы ill Е;со11 (Slgrria). Отбирают алйквоты по 300 мкл через 5, 7 и 9 мин и реакцию останавливают прибавлением 35 мк 100 мМ раствора спермина; смесь выдерживают 15 мин при 0°С центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промывают 80%-ным этанолом, содержащим 0.3 М ацетат натри и 10 мМ ацетат магни , снова центгрифугируют, после чего осаДок раст1аор Ют в 300 мкл буфера, содержаще fo 50 мМ ацетат натри , рН Б.О 30 гиМ NaCI и 1 MMZnS04, прибавл ют еД. нуклеазы из золотистой фасоли и смесь инкубируют 30 мин при . Реакцию останавливают чэсаждёнием ДНК спермином как описано выше.; Осадок промывают этанолом, высушивают , раствор ют в ЗОО мкл буфера R и 66рабат:ывают 80 ед. рестриктазы Hrndlll в течение 4 ч при 37°С. после чегр фрагменты ДНК нужного размера (около 600-650 п.о.), содержащие большую часть гена лимфотоксина , выдел ют при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы.
0,2 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лидируют в 25 мкл буфера L (20 мМ трис-НС1,- рН 7.5. 10 мМ MgCl2. 0.2 мМ гАТР, 10 мМ дитиотреит) С 1 мкг векторной ДНК. полученной, как описано выше, из плазмиды pTNF33 . с помощью :50 ед. Т4 ДНК-лигазы в течение 6 ч при 15°С.
Аликвоту реакционной смеси используют дл трансформации компонентных клеток E.coli. Трансформанты высевают на чашки с LB-arapOM, содержащим ампициллин
(100мкг/мл)ихлорамфеникол. Скрининг рекомбинантов провод тс помощью гибридизации колоний 1п situ с р-меченными. олигонуклеотидами (1) и (П). Из клонов, гибридизирующихс с олигонуклеотидом (II) и
негибридизующихс с олигонуклеоитидом (I). выдел ют ДНК и анализируют с помощью эндонуклеаз НаеШ и Mspl м определением
нуклеотидной последовательности регул торной области и начала структурного гена.
Одну из полученных таким образом рекомбинантных ДНК, pLT20. используют дл дальнейшего конструировани .
П р и м е рЗ. Конструирование рбкомбинантной плазмидной ДНК pLT21,
К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pLT20 в 100 мкл буфера R прибавл ют рестриктазы Kpnl и HindUl (по25 ед. каждой) и инкубируют 1 ч при 37°С. после чего фрагмент (-700 п.о.) выдел ют электрофорезом в
1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Акало-. гичным образом гидролизуют 2 мкг репликативной Формы ДНК (РФ ДНК) фага Ml3mp10 тидролизрм той же смесью зндонуклеаз и векторный фрагмент также очиЩают электрофорезом в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Затем 0.5 мкг векторного фрагмента -лигируют с 0,1 мкг Kpnl/Hindlfi-фрагмента. полученного из плаймиды pLT20, в 20 мкл буфер L а течение 10 ч При 13°С. Одной дес той частью лйгазнрйс;меси трансформируют компетентные клетки Е.coll WK6 mutS. После трансформации клетки смешивают при с 3 мл 0,8% иВ-агара. содержащего
40 мкг/мл 5-бром-4-хлрр-р -D-галактопиранозид (X-GaO, 1 мМ изопропилтио-/ -D-raлакто-пиранозид и 200 мкл культуры Клеток Е.сбИ mutS в логарифмической фазе
роста. Смесь выливают на чашки с 1.6%
LB-arapoM и после застывани инкубируют 16ч при37°С Из фаговых клонов, образующих бесцветные бл шки, выдел ют двухцеЬочную РФ ДНК и ее анализируют с помощью совместного гидролиза рестриктазаМй Kpnl и Hindfll. Дл дальнейшей работы .испрльзуют рекомбииантный фаг M13LT20. содержащий нужной величины фрагмент Kpnf/Hlndlll. Дл выделени одноцепочечной (+)-ДНКк 10мл 2 X LB-бульона
прибавл ют 0.1 мл ночной культуры клеток Е.соП WK-6 njutS: в смесь внос т кусочек верхнего агара, содержащего индивидуальную фаговую бл шку, и инкубируют при аэрации 6 ч При 37°С. З тем vлегки центрифугируют {12000 об/мин; 5 мин), к суперматанту прибавл ют 1,4 мл растворЭ, содержащего 20% полиэтиленгликол (ПЭГ-бООО) и 2,5 М NaCl. выдерживают 15 мин при 20°С и центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. Осадок раствор ют в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HGt, рН 8.0. 1 мМ EDTA. раствортрижды экстрари руют фенолом и ДНК высаживают этано .ЛОМ- - -..:, ;
