PT99578B - Processo para a reactivacao de uma proteina desnaturada - Google Patents

Processo para a reactivacao de uma proteina desnaturada Download PDF

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Description

O presente invento refere-se a um processo aperfeiçoado para a solubilização e renaturação de proteína desnaturada, no qual a proteína é tratada com tampão Tris que apresenta uma concentração de, pelo menos, 400 mmol/1 de base Tris ou de um sal de Tris.
A produção de proteínas em células procariotas como, por exemplo, E.coli, dá frequentemente origem a agregados proteicos pouco solúveis (corpos de inclusão). Para transformar estas proteínas na sua forma solúvel, são necessários vários passos de solubilização e de renaturação. A solubilização de proteínas é um processo usual (veja, por exemplo, a EP-A 0 361 475, EP-A 0 114 506, EP-A 0 093 619 e EP-A 0 253 823).
Além disso conhecem-se não só tampões como também processos para a renaturação de proteínas desnaturadas (veja, por exemplo, a WO 87/02673, EP-A 0 364 926, EP-A 0 241 022).
Um factor essencial, que limita o rendimento em proteína renaturada na reactivação de proteínas (com ou sem formação de pontes de dissulfureto), é a reacção paralela de transformação da proteína desnaturada no intermediário de dobragem e a agregação de várias moléculas proteicas. Por esta razão, a concentração de proteína desnaturada no tampão de renaturação é um parâmetro essencial para o rendimento do processo de renaturação, isto é, uma concentração crescente de proteína desnaturada favorece a agregação, baixando o rendimento relativo em proteína renaturada com a conformação da proteína nativa.
Em todos os processos para a reactivação de proteínas presentemente conhecidos é portanto necessário que a quantidade de proteína desnaturada na preparação não seja superior a uma concentração crítica. Visto que a solubilidade da proteína no tampão de reactivação utilizado é muitas vezes reduzida, resultam, por isso, desvantagens consideráveis no que diz respeito a um rendimento mais reduzido, necessidade maior de tempo ou/e volumes maiores do tampão.
4Ζ 'Ύ Xi
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1197/00/ΡΤ
-3Um dos problemas que o presente invento quer resolver é, portanto, criar condições para a reactivação (isto é, nomeadamente para a solubilização e renaturação), e proporciona um tampão no qual a solubilidade da proteína desnaturada e renaturada, em relação aos tampões usuais, é aumentada consideravelmente.
Este problema é resolvido de acordo com o presente invento por um processo para a reactivação de proteína desnaturada, caracterizado por se incubar a proteína com uma solução de base de tris-(hidroximetil)-aminometano (a seguir designado por Tris) ou um sal de Tris, numa concentração de, pelo menos, 400 mmol/1 e com um valor de pH ao qual a proteína a tratar possa assumir a sua conformação nativa.
A utilização de um tampão que contenha base de Tris ou sais de Tris com uma concentração de mais de 400 mmol/1 aumenta consideravelmente, na reactivação de proteínas desnaturadas, a solubilidade das proteínas em vias de renaturação. Isto conduz a um aumento nítido do rendimento em proteína activa em relação a processos padrão usuais. Embora os tampões de reactivação até à data usuais contenham, muitas vezes, Tris numa concentração de 50 a 100 mmol/1 para estabilizar a solução de reacção, não se tinha dado conta, até agora, das surpreendentes propriedades solubilizantes (que, consequentemente, melhoram o rendimento da renaturação) de Tris, numa concentração de, pelo menos, 400 mmol/1.
Por sal de Tris, no sentido do presente invento, entende-se um sal de Tris de qualquer ácido orgâncio ou inorgânico. Exemplos de sais Tris são, por exemplo, acetato de Tris, benzoato de Tris, borato de Tris, carbonato de Tris, citrato de Tris, hidrocloreto de Tris, maleato de Tris, nitrato de Tris, oxalato de Tris, fosfato de Tris, succinato de Tris, sulfato de Tris, e outros semelhantes.
