PT98326B - Processos para a preparacao de antigenios de superficie celular, cd27, cd53 e tlisa, e de composicoes farmaceuticas compreendendo os referidos antigenios - Google Patents

Description

Alguns métodos normalmente usados estão descritos por exemplo em Maniatis et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Uma vez construída uma biblioteca de cDNA genómico, é necessário isolar a partir de milhares de células hospedeiras a célula contendo o gene humano particular com interesse. Têm sido utilizados muitos métodos diferentes de isolamento de genes alvo a partir de bibliotecas de cDNA com sucesso variável. Estes incluem por exemplo a utilização de sondas de ácido nucleico, as quais são fragmentos de mRNA marcado tendo sequências de ácido nucleico complementares da sequência de DNA do gene alvo. Quando este método se aplica a clones de cDNA de mRNAs abundantes em hospedeiros bacterianos transformados, colónias que hibridam fortemente com a sonda provavelmente contêm as sequências de DNA alvo. A identidade do clone pode então ser provada por exemplo por hibridação/selecção in situ (Goldberg et al.. Methods Enzvmol.. 68:206 (1979)) tradução parada por híbridos (Paterson et al.f Proceedinas of the National Academv of Sciences. 74:4370 (1977)), ou sequenciação directa de DNA (Maxam e Gilbert, Proceedinqs of the Natural Academv of Sciences. 74:560 (1977); Maat e Smith, Nucleic Acids Res.. 5:4537 (1978)).

No entanto tais métodos têm desvantagens quando o objectivo é clonar mRNAs de relativamente pouca abundância a partir de bibliotecas de cDNA. Por exemplo, usando hibridação directa de colónias in situ. é muito díficil detectar clones contendo cDNA complementar de espécies de mRNA presentes na população da biblioteca inicial numa quantidade inferior a 1/200. Como resultado disto foram desenvolvidos vários métodos para enriquecimento de mRNA na população total (e.g. fraccionamento por tamanho, utilização de oligodesoxinucleótidos sintéticos, hibridação diferencial ou imunopurificação) e são muitas vezes 4

usados quando são clonados mRNAs pouco abundantes. Tais métodos estão descritos, por exemplo, em Maniatis et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual, supra.

Muitas proteínas eucarióticas funcionais existem inicialmente na forma de moléculas precursoras que contêm sequências líder ou sinal nos seus extremos N-terminais. Estas sequências líder ligam-se à membrana celular e conduzem a restante proteína através da bicamada lípidica, após o que a sequência sinal é clivada a partir da proteína por uma enzima sinal-pepti-dase. A proteína funciona assim apenas apôs secreção das células (por exemplo, insulina, albumina sérica, anticorpos e enzimas do tracto digestivo) ou após as proteínas terem sido ancoradas à superfície externa de uma membrana celular (por exemplo, anti-génios de histocompatibilidade).

Os antigénios de superfície celular característicos dos linfócitos T de mamífero são outros exemplos de proteínas que se ancoram à superfície celular. Nos mamíferos, certas células derivadas de medula óssea maturam para dar linfócitos, os quais estão presentes nos orgãos linfóides, incluindo o timo, baço, nódulos linfáticos e agregados linfóides e também circulam activamente pelo sangue e nos sistemas linfáticos. As células de linfócitos maduros podem ser divididas em duas populações: linfócitos dependentes do timo (T) e linfócitos independentes do timo (B). Os linfócitos T migram para o interior do timo onde sofrem proliferação e diferenciação. Durante o seu processo de diferenciação, eles expressam aloantigénios característicos da membrana celular, incluindo Thy-1, TLA, gv-1, Ly-1, Ly-2, Ly-3 e Ly-5. À medida que sofrem maturação os linfócitos T perdem os antigénios TLA e alguns dos antigénios Thy-1 e ganham antigénios de histocompatibilidade, adquirindo a conformação de membrana típica dos linfócitos T circulantes. Isto está descrito, por 5

exemplo, por Mota, "Activity of immune Cells" em Bier et al.. eds. Fundamentais of Immunoloav. 2d Ed., Springer-Verlag, Berlin, pp. 35-62 (1986).

Os linfócitos T estão envolvidos indirectamente na formação de anticorpos e as suas actividades necessitaram pois de análise complexa da função celular, para além de simples medição do título de anticorpos. Em parte devido a isto, a sua importância no desenvolvimento de competência imunológica não foi reconhecida até há relativamente pouco tempo. Os linfócitos T maduros sintetizam e expressam um padrão único dos antigénios glicopro-teína de superfície que servem como marcas para a identificação de diferentes subpopulações de linfócitos T, incluindo células T auxiliares, células T supressoras e células T citotóxicas. Cada uma destas subpopulações desempenha um papel muito importante na regulação do sistema imune. (Mota, supra).

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Nos humanos, a heterogeneidade funcional e fenotípica dos linfócitos T está bem aceite. Conhecem-se duas duas subpopulações principais: células T efectoras medeiam a imunidade celular; e células T reguladoras contendo linfócitos T auxiliares e supressores. Estas duas subpopulações foram definidas com heteroanti-soro, autoanticorpos e anticorpos monoclonais dirigidos contra antigénios de superfície celular. Por exemplo, no inicio do seu desenvolvimento as células linfóides humanas no timo expressam um antigénio designado Til que reage fortemente com um anticorpo monoclonal designado Conjunto de Diferenciação 2 ("Cluster of Differentiation 2 (CD2) e reage ligeiramente com o anticorpo monoclonall CD5 contra o antigénio de superfície celular Tl. Durante a maturação, estas células perdem Til (CD2) e adquirem três antigénios novos definidos por anticorpos monoclonais CD4, CD8 e CDl. Com mais maturação, os timócitos cessam de expressar os antigénios de superfície celular reactivos com o 6 Λ !

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anticorpo monoclonal CD1, expressam o antigénio T3 reactivo com o anticorpo monoclonal CD3 e depois segregam-se em duas subpopula-ções que expressam o antigénio T4 (CD4) ou T8 (CD8). A competência imunológica é adquirida nesta fase, mas não está totalmente desenvolvida até os linfócitos tímicos migrarem para fora do timo. (Mota, supra.) Pelo contrário expressam os antigénios Tl (CD5) e T3 (CD3). 0 antigénio T4 (CD4) está presente em aproxima-damente 55-65% dos linfócitos T periféricos, enquanto o antigénio T8 (CD8) é expresso em 20-30%. Estas duas subpopulações correspondem a células T auxiliares e supressoras e citotóxicas, respectivamente.

Para além de proporcionar um meio conveniente de distinguir subpopulações de linfócitos T, estes antigénios de superfície celular são importantes para a activação de células T maduras e função efectora. A activação de células T envolve uma série complexa de interacções na superfície celular entre a célula Te a célula alvo ou célula estimuladora para além da ligação ao seu antigénio específico.

Por exemplo, CD2, o receptor dos eritrócitos para células T humanas, permite que timócitos e linfócitos T adiram às células alvo (e.g., eritrócitos) e ao epitélio tímico. Isto ocorre via um ligando molecular específico para CD2, designado LFA-3, em humanos, que é um antigénio de superfície largamente distribuído. Este fenómeno foi empregue para detectar, testar e purificar células humanas produtoras de anticorpos contra eritrócitos de carneiro e servem como base para o teste das rosetas E, pela primeira vez descrito por Zaalberg, Nature 202: 1231 (1964). Também se encontrou que as interacções CD2/LFA-3 medeiam a conjugação citolítica com o alvo (Shaw et al.. Nature 323:262--264 (1986) e a reacção mista de linfócitos (Martin et al.. J.

Immunol. 131: 180-185 (1983). Os anticorpos monoclonais anti-CD2 podem activar directamente os linfócitos T periféricos através de uma via independente de antigénio (Meuer et al.. Cell 36:897-906 (1984)), indicando um papel imuno-regulador mais largo para CD2. O reconhecimento de que os linfócitos T são os principais efectores da imunidade celular e que estão também envolvidos como células auxiliares ou supressoras na modulação da resposta imune resultou numa contribuição significativa para a crescente aplicação prática da imunologia clínica à medicina. O âmbito deste pedido inclui defesa contra infecções, prevenção de doenças por imunização, transplante de orgãos, bancos de sangue e tratamento de deficiências do sistema imune e uma variedade de perturbações que são mediadas por mecanismos imunológicos. Ainda, as técnicas imunológicas frequentemente são usadas em laboratório clínico, como seja na medição de hormonas e drogas. A imunologia clínica está descrita, por exemplo, em Weir, ed., Handbook of experimental Immunoloqy in Four Volumes: Volume 4: Applications of Immunoloaical Methods in Biomedical Sciences. 4a ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986); Boguslaski et al.. eds., Clinicai Immunochemistrv: Principies of Methods and Applications. Little, Brown Co., Boston (1984); Holborow et al♦. eds., Immunoloqy in Medicine: A Comprehensive Guide to Clinicai

Immunoloqy. 2d Ed., Grune & Stratton, London (1983); e Petersdorf et al.. eds., Harrisoms Principies of Internai Medicine. 10a ed., McGraw-Hill, New York, pp. 344-391 (1983). Claramente será importante uma comparação mais exaustiva das proteínas que medeiam o sistema imune para imunologia clínica. A utilização de bibliotecas de expressão de mamíferos para isolar cDNAs codificadores de proteínas de memífero tais como as descritas atrás oferecem várias vantagens. Por exemplo, a proteína expressa numa célula hospedeira de mamífero deverá ser funcional e deverá sofrer qualquer modificação pós-tradução normal. Uma proteína normalmente transportada através do sistema de membranas intracelulares para a superfície celular deverá sofrer o processo completo de transporte. Um sistema de expressão de mamífero também permitirá o estudo de mecanismos de transporte intracelular e do mecanismo que insere e ancora as proteínas de superfície celular às membranas.

Uma célula hospedeira de mamífero, designada uma célula "COS", é formada por infecção de células de reim de macaco com um vector virai mutante, designado vírus símio 40 (SV40), o qual tem genes precoces e tardios funcionais, mas não possui uma origem funcional de replicação. Nas células COS, qualquer DNA estranho clonado num vector contendo a origem de replicação de SV40 que se replica devido ao antigénio T de SV40 estar presente em células COS. 0 DNA estranho replicará transitoriamente, independentemente do DNA celular.

Com excepção de alguns cDNAs recentes de linfoquinas isolados por expressão em células COS (Wong, G.G., et al. Science 228: 810-815 (1985); Lee, F. et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:2061-2065 (1986); Yokota, T., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:5894-5898 (1986); Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)), no entanto, poucos cDNAs em geral foram isolados a partir de bibliotecas de expressão de mamífero. Parece haver duas razões prinicipais para isto: primeiro, a tecnologia existente (Okayama, H. et al.. Mol. Cell. Biol. 2:161-170 (1982)) para construção de bibliotecas grandes de plasmídeos é difícil de manipular e o tamanho da biblioteca raramente se aproxima às acessíveis pelas técnicas de clonagem em fagos. (Huynh, T. et al.. Em:DNA Cloninq Vol. I, A Praticai Approach. Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78). Segundo, os vectores existentes estão, com excepção de um (Wong, G.G., et al.. Science 228:810-815 (1985)), mal adaptados a níveis altos de expressão, particularmente em células COS. Os sucessos descritos com cDNAs de linfoquina não implicam um êxito geral dos métodos usados, uma vez gue estes cDNAs são particularmente fáceis de isolar a partir de bibliotecas de expressão. Os bioensaios com linfoquinas são muito sensíveis ((Wong, G.C., et al.. Science 228:810-815 (1985); Lee, F. et al. Proceedinas of the National Academy of Sciences. USA 83:2061-2065 (1986); (1986): Yokota, T. et al♦. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:5894-5898 (1986); Yang, Y. et al.. Cell 47:3-10 (1986)) e os mRNAs são tipicamente abundantes e curtos (Wong, G.C. et al.. Science 228:810-815 (1985); Lee, F., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA. 83:2061-2065 (1986); Yokota, T., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83: 5894-5898 (1986); Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)).

Assim, a expressão em hospedeiros mamíferos anterior-mente essencialmente empregue como um meio de verificação da identidade da proteína codificada por um gene isolado por métodos de clonagem mais tradicionais. Por exemplo, Stuve et al.. J. Virol. S1S2X.* 327-335 (1987), clonaram o gene da glicoproteína gB2 de herpes simplex tipo II estirpe 333 por hibridação de placas dos vectores fágicos recombinantes baseados em M13 usados para transformar E. coli JM101 competentes. A identidade da proteína codificada pelo clone assim isolado foi verificada por transfec-ção de células de mamífero COS e de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão foi demonstrada por imunofluorescência e radio-imunoprecipitação.

Oshima et al. usaram hibridação em placas para fazer o rastreio de uma biblioteca de cDNA no fago lambda gtll relativamente ao gene codificador da beta-glucuronidase de placenta humana. Oshima et al.f Proceedinqs of the National Academv of

Sciences, USA 84:685-689 (1987). A identidade dos clones de cDNA isolados foi verificada por imunoprecipitação da proteína expressa por células COS-7 transfectadas com inserções clonadas usando o promotor tardio do SV40. A expressão transitória em células de mamífero foi empregue como um meio de confirmar a identidade dos genes ante-riormente isolados por outros métodos de rastreio. Gerald et al.. Journal of General viroloqy 67:2695-2703 (1986). Mackenzie, Journal of Biolocrical Chemistry 261:14112-14117 (1986); Seif et al. . Gene 43.:1111-1121 (1986); Orkin et al. . Molecular and Cellular Bioloqy 5(4):762-767 (1985). Estes métodos muitas vezes são ineficazes e demorados e requerem vários ciclos de rastreio para identificar clones de tamanho completo ou sobreponíveis. Os métodos de rastreio anteriores baseados na expressão de proteínas de fusão são ineficazes e requerem grandes quantidades de anticorpos monoclonais. Tais desvantagens são acentuadas pela utilização de vectores de expressão ineficazes os quais resultam em níveis de proteína expressa que são inadequados para permitir selecção eficaz.

Sumário do invento 0 presente invento está relacionado com um novo método para a clonagem de cDNA codificador de antigénios da superfície celular, com um método para a construção de bibliotecas de cDNA com vectores de expressão altamente eficazes particularmente adequados à expressão de níveis elevados de expressão em células eucarióticas hospedeiras e com as sequências de nucleótidos isoladas e seus produtos codificados. A técnica de clonagem altamente eficaz do presente invento baseia-se na expressão transitória de antigénio em 11

células eucarióticas e selecção física de células que expressam o antigénio por adesão das células a um substrato revestido com anticorpo, como seja uma placa de cultura. Os métodos do presente invento são úteis para o isolamento e clonagem molecular de qualquer proteína que possa ser expressa e transportada para a membrana da superfície celular de uma célula eucariótica.

0 método para a clonagem de cDNA codificador de um antigénio de superfície celular do presente invento compreende a preparação de uma biblioteca de cDNA; introdução desta biblioteca de cDNA num mamífero eucariôtico de preferência células em cultura de tecidos; a cultura destas células em condições que permitem a expressão do antigénio de superfície celular; exposição das células a um primeiro anticorpo ou anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície celular, permitindo assim a formação de um complexo antigénio de superfície celular-primeiro anticorpo; exposição subsequente das células a um substrato revestido com um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo, causando assim que as células que expressam o antigénio de superfície celular adiram ao substrato através da formação de um complexo antigénio de superfície celular-primeiro anticorpo-segundo anticorpo; e separação das células aderentes e não aderentes.

Por meio do método de clonagem do presente invento, foi conseguido o isolamento e clonagem molecular de genes codificadores de antigénios de superfície tais como: o CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLÍSa e Leu8. As sequências de nucleótidos dos genes clonados pelo método do presente invento foram determinadas e identificadas as sequências de aminoácidos das proteínas codificadas. Um gene clonado, como % 12

seja um codificador de CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CO26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 é também um objec-tivo do presente invento.

Uma vez clonado o gene codificador de um antigénio de acordo com o método do presente invento, aquele gene pode ser expresso numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica para produzir a proteína codificada ou parte dela numa forma substancialmente pura numa forma que não existe na natureza. Um outro aspecto do presente invento está relacionado com antigénios de superfície celular substancialmente puro, particularmente: antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 e seus análogos funcionais e equivalentes. As sequências de aminoácidos primárias dos antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 foram determinadas, o invento também está pois relacionado com as sequências de aminoácidos daqueles antigénios e seus equivalentes funcionais e com as sequências de nucleótidos codificadoras daqueles antigénios.

Este invento também está relacionado com vectores de expressão que permitem a obtenção de bibliotecas de expressão de mamífero muito grandes e dão grandes quantidades de proteína em células hospedeiras de mamífero, resultando numa selecção eficaz. Numa realização particular deste invento, um vector de expressão de cDNA compreende um gene de tRNA supressor; uma origem de SV40; uma unidade de transcrição sintética, compreendendo um promotor 13 J*

quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de AD169 do citomegalovírus humano fundidas com sequências da LTR -60 a +80 do HIV, inseridas entre o gene de tRNA supressor e a origem do SV40; uma unidade de transcrição sintética, compreendendo um promotro quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de AD169 de citomegalovírus humano fundida com as sequências LTR -60 a +80 do HIV, inseridas entre o gene do tRNA supressor e a origem do SV40; um poliadaptador compreendendo dois sítios BstXI separados por uma sequência de DNA substituível e delimitada por sítios Xbal; e sinais de "splicing" do antigénio t pequeno e de poliadenilação da região precoce do SV40.

Um outro aspecto do presente invento compreende uma unidade de transcrição sintética para usar num vector de expressão de cDNA, compreendendo um promotor quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imedatas de AD162 de citomegalovírus humano fundidas com sequências LTR -60 a +80 do HIV. 0 tamanho pequeno e o arranjo particular das sequências do vector de expressão de cDNA do presente invento permite uma replicação altamente eficaz em células de mamífero em cultura de tecidos, tais como células COS. Ainda, este vector emprega um poliadaptador contendo dois sítios BstXI invertidos separados por um pequeno segmento de DNA substituível, o que permite a utilização de uma estratégia muito eficaz de inserção de cDNA baseada em oligonucleótidos.

Num outro aspecto, o presente invento compreende um vector tendo dois sítios BstI idênticos numa orientação invertida um em relação ao outro, sítios BstXI esses que estão separados por um pequeno fragmento de DNA substituível. Um outro aspecto do invento é um poliadaptador como descrito atrás.

Um outro aspecto do invento está relacionado com um método de inserção de cDNA baseado em oligonucleótidos, caracte-rizado pela ligação de oligonucleótidos de DNA sintético ao segmento de cDNA pretendido a ser inserido num vector, os oligo-nucleõtidos de DNA sintético dando as mesmas sequências terminais do fragmento pequeno de DNA substituível do poliadaptador do invento e inserção do segmento de cDNA resultante mais sequências terminais de oligonucleótidos sintéticos no poliadaptador do vector, do qual foi removido o fragmento pequeno de DNA substituível.

Na preparação de bibliotecas de cDNA de acordo com o presente invento, descobriu-se que muitos tumores são altamente infiltrados por macrófagos e linfócitos e podem assim ser empregues como uma fonte de produtos de transcrição de macrófagos ou de linfócitos com bom efeito em vez das linhas de células tumo-rais normalmente usadas. Num outro aspecto, então o presente invento está relacionado com a utilização de células tumorais, particularmente células tumorais humanas, para preparar bibblio-tecas de cDNA para usar de acordo com os métodos do presente invento.

Uma outra vantagem do poderoso sistema de selecção do presente invento é que a inserção direccionada do cDNA não é necessária. O método do presente invento resulta em eficiências de construção de bibliotecas que estão a par com as descritas para os vectores fágicos tais como lambda gtlO e lambda gtll, com a vantagem adicional de os clones gerados de acordo com os métodos do presente invento serem mais fáceis de manipular. A técnica de imuno-selecção do presente invento permite a utilização eficiente de anticorpos, os quais podem ser monno-clonais ou policlonais, em quantidades absolutas relativamente pequenas. 0 método do presente invento também é bastante rápido. De um modo geral, três ou menos ciclos de imuno-selecção e pescagem são necessários para isolar um clone de cDNA alvo. Assim, o método do presente invento também resulta na utilização eficaz de trabalho e materiais quando da clonagem dos genes codificadores de antigénios de superfície celular. Como descrito atrás, este método tem sido empregue para clonar com êxito genes codificadores de antigénios de superfície celular associados a linfócitos T de mamífero (e.g. antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8).

Os genes e proteínas purificados do presente invento são úteis para aplicações em imunodiagnóstico e imunoterapia, incluindo o diagnóstico e tratamento de infecções, doenças e peturbações mediadas pelo sistema imune em animais, incluindo humanos. Eles podem também ser usados para identificar, isolar e purificar outros anticorpos e antigénios. Tais utilizações em diagnóstico e terapia compreendem ainda um outro aspecto do presente invento. Ainda, as proteínas substancialmente puras do presente invento podem ser preparadas como medicamentos ou composições farmacêuticas para administração terapêutica. 0 presente invento está ainda relacionado com tais medicamentos e composições.

Breve Descrição dos Desenhos

Fiaura 1. Sequência de nucleótidos do vector de expressão ΡΪΗ3

Os nucleótidos 1-589 derivam da origem do pMBl (pBR322 ori); os nucleótidos 598-799 derivam do gene sintético do tRNA supressor da tirosina (gene supF); os nucleótidos 800-947 derivam de um vestígio do fragmento LTR de ASV (PvuII a Miul); os nucleótidos 948-1500 derivam do potenciador de AD169 de citomegalovírus humano; os nucleótidos 1501-1650 derivam da TATAde HIV e de elementos que respondem a tat; os nucleótidos 1651-1716 derivam do poliadaptador piLNAXN (HindIII a Xba); nucleótidos 1717-2569 derivam de pSV para "splicing" e sinais de poliadenilação; os nucleótidos 2570-2917 derivam da origem de replicação do SV40 (PvuII a HindIII); e os nucleótidos 2918-2922 derivam de piVX, o que resta do sítio RI do poliadaptador.

Figura 2. Sequência de nucleótidos da inserção de cDNA de CD2 A numeração dos nucleótidos é dada entre parêntesis à direita, a numeração de aminoácidos à esquerda. Estão apresentadas a localizações dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO), assim como a sequência transmembranar prevista. A sequência de aminoácidos estánumerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora.

Figura 3. Mapa de restrição do vector de expressão CDM8 O vector CDM8 inclui uma versão com deleções de uma região precoce mutante do vírus polioma seleccionado relativamente a expressão de alta eficácia em células de murganho e de macaco. Essencialmente toda a região do promotor da imunodefici-ência humana foi substituída com as sequências cognatas do promotor precoce imediato do citomegalovírus e por inclusão de um promotor do bacteiofago T7 entre o promotor eucariótico e o sítio de inserção de cDNA. As setas indicam a direcção da transcrição.

Figura 4. Sequência de nucleótidos e correspondente sequência de aminoácidos do antigénio LFA-3 Células WOP transfectadas com um clone codificador do antigénio LFA-3 foram detectadas por imunofluorescência indirec-ta, amplificadas e seguenciadas. (A) mostra a inserção de S74 pares de bses contendo uma grelha de leitura aberta de 237 resíduos começando um codão metionina e terminando numa série de resíduos hidrófobos. As regiões hidrófobas e hidrófilas dentro desta grelha de leitura aberta estão apresentados em (B).

Figura 6. Sequência de nucleótidos do vector PÍH3M

Existem 7 segmentos. Os resíduos 1-587 são da origem de replicação do pBR322, 588-1182 da origem do M13, 1183-1384 do gene supF, 1385-2238 são do promotor quimérico de citomegaloví-rus/vírus da imunodeficiência humano, 2239-2647 são do fragmento substituível, 2648-3547 do plasmídeo pSV2 (sinais de "splicing" e de poliadenilação) e 3548-3900 da origem do vírus SV40.

Figura 7. Sequência de nucleótidos do cDNA de CD28

Numeração de nucleótidos está dada entre parêntesis à direita, numeração de aminoácidos, centro e esquerda. Estão apresentados a localização dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO) assim como a sequência trans-membranar (TM) prevista. A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora.

Figura 8.

Sequência de nucleótidos da inserção de cDNA de CD7 A numeração de nucleótidos é dada entre parêntesis à direita. Os sítios dador e aceitador de ,,splicing,, indicados por (/). Está apresentada a localização dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO), o potencial sítio de esterificação de ácidos gordos está assinalado por (*) e o domínio transmembranar específico (TM) está sublinhado. As sequências de nucleótidos potencialmente envolvidas na formação de estruturas em gancho estão assinalados por (.). O presumível sinal de poliadenilação está sublinhado.

Figura 9. Sequência de nucleótidos do cDNA de CDw32 0 número dos nucleótidos é dado entre parêntesis à direita, a numeração de aminoácidos no centro e à esquerda. As localizações dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO) estão aresentadas, assim como a sequência transmembranar (TM). A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora. Os resíduos císteina estão assinalados com asteriscos.

Figura 10. Sequência do cDNA CD20.4

A. Os sítios de potencial glicosilação ligada em N estão assinalados pelo símbolo -CHO-; as regiões hidrófobas estão assinaladas. O sítio da cauda poli(A)+ no clone CD20.6 está representado por um asterisco. B. O perfil de hidrofobicidade da sequência em A.

Fiaura 11.

Sequência de ICAM-1

Sequência completa de nucleótidos da inserção de cDNA de ICAM-1 e sequência proteica prevista. Numeração de nucleótidos está à esquerda, numeração de aminoácidos no centro. 0 motivo RGE na posição 128 está sublinhado, os potenciais sítios de glicosi-lação ligados em N estão indicados por -CHO- e o domínio trans-membranar por -TM-. A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado do peptídeo sinal. A sequenciação foi por terminação de cadeias didesoxi (Sanger, F., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)), usando uma combinação de subclones e oligonucleótidos específicos.

Figura 12. Figura 13. Figura 15. Figura 16. Figura 17.

Sequência de nucleótidos de CD19 Sequência de nucleótidos de CD20 Sequência de nucleótidos de CDw32a Sequência de nucleótidos de CDw32b Sequência de nucleótidos de CD40.

Descricão Detalhada do Invento

Este invento está relacionado com um novo método para a clonagem de cDNA codificador de um antigénio de superfície celular e com um método para a construção de bibliotecas de cDNA. Ele está também relacionado com vectores particulares de expressão de cDNA e seus componente, sequências de nucleótidos ou genes isolados pelo método, antigénios de superfície celular substancialmente puros codificados pelos segmentos de cDNA e métodos de 20

utilização das sequências de nucleótidos isoladas e produtos codificados.

Na descrição que segue, será feita referência a várias metodologias conhecidas dos familiarizados com a genética de recombinantes. Publicações e outros materiais que descrevem tais metodologias a que aqui é feita referência são aqui incluídos como referência na sua totalidade. Trabalhos cuja referência é muito usada e que descrevem os princípios gerais da tecnologia de DNA recombinante incluem Darnell, J.E. et al.. Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc., editor, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II. John Wiley & Sons, editor, New York, N-Y. (1985); Old, R.W. et al.. Principies of Gene Maniou-lation: An Introduction to Genetic Enaineerina. 2a edição, University of Califórnia Press, Berkeley, CA (1981); e Maniatis, T. et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, NY (1982).

