KR100761486B1

KR100761486B1 - 파아지를 이용한 생리 활성 단백질 및 펩티드의 대량생산법

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Publication number: KR100761486B1
Application number: KR1020037002240A
Authority: KR
Inventors: 비탈리 에이. 코르디움; 스피틀라나 아이. 체르니크; 이리나 유. 슬라브첸코; 오렉산더 에프. 보지아노브
Original assignee: 카디오배스큘러 바이오 떼러퓨틱스, 인크.; 페이지 바이오테크놀로지 코오퍼레이션
Priority date: 2000-08-15
Filing date: 2001-08-15
Publication date: 2007-10-04
Also published as: DE60127561T2; EP1309604A2; US6773899B2; CA2419203A1; JP2004528005A; WO2002014468A3; US20020090678A1; WO2002014468A9; ES2284677T3; ATE358135T1; AU8491401A; WO2002014468A2; AU2001284914B2; KR20030031979A; DE60127561D1; EP1309604A4; EP1309604B1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 목표 유전자를 가지는 플라스미드를 포함하는 생산자 주의 박테리아 세포들을, 상기 목표 유전자(들)를 가지거나 가지지 않는 박테리오파아지 로 감염시킴으로써, 박테리아 세포들에서 생리 활성 있는 단백질 및 펩디드의 생산을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 생리 활성 있는 단백질들을 암호화 하는 목표 유전자들은 T7 중합효소 프로모터의 조절 하에 있으며, 상기 박테리아는 또한 T7 RNA 중합효소의 유전자를 발현할 수 있다. 상기 파아지는 상기 목표 유전자의 합성을 증대시키고, 생산주 주 세포의 용해를 유도한다. 대량 생산은 T7 중합효소 프로모터로부터 달성된 높은 발현 수준과 함께 상기 파아지의 용해 성장을 지연하는 배양 조건 하에서 생산자 주 세포를 배양함으로써 달성된다. 생리 활성 있는 단백질과 펩티드들은 이어서, 생산자 주의 세포들이 상기 파아지에 의하여 용해되면서, 배양액 내에 용해 가능한 형태로 축적된다.

Description

파아지를 이용한 생리 활성 단백질 및 펩티드의 대량생산법{Phage-Dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides}

본 발명은 DNA 재조합 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 박테리아 숙주 세포내에서 이종 유래의 단백질 생산을 증대시키는 새로운 방법에 관한 것이다. 개시되는 방법은 박테리아 숙주 세포의 용해를 유도하기 위하여, T7 프로모터에 작동할 수 있도록 연결된 관심 유전자를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 박테리오파아지 λ로 감염시키는 단계를 포함한다. 대량 생산은, 단지 플라스미드 만이 이종 유래의 복제 DNA를 하나 이상 가지고 있거나 혹은 플라스미드와 파아지 가 각각 이종 유래의 복제 DNA를 하나 이상 가지고 있을 때, 선택된 숙주 세포 내에서 달성될 수 있다.

오늘날, 유전 공학 기술은 의약과 산업에 중요하게 응용될 수 있는 다양한 생물학적 활성을 가진 물질을 대량으로 생산할 수 있는 미생물 주들을 제조할 수 있게 한다. 일반적으로, 박테리아 숙주 세포를 형질 전환하는 데는 이종 유래의 유전자가 삽입되는 플라스미드 벡터들이 사용된다. 다른 대장균 주들이 자주 수용 세포로서 사용된다. 그러한 플라스미드를 이용한 형질 전환 방법을 사용하여, 인슐린, γ-인터페론, 수많은 인터류킨, 슈퍼옥사이드 디스무타아제, 플라스미노겐 활 성물질, 종양 괴사 인자, 에리트로포이에틴 등을 비롯한, 가치있는 다양한 인간 단백질 및 펩티드를 생산하도록 대장균 세포가 공업적으로 처리되어 왔다. 이러한 물질들은 의약계에서 이미 사용되고 있거나 혹은 임상 연구의 다른 단계를 거치고 있다.

그러나, 플라스미드 기술은 심각한 단점들을 가지고 있다. 원하는 제품은 생합성 후 박테라아 세포들로부터 추출되어야 하는 데, 이는 다단계 과정으로, 기술적으로 복잡하다. 예를 들면, 인터페론 추출은 세포 파괴, 완충 용액 추출, 폴리에틸레메닌 과정, 조명, 황산 암모늄에 의한 침전, 투석, 및 원심 분리 (Goeddel, 유럽 특허 제0043980호)의 과정을 거친다. 그와 같은 추출 및 정제 과정의 필요성은 재조합 제품의 생산 기술을 복잡하게 할 뿐 아니라, 또한 특히 공업적인 대량 생산시에 상당량의 손실을 초래한다.

문제를 더욱 복잡하게 하는 점은, 복제된 유전자가 상대적으로 높은 수준으로 발현될 때, 생성된 진핵 단백질은 불용성 집단으로서 대장균의 세포질에 축적되는 경향이 있으며, 이는 가끔 세포막과 연관이 있다. 결과적으로, 위에서 기술한 추출과 정제 과정은 그 자체로도 이미 어려운 과정인데, 내부에 축적된 불용성 개체의 추출을 위한 부가적인 과정을 거쳐야 한다.

일반적으로, 불용성 단백질은 높은 온도 또는 8M 우레아 혹은 6∼8M 구아닌-염산과 같은 변성제의 존재 하에서 SDS 혹은 라우릴사르코신과 같은 이온성 세제를 사용하여 용해되게 한다.

가끔, 정제의 최종 단계는 용해된 폴리펩티드의 원형 재현 및 재산화 과정(renaturation and reoxidation)을 거치게 되며, 이는 기능성을 회복하는 데 필요한 단계이다. 단백질이 자연상태에서 적절히 중첩되는데 필요한 이황화 결합이 다시 형성되어야 한다. 이황화 결합 교환과 같은 원형 재현 과정에서는 글루타티온과 같은 비싸고 독성이 있는 시약과 산화된 2-메르캡토에탄올 혹은 디티오트레이톨이 사용될 수도 있다. 게다가, 유전 공학 산물인 생리 활성 있는 단백질의 최종 수율은 상대적으로 낮을 수 있다. 더욱더, 2차 및 3차 단백질 구조를 용해하고 다시 재생하는 데 필요한 독성 물질이 심지어는 그 흔적만 있어도 그 단백질의 임상 응용은 불가능하게 할 수도 있다. 따라서, 목표하는 단백질이 박테리아 숙주 세포내에 축적된 불용성 개체로 생성되는 것은, 재조합 단백질의 생산을 복잡하게 할 뿐 아니라 또한 최종 단백질을 임상적으로 사용하기에 부적절하게 할 수 있다 (Fisher, B., Sumner, I., Goodenough, P., Biotech and Bioeng. 41: 3-13, 1993).

플라스미드로 형질 전환된 박테리아 숙주 세포로부터 이종 유래의 유전자를 발현하여 생산된 단백질의 추출과 연관되는 기술적인 난점들은 형질 전환된 박테리아 숙주 세포를, 그 용해 경로가 숙주 세포의 용해를 초래하는 박테리오파아지로 감염시킴으로서 극복될 수 있다. 따라서, 원하는 단백질은 단순히 배양액으로 방출되게 된다. (Breeze A.S., 영국특허 제2 143 238A호). 따라서, Breeze는 용해를 조절하기 위하여 온도에 민감한 cl 변이를 가지고 있는 파아지 λ로 박테리아 세포를 감염시켜서 대장균에서 생산되는 효소의 수율을 증가시키는 방법을 개시하였다. cl-유전자 생성물은 전사의 초기 단계를 억제하며 파아지 DNA의 후반부의 전사를 방해하는데, 이는 머리와 꼬리 부분의 접합 및 세포 용해에 필요하다 (Mantiatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 온도에 민감한 cl 변이를 가지는 박테리오파아지는, cl-유전자가 용해 성장에 필요한 파아지 유전자의 전사를 억제하게 하는 온도에서 세포가 번식하는 한, 용원성 상태를 생성하고 유지할 수 있다. 따라서, 형질 전환된 숙주 세포는 30℃에서 배양될 수 있고, 여기에서 파아지 DNA의 전사는 계속하여 cl에 의하여 억제되고 파아지는 최대의 발효 단계에 도달할 때까지 용원성 상태에 남아 있게 된다.

이어서, 배양 온도를 cl 억제인자의 활성을 없애기 위하여 30분간 42℃로 증가시키고, 파아지가 용해 작용을 시작하게 한다. 그 후, 숙주 세포를 2∼3 시간 동안 30℃에서 배양하여 효소가 완전히 용해되어 나오게 한다 (Breeze A.S. 영국특허 제2 143 238A호).

Breeze는 박테리아 생산자 세포로부터 단백질을 방출하는 방법을 개시하고 있지만, 30℃를 초과하지 않는 온도에서 생산자를 배양할 필요가 있고, 이 온도는 대장균의 성장에 최적의 온도는 아니다. 32℃를 초과하는 온도에서는 온도에 민감한 용해성 프로파아지의 성장으로 인하여 최대 발효물질 축적 단계에 도달하기 전에 용해가 되기 때문에, 최적의 온도 (37℃)에서의 합성은 가능하지 않다.

더욱더, Breeze가 개시한 바와 같이, 42℃에서 30분간 박테리아 숙주 세포를 배양하면 목표 단백질을 분해하는 단백질 분해 효소를 활성화 시킬 수 있다.