processo de acordo com o invento é próprio para a renaturação de proteínas, não sendo crítica, em princípio, a
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causa da desnaturação (sal, calor etc.). Apesar do processo de acordo com o invento ser próprio, de preferência, para a renaturação de produtos fabricados através da engenharia genética e obtidos sob forma de material inactivo, em corpos de inclusão, é, no entanto, em princípio possível aplicar o processo também em outras proteínas desnaturadas. 0 processo de acordo com o invento é aplicável, nomeadamente, aos processos publicados na WO 87/02673, EP-A 0 241 022 e EP-A 0 364 926. Neste contexto, a WO 87/02673 descreve um processo para a activação de tPA não glicosilado, após a expressão em procariotas, através de lise celular, solubilização sob condições desnaturantes e redutoras, e reactivação sob condições oxidantes em presença de GSH/GSSG, trabalhando-se, na etapa da reactivação, com um valor de pH de 9 a 12, uma concentração de GSH de 0,1 a 20 mmol/1, uma concentração de GSSG de 0,01 a 3 mmol/1 e uma concentração não desnaturante de um agente desnaturante. A EP-A 0 241 022 descreve um processo para a renaturação de proteínas desnaturadas numa solução de um tampão de renaturação, no qual se produz uma solução da proteína a renaturar com a concentração crítica no tampão escolhido, adicionando, após a formação do intermediário de dobragem, mais proteína a renaturar, na quantidade necessária à obtenção da concentração crítica. A EP-A 0 364 926 refere-se a um processo para a activação de proteínas biologicamente activas produzidas através da engenharia genética, expressas em procariotas, após lise celular, através de solubilização sob condições desnaturantes e redutoras e reactivação subsequente sob condições oxidantes e renaturantes, no qual se trabalha com uma concentração de proteína de 1 - 1000 Mg/ml e se realiza, entre a solubilização e a reactivação, uma diálise contra um tampão com um valor de pH entre 1 e 4 contendo 4 a 8 mol/1 de hidrocloreto de guanidina ou 6 a 10 mol/1 de ureia.
O processo de acordo com o invento pode ser realizado em duas variantes. Uma consiste em trabalhar num tampão Tris com a concentração indicada de modo que o Tris e/ou um sal de Tris seja, também, utilizado para o ajuste do pH. A segunda variante consiste em trabalhar com um tampão que já foi descrito anteriormente em relação ao respectivo processo, juntando
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-5adicionalmente Tris e/ou um sal de Tris. Isto significa que o valor de pH da solução de incubação é ajustado através de uma substância tampão diferente de Tris. Em ambos os casos convém dar atenção a que a adição de Tris ou o aumento da concentração de Tris não provoquem nenhuma alteração do valor de pH.
A incubação é realizada a um valor de pH em que a proteína a ser tratada pode estar presente na sua conformação nativa. Isto significa que a incubação não se realiza, no processo de acordo com o invento, a um valor de pH que torne impossível a formação de uma conformação nativa da proteína. Por conformações nativas de proteína entendam-se, por sua vez, estruturas secundárias, terciárias e, eventualmente, quaternárias nas quais a proteína possa ter uma actividade biológica.
O processo de acordo com o invento inclui a incubação de uma proteína desnaturada por meio de uma solução de Tris que apresente uma concentração de, pelo menos, 400 mmol/1. A concentração de Tris é, de preferência, 0,4 a 2 mol/1, prefere-se sobretudo Tris a, aproximadamente, 1 mol/1. Com algumas proteínas (por exemplo com fragmentos de anticorpos) conseguem obter-se rendimentos de reactivação óptimos a concentrações de Tris na gama de 0,5 mol/1.
rendimento de um processo de renaturação depende, como já se descreveu acima, da concentração da proteína na solução de renaturação. Para o processo de acordo com o invento escolhe-se, de preferência, uma concentração de proteína na gama até 4000 ^g/ml.
Dependendo do tipo de proteína e do processo de renaturação é possível, no entanto, que também se revelem adequadas concentrações de proteína acima dessa gama.
No processo de acordo com o invento a proteína desnaturada é adicionada à solução de renaturação de modo contínuo ou em cargas (por exemplo, naturação por impulsos). Em muitos casos (por exemplo, na renaturação de tPA e de derivados de tPA) revelou-se,
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-6também, ser favorável adicionar à solução de incubação 0,2 a 1 mol/1 de arginina.
Exemplos preferidos de proteínas que podem ser renaturadas pelo processo de acordo com o invento são tPA recombinante ou muteínas de tPA (nomeadamente uma muteína de tPA não glicosilada com a composição de domínios K2P), factor estimulador de colónia de granulócitos recombinante (G-CSF), ou anticorpos ou os seus fragmentos. 0 processo de acordo com o invento não se limita porém a estes exemplos, mas pode aplicar-se em relação a quaisqer proteínas.
J
As vantagens do processo de reactivação de acordo com o invento abrangem sobretudo um aumento do rendimento final em proteína activa, de 30 a 300% em relação a um processo no qual se trabalha com um tampão que apresenta uma concentração mais baixa de Tris.