Por "clonagem" pretende-se significar a utilização de técnicas de recombinação in vitro para inserir um gene particular ou outra sequência de DNA numa molécula vector. Para clonar com êxito um gene pretendido é necessário empregar métodos para obter fragmentos de DNA, para ligar os fragmentos a moléculas de vector, para introdução da molécula de DNA composta numa célula hospedeira em que se possa replicar e para selecção do clone tendo o gene alvo de entre as células hospedeiras recipientes.

Por ,,cDNA" pretende-se significar DNA complementar ou cópia produzido a partir de um molde de RNA pela acção de uma DNA-polimerase RNA-dependente (transcriptase reversa). Assim um "clone de cDNA"significa uma sequência de DNA de cadeia dupla complementar de uma molécula de RNA com interesse, transportada num veículo de clonagem. 21

Por “biblioteca de cDNA" pretende-se significar uma colecção de moléculas de DNA recombinante contendo inserções de cDNA que em conjunto compreendem todo o genoma de um organismo. Tal biblioteca de cDNA pode ser preparada por métodos reconhecidos dscritos por exemplo em Maniatis et al.. Molecular Cloninq: A _ Laboratorv Manual, supra. De um modo geral o RNA é primeiro isolado a partir das células de um organismo em cujo genoma se pretende clonar um gene particular. São preferidas para fins do presente invento linhas celulares de mamífero e particularmente humanas. São preferidas a linha de células tumorais humanas v ^ HPB-ALL e a linha celular linfoblastóide humana JY. Como alterna tiva, o RNA pode ser isolado a partir de uma célula tumoral, derivada de um tumor animal e de preferência de um tumor humano. Assim, pode ser preparada uma biblioteca por exemplo a partir de um tumor adrenal humano mas pode ser usado qualquer tumor.

0 método de clonagem com imunoselecção do presente invento compreende a preparação de uma biblioteca de cDNA por extracção de RNA total incuindo um gene particular derivado de uma célula, síntese de uma série de fragmentos de cDNA complementares de cadeia dupla a partir do RNA e introdução destes fragmentos de cDNA em células de mamífero em cultura de tecidos. As células de mamífero são mantidas em condições que permitem a expressão da proteína (i.e. o antigénio de superfície celular). As células resultantes são expostas a um primeiro anticorpo ou grupo de anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície celular. Isto resulta na formação de um complexo antigénio de superfície-primeiro anticorpo. Os complexos são expostos a um substrato o qual está revestido ou foi ligado a um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo. As células que expressam o antigénio de superfície celular aderem ao substrato (devido â formação de um complexo antigénio de superfície 22

celular-primeiro anticorpo segundo anticorpo). As células aderentes são separadas das células não aderentes.

Isolamento de RNA total

Para o isolamento de RNA total é preferido o método de tiocianato/CsCl. É mais preferido uma variante tiocianato de guanidinio /LiCl do método GusSCN/CsCl, o qual tem maior capacidade e é mais rápido. Resumidamente, para cada ml da mistura pretendida, são dissolvidos 0,5 g de GuSCN em 0,58 ml de 25% LiCl (solução stock filtrada através de um filtro de 0,45 microns) e adicionado 20 μΐ de mercaptoetanol. As células foram sedimentadas e o sedimento disperso nas paredes por agitação, adicionado 1 ml de solução para 5 x 107 células. A combinação resultante é tratada com polytron até perder a viscosidase. Para preparações em pequena escala (menos de 1θ8 células) colocar 2 ml de mistura tratada em 1,5 ml de 5,7M CsCl (sem RNase; 1,26 g de CsCl adicionado a cada ml de 10 mM EDTA pH8), cobrir com água sem RNase e centrifugação em SW55 50K rpm 2 horas. Para preparações em larga escala, umaa camada de 25 ml e m 12 ml de CsCl num tubo SW28, coberta e centrifugada a 24K rpm 8 h. Aspirar o conteúdo cuidadosamente com ima pipeta pasteur estéril ligada a um frasco de vácuo. Uma vez passada a interface de CsCl, raspa-se uma banda à volta do tubo com a ponta da pipeta para evitar que c camada na parede do tubo desça. A restante solução de CsCl é aspirada. Os sedimentos são ressuspensos em água (não tentar redissolver). Adiciona-se 1/10 do vol. de NaOAc e 3 vol. de EtOH e a combinação resultante é centrifugada. Se necessário, o sedimento é ressus-penso em água (e.g., a 70°C). Ajusta-se a concentração a 1 mg/ml e congela-se. O pequeno RNA (e.g. 5S) não sedimenta. Para pequenas quantidades de células, baixam-se os volumes e cobre-se GuSCN com água sem RNase no gradiente. (a precipitação é ineficax quando o RNA está diluído).

Preparação de RNA poliA+

Em seguida pode-se preparar RNA poliA+, de preferência pelo método de selecção com oligo dT. Resumidamente, prepara-se uma coluna rejeitável de polipropileno lavando com 5M NaOH e depois lavando com água sem RNase. Por cada miligrama de RNA total usa-se cerca de 0,3 ml (volume empacotado final) de oligo dT celulose. A oligo dT celulose é preparada ressuspendendo cerca de 0,5 ml de pó seco em 1 ml de 0,1M NaOHe transferindo-a para a coluna ou por infiltração de 0,1 NaOH através de uma coluna já anteriormente usada (as colunas podem ser reutilizadas muitas vezes). Esta é lavada com vários volumes de coluna de água sem RNase, até o pH ser neutro e equilibrada com 2-3 ml de tampão de aplicação. O conteúdo da coluna é então removido para um tubo estéril de 15 ml usando 4-6 ml de tampão de aplicação. O RNA total é aquecido a 70°C durante 2-3 minutos., adiciona-se LiCl do stock sem RNase (para 0,5 M) e combina-se com oligo dT celulose num tubo de 15 ml. Isto é seguido de vortex ou agitação durante 10 minutos. O resultado é vertido sobre uma coluna e lavado com 3 ml de tampão de aplicação e depois com 3 ml de tampão de lavagem. O mRNA é eluido directamente para um tubo SW55 com 1,5 ml de 2 mM EDTA, 0,1% SDS; as duas ou três primeiras gotas são rejeitadas. 0 mRNA eluido é precipitado pela adição de 1/10 de vol. de NaOAc e cheio o tubo com EtOH. Este é então misturado, arrefecido durante 30 minutos a -20°C e centrifugado a 50K rpma 5°C durante 30 minutos. 0 sedimento de mRNA é ressuspenso em 50-100 μΐ de água sem RNAse. Aproximadamente 5 μΐ é fundido a 70°C em MOPS/EDTA/formaldeído e corrido num gel de 1% de agarose a 1% para avaliar a qualidade.

Síntese de cDNA

Para isto sintetiza-se cDNA. Um método preferido de síntese de cDNA é uma variante do descrito por Gubler e Hoffman (Gene, 25:263-269 (1982)). Isto é realizado como segue: a. Primeira cadeia. 4 μg de mRNA aquecidos a cerca de 100°C num tubo de microtubo durante 30 seguinds e parado o aquecimento em gelo. Adiciona-se o seguinte: 20 θμΐ de tampão RT1, 2 μΐ de inibidor de RNases (Boehringer 36 u/μΐ), 1 μΐ de 5 μg/ml de oligo dT (Collaborative Research), 2,5 μΐ de 20 mM dXTPs (ultrapuros), 1 μΐ de 1 M DTT e 4 μΐ de RT-LX (Life Science, 24 u/μΐ). A combinação resultante é incubada a 42°C durante 40 minutos. Ela é aquecida para inactivar (70°C 10 minutos). b. Segunda cadeia. 320 μΐ de água sem RNase, 80 μΐ de tampão RT2, 5 μΐ de DNA-polimerase I (Boehringer, SU/μΙ). Incubar a 15°C durante 1 hr e 22°C durante 1 hr. Adicionar 20 μΐ de 0,5M EDTA pH 8,0, extrair com fenol e precipitar com EtOH pela adição de NaCl para 0,5M, poliacrilamida linear (veículo) para 20 μg/ml e enchimento do tubo com EtOH. Centrifugar 2-3 minutos numa microfuge, remover, vortex para remover o precipitado da parede do tubo e centrifugar novamente 1 minuto. c. Adaptadores. Ressuspender o cDNA precipitado em 240 μΐ de TE (10/1). adicionar 30 μΐ de tampão de baixo teor salino lOx, 30 μΐ de tampão de ligação lOx, 3 μΐ (2,4 μg) de adptador 12-meros desfosforilado, 2 μΐ (1,6 μg) de adaptador 8-meros desfosforilado e 1 μΐ de DNA-ligase de T4 (BioLabs, 400 U/μΙ ou Boehringer, 1 unidade Weiss/ml). Incubar a 15°C durante a noite. Extrair com fenol clorofórmio e precipitar com EtOH como atrás (não é necessário veículo extra), e ressuspenso em 100 μΐ de TE. 25

Utilização de fragmentos de cDNA em vectores de expressão

Para usar com os vectores de expressão de cDNA baseados em BstXI do invento (ver infra), os segmentos de oligonucleótidos contendo sequências terminais correspondendo a sítios BstXInos vetores são ligados ao fragmento de cDNA pretendido a ser inserido. Os fragmentos resultantes são reunidos por fraccionamento. Um método preferido é como se segue:

Preparar uma solução de 20% KOA, 2mM EDTA/ 1 jLíg/ml de EtBr e uma solução de 5% KOAc, 2 mM EDTA, 1 jug/ml de EtBr. Adicionar 2,6 ml de uma solução KOAc â câmara de trás de um formador de gradientes. Remover a bolha de ar do tubo que liga as duas câmaras permitindo que a solução corra para a câmara de frente e depis volte para trás. Fechar a passagem entre as câmaras e adicionar 2,5 ml da solução a 5% à câmara da frente. Se existir líquido na tubagem de um gradiente anterior, deixar a solução a 5% correr até ao fim do tubo e depois voltar para a câmara. Colocar o aparelho numa placa de agitação, colocar a barra de agitação a mover-se tão rápido quanto possível, abrir a torneira entre as duas câmaras e depois abrir a torneira de saída. Encher um tubo de polialómero SW55 do fundo para o cimo com a solução de KOAc. Preparar um tubo para equilibrar e centri-fugar o gradiente durante 3 horas a 50t rpm a 22°C. Colher as fraeções do gradiente, furar o tubo com um sistema de infusão em borboleta (com o centro apertado) perto do fundo do tubo e colher três fraeções de 0,5 ml e 6 de 0,25 ml para microtubos (cerca de 22 e 11 gotas respectivamente.). Precipitar com EtOH as fraeções adicionando poliacrilamida linear a 20jug/ml e enchendo o tubo até ao cimo com EtOH. Após arrefecimento dos tubos centrifugá-los numa microfuge durante 3 minutos. Vortex e centrifugar novamente 1 minuto. Lavar os sedimentos com EtOH a 70% (centrifugar de novo). Não secar totalmente. Ressuspender cada uma das fraeções de 0,25 ml em 10 μΐ de TE. Correr 1 μΐ num minigel de 1% de agarose. Reunir as três primeiras fracções e as seis últimas que não contêm material inferior a 1 Kb.

Os plasmídeos de tRNA supressor podem ser propagados por métodos conhecidos. Num método preferido de acordo com o presente invento, plasmídeos supF podem ser seleccionados em hospedeiros não supressores contendo um segundo plasmídeo, p3, o qual contem ampicilibna mutagenizada em amber e elementos de resistência à tetraciclina (Seed, 1983). 0 plasmídeo p3 deriva de PR1, tem 57 Kb de comprimento e é mantido estavelmente como um epissoma de cópia simples. A resistência à ampicilina deste plasmídeo não pode ser usada em estirpes contendo p3. A selecção da resistência a tet sózinha é quase tão boa quanto a selecção da resistência amp+tet. No entanto, o aparecimento de mutações espontâneas no tRNA supressor cromossómico apresenta um fundo inevitável (frequência de aproximadamente 10-9) neste sistema. As colónias que surgem de mutações espontâneas no supressor são geralmente maiores do que as clónias que surgem da transformação com plasmídeos. Os plasmídeos supressores tipicamente são seleccionados em meio LBcontendo amp a 12,5 /ig/ml e tet a 7,5 ^g/ml. Para preparações grandes de plasmídeo pode usar-se meio M9 com casaminoácidos contendo glicerol (0,8%) como fonte de carbono e a bactéria crescida até saturação. 0 DNA vector pode ser isolado por métodos conhecidos. 0 método que se segue é preferido para plasmídeos derivados de 1 litro de células saturadas:

Centrifugar as células em frascos de 1 litro J6, 4,2K rpm, 25 minutos. Ressuspender em 40 ml de 10 mM EDTA pH 8 (bater numa superfície macia). Adicionar 80 ml de 0,2M NaOH, 1% SDS, agitar até clarificar e ficar viscoso. Adicionar 40 ml de 5M 27

KOAc, pH 4,7 (2,5M KOAc, 2,5M HOAc) agitar não muito fortemente (até os grumos terem 2-3 mm de tamanho). Centrifugar (mesmo tubo) 4,2K rpm, 5 minutos. Verter o sobrenadante através de gase para uma garrafa de de 250 ml. Encher a garrafa com álcool isopropí-lico. Centrifugar na J6, 4,2K rpm, 5 minutos. Decantar a garrafa, lavar suavemente com EtOH a 70% (evitar fragmentar o sedimento). Inverter a garrafa e remover vestígios de EtOH com papel absorvente. Ressuspender em 3,5 ml de Tris/EDTA 20 mM/10mM. Adicionar 3,75 ml do sedimento ressuspenso a 4,5 g de CsCl. Adicionar 0,75 ml de brometo de etídio a 10 mg/ml, misturar. Encher tubos VTÍ80 com a solução. Correr a uma velocidade de 80K rpm durante 2,5 horas ou mais. Extrair as bandas com luz vísivel usando uma seringa de l ml e uma agulha de 20 gauge ou menos. Cortar o topo do tubo, inserir a agulha inclinada para cima no tubo num ângulo de aproximadamente 30°C relativamente ao tubo, (i.e., tão inclinado quanto possível). numa posição cerca de 3mm abaixo da banda com o bisel da agulha para cima. Após remoção da banda, colocar o conteúdo do tubo em lexívia. Colocar as bandas extraídas em tubos Sarsted de 13 ml Encher o tubo até ao topo com n-butanol saturado com 1M NaCl, extrair. Se se obtiver uma grande quantidade de DNA deve-se extrair novamente. Aspirar o butanol para uma ratoeira contendo 5M NaOH (para destruir o etídio). Adicionar aproximadamente igual volume de acetato de amónio 1M ao DNA (esguicho). Centrifugar a 10K rpm, 5 min. J2-21. Lavar o sedimento cuidadosamente com etanol a 70%. Secar com zaragatoa ou liofilizador. 0 vector pode ser preparado para clonagem por métodos conhecidos. Um método preferido começa com o corte de 20 μg de vector num volume de reacção de 200 μΐ com 100 unidades de BstXI (New York Biolabs), clivando a 50°C durante a noite num banho--maria termostatizado (i.e., banho-maria com circulação de água). Preparar 2 gradientes de 5-20% KOAc em tubos SW55 como descrito atrás. Adicionar 100 μΐ do vector digerido a cada um dos tubos e correr durante 3 horas, 50K rpm a 22°C. Examinar o tubo sob luz UV de 300 nm. A banda pretendida migrará 2/3 do comprimento do tubo. Maior migração da banda significa que o gradiente está com mais material do que o devido. Remover a banda com uma seringa de 1 ml e agulha de 20 gauge. Adicionar poliacrilamida linear e precipitar o plasmídeo adicionando 3 volumes de EtOH. Ressuspen-der em 50 μΐ de TE. Fazer ligações usando uma quantidade constante de vector e quantidades crescentes de cDNAs. Com base nestes ensaios de ligação estabelecer ligação em larga escala o que pode ser conseguido por métodos conhecidos, Geralraente toda a preparação de cDNA requere 1-2 μg de vector cortado.

Os adaptadores podem ser preparados por métodos conhecidos, mas prefere-se ressuspender os adaptadores brutos numa concentração de 1 μg/μl. adicionar MgS04 para 10 mM e precipitar pela adição de 5 volumes de EtOH. Lavar com EtOH a 70% e ressuspender em TEnuma concentração de lμg/μl. Para desfosforilar tomar 25 μΐ de adaptadores ressuspensos, adicionar 3 μΐ de tampão de desfosforilação lOx e 20 unidades de quinase; incubar a 37°C durante a noite. A preparação dos tampões referidos na descrição atrás dos métodos preferidos de acordo com o presente invento serão evidentes para os familiarizados com a área. Por conveniência as composições preferidas dos tampões são as seguintes:

Tampão de aplicação: 0,5M LiCl, 10mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA 0,1% SDS. Tampão de lavagem: 0,15M LiCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA 0,1% SDS. Tampão Rtl: 0,25 M Tris pH 8,8 (8,2 a 42°C), 0,25M KC1, 30 mM MgCl2· Tampão Rt2: 0,1M Tris pH 7,5, 25 mM MgCl2, 0,5M KC1, 0,25 mg/ml BSA, 50 mM DTT. Sais baixos lOx: 60 mM Tris pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 2,5 mg/ml BSA, 70 mM Me.

Adições de ligação lOx: lmM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 10 mM

Tampão de desfosforilação lOx: espermidina. 0,5M Tris pH 7,5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, lOmM espermidina, 1 mg/mlBSA 100 mM MgCl2.

Por "vector" pretende-se significar uma molécula de DNA, derivada de um plasmídeo ou bacteriofago, na qual podem ser inseridos ou clonados fragmentos de DNA. Um vector conterá um ou mais sítios de restrição únicos e podem ser capazes de replicação autónoma num hospedeiro definido ou organismo veículo de tal forma que a sequência clonada é reprodutível. Assim, por "vector de expressão de DNA" pretende-se significar qualquer elemento autónomo capaz de se replicar num hospedeiro independentemente do cromossoma do hospedeiro após sequências adicionais de DNA terem sido incorporadas no genoma do elemento autónomo. Tais vectores de expressão incluem plasmídeos bacterianos e fagos.

No entanto, são preferidos para fins do presente invento vectores virais tais como os derivados do vírus símio 40 (SV40). SV40 é um papovavírus tendo um peso molecular de 28 Mdal e contem uma molécula de DNA de cadeia dupla circular tendo um peso molecular de 3 Mdal, a qual compreende todo o genoma do vírus. Toda a sequência de nucleõtidos desta pequena molécula de DNA circular covalentemente fechada foi sequenciada. Fiers et al.. Nature 273:113-120 (1978); Reddy et al.. Science 200:494-502 (1978). O DNA virai do SV40 pode ser obtido em grandes quantidades e as regiões genómicas responsáveis pelas várias funções virais foram localizadas com precisão em relação a um mapa físicodetalhado do DNA. Fiers et al.. supra; Reddy et al.. supra. 0 genoma virai do SV40 pode multiplicar-se vegetativamente ou como uma parte integral dos cromossomas celulares e existe muita informação sobre a replicação e expressão deste genoma.

Também são preferidos para fins do presente invento um veículo de clonagem bacteriófago de cadeia dupla, designado M13, tendo um genoma de DNA circular fechado de aproximadamente 6,5 Kb. Uma vantagem da utilização de M13 como veículo de clonagem é que as partículas fágicas libertadas a partir de células infectadas contêm DNA de cadeia simples homólogo de apenas uma das duas cadeias complementares do DNA clonado, o qual pode pois ser usado como molde para análise de sequenciação de DNA. São ainda mais preferidos para fins do presente invento os vectores de expressão designados piH3, pÍH3M e CDM8, depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. piH3M e CDM8, depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 31

MD 20852. piH3 foi depositado na ATCC era 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67634. piH3M foi depositado na ATCC em 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67633. CDM8 foi depositado na ATCC em 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67635.

Por "cultura de tecidos" pretende-se sugnificar a manutenção ou crescimento de células de tecidos animais in vitro de forma a permitir posterior diferenciação e preservação da arquitectura celular ou função ou ambas. "Células de tecidos primárias" são as que derivam directamente de uma população consistindo em células do mesmo tipo desempenhando a mesma função num organismo. 0 tratamento de tais células em cultura de tecidos com a enzima proteolítica tripsina, por exemplo, dissocia-as em células de tcidos primárias individuais que crescem bem quando semeadas em placas de cultura em densidades elevadas. As culturas celulares que derivam da multiplicação de células primárias em cultura de tecidos são designadas "culturas de células secundárias". A maior parte das células secundárias dividem-se um número finito de vezes e depois morrem. No entanto, algumas células secundárias podem passar este "período de crise", após o que são capazes de se multiplicar indefinitivamente para formar uma "linha celular contínua". As linhas celulares muitas vezes contêm cromossomas extra e geralmente são também anormais noutros aspectos. A imortalidade destas células é uma característica partilhada com as células cancerosas.

As linhas celulares preferidas para usar com células em cultura de tecidos de acordo com o presente invento incluem a linha de células de rim de macaco "COS". As células COS são as que foram transformadas por DNA de SV40 contendo uma região de genes precoces funcionais mas uma origem de replicação do DNA virai defectiva. 0 clone M6 das células COS é particularmente 32

preferido para usar de acordo com o método do invento. São também preferidos para fins do presente invento células de murganho "WOP", as quais são células NIH 3T3 transfectadas com DNA de polioma com uma delecção da origem. 0 cDNA pode ser introduzido nas células hospedeiras em cultura de tecidos do presente invento por quaisquer métodos conhecidos. A transfecção pode ser conseguida por exemplo por fusão de protoplastos, por fusão de esfero-plastos ou pelo método do DEAE dextrano (Sussman et al.. Cell Biol. 4:1641-1643 (1984)). i

Se se empregar fusão de esferoplastos, um método preferido é a seguinte variante baseada em Sandri-Goldrin et al.. Mol. Cell Biol. 1:743-752 (1981). Resumidamente, por exemplo, uma série de seis fusões requere 100 ml de células em caldo. Crescer as células contendo o plasmídeo amplificável para DO 600=0,5 em LB. Adicionar espectinomicina para 100 ^g/ml (ou cloranfenicol para 150 ^g/ml). Continuar a incubação a 37°C com agitação durante 10-16 horas. (As células começam a lisar com incubação prolongada em meio com espectinomicina ou cloranfenicol). Centrifugar 100 ml da cultura (rotor JA14/GSA, garrafa de 250 ml) 5 minutos a 10000 rpm. Decantar bem, ressuspender o sedimento na garrafa com 5 ml de sucrose a 20% fria, 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Incubar em gelo 5 minutos. Adicionar 2 ml de 0,25M EDTA pH 8,0, incubar 5 minutos a 37°C (banho maria). Colocar em gelo, testar a percentagem de conversão em esferoplastos por microscopia. Num fluxo adicionar lentamente 20 ml de DME/10% sucrose/10 mM MgCl2 frio (gota a gota, ca. 2 gotas por segundo). Remover o meio das células semeadas no dia anterior em placas de 6 cm (50% de confluência). Adicionar 5 ml de suspensão de esferoplastos a cada placa. Colocar as placas no topo de suportes de tubos numa centrífuga basculante. De uma só vez podem ser colocadas a placas. As placas podem ser empilhadas umas sobre as outras, mas 3 numa pilha não é aconselhável pois a camada de esferoplastos na placa de cima verte ou descola-se após centrifugação. Centrifugar a lOOOxg 10 min. A força é calculada com base no raio da placa do fundo. Aspirar o fluido das placas cuidadosamente. Pipetar 1,5-2 ml de PE6 a 50% (p/p) (ou PEG 1000) /50% DME (sem soro) sobre o centro da placa, se necessário, andar com a ponta da pipeta à volta para assegurar que o PEG se espalha uniformemente e radialmente por toda a placa. Após a adição de PEG à última placa inclinar todas as placas sobre as suas tampas de forma a que a solução de PEG venha para o fundo. Aspirar o PEG. A camada fina de PEG residual que fica nas células é suficiente para promover a fusão; é melhor retirar a camada de PEG por lavagem e pode-se obter melhor viabilidade celular, do que se deixar o grosso do PEG. Após 90 a 120 segundos (PEG 1000) ou 120 a 150 segundos (PEG 1450) de contacto com a solução de PEG, pipetar 1,5 ml de DME(sem soro) para o centro da placa. A camada de PEG será espalhada radialmente pelo DME. Inclinar as placas e aspirar. Repetir a lavagem com DMEM. Adicionar 3 ml de DME/10% soro contendo 15 gg/mp de sulfato de gentamicina. Incubar 4-6 horas numa estufa. Remover o meio e a suspensão de bactérias residuais adicionar mais meio e incubar 2-3 dias. Lavagem extensiva da camada de células para remover o PEG tende a remover muitas das células sem qualquer benefício substancial. Se as células sedimentarem numa segunda lavagem com DMEM durante alguns minutos, a maior parte da camada de esferoplastos descolará espontaneamente; no entanto prefere-se lavar rapidamente e deixar que a camada descole em meio completo a 37°C. A solução de PEG pode ser convenientemente preparada fundindo uma garrafa fresca de PEG a 60°C e vertendo aproximada-mente quantidades de 50 ml por meio de um tubo de centrífuga de 50 ml para garrafas previamente pesadas. 0 PEG distribuído é guardado a 5°c no escuro. Para reconstituir uma garrafa fresca, pesar a quantidade, fundir novamente e adicionar um volume igual 34

de DME (sem soro). Ajusttar o pH com solução de bicarbonato de sódio a 7,5% se necessário e esterilizar por filtração. A solução de PEG resultante pode ser guardada até 3 meses à temperatura ambiente sem consequências adversas detectáveis. i

As células hospedeiras ttransfectadas serão cultivadas de acordo com o invento de forma a conseguir-se expressão da proteína codificada pelo clone de cDNA e a aumentar os números absolutos de células disponíveis para subsequente imuno-selecção. Os familiarizados com a matéria conhecerão métodos e meios adequados a esta finalidade, tendo em consideração o tipo de células e outras variáveis normalmente consideradas. As células COS, por exemplo, podem ser cultivadas em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) suplementado com 10% de soro fetal e sulfato de gentamicina. A expressão transitória de células transfectadas normalmente pode-se esperar entre 48 e 72 horas após a transfecção. No entanto, este período de tempo pode variar dependendo do tipo ou estirpe da célula hospedeira usada e das condições da cultura celular, como será aparente para os familiarizados com a matéria.

Imunoprecipitação, transferência e sequenciação de cDNA dos genes clonados de acordo com os métodos do presente invento podem ser realizados por meios convenientes conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, prefere-se o protocolo de imunoprecipitação de Clark et al.. Leukocvte Τνοΐηα II. Vol. II, pp. 155-167 (1986). Podem ser empregues Southern, Northern ou outros métodos de análise de transferências conhecidos dos familiarizados com a matéria, usando sondas de hibridação preparadas por métodos conhecidos, tais como os de Hu et al. (Gene 18:271-277 (1982)). A sequenciação de cDNA também pode ser conseguida por métodos conhecidos, incluindo o método de didesoxinucleótidos de Sanger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USAI 74i5463-5467 (1977).