Auerbach 등 (미국 특허 제4,637,980호)은 파아지 λDNA 단편을 사용하여 재조합 산물의 용해 방출을 유도하였다. Breeze와 같이, 그러한 방법에서는, λcl-유 전자 산물의 온도에 민감한 변이를 사용하여 박테리아 숙주 세포의 온도에 따라 용해하는 것을 가능하게 하였다. Auerbach의 방법에서는 42℃에서 cl 억제인자를 불활성화 시킨 후 리소자임을 생산하기 위하여 λDNA 단편이 엔도리신을 암호화하는 유전자들 N, Q, R 및 S의 기능을 유지하였다. 대부분의 남아 있는 파아지 유전자들은 제거되고; O 와 P 유전자의 변이는 파아지 DNA의 복제를 억제하였다. 결과적으로 상기 λDNA는 목표 유전자의 발현을 조절할 수 있는, 완전히 기능하는 파아지가 아니었다. 게다가, Auerbach의 λDNA는 목표 유전자를 운반하는 벡터로 사용하기에도 적절하지 않다.

더욱더, 위에서 기술한 바와 같이, 박테리아 숙주 세포를 Auerbach가 개시한 바에 따라 42∼44℃에서 90∼120분간 배양하면 목표 단백질을 분해하는 단백질 분해 효소를 활성화 시킬 수 있다.

박테리아 숙주 세포로부터 완전한 단백질을 용해 방출시키는 외에도, 박테리오파아지는 또한 이종 유래의 DNA를 숙주 박테리아 세포로 운반하기 위한 박테리아 플라스미드계 벡터의 대안으로서 사용될 수 있다 (Murray, N.E. and Murray, K., Nature 251:476-481, 1974; Moir, A., Brammar, W.J., Molec. Gen. Genet. 149:87-99, 1976). 일반적으로, 유전자와 이들 생산물의 증폭은 파아지의 용해 성장 중에 달성된다. 이때, 파아지의 게놈이 박테리아 숙주 DNA 속으로 들어 간다 (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196;188-189, 1977; Murray, N.E., and Kelley, W.S., Molec. Gen. Genet. 175; 77-87, 1979; Walter, F., Siegel, M., Malke, H., 1990. DD 276,694; Mory, Y., Revel, M., Chen, L., Sheldon, I.F., Yuti-Chernajovsky, 1983, GB 2,103,222 A). 보통, 박테리아 숙주 세포를 감염시키기 위하여 용원성 배양이 사용되거나 혹은 재조합 용원성 파아지 λ가 살고 있는 "데워진" 박테리아 배양을 사용하여 이종 유래의 유전자의 발현을 증폭시킨다.

이종 유래의 유전자 발현을 위하여 λ벡터들을 성공적으로 사용한 예들이 있지만, λ벡터들은 주로 유전자 복제에 사용되어 왔다. 일단 복제되면, 유전자들은 더 효과적인 발현을 위하여 플라스미드 벡터로 이동된다. 예를 들면, 인간의 β-인터페론 유전자를 함유하는 파아지 λ카론(Charon) 4A C15에 의하여 대장균이 감염될 때, 세포 용해질 속의 인터페론의 양은 7∼8 ×10⁶ 단위/리터이었다. 목표 DNA를 가지고 있는 DNA 단편이 파아지로부터 플라스미드로 재 복제된 후, β-인터페론 수율은 1 ×10⁸ 단위/리터로 증가되었다 (Moir, A., Brammar, W.J., Molec. Gen. Genet. 149:87-99,1976)

재조합 벡터에 의하여 박테리아 숙주 세포내에 생성된 이종 유래의 단백질 수율을 증가시키기 위하여, 파아지 λ가 박테리아 세포 용해를 시작하게 하는 능력을 상실하게 하는, 파아지 게놈의 변이를 도입하였다. 이런 방식으로 이종 유래의 유전자가 박테리아 숙주 세포에서 발현되는 시간을 연장함으로써 수율이 증가되었다. 따라서, 예를 들면, S-유전자에 앰버(amber) 변이를 가지는 λgt4ligS를 함유하는 용원성 배양에서 DNA 연결효소 1의 수율은 앰버 변이를 가지지 않는 λgt4lig를 함유하는 용원성 배양에서 DNA 연결효소 1의 수율보다 5배 높았다 (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196;188-189, 1977). 파아지 λS 단백질은 용해에 필요하다; 따라서 S 변이체는 숙주 세포를 용해하지 않고 목표 단백질뿐 아니라 많은 세포내 자손 파아지 입자들을 축적한다 (Mantiatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

상기 앰버 변이 없는 재조합 파아지 λ에 비하여, S 및 Q 유전자에서 앰버 변이를 가지는 재조합 파아지 λ를 함유하는 용원성 배양의 경우, DNA 중합효소 1의 수율이 유사하게 증가한다는 보고가 있다(Murray, N.E. and Kelley, W.S., Molec. gen. Genet. 175;77-87, 1979). 파아지 λQ 단백질은 파아지 DNA의 후반부 전사에 필요하며, 이 후반부는 머리와 꼬리의 접합 및 세포 용해에 관련되는 많은 유전자를 포함한다 (Mantiatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

미국 특허 제4,710,463호에서, Murray는 λS 및 E 유전자의 변이뿐 아니라온도에 민감한 cl의 변이를 함유하는 파아지 로 대장균의 비억제(Su°) 주를 용원화하는 법을 개시하고 있다. 결과적으로, 37℃에서 용원성 대장균을 오랫동안 배양시키면 재조합 단백질 생산이 증가하고, 이들은 세포내에 보유된다. 왜냐하면, 이들은 정상적으로 파아지 유전자 산물에 의하여 용해되지 않기 때문이다. 재조합 파아지 게놈은 단백질 막으로 싸이지 않기 때문에, 이는 전사가 가능한 상태로 남아 있게 된다.

N, R, S, Q, 및/또한 E 변이를 가진 벡터들을 사용하여 가능한 이종 유래의 단백질의 수율을 증가시킬 수 있음에도 불구하고, 목표 단백질의 용해 방출에 관련된 박테리오파이지 벡터의 잠재적 기술적 이점은 이러한 변이로 인하여 상실될 수도 있다. 왜냐하면, 목표 단백질이 박테리아 세포내에 축적되기 때문이다. 따라서, 용해에 결함이 있는 변이체 λ벡터를 사용하여 이종 유래의 단백질을 생산할 때, 결과 산물의 손실과 함께, 플라스미드 벡터에 의하여 전환된 박테리아 세포에 대하여 위에서 기술한 바와 같이, 추출 및 정제 단계를 거쳐야 한다.

T7 프로모터/T7 RNA 중합효소 시스템은 재조합 단백질을 대량으로 발현시키는 데 유용하다. T7 프로모터를 사용하려면 T7 RNA 중합효소가 있어야 한다. T7 RNA중합효소는 숙주 주에 있는 용원에 함유된 재조합 T7 중합효소를 유도하거나 혹은 T7 중합효소 유전자의 발현을 위한 플라스미드로 형질 전환하여 공급될 수 있다. T7 RNA 중합효소는 그 자신의 프로모터에 대단히 특수하다. T7 프로모터로부터의 전사 반응은 대단히 효과적이고 전장 RNA의 많은 복제물이 각각의 주형으로부터 생산될 수 있다.

일 실시예에서, 생리 활성이 있는 단백질을 생산하는 방법을 기술하는 데, 이 방법은 T7 중합효소 프로모터에 작동할 수 있도록 연결된 생리 활성이 있는 단백질을 암호화하는 발현 가능한 유전자를 한 카피(copy) 이상 가지는 플라스미드로, T7 RNA 중합효소의 유전자를 발현시킬 수 있는 대장균주를 형질 전환하는 단계; 용해를 지연시키는 것을 조절할 수 있는 박테리오파아지로 상기 형질 전환된 박테리아 숙주 세포를 감염시키는 단계; 및 용해가능하고 생리 활성이 있는 단백질이 원하는 수준의 양으로 생산될 때까지 대장균 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함한다.

한 바람직한 실시예에서, 상기 박테리오파아지는 온도에 민감한 변이를 가지고 있다. 더욱 바람직한 실시예에서, 온도에 민감한 변이는 cl₈₅₇이다.

바람직하게는, 상기 대장균 숙주 세포는 배양 단계 전에 박테리오파아지의 용해 성장을 방지하는 온도에서 성장된다.

바람직한 실시예에서, 상기 박테리오파아지는 용해를 지연시키는 것을 조절할 수 있는 하나 이상의 유전자에 변이를 가지고 있다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 용해를 지연시키는 것을 조절할 수 있는 하나 이상의 유전자는 N, Q, 및 R로 구성되는 군에서 선택된다.

바람직한 실시예에서, 대장균 주는 앰버 변이를 수선하는 억제 인자를 생산한다.

다른 실시예에서, 대장균 주는 앰버 변이를 수선하는 억제 인자를 가지지 않는다.

바람직한 실시예에서, 상기 감염 박테리오파아지는 감염 다중도가 약 1∼100의 범위로 되도록 제공된다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 감염 박테리오파아지는 감염 다중도가 약 10∼25의 범위로 되도록 제공된다.

일 실시예에서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간 산성 피브로블라스트 성장 인자를 암호화 한다. 다른 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자는 134개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자는 140개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자는 146개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자는 155개의 아미노산을 포함한다. 가장 바람직한 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자는 서열 인식 번호 1번에 주어진 서열을 가진다.

일 실시예에서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간의 성장 호르몬을 암호화 한다. 다른 실시예에서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간의 인터페론을 암호화 한다. 또 다른 실시예에서, 상기 발현 가능한 유전자는 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 암호화 한다.

바람직한 실시예에서, T7 RNA 중합효소의 유전자는 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 유도 가능한 프로모터는 lac UV 5 프로모터이다.

