JPH06504186A - Ｃｄ５３細胞表面抗原とその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ５３細胞表面抗原とその使用 本発明は、同時係属中の１９８８年２月２５日出願の米国特許出願番号１６０． ４１６号の一部継続出願である、同時係属中の１９８９年７月１３日出願の米国 特許出願番号３７９．０７６号の一部継続出願である、同時継続中の１９９０年 ３月２３日出願の米国特許出願番号４９８．８０９号の一部継続出願である。

ｌ且旦！景 組換え遺伝子学の分野における基本的な手法は、ポ’Ｊ（Ａ）”ｍＲＮＡを二本 鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡへ変換し、次にその二本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクター に挿入し、適切な宿主細胞中で発現させることである。ｄｓ　ｃＤＮＡに対する 分子クローニング法は、例えばＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ編集のＧｅｎｅｔｉｃ　ｎ 　１ｎｅｅｒｉｎ　、　Ｍｏ１．　Ｌ　ｐ、２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）のＷｉｌｌｉａｍｓのｒ　Ｔｈｅ　Ｐｒ ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃＤＮＡ　Ｃ１ ｏｎｅ　ＢａｎｋＪ　、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編集の堕且」胆堕…、　Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）のＭａｎｉａｔｉｓのｒＲ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡＪ　、および５ｔｅｌｏらのＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｎ競丘■、　Ｖｏｌ、　１．　ｐ、　１５．　Ｐｌｅｎｃｖ＋　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７９）のＥｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓらのｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡＪの中で考察がなさ れている。

相当な数の要因が特定の遺伝子のクローニングに影響を及ぼすため、ｃＤＮＡク ローニングのための戦略は注意深く選択しなければならない。多くのｃＤＮＡク ローニング戦略に共通する方法には、目的の生物の細胞からの全ボ’）　（Ａ） ”ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡクローンの集合体であるｒ　ｃＤＮＡライブラリー」 を構築スることが含まれる。

哺乳動物細胞は３０．０００にも上る異なるｍＲＮＡ配列を含み得、例えば存在 量の少ないｍＲＮＡを得るために必要なりローンの数はさらに多数で有り得る。

バクテリオファージλ、コスミド、およびウィルスベクターを含む異なる発現ベ クター中で、真核細胞のゲノムＤＮＡライブラリーを構築する方法が知られてい る。一般的に用いられる方法のいくつかが、例えばＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されてい る。

一旦ゲツムｃＤＮＡライブラリーが構築されると、目的の特定のヒト遺伝子を含 む細胞を何千という宿主細胞の中から単離することが必要である。ｃＤＮＡライ ブラリーから標的遺伝子を単離するために多くの異なる方法が採用され、その成 功度は様々である。これらの方法には、例えば、標的遺伝子のＤＮＡ配列に相補 的な核酸配列を有する標識された＋ｇＲＮＡフラグメントである核酸プローブの 使用が含まれる。この方法を形質転換された細菌宿主中での多数のｍＲＮＡのｃ ＤＮＡクローンに適用スると、プローブと強固にハイブリダイズするコロニーは 標的ＤＮＡ配列を含むことが期待される。次にクローンの同定が、例えば、ｉｎ 　５ｉｔｕハイブリダイゼ一ンヨン／選択（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　６８：２０６　（１９７９））　、ハイブリッド阻害 翻訳法（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、ヒ立井１壮ｌ旺二」」上り違匹二ュ［−値玉上証 一ゴ５ｃｉｅｎｃｅｓ、　７４：４３７０　（１９７７））　、あるいは直接的 なりＮＡの配列決定（ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　 ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａＡｃａｄｅｍ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　 ７４：５６０　（１９７７）、ＭａａｔおよびＳｍ１ｔｈ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　５：４５３７　（１９７８））によ り行われる。

しかしながらこのような方法は、ｃＤＮＡライブラリーから比較的存在量の少な いｍＲＮＡをクローニングすることが目的であるときには大きな欠点を有する。

例えば、直接的な江」匝」コロニーハイブリダイゼーションを用いる際、最初の ライブラリーポピユレーションにおいて、２００中に１より小さい割合で存在す るｌｌｌＲＮＡ種に相補的なｃＤＮＡを含むクローンを検出するのは非常に困難 である。その結果、全ポビニレーシ１ン中の＋５ＲＮＡをを増やす種々の方法（ 例えば、サイズ分画、合成オリゴヌクレオチドの使用、示差ハイブリダイゼーシ ョン、あるいは免疫的精製）が開発され、しばしば存在量の少ない＠ＲＮＡのク ローニングに用いられてきた。このような方法は例えば、上述のＭａｎｉａｔｉ ｓら、Ｍｏｅｃｕｌａ　Ｃｏｎ１　：　ｂ　ａｔｏ　Ｍａｎｕ虹に記載されてい る。

多くの機能的な真核細胞タンパク質が、最初からそれらのＮ末端にリーダーある いはシグナル配列を含む前駆体分子の形で存在している。これらのリーダー配列 は細胞膜に結合し、脂質二分子層を介して残りのタンパク質を引き寄せ、その後 シグナル配列がシグナルペプチダーゼ酵素によって開裂する。

従って、このタンパク質は細胞から分泌された後でのみ（例えば、インシュリン 、血清アルブミン、抗体および消化管酵素）、あるいはこのタンパク質が細胞膜 の外側表面に固定された後でのみ（例えば、組織適合性抗原）機能する。

哺乳動物１９７８球に特有の細胞表面抗原は、細胞表面に固定されるタンパク質 のさらなる例である。哺乳動物においては、骨髄由来の特定の細胞はリンパ球に 成熟し、そのリンパ球は胸腺、膵臓、リンパ節およびリンパ集合体を含むリンパ 組織に存在し、さらに血液およびリンパ系を介して能動的に循環する。成熟リン パ球細胞は２種のポピーレーション：胸腺依存性（Ｔ）ＩＪンパ球および胸腺非 依存性（Ｂ）ＩＪンパ球に分類し得る。Ｔ’Ｊンバ球は胸腺内部に移動し、そこ で分化的な***増殖をする。分化過程においてそれらは、Ｔｈｙ−１、ＴＬＡ％ ｇｖ−１、Ｌｙ−１、ｔ、ｙ−ｚ、Ｌｙ−３およびｔ、ｙ−ｓを含む特有の細胞 表面膜アロ抗原を発現する。それらが成熟するにつれ、１９２８球はＴＬＡ抗原 およびＴｈｙ−１抗原のいくつかを失い、そして組織適合性抗原を得、再循環１ ９７８球を衰微する膜コンフォメーシヲンを得る。このことは例えば、Ｂｉｅｒ ら編集　ｕ　ｄａｍ　ｎｔａｌｓ　ｏ　Ｉｎ　ｕｄ五「策２版、Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎｓ　ｐｐ、　３５−６２　＜１９８６）のＭ ＯｔａｌこよるｒＡｃｔｒｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｉ＠５ａｎｅ　Ｃｅ１ｌｓＪに記載 されている。

１９２８球は抗体の形成に間接的に関わり、従ってその活性は、単に抗体力価の 測定以上に細胞機能の複雑な解析を必要とした。幾分かはこのことのせいで、比 較的最近まで、それらの免疫学的応答能の発達における重要性が認識されなかっ た。成熟１９２８球は、Ｔヘルパー細胞、Ｔサプレッサー細胞、およびＴ細胞障 害性細胞を含む、異なる丁すンパ球すブポピュレーシ１ンの同定のためのマーカ ーとして機能する表面膜タンパク質の固有のパターンを合成しそして発現する。

これらのサブポピニレーションのそれぞれは、免疫系を調節する上で非常に重要 な役割を果たしている（前記Ｍｏｔａ）。

ヒトにおいて、１９２８球の機能的および表現型の異質性は十分認識されている 。２つの主要なサブポピニレーシ目ンが知られている：細胞性免疫を仲介するエ フェクターＴ細胞；およびヘルパーおよびサプレッサーＴリンパ球を含むレギュ レーターＴ細胞。これらの２つのサブポビニレーションは、ヘテロ抗血清、自己 抗体、および細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体によって確定されてる 。例えば、発生の初期には、胸腺内のヒトリンパ球細胞はＣＤ分類２（ＣＤ２） と称するモノクローナル抗体と強く反応し、細胞表面抗原Ｔ１に対するモノクロ ーナル抗体ＣＤ５とわずかに反応するＴｌｌと称する抗原を発現する。成熟過程 において、これらの細胞はＴｌ１（ＣＤ２）を失い、そして、モノクローナル抗 体ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤＩによって確定される３つの新しい抗原を獲得す る。さらに成熟するにしたがって、この胸腺細胞はモノクローナル抗体ＣＤＩに 反応性の細胞表面抗原の発現を終始し、モノクローナル抗体ＣＤ３に反応性のＴ ３抗原を発現し、次に７４　（ＣＤ４）あるいはＴ８（ＣＤ８）を発現する２つ のサブポピニレーシ１ンに分離する。免疫学的応答能はこの段階で獲得されるが 、胸腺リンパ球が胸腺外に移行するまでは、完全には発達しない（前記Ｍｏｔａ ）。多数の胸腺細胞とは対象的に、循環ＴＩＪンパ球はＴｌ（ＣＤ５）およびＴ ３（ＣＤ３）抗原を発現する。Ｔ４（ＣＤ４）抗原は、末梢１９７１球のおよそ ５５−６５％に存在するが、Ｔ８（ＣＤ８）抗原は２０−３０％に発現される。

これらの２つのサブポビュレーシ１ンは、それぞれヘルパーＴ細胞、およびサプ レッサー並びに細胞障害性Ｔ細胞に対応する。

これらの細胞表面抗原は、１９７３球サブポピユレーションを区別する便利な方 法を提供するのに加えて、成熟Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能にとって 重要である。ＴＪｉ［ＩＩＦ！活性化は、Ｔ細胞レセプターのその特異的な抗原 への結合に加えて、Ｔｗｉ胞と標的細胞あるいは刺激細胞との開の細胞表面相互 作用の複雑な過程を包含する。

例えばＣＤ２、ヒトＴ細胞赤血球レセプターは、胸腺細胞および１９２８球を標 的細胞（すなわち赤血球）および胸腺上皮に結合させる。このことは、ＬＦＡ− ３と称する、ヒトに広く分布する表面抗原であるＣＤ２に対する特異的な分子リ ガンドを介して起こる。この現象は長い間、ヒツジ赤血球に対する抗体を産する ヒト細胞の検出、ア・ｙセイ、および精製に用いられてきており、Ｅ−ロゼツト 試験における基礎をなすものである。これについては、Ｚａａｌｂｅｒｇによっ て■鳳Ｌｉｌ：１２３１　（１９６４）に初めて記載された。ＣＤ２／ＬＦＡ− ３相互作用もまた細胞溶解性標的接合（５ｈａｖら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：２ ６２−２６４　（１９８６））　、および混合リンパ球反応（Ｍａｒｔｉｎら、 Ｌ−工ｍ３□　ｌｕ：１１１０−１８５　（１９８３））を仲介することが示さ れている。抗ＣＤ２モノクローナル抗体は、抗原非依存性の経路を介して直接的 に末梢Ｔリンパ球を活性化し得（Ｍｅｕｅｒら、！１Ｌ１３６：［１９７−９０ ６（１９８４））　、ＣＤ２に対するより広い免疫的調節の役割を示している。

１９２８球が細胞媒介免疫の主たるエフェクターであり、そしてまたヘルパーあ るいはサプレッサー細胞として免疫応答の調節に関わっているという２識により 、臨床免疫学が医学へ実際的に適用されることに太き（寄与するものとなった。

この適用の範囲には感染に対する防御、免疫感作による疾患の予防、臓器移植、 血液貯蔵、および免疫系の欠損および免疫学的な機構によ）て仲介される種々の 病気の治療が包含される。さらに、免疫学的な技法は、ホルモンおよび薬物の測 定に用いられるように、臨床検査室において、しばしば用いられる。臨床免疫学 は、例えば、Ｗｅｉｒｌｉ集、■晟匝吐」Ｌムｅ　’ｍｅ　ｔａ　＋ｕｕ　ｏｌ ｏ　°　Ｆｏ　Ｖｏ　ｕｖａｅｓ：　Ｖｏ　ｕｓｅ　：　Ａ　’ａｔｉ　ｎｓ　 ｏ　ｍｍｕｎｏｌｏ　’ｃａ　Ｍ　ｔ　ｏｄｓ　”　ｗｅｄ　ｃａ　Ｓｃ’ｅ　 ｃ且、　４ｔｈ　Ｅｄ、、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕ ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　０ｘｆｏｒｄ（１９１１６）ＨＢｏｇｕｓｌａｓｋｉ ら編集、Ｃ’ｎ’ｃａ　ｍ＋ｌｏｃ　ｍ’ｓｔ　：’　ｃ’　ｓ　Ｍｅｔ　ｏｄ 　ａ　ｄ　’ｃａｔ’　ｎｓ、　Ｌｉｔｔｌｅ、　Ｂｒｏｗｎ　＆Ｃｏ、、　Ｂ ｏｓｔｏｎ　（１９８４）；　Ｈｏｌｂｏｒｏｗら編集、　ｍｍｕ　’　Ｍ　’ ｃｉｎｅ：　Ａ　Ｃｏｗ　ｅｅｎｓｉｖ　Ｇｕｉ　ｅｔｏＣｉ　ｔｅａ　１ｍ＋ １ｕｏｏ　、　２ｄＥｄ、、　Ｇｒｕｎｅ　＆　５ｔｒａｔｔｏｎ、　Ｌｏｎｄ ｏｎ　（１９８３）：およびＰｅｔｅｒｓｄ。