Os anticorpos usados de acordo com o presente invento podem ser policlonais ou monoclonais. Estes podem ser usados isoladamente ou juntamente com outros anticorpos policlonais ou monoclonais para efectuar a imuno-selecção de células expressando o antigénio ou antigénios pretendidos pelos métodos do presente invento. Os métodos de preparação de anticorpos ou seus fragmentos parausar de acordo com o presente invento são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria.

Trabalhos de referência convencionais estabelecendo os princípios gerais de imunologia incluem Klein, J., Immunolocrv: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, editor, New York (1982); Kennett, R. et al. eds., Monoclonal Antibodies, Hvbridoma: A New Dimension in Biological Analvsis. Plenum Press, editor, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" em Burden, R., et al.. eds., laboratory Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy. Vol.13, Elsevere, aditor, Amsterdam (1984). 0 termo "anticorpo" pretende incluir a molécula intacta assim como seus fragmentos, tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab)»2f os quais também são capazes de se ligar ao antigénio. As preparações de anticorpos policlonais podem ser derivadas directamente do sangue da espécie animal pretendida apôs imunização com o antigénio de interesse ou um seu fragmento, usando qualquer um dos protocolos convencionais conhecidos dos familiarizados com a matéria. De forma semelhante, os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos connhecidos (Kohler et al.. Eur. J. Immunol.. 6:292 (1976)). Prefere-se a utilização de anticorpos monoclonais para fins do presente invento.

Para fins de imuno-selecção de acordo com o presente invento, as células hospedeiras em cultura de tecidos que foram expostas a anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície da célula alvo são separadas das células hospedeiras que não expressam o antigénio alvo distribuindo as células num substrato revestido com anticorpo dirigido contra anticorpo contra o antigénio. Esta técnica, designada "panning" será conhecida dos familiarizados com a matéria e está descrita por exemplo por Mage et al.. J. Immunol. Meth. 15:47-56 (1977) e Wysocki e sato, Proc. Natl Acad. Sei. USA^ 75:2844-2848 (1978). "Panning” de acordo com os métodos do presente invento pode ser realizado como se segue: a. Placas revestidas com anticorpos. Podem ser usadas placas bacteriológicas de 60 mm, Falcon 1007 ou equivalentes ou placas de 10 cm tais como as Fisher 8-757-12. Anticorpo de carneiro anti-murganho purificado por afinidade (por exemplo da CooperBiomedical (Cappell)) foi diluido para 10/zg/ml em 50 mM Tris HC1, pH 9,5. Adicionar 3 ml por placa de 6 cm ou 10 ml por placa de 10 cm. Deixar em repouso ca. 1,5 horas, remover para a placa seguinte às 1,5 horas e depois para uma terceira placa. Lavar as placas 3x com 0,15M NaCl (é conveniente uma garrafa de lavagem para isto), incubar com 3 ml de 1 mg/ml BSA em PBS durante a noite, aspirar e congelar. b. "Panning". As células estarão em placas de 60 mm. Aspirar o meio da placa, adicionar 2 ml de PBS/0,5 mM EDTA/0,02% de azida e incubar as placas a 37°C durante 30 minutos para descolar as células da placa. Triturar as células fortemente com 37\ Λ

uma pipeta de pasteur curta e colher as células de cada placa num tubo de centrífuga. Centrifugar 4 min. marcando 2,5 (200 xg) (demora 5 minutos). Ressuspender as células em 0,5-1,0 ml de PBS/EDTA/azida/5%FBS e adicionar os anticorpos. Incubar pelo menos 30 minutos em gelo. Adicionar igual volume de PBS/EDTA/-azida, colocar cuidadosamente sobre 3 ml de PBS/EDTA/azida/2% Ficoll e centrifugar 4 min. marcando 2,5. Aspirar o sobrenadante suavemente. Ressupender as células em 0,5 ml de PBS/EDTA/azida e adicionar pequenas quantidades a placas revestidas com anticorpos contendo 3 ml de PBS/EDTA/azida/5%FBS pipetando através de um filtro de 100 micron de Nylon (Tetko). Adicionar células no máximo de duas placas de 60 mm a uma placa de 60 mm revestida com anticorpo. Deixar em repouso à temperatura ambiente ambiente 1-3 horas, remover o excesso de células que não aderiram à placa por lavagem suave com PBS/5% soro ou com meio. 2 ou 3 lavagens de 3 ml são geralmente suficientes. c. Sobrenadante de Hirt. Uma variante preferida do método de Hirt, J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967) é como se segue: Adicionar 0,4 ml de 0,6% SDS, 10 mM EDTA a uma placa revestida contendo células aderentes. Deixar em repouso 20 minutos (1 min. pode ser suficiente se praticamente não existirem células na placa). Pipetar a mistura viscosa para um microtubo. Adicionar 0,1 ml de 5M NaCl, misturar, colocar em gelo pelo menos 5 horas. Mantendo tão frio quanto possível parece melhorar a qualidade do Hirt. Centrifugar 4 min., remover o sobrenadante cuidadosamente, extrair com fenol (duas vezes se a primeira inrterface não estiver limpa), adicionar 10 μg de poliacrilamida linear (ou outro veículo), encher o tubo até cima com EtOH, precipitar e ressuspender em 0,1 ml. Adicionar 3 volumes de EtOH/NaOAc, precipitar novamente e ressuspender em 0,1 ml. Transformar MC106l/p3, de preferência usando o protocolo de alta eficácia descrito a seguir. Se o volume de DNA exceder 2% da quantidade de células competentes, a eficácia de transformação baixará. 5% dá o mesmo número de colónias de 2,5% (metade da eficácia).

Para este aspecto do presente invento prefere-se usar "bloqueadores" no meio de incubação. Os bloqueadores asseguram que proteínas inespecíficas, proteases ou anticorpos presentes não se liguem ou destruam os anticorpos presentes no substrato ou na superfície da célula hospedeira, para dar resultados falsos positivos ou falsos negativos. A seleção dos bloqueadores pode melhorar substancialmente a especificidade do passo de imunose-lecção do presente invento. Pode-se usar como bloqueadores uma série de anticorpos monoclonais inespecíficos, por exemplo, da mesma classe ou subclasse (isotipo) dos usados no passo de imuno-selecção (e.g., IgGi, IgG2A, IgGm, etc.). A concentração dos bloqueadores é importante para manter a sensibilidade adequada ainda que inibindo a interferência indesejável. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que o sistema tampão usado para incubação pode ser seleccionado para optimizar a acção de blo-queamento e diminuir a ligação inespecífica.

Uma população de células a ser "panned" relativamente às que expressam o antigénio de superfície celular alvo é primeiro descolada da sua placa de cultura de tecidos (colhida) sem tripsina. As células são então expostas a um primeiro anticorpo, o qual pode ser policlonal ou monoclonal, dirigido contra o antigénio de interesse ou contra uma família de genes relacionados. Nesta fase inicial pode-se usar um único anticorpo ou um grupo de anticorpos, a escolha dependendo da natureza do antigénio alvo, da sua frequência prevista e outras variáveis que serão aparentes para os familiarizados com a matéria. Os antigénios alvo expressos nas superfícies de células hospedeiras formarão vun complexo antigénio-anticorpo.

As células são subsequentemente colocadas em aposição estreita a um substrato, como seja uma placa de cultura de tecidos, disco de filtro ou similares, que previamente foi revestida com um segundo anticorpo ou grupos de anticorpos. Este segundo anticorpo será dirigido contra o primeiro anticorpo e a sua escolha será uma questão decidida pelos utilizadores ditada por exemplo pelo animal em que foi induzido o primeiro anticorpo. Por exemplo, se o primeiro anticorpo for induzido em murganhos, o segundo anticorpo deve ser dirigido contra imunoglobulinas de murganho, induzidos em cabras ou carneiros. As células expressando o antigénio alvo aderirão ao substrato através do complexo formado entre o antigénio, primeiro anticorpo e o segundo anticorpo. As células aderentezs podem então ser separadas das células não aderentes por lavagem. 0 DNA codificador do antigénio alvo é preparado a partir de células aderentes por métodos conhecidos, tais como o de Hirt, J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967). Este DNA pode ser então usado para transformar E. coli ou outras células hospedeiras adequadas ao longo de outros ciclos de fusão e selecção, para conseguir o grau pretendido de enriquecimento .

No caso geral, os ciclos iniciais de imuno-selecção empregarão um painel de primeiros anticorpos dirigidos contra um epítopo ou grupo de epítopos comuns à família de antigénios a que pertence o antigénio alvo. Este será suficientemente para estreitar significativamente o número de clones para futuros ciclos. Dois destes ciclos geralmente serão adequados, mas o número de ciclos pode variar como foi referido atrás. Daqui em diante é empregue um único ciclo de selecção empregando um único primeiro anticorpo ou um grupo de primeiros anticorpos que reconhecem apenas o antigénio alvo. 40

Por "substrato" pretende-se significar uma superfície sólida à qual os anticorpos podem ser ligados para imuno-selecção de acordo com o presente invento. Substratos adequados conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, dextrano, nylon e outros materiais. Podem ser usados tubos, esferas, placas de microtitulação, placas de cultura bacteriológicas e similares feitos ou revestidos com tais materiais. Os anticorpos podem ser ligados covalentemente ou fisicamente ao substrato por técnicas conhecidas, tais como ligação covalente via uma ligação araida ou éster ou por adsorção. Os familiarizados com a matéria conhecerão outros substratos e métodos adequados para imobilização de anticorpos ou serão capazes de determinar tais substratos e métodos usando não mais do que rotina de experimentação.

A escolha das células hospedeiras em cultura de tecidos para usar de acordo com o presente invento de preferência deverá ser de forma a evitar a situação em que os anticorpos usados no "panning" reconheçam determinantes em células transfectadas. Assim, se bem que as células COS sejam preferidas para a expressão transitória de certos antigénios de superfície, são mais preferidas para as células murinas WOP. Destas últimas, células WOP 3027 são ainda mais preferidas. Células WOP permitem virtualmente que sejam utilizados todos os anticorpos pois são raras as reacções cruzadas entre anticorpos de murganho e determinantes da superfície de células de murganho. 0 tamanho da inserção da molécula de DNA recombinante deverá ser escolhido de forma a optimizar a probabilidade de obtenção de uma sequência codificadora na sua totalidade. Os familiarizados com a matéria conhecerão vários métodos pelos quais um determinação preliminar do tamanho óptimo da inserção para um dado gene pode ser feita.

Construção de vectores e inserção de cDNA

Os vectores adequados para expressão de cDNA em células de mamíferos em cultura de tecidos podem ser construídos por métodos conhecidos. São preferidos para fins do presente invento um vector de expressão contendo a origem de SV40. 0 vector pode conter um uma origem de transcrição sintética ou natural e o promotor da região precoce do SV40. Mesmo mais preferido é um promotor quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de citomegalovírus humano. Várias "sequências potencia-doras" podem também ser usadas com os vectores de SV40. Estas estão descritas, por exemplo, por Banerji et al.. Cell 27:299-308 (1981); Levinson et al.. Nature 295:568-572 (1982); e Conrad et al.. Mol. Cell. Biol. 2:949-965 (1982). A inserção de cDNA nos vectores do presente invento pode ocorrer, por exemplo, por colocação de caudas homopoliméri- cas com transferase terminal. No entanto, as caudas homopolimé-ricas localizadas 5/ relativamente às inserções de cDNA pode inibir a expressão in vitro e in vivo. Assim, é preferido para fins do presente invento a utilização de sítios de clivagem invertidos idênticos separados por um pequeno segmento de DNA substituível. Tais sítios de clivagem idênticos invertidos, de preferência empregando a endonuclease de reestrição BstXI. podem ser usados em paralelo com os oligonucleótidos sintéticos de cDNA, dando os mesmos extremos do segmento substituível do vector. Desta forma, o cDNA não se pode ligar a si próprio mas pode ligar-se ao vector. Isto permite a utilização mais eficaz do cDNA e do vector.

Uma outra realização do presente invento é a estratégia baseada em oligonucleótidos atrás descrita para promover a inserção de cDNA no vector. 0 vector piH3M do presente invento é 42

preferida e emprega os sítios de endonucleases invertidos. Este vector pode conter uma origem de replicação do SV40, mas uma forma mais preferida contem uma origem de M13. Este vector, contendo a origem de M13, permite níveis elevados de expressão em células COS de sequências codificadoras colocadas sob o seu controle. Também, o tamanho pequeno e arranjo particular de sequências no plasmídeo permite níveis elevados de replicação em células COS.

Por "antigénio de superfície celular" pretende-se significar qualquer proteína que seja transportada através do sistema de membranas intracelulares para a superfície celular. Tais antigénios normalmente estão ancorados â membrana de superfície celular através de um domínio terminal carbonilo contendo aminoácidos hidrófobos que ficam na bicamada lipídica da membrana e ali exercem os seus efeitos biológicos e antigénicos. Os antigénios tais como os dos linfócitos T são particularmente adequados para a clonagem de genes pelo método do presente invento. No entanto, os antigénios de superfície celular de quaisquer células podem ser clonados de acordo com opresente método. Ainda, proteínas normalmente não expressas na superfície celular podem ser clonadas de acordo com o presente método por exemplo usando separação de células por activação de fluorescência (FACS) para enriquecer em células fixadas expressando os antigénios intracelulares.

Por "substancialmente puro" pretende-se significar qualquer antigénio do presente invento ou qualquer gene codificador de tal antigénio, que esteja essencialmente livre de outros antigénios ou genes, respectivamente, ou outros contaminantes com os quais possa ser normalmente encontrado na natureza e como tal exista numa forma não encontrada na natureza. Por "derivado funcional" pretende-se significar "fragmentos", "variantes", 43

"análogos" ou "derivados químicos" de uma molécula. Um "fragmento" de uma molécula, como seja qualquer um dos antigénios do presente invento, pretende referir-se a qualquer sub-série de polipeptídeos da molécula. Uma "variante" de tais moléculas pretende referir-se a uma molécula natural substancialmente semelhante à totalidade da molécula ou a um seu fragmento. Um "análogo" da molécula pretende referir-se a uma molécula substancialmente semelhante à molécula na sua totalidade ou a um seu fragmento.

Um fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico de um antigénio é referido como sendo substancialmente semelhante a um outro fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio se a sequência de aminoácidos em ambas as moléculas for substancialmente a mesma, i.e., tiver pelo menos cerca de 50% de homologia e se ambas as moléculas possuírem a uma actividade biológica semelhante. Uma sequência de nucleótidos é referida como sendo "substancialmente semelhante" a uma outra sequência de nucleótidos se ambas as sequências forem substancialmente iguais, i.e., a primeira sequência de nucleótidos codifica um fragmento um fragmento, variante, análogo, derivado químico ou antigénio tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50% de homologia relativamente à codificada pela segunda sequência de nucleótidos e o fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio codificado pela primeira sequência de nucleótidos possuir uma actividade biológica semelhante à actividade biológica do fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio codificado pela segunda sequência de nucleótidos. Assim, desde que duas moléculas possuam uma actividade semelhante, elas são consideradas variantes pois esse termo é aqui usado mesmo se uma das moléculas possuir resíduos de aminoácidos não encontrados na outra, ou se a sequência de resíduos de aminoácidos não for idêntica. Tal como aqui é usado, uma molécula é referida como 44

sendo um "derivado químico" de uma outra molécula quando possui fracções químicas adicionais normalmente não encontradas como parte da molécula. Tais fracções podem melhorar a solubilidade da molécula, adsorção, semi-vida biológica, etc. As fracções podem alternativamente decrescer a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar quaisquer efeitos secundários indesejáveis da molécula, etc. As fracções capazes de mediar tais efeitos estão descritas, por exemplo em Remincrton/s Pharmaceutical Sciences. 16a edição,

Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

I

De forma semelhante, um "derivado funcional" de um gene de qualquer um dos antigénios do presente invento pretende incluir "fragmentos", "variantes" ou "análogos" do gene, os quais podem ser "substancialmente semelhantes" na sequência de nucleó-tidos e que codificam uma molécla possuidora de actividade semelhante.

J

Um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico é referido como possuindo "actividade biológica semelhante" a um outro antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico se o primeiro possuir actividade biológica de pelo menos 25% da do último. As actividades biológicas são aquelas operações, funções ou processos que são característicos de organismos vivos. As actividades biológicas podem também incluir a reprodução, extensão ou adaptação de processos vivos a sistemas in vitro ou não naturais, tais como a actividade biológica apresentada quando um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico é artificialmente introduzido num animal a testar para induzir a produção de anticorpos. Um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico pode ter uma ou mais actividades biológicas, as actividades biológicas podem ser detectadas ou medidas por métodos ou ensaios que sejam característicos daquela actividade. Para um derivado funcional 45

possuir uma actividade biológica semelhante à do antigénio ele deve ter uma actividade biológica de pelo menos 25% da do antigénio conforme medido por um ensaio característico daquela actividade e que é conhecido.

Os antigénios substancialmente puros que foram expressos por métodos do presente invento podem ser usados por métodos de ensaio de imunodiagnóstico bem conhecidos dos familiarizados com a matéria, incluindo radio-imunoensaios (EIAs) e ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISAs). As proteínas substancialmente puras do presente invento, na forma solúvel, podem ser administradas sózinhas ou em combinação com outros antigénios do presente invento ou com outros agentes, incluindo linfoquinas e monoquinas ou drogas, para o tratamento de doenças relacionadas com o sistema imune e perturbações e desordens em animais, incluindo humanos. Como exemplos de tais desordens que podem beneficiar do tratamento com as proteínas substancialmente puras do presente invento podem ser referidas doenças de imunodeficiên-cias, doenças do tipo hipersensibilidade imediata, asma, pneumo-nite de hipersensibilidade, doença de complexos imunes, vasculi-te, lupus sistémico eritematoso, artrite reumatóide, perturbações renais imunopatogénicas, inflamação aguda e crónica, anemias hemóliticas, perturbações das plaquetas, neoplasmas de células do plasma e de outras, amiloidose, doenças provocadas por parasitas, esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barre, paralisia miopá-tica aguda e subaguda, miastenia gravis, endocrinopatias imunes e rejeição de treansplantes de tecidos e orgãos, todos como descrito em Petersdorf et al.. eds., Harrison/s Principlaes of Internai

Medicine. supra. Ver também Weir, ed., supra: Boguslaski et al.. eds., supra; e Holborow et al.. eds., supra.

Quando usados em imunoterapia, os antigénios do presente invento podem ou não ser marcados com um agente terapêutico.

Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser acoplados aos antigénios do invento para imunoterapia são drogas, radioisóto-pos, lectinas e toxinas.

As gamas de dosagens para a administração dos antigénios do presente invento são os suficientemente grandes para produzir o efeito imunoterapêutico, mas não tão grandes de forma a causar efeitos secundários adversos, tais como reacções cruzadas indesejáveis, reacçõea anafiláticas e similares. De um modo geral, a dosagme empregue variará com a idade, condição, sexo e grau da doença no paciente. As contraindicações (se existirem), tolerância imune e outras variáveis também afectarão a dosagem adequada. A administração pode ser parenteral, por injecção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. A administração pode também ser intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intradérmi-ca.

As preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos oncluem polipropilenoglicol, polietile-noglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções aquosas e alcoólicas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer ou óleos fixados. Os veículos intravenosos incluem agentes de enchimento fluidos e nutrientes, agentes de enchimento electrólitos, tais como os baseados em destrose de Ringer e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes anti-microbianos, anti-oxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Tais preparações e o modo e método de as fazeer são conhecidos e estão descritos, por exemplo, em Reminaton/s Pharmaceutical Science. 16a ed., supra.

Os antigénios do presente invento podem também ser preparados como medicamentos ou cmposições farmacêuticas compreendendo os antigénios, sozinhos ou em combinação com outros antigénios ou outros agentes tais como linfoquinas, monoquinas e drogas, os medicamentos sendo usados para terapia animal, incluindo humanos, e indicações relacionadas com o sistema imune.

Se bem que os antigénios do presente invento possam ser administrados sozinhos prefere-se que eles sejam administrados como uma composição farmacêutica. As composições do presente invento compreendem pelo menos um antigénio ou o seu sal farma-ceuticamente aceitável, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis e facultativamente outros agentes terapêuticos. Por "aceitável" pretende-se significar que o agente ou veículo é compatível com outros ingredientes da composição e não são prejudiciais para o paciente. As composições incluem as adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bocal e sublingual), vaginal ou parenteral. As composições convenientemente podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos em farmácia. Tais métodos incluem associação do ingrediente activo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas associando uniforme e intimamente o ingrediente activo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e dotando o produto de uma forma caso seja necessário.

As composições farmacêuticas administradas oralmente de acordo com o presente invento podem ter qualquer forma 48

conveniente, incluindo cápsulas, saquetas ou comprimidos cada um dos quais contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo. Os pós ou grânulos são também possíveis, assim como soluções ou suspensões em líquidos aquosos ou não aquosos, ou emulsões líquidas de óleo-em-água ou emulsões líquidas de água-) -em-óleo. 0 ingrediente activo pode também ser apresentado como um bolus, eletuário ou pasta.

Tendo agora descrito o invento, o mesmo será mais detalhadamente compreendido por referência aos exemplos que se seguem, os quais não pretendem de forma alguma limitar o âmbito do invento.

Exemplo I Isolamento. Clonaqem Molecular e Estrutura do

Anticfénio CD2 Humano O vector de expressão de cDNA piH3

Construiu-se um vector de expressão para células COS a partir de piSV (Little et al.. Mol. Biol. Med. 1:473-488 (1983)) por inserção de uma unidade de transcrição sintética entre o gene do tRNA supressor e a origem do SV40. A unidade de transcrição consistiu num promotor quimérico composto por sequências poten-ciadoras precoces imediatas de AD169 do citomegalovírus humano fundidas com as sequências LTR -67 a +80 do HIV. Imediatamente a jusante da sequência LTR +80 foi inserido um poliadaptador contendo dois sítios BstXI separados por uma sequência de 350 pb; os sítios BstXI foram flanqueados por sítios Xbal. os quais também podem ser usados para excisão da inserção. A jusante do poliadaptador foram colocados os sinais de splicing do antigénio t pequeno do SV40 e de poliadenilação da região precoce do SV40 derivadas dp pSV2. A sequência de nucleótidos do vector está apresentada na Figura 1.

Construção da biblioteca de cDNA

Preparou-se RNA derivado de células HPB-ALL pelo método do tiocianato de guanidinio/CsCl como descrito atrás. Preparou-se RNA poliA+ a partir do RNA total por selecção oligo dT. Maniatis et al. . Molecular Clonincr: A Laboratorv Manual, supra. Sinteti-zou-se cDNA pelo método de Gubler e Hoffman (Gene 25:263-269 (1982)). Ligaram-se adaptadores BstXI ao cDNA e os produtos de reacção foram fraccionados por centrifugação através de um gradiente de acetato de potássio de 5-20% contendo 1 mM EDTA durante 3 horas a 50r rpm num rotor SW55. Colheram-se fracções de 50

0,5 ml manualmente com uma agulha de seringa ou borboleta inserida imediatamente abaixo da curva do tubo. Fracções individuais foram precipitadas com etanol após adição de poliacrilamida linear (Strauss e Varshavsky, Cell 37:889-901 (1984)) para 20 μg/ml. As fracções contendo cDNA maior do que 700 pb foram reunidas e ligadas ao vector piH3 purificado em gradiente e digerido com BstXI.

O DNA ligado foi usado para transformar E. coli MC1061/p3 tornada competente pelo seguinte protocolo: A estirpe pretendida e semeada numa placa LB. No dia seguinte uma colónia isolada é inoculada em 20 ml de caldo TYM (receita dada abaixo) num frasco de 250 ml. As células foram cultivadas até meio da fase logarítmica (Οϋροο cerca de 0,2-0,8), vertidas para um frasco de 21 contendo 100 ml de TYM e agitadas fortemente até as células crescerem para 0,5-0,9 OD, depois diluídas novamente para 500 ml no mesmo vaso. Quando as células atingem uma densidade de DO600=°f6r o frasco foi colocado num banho de água com gelo e agitado suavemente para assegurar arrefecimento rápido. Quando a

J cultura estava fria, centrifugou-se a 4,2K rpm durante 15 minutos (J6). 0 sobrenadante foi decantado e o sedimento ressuspenso em cerca de 100 ml de TfB I (abaixo) por agitação suave em gelo. Em seguida foi novamente centrifugada no mesmo frasco a 4,2K rpm durante 8 minutos (J6). 0 sobrenadante foidecantado e o sedimento ressuspenso em 20 ml de TfB II frio por agitação suave em gelo. Quantidades de 0,1 a 0,5 ml foram colocadas em microtubos previa-mente arrefecidos em azoto líquido e guardado a -70°C. Para transformação, retirou-se uma pequena quantidade, descongelou-se à temperatura ambiente só até fundir e colocou-se em gelo. O DNA foi adicionado, deixado em gelo 15-30 minutos e incubado a 37°c durante 5 minutos (6 minutos para quantidades de 0,5 ml). Em seguida as suspensões contendo DNA foram diluídas a 1:10 em LB e cultivadas durante mais 90 minutos antes de serem semeadas ou aplicação da selecção com antibiótico. Como alternativa, A mistura de transformação a que foi dado o choque térmico foi semeada directamente em placas com antibiótico nas quais foi espalhada uma camada fina (4-5 ml) de agar LB sem antibiótico imediatamente antes da sementeira.

Meios e Tampões: TYM: 2% Bacto-Tryptone, 0,5% Yeast

Extract, ο, 1M NaCl, 10 mM MgSC>4 (pode ser adicionado antes da autoclavagem). TfB 1:30 mM KOAc, 50 mM MnCl2, 100 mM KC1, 10 mM CaCl2, 15% (v/v) glicerol. TfB II: 10 mM Na-MOPS, pH 7,0, 75mM CaCl2, 10 mM KC1, 15% glicerol.

Recuoeracão de clones de cDNA por "oannina11

Placas de cultura para bacteriologia (Falcon 1007) foram preparadas para ••panning" por revestimento com um anticorpo de carneiro anti-IgG de murganho como descrito por Wysocki e Sato (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2844-2848 (1978)), excepto as placas serem lavadas com 0,15M NaCl de uma garrafa de lavagens em vez de PBS e os sítios que não reagiram foram bloqueados por incubação durante a noite em PBS contendo 1 mg/ml de BSA. As placas foram tipicamente preparadas em grandes lotes e guardadas congeladas após aspiração do PBS/BSA. No primeiro ciclo de rastreio, 24 placas de 6 cm de células COS confluentes foram transfectadas por fusão de protoplastos de acordo com o método de Sandri-Goldrin et al.. Mol. Cell. Biol. l_:743-752 (1981). 72 horas após a fusão as células foram descoladas por incubação em PBS/1 mM EDTA/0,2% azida de sódio a 37°C durante 30 minutos. As células descoladas foram reunidas, centrifugadas e ressuspensas em PBS/EDTA/5% soro fetal bovino contendo anticorpos monoclonais, geralmente derivados de ascites numa diluição de 1:1000, mas também como reagentes comerciais nas concentrações sugeridas pelos fabricantes. Após 1 hora em gelo, as células foram diluidas a 1:1 com PBS/EDTA/azida contendo 2% Ficoll 400. Após centrifugação (400xg, 5 minutos) o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado, o sedimento ressuspenso numa pequena quantidade de PBS/EDTA/5% FBS e as células distribuídas por placas de "panning" contendo 3 ml de PBS/EDTA/5% FBS. As placas forma então tratadas essencialmente como descrito por Wysocki e Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2844-2848 (1978). O DNA epissómico foi recuperado a partir de células aderentes pelo processo de Hirt (J. Mol. Biol. 26:365-269 (1967)) e usado para transformar MC1061/p3.