바람직한 실시예에서, 생리 활성 있는 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 데, 이 방법은 a) 온도에 민감한 변이를 가지고 있는 박테리오파아지 λ주가 살아 있는 대장균 제1주를 성장시키는 단계; b) 대장균 제1주를 용해하고 상기 박테리오파아지 λ를 방출시키기 위하여 온도를 조절하는 단계; c) 유도 가능한 프로모터의 조절하에서 T7 중합효소 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 생리 활성 있는 단백질을 암호화 하는 발현 가능한 유전자를 한 카피 이상 가지는 플라스미드로 형질 전환되고, 유도 인자를 첨가하여 T7 RNA 중합효소의 유전자를 발현하도록 유도될 수 있는 대장균 제2주를 제공하는 단계; d) 상기 대장균 제1주로부터 방출된 상기 박테리오파아지 λ로 상기 대장균 제2주를 감염시키는 단계; 및 e) 용해 가능하고, 생리 활성이 있는 단백질이, 100㎍/㎖보다 높은 농도로 생산되어, 상기 대장균 제2주의 용해시에 배양 배지로 방출되도록, 유도 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 감염된 대장균 제2주를 배양시키는 단계를 포함한다.

또한 여기에 개시되는 발명에는 서열 인식 번호 1번에 주어진 서열로 본질적으로 구성된, 화학적으로 합성된 핵산이 포함된다.

종래 기술에 비하여 우수하게 달성된 본 발명과 그 장점들을 요약하기 위하여, 본 발명의 목적과 장점들을 위에서 기술하였다. 물론, 본 발명의 임의의 실시예에 따라서는 그 모든 목적과 장점들을 반드시 달성하지는 않을 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들면, 당업자라면, 반드시 여기에 개시되거나 제안된 바와 같이 다른 목적과 장점들을 달성하지 않고도, 하나의 장점 또는 한 그룹의 장점을 달성하거나 최적화하는 방식으로 본 발명이 실시될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

그 외의 본 발명의 국면, 특징, 및 장점들은 하기에 기술되는 실시예의 상세한 설명에서 명백해질 것이다.

본 발명의 이러한 특징들과 다른 특징들은 실시예의 도면을 참조하여 기술되며, 이러한 실시예는 다만 예시의 목적으로 제시되는 것이며, 결코 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자 (155 아미노산) (서열 인식 번호 1번)의 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 서열로서, 자연적으로 나타나는 코돈을, 높은 수준으로 발현된 대장균 단백질에서 발견된 코돈으로 치환된 것이며, 또한 이로부터 번역된 아미노산 서열(서열 인식 번호 2번)을 도시한 도면이다.

도 2는 화학적으로 합성된 haFGF 155 코돈에 생긴 변화를 보여 준것으로서, FGF fr HUMECGFB는 NCBI의 유전자은행으로부터 획득한 서열(서열 인식 번호 3번)이고. HaFGF 155는 본 발명의 한 실시예에 따라 화학적으로 합성된 서열(서열 인식 번호 1번)임을 도시한 도면이다.

도 3은 화학적으로 합성된 haFGF 155 유전자(서열 인식 번호 1번)를 포함하는 pET24-155@rev 콘스트락트를 도시한 도면이다.

도 4는 HPLC로 정제된 haFGF 155를 도시한 것으로서, 이 전기 영동 그림에서, 1레인은 제조합 haFGF 155를 함유하는 조절된 배양액 10ℓ, 2레인은 헤파린-세파로즈로 정제된 haFGF 155 (0.45 g/ℓ) 7ℓ, 3레인은 HPLC로 정제된 haFGF 155 80ℓ로부터 뽑아 낸 14ℓ에 해당함을 도시한 도면이다.

도 5는 화학적으로 합성된 haFGF 134 유전자(서열 인식 번호 4번)를 포함하는 pET24-134@rev 콘스트락트를 도시한 도면이다.

도 6은 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자 (134 아미노산) (서열 인식 번호 4번)의 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 서열로서, 자연적으로 나타나는 코돈을, 높은 수준으로 발현된 대장균 단백질에서 발견된 코돈으로 치환된 것이며, 또한 이로부터 번역된 아미노산 서열(서열 인식 번호 5번)을 도시한 도면이다.

도 7는 화학적으로 합성된 haFGF 140 유전자(서열 인식 번호 6번)를 포함하는 pET24-140@rev 콘스트락트를 도시한 도면이다.

도 8은 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자 (140 아미노산) (서열 인식 번호 6번)의 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 서열로서, 자연적으로 나타나는 코돈을, 높은 수준으로 발현된 대장균 단백질에서 발견된 코돈으로 치환된 것이며, 또한 이로부터 번역된 아미노산 서열(서열 인식 번호 7번)을 도시한 도면이다.

도 9는 화학적으로 합성된 인터페론-2b 유전자(서열 인식 번호 10번)를 포함하는 pET24ap-inf@rev 콘스트락트를 도시한 도면이다.

도 10은 인간의 인터페론-2b (서열 인식 번호 10번)의 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 서열로서, 자연적으로 나타나는 코돈을, 높은 수준으로 발현된 대장균 단백질에서 발견된 코돈으로 치환된 것이며, 또한 이로부터 번역된 아미노산 서열(서열 인식 번호 11번)을 도시한 도면이다.

도 11은 여기에 기술된 파아지를 이용하는 방법으로 생산된 단백질을 함유하는 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 도시하 것으로서, 1레인은 각 표준액이 2g씩 들어 있는 분자량 표준들이고; 2레인은 재조합 FGF 134 단백질을 함유하는 배양액 40ℓ이고; 3레인은 재조합 FGF 140 단백질을 함유하는 배양액 40ℓ이고; 4레인은 재조합 인터페론 2B를 함유하는 배양액 40ℓ이고; 5레인은 재조합 FGF 155 단백질을 함유하는 배양액 40ℓ이고; 6레인은 재조합 인간 성장 호르몬을 함유하는 배양액 40ℓ이고; 7레인은 재조합 메티오닌 아미노펩티다제를 함유하는 배양액 40ℓ이고; 8레인은 대장균의 갈락토시다제를 함유하는 배양액 40ℓ임을 도시한 도면이다.

도 12는 본 발명에서 청구되는 발명에 따라서 정제된 재조합 단백질을 포함하는 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 도시한 것으로서, 1레인은 분자량 표준이고; 2레인은 정제된 FGF 134 단백질 5g이고; 3레인은 정제된 FGF 140 단백질 5g이고; 4레인은 정제된 FGF 146 단백질 5g이고; 5레인은 정제된 인터페론 2B 5g이고; 6레인은 정제된 FGF 155 단백질 5g이고; 7레인은 정제된 메티오닌 아미노 펩티다제 단백질 5g이고; 8레인은 분자량 표준임을 도시한 도면이다.

기술되는 실시예가 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 당업자라면 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 변경할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 오직 첨부되는 청구항에 의해서만 결정되어야 한다.

바이러스 게놈의 40% 이상은 용해 성장에 꼭 필요한 것이 아니기 때문에 박테리오파아지 λ는 벡터로서 유용하다. 유전자 J와 N 사이의 λDNA의 중앙에 위치한 λ게놈의 이 부분은 원하는 산물을 암호화 하는 이종 유래의 DNA로 대체될 수 있다. 이 부분은 감염 초기에 전사된다.

그 합성 정보가 파아지의 초기 유전자의 영역에 기록되어 있는 목표 유전자의 발현을 최대화하기 위하여, 적절한 복제를 보장하도록 특수한 파아지 발육 조건이 제공되어야 한다.

더욱이, 목표 유전자를 포함하는 초기 영역의 전사는 권장되어야 하는 반면에, 세포 용해에 관련되는 후기 유전자의 전사는 억제되어야 한다. 이는 X 입자의 성숙과 연이은 세포 용해를 지연시킨다. 결과적으로, 목표 유전자 산물을 포함하 여, 초기의 파아지 산물은 박테리아 세포에 축적될 것이다. 후기 전사의 억제와 이로 인한 목표 유전자의 발현 지연은: (1) 후기 유전자의 발현을 억제하는 파아지 게놈의 변이, (2) 증가된 감염 다중도, 및/또한 (3) 저하된 온도에서의 감염 박테리아 세포의 배양을 통해 달성될 수 있다.

생산자 세포를 박테리오파아지로 감염시키는 이점은, 파아지가 박테리아 숙주 세포에서의 모든 거대분자 합성을 심도 있도록 재배열하게 한다는 것이다. 박테리아 유전자의 전사를 중지함으로써, 파아지는 목표 유전자를 복제하는 것을 증대시킬 수 있고, 결과적으로 원하는 산물이 더 산출되게 한다.

본 발명의 대량 생산법의 한 실시예에서, 박테리아 용해를 지연시키는 앰버 변이(예를 들면, Q 및 R-변이)를 가지는 파아지 λ는, Su°로 표시된 대장균주 내에 제공되고, 상기 주는 파아지의 앰버 변이를 수정하는 억제 인자를 가지고 있지 않다. 대장균의 비억제(Su°) 주를 얻기 위하여, Su°클론은 야생종 Su+ 집단으로부터 선택된다. 바람직하게는, 선택 마아커, 예를 들면 내성 테트라사이클린 혹은 앰피실린을 파아지 DNA 속으로 삽입한다. 대장균의 비억제(Su°) 주, 예를 들면, 대장균 K802의 선택은 파아지 λcl₈₅₇ Nam7Nam53 bla tet (이후에는 λbla N'이라고 함)로 수행되었다. 대장균 주 C600 (λbla N')이 파아지의 공급원의 역할을 하였다. 이 파아지는 EcoRI 자리에 있는 플라스미드 pCV11(bla tet)를, 억제 유전자 (cl₈₅₇)에 ts-변이를 가지고 있는 한 자리(EcoRI) 벡터 속으로 삽입하여 얻어졌다. 그 후, 두개의 앰버 변이가 생체내 재조합에 의하여 파아지 N 유전자 속으로 도입 되었다.

클론들은 파아지 λ가 제거된(파아지 클리어(clear)) 상태에서 비용원성 검사를 받았다. 파아지 λbla N'외에도, 억제 인자 검사를 위하여 파아지 λcl₈₅₇ Q_am117R_am54가 사용되었다.