ｒｆらｍ集、　ａ　’ｓｏｎ’ｓ　’ｅｉｌｅｓｏ　Ｉｎｔ　ｎａ　Ｍｄ’ｃ’ 　、１０ｔｈ　ｅｄ、、　ＭｃＧｒａｖ−Ｈｉｌｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ出版、 ｐｐ、３４４−３９１　（１９＋１３）に記載されている。明確には、免疫系を 媒介するタンパク質のより完全な理解は臨床免疫学において重要な宵月性がある 。

上述のような哺乳動物タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するために、哺乳 動物の発現ライブラリーを使用することは、いくつかの有利な点を提供する。例 えば、哺乳動物宿主細胞において発現するタンパク質はＩ！能的で、そしてあら ゆる通常の翻訳後の改変を受ける。通常、細胞内膜系を介して細胞表面に輸送さ れるタンパク質は、完全な輸送工程を経る。哺乳動物発現系はまた、細胞内輸送 機構および細胞表面タンパク質の膜への挿入および固定の機構に関する研究を可 能にする。

「ＣＯ幻細胞と呼ばれる、１つの一般的な哺乳動物宿主細胞は、サル腎臓細胞を 、シミアンウィルス株４０（ＳＶ４０）と称する変異ウィルスベクターで感染さ せることによって形成される。

このベクターは、機能的な初期遺伝子および後期遺伝子を有するが、機能的複製 起点が欠如している。ＣＯ５細胞において、ＳＶ４０？Ｉ製起点を含むベクター でクローニングされたあらゆる外来ＤＮＡが複製されるが、これはＳＶ４０　Ｔ 抗原がＣｏｓ細胞中に存在することによる。この外来ＤＮＡは一過性に、細胞Ｄ ＮＡとは独立してｎＩ製する。

ＣＯ３細胞での発現によって単離された、最近のい（っかのリンホカインｃＤＮ Ａ　（ｌｏｎｇ、　Ｇ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：８１０−８１５　（ １９８５）：　Ｌｅｅ、Ｆ、ら、Ｐｒｏｃｅｅｄ’ｎ　ｓ　ｏ　ｔｈｅ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　８３：２０６１− ２０６５　（１９８６）＋　Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ、ら、ヒｌ」ｅ　’ｎ　ｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｎａｔ’ｏｎａ　Ａｃ　ｄｅ＋ｎ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ 　８３：５８９４−５８９８　（１９８６）：　Ｙａｎｇ、　Ｙ、ら、堕且４７ ：３−１０　（１９１１６））という例外はあるものの、一般には哺乳動物発現 ライブラリーからｃＤＮＡが単離されることはほとんどない。このことの主な原 因として次の２つが挙げられる：第１に、大きなプラスミドライブラリーの構築 のための現行の技法（Ｏｋａｙａｌｌａ、　Ｈ，ら、靭上−貞Ｕニー」土（社） −ス：　１６１−１７０　（１９ａ２））は習得するのが困難なこと、そしてフ ァージのクローニング技法によって得られるもの（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、ら、　ｎ＋ ＤＮＡＣｏ１ｎＶｏ、ＩＡＰａｃｔｉｃａ　ｒ。

ａｓｈ、　Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　（ｅｄ）、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ ｘｆｏｒｄ　（１９８５）、　ｐｐ、４９−７８）とライブラリーのサイズがほ とんど一致しないこと。

第２に、１つの例外（ｌｏｎｇ、　Ｇ、Ｇ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　７Ｌｗ：８１ ０−８１５　（１９８５））はあるものの、既存のベクターは、とりわけＣＯ３ 細胞中での高レベルの発現には適合しないことである。リンホカインｃＤＮＡで の報告された成功例は、これらのｃＤＮＡの発現ライブラリーからの単離が特に 容易であるためであって、用いられる方法の一般的な適合性を意味するものでは ない。リンホカインのパイオアフセイは非常に鋭敏であり（（ｌｏｎｇ、　Ｇ、 Ｇ、ら、鈴±ａ岨２ＪＬｉ＋８１０−８１５　（１９８５）：　Ｌｅｅ、Ｆ、ら 、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆｔ　ｔ’　ａ　Ａｅａｅａ＋　ｏ　Ｓｃ’ｅｎ ｃｅｓ　ＵＳ　８３：２０６１−２０６５　（１９８５）：　Ｙｏｋｏｔａ、Ｔ 、ら、ｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔ’ｏｎａ　ＡｃａｄｅｍＳｃ ’　ｎ　ｅｓ　ＵＳ　８３：５１１９４−５８９８　（１９８６）；　Ｙａｎｇ 、Ｙ、ら、　江ｋｌ　４７＋　３−１０　（１９８６））　、ソしｒｍＲＮＡハ 典型的に、豊富で短い（ｌｏｎｇ、Ｇ、　Ｇ、ら、紅オ瓜劇出：８１０−８１５ 　（１９８５）；　Ｌｅｅ、Ｐ、ら、ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃ　ｄｅｍ　ｏｆ　５ ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ　８３：５８９４−５８９８　（１９８６）；Ｙａｎｇ 、Ｙ　ら、Ｃｅ１ｌ　４７：３−１０　Ｃ１９８６＞）。

従って、哺乳動物宿主における発現は以前は、より常習的なりローニング方法に よって単離された遺伝子によってフードされるタンパク質の同定を確認する方法 としてのみ、最も頻繁に用いられてきた。例えば、５ｔｕｖｅら、Ｊ、　Ｖｉｒ ｏｌ、　６１工ａ：３２７−３３５　（１９８７）、は単純ヘルペスＩＩ型３３ ３株の糖タンパク質（ｇＢ２）の遺伝子を、受容能力を有するＥ、　ｃｏｌｉ　 ＪＭＩＯＩを形質転換するのに用いるＭ１３ベースの組換えファージベクターの プラークハイブリダイゼーションによってクローニングした。このようにして単 離したクローンによってコードされるタンパク質の同定は、哺乳動物ＣＯ３およ びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ）細胞のトランスフェクションにより 確認した。

Ｏｓｈｉｍａらは、ヒト胎盤β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子について ファージλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにプラー クハイプリダイゼータ１ンを用いた。

Ｏｓｈｉｍａら、Ｐ　ｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　 Ａｃａｄｅｍ　ｏ　Ｓｃ’ｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：６８５−６８９　 （１９８７）。単離されたｃＤＮＡクローンの同定は、ＳＶ４０後期プロモータ ーを用いてクローニングされたインサートでＣＯ５−７細胞をトランスフェクト することによって発現するタンパク質の免疫沈降によって確認された。

哺乳動物細胞における一過性の発現は、他のスクリーニング法によって前もって 単離された遺伝子の同定を確認する方法として用いられてきた。Ｇｅｒａｌｄら 、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＶＤ１土榎「６７：２ｆｉ９５−２ ７０３（１９８６）。Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ 　ｔｅａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　２６ユ：１４１１２−１４１１７　（１９８６ ）；　５ｅｉｆら、Ｇｅｎｅ４３：１１１１−１１２１　（１９８６）；　０ｒ ｋｉｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｍ且り璽銭仕ニア ６２−７６７　（１０５）。これらの方法は、しばしば全長のあるいはオーバー ラツプするクローンを同定するためには、非能率的で退屈で、モしてスクリーニ ングを何度も繰り返す必要がある。従来の融合タンパク質の発現に基づいたスク リーニング方法は、非能率的で、大量のモノクローナル抗体を必要とする。これ らの欠点は、非能率的な発現ベクターの使用により倍加され、そのことがタンパ ク質発現レベルを効率的な選択には不適当なものにしている。

及囲旦！且 本発明は、細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡのクローニングのための有力な新 規な方法、効率の良い発現ベクター、特に真核宿主細胞における高いレベルの発 現に適したｃＤＮＡライブラリーを構築する方法、およびその単離されたヌクレ オチド配列並びにそれらのコードされる産生物に関する。

本発明の高度に効率的なりローニング技法は、真核細胞における抗原の一過性の 発現、および培養皿のような抗体でコートされた基質への結合による、該抗原を 発現する細胞の物理的な選択に基づ（。本発明の方法は、発現され得そして真核 細胞の膜表面に輸送され得るあらゆるタンパク質の単離および分子クローニング に有用である。

本発明の細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡをクローニングする方法は、ｃＤＮ Ａライブラリーを調製すること、このｃＤＮＡライブラリーを真核の哺乳動物、 好ましくは組織培養細胞に挿入すること、細胞表面抗原の発現を行わせる条件下 でこれらの細胞を培養すること、これらの細胞を細胞表面抗原−第１抗体複合体 の形成が行われるように細胞表面抗原に特異的な第１の抗体あるいは抗体群に曝 すこと、続いて、細胞表面抗原−第１抗体−箪２抗体複合体の形成を介して細胞 表面抗原を発現する細胞の基質への結合を生じさせるように第１抗体に特異的な 第２抗体でコートした基質に細胞を曝すこと、および結合細胞を結合していない 細胞から単離することを包含する。

本発明のクローニング方法によって、以下のような細胞表面抗原をコードする遺 伝子の単離および分子クローニングが達成された：　ＣＤ１ａ、　ＣＤ１ｂ、、 ＣＤ１ｃ、　ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ？、ＣＤ１３、ＣＤＩ４、ＣＤ１６、ＣＤ１ ９、ＣＤ２０．　ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２１１、ＣＤ３１、ＣＤ ｗ３２ａ、ＣＤｖ３２ｂ％　ＣＤ３３、　ＣＤ３４、　ＣＤ３６、　ＣＤ３７、 　ＣＤ３８、　ＣＤ３９、　ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＩＣＡ Ｍ、、、ＬＦＡ−３、ＦｃＲＩａ、　ＦｅＲＩｂ、　ＴＬｉＳａ、およびＬｅｕ ８抗原。本発明の方法によってクローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列が 決定され、それにコードされたタンパク質のアミノ酸配列が同定された。ＣＤ１ ａ、　ＣＤ１ｂ、　ＣＤ１ｃ。

ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ？、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤＩ　９、ＣＤ２ ０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３１、ＣＤｖ３２ａ、　Ｃ Ｄｗ３２ｂ％ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３ｇ、ＣＤ３９、 ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＩｃＡＭ、　ＬＦＡ−３、ＦｃＲＩ ａ、　ＦｃＲＩｂ、　ＴＬｉＳａ、およびＬｅｕｆｌをコードするようなりロー ニングされた遺伝子もまた本発明の目的である。

一旦抗原をコードする遺伝子が本発明の方法に従ってクローニングされると、そ の遺伝子は原核細胞あるいは真核細胞宿主において発現され得、天然には存在し ないような実質的に純粋な形態でそれにコードされたタンパク質あるいはその一 部分を産生ずる。本発明の別の局面は、実質的に純粋な細胞表面抗原、とりわけ ：　ＣＤ１ａ、　ＣＤ１ｂ、、ＣＤ１ｃ、　ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１ ６、ＣＤｌ９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２ｇ、ＣＤｖ３２ａＳＣＤ ｖ３２ｂ％ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４０、Ｃ Ｄ４４、ＣＤ５３、ＩＣＡＭ、　ＬＦＡ−３、ＦｃＲｌａ、　ＦｅＲＩｂ、　Ｔ ＬｉＳａ、およびＬｅｕ８抗原およびそれらの機能性アナログおよび同等物に関 する。ＣＤ１ａ、　ＣＤ１ｂ、　ＣＤ１ｃ。

ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ？、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０ 、ＣＤ２２、ＣＤ２６、　ＣＤ２７、　ＣＤ２ｇ、　ＣＤ３１、　ＣＤｖ３２ａ 、ＣＤｗ３２ｂ、ＣＤ３３、　ＣＤ３４、　ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３ｇ、Ｃ Ｄ３９、ＣＤ４０．　ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＩＣＡＭ、　ＬＦＡ−３ 、ＦｃＲＩａ％ＦｃＲ１ｂ、　ＴＬｉＳａ、およびＬｅｕ８抗原の一次アミノ酸 配列が決定されている。従って本発明はまた、これらの抗原およびそれらの機能 的同等物のアミノ酸配列、およびこれらの抗原をコードするヌクレオチド配列に も関する。

本発明はまた、非常に大きな哺乳動物発現ライブラリーを発生させ、モして哺乳 動物宿主細胞において多量のタンパク質を産し、その結果として効率的な選択を 行わせる、非常に効率的なｃＤＮＡ発現ベクターにも関する。本発明の特定の実 施態様においては、ｃＤＮＡ発現ベクターは、サプレッサーｔ　ＲＮＡ遺伝子； 　ＳＶ４０起点：　ＨＩＶ　ＬＴＲノー６０から＋８０位の配列に融合シタヒト サイトメガロウィルスＡＤ１６９の即時型エンハンサ−配列で構成されるキメラ プロモーターをサブレ１サーｔＲＮＡ遺伝子とＳＶ４０オリジンとの間に挿入し て含有する合成転写単位；置換可能なりＮＡ配列によって隔てられ、モしてＸｂ ａ１部位に隣接する２つのＢｓｔＸＩ部位を含有するポリリンカー；およびＳＶ ４０スモール１抗原スプライス並びに初期領域ポリアデニル化シグナルを含む。

本発明のさらなる局面は、ＨＩｖＬＴＲの一６０位から＋８０位の配列に融合し たヒトサイトメガロウィルスＡＤ１６９即時型エンハンサ−配列で構成されるキ メラプロモーターを含むｃＤＮＡ発現ベクターに用いられる合成転写ユニットを 包含する。本発明のｃＤＮＡ発現ベクターの配列の小さなサイズでかつ特定の調 節は、ＣＯ３細胞のような宿主哺乳動物組織培養細胞における高度に効率的な複 製を可能とさせる。さらにこのベクターは、短い置換可能なりＮＡ上セグメント よって隔てられた２つの逆配向の■ｔＸ１部位を含むポリリンカーを使用するこ とにより、非常に効率的なオリゴヌクレオチドベースのｃＤＮＡ挿入戦略の使用 を可能にする。