Além disso é possível aumentar a concentração de proteína desnaturada no tampão de renaturação, sem diminuir o rendimento final, isto é, o processo de renaturação torna-se nitidamente mais rápido e eficaz.
O processo de acordo com o invento traz uma vantagem sobretudo na renaturação por impulsos, num reactor de renaturação. Neste caso aumenta-se o rendimento de proteína renaturada, e além disso é possível aumentar a concentração de proteína por impulso, do que resulta uma diminuição da duração de reactivação. É também possível realizar os impulsos até uma concentração final de proteína mais alta na preparação de renaturação, sem que se observe uma diminuição do rendimento de renaturação. Assim resulta uma nítida redução no volume do tampão.
Revelou-se particularmente favorável um processo de renaturação por impulsos, no qual se realiza a renaturação num tampão contendo arginina, com uma concentração de Tris de cerca de 1 mol/1, e em que se aumenta a concentração da proteína a
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-7renaturar em cerca de 200 Mg/ml por cada impulso.
invento será pormenorizado, além disso, por meio dos exemplos seguintes.
Abreviaturas:
GSH
GSSG t-PA cprot
Arg
Gdn
Renat
CK : glutationa : glutationa oxidada : activador de plasminogénio tissular : concentração de proteína : arginina : guanidina : renaturação ; creatincinase
Exemplo 1
Rendimento de renaturação em dependência do tempo de incubação até à adição do segundo impulso (+/- 1 mol/1 de Tris)
Material de partida:
Produziram-se corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, de acordo com a WO 90/09437 (exemplo 1) e a seguir solubilizaram-se de acordo com a EP-A 0 361 475 Al (exemplo 1) e transformaram-se no dissulfureto misto. Nos exemplos 2 a 5 procedeu-se com o material de partida de modo análogo.
Renaturação: arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5
EDTA 1 mmol/1 glutationa reduzida (GSH) 0,7 mmol/1 Tris +/- 1 mol/1
Cprot. = 140 MG/111! P°r cada impulso Adição 2a impulso: 1 a 9 h (ver tabela)
Incubação: 12 h à temperatura ambiente após a adição do último impulso.
,.χΧ·73 184
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-8Tabela 1
Tempo 2a impulso (H) sem Tris actividade (+ fibrina) (U/ml) Tris 1 mol/1 actividade (+ fibrina) (U/ml)
0 2855 4736
1 4671 9256
2 4974 9732
3 5060 10359
4 5233 9343
5 5168 9645
6 6845 10185
7 6152 9252
8 6814 10726
9 7115 10335
Α determinação da actividade da muteína de tPA renaturada, K2P, e a definição da unidade U são descritas em Lill (ZGIMAL 42 (1987), 478-486).
Da tabela 1 verifica-se que se obtém no tampão de arginina sem Tris, a partir de um período de permanência de > 6 h até à adição do segundo impulso, um rendimento máximo de renaturação. No caso de se adicionar à preparação 1 mol/1 de Tris, dão-se as alterações seguintes: o rendimento máximo da renaturação aumenta 30 - 40%; já se pode adicionar novamente proteína desnaturada após um período de permanência de 1 a 3 h, sem diminuir o rendimento da renaturação.
Exemplo 2
Renaturação: Dependência na concentração de Tris e na proporção Arg/guanidina
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Material de partida:
Corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, produzidos como se descreve no exemplo 1.
Renaturação
Tris:
Incubação:
Ensaio A: dependência de Tris arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5 EDTA 1 mmo1/1
GSH 0,7 mmol/1
0, 50, 100, 500, 1000 e 2000 mmol/1 cprot. = 80 W/ml h à temperatura ambiente
Tampão:
Incubação
Ensaio B: dependência do tampão EDTA 1 mmol/1, pH 8,5 GSH 0,7 mmol/1 cprot. = 80 ^/ml (1) arginina/HCl 0,6 mol/1 (2) arginina/HCl 0,4 mol/1 mais 0,2 mol/1 de guanidina (Gdn)/HCl (3) arginina/HCl 0,2 mol/1 mais 0,5 mol/1 de guanidina (Gdn)/HCl com +/- 1 mol/1 de Tris de cada vez 24 h à temperatura ambiente
Tabela 2A
Ensaio A: dependência de Tris Tris Actividade (+ fibrina) (mmol/1) (U/ml)
0 2173
50 2750
100 2651
500 3902
1000 5339
2000 5131
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-10Tabela 2Β
Ensaio B: variação do tampão
Tampão Aditivos Actividade (+ fibrina) (U/ml)
(1) 0,6 mol/1 Arg 1 mol/1 Tris 2047 3553
(2) 0,4 mol/1 Arg/ - 1577
0,2 mol/1 Gdn 1 mol/1 Tris 4350
(3) 0,2 mol/1 Arg/ - 1402
0,5 mol/1 Gdn 1 mol/1 Tris 3277
Ensaio A: Com o aumento da concentração de Tris no tampão de renaturação aumenta também o rendimento. O máximo da renaturação encontra-se a uma concentração de Tris de cerca de 1 mol/1.