알려져 있는 바와 같이, 파아지 λN' 변이체는 숙주 세포를 용해할 수 없고, 대단히 불안정한 플라스미드의 형태로 세포내에 존재한다. 만약 숙주 세포가 억제 인자를 포함하고 있으면, 앰버 변이는 표현형에 따라 수정되고, N 단백질이 합성되며, 파아지는 용해 성장될 수 있다. Su+세포와 N'에 의하여 감염된 Su°세포의 생존력의 이 차이는, 대장균 Su⁺세포 집단으로부터 자발적으로 나타나는 Su°복귀 돌연 변이체를 선택하기 위한 초석으로 사용된다. 파아지는, 세포 속으로 내성 앰피실린과 테트라실린을 도입하는, 삽입된 플라스미드와 함께, 용해하지 않는 Su° 세포들이 변이체 탐색을 방해하는 것을 방지하는 데 사용되었다. 상기 파아지는 또한 세포 용해를 초래하는 파아지의 용해 성장을 허용하는 억제 인자의 ts-변이를 포함한다.

앰피실린과 테트라사이클린이 첨가된 배지를 파아지 λbla N'으로 감염시키고 이어서 43℃ 에서 성장시킨 후 Su⁺배양균으로 접종시키면, 플라스미드의 형태로 파아지 λbla N'을 함유하는, 하나의 억제 인자도 없는 세포들이 판상에 생성되게 된다. 상기 파아지로부터 세포들을 치유하여 상기 부모 배양균의 Su° 유도체를 얻 게 된다. 이 방법은 다음의 여러 단계로 세분화될 수 있다.

1. 파아지 λbla N'으로 배양균을 감염시키는 단계

대장균 Su⁺배양균을 1∼2 ×10⁸ 세포/㎖의 농도에서 심하게 흔들어 주며 37℃ 에서 말토스와 함께 M9 배지에서 성장시켰다. 상기 세포들은 파아지 λbla N'으로 세포당 5∼10 개의 다중도로 감염시키고 20℃에서 20분간 배양시켰다. 주어진 조건들에서, 감염효율은 약 100%이고, Su⁺세포 원액 외에도, 상기 파아지는 또한 하나의 Su°세포들을 감염시킨다.

2. 마아커 파아지를 포함하는 억제 인자 없는 세포를 선택하는 단계

감염 후, 세포들을 12γ/㎖의 테트라사이클린 및 20γ/㎖의 앰피실린이 첨가된 아가르 배지에 심고, 43℃에서 성장시켰다. 24시간 후에, 하나의 콜로니가 형성되었고, 이를 항생제와 함께 아가르 배지에 옮겨 심고, 37℃에서 성장시켰다.

3. 파아지 λbla N'으로부터 선택된 클론을 치유하는 단계

대장균 Su°세포들에 있는 파아지 λN'은 대단히 불안정한 플라스미드의 형태로 되어 있기 때문에, 상기 파아지로부터 선택된 클론을 치유하기 위하여 이들을 항생제 없이 선택된 아가르 배지에 심고 37℃에서 성장시켰다. 항생제 없는 상기 배지를 한번 통과하여 상기 파아지를 상실하는 세포의 수는 12∼35%에 달했다.

이들 세포는 항생제 내성 상실과 파아지 λ클리어에 대한 민감도의 획득 여부를 조사하여 선택되었다.

4. 세포내에 억제 인자가 존재하는지 여부를 시험하는 단계

앰버-변이를 가지는 파아지 λ가 치유된 클론 상에 악역(plagues)을 형성하는 능력이 있는지 시험하였다.

부모 대장균 Su⁺ 주의 억제 인자가 없는 동종의 유도체는 클론들이고, 이 클론 상에 파아지 λbla N'은 악역을 형성하지 않았고, 파아지 λcl₈₅₇ Q_am117 R_am54는 1∼3 ×10⁵ PFU/㎖를 생산했으며, 유전자 Q와 R에 변이가 일어나지 않은 파아지 cl₈₅₇ 은 1 ×10¹⁰ PFU/㎖를 생산하였다.

이러한 방법을 사용하여, 우리는 대장균 K802 Su⁺의 Su°복귀 돌연 변이체를 얻었다. 감염 순간의 세포 수와 그들 중의 Su°복귀 돌연 변이체의 수에 근거하여, 억제 인자가 없는 세포가 나타나는 주기는 3 ×10^-7 이었다.

바람직한 실시예에서, 관심있는 유전자는 T7 프로모터의 조절 하에 pET-24a(+) 속으로 복제된다. 임의의 관심 있는 유전자가 청구된 발명을 실행하는 데에 사용될 수 있다. 구체적인 예는 인간의 성장 호르몬, 인터페론, 메티오닌 아미노 펩티다제, 인간의 aFGF 134 아미노산 형태, 인간의 aFGF 140 아미노산 형태, 인간의 aFGF 146 아미노산 형태, 및 인간의 aFGF 155 형태를 포함하고 이들에만 한정되지 않는다. 다른 실시예에서, 관심 있는 유전자는 적절한 프로모터의 조절 하에 박테리아 플라스미드와 파아지 속으로 복제될 수 있다. 가장 바람직한 실시예에서, 화학적으로 합성된 haFGF 155 유전자 (서열 인식 번호 1번)는 T7 프로모터의 조절 하에서 pET-24a(+) 속으로 복제된다. T7 프로모터는 오직 T7 RNA 중합효소에 의하여 인식되며, 대장균의 RNA 중합효소에 의하여는 인식되지 않는다. haFGF 155 유전자 (phaFGF 155)로 얻어진 플라스미드는 대장균 BL21 (DE3) 속으로 형질 전환된다. 이 주는 t7 RNA 중합효소 유전자를 함유한다. T7 RNA 중합효소 유전자는 오직 필요시에만 T7 RNA 중합효소의 합성을 유도하기 위하여 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에 있다. 왜냐 하면, 이 단백질은 대장균 세포에 독성이 있기 때문이다. lac 프로모터의 유도는 IPTG를 영양 배지에 첨가하여 실행된다. 상기 haFGF 155 단백질을 얻기 위하여, 상기 haFGF 155 유전자와 함께 재조합 플라스미드를 포함하는 생산자 주는, 20∼40℃의 온도에서 5 ×10⁷∼ 5 ×10⁹ 세포/㎖의 세포 밀도로 강력하게 통기하는 조건 하에서 배양된다. 그 후, 상기 생산자 주를 세포당 0.1 내지 100 파아지의 다중도로, ts-변이 cl 억제 인자 유전자를 가지는 람다 파아지에 의하여 감염시키고, 20∼37℃에서 2∼14시간 동안 배양을 계속한다. 상기 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 도입된다.

상기 haFGF 유전자는 155개의 아미노산 잔재를 포함하는 유전자를 암호화 한다. 그러나, 조직 샘플로부터 오직 두개의 짧은 aFGF 형태를 분리하는 것이 가능하였다. 상기 두개의 분리된 형태는 140 및 134개의 아미노산 잔재들을 포함한다. 140개의 아미노산을 포함하는 aFGF 형태는 완전하다고 여겨지며, 반면에 134개의 아미노산을 포함하는 aFGF 형태는 절단된 것으로 여겨진다. 조직 샘플로부터 155개의 아미노산을 포함하는 aFGF 형태를 추출하는 것은 불가능하였다. 짧은 동종형태 (isoform)가 세포처리시의 정상적 기능으로서 나타나는지 혹은 aFGF 추출 과정에서 특수한 단백질 분해효소에 의한 분리 과정 중에 생성되는 인공산물인지는 알려져 있지 않다.

세 개의 aFGF 형태에 대하여 분리된 DNA 재조합 분자들로부터 생성된 단백질을 웨스턴 블랏 분석하면, 140 및 134 형태가 많이 발현되고 155 형태는 적게 발현됨을 보여 준다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자의 유전자는 상기 aFGF 단백질의 144 아미노산 형태를 암호화하고, 화학적으로 합성된다 (서열 인식 번호 1번). 상기 haFGF 155 유전자의 뉴클레오티드 서열은 이미 기술된 haFGF 아미노산 서열 (서열 인식 번호 2번)에 기초하여 추론되었다. 상기 합성된 haFGF 유전자의 아미노산 서열은 서열 인식 번호 3번의 FGF 뉴클레오티드 서열의 번역된 서열과 같이 이미 기술된 서열들과 다르지 않다. 그러나, haFGF의 바람직한 뉴클레오티드 서열은 이미 기술된 서열들과 다르다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 haFGF 155 유전자는 많이 합성되는 박테리아 단백질을 위하여 대장균에 의하여 자주 사용되는 코돈을 사용하여 화학적으로 합성되었다. 대장균의 코돈 사용 빈도표는 잘 알려져 있고 입수 가능하다.

예를 들면, http://psyche.uthct.edu/shaun/Sblack/codonuse.html를 참조할 수 있다. 인간의 aFGF 유전자들의 화학적 합성은 잘 알려져 있는 방법으로 수행되었다 (Edge et al.(1983) Nucleic Acids Research 11(18):6419-6435).

이와는 달리, 관심 있는 임의의 유전자는 상기 146, 140, 및 134 동종 형태 들, 및 그 이형(variants), 유도체, 유사체 혹은 그들의 단편을 포함하여, 당업자에게 알려져 있는 다른 형태의 haFGF를 암호화 하는 동물 조직으로부터 분리된 DNA를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 본 발명을 실행하는 데에 사용될 수 있다. 인간의 성장 호르몬, 인간의 인터페론, 및 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 암호화 하는 유전자도 또한 이들의 예가 된다.

도 1은 본 발명자들에 의하여 합성된 바와 같은 haFGF 155 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열 (서열 인식 번호 1번)과 유전자 은행으로부터 얻은 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자의 서열 (서열 인식 번호 3번)을 보여 준다.