他の局面においては、本発明は他方に対し互いに逆向きの配向の２つの同一の… Ｘ１部位を含有するベクターを包含し、このＢｓｔＸ１部位は短い置換可能なり ＮＡフラグメントにより隔てられる。本発明の他の局面は上述のポリリンカーで ある。

本発明のさらなる局面は、合成りＮＡオリゴヌクレオチドをベクターに挿入する ことが所望されるｃＤＮＡに連結すること、この合成オリゴヌクレオチドに本発 明のポリリンカーの短い置換可能なりＮＡフラグメントと同一の末端配列を与え ること、および得られた合成りＮＡオリゴヌクレオチド末端配列を有するＣＤＮ Ａセグメントを、予めこのベクターから短い置換可能なりＮＡフラグメントが取 り除かれているベクターのポリリンカーに挿入することを包含する、オリゴヌク レオチドベースのｃＤＮＡ挿入法に関する。

本発明に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製する際に、多くの腫瘍にマクロファ ージおよびリンパ球が深く侵入しており、従って、この腫瘍を一般に用いられて いる腫瘍細胞系の代わりにマクロファージあるいはリンパ球の効果的な転写のソ ースとして効果的に用い得ることが発見された。従って他の局面では、本発明は 、本発明の方法によって使用するｃＤＮＡライブラリーを調製するための腫瘍細 胞、とりわけヒト腫瘍細胞に関する。

本発明の強力な選択系の他の宵利な点は、ｃＤＮＡの挿入に際し方向を決める必 要が無いことである。本発明の方法により、λｇｔｌＱおよびλｇｔｌｌのよう なファージベクターについて記載されているのと同様のライブラリー構築効率が 得られ、しかも本発明の方法に従って得られるクローンの複製が容易であるとい うさらなる利点がある。

本発明の免疫選択技法は、モノクローナルあるいはポリクローナルでもあり得る 抗体の、比較的少ない絶対量での効率的な使用を可能にする。本発明の方法は極 めて迅速である。

一般に、標的のｃ　ＤＮＡクローンを単離するために、３回ある（１はツレより 少ない免疫選択と開放とのサイクルが必要テする。

従って、本発明の方法は、細胞表面抗原をコードする遺伝子をクローニングする ときに労力と材料の効率的な利用を可能にする。上述したように、この方法は、 哺乳動物Ｔリンパ球に関連する細胞表面抗原（例えば、ＣＤ１ａ、　ＣＤ１ｂ、 　ＣＤ１ｃ、　ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ？、ＣＤ１３、ＣＤＩ４、ＣＤ１６、ＣＤ １９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２［１，ＣＤ３１、ＣＤ ｗ３２ａ、　ＣＤｗ３２ｂ％ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３ ８、ＣＤ３９、ＣＤ４０．、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＩＣＡＭ、　ＬＦ Ａ−３、Ｆｃ［ｉｌａ。

ＦｃＲＩｂ、　ＴＬｒＳａ、およびＩ、ｅｕ８抗原）をコードする遺伝子を首尾 よくクローニングする方法として用いられる。

本発明の精製された遺伝子およびタンパク質は免疫学的診断および免疫学的治療 の適用に有用であり、これらには、ヒトを含む動物における免疫に媒介された感 染、疾患、異常の診断および治療が包含される。これらはまた、他の抗体および 抗原を同定し、単離し、精製するために用いられ得る。このような診断的および 治療的な使用は、本発明の他の局面を包含する。さらに本発明の実質的に純粋な タンパク質は、治療的な投与のための薬剤あるいは薬学的組成物として調製され 得る。本発明はさらにこのような薬剤および組成物に関する。

区」しυＷ胆 図１．　ベクター０１３のヌクレオチド　１ヌクレオチド番号１−５８９はｐＭ Ｂ　ｌ起点由来であり（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）、ヌクレオチド番号５９０−５９ ７は５ａｃｌ＋リンカ−由来であり（ＡＣＣＧＣＧＴ）、ヌクレオチド番号５９ ８−７９９は合成チロシンサプレッサー　ｔＲＮＡ遺伝子由来であり（ｓｕｐＦ 遺伝子）、ヌクレオチド番号８００−９４７はＡＳＷ　ＬＴＲフラグメントの残 りの部分由来であり（ＰｖｕｌｌからＭｌｕｌ）　、ヌクレオチド番号９４８− １５００はヒトサイトメガロウィルスＡＤ１６９エンハンサ−由来であり、ヌク レオチド番号１５０１−１６５０はＦｉｌｖＴＡＴＡおよびｔａｔ応答エレメン ト由来であり、ヌクレオチド番号１５５１−１７１６はｐｉＬＮＸＡＮポリリン カー由来であり（Ｕ！！！　Ｉ　Ｉ　ＩからＸｂａ）　、Ｘクレオチド番号１７ １７−２５６９はｐｓＶからスプライスおよびポリー付加シグナル由来であり、 ヌクレオチＩ’２５７０−２９１７はＳＶ４０複製起点由来でありＱ５１１か叡 り図目■）、およびヌクレオチド番号２９１１！−２９２２は、ポリリンカー由 来のＲ１部位の残りの部分であるｐｉＶＸ由来である。

図２．　ＣＤ２ｃＤＮインサートのヌクレオチド　１ヌクレオチド番号を右側括 弧内に、アミノ酸番号を左側に示している。アスパラギン結合炭化水素（ＣＨＯ ）が付加する潜在部位の位置および推定のトランスメンブレン（ＴＭ）配列が示 されている。アミノ酸配列については、分泌シグナル配列の推定開裂部位から番 号をつけている。

図３．　ＤＭ８　ベタ　−の ＣＤＭＩＩベクターは、マウスおよびサル細胞の両方における効率の高い発現の ために選択された変異体ポリオーマウィルスの初期領域の欠失変異体を含む。実 質的にすべてのヒト免疫不全プロモーター領域がヒトサイトメガロウィルスの即 時型プロモーターの同族配列により、および真核のプロモーターとｃＤＮＡ挿入 部位との間でのバクテリオファージエフプロモーターの挿入により置換される。

矢印は転写の方向を示す。

図５．　１に３Ｍベクターの　′ 転写の方向は矢印で示される。Ｂｓ　ｔＸ　Ｉクローニング部位をはさむ制限エ ンドヌクレアーゼ部位を示す。

図６．ｐｊＨ３Ｍベクターのヌクレオチド　Ｉ７つのセグメントが存在する。１ −５８７残基はｐＢＲ３２２複製起点由来であり、５８８−１１８２はＭＬ３起 点由来、１１１１３−１３１１４は５ｕｐＦ遺伝子由来、１３８５−２２３８は キメラサイトメガロウィルス／ヒト免疫不全ウィルスプロモーター由来、２２３ ９−２６４７は置換可能なフラグメント由来、２６４ｇ−３５４７はプラスミド ｐＳＶ２　（スプライスおよびポリアデニル化シグナル）由来、および３５４１ １−３９００はＳＶ４０ウィルス起点由来である。

図１７．ＣＤ４０のヌクレオチド　１ １豆ユ１史屋Ｘ里 本発明は細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡをクローニングする新規な方法、お よびｃＤＮＡを構築する方法に関する。本発明はまた特定のｃＤＮＡ発現ベクタ ーおよびベクターの構成成分、この方法によって単離されたヌクレオチド配列あ るいは遺伝子、そのｃＤＮＡセグメントにコードされた実質的に純粋な細胞表面 抗原および単離されたヌクレオチド配列およびコードされた産生物を用いる方法 に関する。

以下の記載において、参照される種々の方法は、組み換え遺伝子工学の当該分野 には周知である。刊行物および他の参照される周知の方法において示される材料 はその全体がここに参考として援用されている。一般的な組換えＤＮＡ技法を記 述する標準的な参考文献として、Ｉ）ａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、ε、ら、初お目■肛 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏ　、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋ ｓ、Ｉｎｃ、出版、　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、（１９８６）；　Ｌｅｖｉ ｎ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｌ坦し■、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ出版Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、（１９８５）：　Ｏｌｄ、Ｒ，Ｗ、ら、なｎ亘ｌｅｓ　ｏ ｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉ　ｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　ｌ　ｔ　ｏｄｕｃｔｉｏ　 ｔｏ　Ｇｅｎｅｔ’ｃｂＬヨ狙■ｕ、２ｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ 　（１９１１１１）；　およびＭａｎｆａｔｆｓ、　Ｔ、ら、Ｌｎ剋ムｒ　Ｃ１ ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｆｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ（１９８２）が挙げられる。

用語「クローニング」は、特定の遺伝子あるいは他のＤＮＡ配列をベクター分子 内に挿入する、インビトロでの組換え技法の使用を意味する。所望の遺伝子のク ローニングを成功させるために、ＤｆｆＡフラグメントを得る方法、その７ラグ メントをベクター分子に結合させる方法、その混成りＮＡ分子を、ＤＮＡが複製 できる宿主細胞に導入する方法、および受け入れ宿主細胞の中から標的遺伝子を 有するクローンを選択する方法を使用することが必要である。

用語ｒｃＤＮＡＪは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用に よってＲＮＡｍ型から生産された相補的ＤＮＡあるいはコ＋：’　−ＤＮＡを意 味する。従ってｒ　ｃＤＮＡクローン」は、目的のＲＮＡ分子に相補的で、クロ ーニングベクター内に保持される二重らせんのＤＮＡ配列を意味する。

用４　ｒ　ｃＤＮＡライブラリー」は、一つの生物の全遺伝子を−そろいｃＤＮ Ａ挿入物として含む組換えＤＮＡ分子の集合体を意味する。このようなｃＤＮＡ ライブラリーは、当該分野で認識された方法、例えば、上記Ｍａｎｉａｔｉｓら のＭｏ１ｅｃｕｌａ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂ匹」１幻ｌ−淘り且１１に 記載の方法によって調製し得る。一般に、まず、特定の遺伝子をクローニングす ることが所望されるゲノムを有する生物の細胞からＲＮＡが単離される。本発明 の目的としては好ましくは哺乳動物、特にヒトの細胞株である。さらに好ましく はヒト膿瘍細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬおよびヒトリンパ芽球細胞株ＪＹである。ある いは、ＲＮＡは動物の膿瘍由来の腫瘍細胞から単離され得、そして好ましくはヒ ト腫瘍から単離される。

従ってライブラリーは、例えばヒト副腎膿瘍から調製され得るが、任意の腫瘍が 使用し得る。

本発明の免疫選択クローニング方法は、細胞から特定の遺伝子を含む全ＲＮＡを 抽出することによりｃＤＮＡライブラリーを調製すること、そのＲＮＡから相捕 的な一連の二重鎖ｃＤＮＡフラグメントを合成すること、およびこれらのｅＤＮ Ａフラグメントを組織培養中の哺乳動物細胞に導入することを包含する。哺乳動 物細胞は、タンパク質（すなわち、細胞表面抗原）の発現を可能にする条件下で 維持される。得られた細胞を細胞表面抗原に特異的な第１抗体あるいは抗体のプ ール（グループ）に曝す。これにより、細胞表面抗原−第１抗体複合体が形成さ れる。

この複合体を、第１抗体に特異的な第２抗体でコートされたあるいは結合した基 質に曝す。細胞表面抗原を発現する細胞は基質に結合する（細胞表面抗原−第１ 抗体−第２抗体の複合体が起こるため）。結合している細胞を結合していない細 胞から分離する。

ｋ」人へ１風 総ＲＮＡの単離にはチオシアン酸グアニジン／ＣｓＣ１法が好ましい。さらに好 ましくは、ＧｕＳＣＮ／　ＣｓＣ１法の変法のチオシアン酸グアニジン／ＬｉＣ １法であり、こちらの方が処理能力、速さにおいて優れている。簡単に述べると 、所望の混合物１ｍｌに対して、２５％のＬｉＣ１（０，４５ミクロンのフィル ターで濾過したものを保存）０．５８■ｌに溶解した０、５ｇのＧｕＳＣＮおよ び２０μｌのメルカプトエタノールを加える。細胞を遠心し、ペレットを振動（ フリッキング）によって壁土に分散し％　５　ｘ　１０７までの細胞に対し１ｓ ｌの溶液を加える。得られた混合物をポリトロンによって粘稠性がなくなるまで 剪断する。小さな規模の試料（１０８細胞以下）に対し、１．５ｓｌの５．７Ｍ 　ＣｓＣ１（ＲＮアーゼを含まない；ｐＨ８，１ｈＭ　ＥＤＴＡ各１ｓｌに対し １．２６ｇのＣｓＣ１を加える）上に剪断混合物２ｍｌを層にし、ＲＮアーゼを 含まない水を重層し、５ｗ５ｓを５０ｋ　ｒｐｍで２時間遠心する。大きな規模 の試料に対しては、５Ｗ２８チユーブ中の１２ｍ１のＣｓＣ１上に２５ｉ１を層 にし、２４ｋ　ｒｐｍで８時間遠心する。内容物を減圧フラスコにつないだ滅菌 したパスツールピペットを用いて注意深く吸引する。一旦ＣｓＣ１界面を通り越 したら、ピペットの先でチューブの周りのバンドをかき集め、チューブの壁土の 層が落ちるのを防ぐ。残ったＣｓＣ１溶液を吸引する。ペレットを水中に取る（ 再溶解しないようにする）。１／１０容量のＮａ０Ａｃおよび３容量のＥｔＯＨ を加え、得られた混合物を遠心する。必要であれば、ペレットを水中に再懸濁す る（例えば７０°で）。濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整し、凍結する。小さなＲＮＡ 　（例えば５Ｓ）は落ちない。少量の細胞に対しては容量を小さくし、グラジェ ント上でＧｕＳＣＮにＲＮアーゼを含まない水を重層する（沈降はＲＮＡを希釈 するとき能率が悪い）。