Linhas celulares e cultura de células Células COS clone M6 foram propagadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal e sulfato de gentamicina a 15^g/ml (DME/10% soro de vitela). As células foram distribuídas no dia antes da transfecção por placas de 6 cm a aproximadamente 1:8 a partir de placas stock mantidas tão densas quanto possível sem danificar as células. As linhas de células T foram cultivadas em meio de Dulbecco modificação de Iscove (IMDM) contendo gentamicina como atrás, e NuSerum (Collaborative Research) ou soro bovino fetal a 10%.

Transfeccão de células COS para estudos de imunofluorescência Células COS a 50% de confluência em placas de 6 cm foram transfectadas num volume de 1,5 ml com uma mistura consistindo em meio DME ou IMDM contendo 10% NuSerum (Collaborative Ressearch), 400 μg/ml de DEAE dextrano, 10 μΜ difosfato de cloroquina e ln μg/ml de DNA. Após 4 horas a 73°C (ou mais cedo se as células ficarem com mau aspecto), a mistura de transfecção foi removida e as células foram tratadas com 10% DMSOem PBS durante 2 minutos. Sussman e Milman, Cell Biol. 4:1641-1643 (1984). As células passaram então novamente para DME/10% soro de vitela durante 48 a 72 horas para permitir a expressão.

Imunoprecioitações. Northerns e Southerns

As células T foram marcadas por tratamento com lactope-roxidase, lisadas e imunoprecipitadas pelo processo de Clark e Einfeld (Leukocvte Tvpinq II. Vol.II, pp. 155-167 (1986)), usando esferas de agarose com anticorpos de cabra anti-IgG de murganho (Cooper Biomedical). Células COS foram transfectadas pelo método de DEAE-dextrano e tripsinizadas e passadas sem diluição para novas placas 24 horas após transfecção. 36 horas mais tarde, as células foram descoladas por exposição a PBS/EDTA como atrás, centrifugadas e marcadas pelo método da lactoperoxidase. Preparou-se um lisado límpido como para as imunoprecipitações de células T, excepto o tampão de lise conter 1 mM PMSF e a incubação com o anticorpo primário foi realizada durante apenas 2 horas a 4°C. Amostras eluidas foram fraccionadas em géis descontínuos de 11-25% de poliacrilamida usando o sistema tampão de Laemmli (Nature 227:680-685 (1970)). A análise de transferências Northern foi realizada essencialmente como descrito (Maniatis et al.. Molecular Clonina a Laboratorv Manual (1982)), excepto o DMSO ser omitido do tampão de aplicação, a desnaturação foi realizada a 70eC durante 5 minutos e o gel continha 0,6% de formaldeído em vez de 6%. O gel foi corado em dois volumes de água contendo 1/íg/ml de brometo de etídio, fotografado e transferido para nylon (GeneScreen, Dupont) no líquido de coloração. 0 RNA transferido foi irradiado por exposição a uma lâmpada germicida através de Saran (Church, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 8:1991-1995 (1984)) durante 5 minutos a um fluxo de 0,22 mW/cm2 (medido a 254 nm). A análise de transferências Southern foi realizada por transferência alcalina para nylon (GeneScreen, DuPont) como descrito por Reed e Mann (Nucl. Acids Res. 13:7207-7221 (1986)). Preparam-se sondas de hibridação pelo método de Hu e Messing (Gene 18:271-277 (1982)), e as transferências foram pré-hibridadas em SDS/tampão fosfato (Church e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8:1991-1995 (1984)) contendo 10 equivalentes microgramas de DNA do fago M13 mpl9.

Formação de rosetas de eritrôcitos

Preparam-se eritrôcitos a partir de sangue total por três centrifugações em PBS. Células COS foram transfectadas em placas de 6 cm com CD2 ou outros clones de expressão de anti-génios de superfície pelo método de DEAE. 48 a 72 horas após transfecção o meio foi aspirado e adicionado 2 ml de PBS/5% FDS/azida de sódio por placa, seguido de 0,4 ml das amostras adequadas de eritrôcitos como suspensões a 20% em PBS. Após 1 hora à temperatura ambiente, os eritrôcitos não aderentes foram lavados suavemente e examinadas as placas.

Um cDNA codificador de determinantes antigénicos CD2 foi isolado como se segue: preprou-se cDNA a partir de RNA extraído da linha de células T tumorais humana HPB-ALL e inserido no vector de expressão baseado na origem de SV40 piH3 como descrito atrás. Construiu-se uma biblioteca de cDNA de aproxima-damente 3 x 105 recombinantes e a biblioteca foi introduzida em células COS por fusão de protoplastos. Três dias mais tarde as células foram descoladas por exposição a EDTA e tratadas com um conjunto de anticorpos monoclonais, incluindo três (0KT11, Leu5b e Coulter Til) dirigidos contra determinantes de CD2. As células tratadas com anticorpo foram distribuídas por placas revestidas com anticorpos de carneiro anti-IgG de murganho, deixadas ligar e separadas das células não aderentes por lavagem suave. Este 55 método de enriquecimento é conhecido da literatura de imunologia (Mage et al.. J. Immunol. Methods 15:47-56 (1977).

As colónias resultantes foram reunidas, fundidas com células COS e sujeitas a uma segunda volta de "panning" como 1 anteriormente. Na terceira volta uma fracção das células descola das foi tratada com uma mistura de três anticorpos monoclonais específicos de CD2 e preparou-se novamente sobrenadante de Hirt e usado em transformação de E. coli. Preprou-se DNA a partir de oito das colónias resultantes e usou-se para transfectar células COS. Após três dias, a expressão na superfície do antigénio CD2 foi detectada por imunofluorescência indirecta em seis de oito placas transfectadas. A digestão do DNA dos plasmídeos correspondentes com enzimas de restrição revelou uma inserção de 1,5 Kb nos seis isolados.

Um dos seis clones foi preparado em grandes quantidades para posterior análise. Após transfecção de células COS, a análise de imunofluorescência indirecta com um painel parcial de anticorpos proporcionados pelo Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens mostrou que todos os anticorpos proporcionados deram reacções positivas com excepção de uma amostra de uma amostra que também não reagiu com linfócitos T activados com fito-hemaglutinina. Entre os 17 anticorpos testados foram pelo menos oito os grupos distintos definidos pelos seus padrões diferentes de reactividade com linfócitos de várias espécies de primatas. Jonker e Nooij, Leukocvte Tvoina II. Vol. I, pp. 373-387 (1986). 56

Análise da sequência de cDNA

A inserção de cDNA de CD2 foi subclonada em M13 mpl9 (Vieira e Messing, Gene 19:259-268 (1982)). em ambas as orientações e a sequência determinada pelo método de didesoxinucleótidos (Figura 2). Sanger et al.. Proc. Natl Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977). Um grelha de leitura aberta foi observada estendendo-se por 360 resíduos a partir de um ATG satisfazendo o critério de consensus de Kozak fMicrobiol. Rev.: 1-47:45 (1983)) para codões de inciação da tradução (Figura 1). A sequência de aminoácidos prevista evoca uma proteína de membrana integral com uma única âncora hidrófoba atravessando a membrana terminando num domínio intracitoplásmico grande. A comparação da sequência de aminoácidos N-terminal com a matrix de frequências de resíduos de sequência sinal construída por von Heijne (Nucl. Acids Res. 14:4683--4690 (1986)) sugere que o peptídeo maduro CD2 é formado por clivagem de um peptídeo precursor entre os resíduos 192 (Ser) e 202 (Lis).

Uma característica surpreendente e inesperada desta sequência é a presença de um potencial sítio de N-glicosilação muito perto do sítio de clivagem proposto. 0 esqueleto polipep-tídico resultante tem um peso molecular previsto de 38,9 Kd dividido por um domínio externo de 21,9 Kb e um domínio citoplas-mático de 14,6 Kd. Três sítios de N-glicosilação estão presentes no domínio extracelular. 0 domínio que atravessa a membrana compreende 26 resíduos não alterados de carácter predominantemente hidrofóbico. Nos nove resíduos imediatamente a seguir estão sete resíduos básicos, lisinas ou argininas. 0 aparecimento de resíduos predominantemente hidrofôbicos seguidos de resíduos básicos é uma característica de organização típica das proteínas transmembra-nares portadoras de âncoras no extremo carbonilo.

Uma outra característica surpreendente do domínio transmembranar é o aparecimento de um motivo de volta beta cis-gli-gli-gli (Chou e Fasman, Annual Review of Biochemistry 47:251-276 (1978)), delimitado por resíduos hidrofóbicos (os quais são frequentemente encontrados delimitando as voltas beta). Devido a apenas 20 resíduos arranjados numa hélice alfa serem teoricamente necessários para atravessar a bicamada da membrana de 3 nm (Tanford, Science 200:1012-1018 (1978)) e apenas 14 resíduos hidrofóbicos podem permitir a inserção e exportação de uma proteína de membrana integral (Adams e Rose, Cell 41: 1007--1015 (1985)), o segmento transmembranar do antigénio CD2 pode conter uma dobra ou nó. 0 tamanho relativamente grande do domínio citoplasmáti-co deixa em aberto a possibilidade de CD2 possuir uma actividade enzimática intrínseca. 0 domínio citoplasmático é muito rico em prolinas e contem três sítios com grande probabilidade de torsão. A comparação da sequência de aminoácidos com a base de dados NBRF não revelou homologias substanciais com outras proteínas. Em particular, nenhuma homologia com as cadeias alfa ou beta do receptor das células T, excluindo a sugestão de que CD2 seja um receptor primordial de células T. Milanese et al.. Science 231:1118-1122 (1986).

Imediatamente dentro da face citoplasmática da proteína está um segmento de aminoácidos básicos seguido de um resíduo serina, um padrão encontrado no mesmo local tanto no receptor de EGF como nos genes de histocompatibilidade classe I e em cada um dos casos um sítio conhecido para fosforilação in vivo (EGF) e in vitro (HLA) pela proteína-cinase C ou proteína-cinase dependente de AMP cíclico, respectivamente. Hunter et al.. Nature 311:480--482 (1984); Davis e Czech, Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1974-1978 (1985); Guild e Strominger, J. Biol. Chem. 259:9235-9240 e 13504-13510 (1984). Um sítio semelhante foi encontrado no domínio intracitoplasmático do receptor da interleuquina 2 e é fosfori-lado in vivo pela proteína cinase C. Lenard et al.. Nature 311:626-631 (1984); Nikaido et al.. Nature 311:631-635 (1984);

Shackelford e Trowbridge, J Biol. Chem. 259:11706-(1984).

Imunoprecipitacão do anticrénio CD2 expresso pelas células trans-fectadas

As células COS foram transfectadas com o plasmídeo de expressão de CD2 e marcadas na superfície com 125χ pelo método da lactoperoxidase 60 horas após-transfecção. Preparou-se um lisado de células e fraeções dele foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-CD2 (OKT11) ou com um anticorpo estranho (OKT4; anti-CD4) durante 2 horas a 4°C. Adicionou-se anticorpo anti-mur-ganho ligado a Sepharose e após vários passos de lavagem as proteínas adsorvidas foram eluidas e submetidas a electroforese através de um gel de 11,25% de poliacrilamida juntamente com imunoprecipitados preparados de forma semelhante derivados de linfócitos T activados com fito-hemaglutinina, a linha HPB-ALL dadora de cDNA ou de uma linha de células T a longo termo gerada neste laboratório. A autorradiografia demonstrou uma banda proeminente de material imuno-reactivo precipitado a partir de células COS transfectadas pelo anticorpo anti-CD2, mas não pela testemunha. O peso molecular médio calculado para o material derivado de células COS foi de 51 Kd, comparado com um peso molecular médio de 54 Kd para o material derivado de blastócitos T we dalinha de células T; encontrou-se que o antigénio derivado de células HPB-ALL possui um peso molecular de aproximadamente 61

Kd. As diferenças observadas no tamanho foram atribuídas a diferentes padrões de glicosilação nos diferentes tipos celulares. Uma banda menor de peso molecular aparente 38 Kd estava presente no material imunoprecipitado a partir de células COS mas não a partir de células T ou de células HPB-ALL. O tamanho destas espécies está de acordo com o peso molecular previsto do peptídeo maduro não glicosilado, 39 Kd. Células COS expressando CD2 formam rosetas com eritrócitos de carneiro Células COS transfectadas com o clone de expressão de CD2 foram tratadas durante 1 hora com o anticorpo MT910 purificado anti-CD2 (IgG, kapa) (Rieber et al.. Leukocvte Tvpinq IIf Vol. I, pp. 233-242 (1986)) a uma concentração de 1 μg/ml ou com MB40.5 purificado (IgGl, kapa; Kawata et al.. J. Exp. Med. 160:633-651 (1984)) na mesma concentração. MB40.5 reconhece um determinante monomórfico HLA-ABC e dá reacção cruzada com antigé-nios de histocompatibilidade de Macaco Verde Africano; ele foi escolhido por representar um anticorpo do mesmo isotipo reconhecendo um antigénio de superfície com aproximadamente a mesma abundância do antigénio CD2 expresso pelas células transfectadas. As rosetas de eritrócitos de carneiro foram observadas na presença de MB40.5, mas não na de MT910. A inibição das rosetas foi também observada com o anticorpo OKT11 e não com vários outros anticorpos testemunha. Células COS transfectadas formam rosetas com outros eritrócitos animais

Para além dos eritrócitos de carneiro, as células T humanas formam rosetas com eritrócitos de cavalo, porco, cão, 60

cabra e coelho, mas não com as de murganho ou rato. Johansen et al.. J. Allerav Clin. Immunol. 54:86-94 (1974); Amiot et al.. em A. Bernard et al.. eds. Leucocyte Typinq. Springer, editor, New York, N.Y., pp. 281-293 (1984); Nalet e Fournier, Cell. Immunol. 96,: 126-136 (1985). Também foram observadas auto-rosetas entre eritrócitos humanos e timócitos humanos (Baxley et al.. Clin. exp. Immunol♦ 15:385-393 (1973)). Células COS transfectadas com o clone de expressão CD2 foram tratadas com MT910 ou com o anticorpo testemunha, MB40.5 e expostas a eritrócitos da espécie acima. As rosetas foram observadas com eritrócitos de cavalo, porco, cão, cabra, carneiro, coelho e humanos, mas não com eritrócitos de murganho ou de rato. A formação de rosetas foi bloqueada pelo pré-tratamento de células COS com MT910, mas não com MB40.5. Nestas experiências, observou-se que eritrócitos de cavalo formaram rosetas invulgarmente grandes os eritrócitos de cabra formaram rosetas esparsas, possivelmente devido ao seu pequeno tamanho ficam mais susceptíveis à lavagem. Os eritrócitos de murganho apresentaram ligação espontânea fraca à placa de cultura assim como às células pré-tratadas com MT910 e MB40.5, enquanto que os eritrócitos não mostraram ligação detectável de qualquer tipo.

Ligação de eritrócitos humanos bloqueada pelo anticorpo LFA3

Devido a ter sido sugerido com base nos estudos de anticorpos bloqueadores que LFA3 é a estrutra alvo para o anti-génio CD2 (Shaw et al.. Nature 323:262-264 (1986)), a capacidade do anticorpo anti-LFA3 para evitar a formação de rosetas foi estudada, células transfectadas foram expostas a eritrócitos humanos pré-tratados durante 2 horas com anti-LFA3 (IgGl, kapa) como ascites a uma diluição de 1:1000 ou com uma concentração de lO^g/ml de cada um dos quatro anticorposs não aglutinantes do mesmo isotipo dirigidos contra antigénios de eritrócitos humanos 61

como prevalentes ou mais prevalentes do que LFA3:G10/B11 e D10, anti-antigénio K14, D6, anti-antigénio Wr*3; e F7/B9, anti-anti- génio K. Nichols et al.. Vox Sana, no prelo. Os eritrócitos foram lavados para remover o excesso de anticorpo LFA3, mas deixou-se que formassem rosetas na presença de anticorpos testemunha para garantir contra a possível perda de poder do anticorpo bloqueador por desadsorção. A formação de rosetas foi observada na presença dos quatro anticorpos testemunha, mas não com eritrócitos pré--tratados com anti-LFA3.

Células COS expressando outros antiaénios de células T não formam rosetas

Isolou-se uma série de clones pela mesma técnica de expressão usada para clonar CD2 e caracterizou-se por vários graus de reactividade com anticorpos, restrição de ácidos nuclei-cos e análise de sequências e imunoprecipitação. Clones representativos foram usados para transfectar células COS e analizados relativamente à capacidade de suster a formação de rosetas. Os clones CDla, CDlb, CDlc, CD4, CD5, CD6, CD6, CD8 e CD28 (Tp44) não formaram rosetas com eritrócitos humanos.

Análise de transferências de RNA

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares expressando ou não o antigénio CD2 foram sujeitas a electroforese em géis desnaturantes de agarose e transferidas para nylon. A hibridação do RNA transferido com uma sonda selec-tiva de cadeia (Hu e Messing, Gene 17:271-277 (1982)) preparada a partir do clone M13 contendo uma inserção de cDNA revelou a presença em RNA derivado de populações de timócitos, célula T activada, e de células T senescentes. Quantidades menores foram encontradas em RNA extraído da linha dadora de cDNA, HPB-ALL e 62

ainda menos a partir de MOLT4; níveis escassamente detectáveis foram registados em RNA da linha HSB-2. Não se observou reactivi-dade com RNA das linhas Namalwa (linfoma de Burkitt), U937 (leucemia histiocítica), HuT-78 (leucemia de células T de adultos), PEER (leucemia de células T) ou Jurkat clone J3R7 (leucemia de células T). O padrão de reactividade está de acordo com o padrão conhecido ou medido da expressão de antigénio CD2, o qual estava ausente ou indetectável nas linhas celulares Namalwa, *937, HuT-78, J3R7, PEER e HSB-2, fracamente presente em M0LT4, mais fortemente presente em EPB-ALL e mais fortemente presente em células T activadas. Também é conhecido que os timócitos expressam níveis elevados do antigénio CD2. A avaliação da sequência do clone de cDNA sugeriu que mRNA de 1,3 Kb deve surgir pela formação de um extremo 3/ alterno distai relativamente ao sinal de poliadenilação canónico AATAAA na posição 1085 na sequência de cDNA. Para testar esta noção, RNA de HPB-ALL e células T activadas foi sujeito a análise de transferências Northern e hibridado com uma sonda de cDNA completa ou com uma sonda derivada da fracção 3/ do cDNA distai relativamente

ao nucleótido 1131. Esta última sonda reagiu apenas com a espécie de 1,65 Kb, se bem a primeira mostrasse o mesmo padrão de reactividade observado na Figura 5. Este resultado é consistente com a origem sugerida para o produto de transcrição de 1,3 Kb.

Tanto em preparações de RNA de células T activadas como de células senescentes, foi detectado um produto de transcrição de 0,75 Kb que hibridou fracamente. Presentemente a origem deste RNA é desconhecida.

Organização qenómica do gene CD2

Análise de transferências Southern de DNA genómico derivado de placenta, linfócitos do sangue periférico, células T, células HeLa ou as linhas tumorais usadas na análise de RNA atrás mostrou padrões de digestão BamHI idênticos, indicando que o rearranjo não está envolvido na expressão normal do gene CD2 durante o desenvolvimento. De forma semelhante, não se observa grande alteração genómica que suporte a ausência de expressão do antigénio CD2 nas linhas de células T tumorais examinadas. A análise de restrição de DNA genómico total com uma série de outras enzimas, assim como resultados preliminares com uma colecção incompleta de fagos recombinantes portadores da sequência CD2, mostra que o gene está dividido em pelo menos quatro exões.

Exemplo II Isolamento e Clonagem Molecular do Antigénio LFA-3 Humano 0 exemplo anterior mostra que os cDNAs codificadores de antigénios de superfície, como seja CD2 podem ser isolados pelo sistema de expressão transitória do presente invento, no qual as células COS transfectadas com bibliotecas de cDNA se ligam a placas revestidas com anticorpo ("panned"). 0 DNA de plasmídeo foi recuperado a partir de células aderentes às placas, usado para transformar E. coli e o processo repetido, geralmente duas vezes, para isolar o clone pretendido. Se bem que poderosa esta abordagem não pode ser usada quando os anticorpos monoclonais usados no "panning" reconhecem determinantes nas células transfectadas. Isto parece ser o caso do monoclonal TS2/9 anti-LFA3. No entanto, um sistema de expressão transitória semelhante baseado era células competentes para a replicação do vírus polioma deverá permitir que quase todos os monoclonais sejam usados pois a probabilidade de reacção cruzada entre anticorpos murinos e determinantes de superfície celular murinos deverá ser geralmente pequena.

Criou-se um novo vector de expressão, CDM8 (Figura 3) a partir do vector de células COS piH3M descrito anteriormente. O novo vector difere pela inclusão de uma versão com deleções de uma região precoce mutante do vírus polioma seleccionada pela elevada eficácia de expressão tanto em células murinas como em células de macaco, pela substituição de substancialmente toda a região do promotor do vírus da imunodeficiência humana com as sequências cognatas do promotor precoce imediato de citomegalo-vírus humano e pela inclusão de um promotor do bacteriofago T7 entre o promotor eucariõtico e o sítio da inserção de cDNA. A expressão em células COS de cloranfenicol-acetiltransferase por todos os vectores foi equivalente.

Preparou-se uma biblioteca de 1,9 x 106 recombinantes tendo inserções superiores a 0,8 Kb no vector CDM8 a partir de um micrograma de RNA poli A+ isolado a partir da linha celular linfoblastóide humana JY. A biblioteca foi introduzida em células WOP (células NIH 3T3 transfectadas com DNA com deleções da origem do polioma) por fusão de esferoplastos e sujeito a três ciclos de "panning" e reintrodução em E. coli como descrito no Exemplo I.

Um clone codificador do antigénio LFA-3 foi identificado por imunofluorescência indirecta de células WOP transfectadas, amplificado e sequenciado (Figura 4). Dentro da inserção de 874 pb, uma grelha de leitura aberta de 237 resíduos iniciada no codão metionina quase correspondendo â sequência consensus sugerida por Kozak, Microbiol. Rev. 42:1-45 (1983). A grelha de leitura termina numa série de resíduos hidrofóbicos sem os resíduos básicos de ancoragem característicos das proteínas de 65

membrana internas, mas partilhando características com proteínas de membrana superficiais ligadas a fosfatidilinositol. As características incluem conjuntos de resíduos serina ou treonina numa região hidrofílica imediatamente precedendo o domínio hidrofóbico e a presença de serinas e treoninas na fracção hidrofôbica.

A sequência de aminoácidos prevista a partir da sequência de nucleótidos doclone LFA-3 foi comparada com a base de dados NBRF e não foram descobertas homologias significativas; as homologias mais significativas foram com a proteína do invólucro do HIV. Dentro dos 200 resíduos compreendendo a presumível proteína madura estão 6 sítios de glicosilação ligada em N e 5 resíduos seguidos de serina ou treonina que frequentemente aparecem em proteínas glicosiladas em O. Dez resíduos císteina aparecem na sequência completa, 6 dos quais estão distribuídos na última metade da proteína madura e dos quais um está no domínio hidrofóbico do extremo carbonilo. Se bem que a esterificação de tióis da císteina para ácidos gordos seja comum em proteínas de membrana integrais e possa desempenhar um papel alternado na ancoragem à membrana de LFA-3, são conhecidos dois exemplos de resíduos de císteina dentro ou na margem da região hidrofôbica de proteínas ligads a fosfatidilinositol.

A sequência prevista sugere que as manipulações conhecidas para aumentar a adesão de eritrócitos a células T possa ter explicação física directa na estrutura da molécula de LFA-3. 0 brometo de aminoetilisotiouronio, o aditivo tioureia de bromo-etilamina, sofre rearranjo espontâneo para mercaptoetilguanidina a pH alcalino. 0 último igualmente tem acesso a ligações dissul-fureto inacessíveis a agentes redutores menos caotrópicos e pode assim reduzir e promover o desenrolamento da molécula LFA-3. De forma semelhante, a neuraminidase pode decrescer a interferência espacial pelas muitas cadeias de açúcar na molécula. A análise de hibridação de transferências de RNA e DNA mostraram que o gene LFA-3 não partilha sequências estreitamente relacionadas no genoma e codifica uma única espécie de RNA de cerca de 1 Kb de comprimento. Linhas celulares que expressam grandes quantidades de LFA-3 de superfície têm maiores quantidades de RNA de LFA-3 do que as que expressam quantidades pequenas ou não detectáveis. A radioimunoprecipitação do antigénio expresso em células transfectadas COS e murinas mostra uma banda larga de aproximadamente 50 Kd de peso molecular médio, semelhante ao encontrado nas células JY.

Exemplo III Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNA do Antigénio CD28

Os exemplos anteriores ilustram a técnica baseada em anticorpos monoclonais do presente invento para enriquecimento em cDNAs codificadores de antigénios de superfície. No presente invento, está descrito um método de construção de bibliotecas de expressão que permite que a técnica de enriquecimento seja totalmente explorada. O método do presente invento para fazer bibliotecas de expressão em plasmídeos é de utilização geral para a clonagem de expressão. A técnica de selecção de anticorpos do presente invento também foi aplicado para isolar um clone de cDNA codificador do antigénio CD28. O antigénio partilha homologia substancial com membros da superfamília de imunoglobulinas e forma uma estrutura em dímero na superfície de células COS transfectadas semelhante à estrutura de dímero encontrada em linfócitos T.

Preparação de bibliotecas de cDNA RNA poli(A)+ foi preparado a partir da linha HPB-ALL de células T tumorais humanas por cromatografia em oligo(dT) celulose do RNA total isolado pelo método do tiocianato de guanidinio (Chirgwin, J.M. et al. . Biochemistrv 18.:5294-5299 (1979)).