이들 두 서열은 도 2에서 비교된 바, 80개의 코돈이 구별된다.

발현 및 클론 벡터는 일반적으로 숙주 생물에 의하여 인식되는 프로모터를 가지고 있으며, 관심 있는 유전자에 작동할 수 있게 연결된다. 프로모터들은 이들이 작동할 수 있도록 연결되는 구체적인 핵산 서열의 전사와 번역을 조절하는 구조 유전자 (일반적으로 100∼1,000 개내의 염기쌍)의 시작 코돈의 위쪽(5′)쪽에 위치하는 번역되지 않는 서열들이다. 그러한 프로모터들은 일반적으로 두개의 종류, 유도 가능한 것과 구조적인 것으로 나뉜다. 유도 가능한 프로모터들은 배양 조건의 변화, 예를 들면, 어떤 영양소의 존재 혹은 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 이들 프로모터의 조절하에 DNA로부터의 전사 수준을 증대시키기 시작하는 프로모터들이다. 현재로서는 원핵 숙주 세포에 의하여 인식되는 많은 프로모터가 알려져 있다. 당업자라면 적절한 절단 부위를 제공하도록 적절한 연결기 혹은 보조기를 사용하여 관심 있는 유전자에 이들을 연결하는 방법을 알 것이다.

형질 전환은 DNA를 생물체 내로 도입하는 것을 의미하고, 도입된 DNA는 크로모좀외부의 요소로서 혹은 크로모좀 내로 동화됨으로써 복제될 수 있다. 원핵 세포의 형질 전환은 CaCl₂로 처리하거나 일렉트로포레이션과 같이 당업자에게 잘 알려져 있는 기술들을 사용하여 실행된다. 람다 파아지의 용해 성장을 지연시키는 조건에서 생산자 주를 배양하여 재조합 단백질을 대량으로 생산할 수 있었다. 그러한 조건은 배양 온도의 저하 그리고 Q 및 R 유전자와 같은 후기 람다 파아지의 앰버 변이의 사용을 포함한다.

재조합 단백질은 람다 파아지에 의하여 생산자 주 세포의 용해 결과, 용해될 수 있는 단백질로서 배양 배지에 축적된다. 재조합 단백질의 생산량은 배양 배지에 축적된 용해될 수 있는 단백질의 20%에 달한다. 부스러기는 원심 분리하여 배양 배지에서 제거한다.

그 후, 재조합 단백질은 섞여 있는 용해될 수 있는 단백질과 펩티드들로부터 당업자들에게 잘 알려져 있는 정제 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 방법은 이온 교환 칼럼상에서의 분리, 에탄올 침전, 역상(reverse phase) HPLC, 면역성친화도(immunoaffinity), SDS-PAGE, 황산 암모늄 침전, 및 겔 여과과정들을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. haFGF 단백질의 경우, haFGF 단백질은 정제된 haFGF를 얻기 위하여 헤파린 세파로즈에 적용될 수 있다.

본 발명의 더 상세한 설명은 아래에 제공된다. 기술된 실시예가 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 당업자는 변경을 가할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의하여 전적으로 결정되어야 한다.

<실시예 1>

파아지를 이용하는 방법에 의한 인간의 aFGF 155 생산

대장균 BL21 (DE3)(NOVAGEN)의 배양균들은 플라스미드 pET24 155@rev (도 3)에 의하여 형질 전환되였다. 이 플라스미드는 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자(155 아미노산)을 암호화 하는 haFGF 155 유전자 한 카피를 포함한다.

BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). 플라스미드 pET24-155@rev를 생산하기 위하여 T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 화학적으로 합성된 haFGF 155 유전자 (서열 인식 번호 1번)를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 haFGF 155 유전자의 발현이 시작된다.

pET24-155@rev와 함께 대장균 BL21(DE3)의 배양균은 50 g/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁸ 세포/㎖ 의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54는 대장균 RLMI의 용원성 배양균으로부터 준비되었고, 상기 배양균은 30℃의 LB 배지에서 강력하게 통기하면서 약 1 ×10⁵ 세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. 상기 용원성 배양균은 43℃로 데우고 cl 억제 인자를 비활성화 시키기 위하여 20분간 배양시켰다. 그 후, 온도를 37℃로 내리고, 60∼70 분 후 상기 박테리아 세포는 파아지가 1∼2 ×10¹⁰ PFU/㎖로 형성되면서 용해되었다.

상기 파아지로 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 haFGF 155를 얻기 위하여 haFGF 155 단백질을 포함하는 배양액을 헤파린 세파로즈 칼럼에 적용시켰다.

haFGF 155를 포함하는 배양액은 변성시키는 조건에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔로 분석하고 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 착색하였다. 도 4에서, haFGF 단백질을 포함하는 전기영동 사진을 정제된 haFGF 단백질과 비교하였다. 1레인은 상기 배양액 10㎕의 경우이고, 2레인은 헤파린-세파로즈로 정제된 haFGF 155 단백질 (0.45 g/l) 7㎕의 경우이고, 3레인은 HPLC로 정제된 FGF-155 80㎕의 경우이고, 맨 왼쪽의 표시되지 않은 레인은 분자량 표준(Amersham Pharmacia Biotech사)의 경우이다. 파아지로 감염된 배양액에서 haFGF 155 단백질의 생산량은 전체 세포 단백질의 약 20%이었다.

haFGF의 분자량은 밀도측정기 Image Master VDS로 측정하여 17,908 달턴이었다 (데이터는 명시하지 않음).

위에서 개시된 방법에 따라 생산된 인간의 aFGF 155는 병아리 세포막 분석 ( 실시예 6)에 기초하여 생리 활성을 가지고 있었다. 그 외에도, 정제된 인간의 aFGF 155는 BALB/c 3T3 피브로블라스트를 이용하는 세포에 근거한 증식 분석에서 생리 활성을 보여 주었다 (Linemeyer, 미국특허 제6401832호). 세포 증식 최대자극의 반은 aFGF 155의 농도가 32 pg/㎖일 때이었다. 박테리아 배양액에 포함된 정제되지 않은 인간의 aFGF 155는 또한 3T3 피브로블라스트 분석에서 정제된 aFGF 155와 동일한 생리활성을 나타내었다. 이는 aFGF 155가 용해가능하고 생리 활성이 있는 단백질로서 초기에 박테리아에서 합성되었다는 것을 나타낸다.

<실시예 2>

파아지를 이용하는 방법에 의한 인간의 aFGF 134 아미노산 형태의 생산

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균은 플라스미드 pET24 134@rev (도 5)에 의하여 형질 전환되고, 이 플라스미드는 인간의 aFGF(134 아미노산)(도 6; 서열 인식 번호 4번)을 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자를 한 카피 포함한다. 번역된 아미노산 서열은 서열 인식 번호 5번에 나타낸다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 인간의 aFGF 134 아미노산 형태의 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 aFGF 134 유전자의 발현이 시작된다.

플라스미드 pET24-134@rev와 함께 대장균 BL21(DE3)의 배양균은 50g/㎖ 카나 마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10³ 세포/㎖의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54는 대장균 RLMI의 용원성 배양균으로부터 준비되었고, 상기 배양균은 30℃의 LB 배지에서 강력하게 통기하면서 약 1 ×10⁸ 세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. 상기 용원성 배양균은 43℃로 데우고 cl 억제 인자를 비활성화 시키기 위하여 20분간 배양시켰다. 그 후, 온도를 37℃로 내리고, 60∼70 분 후 상기 박테리아 세포는 파아지가 1∼2 ×10¹⁰ PFU/㎖로 형성되면서 용해되었다.

<실시예 3>

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균은 플라스미드 pET24 140@rev (도 7)에 의하여 형질 전환되고, 이 플라스미드는 인간의 aFGF(도 8; 140 아미노산) (서열 인식 번호 4번)을 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자를 한 카피 포함한다. 해당 단백질은 서열 인식 번호 7번에 나타낸다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈 에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 인간의 aFGF 140 아미노산 형태의 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 aFGF 140 유전자의 발현이 시작된다.

pET24-140@rev와 함께 대장균 BL21(DE3)의 배양균은 50g/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁸ 세포/㎖의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21 에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54는 대장균 RLMI의 용원성 배양균으로부터 준비되었고, 상기 배양균은 30℃의 LB 배지에서 강력하게 통기하면서 약 1 ×10⁸ 세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. 상기 용원성 배양균은 43℃로 데우고 cl 억제 인자를 비활성화 시키기 위하여 20분간 배양시켰다. 그 후, 온도를 37℃로 내리고, 60∼70 분 후 상기 박테리아 세포는 파아지가 1 내지 2 ×10¹⁰ PFU/㎖로 형성되면서 용해되었다.

상기 파아지로 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 haFGF 140를 얻기 위하여 haFGF 140 단백질 을 포함하는 배양액을 헤파린 세파로즈 칼럼에 적용시켰다.

상기 방법에 따라 생산된 인간의 aFGF 140은 병아리 세포막 분석 (실시예 6)에 근거하여 생리 활성을 가지고 있었다.

<실시예 4>

파아지를 이용하는 방법에 의한 인간의 aFGF 146 아미노산 형태의 생산

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균은 플라스미드 pET24-146@rev (도 7)에 의하여 형질 전환되고, 이 플라스미드는 인간의 aFGF(146 아미노산)(도시하지 않음)을 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자를 한 카피 포함한다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 인간의 aFGF 146 아미노산 형태의 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 aFGF 146 유전자의 발현이 시작된다.

pET24-146@rev와 함께 대장균 BL21(DE3)의 배양균은 50g/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁵ 세포/㎖의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

상기 파아지로 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 haFGF 146를 얻기 위하여 haFGF 146 단백질을 포함하는 배양액을 헤파린 세파로즈 칼럼에 적용시켰다.