Дл проведени мутагенеза 0.5 мкг( нитиДНК фагэ M13LT20 смешива бт с 250 пмоль фосфорипироааниого опигонукпеотида (UI) в 50 мкл буфера L без дИтИртреита и гАТР. смесь нагревают 8 течение 15 мин при 80°С. после чего медленно в течение 3 ч охлаждают до 15°С. затем прибавл ют dATP. dGTP и TIP до концентрации 100 мкм каждого и 15 ед. ДНК-полимеразы Е.соН (Фрагмент Кпенова). Смесь инкубируют А ч при 15°С, затем прибавл ют гАТР до концентрации 0.1 мМ. дитиотреит до концентрации 10 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-Лигазы и продолжают инкубацию при той же температуре еще в течение 10 ч. П тую часть реакционной смеси (Используют дл трансформации компетентных клеток E.cdII WK-6 mutS. описано выше. Скрининг рекомбинантных фагое провод т гибридизацией с 5-1 Р -меченным мутагонизирующим рлйгонуклеотидом (III) в услови х жесткой otмывки (55°С. 2 X SSC). Клетки E.GOli WK-6 must, содержащие гибридизующиес с зондом фаги, выращивают, из них вмдел йэт репликативную Форму фаговой ДНК и т|Ьд вергают анализу с помощью совместного гидролиза рестриктазами Kpnl+Pstl и Pstl. Рекрмбинантные фаги, содержащие ДНК, нечувствительные к рестриктазе Xhol и,образующие при гидролизе, смесью рестриктаз Крп и ХЬоГ фрагмент величинойЗ42п.о., M13LT21, отбирают дл дальнейшей рёботы . Затем выдел ют KpnI/HlndlU - фрагмент ДНК этих фагов. реклониру 6г его в плазмиду pTNF3lA по тем же pectpMKtным свойствам, как описано выше, результате получили новую рекомбинантную плазмидную ДНК pLT21. структуру которой подтверждали рестриктным анализом с помощью зндонуклеаз Haelll и Map, а также х)пределением нуклеотидной последовательности плазмиды между сайтами Kpnl и HIndlll.
Плазмида pLT21 детерминирует био-: синтез полипептида, предстае ющеш собой укороченный с N-конЦа Hf 21 аминокислоту лимфотоксин человека.,
П р и м е р 4, Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека.
Ппазмидой pLT9 гр исформируют компетйитные клетки Е.cell SC 20050 по из естному методу и получачтт шт мм-пролуцент полипептида со соойс. лимфотохсииа В человека. , ;
П ри м е р 5. Определение продуктивности штамма Е.соИ - продуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека..
10 Клетки E.cott SG 20050/PLT21 выращи . вают при э 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости враще1чи 190 об/мин,отбирают пробу 2 мл. клетки цент ифугируют 10 мин при 6000 об/мин, 15 затем суспендируют в 1 мл буфера, содор жащего 25 мМ трис-HCl. рН 8.0, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфтормд и 5 мг/мл лизоцим. и инкубируют 30 мин при 25°С. Дл вскрыти клеток смесь замораживают в 0 течение 10 мин при , а затем оттаивают во льду; эту операцию повтор ют трижды, после чего определ ют содержание лимфотоксина 8 растворе измерением его биологической активности.
5 Биологическую активность ЛТ определ ют на культуре трансформированных мышиных фибрОбпастов линии L-929. С зтой целью монослойную культуру клеток выращивают в СОа-тёрмостате в 9б-луночныч 0 пластинах дл культур клеток в среде ОМЕМ,:СОдержащёЙ 10%-ную сыворотку теленка . Дл определени биологической активности культуральную среду замен ют на свежую среду рМЕМ, содержащую 1%-ную 5 сыворотку теленка, актиномицин D (1 мкг/мл) и клеточный лизат в двухкратных серийных разбавлени х {примерно .соответствующих концентрации лимфотоксина от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл). Пластины снова 0 инкубируют в течение 16-20 ч в СОг-термоСтате , затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество . окрашенных (жизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток. За 1 единицу 5 .активности принимают количество лимфотоксина . вызывающее гибель 50% трансформированных клеток. Таким Образом, предлагаема группа
изобретений поэаол ет получать новый norf0 ипептид со сбойствайи лимфотоксина человека , причем уровень биосинтеза такого полипептида составл ет 2 X 10 ед./мл культуры клеток, что составл ет свыше 25% суммарного клеточного белка Е.соИ -при 5 у рощбнной технологии его по учени за счет исключени стадии индукции биосинтеза бе ка. Ф о р му л а и зо б р е т е н и
1. Рекомбйиантиа плазмидна ДНК pLT2t, кодирующа полипептид со свойствами лимфотрксииа человека, мол. м, 2,62 МДа и размером 4,02 т.п.о.. содержаща
HlndlU-Kpnl - фр1гмеит ДНК плазмиды PTNF31 с тандемом промоторов А2 и. A3 рймней области бактериофага Т7 терминатором транскрипции фага л мбда, геном/ -лактамазы и геном хлорамфениколацётилтрансферазы размером 3,4 т.п.о,,
Kpnl-Hlndltl - фрагмент с синтетическим сайтом инициации трансл ции и му; тантным геном пимфотоксина человека, кодирующим аминокислотную последова тельность лимфотоксина чeлoвeкia,y которого делетирована 21 М-концева аминокислота, размером 0,63 Т.П.О.,
генетические маркеры:
ген/ -лактамазы - ген устойчивости к пенициллиновым антибиотикам,
ген Сш - ген устойчивости к хлорамфениколу:
уникальные сайты узнавани рекстрикционных эндонуклеазами, расположенные на следующих рассто ни х вправо от сайта KpnhGSU 129 нуклертидов. Sail- 618 нуклёотидой , HIndtll - 630 нуклеотидов. NCOI 1181 нуклеотид, Ndel - 1955 нуклеотидов.