Preparou-se cDNA por um protocolo baseado no método de Gubler e Hoffman (Gubler, U. et al.. Gene 25:263-269 (1989)). 4 μg de mRNA foi aquecido a aproximadamente 100°C num tubo de centrífuga de 1,5 ml durante 30 segundos, arrefecido em gelo e o volume ajustado a 70 μΐ com água sem RNase. A isto adicionou-se 20 μΐ de

tampão (0,25M Tris pH 8,8 (8,2 a 42°C), 0,25M KC1, 30 mM MgCl2), 2 μΐ de de inibidores de RNAses (Boehringer 36 u/μΐ), 1 μΐ de 1M DTT, 1 μΐ de 5 μg/μl de oligo dT (Collaborative Research), 2 μΐ de trifosfatos de desoxinucleótidos 25 mM cada (US Biochemicals) e 4 μΐ de transcriptase reversa (Life Sciences, 24 u/μΐ). Após 40 minutos a 42°c, a reacção foi parada por aquecimento a 70°C durante 10 minutos. A esta mistura de reacção foi então adicionado 320 μΐ de água sem RNase, 80 μΐ de tampão (0,1M Tris pH 7,5, 25 mM MgCl2, 0,5M KC1, 0,25 mg/ml BSA e 50 mM DTT), 25 unidades de RNaseH (BRL). Após 1 hora a 15°C e 1 hora a 22°C, foram adicionados 20 μΐ de 0,5M EDTA, a mistura de reacção foi extraída com fenol, adicionado NaCl para 0,5M, adicionada poliacrilamida linear (veículo; Strauss, F. et al.. Cell 37:889-901 (1984)) para 20 μg/ml e o tubo foi cheio com etanol. Após centrifugação durante 2-3 minutos a 12000 xg, o tubo foi removido, vortexado para desprender o precipitado espalhado pela parede do tubo e novamente centrifugado durante 1 minuto.

Os oligonucleótidos não purificados tendo a sequência CTCTAAAG e CTTTAGAGCACA foram dissolvidos numa concentração de 1 mg/ml, MgS04 foi adicionado para 10 mM e o DNA precipitado pela adição de 5 volumes de EtOH. 0 sedimento foi lavado com EtOH a 68

70% e ressuspenso em TE numa concentração de lmg/ml. 25 μΐ dos oligonucleótidos ressuspensos foram fosforilados pela adição de 3 μΐ de tampão (0,5 M Tris pH 7,5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, espermi- dina, 1 mg/ml BSA e 10 mM MgCl2) e 20 unidades de cinase de polinucleótidos seguido de incubação a 37°C durante a noite.

3 μΐ dos oligonucleótidos 12-meros e 2 μΐ dos oligonucleótidos 8-meros fosforilados foram adicionados ao cDNA preparado como atrás numa mistura de reacção de 300 μΐ contendo 6 mM

I

Tris pH 7,5, 6 mM MgCl2, 5 mM NaCl, 0,35 mg/ml BSA, 7 mM mercap-toetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM espermidina e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (New England Biolabs) a 15°C durante a noite. Adicionou-se 10 μΐ de 0,5M EDTA, a reacção foi extraída com fenol, precipitada com etanol, ressupensa num volume de 100 μΐ e colocada sobre um gradiente de 5 ml de 5-20% de acetato de potássio em lmM EDTA, 1 jug/ml de brometo de etídio. O gradiente foi centrifugado 3 horas a 50000 rpm (rotor SW55) e fraccionado manualmente, colhendo três fracções de aproximadamente 0,5 ml seguido de seis de aproximadamente 0,25 ml em microtubos por meio de um sistema de infusão em borboleta inserido imediatamente abaixo da curva do tubo. Poliacrilamida linear foi adicionada para 20 μg/ml, os tubos foram cheios com etanol, arrefecidos, centrifugados, agitados com vortex e novamente centrifugados como atrás. 0 precipitado foi lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em ΙΟμΙ. 1 μΐ das 6 últimas fracções foi corrido num gel para determinar quais as fracções a reunir e tipicamente rejeitou-se material com menos de 1 Kb de tamanho. As restantes fracções foram reunidas e ligadas ao vector. A sequência completa e derivação do vector estão apresentados na Figura 5. O vector foi preparado para clonagem por digestão com BstXI e fraccionamento num gradiente de 5-20% de acetato de potássio como descrito para o cDNA. A banda adequada 69

foi colhida com uma seringa sob luz UV de 300 nme precipitada com etanol como atrás. cDNA e vector foram titulados em ligações teste. Geralmente 1-2 μg de vector purificado foram usados para o cDNA derivado de 4 /xg de RNA poli A+. As reacções de ligação foram compostas como descrito para adição do adaptador atrás. As reacções de ligação foram usadas para transformar células MC106l/p3 tornadas competentes como descrito atrás. A eficácia de transformação para o vector superenrolado foi de 3-5 x 108 colónias /jug.

Recuperação e caracterização do clone de CD28 "Panning" da biblioteca foi realizado como descrito atrás, usando o anticorpo 9.3 purificado (Dupont) numa concentração de 1 jug/ml na mistura de anticorpos. Os métodos usados para a transfecção de células COS, radioimunoprecipitação, hibridação de transferências de RNA e DNA e seguenciação de DNA foram todas como descrito atrás.

Para isolar o cDNA de CD28, construiu-se uma biblioteca grande de cDNA e plasmídeo num vector de elevada eficácia de expressão contendo uma origem de replicação do SV40. Uma versão preferida do vector, contendo uma origem de M13, está apresentada na Figura 6. Três características do vector tornam-no particularmente adequado a este fim: (i) a unidade de transcrição eucarió-tica permite níveis de expressão elevados em células COS de sequências codificadoras colocadas sob o seu controle; (ii)o tamanho pequeno e o arranjo particular das sequências no plasmídeo permitem nível elevado de replicação em células COS; e (iii) a presença de dois sítios idênticos BstXI em orientação invertida e separados por um pequeno fragmento substituível permite a utilização de uma estratégia eficaz baseada em oligonucleótidos para promover a inserção de cDNA no vector. 70

O sítio de clivagem BstXI, CCAN/5NTGG, cria uma extensão 3f de quatro bases que varia de sítio para sítio. Criou-se um

vector em que dois sítios idênticos foram colocados em orientação invertida relativamente um em relação ao outro e separados por um curto segmento de DNA substituível. A digestão com BstXI seguido de remoção do segmento substituível deu uma molécula de vector capaz de se ligar a fragmentos tendo os mesmos extremos do segmento substituível, mas não a si próprio. Paralelamente, oligonucleótidos de cDNA sintético foram empregues dando os mesmos extremos do segmento substituível. 0 cDNA não podendo ser então ligado a si próprio liga-se ao vector. Deste modo o cDNA e o vector foram usados tão eficazmente quanto possível. A colocação de caudas com transferase terminal consegue o mesmo fim, mas com menos conveniência e menos eficácia global. Ainda, os segmentos homopoliméricos situados 5/ relativamente às inserções de cDNA foi descrito como inibindo a expressão in vitro e in vivo (YOkota, T., et al.. Nucl. Acids Res. 14:1511-1524 (1986); Riedel, H.. EMBO J. 3:1477-1483 (1985)). Recentemente

foram descritas abordagens semelhantes baseadas na utilização de sítios de restrição parcialmente preenchidos para favorecer a inserção de DNAs genómicos (Zabarovsky, E.R., et al.. Gene 42:119-123 (1986)) e cDNAs (Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)). Estas abordagens dão extremos de 2 a 3 bases complementares, as quais geralmente se ligam menos eficazmente do que as extensões de 4 bases aqui descritas.

Se bem que o esquema de clonagem do presente invento não resulte numa inserção direcional do cDNA, a capacidade para fazer grandes bibliotecas facilmente, acoplada a um processo de selecção poderos, torna desnecessária a inserção direcional. As eficácias de construção da biblioteca observadas de acordo com o presente invento, entre 0,5 e 2 x 106 recombinantes por μg de 71

mRNA, com menos de 1% de fundo e um tamanho de inserção superior

a 1 Kb, comparou favoravelmente aos descritos para os vectores fágicos lambda gtlO (7f5 x 105//ig de mRNA) e lambda gtll (1,5 x 106^g de mRNA) (Huynh, T., et al.« Em: DNA Cloninq Vol. I. A

Praticai Approach. Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78); mas os clones resultantes foram mais fáceis de manipular.

Os cDNAs de antigénio de superfície podem ser isolados a partir destas bibliotecas usando o método de enriquecimento do presente invento. Neste método, a biblioteca é introduzida em células COS (por exemplo, por fusão de esferoplastos ou de protoplastos), onde se replica e expressa as suas inserções. As células foram colhidas por descolamento sem tripsina, tratadas com anticorpos monoclonais específicos contra os antigénios de superfície pretendidos e distribuídas por placas revestidas com anticorpo contra imunoglobulinas de murganho purificado por afinidade. As células expressando o antigénio de superfície aderem e as restantes células podem removidas por lavagem. A partir das células aderentes preparou-se uma fracção de Hirt (Hirt, B., J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967)) e o DNA resultante foi usado para transformar E. coli para mais ciclos de fusão e selecção. Tipicamente, após dois ciclos de selecção com anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes antigénios de superfície, realiza-se um só ciclo de selecção com um único anticorpo ou conjunto de anticorpos que reconhecem o mesmo antigénio.

Isolamento de um cDNA de CD28 0 cDNA de CD28 foi isolado a partir de uma biblioteca de aproximadamente 3 x 105 recombinantes preparados a partir de cDNA derivado de 0,8 gg de RNA poli A+ usando uma versão anterior do protocolo descrito nos Materiais e Métodos. A biblioteca foi 72

despistada relativamente a clones de cDNA de CD28 (e outro antigénio de superfície) pelo método descrito atrás. Após a terceira transfecção, as células COS foram "panned" com o anticorpo 9.3 sozinho. Preparou-se um sobrenadante de Hirt a partir de células aderentes e usou-se para transformar E. coli. 0 DNA de _ plasmídeo foi isolado a partir de oito colónias e usado para transfectar individualmente culturas de células COS. A presença do antigénio CD28 foi detectada em três de oito culturas trans-fectadas por imunofluorescência indirecta. Os três DNAs de plasmídeo continham uma inserção de aproximadamente 1,5 Kb.

I

Análise da sequência de cDNA

I O cDNA de CD28 codifica uma grelha de leitura aberta grande de 220 resíduos tendo as características típicas de uma proteína de membrana integral (Figura 17). A remoção de uma sequência sinal N-terminal prevista dá uma proteína madura de 202 resíduos compreendendo um domínio extracelular com cinco potenciais sítios de glicosilação ligados em N (Asn-X-Ser/Tre), um domínio hidrofóbico que atravessa a membrana de 27 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 41 aminoácidos. Comparação da sequência de aminoácidos de CD28 com a base de dados da National Biomedical Research Foundation (Versão 10.0) revelou homologia substancial com as regiões variáveis da cadeia pesada de imuno-globulina num domínio que abrange quase toda a fracção extracelular de CD28. Dentro deste domínio dois resíduos císteina nos blocos de homologia Leu-(Ser ou Tre)-Cis e Tir-(Tir ou Fen)-Cis são partilhados por CD28, CD4, CD8 e sequências variáveis de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina e moléculas relacionadas com aproximadamente o mesmo espaço (Maddon et al.. Annu. Rev. Biochem. 48:961-997 (1979)). 73

cDNA de CD28 dirige a produção de um homodimero em células COS transfectadas

A imunoprecipitação do antigénio CD28 a partir de células COS transfectadas foi realizada usando o anticorpo monoclonal 9.3 (Hansen, J.A., et al.. Immunoaenetics 10:247-260 (1980)). o material obtido a partir de células COS migrou com um peso molecular de 74 Kd em condições não redutoras e 39 Kd em condições redutoras, um padrão consistente com a formação de homodímeros. Nas mesmas condições células T activadas dão bandas com pesos moleculares de 87 e 44 Kd, e células HPB-ALL dão bandas de 92 e 50 Kd, em condições não redutoras e redutoras respectiva-mente. A variação no peso molecular do material obtido a partir de diferentes tipos celulares surge devido a um resultado de diferentes padrões de glicosilação característico de cada um dos tipos. Resultados semelhantes foram observados com outros antigé-nios de superfície de leucócitos (Seed et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1987)). A sequência de nucleótidos do cDNA de CD28 prevê uma proteína madura com peso molecular de 23 Kd, muito mais pequeno do que observado nestas experiências e provavelmente atribuído à utilização dos sítio de glicosilação ligados em N previsto pela sequência de aminoácidos.

Análise de transferências de RNA

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares que expressam ou não CD28 foram sujeitas a análise de transferências de DNA como descrito atrás. Quatro bandas com pesos moleculares de 3,7, 3,5, 1,5 e 1,3 Kb foram visíveis nas faixas contendo RNA de timócitos, blastócitos T células T senescentes e as linhas celulares de elucemia de cálulas T PEER e HPB-ALL. Não foram detectadas bandas nas faixas contendo RNA preparado a partir das linhas celulares U937 74

(leucemia histiocitica), HuT-78 (Leucemia de células T de adulto) , Jurkata (leucemia de células T), Namalwa (linfoma de Burkitt), M0LT4 e HSB-2, todas elas não expressam CD28. 0 produto da transcrição de 1,5 Kb presumivelmente corresponde ao cDNA isolado e as espécies de 3,7 e 3,5 Kb refletem "splicing" incompleto ou utilização de sítios de poliadenilação alternativos. 0 produto de transcrição de 1,3 Kb pode terminar num sinal de poliadenilação não convencional, uma vez que não existe candidato obvio na sequência.

0 gene de CD28 não está rearraniado

A análise das transferências de DNA (Seed, et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1987)) de DNA genómico derivado de placenta, linfócitos do sangue periférico, células T, células HeLa ou das linhas tumorais usadas na análise de transferências de RNA atrás mostrou padrões de digestão Dral idênticos indicando que o rearranjo não está envolvido na expressão normal do gene CD28 durante o desenvolvimento. De forma semelhante não parece haver grandes rearranjos genómicos que suportem a ausência de expressão do antigénio CD28 nas linhas tumorais das células T examinadas. Pode-se deduzir do padrão de fragmentos Dral que o gene CD28 contem pelo menos dois intrões.

Exemolo IV Isolamento e Clonaoem Molecular de dois cDNAs de Antigénio CD7 Humano 0 conjunto de anticorpos contra CD7 (Palker, et al.. Leukocvte Tvoing II. Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985)) reconheceu uma glicoproteina de 40 Kd (gp40) na superfície de células T do sangue periférico e timócitos. Estudos preliminares com anticorpos anti-CD7 mostraram que as células T CD7+ aumentam a síntese de imunoglobulina (Ig) pelas células B (Miroshima et 75

I

al.. J. Immunol. 129:1091-1098 (1982)), suprimem a síntese de Ig pelas células Bquando estimuladas com concanavalina A (Haynes et al.. Proc. Natl. Acad. sei. U.S.A. 76:5829-5833 (1979)) e são precursores das células T citotóxicas geradas na cultura de linfócitos mistos (Morishima et al.. J. Immunol. 129:1091-1098 (1982)). Ainda, CD7 foi encontrado como sendo a marca mais reprodutível para a identificação de leucemia linfoblástica aguda de células T (Link et al.. Blood 62:722-728 (1983)). Como tal, foram realizados estudos em que as citotoxinas acopladas ao anticorpo 3A1 anti-CD7 foram usadas para purgar a medula óssea antes da reinfusão para evitar reincidência precoce em transplantes autólogos de medula óssea ou como profiláxia contra enxerto vs. doença do hospedeiro em transplantes alogeneicos de medula óssea (Ramakrishnan et al♦. J. Immunol. 135:3616-3622 (1985)). De forma semelhante anticorpos anti-CD7 também se mostraram promissores como agentes imuno-supressores no tratamento de rejeições de alo-enxertos (Raftery et al.. Transo!. Proc. 17:2737-2739 (1985)) o que está de acordo com a observação recente de que o anticorpo 7G5 anti-CD7 inibe significativamente a reacção primária de linfócitos mistos (Lazarovits et al.. Leukocvte Τνοίηα III. Oxford Univ. Press. Oxford (1987)).

Presentemente não está compreendido o papel fisiológico de CD7. Sabe-se que os anticorpos anti-CD7 não são mitogénicos e que não bloqueiam a resposta de células T a PHA, ou toxóide do tétano (Palker et al.. Leukocyte Tvpincr. Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985)). Alguns autores observaram que a expressão de CD7 em timócitos ocorre antes do etabelecimento do rearranjo da cadeia beta do receptor das células T (Pittaluga et al.. Blood 68:134-139 (1986)) e apontam para um possível papel de CD7 neste rearranjo e subsequente expressão do receptor de células T. É claro que a clonagem do antigénio CD7 facilitará a compreensão do seu papel na fisiologia das células T. Sequenciação de 76

nucleótidos e caracterização preliminar de dois cDNAs codificadores do antigénio CD7 foram efectuadas de acordo com o método do presente invento. Levados pela recente sugestão de que CD7 pode ser ou ser parte do receptor de IgM das células T (andrin et al.. Leukocyte Tvoinq III. Oxford Univ. Press. Oxford (1987)), foi avaliada a capacidade de células COS expressando CD7 para se ligarem a IgM ou a complexos imunes de IgM. Os resultados não suportam a simples noção de que CD7 seja ele próprio um receptor de IgM.

Preparação duma biblioteca de cDNA e recuperação e caracterização de clones de CD7 A preparação de uma biblioteca de de cDNA em HPB-ALL no vector de expressão piH3 foi realizado como descrito atrás. "Panning" da biblioteca foi realizado de acordo com o método do presente invento, usando o anticorpo purificado Leu9 anti-CD7 (Bencton Dickinson) e o anticorpo 7G5 como fluido de ascites foi diluido a 1/1000. Métodos para transfecção de células, radioimu-noprecipitação, hibridação de transferências de DNA e de RNA e sequenciação de DNA foram todos já aqui descritos.

Liaacão de IgM e IaG pelas células COS transfectadas com CD7 e CDw32

Anticorpos IgM, IgG e IgA humanos, anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas humanas (anti-Ig(G+M+A)) purificados e conjugados com FITC, eritrócitos bovinos lavados e preservados e fracções IgG e IgM de anticorpos de coelho anti-eritrócitos bovinos foram adquiridos â Cooper Biomedical (Malverne, PA). Células COS foram transfectadas pelo método do DEAE-dextrano com cDNAs codificadores dos antigénios de superfície CD7, CDw32 e CD28. 48 horas após transfecção as células foram lavadas com 77

PBS/0,5% BSA e incubadas com anticorpos IgM, IgG ou IgA numa concentração de jug/ml a 4°C durante 2 horas. Subseguentemente as células foram lavadas com PBS/0,5% BSA e incubadas durante 30 minutos a 4°C com anticorpos de coelho anti-imunoglobulinas humanas conjugados com FITC a 4°C. Após lavagem as células foram examinadas com um microscópio de fluorescência. As experiências foram também realizadas na presença de 0,1% de azida com os mesmos resultados.

Os eritrócitos bovinos para os ensaios de rosetas foram preparados como descrito por Ercolani et al.. J. Immunol. 127;2044-2051 (1981). Resumidamente, uma suspensão a 2% de eritrócitos bovinos foi lavada com PBS/0,5% BSA e tratada com quantidades subaglutinantes da fracção de IgG ou de IgM dos dos anticorpos de coelho anti-eritrócitos bovinos a 4°C durante 1 hora. Os eritrócitos foram então lavados duas vezes com PBS/0,5% BSA e ajustados a uma solução de 2%. 2 ml de eritrócitos revestidos com anticorpos foram colocados em placas de 60 mm contendo células COS que foram transfectados 48 horas antes com CD7, CD32 ou CD28 pelo método do DEAE-dextrano. As placas foram então centrifugadas a 150xg a 4°C durante 15 minutos. Após mais 45 minutos de incubação a 4°C, as placas foram suavemente lavadas 5 vezes com 5 ml de PBS/0,5% BSA e as células COS foram examinadas quanto à formação de rosetas. Estas experiências foram também realizadas na presença de 0,1% de azida de sódio sem alteração dos resultados.

Formação de rosetas de células T com eritrócitos revestidos com anticorpos

Os linfócitos de sangue periférico foram obtidos a partir de sangue heparinizado por centrifugação a 4°C sobre um 78

gradiente de Ficoll-Hypaque a 400xg durante 30 minutos. Os leucócitos na interface foram lavados duas vezes com PBS. Os leucócitos foram ajustados a 10xl07 células/ml em IMDM/10% Soro

Fetal Bovino (FBS) e incubados em placas de cultura de tecidos a 37°C durante 30 minutos. As células não aderentes foram transferidas para novas placas e o PHA foi adicionado para estimular a proliferação de linfócitos T. No dia seguinte as células foram lavadas com PBS e colocadas em IMDM fresco/10%FBS.

Realizaram-se ensaios de foramção de rosetas três dias mais tarde. As células foram lavadas com PBS/0,5% BSA e uma suspensão de 10 μΐ de 2% eritrócitos revestidos com Ig preparados como descrito atrás adicionada a 10 μΐ de PBS/0,5% BSA contendo 5xl06 células/ml. As misturas foram colocadas em placas de 96 cavidades de fundo redondo Falcon e centrifugadas a 150 xg durante 15 minutos a 4°C. Após uma incubação adicional de 45 minutos a 4°C os sedimentos foram ressuspensos com 10 μΐ de PBS/0,5% BSA e as rosetas contadas em microscopia de contraste de fase. As experiências foram realizadas na presença e na ausência de 0,1% de azida de sódio sem diferença detectável.

Isolamento de cDNAs codificadores do anticénio CD7 humano

Para isolar os cDNAs de CD7 construiu-se uma biblioteca grande em plasmídeo no vector de expressão π3Μ como descrito atrás. A biblioteca foi introduzida em células COS por fusão de esferoplastos e deixada a replicar e exprimir as suas inserções. As células COS foram colhidas por descolamento sem tripsina 48 a 72 horas após transfecção, tratadas com anticorpos monoclonais específicos de antigénios de superfície para antigénios de superfície que se pensa serem codificadas com anticorpos anti--murganho purificados por afinidade como aqui descrito. Nestas condições as células que expressam o antigénio de superfície aderem e as restantes células podem removidas por lavagem.

Preparou-se uma fracção de Hirt (Hirt, J. Mol. Biol. 26.:365-369 (1967)) foi preparada a partir de células aderentes e o DNA resultante foi usado para transformar E. coli para mais ciclos de fusão e selecção. No terceiro ciclo de selecção as células descoladas foram tratadas com uma mistura de anticorpos monoclonais específicos para CD7 (765 e Leu9) e um sobrenadante de Hirt foi novamente gerado e usado para transformar E. coli. Após transformação de E. coli com o DNA picaram-se 8 colónias e o DNA de plasmídeo preparado a partir delas por um processo de minipreparação alcalina (Maniatis, et al.. Molecular Cloninc: A laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, New York (1982)). Preparou-se DNA a partir de 8 colónias resultantes e usou-se para transfectar células COS. Após 3 dias detectou-se a expressão na superfície do antigénio CD7 por imunofluorescência indirecta em 7 de 8 placas transfectadas. A digestão com enzimas de restrição dos DNAs de plasmídeos correspondentes revelou duas espécies. Uma continha uma inserção de de 1,2 Kb e a outra uma inserção de 1,3Kb.

Análise da sequência de cDNA de CD7

Ambos os isolados foram sequenciados pelo método de didesoxinucleótidos. 0 cDNA de 1,2 Kb codifica uma grelha de leitura aberta de 240 resíduos tendo as características típicas de uma proteína de membrana integral. A localização inicial do sítio de clivagem da sequência sinal pelo método de von Heijne ÍNucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) foi no 182 resíduo. No entanto, mais tarde determinou-se que a homologia com as regiões variáveis das imunoglobulinas prevê o extremo maduro no resíduo 26; esta localização também está de acordo com a posição do 80

Λ

intrão como discutido abaixo na Figura 8. A remoção da sequência sinal N-terminal prevista dá uma proteína madura de 215 resíduos com um peso molecular previsto de 23 Kd. No domínio extracelular estão dois sítios de glicosilação ligados em N (Asn-X-Ser Tre), de acordo com os resultados de Sutherland et al. (J. Immunol. 133:327-333 (1984)), que também mostraram a presença de glicanos ligados em o e ácido palmítico ligado covalentemente na proteína madura. No domínio hidrofóbico de 27 aminoácidos que atravessam a membrana está um único resíduo císteina que pode ser o sítio de acilação com ácidos gordos (Rose et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:2050-2054 (1984); Kaufman et al.. J. Biol. Chem. 259:7230-7238 (1984)). 0 comprimento do domínio citoplasmático, 39 resíduos, está de acordo com os 30-40 aminoácidos previsto por digestão com protease do precursor de CD7 nas fraeções de membranas micorssomais com ribossomas (Sutherland et al.. J. Immunol. 131:327-333 (1984)). A análise da sequência do clone de 1,7 Kb (Figura 8) revelou a presença de um intrão situado a 121 pb do extremo 5/. 0

intrão de 411 pb contem codões de paragem nas três grelhas de leitura abertas e está situado imediatamente a jusante da sequência sinal secretora, como é frequentemente observado para as proteínas secretadas e de superfície. Ambos os extremos 5/ e 3t do intrão estão de acordo com o sítio consensus dador/aceitador de "splicing" AAG GTRAGA/.../Yg-nNYAG A (Mount, Nucl. Acids Res. 10:459-472 (1982)). Devido aos clones de 1,2 e 1,7 Kb expressarem o antigénio CD7 igualmente bem em células COS, o intrão deve ser removido em células COS de forma pouco eficaz. A comparação da sequência de aminoácidos com a base de dados da National Biomedical Research Foundation revelou homolo-gia substancial com a cadeia kapa de imunoglobulina humana e de murganho e com as regiões variáveis da cadeia gama do receptor de 81

1

células T em quase todo o segmento extracelular da molécula. Dois resíduos císteina partilhados com espaços aproximadamente iguais pelas três estruturas caem nas sequências conservadas Ile-Tre-Cis e Tir-X-Cis. Nas regiões variáveis da cadeia kapa estas císteinas formam um ponte dissulfureto. A presença de pelo menos uma ponte dissulfureto intracadeia na estrutura CD7 foi anteriormente proposto por Sutherland et al.. (J. Immunol. 133:327-333 (1984)), que observaram que a imunoprecipitação de CD7 dá origem a uma-banda com um peso molecular aparente de 40 Kd em condições redutoras e 38 Kd em condições não redutoras.

Com base na homologia com regiões V de imunoglobulina prevê-se que CD7 contenha uma ligação dissulfureto ligando Cis 23 e Cis 89. Uma segunda ponte dissulfureto, ligando Cis 10 e Cis 117 foi proposta com base na semelhança estrutural entre CD7 e Thy-1. Os domínios extracelulares de Thy-1 e CD7 têm 4 resíduos de císteina, em posições praticamente homólogas. Os 4 resíduos de císteina de Thy-1 estão ligados em duas pontes dissulfuretos internas entre Cis 9-111 e Cis 19-85 (Williams et al.. Science 216:696-703 (1982)). Em Thy-1, Cis 111 forma uma ligação amida com a fracção etanolamina de fosfatidilinositol substituído e é portanto o último resíduo da molécula madura (Tse et al.. Science 230:1003-1008 (1985)). Em CD7, Cis 117 é seguido de quatro repetições de uma sequência cujo consensus é Xaa-Pro-Pro-Xaa-Ala--Ser-Ala-Leu-Pro e que é proposto que desempenhe o papel de um pedúnculo projectando o domínio tipo V para fora da superfície celular.