상기 방법에 따라 생산된 인간의 aFGF 146은 병아리 세포막 분석 (실시예 6)에 근거하여 생리 활성을 가지고 있었다.

<실시예 5>

재조합 haFGF 단백질의 정제

haFGF 단백질을 포함하는 배양액을 pH 7.0 인 0.04M KH₂PO₄완충용액으로 일회 희석시키고, pH 7.0의 0.02M KH₂PO₄와 평형시킨 헤파린-세파로즈 칼럼에 적용시켰다. 흐름 속도는 80㎖/시간으로 조절하였다. 상기 haFGF 단백질을 함유하는 배양액을 칼럼에 적용시킨 후, 상기 칼럼을 pH 7.0인 0.02M KH₂PO₄ 완충용액으로 세척하였다. 다음으로, 상기 칼럼을 pH 7.3인 0.6M NaCl을 함유하는 0.02M KH₂PO₄완충용액으로 세척하였다.

용리는 pH 7.5의 1.5M NaCl과 함께 0.02M KH₂PO₄ 완충용액을 사용하여 수행되었다. 모든 단계는 4 에서 수행되었다.

<실시예 6>

닭 배아의 장요막(CAM)에서의 새로운 혈관 형성에 FGF가 미치는 영향을 연구하는 방법

닭 배아 모델에 관한 혈관 생성 방법 (Thomas et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6409-6413)을 채용하여, 순수한 뇌-유도된 산성 피브로블라스트 성장 인자에 비교하여 혈관 형성에 haFGF 155, 146, 140 재조합 단백질들이 미치는 효과를 측정하였다. 순수한 뇌-유도된 산성 피브로블라스트 성장 인자는 인터류킨과 서열 상동성을 가지는 잠재적인 혈관 형성 내피 세포 미토겐(분열 촉진 물질)이다.

3일된 닭 배아의 껍질을 에틸 알코올로 살균하였다. 껍질과 껍질 하부막을 겸자를 사용하여 공기함으로부터 제거하고, 상기 달걀을 35 mm의 플라스틱 페트리 접시로 덮어 두었다. 상기 배아는 37℃에서 5∼6일간 배양되었다. 이 기간이 지난 후, 배아를 조사하여, CAM의 잘 발달된 혈관을 가진 달걀을 실험용으로 선택하였다.

FGF를 함유하는 겔로 침착(deposit)된 디스크형의 여과지를 상기 겔이 혈관을 향하게 하여 달걀 CAM 상에 놓고 3일 더 37℃의 항온조에서 배양시킨다. 상기 겔은 다음과 같이 준비되었다: FGF 시험된 양을 이글(Eagle)액 (용액 1) 30ℓ에 용 해시켰다; 그 후, 이글액 30ℓ에 10 g의 헤파린을 용해시키고 2%의 아가로스를 첨가하였다 (용액 2). 그런 후, 용액 1과 2의 같은 부피를 혼합하고 얻어진 혼합물을 60ℓ의 분량으로 직경이 12mm인 디스크형의 여과지에 침착시켰다.

4일째 되는 날, 상기 여과지를 제거하였다. 진한 암소 우유 (10% 유지방) 약 1㎖이하의 양을 CAM 하에 주입하였다. 그 결과 백색의 배경 하에 CAM 혈관이 쉽게 관측되었다.

상기 실험의 결과들은 컴퓨터와 연계하여 비디오 카메라에 기록되었다. FGF의 영향 하에 새로운 CAM 혈관이 형성되는 것을 다음 계수들로 평가하였다: 혈관 성장의 성질과 방향, 그들의 양과 질(대, 중, 소), 접합의 존재와 부재 등. 이러한 데이터들은 FGF에 노출되지 않은 대조군의 샘플과 비교되었다. 성장 14일째 날에 닭 배아 혈관은 본 발명에서 기술된 파아지를 이용하는 재조합 방법에 따라 생산된 FGF 155로 처리하고 기술된 바와 같이 헤파린 세파로즈로 정제하였다.

재조합 FGF 155 단백질을 사용하여 새로운 혈관이 형성되는 것을 증명하였다. 1g의 FGF 155를 사용한 후 4일째 되는 날, 혈관들은 주로 크기가 작았으며, 방사상으로 성장하였다. FGF 155의 양을 3g으로 증가시켰더니, 혈관들의 크기가 증가되는 것을 보였다. 중간 크기의 혈관이 방사상으로 성장하는 것이 관측되었다. FGF 155를 4g으로 더욱 증가시켰더니, 대조군에 비하여, 4일째 되는 날 대, 중, 소의 혈관들이 나타나는 것을 보였다.

<실시예 7>

파아지을 이용하는 방법에 따른 인간의 성장 호르몬의 생산

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균을, 인간의 성장 호르몬을 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자 (서열 인식 번호 8번) 한 카피를 포함하는 플라스미드로 형질 전환하였다. 번역된 아미노산 서열은 서열 인식 번호 9번에 나타낸다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 인간의 성장 호르몬 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 aFGF 146 유전자의 발현이 시작된다.

대장균 BL21(DE3)의 형질전환된 배양균은 50g/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁸ 세포/㎖의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

파아지 cl₈₅₇ Q_am117R_am54는 대장균 RLMI의 용원성 배양균으로부터 준비되었고, 상기 배양균은 30℃의 LB 배지에서 강력하게 통기하면서 약 1 ×10⁸ 세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. 상기 용원성 배양균은 43℃로 데우고 cl 억제 인자를 비활성화 시키기 위하여 20분간 배양시켰다. 그 후, 온도를 37℃로 내리고, 60∼70 분 후 상기 박테리아 세포는 파아지가 1∼2 ×10¹⁰ PFU/㎖로 형성되면서 용해되었다.

상기 파아지로 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 인간의 성장 호르몬을 얻기 위하여 인간의 성장 호르몬 단백질을 당업자에게 알려져 있는 방법으로 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. Nb2 림프종 세포를 이용하는 세포계 생물분석법 (Gout PW, Cancer Research 40: 2433-2436, 1980)으로 분석한 결과 상기 정제된 인간의 성장 호르몬은 생리 활성을 가지고 있었다. Nb2 세포 성장 최대 자극의 반을 주는 인간 성장 호르몬의 농도는 125 pg/㎖이었다.

<실시예 8>

파아지를 이용하는 방법에 따른 인간의 인터페론-2b의 생산

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균을 플라스미드 pET24ap-inf@rev(도 9)로 형질 전환하였다. 이 플라스미드는 -2 인간의 인터페론을 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자(도 10; 서열 인식 번호 10번) 한 카피를 포함한다. 번역된 아미노산 서열은 서열 인식 번호 11번에 나타낸다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 상기 인터페론 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 상기 인터페론 유전자의 발현이 시작된다.

플라스미드 pET24ap-inf@rev와 함께 대장균 BL21(DE3)의 배양균은 50g/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁸ 세포/㎖ 의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1 mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

상기 파아지가 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 인터페론을 얻기 위하여 인터페론을 이 분야의 기술에 정통한 당업자에게 알려져 있는 방법으로 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.

소낭성 구내염 바이러스로 감염된 소 신장 세포에서 수행된 인터페론 항바이러스 분석법 (Aebersold P, Methods in Enzymology 119:579-592, 1986)에 근거하여, 본 발명에서 개시하는 방법에 따라 생산된 인터페론은 생리 활성을 가지고 있었다. 인터페론 알파 2b는 이 분석에서 단백질 1mg 당 1.81 ×10⁸ IU의 생물학적 효 능(potency)을 가지고 있었다. 정제하기 전에 박테리아 배양액에 함유된 인터페론 알파 2b는 이 항바이러스 분석에서 정제된 인터페론과 동일한 효능을 가지고 있었다. 이는 인터페론 알파 2b가 초기에 박테리아에서 용해 가능하고 생리활성을 가지는 단백질로 합성된다는 것을 나타낸다.

<실시예 9>

파아지를 이용하는 방법에 따른 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제의 생산

대장균 BL21(DE3)(NOVAGEN)의 배양균을, 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 암호화 하는 화학적으로 합성된 유전자를 한 카피 포함하는 플라스미드로 형질 전환하였다. BL21(DE3) 배양균들은 박테리아 게놈에 있는 유도 가능한 lac UV5 프로모터의 조절 하에서 T7 RNA 중합효소를 위한 유전자 한 카피를 포함한다 (Studier et al.(1986) J. Mol. Biol. 189:113-130). T7 프로모터의 조절 하에서 플라스미드 pET-24a(+)(NOVAGEN) 속으로 상기 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제 유전자를 삽입하였다. IPTG에 의한 lac UV5 프로모터의 유도를 통하여 중개된 세포에 있는 T7 중합효소가 나타난 후에만 상기 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제 유전자의 발현이 시작된다.

대장균 BL21(DE3)의 형질 전환된 배양균은 50g/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 2 ×10⁸ 세포/㎖ 의 밀도로, 37℃에서 교반하면서 성장시켰다. 그 후, 상기 세포들은 파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54로 1 박테리아 세포당 약 10 파아지의 다중도로 감염시켰고, 21℃에서 약 14시간동안 교반하며 배양되었다. 파아지와 함께, 1mM의 IPTG도 배지 속으로 도입되었다.

파아지 cl₈₅₇ Q_am117 R_am54는 대장균 RLMI의 용원성 배양균으로부터 준비되었고, 상기 배양균은 30℃의 LB 배지에서 강력하게 통기하면서 약 1 ×10⁸세포/㎖의 밀도로 성장시켰다. 상기 용원성 배양균은 43℃로 데우고 cl 억제 인자를 비활성화 시키기 위하여 20분간 배양시켰다. 그 후, 온도를 37℃로 내리고, 60∼70 분 후 상기 박테리아 세포는 파아지가 1 내지 2 ×10¹⁰ PFU/㎖로 형성되면서 용해되었다.