二二ｒ１佳へ鳳Ｉ 次に、ポリＡ“ＲＮＡは、好ましくはオリゴｄＴ選択法によって調製し得る。簡 単に述べると、使い捨てのポリプロピレンカラムを５ＭのＮａＯＨで洗浄し、そ して次にＲＮアーゼを含まない水ですすぐことによって調製する。各１ｍｇの全 ＲＮＡに対し約０．３ｓｌのオリゴｄＴセルロース（最終的にベッドをパ・ツク する）を使用する。オリゴｄＴセルロースを１ｓｌの０．ＩＭ　ＮａＯＨ中に約 ０．５ｓｌの乾燥粉末を再懸濁してカラム内に移すか、あるい以前に使用したカ ラムにＯ，ＩＮ　ＮａＯＨを浸透させて調製する（カラムは何回も再利用できる ）。これをカラム容量の数倍のＲＮアーゼを含まない水で、ｐＦＩが中性になる まで洗浄し、２−３ｓｌのローディングバッファーですすぐ。次にカラムベッド を取り除き、４−６ｍ１のローディングバッファーを用いて、滅菌したｌＳｍ１ のチューブに入れる。全ＲＮＡを２−３分間７０℃に加温し、ＲＮアーゼを含ま ないストックからＬｉＣ１を０．５Ｍまで加え、１５ｍ１チユーブ中でオリゴｄ Ｔセルロースと結合させる。次に１０分間渦状に混合するか攪拌する。生成物を カラムに注ぎ入れ、３ｓｌのローディングバッファーおよび続いて３１の中間洗 浄バッファーで洗浄する。

ａ＋ＲＮＡを１．５ｓｌの２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１％ＳＤＳを用いて、ｓｗ ｓ　ｓチューブに直接溶出する。最初の２〜３滴は捨てる。

溶出したｍＲＮＡを１／１０容量の３Ｍ　Ｎａ０Ａｃを加えることによって沈降 させ、ＥｔＯＨでチューブ満たす。次にこれを混合し、３０分間−２０℃で冷却 し、５０ｋ　１ｍで５°Ｃにて３０分間遠心する。ＥｔＯＨを注ぎ出して、チュ ーブを風乾する。ｍＲＮＡペレットを５Ｏ−１００ｕｌのＲＮアーゼを含まない 水に再懸濁する。約５ｕｌを７０℃でＭＯＰＳ／ＥＤＴＡ／ホルムアルデヒドに 溶解し、品質をチェックするためにＲＮアーゼを含まない１％アガロースゲル上 で泳動させる。

Ｑ…皇底 次にｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡ合成の好ましい方法はＧｕｂ　ｌｅｒおよび Ｈｏｆｆｍａｎ　（蝕皿、　ＬＬ：２６３−２６９　（１９８２））に記載の方 法の変法である。この方法は以下のように行われる：ａ。第１鎖。４ｕｇの＋＊ ＲＮＡをマイクロッエージチューブに入れ、３０秒間約１００℃に加熱し、氷上 で冷却する。ＲＮアーゼを含まない水で容量を７０ｕｌに調整する。以下のもの を加える：　２０ｕｌのＲＴＩバッファー、２ｕｌのＲＮアーゼインヒビター（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ　３６ｕ／ｕｌ）、ｌｕｌの５ｕｇ／ｕｌのオリゴｄＴ（ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、’１．５ｕｌの２０ｍＭ　 ｄＸＴＰ’ｓ（超純粋）、ｌｕｌのＬＭ　ＤＴＴ、および４ｕｌのＲＴ−ＬＸ（ Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４　ｕ／ｕｌ）。得られた混合物を４２℃で４ ０分間インキコベートする。加熱して不活性化する（７０℃で１０分間）。

ｂ、第２鎖。３２０ｕｌのＲＮアーゼを含まない水、８０ｕｌのＲＴ２バ’ｔフ ァー、５ｕｌのＤＮＡポリメラーゼ　ｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、５　Ｕ／ｕｌ ）、２ｕ１のＲＮアーゼＨ（ＢＲＬ　２　ｕ／ｕｌ）。１５℃で１時間インキュ ベートし、２２℃で１時間インキュベートする。　２０ｕｌの０．５Ｍ　ＥＤＴ Ａ、　ｐｉ（ａ、ｏを加えフェノール抽出し、０．５ＭまでＮａＣ１を加えるこ とによってＥｔＯＨ沈降させ、直鎖のポリアクリルアミド（キャリア）を２０％ ｇ／ｍｌまで加え、チューブをＥｔＯＨで満たす。マイクロッエージチューブ中 で２−３分間遠心し、取り出し、沈降がチューブの壁の高くまで上がるように渦 状に攪拌し、さらに１分間遠心する。

Ｃ，アダプター。沈降したｃＤＮＡを２４０ｕｌのＴＥ（１０／１）中に再懸濁 する。３０ｕｌの１０ｘ低塩バツフアー、３０ｕｌの１０Ｘ低塩バツフアー、３ ０ｕｌのＩＯＸ結合反応付加物、３ｕｌ（２，４■ｇ）のキナーゼ処理１２−ｍ ａｒアダプター、２ｕｌ（１，６■ｇ）の牛ナーゼ処理８−ｍａｒアダプター、 および１ｕ１７７）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ、　４００ｕ／ｕｌ 、あるいはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｉ　Ｗｅｉｓｓ　ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加え る。　１５°Ｃで一晩インキュベートする。上記のようにフェノール抽出し、Ｅ ｔＯＨ沈降させ（今回は余分なキャリアは不要である）　、１００ｕｌのＴＥ中 に再懸濁させる。

ベク　−におけるｃＤＮＡフラグメントの本発明の１ｉｉｘ１ベースのｃＤＮＡ 発現ベクター（下記参照）とともに使用するために、ベクター上のＢｓ　ｔＸ　 １部位に相当する末端配列を有するオリゴヌクレオチドのセグメントを、挿入を 所望するｃＤＮＡフラグメントに連結させる。得られたフラグメントを分画して プールする。好ましい方法は、以下のようにして行う： ２０％ＫＯＡ、　２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌｕｇ／ｍｌのｌ：ｔｈＢｒ溶液、および ５％ＫＯＡｃ。

２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｔｕｇ／ｍｌ　ＥｔｈＢｒ溶液を調製する。２．　ｆ＋ｓ ｌの２０％にＯＡｃ溶液を小さなグラジェントマーカーのバックチャンバーに加 える。２つのチャンバーを結合させているチューブから、溶液を前方のチャンバ ーに流入させ、後ろに傾けることによって気泡を取り除く。チャンバー間の通路 を閉じ、２．５ｍｌの５％溶液を前方のチャンバーに加える。もし前回の遠心に よってチューブ内に液体が残っていたら、５％溶液をチューブの端まで流し、そ の後チャンバーにもどす。装置を攪拌板の上に置き、かき混ぜ棒が可能な限り速 く動くようにセットし、２つのチャンバーをつないでいるストップコックを開き 、次に前方のストップコックを開く。ポリアロマ−５ｖｓｓチユーブをＫＯＡｃ 溶液で底から満たす。グラジェントに１００μｌのｃＤＮＡ溶液を重層する。バ ランスチューブを準備しグラジェントを２２℃で３時間５０ｋ　ｒｐｙａで遠心 する。グラジェントから画分を回収するために、５Ｗ５５チユーブの底の近くに バタフライ注入セットを用いて穴をあけ（１ｕｅｒ　ｂｕｂは取り外しておく） 、３つの０．５！ＩＩ画分、次に６つの０．２５ｍ１画分をマイクロフニージチ ューブ内に集める（それぞれ約２ｚ滴および１１滴）。線状のポリアクリルアミ ドを２０μｇ／ｍｌまで加えそしてチューブを上端までＥｔＯＨで満たすことに より分画をＥｔＯＨ沈降させる。チューブを冷却した後、マイクロッ二−ジで３ 分間遠心する。攪拌し１分間再遠心する。

ペレットを７０％ＥｔＯＨですすぐ（再遠心する）。完全には乾燥させない。各 ０．２５ｍ１ＩＩ分を１０μｍのＴＥ中に再懸濁する。１％アガロースミニゲル 上で１　ｕｌを流す。最初の３画分とｌｋｂより小さないかなる物質をも含まな い最後の６画分をプールする。

サプレッサーｔ　ＲＮＡプラスミドは既知の方法によって増殖させ得る。本発明 による好適な方法においては、５ｕｐｌ”プラスミドは第２のプラスミドである ｐ３を含む非サブレッシング宿主中で選択され、このｐ３はアンバー突然変異し た、アンピシリンおよびテトラサイクリン薬剤耐性エレメント（Ｓｅｅｄ、　１ ９８３）を含む。ｐ３プラスミドはＰＲＩ由来であり、５７ｋｂの長さを有し安 定して維持されるノングルコビーのエビソームである。このプラスミドのアンピ シリン耐性は高率で機能を失うので、ａｍｐ’プラスミドは通常ｐ３含有株中で は使用し得ない。ｔｅｕＷ性のみに対する選択でも、ａｍｐ＋　ｔｅｔ耐性に対 する選択と同様に良好である。しかしながら、自然発生する染色体サプレッサー ｔ　ＲＮＡの突然変異は、この系において避は難いバックグラウンド（約１０− ９の頻１１１ｉ：）を呈示する。自然発生的なサプレッサー突然変異から生じる コロニーは通常プラスミド形質転換から生じるコロニーよりも大きい。サプレッ サープラスミドは典型的に１２．５ｋｇ／ｍｌのａｍｐおよび？、　５１ｔ　ｇ ／ｍｌのｔｅｔを含むＬＢ培地中で選択される。大きなプラスミド調製物に対し ては、グリセロール（０８％）を含むＭ９カサミノ酸培地が炭素源として用いら れ得、細菌が飽和状態まで増殖する。

ベクターＤＮＡは既知の方法で単離し得る。以下に示す方法は１リツターの飽和 細胞から得たプラスミドに好適である。

ｌワ／ターのＪ６瓶に入れた細胞を、４．２ｋ　ｒｐｒａで２５分間遠心する。

ｐＨ８の４０ｍ１の１０１ＩＩ１０１ＩＩ中に再懸濁する（柔らかい表面をたた （）。１ｌｈｌのＱ、２Ｍ　ＮａＯＨ，１％ＳＤＳを加え、透明で粘稠になるま で渦状に攪拌するａ　４０ｍ１の５Ｍ　ＫＯＡｃ、　ｐＨ４，７（２，５Ｍ　Ｋ ＯＡｃ、２．５Ｍ　ＨＯＡｃ）を加え、やや勢いよく振盪する（塊が２−３■の 大きさになるまで）。（同じ容器で）　４．２ｋ　ｒｐｍで５分間遠心する。

上清を荒巨薄地の綿布を通して２５０ｍ１の瓶に注ぐ。瓶をイソプロピルアルコ ールで満たす。Ｊ６瓶を４．２ｋ　ｒｐｍで５分間遠心する。

瓶から水分を流出させ、７０％ＥｔＯＨで穏やかにすすぐ（ペレットが７ラグメ ント化するのを避ける）。瓶を逆さにして、キムワイブで残ったＥｔＯＨを除去 する。３．５ｍｌのＴｒｉｓ塩基／　ＥＤＴＡ２Ｑｄ／１０ｍＭ中に再懸濁する 。３．７５ｍ１の再懸濁ペレットをＣｓＣ１４，５ｇに加える。０．７５ｍ１の １０ｍｇ／＋１臭化エチジウムを加えて混合する。ＶＴｆｌｌＯチューブを溶液 で満たす。８０ｒｐｒｘの速度で２．５時間以上遠心する。ｌｌ１ｌのシリンジ および２０ゲージ以下の針を用いて可視光でモニターしてバンドを抽出する。チ ューブの先端を切り、バンドの約３＋ａｍ下方で針の斜面を上にしてチューブに 対して約３０’の角度で針を上向きに挿入する（即ち、できるだけ浅く）。バン ドを取り除いた後、チューブの内容物を漂白剤に注ぎ入れる。抽出したバンドを １３ｓｌの５ａｒｓｔｅａｔチユーブに入れる。チューブの上までＩＭ　ＮａＣ １飽和ｎ−ブタノールで満たし、抽出する。もし非常に大量のＤＮＡが得られた ら再抽出する。ブタノールを５Ｍ　ＮａＯＨを含むトラップ内に吸引する（エチ ジウムを分解するため）。ＤＮＡにほぼ等容量の１Ｍ酢酸アンモニウムを加える （スカート瓶）。約２容量の９５％エタノールを加える（スカート瓶）。ＩＯＫ 　ｒｐｍで５分間、Ｊ２−２１で遠心する。ぺレットを注意２＜７０％エタノー ルですすぐ。綿棒あるいは凍結乾燥器を用いて乾燥させる。