Para além das homologias apresentadas na Figura 20 e referidas atrás, o domínio extracelular de CD7 tem homologia significativa com ambas as cadeias do heterodímero de CD8 de rato (Johnson et al.. Nature 323:74-76 (1986)) e a proteína P0 da mielina (Lemke et al.. Cell 40:501-508 (1985)). CD7 dirige a produção de uma proteína de 40 Kd nas células COS transfectadas A imunoprecipitação do antigénio CD7 a partir de células COS transfectadas foi realizada como aqui descrito usando o anticorpo monoclonal 7G5 (Lazarovits et al.. Leukocvte Tvping III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987). O material obtido a partir de células COS migrou como uma banda larga com peso molecular de 40 Kd em condições redutoras. Nas mesmas condições células HPB-ALL (a linha dadora de cDNA) e células T activadas deram bandas com pesos moleculares de 41 e 39 Kd respectivamente. Tanto nas células COS como nas células HPB-ALLfoi também observada uma banda fraca com peso molecular de 30 τd, possivelmente correspondendo a um precursor parcialmente glicosilado (Sutherland, D.R., et al.. J. Immunol. 133:327-333 (1984)).

Análise de transferências de RNA

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares expressando ou não tendo CD7 foram sujeitas a análise de transferências Northern como aqui descrito. Uma única espécie de 1,3 Kb foi visível nas faixas contendo RNA de timóci-tos, células T activadas, células T em repouso e de linhas de leucémias de células T, HuT-78, HPB-ALL, Jurkat J3R7, HSB-2 e PEER. Com excepção da linha de células PEER, nenhum dos tumores de células T apresentou sobre-expressão significativa dos transcritos CD7. 0 RNA de CD7 foi detectado em todas as células derivadas do timo, mas não em RNA de células U937 (leucemia histiocítica) e Namalwa (Linfoma de Burkitt). Não se detectou qualquer banda correspondendo ao cDNA de 1,7 Kb, sugerindo que esta espécie é artificialmente enriquecida durante o processo de clonagem ou de amplificação da biblioteca. 83

» O enriquecimento durante a amplificação parece improvável pois o clone de cDNA de 12 Kb propaga-se tão bem em E. coli como o clone 1.7 Kb. No entanto, imediatamente a montante e a jusante do sítio da inserção do intrão estão sequências que poderão formar um estrutura em pé e ansa interrompida. Oito dos 10 pares de bases do potencial pé são pares GC, talvez dando a estrutura estabilidade suficiente para interferir com a elongação da primeira cadeia de cDNA. A presença do intrão separa grandemente as duas metades do pé, potencialmente eliminando a estrutura através de uma entropia de ansa desfavorável e permitindo a síntese eficaz de uma primeira cadeia. O gene CD7 não é rearraniado A análise de transferências Southern do DNA genómico derivado de placenta, linfócitos de sangue periférico, células T, células HeLa ou as linhas de células tumorais usadas na análise de transferências de RNA atrás mostrou padrões idênticos de digestão com Dral. Assim, o gene CD7 não é grandemente alterado durante o desenvolvimento e o nível elevado de expressão na linha celular PEER não é a consequência de um rearranjo genómico substancial.

J

Células COS expressando CD7 não se ligam a IoM

Os linfócitos T humanos do sangue periférico expressam receptores de anticorpos IgM (FcRu: Moretta et al.. Eur. J. Immunol. 5:565-569 (1975); McConnell et al.. islmmunol. 30:835--837 (1976)). Recentemente foi descrito que CD7 deve desempenhar um papel na ligação de IgM a células T (Sandrin et al.. Leukocvte

Tvninq III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)). As células L, normalmente CD7” e FcRu~, tornam-se CD7+e FcRu+ quando transfectadas com um fragmento genómico de 16 Kb 84

codificador do antigénio CD7 (Sandrin et al.. Leukocvte Tvpinq III.. Oxford Ubniversity Press, editor, Oxford, England (1987)). Ainda, a ligação de IgM a células CD7 positivas pode ser bloqueada pelo anticorpos monclonal anti-CD7 Hully-m2 (Thurlow et al.. Transolantation 38:143-147 (1984)) e as colunas de IgM ligam uma proteína de 37 Kd derivada de lisados marcados radioactivamente de linfócitos T de sangue periférico (Sandrin et al.. Leukocvte Tvpinq III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)).

Assim, células COS expressando CD7 foram testadas relativamente à sua capacidade para ligar IgM. A actividade de receptor de IgM foi ensaiada por ligação directa (Hardin et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:912-914 (1979)) ou por um ensaio de rosetas com eritrócitos de boi revestidos com uma fraeção de IgM de soro de coelho anti-eritrócitos bovinos como descrito por Ercolani et al.. J. Immunol. 127:2044-2051 (1981)). As células expressando CD7 não se ligam a IgM humano nem forma rosetas com eritrócitos revestidos com IgM. Nas mesmas condições, as células COS transfectadas com um cDNA codificador do receptor CDw32 de IgG humana liga-se directamente a IgG e forma rosetas com eritrócitos revestidos com IgG. Os eritrócitos revestidos com anticorpos IgM ou IgG também aderem a uma fraeção de linfócitos periféricos como descrito (Moretta et al.r Eur. J. Immunol. 5:565.569 (1975).

Estes resultados não apoiam a noção de que o antigénio CD7 seja por si só um receptor de IgM, se bem que eles não excluam a possibilidade de as células COS suprimirem a actividade de ligação de IgM de alguma forma ou que CD7 seja parte do receptor de IgM ou modificado para o ser. Que CD7 não é por si só um receptor de IgM é apoiado pela observação de que uma série de linhas de células T CD7+ são FcRu- (Sandrin et al.f Leukocvte

Tvpinq III Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)).

Exemplo V

Isolamento e Clonacrem Molecular do Anticrénio CDw32 Humano

Um cDNA codificador do antigénio CDw32 humano, um

receptor humano dos domínios constantes da imunoglobulina G (receptor Fc), foi isolado pelo método do presente invento, devido â sua afinidade para o seu ligando, igG. A sequência do clone isolado está estreitamente relacionada com o receptor Fc beta murino, mas diverge completamente na fracção codificador do

domínio citoplasmático. 0 receptor expresso em células COS apresentou uma preferência para IgGi entre os subtipos de IgG e nenhuma afinidade para IgM, IgA ou IgE.

Para isolar o clone do receptor Fc, preparam-se bibliotecas de cDNA a partir de linhas de células tumorais ou a partir de um tumor humano e transfectaram-se células COS. Após 48 horas, as células foram tratadas com anticorpos IgG de murganho ou humanos e deixadas em repouso nas placas revestidas com anticorpos de carneiro anti-IgG de murganho ou com anticorpos de cabra anti-IgG humana purificadas por afinidade. Após lise, recuperação de DNA e transformação de E. coli. o ciclo foi repetido durante mais duas vezes. Se bem que não tenham sido isolados clones positivos a partir das bibliotecas de linhas tumorais, um clone de cDNA codificador de um receptor Fc foi isolado a partir de uma biblioteca preparada a partir de um tumor adrenal humano. Desco-briu-se que muitos tumores estão altamente infiltrados por macrófagos e linfócitos. Assim,, o RNA tumoral pode ser uma boa fonte em geral para transcritos de macrófagos humanos.

Por ensaio de imunofluorescência indirecta, o receptor humano expresso em células COS ligou todas as IgGs de murganho e humanas com afinidade relativamente baixalO”7M) e observou-se uma discriminação clara entre anticorpos humanos para IgGi· IgM,

IgAi, IgA2 e IgE humanas não se ligam nem tal acontece com IgM ou IgA murina. Conforme esperado Fc humano mas não os fragmentos Fab ligaram-se âs células transfectadas. Entre os anticorpos monoclo-nais apresentados ao Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens, três deram forte imunofluorescência positiva: dois (de entre dois) reconhecendo o determinante CDw32 do receptor Fc e um (de entre quatro) reconhecendo o determinante CD23 (receptor Fc de IgE em células B). Os monoclonais que reconhecem o antigénio CD16 do receptor Fc de células T/macrófa-gos deu apenas uma imunofluorescência fraca comparável com a mostrada pelas ascites testemunha. A radio-imunoprecipitação de células cos transfectadas com anticorpos Cdw32 mostrou a presença de uma única espécie de 40 Kd, comparável em tamanho com o antigénio reconhecido na superfície da linha mielóide CDw32+ HL-60 e com o antigénio menos abundante presente na linha leucémica histiocítica U937. Este resultado reforça a noção de que o receptor isolado é CDw32, pois o receptor CD16 está descrito como sendo substancialmente maior (60-70 Kd). A sequência de nucleótidos do receptor isolado (Figura 9) é altamente homóloga da dos membros da família recentemente isolada de receptores murinos e mais estreitamente relacionada com o receptor beta2 murino por homologia de ácidos nucleicos. Surpreendentemente, o receptor beta2 murino é encontrado em linfócitos B e T e macrófagos; no sistema humano, CDw32 (mostrado aqui como sendo do tipo beta2) está restringido a macrófagos enquanto um outro receptor Fc (CD16) é encontrado linfócitos e macrófagos. A sequência humana parece ter divergido da sequência de murganho pela inserção de aproximadamente 1 Kb de DNA algumas bases 3/ relativamente à junção entre os domínios transmembranar e citoplasmático. As junções do sítio de inserção não mostram 87

relações óbvias com sequências dadoras e aceitadoras de "splicing". A comparação das sequências peptídicas humana e murina mostraram que a sequência peptídica diverge no final do domínio transmembranar, antes da sequência de nucleõtidos divergir sugerindo a existência de uma pressão selectiva favorecendo a criação de um domínio citoplasmático diferente.

A análise de transferências de RNA mostrou que linhas mielóides mas não linhas celulares linfocíticas expressavam RNA homólogo da sonda CDw32. A análise de transferências de DNA mostrou múltiplas bandas consistentes com a existência de uma pequena família de multigenes.

Exemplo VI Isolamento e Clonaaem Molecular de Dois Clones de cDNA Codificadores do Antiaénio CD20 Específico de LinfÓcitOS B f Bl, Bp35)

Estudos recentes sugerem que o antigénio CD20 das células B (Bl, Bp35) desempenha um papel importante na activação de células B. Os anticorpos monoclonais (mAb) contra CD20 induzem diferentes respostas celulares dependendo do anticorpo usado e da fase de diferenciação ou activação das células B alvo. 0 anticorpo monoclonal 1F5 activa as células B em repouso através da iniciação da transcrição da fase Gq para a fase do ciclo celular e induz a proliferação de células B densas das amígdalas (Clark et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1766 (1985); Clark e Shu, J. Immunol. 138:720 (1987)). No entanto, 1F5 não induz um aumento no cálcio citoplasmático livre e não induz a proliferação de células B circulantes (Rabinovitch et al. . Em: Leukocvte Typino III (McMichael, Ed.), p. 435, Oxford University Press (1987)). Encontrou-se que outros mAbs anti-CD20, como seja Bl, bloqueiam a activação das células B (Tedder et al.. J. Immunol. 135:973 (1985)) e tanto 1F5 como Bl podem inibir a diferenciação 88

de células B (Golay et al.. J. Immunol. 135:3795 (1985)). Recentemente foi sugerido que a fosforilação e internalização de CD20 podem ser passos necessário para a entrada das células B na fase

Gi do ciclo celular (Valentine, Ed.)# Em: Leukocyte Tvpincr III p.440, Oxford University Press (1987)). No presente exemplo, dois clones de cDNA de CD20 foram isolados e expressos usando os métodos do presente invento.

Preparação da biblioteca de cDNA e recuperação de clones de cDNA por "panninq'1

Preparou-se RNA poli (A)+ a partir da linha celular humana Daudi de Burkitt por cromatografia em oligo (dT) celulose de RNA total isolado por processos aqui descritos. A preparação de cDNA e a construção da biblioteca de expressão foram realizadas como descrito.

Os anticorpos anti CD20 1F5, 2H7, Bl, L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl e NU-B2 foram adquiridos â International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al.. Em: Leukocyte Tvpinq III (McMichael, Ed.), p. 440, Oxford University Press (1987)). Os mAbs purificados foram usados numa diluição de 1:1000. Fez-se "panning" de acordo com o presente método. No primeiro ciclo de despiste, oito placas de 10 cm de células COS 50% confluentes foram transfectadas pelo método do DEAE-Dextran. Realizaram-se ciclos de despistes subsequentes por fusão de esferoplastos.

Imunoprecipitacão. Seauenciacão. Hibridacão de Transferências de RNA e DNA

Linhas de células B CESS e Daudi foram marcadas metabo-licamente com 35S-metionina e 35-císteina durante 6 horas a 89

37°C. Células COS transfectadas pelo método de DEAE-Dextran foram marcadas de forma semelhante 36 horas pós-infecção. As células marcadas foram incubadas com o mAb BI (Coulter) a 4°C durante 1 hora, lavadas em PBS e lisadas com 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 0,05% desoxicolato e 1 mM PMSF em PBS. Após centrifugação (13000xg, 5 min.), o lisado foi incubado com células S♦ aureus (Calbiochem) durante 1 hora a 4°C. As células S. aureus foramsedimentadas, lavadas 5 vezes com 1% NP-40/PBS, eluidas e sujeitas a electro-forese através de géis de 12,5% de poliacrilamida.

A análise de transferências de DNA e RNA e a preparação de sondas de hibridação foram realizadas como descrito. A sequen-ciação foi feita pelo método de Sanger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977)). A sequência de nucleótidos do cDNA de CD20.4 está representada na Figura 10.

Dois clones de cDNA, portadores de inserções de 1,5 (CD20.4) e 1,0 Kb (CD20.6), foram isolados a partir de uma biblioteca de DNA de células Daudi por "panning” com um painel de mAbs contra CD20. As células COS transfectadas com qualquer um dos clones reagiu com todos os membros do apinel de anticorpos. A imunoprecipitação de proteína codificada por cDNA a partir de células COS transfectadas mostrou duas bandas de 32 e 30 Kd reminiscentes das bandas de 37 e 35 Kd observadas em diferentes sub-séries e linhas de células B (Valentine et al.. "Structure and Function of the B Cell Specific 35-37 KDa CD20 Protein" Em: Leukocvte Tvpinq III (McMichael, Ed.), p. 440, Oxford University Press (1987)). Foi observado pelos presente inventores que os pesos moleculares dos antigénios de superfície expressos em células COS são consistentemente mais pequenos do que as suas contrapartes nativas. Isto pode ser devido a diferenças na glicosilação. 90

Ambos os clones de cDNA têm a mesma sequência codificadora e diferem apenas na região 3/ não traduzida. A inserção no clone CD20.6 tem uma pequena cauda poli A e não possui um sinal de poliadenilação consensus, enquanto que a inserção em CD20.4 não possui uma cauda poliA e estende-se 431 pb para lá do extremo 3/ em CD20.6 (Fig. 10A).

A análise de transferências de RNA mostrou que três transcritos de 3,8, 3,0 e 1,5 Kb estavam presentes em células B mas ausentes de outros tipos celulares, de acordo com o padrão conhecido de reactividade de anticorpos (Clark et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82.:1766 (1985); Clark et al.. J. Immunol. 138:720 (1987); Tedder et al.. J. Immunol. 135:973 (1985); Golay et al♦. J. Immunol. 135:3795 (1985)). Parece provável que o clone CD20.6 derive do transcrito de 1,5 Kb ou possivelmente de uma espécie ainda mais pequena, mesmo indetectável. Devido ao clone CD20.4 não possuir uma cauda poli(A)+ presentemente não podemos inferir qual a sua fonte.

A análise de transferências de DNA mostrou que as sequências genómicas CD20 não são rearranjadas durante o desenvolvimento e não são amplificadas nas linhas celulares observadas. Observou-se um polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição numa amostra de DNA obtido a partir de placenta. A sequência de aminoácidos prevista pelo cDNA contem 297 resíduos e tem um peso molecular de 33097 daltons. A sequência contem três segmentos hidrofóbicos principais envolvendo os resíduos 51-103, 117-141 e 183-203 (Fig. 10). Duas outras carac-terísticas notáveis são a ausência de um peptídeo sinal amino--terminal e a presença de um domínio terminal carbonilo altamente carregado. Um anticorpo policlonal anti-CD20 que reconheceu os 18 últimos resíduos do extremo carboxilo reage com lisados de células que expressam CD20 mas não com células intactas, sugerindo que o exteemo carbonilo de CD20 está situado dentro do citoplasma. Uma vez que não existe peptídeo sinal amino-terminal, é provável que o extremo amina seja também intracelular e que a primeira região hidrofóbica actue como um sinal de inserção interna na membrana (Zerial et al.. EMBO J.: 5:1543 (1986)). A primeira região hidrofóbica é composta por 53 resíduos é portanto suficientemente longo para atravessar a membrana duas vezes se organizada como uma hélice alfa. Devido a haver duas regiões hidrofóbicas restantes, a localização intracelular do extremo carbonilo requere que o primeiro domínio hidrofóbico saia da membrana lateralmente. Como alternativa, o anticorpo do extremo carbonilo pode reconhecer apenas epítopos expostos pelo tratamento com detergente permitindo que o extremo carbonilo seja extra-celular e forçando o primeiro domínio hidrofóbico a sair da membrana no lado extracelular. A sequência contem 2 potenciais sítios de N-glicosilação (Asn-Xaa-Ser/Tre, onde Xaa não pode ser Pro (Bause, Biochem. J. 209:331 (1983)) nas posições e 293, mas não se espera que qualquer uma destas seja utilizada se situadas no domínio intracelular da molécula. A diferença no peso molecular entre CD20 expresso em células COS e em células B é provavelmente devido à glicosilação ligada em O, se bem que outras formas de modificação pós-tradução não são excluídas. Se o extremo carbonilo for intracelular, o único domínio extracelular ficaria entre os resíduos 142 e 182. Esta região é rica em resíduos serina e treonina que devem suportar glicosilação ligada em N. A observação de duas espécies de proteínas nas células COS não pode ser explicado pela formação de "splicing" alternado pois a sequência de cDNA não contem quaisquer sinais promissores dadores ou aceitadores de "splicing” (Shapiro et al.. Nucl. Acids Res. 15: 7155 (1987)). Uma diferença na selecção do sítio de glicosilação ou no sítio de iniciação da tradução alternado pode 92

dar origem às duas espécies observadas. A iniciação do primeiro e do segundo ATG dá pseos moleculares de 33,1 e 30,8 Kd respectiva-mente para as proteínas, de acordo com 7s tamanhos observados em células COS. Nem ATG está embebido na sequência consensus proposta por Kozak fNucl. Acids Res. 12:857 (1984)). A utilização de sítios de iniciação alternados foi descrita para várias proteínas (Kozak, Nucl. Acids Res. 12:857 (1984)).

A comparação da sequência peptídica com as sequências da base de dados da National Biomedical Research Foundation não mostrou homologia significativa pelo algoritmo de alinhamento rápido de sequências FASTP. Devido ao grosso da proteína parecer star confinada ao interior da membrana e da célula, parece plausível que que ela possa desempenhar um papel na transdução de sinais de outras proteínas transmembranares para o interior celular. Consistente com este papel está a natureza relativamente hidrofílica das regiões hidrofóbicas que devem permitir as interacções das ligações de hidrogénio com as fracções transmembranares de outras proteínas.

Exemplo VII Isolamento e Clonacrem Molecular de ICAM. uma

Ligando de Adesão de LFA-1

Os contactos celulares específicos de antigénio no sistema imune são fortalecidos pelas interações inespecíficas de antigénio mediadas em parte pelos antigénios associados às funções de linfócitos ou LFA (Springer, T.A., et al.. Annu. Rev. Immunol. 5:175-194 (1987)). O antigénio LFA, um receptor major de células T, células B e granulócitos (Rothlein, R., et al.. Exp. Med, 163:1132-1149 (1987)) está envolvido na formação de conjugados citolíticos, morte das células dependente Pe anticorpos pelas células K e granulócitos e interacções com células T auxiliares. LFA-1 foi colocado na família das intgrinas dos receptores de 93

superfície celular devido à alta semelhança de Sequências entre LFA-1 e as cadeias beta da integrina /Kishimoto, T.K., et al.. Cell 48:681-690 (1987); Hynes, R.O. Cell 48:549-554 (1987)). Os ligandos de adesão da família das integrinas são glicoproteínas portadoras do motivo de sequência Arg-Gli-Asp (RGD), e.g., fibronectina, fibrinogénio, vitronectina e factor de von Willebrand (Ruoslahti, E., et al.. Cell 44;517-518 (1987)). )

Neste Exemplo, a Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-l), um ligando para LFA-1 (Rothlein, R., et al.. J. Immunol. 137:1270-1275 (1986); Dustin, M.L., et al.. J. Immunol. 137:245-254 (1986)), foi clonada de acordo com os métodos do presente invento. ICAM não contem motivos RGD e em vez disso é homóloga da molécula de adesão de células neurais NCAM (Cunningham, B.A., et al. Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al.. EMBO J. 6:907-914 (1987)). As células COS Transfec-tadas com o clone de cDNAde ICAM liga-se a células mielóides por uma inteacção específica que pode ser bloqueada pelso anticorpos monoclonais dirigidos contra LFA-1 ou ICAM-1.

Construiu-se uma biblioteca de cDNA usando RNA preparado a partir de células HL60 induzidas com acetato miristato de forbol PMA). A biblioteca foi usada para transfectar células COS e as células expressando antigénios de superfície foram recuperadas de acordo com os métodos do presente invento por "panning" com os anticorpos monoclonais (mAbs) anti-ICAM 8F5 e 84H10 (McMitchael, A.J., et al.. eds., Leukocvte Tvping III. White Cell Differentiation Anticrens. Oxford University Press (1987)). Recuperou-se DNA epissomal a partir das células "panned" e o ciclo de expressão-"panning" repetido mais 2 vezes para se obter um clone de cDNA designado pICAM-1. 94

Células COS transfectadas com pICAM-1 deram reacções em imunofluorescência de superfície com três anticorpos anti-ICAM-1: 8F5; 84H10; e RR-1. A imunoprecipitação de células COS transfectadas com pICAM-1 com o mAb 84H10 deu uma banda de peso molecular 100 Kd. 30). Uma proteína ligeiramente mais larga de 110 Kd foi precipitada a partir de células HL60 induzidas durante 48 horas com acetato miristato de forbol (PMA), interferão gama (gamalFN), factor de necrose tumoral (TNF), ou interleuquina-1 beta (IL-1 beta), mas estava ausente das células não induzidas. O peso molecular mais pequeno de ICAM-1 expresso em células COS é consistente com os pesos moleculares mais baixos observados para outros antigénios de superfície expressos em células COS.

A análise de transferências de RNA mostrou duas espécies de 3,2 Kb e 1,9 Kb presentes em células HeLa estmuladas com PMA, IFN gama, TNF ou IL-l gama, mas ausente em células não induzidas. Assim, a expressão de ICAM-1 é regulada por uma série de citocinas, aparentemente ao nível da transcrição. Espécies semehantes estão presentes em células B (JY e Raji), células T (blastos Peer e T) e células Assassinas Activadas por Linfoquinas (LAK). A estrutura destes transcritos ICAM-1 e a sua relação com o cDNA de ICAM-1 permanece por estabelecer. A hibridação de transferências de DNA genómico derivado de placenta revelou um padrão consistente com um gene de uma só cópia.

Para investigar se pICAM-1 codifica uma molécula de desão funcional, as células COS expressando ICAM-1 foram testadas relativamente à sua capacidade para se ligar a células HL60. Após 30 minutos a 37°C na presença de Mg2+, as células HL60 aderiram fortemente às células COS exprerssando ICAM, mas não a células transfectadas testemunhas. A especificidade desta adesão foi demonstrada por pré-incubação das células COS expressnado ICAM-1 com o mAb 84H10. Toda a ligação de HL60 foi abolida nestas condições. Um anticorpo monoclonal do mesmo isotipo, W6/32, que reconhece um determinante monomórfico relacionado com HLA-ABC de aproximadamente igual abundância de ICAM-1 nas células COS transfectadas, não teve efeito na adesão. De modo semelhante, a pré-incubação das células HL60 com 84H10 ou W6/32 não inibe a ligação.

Para determinar se LFA-1 estava a actuar como o recep-tor para ICAM-1 neste sistema, células HL60 foram pré-tratadas com anticorpos contra a cadeia beta de LFA-1 (CD18 (McMichael, A.J., et al, eds., Leukocvte Tvpinq III. White Cell Differen-tiation Antiaens. Oxford University Press (1987)) e depois sujeito ao ensaio de ligação. Toda a adesão a células COS que expressam ICAM foi bloqueada. 0 pré-tratamento de células COS com os anticorpos CD18 não teve qualquer efeito na adesão. Isto proporciona evidência directa de que ICAM-1 está de facto a actuar como um ligando de adesão para LFA-1. A sequência da inserção de CDNA de pICAM-1 consiste em 1846 nucleótidos (Figura 11). A sequência peptídica prevista de 532 resíduos tem as características típicas de uma proteína transmembranar incluindo uma sequência sinal putativa, a qual pode ser clivada entre glicina-25 e asparagina-26 (von Heijne, G. Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) e um único domínio de 25 resíduo que atravessa a membrana terminando num domínio citoplas-mático curto altamente carregado. O domínio extracelular contem sete potenciais sítios de glicosilação ligados em N que podem adequadamente explicar a diferença no tamanho entre o precursor desglicosilado (55 Kd) e o produto final (90-115 Kd) (Dustin, M.L., et al. J. Immunol. 137:245-254 (1986)). A utilização diferencial destes sítios de glicosilação putativos pode também explicar o peso molecular heterogénio de ICAM-1 observado em 96

diferente tipos celulares (Dustin, M-L., et ai., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). LFA-l é um membro da família das integrinas dos recep-tores celulares (Kishimoto, T.K., et al.. Cell 48:681-690 (1987); ^ Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987)). O motivo tripeptídico

Arg-Gli-Asp (RGD) é uma caracterísitca comum dos ligandos desta família, e.g., fibronectina, fibrinogénio, vitronectina e factor de von Willebrand e é crucial para a interacção de receptores--ligandos (Ruoslahti, E, et al.. Cell 44:517-518 (1987)). No

P entanto, ICAM-1 não contem motivos RGD, tendo em seu lugar uma única sequência RGE na posição 152. Uma pesquisa na base de dados da National Bioedical Research Foundation (Dayhoff, M.O., et al. Methods Enzvmol. 91:524-545 (1983)) (NBRF) não revelou semelhanças significativas com outras proteínas. No entanto, uma comparação com uma base de dados de um laboratório contendo proteínas de superfície recentemente publicadas revelou uma semelhança surpreendente e significativa entre ICAM-1 e a molécula de adesão de células neurais NCAM-1 (Cunningham, B.A., et al.. Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al.. EMBO J. 6:907-914 (1987)). A avaliação do alinhamento óptimo obtido usando o programa NBRF ALIGN tem 8 desvios padrões acima da média obtida a partir de 500 permutações ao acaso das sequências. A probabilidade da ocorrência espontânea de uma avaliação igual ou superior é de aproximadamente 10“9.