상기 파아지로 감염된 세포를 14시간 동안 배양시킨 후, 부스러기는 원심 분리하여 배양액에서 제거하였다. 순수한 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 얻기 위하여 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 당업자에게 알려져 있는 방법으로 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하였다.

<실시예 10>

파아지를 이용하는 방법에 따라 생산된 재조합 단백질의 겔 분석

인간의 aFGF 134 아미노산 형태, 인간의 aFGF 140 아미노산 형태, 인간의 aFGF 155 아미노산 형태, 인간의 성장 호르몬, 인터페론, 및 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하는 배양액을 변성시키는 조건 하에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 분석하고 쿠마시 블루로 착색하였다. 인간의 aFGF 134 아미노산 형태, 인간의 aFGF 140 아미노산 형태, 인간의 aFGF 146 아미노산 형태, 인간의 성장 호르몬, 및 인터페론 단백질들을 포함하는 배양액의 전기 영동 그림이 도 11에서 분자량 표준에 비교된다. 2레인은 인간의 aFGF 134 아미노산 형태를 포함하는 배양 액 30 l의 경우이다. 3레인은 인간의 aFGF 140 단백질을 포함하는 배양액 30ℓ의 경우이다. 4레인은 재조합 인터페론을 포함하는 배양액 30ℓ의 경우이다. 5레인은 재조합 FGF 155 단백질을 포함하는 배양액 30ℓ의 경우이다. 6레인은 재조합 인간 성장 호르몬을 포함하는 배양액 30ℓ의 경우이다. 7레인은 재조합 메티오닌 아미노 펩티다제를 포함하는 배양액 30ℓ의 경우이다. 1레인은 각각의 분자량 표준 (Amersham Pharmacia Biotech) 2g의 경우이다. 위로부터, 그 분자량 표준은: 94,000; 67,000; 43,000; 30,000; 20,100; 및 14,400이다.

혼합되어 있는 인간의 aFGF 134 아미노산 형태, 인간의 aFGF 140 아미노산 형태, 인간의 aFGF 155 아미노산 형태, 인간의 성장 호르몬, 인터페론, 및 메티오닌 아미노펩티다제는 폴리아크릴아미드 겔 상의 착색된 단백질 밴드를 밀도측정기 Image Master VDS (Pharmacia Biotech사)으로 스캔하여 정량하였다. 파아지로 감염된 배양균에서 재조합 단백질의 생산량은 전체 세포 단백질의 약 20% 이었다.

재조합 haFGF 134, haFGF 140, haFGF 146, 인터페론, haFGF 155 및 메티오닌 아미노펩티다제를 포함하는 전기 영동 그림은 분자량 표준에 비교되었다 (도 12). 2레인은 정제된 aFGF 134 단백질 5g의 경우이다. 3레인은 정제된 인간의 aFGF 140 5g의 경우이다. 4레인은 정제된 인간의 aFGF 146 아미노산 형태 5g의 경우이다. 파아지로 감염된 배양균에서 인간의 aFGF 아미노산 형태의 생산량은 전체 세포 단백질의 약 20%이었다. 5레인은 정제된 인터페론 5g의 경우이다. 6레인은 haFGF 155 단백질 5g의 경우이다. 7레인은 정제된 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제 5g의 경우이다. 1레인과 8레인은 각각 분자량 표준(Amersham Pharmacia Biotech사) 2g의 경우이다.

당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 여러 가지 다양한 변경이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 본 발명의 실시예들은 단지 예시적이며 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아니라는 것을 이해해야 한다.