Surpreendente, entre os 100 mmol/1 e os 500 mmol/1 de Tris, o rendimento da renaturação aumenta. Ensaio B: Pela adição de 1 mol/1 de Tris foi aumentado drasticamente o rendimento em todos os casos (pelo factor 2 a 3).
Exemplo 3
Renaturação em dependência da concentração de proteína (+/- 1 mol/1 de Tris)
Material de partida:
Corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, produzidos como se descreve no exemplo 1.
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Ζ.·ζ' ¢/// ·
-11ζ*··*
Renaturação: Tampão A:
arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5 EDTA 1 mmol/1
GSH 0,7 mmol/1
cprot.: 112, 223 e 446 /ig/ml
Tampão B:
arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5
Tris 1 mol/1
EDTA 1 mmol/1
GSH 0 ,7 mmol/1
cprot.: 112, 223, 446, 893, 2230, 4460 μg/ml
Incubação: 24 h à temperatura ambiente
O resultado deste ensaio é representado na tabela 3 seguinte:
Tabela 3
Tris cprot. Actividade Actividade/Cproj..
(+ fibrina) (U/mg)
(mol/1) (jug/ml) (U/ml)
0 112 2875 25670
223 4187 18780
446 5956 13350
1 112 2900 25890
223 5171 23190
446 10163 22790
893 13286 14880
2230 17483 7840
4460 24930 5590
No tampão de arginina sem Tris, a taxa de renaturação diminui com um aumento da concentração de proteína. No caso de se adicionar ao tampão l mol/1 de Tris, não se regista nenhuma diminuição significativa do rendimento de renaturação
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-12(actividade/Cpro^-,) até uma concentração de proteína de 400 jig/ml. Apenas a concentrações de proteína mais elevadas desce o rendimento com o aumento da concentração.
Exemplo 4
Naturação por impulsos: +/” 1 mol/1 de Tris
Material de partida:
Corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, produzidos como se descreve no exemplo 1.
Renaturação: arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5
EDTA 1 mmol/1
GSH 0,7 mmol/1
Tris +/- 1 mol/1
Cprot.: 150 MÇf/®3· Por cada impulso
Tempo de permanência: 12 h
Concentração final: 1500 gg/ml
Recipiente com mistura de dissulfuretos a O°C Reacção em atmosfera de azoto resultado deste ensaio é representado na tabela 4 seguinte:
(segue Tabela 4)
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X —13 —
Tabela 4
Tris (mol/1) cprot. (Mg/ml) Actividade (+ fibrina) (U/ml) Actividade/Cpro-(- . (U/mg)
0 150 3000 20000
450 —
750 11622 15496
1050 14430 13743
1350 17507 12968
1 150 4353 29020
450 10978 24395
750 17319 23092
1050 22600 21524
1350 27920 20681
No impulso sem Tris houve uma nítida turvação a partir de uma concentração de proteína de 700 Mg/ml, enquanto que o impulso com uma adição de 1 mol/1 de Tris ficou completamente claro mesmo com uma concentração de proteína de 1,5 mg/ml. Pela adição de 1 mol/1 de Tris foi aumentado o rendimento final em cerca de 30%.
Exemplo 5
Naturação por impulsos: Aproximação a um processo contínuo (+/- 1 mol/1 de Tris)
Material de partida:
Corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, produzidos como se descreve no exemplo 1.
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1197/00/ΡΤ ^asseSSE?
-14Renaturação: arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8,5
GSH 0,7 mmol/1 EDTA 1 mmol/1 Tris +/- 1 mol/1
Impulsos: Tempos de permanência: 30 minutos Cprot. “ aumento por impulso: (A) 9,3 jxg/ml?