クローニングに用いるベクターは既知の方法で調製し得る。

好ましい方法では、まず２０Ｍｇのベクターを２００μｌの反応溶液中で１００ ユニツトのＢｓｔＸＩ　ＣＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断し、十分 に温度制御された水浴（即ち、循環水浴）中で１晩５０℃で切断する。上述の５ Ｗ５５チユーブ中に２つのＫＯＡｃ　５−２０％の濃度勾配を：ｌｕする。各チ ューブに１００μｍの消化されたベクターを加え、２２℃で３時間５０Ｋ　ｒｐ ｍで遠心する。３００ｎｍのＵＶ光の下でチューブを試験する。所望のバンドは チューブの２７３の長さ分移動り、ている。バンドが前方に引きずっているのは グラジェントが過負荷状態であることを意味している。１ｍｌのシリンジおよび ２０ゲージの針を用いてバンドを取り除く。直鎖のポリアクリルアミドを加え３ 容量のＥｔＯＨを加えることによってプラスミドを沈降させる。５０μｌのＴＥ 中に再懸濁させる。一定量のベクターおよび増加する量のｃ　ＤＮＡを用いて連 結反応を行わせる。

これらの試験的連結反応を基に大きな規模の連結反応を既知の方法で開始する。

通常は全ｃＤＮＡｍ製物に対し、１−２Ｍｇの切断されたベクターが必要である 。

アダプターは既知の方法で調製され得るが、粗製アダプターを１Ｍｇ／μｌの濃 度に再懸濁し、Ｍｇ５Ｏａを１ｈＭまで加え、５容量のＥ　ｔｏｌ（を加えるこ とによって沈降させることが好ましい。

７０％ＥｔＯＨですすぎ、ＴＥ中に１Ｍｇ／μｌの濃度で再懸濁する。キナーゼ 処理に対しては、２５μｍの再懸濁アダプターを取り、３μｌのＩＯＸキナーゼ 処理用バッファーおよび２０ユニツトのキナーゼを加え、３７℃で１晩インキユ ベートする。

本発明による上記の好ましい方法におけるバッファーの調製は当業者には明らか である。簡便のために好適なバッファー組成を以下に示す： ローディングバッファ一：　０．５Ｍ　ＬｉＣ１，１０ｍＭ　）リスｐＨ７，５ ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　０．１％ＳＤＳ。

中間洗浄バッファー：　０．１５Ｍ　ＬｉＣ１，１０１１ＭトリスｐＨ７，５、 ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ　０．１％ＳＤＳ。

Ｒｔｌバッファー：　０．２５Ｍ　トリス　ｐＨ１１，８（４２℃で８．２）、 ０．２５ＭＭＣｌ、　３０ｍＭ　ＭｇＣｈ、 Ｒｔ２バッフｙ　：０．ＩＭ）リスｐ■７．５．２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．５ ＭＫＣｌ、　０．２５ｍｇ／ｉｔ　ＢＳＡ、　５０ｍＭ　ＤＴＴ。

ｔａＸ低塩：６０１１Ｍ０１１ＭトリスルＳ、６０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ａ＋ Ｍ　ＮａＣ１，２５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　？ｈＭ　Ｍｅ。

ｉｏｘ連結付加物：１ｍＭ　ＡＴＰ、　２０＋＊Ｍ　ＤＴＴ、　１ｍｇ／ｍｌ　 ＢＳＡ、　１０ｍＭスペルミジン、 １０Ｘキナーゼ処理用ハツ７ｙ　：０．５Ｍ　）リスｐＨ７，５，１０ｍＭＡＴ Ｐ、　２０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｈＭスペルミジン、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　１０ ０鵬Ｍ　ＭｇＣ＋２゜ （以下余白） 用語「ベクター」は、プラスミドあるいはバクテリオファージ由来で、その中に ＤＩｉＡフラグメントが挿入されるか、あるいはクローニングされ得るＤＮＡ分 子を意味する。１個のベクターは１以上の固有の制限部位を含有し、クローニン グした配列が再生産されるような限定された宿主あるいはビークル生物中で自律 的に復製し得る。従って、用語ｒＤＮＡ発現ベクター」は、自律性のエレメント のゲノムに付加的なりＮＡ配列が組み込まれた後に宿主中で宿主の染色体とは独 立に複製し得る、あらゆる自律性のエレメントを意味する。そのようなりＮＡ発 現ベクターには、最近のプラスミドおよびファージが含まれる。

しかしながら、本発明の目的のために好ましいのは、シミアンウィルス株４０（ ＳＶ４０）由来のベクターのようなウィルスベクターである。ＳＶ４０は２８Ｍ ｄａｌの分子量を有するパボーバウイルスで、３Ｍｄａｌの分子量を有する環状 の２本鎖ＤＮＡを含有しており、このＤＮＡはウィルスのすべてのゲノムを含ん でいる。この１本鎖の小さな共有結合によって閉環している環状ＤＮＡ分子の全 ヌクレオチド配列は決定されている。Ｆｊｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１ １３−１２０　（１９７８）＋　Ｒｅｄｄｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２００：４９ ４−５０２　（１９７８）。

ＳＶ４０のウィルス性ＤＮＡは大量に得られ、種々のウィルス性機能に関連する ゲノム領域は、このＤＮＡの詳細な物理的マツプどおりに正確に位置している。

前述のＦｉｅｒｓら、Ｒｅｄｄ　ｙら。ＳＶ４０のウィルスゲノムは無性的に増 殖しながら、あるいは細胞染色体の不可欠部分として増殖し、ゲノムの復製と発 現により豊富な情報が存在する。

また本発明の目的にとって好ましいのは、Ｍ２Ｓと称する１本鎖のバクテリオフ ァージクローニングビークルである。このＭ２Ｓは約６．５ｋｂの閉環ＤＮＡゲ ノムを有する。Ｍ２Ｓをクローニングビークルとして用いることの１つの利点は 、感染細胞から放出されるファージ粒子がクローニングされたＤＮＡの相補的２ 本鎖の１方のみに相同な１本鎖ＤＮＡを含有することであり、そのことによって ＤＮＡ配列決定分析の鋳型として用い得る。

本発明の目的にとってさらにより好ましいのは、ｐｉｌ１３、ｐｉＨ３Ｍ、およ びＣＤＭ８と称する発現ベクターであり、これらはアメリカンタイプカルチャー コレクシテン（ＡＴＣＣ）、１２３０１　ｆ’ａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０８Ｓ２に寄託されているＯ　Ｉ）ｉＨ３はＡＴ ＣＣに１９８８年２月２４日に寄託され、受託番号はＡＴＣＣ６７６３４である 。

ｐｉＨ３ＭはＡＴＣＣに１９８８年２月２４日に寄託され、受託番号はＡＴＣＣ ６７６３３である。ＣＤＭ８はＡＴＣＣに１９８８年２月２４日に寄託され、受 託番号はＡＴＣＣ６７６３５である。

用語「組織培養」は、細胞構造あるいは機能あるいはその両方のさらなる分化お よび保存を可能にするための、インビトロでの動物組繊細胞の維持あるいは成長 を意味する。「１次組繊細胞」とは、１つの生物において同一の機能を行う同種 の細胞からなるポビニレーションから直接に採られた細胞である。例えば、この ような組繊細胞をタンパク質分解酵素であるトリプシンで処理し、個々の１次組 繊細胞に分離し、高密度で培養皿に蒔くとよく成長する。組織培養中の１次細胞 の増殖から生じる細胞培養は、「２次細胞培養」と称される。はとんどの２次細 胞は有限的に倍数に***し、そして死ぬ。しかしながら、わずかな２次細胞がこ の「危機期間」を通過し得、この後無限に増殖することが可能になり、連続的な 「細胞系」を形成する。細胞系は多くの場合余分の染色体を含み、通常は他の点 についても異常である。これらの細胞が永代的であることは癌細胞と共通した特 徴である。

本発明による組織培養細胞として用いるのに好適な細胞系には、ｒｃＯｓＪと称 されるサル腎臓細胞系が含まれる。ｃｏｓ細胞は、機能的初期遺伝子領域を含む が、ウィルスＤＮＡｍ製起点を欠＜　ＳＶ４０　ＤＮＡによって形質転換された 細胞である。ｃｏｓ細胞クロりンＭ６は、本発明の方法に使用するのに特に好適 である。

マウスｒｆＯＰＪ細胞もまた本発明の目的に好適であり、この細胞はポリオーマ 起点欠失ＤＮＡでトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞である。ｃＤＮＡは 本発明の宿主組織培養細胞に、当業者に既知の任意の方法で導入される。トラン スフェクシヨンは、例えばプロトプラスト融合、スフェロプラスト融合、あるい はＤＥＡＥデキストラン方法によって行われ得る（　Ｓｕｓｓｍａｎら、Ω杜Ｌ 」■Ｌｉ：１６４１−１６４３　（１９８４））。

スフェロプラスト融合を行う場合は、１つの好適な方法は、５ａｎｄｒｉ−Ｇｏ ｌｄｒｉｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　旧ｏ、　ｌニア４３−７５２　（１９８１） に基づく以下の変形法である。闇単に述べれば、例えば、６個の融合体からなる １組を得るには、ブロス中の細胞１０ｈｌを必要とする。増幅可能なプラスミド を含有する細胞をＬＢ中ＯＤ　６００＝０５に増殖させる。スペクチノマインン をｔｏｏ　ｕｇ／＋１１まで添加スる（またはクロラムフェニコールを１５０　 ｕｇ／ｍｌまで添加する）。

３７℃で振盪しながらｔｏ−ｔｓ時間インキ二ベーシ１ンを続ける。

（細胞はスペクチ／マイシンまたはクロラムフェニコール培地でインキユベーシ ョンを長く続けると溶解を始める。）培養物１００＋ａｌを１０．ＯＯＯｒｐｍ で５分間、遠心分離して沈澱させる（ＪＡ１４／ＧＳＡロータ、２５０ｍ１ボト ル）。十分に排水して、ペレットを５ｍｌの冷たい２０％スクロース、５０ｍＭ トリス−［ＩＣＬ　ｐＦＩＢ、０を含有するボトル内で再懸濁させる。氷上で５ 分間インキュベートする。２＊１の冷たい０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＦＩＢ、０ を添加し、３７℃で５分間インキュベート（水浴）する。氷上に置き、顕微鏡に よりスフェロプラストへの転換率を調べる。フローフード内で、２０■ｌの冷た いＤＭＥ／　１０％スクロース／　ＩＱｍＭ　ＭｇＣｈを徐々に添加する（滴下 、１秒間に約２滴）。６ｃｍ皿に前日プレートした細胞かう培地を除去するＣ５ ０％コンフルエンス）、５ｍｌのスフェロプラスト懸濁液を各国に添加する。皿 を拭動するパケット遠心機内の管状搬体の先端部に置く。一度に６皿までの調製 が可能である。皿は互いの上に積み重ね得るが、３段重ねは、最上部の皿のスフ ェロプラスト層が遠心分離の後に破裂または分離することが多いため推められな い。１１００Ｏｘで１０分間遠心分離する。力は底プレートまでの回転半径に基 づいて計夏する。皿から液を慎重に吸引するａ　１．５−２ｍ１の５０％（ｗ／ ｖ）　ＰＥＧ　１４５０（またはＰＥＧ　１０００）　１５０％ＤＭＥ　（血清 なし）を皿のまん中にピペットで移す。必要であれば、ＰＥＧが皿全体にわたっ て均一におよび放射状に確実に広がるようにピペットの先端部を周囲に回しなが ら移す。ＰＥＧを最後の皿に添加した後、すべての皿を各々の蓋の上に立てかけ て、ＰＥＧ溶液が底に集まるようにする。ＰＥＧを吸引する。融合を促進するに は、細胞上に残留するＰＥＧの薄層で十分である。残留層は洗い流すのが間車で あり、またＰＥＧの塊りが後に残る場合より、細胞の生存能力が向上し得る。Ｐ ＥＧ溶液との接触後９０秒から１２０秒（ＰＥ０１０００）または１２０秒から １５０秒（ＰＥ０１４５０）で、１．５ｉ１のＤＭＥ　（血清なし）を皿の中央 部にピペットで移す。ＰＥＧ層はＤＭＨにより放射状に押し流される。皿を傾け て吸引する。ＤＭＥ洗浄を繰り返す。１５Ｍｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンを含 有する３ｍｌのＤＭＥ／　１０％血清を添加する。インキュベーター内で４−６ 時間インキュベートする。

培地および残留する細菌懸濁物を除去し、さらに培地を添加して、２−３日イン キュベートする。ＰＥＧを除去するために細胞層を洗浄しすぎると、細胞の多く を除去するため実質的な効果が得られないことが多い。２回目のＤＭＥ洗浄で細 胞を数分間放置すると、スフェロプラスト層のほとんどが自然に現れてくる。し かし、蘭単に洗浄して、３７゛Ｃで完全培地にて層を引き離すのが好適である。

ＰＥＧ溶液は、好適には、６０℃で新しいボトルのＰＥＧを溶解させ、５０ｍ１ の遠心分離管により約５０ａ＋１分量を予め重量を測定したボトルに注ぐことに より調製され得る。この分量されたＰＥＧを暗室で５℃で保存する。新しいボト ルの作製は、該分量の重量を測定し、再溶融し、同量のＤＭＥ　（血清なし）を 添加する。

必要であれば、７５％Ｎａ炭酸水素ナトリウム溶液によりｐＨを調整し、濾過滅 菌する。得られるＰＥＧ溶液は認められるような有害な結果をもたらすことなく 、室昌で３ケ月まで保存し得る。

ｃＤＮＡクローンによりコードされるタンパク質を発現させ、後の免疫選択にお いて利用し得る細胞の絶対数を増やすために、トランスフェクトされた宿主細胞 を本発明により培養し得る。この目的のための適切な方法および培地については 、細胞の型およびその他の通常考慮される変数を考慮すれば、当業者には周知で ある。例えば、ＣＯ３細胞は、１０％仔ウシ血清および硫酸ゲンタマイシンによ り補充されるダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥ）で培養され得る。トラン スフェクトされた細胞の一過的発現は、通常は、４８時間から７２時間のポスト トランスフェクションの間に予想され得る。しかし、当業者に明らかなように、 この期間は使用する宿主細胞の型または細胞株および細胞培養条件により変動し 得る。