U. Штамм бактерий Escherlchla соН ВКПМ 8-5279 - продуцент полипептида со 15 сво{ ствами лимфотокеина человеке.
..... . . : , . , . . .- -11
.fMet Tal Arg Зет Ser Бег ila
м СС5ЕАС(Я АМШ МА ШААСгСА га АОА ТСС ТОО AGO ОТ GCC
.. -.. - -20 ;.../.- .VV.. . .. о . Oltt 5Ito Ala Arg Gin His гО lys Met His Leu Ala Hie Ser Thr beu,.. Ш ACT 000 OQT CAG CAC CtiC AAG АФО CAO СИ GCC ОАО AGO AAC CTC...
imWCCCAOAOTGOOGGfCAGO .. ,( (ГГАААТТФАААТ Ш1& CTU60CCACAOCAACGTC...
AAlfAQCAAaiAC-GAACGGGfGTCGT
- . , . (т) .
%1P
t
(И
Ai
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904834066A RU1709731C (ru) | 1990-03-21 | 1990-03-21 | Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904834066A RU1709731C (ru) | 1990-03-21 | 1990-03-21 | Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1709731C true RU1709731C (ru) | 1993-07-30 |
Family
ID=21518050
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904834066A RU1709731C (ru) | 1990-03-21 | 1990-03-21 | Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1709731C (ru) |
-
1990
- 1990-03-21 RU SU904834066A patent/RU1709731C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Авторское свидетепьства.СССР № 1561510. кл. G 12.N 15/ф;-Т988.Kobayski et al. J.BIochefn. 1986, Nfe 100.N?3. p.727-733.: ; * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2882775B2 (ja) | ヒトーグリア由来神経突起因子 | |
US5608036A (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
JPH01501283A (ja) | 新規な型のコロニー刺激因子―1 | |
KR100761486B1 (ko) | 파아지를 이용한 생리 활성 단백질 및 펩티드의 대량생산법 | |
Tocci et al. | Expression in Escherichia coli of fully active recombinant human IL 1 beta: comparison with native human IL 1 beta. | |
DE3587205T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines proteins und dafuer zu verwendender vektor, rekombinante dns und transformierte zelle. | |
RU1709731C (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК pLT21, кодирующа полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека | |
KR910001812B1 (ko) | 외래유전자의 발현제어방법 및 그 방법을 사용한 외래유전자산물의 생산방법 | |
KR100427587B1 (ko) | 신규 d-글루탐산 합성효소 유전자 dna 및 이를 이용한 항생제 비의존성 벡터 | |
JPH05199867A (ja) | 新規微生物及びそれを用いるd−ビオチンの製法 | |
JP3350533B2 (ja) | Dna含有プラスミド | |
RU2408730C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК Collbd-BMP-7, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pCollbd-BMP-7, ШТАММ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7 | |
RU2153535C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii | |
JP2548204B2 (ja) | 新生理活性ポリペプチド | |
RU1438240C (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РТNF 22, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕН ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА - ПРОМЕЖУТОЧНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 31, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА | |
US4988622A (en) | Recombinant plasmid DNA pVN 22 coding biosynthesis of human leukocyte interferon alpha-I1 and strain Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) - producer of human leukocyte interferon alpha-I1 containing same | |
RU1438241C (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк ртnf 33, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека | |
RU1445193C (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGA 23 - ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 311Δ,-/,, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTNF 311Δ,-/,, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА | |
RU2233879C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина | |
RU2099421C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного интерлейкина-3 человека, рекомбинантная плазмидная днк p3pteil3, кодирующая рекомбинантный интерлейкин-3 человека, штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-3 человека | |
RU2091488C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк р 280 gm, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. штамм escherichia coli sg20050/р 280 gm - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека | |
JP2673099B2 (ja) | 新規ポリペプチド | |
JP3290473B2 (ja) | ビオチンオペロン | |
RU2156299C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм escherichia coli sa 9325 - продуцент рекомбинантного белка | |
RU2408726C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК Collbd-CBD, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pОС-Collbd, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-CBD, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-CBD |