(B) 31 ^g/ml
Duração de adição por bombagem: 2 minutos Concentração final: 3000 Mg/ml Recipiente com mistura de dissulfuretos a O°C, Reacção em atmosfera de N2
O resultado deste ensaio é apresentado na tabela 5:
Tabela 5A:
1 mol/1 de Tris, Cpj-θ^, = 9,3 MU/ml por cada 30 minutos
Tempo (h) cprot. (Mg/ml) Actividade (+ fibrina) (U/ml) Actividade/Cprot (U/mg)
16 245 10223 41726
23 527 23295 44203
42 800 30405 38006
48 904 43339 47941
69 1299 43964 33844
73 1375 49505 36003
137 2580 107499 41666
146 2759 104009 37698
Sem Tris, C.
prot.
=9,3 Mg/ml por cada 30 minutos
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-15Tempo cprot. Actividade (+ fibrina) (h) (Mg/ml) (U/ml)
Actividade/Cprot .
(U/mg)
8 114 2932 25719
24 338 5635 16671
40 563 14723 26150
56 788 24035 30501
72 1013 27909 27550
88 1238 33802 27303
104 1463 37734 25792
120 1688 46420 27500
176 2485 59195 23821
192 2710 62098 22914
208 2935 61764 21044
224 3160 65896 20853
Tabela 5B:
mol/1 de Tris, Cprot> = 31 Mg/ml por cada 30 minutos
Tempo (h) cprot. (Mg/ml) Actividade (+ fibrina) (U/ml) Actividade/Cprot (U/mg)
1 94 1590 16914
3 218 6265 28738
18 1094 33897 30984
42 2563 - -
49 3031 53033 17496
65 3696 72056 19495
Sem Tris, C.
prot.
gg/ml por cada 30 minutos
184
1197/00/ΡΤ
Actividade/Cpro .
-16Tempo cprot. Actividade (+ fibrina) (h) (Mg/ml) (U/ml) (U/mg)
1 94 107 -
3 219 4587 20945
18 1094 20257 18516
42 2563 23580 9200
49 3031 33482 11046
65 3696 36126 9774
De uma aproximação a um processo contínuo (aumento da frequência de adição dos impulsos de naturação individuais sendo as restantes condições idênticas) resultam taxas de naturação iguais em comparação com a experiência de impulsos. Pela adição ao tampão de renaturação de 1 mol/1 de Tris o rendimento final é aumentado, de modo geral, em cerca de 20% a 100%.
Exemplo 6
Renaturação de K2P reduzido em dependência da concentração de Tris
Material de partida: Corpos de inclusão (IB) da muteína de tPA, K2P, produzidos como se descreve no exemplo 1.
Solubilização: Gdn/HCl 6 mol/1, pH 8,3 Tris 0,1 mol/1 EDTA 1 mmol/1 DTE 0,1 mol/1
Cprot. = 7'5 mU/ml minutos Ultraturrax
Incubação: 1 h à temperatura ambiente
Paragem: pH 3,0 através de HC1
Diálise:
Gdn/HCl 6 mol/1, pH 3,0 EDTA 1 mmol/1
184
1197/00/ΡΤ /7
-17Renaturação arginina/HCl 0,7 mol/1, pH 8,5
EDTA 1 mmol/1
GSH 3 mmol/1
GSSG (glutationa oxidada) 0,3 mmol/1 Tris: 0; 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8 e
2,1 mol/1 cprot. = 150 Mg/m!
resultado deste ensaio é apresentado na tabela 6
Tabela 6
Tris Actividade
(mol/1) (U/ml)
0 1339
0,3 1478
0,6 1591
0,9 1725
1,2 1766
1/5 1766
1,8 1725
2,1 1717
J
Também na renaturação directa da proteína reduzida, o rendimento de renaturação aumenta em 30% pela adição de > 1 mol/1 de Tris.