本発明の方法によりクローニングされた遺伝子の免疫沈降、プロッティング、お よびｃＤＮＡ配列決定は、当業者には周知の都合のよい方法により実行され得る 。例えば、Ｃ１ａｒｋら、困ｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ　Ｉ　、　Ｖｏｌ、ＩＩ、 　ｐｐ、１５５−１６７（１９８６）の免疫沈降法のプロトコールが好適である 。サイン法、ノーサン法、または他の当業者には周知のプロット分析方法は、ｆ ｌｕら（江旦１８：２７１−２７７　（１９ｇ２））の方法のような周知の方法 により調製されたハイブリダイゼーシヨンプローブを用いて使用され得る。ｃＤ ＮＡ配列決定はまた、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 ＳｃＬ剋１７４：５４６３−５４６７　（１９７７）ノジデオキシヌクレオチド 法を含む周知の方法により実行され得る。

本発明により使用される抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る 。これらは単独で、または他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体と結合 して使用され、本発明の方法により所望の１つのまたは複数の抗体あるいは抗原 を発現する細胞の免疫選択を行い得る。本発明により使用するために抗体または そのフラグメントを調製する方法は、当業者には周知である。

免疫学の一般原理を示す標準的な参考文献としては、Ｋｌｅｉｎ、　Ｊ、、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏ　：　Ｔ　ｅ　５ｃｉｅ　ｃｅ　ｏｆ　５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅ　 ｆ　Ｄ’ｓｅｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、出版社Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９ｇ２）　；にｅｎｎｅｔｔ、Ｒ，ら編、靭ｎｏ ｃ肋ルＬ」囮１堕疋匡扛」■ｕ山鎮□工１」上、Ｄｉｍｅｎｓｉｏ　’ｎ　１ｏ ｌｏ　ｉｅａ　Ａｎａｌ　５ｅｓｓ　出版社Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８０）　；　Ｃａａ＋ｐｂｅ１１．Ａ、、　−Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、Ｂｕｒｄｅｎ、 Ｒ，ら編、　ａｂｏｒａｔｏｒ　Ｔｅａ　ｎｉ　ｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ ５ｉｓｔ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ　ｏ　、　Ｖｏｌ、１３、出版 社Ｅｌｓｅｖｅｒｅ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（ｆ９１１４）がある。

用語「抗体」は、抗原に結合し得る、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ）２のような 、完全な分子およびそのフラグメントを含むことを意味する。ポリクローナル抗 体の調製は、当業者には周知の標準プロトコルを用いて、問題の抗原またはその フラグメントによる免疫後、所望の動物柵の血液から直接誘導され得る。同様に 、モノクローナル抗体は周知の方法（Ｋｏｈｌｅｒら、ｕｒ、　Ｊ、ｍｍｕｎｏ ｌ炙：２９２　（１９７６）を用いて調製され得る。本発明の目的にとっては、 モノクローナル抗体の使用が好適である。

本発明による免疫選択のために、標的細胞の表面抗原に特異的な抗体に曝された 組織培養宿主細胞を、標的抗原を発現しない宿主細胞から、その抗原に対する抗 体に特異的な抗体をコートした基質上に細胞を散布することにより分離する。

この技法は「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）　Ｊと呼ばれ、当業者には周知であり 、例えば、Ｍａｇｅら、Ｊ、ｎ＋＋＊ｕ　ｏ　、　Ｍｅｔｈ、　ｌｉ：　４７− ５６（１９７７）、および１Ｖｙｓｏｃｋｉおよび５ａｔＯｘ　Ｐ　ｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、ｃａｄ、ｃ゛ｋ　姐録Ｌ■：２８４４−２１１４８　（１９７８）ｉｌ １ｍ記載されティる。

本発明の方法によるパニングは以下のように実行され得る。

８、抗体をコートした皿。細菌学用の６ｈｍプレートｓ　Ｆａｌｃｏｎ１００７ またはその等傷物、もしくはＦｉｓｈｅｒ　８−７５７−１２のような１０ｃ＋ ｏ皿を使用し得る。ヒツジの抗マウスアフィニティー精製された抗体（例えばＣ ｏｏｐｅｒ　ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ　（Ｃａｐｐｅｌｌ）製）を５０■Ｍトリス ■Ｃ１ｐＨ９，５で１０　ｕｇ／ｉ１１に希釈する。６ｃｍ皿につき３ｓｌまた は１０ｃｍ皿にっき１０１１を添加する。約１．５時間放置し、別の皿に移し１ ．５時間放置して、次にさらに別の皿に移す。プレー）３ｘを０．１５　ＮａＣ １により洗浄しくこれには洗浄ボトルが便利である）　、ｌａｇ／ｍｌのＢＳＡ を含有する３ｓｌのＰＢＳにより一夜インキュベートし、吸引し、また凍結させ る。

ｂ、パニング。細胞を６０℃１ｍ皿に置く。培地を皿から吸引し、２ｓｌのＰＢ Ｓ／　０．５　ｓＭ　ＥＤＴＡ／　０．０２％アジ化物を添加し、また皿を３７ ℃で３０分間インキコベートして、細胞を皿から引き離す。

細胞を短いパスツールピペットにより激しく摩砕して、遠心管内の各町から細胞 を収集する。２．５　（２（１０Ｋ　ｇ）にセットして４分間遠心する（５重要 する）。０．５−１．０　ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物７５％ＦＢＳ化物 ７奢 とも３０分間インキュベートする。等容量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物を添加 し、３ｉ１のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物７２％Ｆｉｃ化物７土ことにより上清 を吸引する。０．　５ｓｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物で細胞を取り出し、３ ｓｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物（ａｚｉｄａ）１５％ＦＢＳを含有する抗体 をコートした皿に、１００ミクロンのナイロンメ，シｘ　（Ｔｅｔｋｏ）を通し てピペットで移すことにより分量を添加する。最大２ｍの６　０＋ｉｍ皿から得 られる細胞を抗体をコートした１個の６０ｍｍ皿に添加する。室温で１−３時間 放置する。ＰＢＳ／Ｓ％血清で、または培地で緩やかに洗浄することにより皿に 付着していない過剰の細胞を除去する。通常は、３ｓｌを２または３回の洗浄す ることで十分である。

Ｃ１旧ｒｔ上清。）Ｉｊｒｔ，　Ｊ．　Ｍｏ１ｅｃ．　Ｂｉｏ＋．　２５：３６ ５−３６９　（１９６７）の方法の１つの好適な変形法は以下の通りである。０ ．　４ｓｌの０．６％ＳＤＳ，　１０ｍＭ　ＥＤＴＡをバンニングされたプレー トに添加する。

２０分間放置する（プレート上に実質的には細胞が存在しない場合は１分間でよ い）。粘性混合物を遠心管にピペットで移す。０．　１ｓｌの５Ｍ　ＮａＣｌを 添加し、混合し、少くとも５時間氷上に置く。混合物をできるだけ冷たく保つと 、Ｈｉｒｔの品質が向上するようにみえる。４分間遠心して上清、フェノール抽 出物を慎重に除去しく最初の界面が透明でないときは二度）　、１０ｕｇの線状 ポリアクリルアミド（または他の搬体）を添加し、管にＥｔＯＨを先端部まで満 たし、沈澱させ、またＯ．　１ｓｌで再懸濁させる。３容量のＥｔＯＨ／Ｎａｏ Ａｃを添加し、再沈澱させ、また０．１ｓｌにて再懸濁させる。好ましくは、後 述の高効率のプロトコルを用いて、ＭＣ１０６１／ｐ３へ形質転換させる。ＤＮ Ａ容量が成分細胞分量の２ｚを超える場合は、形質転換の効率は低下する。５ｘ でも与えるコロニーの数は、２．５％の場合と同じである（効率は半減する）。

本発明のこの面においては、インキュベーション培地で「ブロッカ−」を使用す ることが好適である。ブロッカ−により、存在する非特異タンパク賀、プロテア ーゼ、または抗体が、基質にまたは宿主細胞の表面に存在する抗体と架橋結合、 またはこれを破壊して、誤った陽性または陰性の結果が生じることが確実に免れ る。ブロッカ−の選択は、実質的には本発明の免疫選択工程の特異性を向上させ 得る。例えば、免疫選択工程で使用されるものと同じクラスまたはサブクラス（ アイソタイプ）の、多数の非特異モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ，、Ｉｇ Ｇ２Ａ、ＩｇＧｍなど）をブロッカ−として使用し得る。

ブロッカ−の濃度（通常は１１−１Ｏ０ｕ／ｕｌ）は、適切な感受性を維持し、 しかも不必要な干渉を阻止するために重要である。

また、インキュベージテンに使用されるバッファーシステムはブロッキング作用 を最適化しまた非特異結合を減少させるように選択され得ることは、当業者には 周知である。

標的細胞表面の抗原を発現するものに対してパニングされる細胞の群は、先ず、 トリプシンの存在しない（集菌された）その細胞培養皿から分離される。次に細 胞を、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、問題の抗原に特異的また は関連する抗原の７アミＩＪ−に特異的な策１の抗体に曝す。

この最初の段階で、単一の抗体、または抗体の群を使用し得、選択は標的抗原の 性質、その予想頻度、および当業者には明白な他の変数に依存する。宿主細胞の 表面に発現する標的抗原は抗原−抗体複合体を形成する。

続いて、細胞を、培養皿、フィルターディスクなどの、第２の抗体または抗体の 群により予めコートされた基質に密接した位置に置く。この第２の抗体は第１の 抗体に特異的で、その選択は、例えば箪１の抗体を産生じた動物により指定され る、当業者には周知の事項である。例えば、第１の抗体をマウスで産生ずると、 第２の抗体はマウスの免疫グロブリンに特異的であり、ヤギまたはヒツジで産生 され得る。標的抗原を発現する細胞は、抗原、第１の抗体、および策２の抗体の 間に形成される複合体を介して基質に付着する。次に、付着した細胞を洗浄によ り付着しない細胞から分離し得る。標的抗原をコードするＤＮＡを、）ＩｉＮ、 　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　ｉｆｉ：３６５−３６９　（１９６７）の 方法のような周知の方法により付着細胞から調製する。このＤＮＡを、さらに融 合および選択を繰り返すために、Ｅ、　ｃｏｌｔまたは他の適切な宿主細胞に形 質転換して、所望の程度の濃度を得る。

通常の場合には、免疫選択の最初の繰り返しでは、標的抗原が属する抗原のファ ミリーに共通のエピトープまたはエピトープ群に特異的な第１の抗体のパネルを 使用する。後の繰り返しのためにクローン数を著しく減らすにはこれで十分であ る。通常はこのような繰り返しを２度行えば十分であるが、上述のように繰り返 しの回数は変動し得る。この後、標的抗原のみを認識する単一の第１の抗体また は第１の抗体の群を使用して、１回の選択を行い得る。

「基質」は、抗体が本発明による免疫選択のために結合し得る固体表面を意味す る。周知の適切な基質としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキ ストラン、ナイロン、および他の材料がある。このような材料により形成または コートされた管、ビーズ、マイクロタイタープレート、細菌学用培養皿などを使 用し得る。抗体は、アミドまたはエステル結合による共有結合または吸着のよう な周知の方法により、共有結合によりまたは物理的に基質に結合し得る。当業者 にとっては、多くの他の適切な基質、およびその上に抗体を固定化する方法は周 知である。または、通常の実験のみを用いてこのような基質および方法を確証し 得る。

本発明により使用するための宿主組織培養細胞の選択は、好ましくは、パニング のために使用される抗体がトランスフェクトされない細胞上に抗原決定基を認識 するという状況を避けるように行われるべきである。従って、ＣＯ３細胞は特定 の表面抗原の一過的な発現には好適であるが、より好適なのは、マウスのＷＯＰ 細胞である。後者の中でも、ＷＯＰ　３０２７細胞はさらに好適である。ＷＯＰ 細胞では実質的にすべての抗体を使用し得る。これは、マウスの抗体とマウスの 細胞表面の抗原決定基との間の交差反応が希であるためである。

組換えＤＮＡ分子の挿入サイズは、全フード配列が得られる可能性を最大限にす るように選択されるべきである。特定の遺伝子にとって最適な挿入サイズを事前 に決定し得る様々な方法は当業者には既知である。

ベク　−の　およびｃＤＮＡの 哺乳動物の組織培養細胞におけるｃＤＮＡの発現に適切なベクターは、周知の方 法により構築され得る。ＳＶ４０起点を含有する発現ベクターが、本発明の目的 にとっては好適である。ベクターは天然由来のまたは合成の転写起点および５Ｖ ４Ｇ初期領域プロモーターを含有し得る。さらに好適なものは、ヒトサイトメガ ロウィルス即時型エン／１ンサー配列よりなるキメラプロモーターである。様々 な「エンハンサー配列」もまた５ｖ４０ベクターと共に使用され得る。これらは 、例えば、Ｂａｎｅｒｊｌら、Ｃｅ１ｌ　ｐ：２９９−３０８　＜１９８１）　 ：　Ｌｅｖ：ｎ５ｏｎら、独よｕｘａ　２Ｍ　：　５６８−５７２　（１９８２ ）；およびＣｏｎｒａｄら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｉ：９４９− ９６５　（１９＋１２）に述べられている。