Usando uma base de dados de sequências conhecidas relacionadas com imunoglobulina mostrou-se que ICAM-1 pode ser dividida em cinco domínios Ig (28-112, 115-206, 217-310, 312-391 e 399-477) cada um deles apresenta semelhança significativa com outros membros da superfamília de Ig (Williams, A.F., Immunol. Today 8:298-3-3 (1987)). Por exemplo, o domínio I é semelhante a CD3 enquanto que domínios IV e V são semelhantes aos domínios de glicoproteína associada a mielina (Arguint, M., et al.. Mol. Cell Biol. 7:3221-3232 (1987)). Todos os cinco domínios Ig de NCAM alinham com os segmentos de Ig em ICAM e a contribuição principal para a semelhança vem do domínio II e III de ICAM. Finalmente, a molécula CD2 de adesão específica de células T mostra oratica-mente a mesma semelhança com NCAM que ICAM, mas ICAM e CD2 estão apenas fracamente relacionados. Assim, algum precursor de NCAM é anterior a ICAM e a CD2. A capacidade de um cDNA de ICAM-1 funcional permitirá uma melhor abordagem do papel de adesão mediada por ICAM-l/LFA-1 na função de leucócitos específica de antigénios, incluindo morte mediada por células T, respostas de T auxiliares e morte mediada por células dependentes de anticorpos.

Exemplo VIII Isolamento e Clonagem Molecular dos

Antigénios CD19. CD20. CDw32a. CDw32b e CD40 0 método rápido de clonagem com imuno-selecção do presente invento foi aplicado para isolar e clonar os antigénios CD19, CD20, CDw32b e CD40. A sequência de nucleótidos de CD19 está apresentada na Figura 12. A sequência de nucleótidos de CD20 está apresentado na Figura 13. A sequência de nucleótidos de CDw32a está apresentada na Figura 15. A sequência de nucleótidos de CDw32b está apresentado na Figura 16. A sequência de nucleótidos de CD40 está apresentada na Figura 17.

Exemplo IX Clonagem. Sequência e Expressão de CD36

Para isolar um clone de cDNA codificador de CD36, um cDNA de placenta humana (Simmons e Seed (1988) Nature 333:568--570) foi transferido para células COS usando DEAE-Dextran como facilitador (Exenmplo I, supra). 48 horas pós-transfecção as 98

células foram descoladas das placas sem tripsina, incubadas com os anticorpos monoclonais anti-CD36 5F1 (Bernstein et al. (1982) J. Immunol. 128:876-881) (Andrews et al. (1984) J. Immunol. 128:398-404) foram "panned" em placas revestidas com anticorpos de cabra anti-imunoglobulina de murganho. As células não aderentes foram removidas por lavagem suave, as células aderentes foram lisadas e os plasmídeos epissomais recuperados das células foram purificados e usados para transformar E. coli. Após dois ciclos semelhantes de enriqueimento após fusão de esferoplastos, os DNAs de plasmídeo recuperados a partir de 11 de entre 12 colónias escolhidas ao acaso dirigem o aparecimento de de determinantes CD36 em células COS transfectadas.

Dois dos clones foram escolhidos ao acaso para posterior análise. Ambos são portadores de inserções com cerca de 1,9 Kb e apresentaram padrões de fragmentos de restrição idênticos. As células COS transfectadas com qualquer um destes clones reagiu com os anticorpos monoclonais 5F1 e F13 e com OKM5 (Ortho, Raritan, NJ).A imunoprecipitação de células transfectadas com um conjunto de anticorpos anti-CD36 revelou a presença de uma molécula de 83 rd presente em células COS transfectadas e células d emelanoma C32 e ausente de células COS testemunha (transfectadas com CD25). Uma espécie de alto peso molecular, possivelmente dimérica CD36 foi imunoprecipitadaa partir de lisados de células COS transfectadas mas não a partir do lisado de células C32. A sequência de nucleótidos está apresentada na Tabela 1. Na Tabela 1, a numeração da sequência de nucleótidos está apresentada na margem esquerda no começo de cada linha. A sequência de aminoáci-dos deduzida está apresentada como um código de uma só letra por debaixo do começo de cada tripleto de nucleótidos codificadores, com a metionina de iniciação indicada pelo número 1 acima do codão de iniciação. Os potenciais sítios de glicosilação ligada em N na sequência de aminoácidos derivada estão sublinhados por uma linha a tracejado. O domínio transmembranar putativo está duplamente sublinhado. Se bem que dois motivos consensus de poliadenilação (AATAAA) sejam encontrados no cDNA, não existe cauda poli (A) e nenhuma das espécies de RNA observadas pela hibridação de transferências é suficientemente curta para corresponder a poliadenilação nestes sítios, assumindo que os transcritos são portadores do mesmo extremo 5/ aproximado como observado no clone. 0 codão de iniciação presumido não é o primeiro ATG encontrado no clone, mas os dois anteriores são seguidos de perto por codões de terminação na mesma grelha de leitura. A metionina iniciadora prevista é seguida de uma região hidrofóbica curta semelhante a uma sequência sinal secretora para a qual no entanto não pode ser feita uma identificação clara do sítio de clivagem. A determinação recente da Tabela 1 a sequência de 36 aminoãcidos amino-termina1 (Tandon et al. J. Biol. Chem. 264:7570-7575 (1989)) indica que o polipeptídeo maduro começa no resíduo de aminoácido imediatamente após a metionina iniciadora.

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marcadas na superfície com Na125I e lisadas numa solução tampão de fosfatos salina contendo 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 0,5% NP40 e 0,1% de dodecilsulfato de sódio. Adicionou-se anticorpos monoclonais anti-CD36 e deixou-se adsorver ao lisado durante 12 horas a 4°C, após o que se adicionou esferas revestidas com anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas de murganho (Cappel), misturou-se durante duas horas e lavou-se como descrito (Clark e Einfeld J. Immunol. 135:155-1667 (1986)). Quantidades maiores de proteína podem também ser obtidas na forma purificada a partir de um lisado de células COS transfectadas por uma purificação em coluna de imunoafinidade. Outros anticorpos contra CD36 podem ser obtidos usando a proteína CD36, expressa e/ou purificada como descrito, como imunogénio. CD36 foi identificado como um sítio de ligação para citoaderência de eritrócitos parasitados com Plasmodium falcioarum. pelos presentes inventores e por Ockenhouse, C.D. et al. (1989) Science 243:1469-1741. A cito-adesão de eritrócitos parasitados foi observada como sendo bloqueada pelos anticorpos monoclonais contra CD36. A incubação de eritrócitos infectados com células COS transfectadas com um cDNA de CD36 mostrou cito--aderência pronunciada. Pensa-se que a capacidade dos eritrócitos parasitados com P. falcioarum para se evadirem à sua eliminação no baço através da sua aderência a superfícies vasculares periféricas desempenhe um papel importante na patogenicidade de malária Falcioarum e contribuam para o síndrome letal da malária cerebral causando oclusão dos vasos pequenos no cérebro. Portanto, o cDNA e a proteína purificada do invento são úteis para proporcionarem CD36 purificado suficiente para fazer anticorpos monoclonais terapêuticos. 103

Exemplo X Isolamento e Clonaaem de Três Clones de cDNA

Codificadores de FcRI Específico de Macrófagos

Três clones de cDNA independentes (designados pl35, p90 e p98/X2) codificadores de Fel humano foram isolados pelo método rápido de clonagem com imuno-selecção do presente invento a partir de uma biblioteca de cDNA expressa em células COS. (Ver também Allen, J.M. e Seed B.f Science 243;378-381 (1989)). A biblioteca de cDNA foi construída a partir de RNA poliadenilado obtido a partir de células de um só doente a ser sujeito a terapia de indução com interleuquina extracorporal. A expressão dos três cDNAs em células COS deu origem a ligação a IgG da afinidade adequada e especificidade de subtipo. A análise da sequência de DNA revelou que os cDNAs codificam proteínas de membrana integrais tipo I semelhantes com 3 domínios extracelu-lares de imunoglobulina. O domínio intracelular de p98/X2 diverge do dos outros dois cDNAs. Uma sequência composta dos três cDNAs está apresentada na Tabela 2 com as diferenças nos nucleótidos dos clones p89/X2 ou p90 mostrados respectivamente abaixo ou acima da sequência de pl35. 104 Ο < u < μ.

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Quadro

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105

O tracejado representa intervalos e não estão apresentados resíduos acima ou abaixo onde as sequênicas são iguais. O cDNA de p90 tem a região 5/ não traduzida mais curta, 7 resíduos adicionais entre o motivo de poliadenilação e o segmento poliA e 2 polimorfismos na região codificadora. O cDNA de p98/X2 tem a região 5» não traduzida mais longa, 1 polimorfismo na sequência codificadora e diverge dos outros dois cDNAs no resíduo 1051, tornando-se um padrão complexo de repetições de sequências a montante. 0 clone p98/X2 não possui um sítio de poliadenilação.

A proteína FcRI de cada um dos três clones foi purificada a partir das respectivas linhas de células COS que a expressa, por imuno-adsorção a IgG-agarose. (Ver Stengelin S. et al♦. EMBQ J. 7:1053 (1988)). A electroforese em gel das proteínas purificadas mostrou uma única espécie das células COS pl35 e p90, peso molecular relativo de 70 Kd. As células transfectadas com p98/X2 expressaram uma proteína de 67 Kd. Uma proteína ligeiramente maior de 75 Kd foi adsorvida a partir de promonócitos U937 tratados com interferão gama. 0 peso molecular mais pequeno observado em células COS é consistente com os pesos reduzidos observados na Tabela 2 para outros antigénios de superfície expressos em células COS, ver e.g., Exemplo IX.

As sequências polipeptídicas previstas mostram as características típicas de uma proteína de membrana integral tipo I e incluem uma pequena sequência sinal hidrofóbica, um único domínio hidrofóbico que atravessa a membrana e um domínio cito-plasmático pequeno altamente carregado (Fig. 4). A fracção extracelular contem seis potenciais sítios de glicosilação ligados em N e seis resíduos Cis distribuídos entre três séries de domínios C2 relacionados com Ig.

FcRI é um receptor de alta afinidade para a fracção Fc de IgG, normalmente situado na superfície celular de macrófagos. A capacidade para interferir com tal ligação ou para causar a sua ocorrência noutras superfícies que não sejam as de macrófagos é útil em terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de FcRI e um ligando do receptor será útil para aumentar a potência de anticorpos em terapia.

Exemplo XI Isolamento e Clonaaem de cDNA Codificador do

Antiqénio TLiSA de células T

Um clone de cDNA codificador de TLiSA foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de células T humanas transferida para células cos como descrito e sujeito ao método rápido de clonagem com imuno-selecção do invento. Um anticorpo monoclonal ACT-T-SET TLiSAI (T-Cell Sciences Corp., Cambridge, Massachu-setts) foi usado para detectar células COS transfectadas expressando o cDNA clonado, por imunofluorescência indirecta positiva. 0 plasmídeo positivo continha uma inserção de 1,7 Kb. A proteína TLiSA foi isolada por imunoprecipitação como descrito supra. Exemplo IX. A proteína tem um peso molecular de aproximadamente 50 Kd, conforme medido por electroforese em gel. A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada por terminação de cadeias didesoxi como descrito supra. A sequência de 1714 resíduos está apresentada na Tabela 3, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida apresentada num código de uma só letra sob o primeiro nucleótido de cada tripleto codificador. 0 ATG codificador da presumível metionina iniciadora ê seguido de uma curta região hidrofóbica consistente com sequências sinais secretoras, o sítio de excisão mais provável sendo 19 resíduos dentro da grelha de leitura aberta. O polipeptídeo resultante se 107

não for mais processado possui 317 resíduos com um peso molecular previsto de aproximadamente 36 Kd. O domínio extracelular proposto é seguido de 25 resíduos predominantemente hidrofóbicos correspondendo ao domínio intracelular. (Tabela 3, sublinhado duplo.) A presença de 9 potenciais sítios de glicosilação ligados em N (Tabela 3, linhas a tracejado simples) parece suficiente para justificar a discrepância no peso molecular entre o poli-peptídeo previsto e a espécie de 50 Kd encontrada por imunopre-cipitação.

I 108

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16Θ1 GTGTTGGCAAGATGGCTGCCAACTCTTGGCAATTCATACATCCTTGTTTCTGTCTGGTAGAGAGTTTGCTTCTCAAATGGAGCAAACAAATTTGATTATTTTTTCATTCTTAAATAGGCA TLiSA está envolvido na mediação da diferenciação de células T induzida por IL-2 para formas citolíticas. Os anticorpos contra TLiSA são úteis para prevenir a diferenciação de células T estimulada por IL-2 e para modular os efeitos adversos da IL-2 em terapia.

Exemplo XII Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNA

Codificador do Antiqénio CD22 especifico de Linfócitos B

Para isolar o cDNA de CD22, construiu-se uma biblioteca de expressão a partir da linha ccelular Daudi de linfoma de Burkitt, introduziu-se em células COS pelo método do DEAE-Dextra descrito supra e submeteu-se a três ciclos de "panning" e re-in-trodução em E. coli como descrito em Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987). De 16 plasmídeos selecciona-dos após o terceiro ciclo, dois apresentaram-se positivos para a expressão de CD22 por imunofluorescência indirecta em células COS. Dos cinco epitopos relacionados com açúcares, A, B, C, D e E, reconhecidos pelos anticorpos monoclonais anti-CD22, apenas os epitopos A e D foram expressos em células COS. A imunoprecipitação de CD22 a partir de células COS transfectadas deu uma única banda correspondendo a um peso molecular de 110 Kd, inferior às espécies de 135 Kd obtidas a partir das células Raji de linfoma de Burkitt. A diferença no peso molecular pode estar relacionada com diferenças na glicosi-lação. Uma vez que os epitopos imunogénicos de C22 estão relacionados com açúcares, estas diferenças devem justificar a ausência de epitopos B, C e E. A análise de transferências de KNA revelou a presença de uma espécie principal de RNA de 3 Kb e 4 espécies menos 110

abundantes de 2,6, 2,3, 2,0 e 1,5 Kb em várias linhas de células B. RNA codificador de CD22 não foi encontrado em várias linhas de células T, incluindo células T do sangue periférico, a leucémia de células T Jurkat, as linhas de leucemia mielõide HL60 e U937 e o hepatoma HepG2.

Hibridação de transferências de DNA de placenta deu um padrão simples consistente com um gene de uma única cópis. A análise da sequência de DNA pelo método didesoxi descrito supra mostrou que a inserção de 2107 pb codificava um polipeptídeo de 647 aminoácidos. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos aparecem na Tabela 4.

111

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Quadro 4 (pág.2)

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A metionina inicial é seguida de 18 aminoácidos predominantemente hidrofóbicos assemelhando-se a uma sequência sinal secretora. A proteína madura, tendo um peso molecular relativo de 71,1 Kd consiste numa fracção extracelular de 491 resíduos, seguido de um domínio de 19 resíduos que atravessa a membrana (sublinhado em duplicado) e um domínio intracelular de 118 aminoácidos. Dez potenciais sítios de glicosilação ligada em N (N-X-S/T, X não é igual a P) foram encontrados no domínio extracelular previsto, assim como um grande número de resíduos serina e treonina que podem ser sítios de adição de glicano ligado em O. A abundância de potenciais sítios de glicosilação e a diferença no peso entre o esqueleto proteico previsto e o produto precipitado a partir de células COS e as linhas de células B sugere que cerca de 50% do peso de CD22 é dado pelo açúcar. A porção extracelular de CD22 consiste em cinco segmentos tendo tendo uma organização de domínios do tipo imunoglobu-lina. O pequeno espaço entre císteinas (63 e 64 resíduos nos domínios 1 e 2 e 42 resíduos nos domínios 3-5) sugere que eles se dobrem na estrutura de 7 cadeias em duas camadas de folhas beta característica das regiões constantes das imunoglobulinas em lugar da estrutura de 9 cadeias das regiões variáveis.

Devido a CD22 ter sido encontrado como altamente homólogo da glicoproteína associada a mielina (MAG), uma proteína de superfície de células neuronais que medeia os contactos célula-célula durante a mielogénese, postulou-se que CD22 tem um papel na adesão de células B. As células COS transfectadas com cDNA de CD22 foram colocadas em contacto com eritrócitos ou células mononucleares do sangue periférico e incubadas em condições que minimizem a interacção inespecífica. Observou-se a formação de rosetas com eritrócitos e células mononucleares com células COS positivas para CD22 mas não com células COS transfec-tadas com um clone de cDNA não relacionado.

Os estudos de adesão de células B envolvendo os anticorpos monoclonais indicaram que epítopos diferentes de CD22 pode participar na adesão de eritrócitos e monócitos e que diferentes ligandos podem ser econhecidos em cada um dos tipos celulares. Os estudos de adesão de células B também sugere que CD22, de forma análoga à adesão de CD2, CD4 e CD8 de células T a células alvo# pode promover o reconhecimento pelo receptor de antigénios das células B através da intensificação dos contactos com células apresentadoras de antigénios. CD22 foi anteriormente implicado na transmissão de sinais de sinergismo com o receptor de antigénios (Pezutto et al.. J. Immunol. 138;98-103 (1987)) e ligação cruzada da IgM de superfície produz um fluxo de cálcio intracelular em células igM±CD22+ mas não em IgM+CD22“ (Pezzuto et al.. J.

Immunol. 140:1791-1795 (1988)). Estes resultados sugerem que tal como as moléculas acessoras de células T, CD22 pode também participar na regulação da transdução de sinais. A capacidade para interferir com a ligação de células positivas para CD22 com células acessoras ou a capacidade para causar tal ligação em superfícies diferentes das dos linfócitos pode ser útil em diagnóstico e terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de CD22 e um ligando de receptor fixado a um substrato será útil na detecção da presença de um antigénio particular em fluídos do corpo. Uma forma solúvel de CD22 pode ter actividade imunomoduladora.

Exemplo XIII

Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNA Codificador do Anticrénio CD27 Especifico de Linfócitos T

Um clone de cDNA codificador de CD27 foi obtido a partir de cDNA de linfócitos T humanos trasnferidos para células COS e imuno-seleccionado pelo método do presente invento. Extraiu-se RNA a partir de células mononucleares derivadas de uma unidade de sangue, após quatro dias de cultura em meio contendo 1 jtíg/ml de fito-hemaglutinina (PHA) , usando tiocianato de guanidi-nio. O RNA total foi seleccionado relativamente a poli(A). Fez-se cDNA e clonou-se em CDM8, usou-se para transfectar células COS e o cDNA de CD27 foi imuno-seleccionado com os anticorpos monoclo-nais 0KT18a e CLB-9F4 (fornecidos como descrito em Seed e Aruffo Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84;3365-3369 (1987)). O vector continha uma inserção de cDNA de 1,2 Kb. A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada por terminação de cadeias de didesoxinucleótidos como descrito, supra. A sequência de 1203 resíduos e a sequência de aminoácidos deduzida estão apresentadas na Tabela 5. 116

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A metionina de iniciação está indicada pelo número 1 acima do codão de iniciação. 0 polipeptídeo CD27 deduzido demonstra as características típicas de uma proteína de membrana integral tipol. Ela começa com uma região hidrofóbica de vinte aminoácidos consistente com uma sequência sinal secretora. Esta região hidrofóbica é seguida de um domínio hidrofóbico que atravessa a membrana (duplamente sublinhado) e um domínio cito-plasmático de 49 aminoácidos começando com uma sequência de paragem de transferência carregado positivamente. Não existe uma cauda poli (A).

A sequência de aminoácidos deduzida de CD27 é altamente homóloga do antigénio CD40 de linfócitos B e de carcinoma, descrito supra, ao longo de todo o seu comprimento. CD27 é também altamente homólogo do receptor do factor de crescimento das células nervosas (NGFR) nos domínios extracelulares e transmem-branares (Stamenkovic et al.. EMBO J. 8:1403-1410 (1989); Johnson et al.. cell 47:545-554 (1989)). o motivco estrutural mais conservadonestas três proteínas é a abundância de císteinas ou histidinas na região extracelular. Estas são muitas vezes encontradas aos pares separados por dois ou quatro resíduos de aminoácidos intervenientes semelhantes ao arranjo encontrado em proteínas que usam esta estrutura para ligar um ião zinco. A região rica em císteina e histidinas é seguida de um domínio proximal membranar rico em serina, treonina e prolina que foi sugerido como sendo a região em que glicanos bioquimicamente identificados ligados em O são adicionados a NGFR (Johnson et al. (1986), supra; Grob et al.. J. Biol. Chem. 260:8044-8049 (1985)). A imunoprecipitação de células COS transfectadas com anticorpos anti-CD27 seguido de electroforese em gel revelou a presença de uma espécie de 110 Kd quando não reduzida e uma única banda de 55 Kd na presença de agente redutor. Isto indica que nas 118

células COS transfectadas, CD27 é um homodímero ligado por pontes dissulfureto compreendido por monómeros de 55Kd, semelhante às formas precipitadas a partir de linfócitos T. (Bigler et al.. J. Immunol. 141:21-28 (1988); Stockinger et al.. Leukocvte Tvpinq II. vol. 1:513-529 (1986); Van Lier et al.. Eur. J. Immunol. 18:811-816 (1987)).

CD27 é um antigénio de activação de linfócitos T. A sua estrutura sugere que ele pode funcionar como receptor de uma linfoquina ou factor de crescimento. 0 reconhecimento de CD27 causa a proliferação de células T e aumenta a expressão de certos genes necessários para as funções auxiliares e efectoras da célula T. A expressão de CD27 em células T aumenta duas a cinco vezes com estimulação por fito-hemaglutinina (PHA) ou anticorpos monoclonais contra CD3 e a adição de pelo menos um anticorpo monoclonal contra CD27 pode aumentara proliferação de células T estimulada com PHA (Bigler e Chiorazzi, Leukocvte Tvpincf II. Vol. 1:503-512 (1986); Van Lier, (1987)). Encontrou-se que as células T positivas para CD27 proporcionam auxílio a células B para a síntese de IgM e secretam 11-2 quando adequadamente estimuladas (Van Lier et al.. Eur. J. Immunol. 18:811-816 (1988)).

A capacidade para interferir com a ligação de CD27 a células T positivas com células apresentadoras de antigénios ou a capacidade para causar a ocorrência de tal ligação nas superfícies que não sejam de linfócitos, pode ser útil em diagnósticos e em terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de Cd27 e um ligando de receptores fixado a um substrato serão úteis na detecção da presença de um antigénio particular nos fluidos do corpo. Uma proteína de fusão CD27 solúvel será útil para evitar proliferação de células T indesejável, por exemplo, em certas doenças auto-imunes. 119

Exemplo XIV Isolamento e Clonaaem Molecular de Dois

Clones de cDNA Codificadores de Antiqénios Leu8 Específicos de Linfócitos T

Dois clones de cDNA codificadores de determinantes Leu8 foram isolados a partir de uma biblioteca de células T humanas pelo método do presente invento.

A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada pela terminação de cadeias de didesoxinucleótidos como descrito supra. As análises de sequências de DNA (Tabela 6) mostra que a inserção maior contem 2350 resíduos enquanto que a mais pequena contem não possui 436 resíduos internos mas é idêntica no restante.

I

Quadro

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123

Toda a sequência do clone mais longo está apresentada, com a porção eliminada do clone mais curto sublinhado acima. A sequência de aminoácidos prevista está apresentada abaixo da sequência de nucleótidos. Os sítios de potencial glicosilação ligada em N estão designados por —CHO— e a região transmem-branar proposta para a forma mais longa está duplamente sublinhada.

A hibridação de transferências de DNA do genoma fragmentado de células T humanas mostrou um padrão consistente com um gene de cópia única. A hibridação de transferências de RNA revelou um transcrito principal de 2,4 Kb em células mononuclea-res de sangue periférico, células B das amígdalas e várias linhas de células linfocíticas; e um transcrito pouco abundante de 2,0 Kb, presente em células mononucleares de sangue periférico e as linhas de células T leucémicas HSB-2.

A sequência proteica codificada pela inserção maior (a forma convencional) é portadora de um domínio fortemente hidrofó-bico putativo que atravessa a membrana perto do seu extremo C, seguido de vários resíduos carregados positivamente assemelhando--se a uma sequência âncora citoplasmãtica. A proteína está estreitamente relacionada com o receptor murino Mel-14 recentemente descrito (Lasky et al.. Cell 56:1045-1055 (1989); Sieqelmanet al., Science 243:1165-1172 (1989)). A proteína codificada pela sequência mais curta (uma forma com fosfolípidos ancorados) é portadora de um domínio C-terminal fracamente hidrofóbico característico de proteínas de superfície qy«ue estão ligadas à membrana celular por ligação covalente a um glicano substituído com fosfatidilinositol. 124

V )

Observou-se que os anticorpos monoclonais TQ1 (Reinherz et al. (1982) J. Immun. 128:463-468) e Mel-14 (Gallatin et al. (1983) Nature 304:30-34) reagem com células CO transfectadas com o clone Leu8. A presença ou ausência de Leu8 em linfócitos T CD4+ identifica as subséries supressora-indutora e auxiliar-indutora de células T CD4+. Leu8 é um receptor de auto-direcionamento, permitindo às células T aderirem a endotélio pós-capilar especializado dos nódulos linfáticos periféricos. A presença ou ausência de Leu8 classifica a célula T em termos de de potencial auto-direcionamento e distribuição nos tecidos. Estudos serológicos indicaram que Leu8 é uma marca de linfócitos em repouso nos nódulos linfáticos periféricos (Poletti et al.. Hum. Pathol. 19:1001-1007 (1988)). A activação de células T por ésteres de forbol mais PHA resulta em expressão reduzida de Leu8 e transcritos reduzidos, com a redução na expressão de Leu8 sendo mais rápida do que a redução dos transcritos Leu8. Parece pois que Leu8 de superfície é perdido mais rapidamente do que previsto pela regeneração de RNA, possivelmente por protecção da forma ligada a fosfatidilinositol (Ferguson & Williams, A. Rev.

Biochem. 57:285-320 (1988)). Entre as células T periféricas, a subsérie CD4+ Leu8" proporciona auxílio à síntese de IgM e IgG pelas células B (Reinherz et al.. J. Immun. 128:463-468 (1982);

Gatenby et al.. J. Immun. 129:1997-2000), enquanto que células CD4+ Leu8“ inibem directamente a síntese de IgG induzida pelo mitogénio erva dos cancros (Kanof et al.. J. Immun. 139:49-54 (1987)). Parece pois que células CD4+ Leu8", activadas para proporcionar auxílio à síntese de Ig pelas célulasB, saem dos nódulos e circulam perifericamente para encontrar as células apresentadoras de antigénio. 125

A capacidade para interferir com a ligação de células T Leu8“ a células apresentadoras de antigénio ou a capacidade para fazer com que tal ligação ocorra em outras superfícies que não de linfócitos, pode ser útil em diagnósticos e terapia. Por exemplo, o nível de células T Leu8” activadas relativamente a células Leu8+ em repouso poderá servir como uma medida da resposta imune a um antigénio particular.