Exemplo 7
Renaturação de G-CSF
Material de partida:
Corpos de inclusão (IB) de G-CSF, produzidos de acordo com
PCT/EP91/00192 (Exemplo 3)
184
1197/00/ΡΤ
-18Solubilização: Gdn/HCl 6 mol/1, pH 8
Tris 0,1 mol/1
EDTA 1 mmol/1
DTE 0,1 mol/1 cprot. = 10 m9/ral 2 minutos Ultraturrax
Incubação: 2 h à temperatura ambiente com agitação
Paragem: pH 3 através de HCl
Diálise:
J
Gdn/HCl 6 mol/1, pH 2,5
EDTA 3 mmol/1
4°C, até a remoção total do agente redutor
Concentração de proteína após a diálise:
8,5 mg/ml
Renaturação:
A)
B)
Ensaio I:
arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8
EDTA 1 mmol/1
GSH 0,5 mmol/1
GSSG 5 mmol/1
Tris 0,1 mol/1
Tris 1 mol/1
Impulso: C = 50 ^g/ml em 30 minutos t = 1 h
Concentração final de proteína = 1 mg/ml
Ensaio II:
arginina/HCl 0,6 mol/1, pH 8 EDTA 1 mmol/1 GSH 0,5 mmol/1 GSSG 5 mmol/1
A) Tris 0,1 mol/1
B) Tris 1 mol/1
Impulso: C = 50 gg/ml em 30 minutos t = 1 h
Concentração de proteína = 0,6 mg/ml
184
1197/00/ΡΤ
./
Após a renaturação realiza-se uma centrifugação a 16000 rpm, durante 30 minutos. Seguidamente, é feita uma diálise contra Tris 20 mmol/1, pH 8 e EDTA 1 mmol/1.
O resultado deste ensaio é apresentado na tabela 7.
Tabela 7
Ensaio % renaturação após diálise em tampão Tris pH 8,0
Ensaio I
A: Tris 0,1 mol/1 10
B: Tris 1 mol/1 63
Ensaio II
A: Tris 0,1 mol/1 20
B: Tris 1 mol/1 50
A determinação da actividade de G-CSF efectuou-se por meio de um teste de proliferação (inserção de 3H-timidina) com uma linha celular leucémica murina dependente de G-CSF (NFS60) como se descreve em Mossmann, T. (1985) J. Immunol.Methods 65, 66-73 e Holmes, K.L.; Plaszynski, E.; Federickson, T.T.; Morse, H.C. III & Ihle, J. (1985) PNAS USA 82, 6687-6691.
Resultados análogos foram obtidos com G-CSF produzido de acordo com a EP 91 107 429.2 e muteínas de G-CSF.
Exemplo 8
Renaturação de fragmentos Fab de anticorpos
Denaturação; Gdn/HCl 5 mol/1, pH 8,5 Tris 0,1 mol/1 EDTA 2 mmol/1 DTE 0,3 mol/1 &
184
1197/00/ΡΤ
-20,1 /
Renaturação:
cprot. = 5 m9/ml
Incubação: 2 -3 h à temperatura ambiente
Tampão Tris, pH 7,5 (Tris: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75 e 1 mol/1)
EDTA 2 mmol/1 GSSG 6 mmol/1 'prot.
= 50 Mg/ml
Incubação: 80 h a 10C
Teste de actividade: ELISA com CK biotinada de acordo com a DE-A 38 35 350.4 (exemplo 8.2).
O resultado é apresentado na tabela 8.
Tabela 8
Tris (mol/1)
Renaturação
0,05 13
0,1 18
0,2 22
0,3 27
0,5 35
0,75 36
1 37
O rendimento da renaturação dos Fab de anticorpos aumenta linearmente até uma concentração de Tris de 0,5 mol/1; um aumento adicional da concentração de Tris aumenta o rendimento apenas de modo insignificante.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 - Processo para a reactivação de proteína desnaturada, caracterizado por se incubar a proteína com uma solução de trisbase e/ou um sal de Tris a uma concentração de, pelo menos, 400 mmol/1 e a um valor de pH ao qual a proteína a tratar pode assumir a sua conformação nativa.
  2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o valor de pH da solução de incubação ser ajustado com uma substância tampão diferente de Tris.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar o Tris também para o ajuste do valor de pH.
  4. 4 - Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se utilizar uma solução de Tris a 0,4 - 2 mol/1.
  5. 5 - Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se adicionar à solução de incubação 0,2 a 1,0 mol/1 de arginina.
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se tratar tPA recombinante ou uma muteína de tPA.
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se tratar uma muteína de tPA não glicosilada da composição de domínios K2P.
  8. 8 - Processo de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado por se adicionar a proteína desnaturada de modo contínuo ou em cargas à solução de renaturação.
  9. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se realizar uma técnica de renaturação por impulsos, num reactor de renaturação.
    73 184
    1197/00/ΡΤ
    -2210 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se realizar a renaturação num tampão contendo arginina com uma concentração de Tris de cerca de 1 mol/1 e por se aumentar, em cada impulso, a concentração de proteína em cerca de 200 /zg.
  10. 11 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 ou 8 a 10, caracterizado por se tratar G-CSF recombinante.
  11. 12 - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5 ou 8a 10, caracterizado por se tratarem anticorpos ou os seus fragmentos.
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