本発明のベクターへのｃＤＮＡの挿入は、例えば、末端トランスフェラーゼによ るホモポリマーテーリングにより起こり得る。しかし、５゛部位でのｃＤＮＡイ ンサートへのホモポリマーの道は、インビトロおよびインビボにおける発現を阻 止し得る。

従って、短い置換可能なりＮＡ上セグメントより分離される逆配回の同一切断部 位を使用することは、本発明の目的には好適である。好ましくはＢｓｔＸＩ制限 エンドヌクレアーゼを用いる、このような逆配同の同一切断部位は、ベクターの 置換可能セグメントと同じ末端を提供するため、ｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチ ドと平行して使用され得る。この方法では、ｃＤＮＡはそれ自体に結合し得ない が、ベクターに結合し得る。このため、ｃＤＮＡおよびベクターの両方を最も効 率的に使用し得る。

本発明の別の実施態様は、ｃＤＮＡのベクターへの挿入を促進する上述の効率的 なオリゴヌクレオチドに基づく方法である。

本発明のｐｉＨ３Ｍベクターは好適であり、逆配向のエンドヌクレアーゼ部位を 使用する。このベクターは複製のＳＶ４０起点を含有し得るが、より好適な形態 はＭ１３起点を含有する。Ｍ１３起点を含有するこのベクターは、その制御の下 に置かれれるコード配列のＣＯ５細胞に高レベルの発現が可能となる。また、プ ラスミドの小さなサイズおよび特別配置の配列により、ＣＯ８細胞に高レベルの 複製が可能となる。

「細胞表面抗原」は、細胞内膜系を通して細胞表面に輸送されるタンパク質を意 味する。このような抗原は通常は、膜の脂質二重構造体中に存する疎水性アミノ 酸を含有するカルボキシル末端ドメインを通して細胞表面膜に係留され、生体的 および抗原としての効果を示す。Ｔ−リンパ球の抗原のような抗原は、本発明の 方法による遺伝子クローニングにとって特に適切である。しかし、すべての細胞 の細胞表面抗原が本発明ニよりクローニングされ得る。さらに、細胞表面に通常 は発現しないタンパク質は、例えば、細胞内抗原を発現する固定細胞に対して富 養化する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用することにより、本方法により クローニングが認められ得る。

「実質的に純粋な」は、本発明のすべての抗原、またはこれら抗原をコードする すべての遺伝子を意味し、これらは本質的には、各々他の抗原または遺伝子から 、もしくは、一般に天然に見られ得る、およびそれ自体としては天然には見られ ない形態で存在する、他の夾雑物質から遊離している。「機能性誘導体」は、分 子の「フラグメント」、「変異体」、「アナログ」、または「化学的誘導体」を 意味する。本発明の抗原のすべてのような分子の「フラグメント」は、分子のポ リベブチドサブセ・ノドを意味する。このような分子の「変異体」は、分子全体 またはその７ラグメントと実質的に同様の天然に存在する分子を意味する。分子 の「アナログ」は、分子全体またはそのフラグメントと実質的に同様の非天然の 分子を意味する。

抗原のフラグメント、変異体、アナログ、および／または化学的誘導体と、別の フラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、および／または抗原とは、両 方の分子におけるアミノ酸配列が実質的に同じ、すなわち、少くとも約５０％の 相同性を有する場合、および両方の分子が同様の生物学的活性を有する場合、「 実質的に同様である」といわれる。ヌクレオチド配列と別のヌクレオチド配列と は、両方の配列が実質的に同じ、すなわち、第１のヌクレオチド配列が、第２の ヌクレオチド配列によりコードされるものに少くとも約５０％の相同性を有する アミノ酸配列を持つフラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、または抗 原をコードし、また第１のヌクレオチド配列によりコードされるフラグメント、 変異体、アナログ、化学的誘導体、および／または抗原が、第２のヌクレオチド 配列によりコードされるフラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、およ び／または抗原の生物学的活性と同様の生物学的活性を有する場合、「実質的に 同様である」といわれる。従って、２つの分子が同様の活性を有する場合は、分 子の一方が他方には見られない付加的なアミノ酸残基を含有する場合でも、また はアミノ酸残基の配列が同一でない場合でも、本明細書で使用される用語として の変異体であると見なされる。本明細書で使用される意味では、分子は、通常は 分子の一部ではない付加的な化学部分を含有するとき、別の分子の「化学的誘導 体」であるといわれる。このような部分は分子の溶解度、吸収度、生物学的半減 期などを向上させ得る。これら部分は分子の毒性を低減、もしくは分子の有害な 副作用を除去または低減し得る。このような効果を媒介し得る部分については、 例えば、　ｅｍｉｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐ　ａｒ■ｃｅｕｔｉｃ　Ｓ　’　ｃ　、　 １６ｔｈ　ｅｄ、、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏ ｎ、　Ｐｅｎｎ、　（１９８Ｇ）にて開示されティる。

同様に、本発明の抗原すべての遺伝子の「機能性誘導体」は、遺伝子の「フラグ メント」、「変異体」、または「アナログ」を含有することを意味し、ヌクレオ チド配列において「実質的に同様」であり得、また同様の活性を有する分子をコ ードする。

抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および／または化学的誘導体と、他の 抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および／または化学的誘導体とは、前 者が後者の少くとも約２５％の生物学的活性を有する場合、「同様の生物学的活 性」を有するといわれる。生物学的活性とは、生存する生物に特徴的な作用、機 能、またはプロセスである。生物学的活性はまた、抗原、フラグメント、変異体 、アナログ、および／または化学的誘導体が抗体の産生を誘導するように被検動 物に人工的に導入されるときに示される生物学的活性のような生存プロセスを、 インビトロにおける系または非天然の系に再生、延長、または適用することを含 み得る。抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および／または化学的誘導体 は１つ以上の生物学的活性を有し得る。生物学的活性は、その活性に特異的な方 法またはアッセイにより検出または測定され得る。抗原の生物学的活性と同様の 生物学的活性を有する機能性誘導体にとっては、その活性に特異的であり当業者 には周知のアッセイにより測定される抗原の生物学的活性の少くとも約２５％の 活性を有する必要がある。

本発明の方法により発現した実質的に純粋な抗原は、放射性免疫測定法（ＲＩＡ ）　、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）　、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳ Ａ）を含む、当業者には周知の免疫診断アッセイ法において使用され得る。本発 明の実質的に純粋なタンパク質は、可溶性の形態で、単独で、または本発明の他 の抗原、もしくはリンホカインおよびモノカインのような他の薬剤、または薬品 との組合せで、ヒトを含む動物の免疫に関連した疾患および不全の治療のために 投与され得る。

本発明の実質的に純粋なタンパク質による治療から効果が得られ得る不全の例と しては、免疫不全疾患、即時型過敏症、喘息、過敏性肺臓炎、免疫複合体病、脈 管炎、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、免疫病理学的腎臓疾患、急 性および慢性炎症、溶血性貧血、血小板異常、血漿およびその他の細胞の新生物 、アミロイド症、寄生虫性疾患、多発性硬化症、ギランーバレー症候群、急性お よび亜急性筋麻痺、重症筋無力症、免疫内分泌障害、および組織および臓器の移 植拒絶がある。これらすべては、Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆら編、■江口ｎｊＰｒ’ ｎｅ’　ｓ　ｆ　ｎｔｅ　ｎａ　Ｍｅｄ’ｃ’ｎ　、前出、に記載されている口 １ｆｅｉｒ編、前出ＨＢｏｇｕｓｌａｓｋｉら編、前出；およびＩｌｏｌｂｏｒ ｏｗら編、前出もまた参照。

免疫治療に使用するときは、本発明の抗原は治療剤により標識され得る、または 標識され得ない。免疫治療のため本発明の抗原に結合され得る治療剤の例として は、放射性同位元素、レクチン、およびトキシンがある。

本発明の抗原の投与のための投与量の範囲は、所望の免疫治療効果を生じるのに 十分な多さであるが、不必要な交差反応、過敏症反応などの宵宮な副作用を引き 起こすほどに多くはない。一般に、使用する投与量は、患者の年齢、症状、性別 、および疾患の程度により変動する。反対徴候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔ ｆｏｎｓ）　（存在する場合）、免疫寛容、および他の変数もまた適切な投与量 に影響を与える。投与は注射または経時的な漸次潅流による非経口により行われ 得る。投与はまた、静脈、腸管内、筋向、皮下、または皮内への注入によるもの であり得る。

非経口による投与のための調製物は、滅菌した水性または非水性の溶剤、懸濁剤 、および乳化剤を含む。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリ エチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチル のような注射可能有機エステルがある。水性キャリアとしては、水、アルコール 溶液および水溶液、乳化液、または懸濁液があり、生理食塩水およびバッファー 媒体を含む。非経口注射用媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル氏ブド ウ糖溶液、ブドウ糖および塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンゲル氏溶液、または 固定オイルがある。静脈注射用媒体としては、リンゲル氏ブドウ糖などに基づく ものなどの、液体および栄養素補給剤、電解質補給剤がある。例えば、抗殺菌剤 、抗酸化剤、不活性ガスなどの保存料およびその他の添加物もまた存在し得る。

このような調製物、およびこれらを作製する作法および方法は周知であり、例え ばＲｅ５ｉｎ　ｔｏ　’ｓ　Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　 １６ｔｈ　ｅｄ、、前出、に記載されている〇本発明の抗原はまた、抗原を有す る薬品または薬学的組成物として、単独で、またはリンホカイン、モノカイン、 および、薬剤のような他の抗原または他の薬剤との組合せで、調製され得る。薬 品は、ヒトを含む動物の免疫関連の適応症の治療のために使用される。

本発明の抗原は単独で投与され得るが、薬学的組成物として投与されるのが好適 である。本発明の組成物は、少くとも１個の抗原またはその薬学的に受容可能な 塩を、１つ以上の受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療剤と共に有す る。「受容可能な」は、薬剤またはキャリアが、組成物の他の成分と適合し、ま た患者に対して無害であることを意味する。組成物には、経口、鼻膣、局所（頬 および舌下を含む）、膣内、または非経口の投与に適するものを含む。組成物は 、好適には一定投与量の形態で提供され得、薬学分野では周知の方法により調製 され得る。このような方法は、活性成分を１つ以上の補助成分を構成するキャリ アと結合させることを含む。一般に、組成物は、活性成分を液体キャリアまたは 微細に粉砕された固形キャリアもしくはその両方と、均一におよび密に結合させ 、また必要であればこれにより形成された産物をシェービングすることにより調 製される。

本発明により経口投与された薬学的組成物は、各々一定量の活性成分を含有する カプセル、カシェ剤、または錠剤を含む、いかなる好適な形態もとり得る。粉体 または顆粒もまた、水性または非水性溶液、または水中油型乳剤、または油中水 型乳剤における溶液または懸濁液と同様に可能である。活性成分はまたポーラス 、舐剤、またはペーストとして提供され得る。

以上、本発明について述べたが、本発明は以下の実施例を参照することによりさ らに十分に理解される。これら実施例はいかなる意味においても本発明の範囲を 制限するものではない。

（以下余臼） 実施例■　ヒトＣＤ２　の　クローニングおよび　。

ｃＤＮＡ　ベク　−　ｉ）＋３ サプレツサーｔＲＮＡ遺伝子とＳＶ４０起点との間に合成転写ユニットを挿入す ることにより、ｐｉｓＶ　（Ｌｉｔｔｌｅら、１．　Ｂ’ｏ　、　Ｍ０工ｉ：４ ７３−４８１１　（１９８３））からｃｏｓ細胞発現ベクターを構築した。

転写ユニットは、ＨＩＶ　ＬＴＲ−６７から＋８０配列に融合した、ヒトサイト メガロウィルスＡＤ１６９の即時型エン／−ンサー配列を含むキメラプロモータ ーから構成された。ＬＴＲ＋８０のすぐ下流には、３５０ｂｐスタツフｙ　−（ ｓｔｕｆｆｅｒ）により隔てられた２つの七」１１部位を含むポリリンカーを挿 入し、ＢｓｔＸ１部位の側部には独虹部位を配置し、インサートを切り出すため に用いることができた。ポリリンカーの下流側には、ＳＶ４０　Ａ抗原のスプラ イスおよびｐｓＶ２から得た初期領域ポリアデニル化シグナルを配置した。ベク ターのヌクレオチド配列は、図１に示す。

ｃ！ｌＡライブラ「−の 上記のように、グアニジニウムチオシアネート／ＣｓＣ１法により、ＢＰＢ−Ａ ＬＬ細胞からＲＮＡを調製した。オリゴｄＴ選択により全ＲＮＡからポＩＪ　Ａ ″ＲＮＡを調製した。Ｍａｎｉａｔｉｓら、助士に吋μ二匹ｏｎ’ｎ　：　Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏ　Ｍａｎｕａｌ、上記。ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ　 （ＳＯｋ　ｒｐｍで３時間、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５ｍ１−２０％の酢酸カリ ウム勾配により遠心分離にかけて分画した。０．５＋ｗｌの画分を、管の湾曲部 のすぐ上に挿入した注射針または翼状針を用いて手で回収した。各国分を、線状 ポリアクリルアミドを添加（ＳｔｒａｕｓＳおよびｌ／ａｒｓｈａｖｓｋｙ、　 ｃｇＪｌ　３７：８１１９−９０１　（１９８４））　した後、２０ｕｇ／ｍｌ にエタノール沈降させた。７００ｂｐよりも大きなｃＤＮＡを含む両分をプール し、勾配精製したＢｓｔＸｌで消化したｐｉＨ３ベクターに連結した。