0 domínio extracelular da proteína transmembranar Leu8 que medeia a adesão a células endoteliais especializadas dos nódulos linfáticos foi observado como sendo específico no seu reconhecimento do ligando lectina, galactosil-ceramida sulfatada (sulfito). A modificação da especificidade desta ligação pode servir para regular o potencial de auto-direcionamento das células T em repouso. As formas solúveis de LeuSpodem actuar como agentes anti-inflamatórios através da redução da migração de linfócitos.

Exemplo XV Isolamento e Clonaaem Molecular de cDNAs

Codificadores de Antiqénios CD44

CD44 é uma proteína polimórfica integral de membrana. Análise de dados imunoquímicos e de transferências de RNA suportaram a existência de duas formas de CD44: uma forma de mesên-quima expressa pelas células hematopoiéticas e uma forma epi-telial fracamente expressa pelo epitélio normal mas altamente expressa pelos carcinomas.

Para isolar um clone de cDNA codificador de CD44 (Stamenkovic et al.. Cell 56:1057-1062 (1989)), preparam-se bibliotecas a partir da linha celular de linfoma histiocítico U937, a linha linfoblastóide B JY, a linha Raji de linfoma de Burkitt e a linha de leucemia mielóide KG-1 foram transfectadas 126

separadamente em células COS pelo método do DEAE-Dextran, descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfecção, incubadas com os anticorpos monoclonais J173 anti-CD44 (Pesandro et al.. J. immunol. 137:3689-3695 (1986)) e "panned" em placas revestidas com anticorpo de cabra anti-murganho purificado por afinidade. Após várias lavagens, as células aderentes foram lisadas e purificado DNA epissomal e usado para transfectar E. coli. Após dois ciclos semelhantes após fusão de esferoplastos, encontrou-se que DNA de plasmídeo recuperado a partir de três de entre oito colónias picadas ao acaso dirigem o aparecimento de determinantes CD44 hematopoiéticos em células COS transfectadas.

Dois destes três clones, CD44.5 e CD44.8, são portadores de inserções com cerca de 1,4 Kb, enquanto que o terceiro, CD44.4, continha uma inserção com cerca de 1,7 Kb. As células COS transfectadas com qualquer um destes clones reagiu com os anticorpos monoclonais anti-CD44 J173, F-10-44-2 (Dalchau et al.. Eur. J. Immunol. 10:745-749 (1980)) e o anticorpo monoclonal IM7 anti-Pgp-1 (Trowbridge et al.. Immunoaenetics 15:299-312 (1982)). As células não transfectadas apresentaram reactividade fraca com J173.

A sequência de nucleótidos do cDNA de CD44.5 hematopoi-ético (Tabela 7) consiste em 1354 resíduos terminando numa pequena cauda poli(A) de 19 pares de bases a jusante de uma sequência CATAAA. 127

EH CD 2 CD 2 u EH Eh X CD CD > υ 2 2 U CD 2 s u Eh , O « o u υ a EH 2 EH o CD 1 CD PO O CD CD CD 1 CD U Eh 0 EH O EH Eh O 2 « < s 2 Eh „ 2 s CJ CD CD 0 A 1 2 CD 2 i υ a CD 0 „ 2 s υ 2 CD CD CD o U CD 2 CD 2 u CD CD H CD u Eh S 0 Eh CD α EH 2 S υ 0 0 > 2 CD CD 2 υ υ u 2 2 2 EH υ 0 O ffi CJ u CD 2 o u o 0 EH O Pi CD 2 EH Pm CD EH u K 2 EH υ CD EH Eh k1 υ CD CD > U ο Eh Se Eh O u CD CD 2 Eh CD CD _ CD CD υ CD EH £ 2 CD u EH 0 2 ω o EH CD 2 Eh o Eh Pm EH 2 o CD EH 2 S 0 2 Eh Pm u Eh 2 W CJ EH t- o α CD Eh Pm o u 2 „ υ « Eh Eh CD Q υ O •a u CD CD CD 2 (0 CJ Eh Eh υ CD 3 0 2 S u 2 a o O υ 2 w Eh u 2 EH u CD 2 2 o υ CJ Eh Eh O Eh 2 2 H 0 O CD Eh Eh O CD 2 O k) EH U 2 s CJ 2 υ CD 2 0 EH EH CD Q O υ Eh J Eh CD CD Eh CJ U 0 2 CD 2 0 eh CD Q υ EH Eh υ u CD CD EH CD 2 O α 2 H CD υ υ CD 2 EH EH 2 CD W Eh υ O O CD CD α CD υ 0 o U 2 Eh 2 CD CD 2 CD 0 υ CD CD υ CD EH cj ps CD υ υ μ} Eh H u Ο O υ u CD Eh W Eh CD 2 TO υ 0 o CD Eh α Eh Eh 2 H 0 Eh _0 α 2 Eh CD CD u υ O 2 TO o u 0 P) υ pH H H vo H eo H CM υ CJ 2 S υ Eh TO EH Eh to Eh Eh υ υ CD > CD 2 EH 2 s EH Eh u 2 2 H u 2 s Eh O P. υ O u EH 2 Eh 2 EH (M 2 U S υ EH O o 2 H IH EH CJ D 2 H Eh CJ CD 2 2 Eh CD Eh Pm Eh CJ « 2 EH α CJ ãH u 2 Eh υ ρ< α CJ EH 1 CJ Pi Eh CD Q 1 2 2 H Ej O CD CD rtj K CD CD Eh Ehjx υ EH CD > o 1 2 0 2 1 CD Q EH ^ υ α Eh CD > υ Eh EH ο Eh Pm 2 Eh W υ υ a CJ CJ CD υ CD 2 CD 2 Eh 2 CD CD υ $ ^ s 2 S CJ CD PO o υ 2 2 CJ Pi Ej Eh N CD 2 H 2 Eh 0 U CJ k1 Eh 2 Eh o Eh Pm O 2 CD Eh CD Q CD υ >o 2 CD CD υ υ Eh EH 2 Eh 2 2 H CJ Eh >h υ Eh CD 2 CD > CD Eh >h 2 2 Pd CD υ O Eh EH TO CD CD > 2 Eh υ CD υ υ CD 2 Eh ο CD CD Eh 2 EH 2 CD CD U Eh CJ 2 2 Eh EH CD PO υ 2 EH 2 CD Q 2 Eh 2 S Eh Pi υ 2 2 CD PO 2 CD CD CD CJ u 2 CD PO Eh 1 CD 2 Eh 2 H 1 2 O CJ O U CJ P< O PE CD 2 2 2 TO υ EH α CD 1 CD CJ Pi Eh , 1 Eh ϋ Eh CJ κΐ υ O EH EH CD 2 CJ 2 H 2 H H H ΓΊ o CO n *· Η2 0 Q Eh υ r U P< υt* 0 gcn υ a u2 %

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Λ

de linfócitos. Mostrou-se que CD44 hematopoiético é um receptor da matrix extracelular com afinidade para colagénios tipo I e VI (Stamenkovic et al.. Cell 56:1057-1062 (1989)). CD44 hematopoiético pode também ter um papel na activação de linfócitos. A capacidade para interferir com a ligação de CD44 hematopoiético a células dos nódulos linfáticos ou a capacidade para causar tal ligação noutras superfícies pode ser útil em diagnóstico e terapia. Por exemplo, a modificação desta ligação pode servir para regular o potencial de auto-direcionamento dos linfócitos. As formas solúveis de CD44 podem ter actividade imuno-moduladora.

Para isolar um clone de cDNA codificador da forma epitelial de CD44, uma biblioteca de cDNA preparada a partir da linha de carcinoma do cólon HT29 foi usada para transfectar células COS pelo método do DEAE-Dextran descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfecção, incubadas com o anticorpo monoclonal F-10-44-2 anti-CD44 (Dalchau et al.. Eur. J. Immunol. 10:745-749 (1980)) e "panned" em placas revestidas com anticorpo de cabra anti-murganho purificado por afinidade. Após várias lavagens as células aderentes foram lisadas e o DNAepis-somal purificado e usado para transformar E. coli. Após dois ciclos semelhantes de enriquecimento após fusão de esferoplastos, como descrito supra. encontrou-se que o DNA de plasmídeo recuperado a partir de sete de entre dez colónias escolhidas ao acaso dirige o aparecimento de determinantes CD44 epiteliais em células COS transfectadas. os sete clones positivos são portadores de inserções de cDNA com cerca de 2,4 Kb. A análise com enzimas de restrição do clone contendo a inserção de cDNA epitelial mostrou que a sequência codificadora 131 (Tabela 8) foi alargada relativamente à inserção de CD44 hemato-poiético pela adição de 496 pares de bases. ΕΗ ο 4 Ο Εη Εη >η Ο ο > υ 2 υ ο Ο ΕΗ , u « υ U Β Εη Εη υ C3 ο (3 0 Ο ο Εη Ο Εη ΕΗ CJ 4 d Εη 4 Β ο Ο Β ο 4 f£ ο C3 w 2 w 2 C3 C3 ο Ο 13 4 U C3 13 Β υ Εη !ϊ (3 ο Ο ΕΗ υ υ Ο > 13 0 ri} Ο υ 4 2 α U Ο Β ο ο 4 ο α α ΕΗ 13 2 _ Εη Β Η u a 4 υ ο ΕΗ υ C3 Ο > υ Εη S ΕΗ υ Ο 15 13 Ο Ο Ο Ο Εη £ 4 υ ΕΗ υ υ ΕΗ Ο 4 ο ΕΗ Cm ΕΗ υ Ο Εη α 4 Εη Β γ 3 a υ ο υ ο CO υ 4 υ pí ο ΕΗ ο ω Ο U Ο υ <3 Ό Ο ΕΗ Εη Ο Λ υ 2 £ υ 3 Ο υ υ σ ΕΗ α 4 Εη Ο 2 4 Ο ο Εη ΕΗ 2 2 η ο ο ΕΗ ο ο 4 ΕΗ U 2 a 2 υ ο V Εη ΕΗ υ υ Εη Β ο ο ΕΗ υ υ 4 V Εη Ο Ω ΕΗ Εη υ Ο Ο Εη 13 υ 4 Η Ο ο Ο ΕΗ ΕΗ 4 ΕΗ υ υ σ (5 υ ο 13 U U 2 13 Ο 4 υ α ο U ο Εη ο υ U Β ΕΗ U CJ υ U C3 ΕΗ ο 4 ω υ υ ο ο ΕΗ Εη ο Εη υ Β 2 Εη ο υ Γ) U υ οβ Η Η V0 γΗ co Η 0 4 ο U *£ α Εη W 2 κ ΕΗ V) ΕΗ υ U ο Ο 2 4 2 a ΕΗ 1 Ο Β Ο 2 1 ο υ 2 a Ο ΕΗ U Β U a 4 a υ ΕΗ D 15 2 Εη Β 1 4 υ a U ι u σ U Ο υ Ej ΕΗ ϋ υ 2 Η Εη Ο 4 C5 2 0 ϋ , Εη >η 2 ΕΗ ^ Ο Pi υ υ 0 2 Εη υ α β CJ 2 Εη ΕΗ 2 υ Ej 15 D υ 2 Η ΕΗ Ο Β Ο 2 ο ΕΗ ^ Εη >η Εη , C5 > Ο ΕΗ Β Ο 2 α ΕΗ υ α υ Ο > ο 2 Εη ΕΗ ο υ 2 εη ω ο ο a ο 2 W ο υ εη ο 2 ΕΗ â a 0 0 Ο υ 2 ^ a ΕΗ Ο Η υ ΕΗ Β 2 2 ΕΗ ΕΗ Εη * υ 2 Η 2 0 4 υ υ Ç3 ΕΗ 2 Εη 2 « ΕΗ Β υ 15 Εη α Ο υ Β ο 15 U υ ΕΗ Ο Ej Εη υ 2 2 Η ΕΗ „ ΕΗ >Η 0 υ β (5 2 υ Ο Εη >η 2 2 Pi Ο Ο Ο υ ΕΗ ΕΗ ο (5 > υ Εη ο υ 0 2 υ ο Ο α u ο υ 2 Εη 2 Ο 2 13 υ 2 2 Εη 2 (5 ΚΙ υ Ο Η Εη 2 15 Εη 2 a υ ΕΗ Β CJ 2 Εη 2 Ο U Ο ο Ο υ pí U ο Εη ΕΗ 1 Ο 2 υ 2 W 1 2 Εη W υ ο υ υ a ο 2 Εη 2 W Ο Εη 2 Η ο 1 C3 υ ΕΗ 1 Εη U Ο U Β CJ 2 W ΕΗ ΕΗ υ U 2 Η ι—Ι Η τΡ ΓΟ Ο Ν η 2 aδο > ΕΗ Εη 2 Η Η U 2 μ § « Q η ο 15* 2 ο a 2 Εη w U > Η U 2 Η Εηα Ο Β ϋ 2 4 Εη W ΕΗ 4 a 2 Η υ Β U Ο 13 ΕΗ Β 2 W 2 Ε· CJ υ δ U υ β d* 4 Η ο 2 2 2 Εη >η α 1 U Β δ"1 δ 1 2 ΕΗ F ^ Ο ο 3Η a ο ο ΕΗ Ο Εη 2 2 Η 1 2 C3 Q 3 ι C3 α 2 2 Εη 2 ΕΗ >Η ΕΗ C3 W ΕΗ Μ Β Ο ο ο 2

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s ã Eh % O A análise da sequência de DNA mostrou que o cDNA de CD44 epitelial é muito semelhante ao cDNA de 44.5 mas codifica mais um domínio extracelular de 165 aminoácidos, inserido cerca de 140 resíduos a montante da secção transmembranar partilhada por ambos os clones. A proteína madura compreenderá 493 resíduos. A análise da transferência de RNA revelou que os transcritos de CD44 epiteliais compreendem espécies de 2,2, 2,7 e 5,5 Kb. CD44 epitelial isolado por imunoprecipitação revelou que a glicoproteína tem cerca de 160 Kd. Células B transfectadas expressando CD44 epitelial não aderem a células do estroma de nódulos linfáticos de rato em cultura primária como acontece com linfócitos transfectados com CD44 hematopoiético. CD44 epitelial é fracamente expresso por carcinomas. É possível que a função do receptor de matrix extracelular de CD44 epitelial seja promover a invasão pelo tumor. A capacidade para interferir com a ligação de CD44 epitelial com matrizes extracelulares pode ser útil em terapia e em diagnósticos. Por exemplo, a interferência da ligação de CD44 epitelial a matrizes extracelulares pode diminuir a probabilidade de metastases em doentes com cancro. As formas solúveis de CD44 podem actuar para evitar o auto-direcionamento das células de metástases para os nódulos linfáticos.

Exemolo XVI Isolamento e Clonaoem Molecular de cDNA

Codificador de Antigénios CD53 CD53, o antigénio reconhecido pelos anticorpos MEM-53 (Hadam, M.R. (1989) em Leukocvte Tvoinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 674), HD77, HI29 e HI36 e 63-5A3, é uma glicoproteína largamente distribuída entre as células 135

nucleadas das linhas hematopoiéticas, mas restringida apenas a elas (Stevanova, I., et al. (1989) em Leukocyte Typinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678). CD53 é expresso por monócitos e macrófagos, por granulócitos, células dendríticas, osteoclastos e osteoblastos e por células T e B de todas as fases de diferenciação.

Para se obter um clone de cDNA codificador de CD53, bibliotecas de cDNA construídas a partir de linfócitos do sangue periférico e a linha HL6o de células tumorais promielocíticas e usadas para transfectar células COS pelo método de DEAE-Dextran descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfec-ção, incubadas com anticorpos monoclonais MEM-53 e "panned" como descrito em Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365--3369 (1987) e Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573--8577 (1987). Após dois ciclos subsequentes de enriquecimento após fusão de esferoplastos, o DNA de plasmídeo recuperado a partir de colónias isoladas foi usado para transfectar células COS e avaliada a expressão de CD53 por imunofluorescência.

I

Dois de entre oito transfectantes foram positivos, cada um deles portador de uma inserção de aproximadamente 1,5 Kb. As células COS transfectadas com ambos os clones reagiram com os anticorpos MEM-53, HT29, HI36 e 63-5A3.

Para isolar CD53 a partir de linfócitos do sangue periférico e as células COS transfectadas para fins de comparação, linfócitos e células COS transfectadas foram marcadas na supefície com 125i usando lactoperoxidase e H2O2 e depois lisadas num tampão de lise de 50 mM Tris-HCl pH 8,0 contendo 1% NP40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 20 mM iodoacetamida e 1 mM fluore-to de fenilmetilsulfonilo. As células foram solubilizadas numa concentração de 2,5 x IO7 células/ml em tampão de lise durante 45 136

minutos depois centrifugado a 12000 g. Após pré-clarificação com esferas de anticorpos de cabra anti.imunoglobulina de murganho (Cappel, Malvern, PA) as imunoprecipitações foram realizadas cora os anticorpos monoclonais MEM53 ou 63-5A3 e Proteína A-Sepharose CL-4B (Sigma, St. Louis, MO)como descrito por Schneider et al. (J. Biol. Chem. 257:10766 (1982)). Os imunoprecipitados foram eluidos em tampão de amostra com SDS e analisados em géis de 12,5% de acrilamida contendo dodecilsulfato de sódio.

Uma banda larga de proteína marcada com iodo radioacti-vo com um peso entre 34 Kd e 42 Kd foi obtido a partir de linfó-citos do sangue periférico com os anticorpos monoclonais MEM-53 ou 63-5A3, comparável à banda obtida a partir de células COS transfectadas com CD53, estendendo-se entre 36 Kd e 64 Kd. O peso mais elevado nas células COS é atípico, pois as proteínas de superfície celular recuperadas a partir de células COS transfectadas geralmente apresentam peso molecular inalterado ou mais baixo do que o encontrado na célula de onde deriva o clone de cDNA (Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365-3369 (1987)). Aproximadamente 15 Kd de peso foram libertados da glicoproteína por digestão com endoglicosidade F (N-glicanase), enquanto que o tratamento com neuraminidase e O-glicanase não tem efeito no peso molecular aparente (Hadam, M.R. (1989) em Leukocvte Tvpinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 674); Stevanova, I., et al. (1989) em Leukocvte Tvpinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678). Uma banda adicional fraca de 20 Kd, possivelmente precursor não glicosilado foi detectada em imunoprecipitados de células COS não transfectadas, mas estava ausente de imunoprecipitados de linfócitos do sangue periférico. A hibridação de DNA genómico derivado de uma linha de células de células T PEER digerido com várias enzimas revelou um 137

padrão consistente com um gene de uma única cópia. A análise de transferências de RNA revelou um único mRNA de 1,8 Kb derivado de linhas celulares mielóides e de linfócitos de sangue periférico. O nível de expressão foi comparável nas diferentes linhas celulares excepto na linha celular THP1, a qual tinha pouco mRNA CD53. Os transcritos de CD53 são mais abundantes em linfócitos de sangue periférico do que em linhas de células cultivadas, consistente com a expressão de CD53 de superfície mais abundante nestas células.

A sequência de nucleótidos do cDNA de CD53 foi determinada por terminação de cadeias didesoxinucleotídicas como descrito supra. usando oligonucleótidos iniciadores sintéticos. A sequência da inserção CD53 consiste em 1452 nucleótidos (Tabela 9) e termina perto de dois motivos AATAAA (sublinhados).

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A sequência não codificadora 3/ contém três exemplos da sequência ATTTA (indicado pelas aspas), que se demonstrou mediar a instabilidade de mRNA (Shaw e Kamen, Cell 46:659 (1986)). Uma grelha de leitura aberta começando no resíduo 74 codifica uma proteína de 219 aminoácidos com um peso molecular previsto de 24,340 Kd. O polipeptídeo previsto é invulgar por ser portador de quatro segmentos hidrofóbicos (duplamente sublinhados), três dos quais estão em estreita proximidade do extremo amina da molécula. 0 primeiro segmento hidrofóbico é atipicamente longo para sequência sinal ou simples hélice alfa transmembranar e contem três resíduos císteina e um resíduo glicina situado no meio. Ambas as císteinas e glicina precedem imediatamente o sítio do sinal de clivagem (von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683 (1986)), sugerindo que o extremo amina da proteína madura começa no meio do primeiro domínio hidrofóbico. É dado algum apoio a este ponto de vista pelo facto de o tamanho do esqueleto polipeptídico de ME491, uma proteína de membrana integral tipo III relacionada, discutido infra, ser mais pequena do que o tamanho previsto a partir da sequência de cDNA, possivelmente como uma consequência da excisão de um peptídeo sinal. Devido a existir apenas dois sítios potenciais para adição de glicano ligado em N (indicado na Tabela 9 pelas designações —CHO—), situado entre o terceiro e quarto segmentos hidrofóbicos, o extremo carbonilo fica dentro da célula, assim como a fracção hidrofílica curta entre o segundo e o terceiro segmentos hidrofóbicos. Se o extremo amina não for processado ele deve permanecer intracelular. CD53 é uma proteína de membrana integral Tipo III relacionada com outra proteínas de membrana: antigénio ME491, uma proteína de melanoma cuja expressão aumentada está bem correlacionada com a progressão de tumores (Hotta, et al.. Câncer Res♦ 48:2955 (1988)); CD37 um antigénio extensivamente glicosilado predominantemente expresso em células B, mas não específico das linhas de células B /Schwartz et al.. J. Immun. 140:905 (1988); e S5.7 um antigénio não glicosilado largamente expresso em células da linhagem hematopoiética (Pressano et al.. Câncer Res. 43:4812 (1983)). Em adição, CD53 está distantemente relacionado com E. coli lac Y permease, uma proteína integral de membrana tipo III que faz a passagem de lactose para a célula bacteriana. Os transcritos de CD53 nos linfócitos de sangue periférico aumentam após estimulação mitogénica por PHA, sugerindo que a proteína pode estar envolvida no transporte de factores essenciais para a proliferação celular.

Entre as moléculas com larga reactividade no sistema hematopoiético, CD53 presentemente dá a reactividade mais larga assim como a restrição mais precisa às células hematopoiéticas. Os anticorpos anti-CD53 são um instrumento útil na identificação de neoplasmas hematopoiéticos e podem provar úteis na identificação de células mal definidas morfologicamente, por exemplo em culturas primárias de baço ou de medula óssea.

Equivalentes

Os familiarizados com a matéria reconhecerão ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina muitos equivalentes às realizações específicas do invento aqui descrito. Tais equivalentes destinam-se a ser incluídos dentro do âmbito deste invento.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES: Ia - Processo para a produção da proteína CD53, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de nucleótidos recombinante que codifica a proteína CD53. 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína CD53 ter a sequência de aminoácidos do Quadro 9: 143

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   ou os seus derivados funcionais. 3a - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado por a sequência de nucleótidos recombinante compreender a sequência de nucleótidos do Quadro 9 ou os seus derivados funcionais. 4a - Processo para a produção de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a inclusão na referida composição farmacêutica da proteína CD53 substancialmente pura, encontrando-se a proteína CD53 presente numa forma solúvel ou na forma de um sal aceitável. 5a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína CD53 substancialmente pura compreender a proteína contendo a sequência de aminoácidos do Quadro 9 ou os seus derivados funcionais. 6a - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda a adição de um veículo farmacêutico. 7a - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por compreender ainda a adição de um agente terapêutico. 8a - Método de imunodiagnóstico, caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD53 ou de uma sonda de nucleótidos de CD53 para a detecção de células da linhagem hematopoiética. 9a - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD53 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 9. 146

   10a - Método de imunodiagnóstico, caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD53 ou de uma sonda de nucleótidos de CD53 para a detecção de neoplasmas hematopoiéticos. 11a - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD53 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 9. 12a - Método para a detecção de anticorpos contra a proteína CD53, caracterizado por compreender a utilização da proteína CD53 substancialmente pura ou dos seus derivados funcionais num imuno-ensaio. 13a - Método para a identificação morfológica de células mal definidas, caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD53 ou de uma sonda de nucleótidos de CD53 para detectar as referidas células. 14 a _ Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD53 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 9. 15a - Método para a produção de anticorpos monoclonais contra a proteína CD53, diferentes de MEM-53, HD77, HI29, HI36 e 63-5A3, caracterizado por se empregar a proteína 0D53 substancialmente pura ou os seus derivados funcionais em métodos padrão de produção de anticorpos monoclonais. 16a - Processo para a produção da proteína TLiSA, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de nucleótidos recombinante que codifica a proteína TLiSA. 17* - processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a proteína TLiSA ter a sequência de aminoácidos do Quadro 3: II 148 II 148 GCGGGGAGCTTGCACTGACCAÂGAGGGTGfTGAGGCTAAGAGGCCACGATAAACACGATÂCGÂTÀAAAaTCCTTAACCMGACGCAa\TGGGAAGAAGCGTTAGAGCCXCiCXccACTCAC - h- ll d Be. d d d d • f- to d Q O ca h- d » 1 < d d 1= -* -tf > d o 1 b> < — to u u < h- to < S- — >- • < • h- • d • u u < -tf H u cu i — >- d )- u d ) _ < d d d U X < to d o d o o J I h^1 = u. o > p — d • ν • < • 1 J α < >-H 5 O o d . —» ΙΟ > d d «< 5 Δ d d tf < h- 3 ~ o uj < M c3 uj < 5 d r— d hUUJ d d < • h- IO • l·- to 1 LJ h μ- — d t d O HH U δ o d ) d -< i O 1 < d h- 1 — h* < < | U _J d cr < 2: i h- d U < d d Ρ)ϋ< d cr d ce h- 1 á d d t < LJ < os -tf H· h· U- d u d d d < d μ- H >· d o - U- d < d — h- — LJ U> -tf M d _J Cl 1- o — < • < -tf • d LJ U X <i- 1 d F d d * d P U _J tu. — i <2 i -tf d F d d i F U -J d F5: 5 z ! 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   ou os seus derivados funcionais. 28® - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a sequência de nucleótidos recombinante compreender a sequência de nucleótidos do Quadro 5 ou os seus derivados funcionais. 29® - Processo para a produção de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a inclusão na referida composição farmacêutica da proteína CD27 substancialmente pura, encontrando-se a referida proteína CD27 presente numa forma solúvel ou na forma de um sal aceitável. 30® - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por a referida proteína CD27 substancialmente pura compreender a proteína contendo a sequência de aminoácidos do Quadro 5 ou os seus derivados funcionais. 31® - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender ainda a adição de um veículo farmacêutico. 32® - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender ainda a adição de um agente terapêutico . 33® - Método de imunodiagnóstico caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD27 ou de uma sonda de nucleótidos de CD27 para a detecção de células T. 34® - Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD27 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 5. 153 35* - Método para a detecção de anticorpos contra a proteína CD27, caracterizado por compreender a utilização da proteína CD27 substancialmente pura ou dos seus derivados funcionais num imuno-ensaio. 36* - Método para a produção de anticorpos monoclonais contra a proteína CD27, diferentes de 0KT18a e CLB-9F4, caracterizado por se empregar a proteína CD27 substancialmente pura ou os seus derivados funcionais em métodos padrão de produção de anticorpos monoclonais. Lisboa, 15 de Julho de 1991

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