<110> Phage Biotechnology Corporation <120> PHAGE-DEPENDENT SUPER PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE PROTEIN AND PEPTIDES <130> PHAGE.006VPC <150> 09/318,288 <151> 1999-05-25 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This sequence was chemically synthesized based upon the amino acid sequence of human acidic fibroblast growth factor (155 amino acids) using codons which are used in highly expressed proteins from E. coli. <221> CDS <222> (122)..(586) <400> 1 gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 60 gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca 120 t atg gct gaa ggg gaa atc acc acc ttt aca gcg tta acg gag 163 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu 1 5 10 aaa ttt aac ctt ccg ccc ggg aat tac aaa aaa ccc aag ctt ctt tac 211 Lys Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr 15 20 25 30 tgc agt aac gga gga cac ttc ctg cga att ctg cca gat ggc aca gta 259 Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val 35 40 45 gat ggg act cgc gat cgc tcc gac cag cac att cag ctg caa ctc tcg 307 Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser 50 55 60 gcc gaa agc gtt gga gag gtc tat atc aag tcg acg gag act ggc cag 355 Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln 65 70 75 tac ctt gcc atg gac acc gat ggg ctt ctg tat ggc tca cag acg cct 403 Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro 80 85 90 aac gaa gaa tgc ttg ttt cta gaa aga cta gaa gaa aac cat tac aac 451 Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn 95 100 105 110 acg tac ata tcg aaa aaa cat gca gag aag aac tgg ttt gta ggc ctt 499 Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu 115 120 125 aaa aaa aat ggt tcc tgt aag cgt gga cca cgg act cac tat ggc caa 547 Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln 130 135 140 aag gct atc ttg ttc ctg cca cta cca gtg acg tcc gac taag 590 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Thr Ser Asp 145 150 155 gatccgaatt cgagctccgt cgacaagctt gcggccgcac 630 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 35 40 45 Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu 50 55 60 Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu 85 90 95 Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr 100 105 110 Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys 115 120 125 Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 145 150 155 <210> 3 <211> 468 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggctgaag gggaaatcac caccttcaca gccctgaccg agaagtttaa tctgcctcca 60 gggaattaca agaagcccaa actcctctac tgtagcaacg ggggccactt cctgaggatc 120 cttccggatg gcacagtgga tgggacaagg gacaggagcg accagcacat tcagctgcag 180 ctcagtgcgg aaagcgtggg ggaggtgtat ataaagagta ccgagactgg ccagtacttg 240 gccatggaca ccgacgggct tttatacggc tcacagacac caaatgagga atgtttgttc 300 ctggaaaggc tggaggagaa ccattacaac acctatatat ccaagaagca tgcagagaag 360 aattggtttg ttggcctcaa gaagaatggg agctgcaacg gcggtcctcg gactcactat 420 ggccagaaag caatcttgtt tctccccctg ccagtctctt ctgattaa 468 <210> 4 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This sequence is a chemically synthesized sequence encoding a 134 amino form of fibroblast growth factor with alterations for preferred codon usage in E. coli. <221> CDS <222> (122)..(526) <400> 4 gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 60 gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca 120 t atg aat tac aaa aaa ccc aag ctt ctt tac tgc agt aac gga 163 Met Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly 1 5 10 gga cac ttc ctg cga att ctg cca gat ggc aca gta gat ggg act cgc 211 Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg 15 20 25 30 gat cgc tcc gac cag cac att cag ctg caa ctc tcg gcc gaa agc gtt 259 Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val 35 40 45 gga gag gtc tat atc aag tcg acg gag act ggc cag tac ctt gcc atg 307 Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met 50 55 60 gac acc gat ggg ctt ctg tat ggc tca cag acg cct aac gaa gaa tgc 355 Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys 65 70 75 ttg ttt cta gaa aga cta gaa gaa aac cat tac aac acg tac ata tcg 403 Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser 80 85 90 aaa aaa cat gca gag aag aac tgg ttt gta ggc ctt aaa aaa aat ggt 451 Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly 95 100 105 110 tcc tgt aag cgt gga cca cgg act cac tat ggc caa aag gct atc ttg 499 Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu 115 120 125 ttc ctg cca cta cca gtg agc tcc gac taag gatccgaatt cgagctccgt 550 Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 cgacaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 610 caaagcccga aaggaagctg 630 <210> 5 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Translated protein sequence for the chemically synthesized 134 amino acid form of fibroblast growth factor <400> 5 Met Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His 1 5 10 15 Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg 20 25 30 Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu 35 40 45 Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr 50 55 60 Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe 65 70 75 80 Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys 85 90 95 His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys 100 105 110 Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu 115 120 125 Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 <210> 6 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trasnslated protein sequence for the chemically synthesized 134 amino acid formo of fibroblast growth factor <221> CDS <222> (122)..(544) <400> 6 gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 60 gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca 120 t atg ttt aac ctt ccg ccc ggg aat tac aaa aaa ccc aag ctt 163 Met Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 1 5 10 ctt tac tgc agt aac gga gga cac ttc ctg cga att ctg cca gat ggc 211 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 15 20 25 30 aca gta gat ggg act cgc gat cgc tcc gac cag cac att cag ctg caa 259 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 35 40 45 ctc tcg gcc gaa agc gtt gga gag gtc tat atc aag tcg acg gag act 307 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 50 55 60 ggc cag tac ctt gcc atg gac acc gat ggg ctt ctg tat ggc tca cag 355 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 65 70 75 acg cct aac gaa gaa tgc ttg ttt cta gaa aga cta gaa gaa aac cat 403 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 80 85 90 tac aac acg tac ata tcg aaa aaa cat gca gag aag aac tgg ttt gta 451 Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 95 100 105 110 ggc ctt aaa aaa aat ggt tcc tgt aag cgt gga cca cgg act cac tat 499 Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 115 120 125 ggc caa aag gct atc ttg ttc ctg cca cta cca gtg agc tcc gac 544 Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140 taagga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc 600 accaccacca ctgagatccg gctgctaaca 630 <210> 7 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Translated protein sequence for the chemically synthesized 140 amino acid form of fibroblast growth factor <400> 7 Met Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val 20 25 30 Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser 35 40 45 Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln 50 55 60 Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro 65 70 75 80 Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn 85 90 95 Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu 100 105 110 Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140 <210> 8 <211> 1822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> TATA_signal <222> (102)..(107) <221> CDS <222> (193)..(201) <221> intron <222> (202)..(457) <221> CDS <222> (458)..(619) <221> intron <222> (620)..(828) <221> CDS <222> (829)..(948) <221> intron <222> (949)..(1041) <221> CDS <222> (1042)..(1206) <221> intron <222> (1207)..(1459) <221> CDS <222> (1460)..(1654) <223> Chemically synthesized sequence for Human Growth Hormone using codons preferred for expression in E. coli <400> 8 ggagcttcta aattatccat tagcacaagc ccgtcagtgg ccccatgcat aaatgtacac 60 agaaacaggt gggggcaaca gtgggagaga aggggccagg gtataaaaag ggcccacaag 120 agaccggctc aaggatccca aggcccaact ccccgaacca ctcagggtcc tgtggacgct 180 cacctagctg ca atg gct aca ggtaagcgc ccctaaaatc cctttgggca 230 Met Ala Thr 1 caatgtgtcc tgaggggaga ggcagcgacc tgtagatggg acgggggcac taaccctcag 290 gtttggggct tctgaatgag tatcgccatg taagcccagt atggccaatc tcagaaagct 350 cctggtccct ggagggatgg agagagaaaa acaaacagct cctggagcag ggagagtgct 410 ggcctcttgc tctccggctc cctctgttgc cctctggttt ctcccca ggc tcc cgg 466 Gly Ser Arg 5 acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc ctg ctc tgc ctg ccc tgg ctt caa 514 Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu Cys Leu Pro Trp Leu Gln 10 15 20 gag ggc agt gcc ttc cca acc att ccc tta tcc agg ctt ttt gac aac 562 Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn 25 30 35 gct atg ctc cgc gcc cat cgt ctg cac cag ctg gcc ttt gac acc tac 610 Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr 40 45 50 cag gag ttt g taagctcttg gggaatgggt gcgcatcagg ggtggcagga 660 Gln Glu Phe 55 aggggtgact ttcccccgct gggaaataag aggaggagac taaggagctc agggtttttc 720 ccgaagcgaa aatgcaggca gatgagcaca cgctgagtga ggttcccaga aaagtaacaa 780 tgggagctgg tctccagcgt agaccttggt gggcggtcct tctcctag gaa gaa gcc 837 Glu Glu Ala 60 tat atc cca aag gaa cag aag tat tca ttc ctg cag aac ccc cag acc 885 Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr 65 70 75 tcc ctc tgt ttc tca gag tct att ccg aca ccc tcc aac agg gag gaa 933 Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu 80 85 90 35 aca caa cag aaa tcc gt gagtggatgc cttgacccca ggcggggatg 980 Thr Gln Gln Lys Ser 95 ggggagacct gtagtcagag cccccgggca gcacaggcca atgcccgtcc ttcccctgca 1040 g aac cta gag ctg ctc cgc atc tcc ctg ctg ctc atc cag tcg 1083 Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser 100 105 110 tgg ctg gag ccc gtg cag ttc ctc agg agt gtc ttc gcc aac agc ctg 1131 Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu 115 120 125 30 gtg tac ggc gcc tct gac agc aac gtc tat gac ctc cta aag gac cta 1179 Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu 130 135 140 gag gaa ggc atc caa acg ctg atg ggg gtgg gggtggcgct aggggtcccc 1230 Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 145 150 aatcttggag ccccactgac tttgagagct gtgttagaga aacactgctg ccctcttttt 1290 agcagtccag gccctgaccc aagagaactc accttattct tcatttcccc tcgtgaatcc 1350 tctagccttt ctctacaccc tgaaggggag ggaggaaaat gaatgaatga gaaagggagg 1410 gagcagtacc caagcgcttg gcctctcctt ctcttccttc actttgcag agg ctg gaa 1468 Arg Leu Glu 155 gat ggc agc ccc cgg act ggg cag atc ttc aag cag acc tac agc aag 1516 Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys 160 165 170 ttc gac aca aac tca cac aac gat gac gca cta ctc aag aac tac ggg 1564 Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly 175 180 185 ctg ctc tac tgc ttc agg aag gac atg gac aag gtc gag aca ttc ctg 1612 Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu 190 195 200 cgc atc gtg cag tgc cgc tct gtg gag ggc agc tgt ggc ttc tagctg 1660 Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 205 210 215 cccgggtggc atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccttgga agttgccact 1720 ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg 1780 tcctctataa tattatgggg tggagggggg tggtttggag ca 1822 <210> 9 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Glu Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu 20 25 30 Ser Arg Leu Phe Glu Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 35 40 45 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 65 70 75 80 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 100 105 110 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 130 135 140 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 145 150 155 160 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 165 170 175 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 180 185 190 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 195 200 205 Arg Ser Val Glu Gly Thr Cys Gly Phe 210 215 <210> 10 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized seqeuence for human interferon alpha-2b <221> promoter <222> (231)..(249) <221> CDS <222> (320)..(784) <400> 10 gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt 60 tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg 120 tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag 180 gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc cagatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac 240 tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt ttgtttaact 300 ttaagaagga gatatacat atg gct gaa ggg gaa atc acc acc ttt aca gcg 352 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala 1 5 10 tta acg gag aaa ttt aac ctt ccg ccc ggg aat tac aaa aaa ccc aag 400 Leu Thr Glu Lys Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys 15 20 25 ctt ctt tac tgc agt aac gga gga cac ttc ctg cga att ctg cca gat 448 Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp 30 35 40 ggc aca gta gat ggg act cgc gat cgc tcc gac cag cac att cag ctg 496 Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu 45 50 55 caa ctc tcg gcc gaa agc gtt gga gag gtc tat atc aag tcg acg gag 544 Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu 60 65 70 75 act ggc cag tac ctt gcc atg gac acc gat ggg ctt ctg tat ggc tca 592 Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser 80 85 90 cag acg cct aac gaa gaa tgc ttg ttt cta gaa aga cta gaa gaa aac 640 Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn 95 100 105 cat tac aac acg tac ata tcg aaa aaa cat gca gag aag aac tgg ttt 688 His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe 110 115 120 gta ggc ctt aaa aaa aat ggt tcc tgt aag cgt gga cca cgg act cac 736 Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His 125 130 135 tat ggc caa aag gct atc ttg ttc ctg cca cta cca gtg agc tcc gac 784 Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 140 145 150 155 taagga tccgaattcg agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gacgaccacc 840 accaccacca ctgagatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg 900 ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 960 ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 990 <210> 11 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Translated protein sequence for the chemically synthesized human interferon alpha-2b <400> 11 Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser 20 25 30 Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly 35 40 45 Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu 50 55 60 Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu 85 90 95 Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr 100 105 110 Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys 115 120 125 Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala 130 135 140 Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 145 150 155

Claims

T7 중합효소 프로모터에 작동할 수 있도록 연결된 생리 활성 단백질을 암호화하는 발현 가능한 유전자를 한 카피 이상 가지는 플라스미드로, T7 RNA 중합효소의 유전자를 발현시킬 수 있는 대장균주를 형질 전환하는 단계;

용해를 지연시키는 것을 조절할 수 있는 N, Q, 및 R로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 변이를 갖는 박테리오파아지로 상기 형질 전환된 박테리아 숙주 세포를 감염시키는 단계; 및

용해가능하고 생리 활성이 있는 단백질이 원하는 수준의 양으로 생산될 때까지 대장균 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 생리 활성 단백질을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 온도에 민감한 변이 cl₈₅₇을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제2항에 있어서, 상기 배양 단계 전에, 상기 대장균 숙주 세포들을 상기 박테리오파아지의 용해 성장을 방지하는 온도에서 성장시키는 것을 특징으로 하는 방 법.
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제1항에 있어서, 상기 대장균 주는 앰버변이를 수정하기 위한 억제 인자를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 대장균 주는 앰버변이를 수정하기 위한 억제 인자가 없는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 감염 박테리오파아지는 1∼10의 범위의 감염 다중도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 감염 박테리오파아지는 10∼25의 범위의 감염 다중도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 대장균 주의 박테리오파아지-조절된 지연 용해가 낮은 감염 다중도에 비하여 높은 감염 다중도에서 지연되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자를 암호화 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자가 134개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자가 140개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자가 146개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자가 155개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 인간의 산성 피브로블라스트 성장 인자가 서열 인식 번호 1번에 나타낸 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간의 성장 호르몬을 암호화 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 유전자는 인간의 인터페론을 암호화 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 발현 가능한 유전자는 대장균 메티오닌 아미노 펩티다제를 암호화 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 T7 RNA 중합효소의 유전자는 유도 가능한 프로모터의 조절 하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 유도 가능한 프로모터는 lac UV 5 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
서열 인식 번호 1번에 나타낸 서열로 구성된 화학적으로 합성된 핵산.
a) 온도에 민감한 변이 cl₈₅₇을 가지고 있는 박테리오파아지 λ주가 살아 있는 대장균 제1주를 성장시키는 단계;

b) 대장균 제1주를 용해하고 상기 박테리오파아지 λ를 방출시키기 위하여 온도를 조절하는 단계;

c) 유도 가능한 프로모터의 조절하에서 T7 중합효소 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 생리 활성 있는 단백질을 암호화 하는 발현 가능한 유전자를 한 카피 이상 가지는 플라스미드로 형질 전환되고, 유도 인자를 첨가하여 T7 RNA 중합효소의 유전자를 발현하도록 유도될 수 있는 대장균 제2주를 제공하는 단계;

d) 상기 대장균 제1주로부터 방출된 상기 박테리오파아지 λ로 상기 대장균 제2주를 감염시키는 단계; 및

e) 용해 가능하고, 생리 활성이 있는 단백질이, 100㎍/㎖보다 높은 농도로 생산되어, 상기 대장균 제2주의 용해시에 배양 배지로 방출되도록, 유도 인자를 포함하는 배양 배지에서 상기 감염된 대장균 제2주를 배양시키는 단계를 포함하는 생리 활성 단백질을 생산하는 방법.