連結されたＤＮＡを、以下のプロトコルで反応性をもたせた旦、ＣＯ■ＭＣ１０ ６１／ｐ３に形質転換した：所望の株をＬＢプレート上で線状に塗布した。次の 日、単一コロニーを、２５０ｍ１フラスコ中で、２０■ｌのＴＹＭブロス（以下 の処方）に植え付けた。ミ、ｙドログ（ｍｉｄｌｏｇ）相（ＯＤｓｅｅ約０．２ −０．８）に細胞を増殖し、１０ｈｌのＴＹＭを含む２１フラスコに注ぎ、細胞 が０．５−０．９０Ｄに増殖するまで激しく攪拌し、次いで同一容器中で再び５ ００＋＊１に希釈した。

細胞が０Ｄｓａｓ　０．６に増殖すると、フラスコを氷水に入れ、すばやく冷却 するようにゆるやかに振盪した。培養物が冷却されたとき、４．２ｋ　ｒｐｍで １５分間（Ｊ６）遠心した。上清を注ぎ出し、ベレットを氷上でゆるやかに振盪 することにより、約１００■ｌの冷えたＴｆＢ　Ｉ　（下記）中で再懸濁した。

その後、同一の瓶中で、ベレットを、４．２ｋ　ｒｐｍで８分間（Ｊ６）再び遠 心した。上清を注ぎ出し、ベレットを、水上でゆるやかに振盪することにより、 ２０ｍ１の冷えたＴｆＢＩＩ中で再懸濁した。０．１から０．５ｅ１７７）分別 部分を、予め冷凍しておいたマイクロヒコージチコーブに入れ、液体窒素中で凍 結し、−７０’Ｃで保存した。形質転換するために、分別部分を除去し、丁度溶 融するまで室温で解凍し、水上に置いた。ＤＮＡを加え、水上で１５−３０分間 放置し、３７°Ｃで５分間（０、５ｍｌの分別部分につき６分間）インキユベー トした。その後、ＤＮＡを含む懸濁液をＬＢで１＝１０に希釈し、プレートまた は抗生物質選択にかける荊に９０分間増殖させた。あるいは、熱パルスした形質 転換混合物を、抗生物質含有プレート上に直接プレートした。この抗生物質含有 プレートには、プレート直前に抗生物質を含まないＬＢ寒天の薄層（４−５ｍｌ ）を注入しておいた。

培地およびバッファー：　ＴＹＭ：　２％のバクトドリブトン（Ｂａａｔｏ−Ｔ ｒｙｐｔｏｎｅ）　、０．５％の酵母抽出物、Ｏ，ＬＭのＮａＣ１，１０５Ｍの Ｍｇ５Ｏ，（加圧滅菌前に加えられる）。ＴｆＢ　Ｉ：３０ｍＭのにＯＡｃ、　 ５０重ＭのＭｎＣｌ２．１００ｍＭのＫＣＬ、　１０ｍＭのＣａＣｌ２．１５％ （ｖ／ｖ）のグリセロールｏ　ＴｆＢ　ＩＩ：１０ｍＭのＮａ−ＭＯＰＳ％ｐＨ ７，０，７５ＭＭのＣａＣｌ２．１０ｍＭのＫＣｌ、１５％のグリセロール。

パニング　ａｎｎｉｎ　によるＣＮクローンの口ＰＢＳの代わりに洗浄瓶からの ０．　ＩＳＭのＮａＣ１で皿を洗浄したこと以外は、Ｗｙｓｏｃｋｉおよび５ａ ｔｏ　（ｏｃ、　ｔ　、ｃａ　Ｓｃ’、　ＵＡ　７５：２８４４−２８４８　（ １９７ｇ））　ｌ、：より記載されるように、細菌培養皿（Ｆａｌｃｏｎ　１０ ０７）を、アフィニテイ精製されたヒツジの抗マウスＩｇＧ抗体でコーティング することよるパニングを行うために調製し、未反応部位を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳ Ａを含むＰＢＳ中で一晩インキユベートすることにより阻害した。皿は、通常、 大量のバッチで調製し、ＰＢＳ／ＢＳＡの吸引後、凍結保存した。最初のスクリ ーニングでは、５０ｚコンフルエンスのＣＯ３細胞を含む２４６ｃ１の皿を、５ ａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｒｉｎら、Ｍｏ、Ｃｅ１　ｉｏ、ｌニア４３−７５２（１ ９８１）の方法によるプロトプラスト融合でトランスフェクトした。融合の７２ 時間後、細胞を、ＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／、０２％のアジ化ナトリウム中、 ３７℃で３０分間インキコベートすることにより分離した。分離した細胞をプー ルし、遠心分離にかけ、通常は、１：１０００希釈の腹水のように、しかし製造 者により示唆された濃度での市販の試薬のように、モノクローナル抗体を含む冷 したＰＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｓ％の胎児ウシ血清中で再懸濁した。水上で１時間放置 した後、細胞を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物で１：１に希釈し、２％のＦｉｃ ｏｌｌ　４００を含むｌＧｍ１のＰＢＳ／ＥＤＴＡ／アジ化物上に積層した。

遠心分離（４００ｘｇ、　５分間）後、上溝を注意深く吸引し、ベレットを少量 Ｉｆ）　ＰＢＳ／ＥＤ丁Ａ１５％０）　ＦＢＳ中で再懸濁し、細胞を、３ｍｌの ＰＢＳ／ＥＤＴＡ１５％のＦＢＳを含むパニングプレートに分配した。次いで、 Ｗｙｓｏｃｋｉおよび５ａｔｏ、Ｐｒｏｃ、　１Ｊａｔ１．　ｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　７５：２１１４４−Ｚａ４Ｂ　（１９７８）により実質的に記載さ せるように、プレートを処理した。エピ７−ムＤＮＡを、Ｈｉｒｔ　（ムＭｏ１ ．　’ｏ、２６：３６５−２６９　（１９６７））の手法により、付着細胞から 回収し、ＭＣ１０６１／ｐ３に形質転換した。

二および　立 １０％の仔ウシ面漬および１５　ｕｇ／ｍ　ｌの硫化ゲンタマイシンを補足した ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥ／１０％の仔ウシ血清）で、ＣＯ５細胞ク ロー２Ｍ６細胞を増殖させた。細胞をあまり傷つけないようにできるだけ密度を 高くして保持したストックプレートから６ｃｍ皿にトランスフェクトする前日に 、細胞を約１：８の比率で分離した。上記のようなゲンタマイシン、および１０ ％のＮｕＳｅｒｕｍ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）また は胎児ウシ血清のいずれかを含むｌ５ｃｏｖｅの変性ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ ）中でＴ細胞系を増殖させた。

″のためのＣＯＳ　の１５７１７１２９１７６ｃｍ皿中の５０％コンフルエンス のＣＯＳ細胞を、１０％のＮｕｓｅｒｕｌ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ）　、４００ｕｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン、１０ｕＭのク ロロキンジホスフェート、およびｔｕｇ／ｍｌのＤＮＡを含むＤＭＥまたは［Ｍ ＤＭ培地からなるカクテル１．５ｍｌでトランスフェクトした。３７°Ｃで４時 間後（または、細胞が弱っているようであればそれよりも早＜）、トランスフエ フシラン混合物を除去し、１０％のＤＭＳＯを用いてＰＢＳ中で２分間細胞を処 理した。ＳｕｓｓｍａｎおよびＭｉｌｍａｎ、　騰ｄ上Ｊ□　４：１６４１−１ ６４３（１９８４）。次いで、細胞をＤＭＥ／１０％の仔ウシ血清に戻し、４８ から７ｚ時間発現させた。

′　ノーザン　およびサイン Ｔ細胞をラクトペルオキシダーゼ処理により標識し、溶解させ、Ｃ１ａｒｋおよ びＥｉｎｆｅｌｄ　（ｅｕｋ　ｃ　ｔｅ　ｉ　［、Ｖｏｌ、Ｉｌ、　ｐｐ、１５ ５−１６７　（１９８６））の手法により、市販のヤギ抗マウスＩｇＧアガロー スビーズ（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用いて免疫沈降させた。Ｃ Ｏ３細胞を、ＤＥＡＥデキストラン法によりトランスフェクトし、トリプシン処 理し、トランスフエフシランの２４時間後、希釈しないで新しいプレートに移し た。３６時間後、細胞を上記のようにＰＢＳ／ＥＤＴＡに曝すことにより分離し 、遠心分離にかけ、ラクトペルオキシデート法により標識した。溶解／＜・ノフ ア−がＬｄのＰＭＳＦを含んでいたこと以外は、■細胞の免疫沈降と同様に、透 明な溶解産物を調製し、第１抗体によるインキコベーンクンを４℃で２時間だけ 行った。溶離した試料は、Ｌａｅｕｉｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６ ８５　（１９７０））のバッファー系を用いて、不連続な１１．２５％のポリア クリルアミドゲル上で分画した。

ＤＭＳＯをローディングバッファーから除去し、７０℃で５分間変性し、ゲルに は、６％ではなく０．６％のホルムアルデヒドを含ませたこと以外は、（Ｍａｎ ｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎ’ｎ　ａ　［、ａｂａｔｏｒ　Ｍ ａｎｕａｌ　（１９８２））に実賞的に記載されるように、ノーザンプロット分 析を行った。ｊｕｇ／■１の臭化エチジウムを含む２容置の水中でゲルを染色し 、写真に撮り、染色溶液中でナイロン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ、　ＤＣＩＰＯＩ ＩＯに転移した。転移したＲＮＡを、５ａｒａｎ　Ｗｒａｐ　（Ｃｈｕｒｃｈお よびＧ１１ｂｅｒｔ、　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃａｄ、Ｓｃｉ。

」鎖塁：１９９１−１９９５（１９１１４＞）を介して滅菌ランプに曝すことに より、０．２２＋ａｆ／ｃｍ２の束密度（２５４ｒｖで測定した）で５分間照射 した。ＲｅｅｄおよびＭａｎｎ　（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ’ｄｓ　Ｒｅｓ、［ニア２ ０７−７２２１（１９１１１６））　１ｍ記載されるように、ナイロ：／　（Ｇ ａｎｅＳｃｒｅｅｎ、　ＤｕＰｏｎｔ）へのアルカリ転移により、サザンプロッ ト分析を行った。ハイブリダイゼーシヨンプローブを、ＨｕおよびＭｅｓｓｉｎ ｇ　（虹吐１８：２７１−２７７（１９８２））　＋７）方法によす調製し、Ｍ １３　ｍｐ１９７　ｙ−ジのｌ０ＤＮＡ　ミクログラム当量を含むＳＤＳ／リン 酸バッファー（ＣｈｕｒｃｈおよびＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　ｉ：１９９１−１９９５　（１９８４））にお いてプロットをプレハイブリダイズした。

Ｎ　ローディング ＰＢＳ中で３回遠心分離にかけることにより、全血液から赤血球を調製した。Ｄ ＥＡＥ法により、ＣＤ２または他の表面抗原発現クローンを含む６ｃｍ皿にＣＯ Ｓ細胞をトランスフェクトした。トランスフエフシランの４８から７２時間後、 培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ／Ｓ％ＦＤＳ／アジ化物を各プレートに加え、次 いでＰＢＳ中２０％の懸濁液として、０．４ｍｌの適切な赤血球試料を加えた。

室温で１時間放置した後、未付着の赤血球をゆるやかに洗浄し、プレートを調べ た。

ＣＤ２抗原決定基をコードするｃＤＮＡを以下のように単離した。

ヒトＴｉｌ胞腫瘍系ＨＰＢ−ＡＩ、ＩＩ、から抽出したＪｉＮＡからｃＤＮＡを 調製し、上記のように、ＳＶ４０起点をベースとした発現ベクターｐｉＨ３に挿 入した。約３Ｘ１０５組換え体のｅＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラ リーをプロトプラスト融合法によりＣＯ３細胞に導入した。３日後、細胞をＥＤ ＴＡに曝すことにより分離し、ＣＤ２決定基に対する３つのモノクローナル抗体 （ＯＫＴＩｌ、　Ｌａｕ５ｂおよびＣｏｕｌｔｅｒ　Ｔｌ１）を含むプールで処 理した。抗体で処理した細胞を、アフィニティー精製のヒツジ抗マウス＋ｇＧ抗 体でコーティングした皿に分配し、付着させ、未付着細胞をゆるやかに洗浄する ことにより分離した。この集積法は、免疫堂文献（Ｍａｇｅら、Ｊ、　Ｉ＋＋ｎ ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｊ−：４７−５６　（１９７７））により公知 である。

得られたコロニーをプールし、ＣＯ３細胞に融合し、前記のように、２回目のパ ニングを行った。３回目のパニングにおいて、分離細胞の一部をＣＤ２に特異的 な３つのモノクローナル抗体の混合物で処理し、Ｈｉｒｔ上清を再び生成し、Ｌ 並置に形質転換した。得られたコロニーのうちの８個からＤＮＡを調製し、ＣＯ ８細胞にトランスフェクトした。３日後、８個のトランスフェクトされた皿のう ちの６個において、間接免疫蛍光法を行うことにより、ＣＤ２抗原の表面発現を 検出した。対応するプラスミドＤＮＡを制限酵素で消化することにより、６個の 単離体中のすべてで１．５ｋｂのインサートが示された。

さらなる分析を行うために、６個のクローンのうちの１個を大量にｒＡ製した。

ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした後、白血球分化抗原に関する第３回国際ワー クシタツブにより提供された抗体パネルの一部分で間接的に免疫蛍光分析した結 果、フェトヘマグルチニン活性１９７３球とも反応しなかった１個の試料を除い て、提供された抗体のすべてが、陽性反応を示した。

テストした１７個の抗体のうち、少なくとも８個の職別可能な群が、様々な霊長 類のリンパ球との異なる反応パターンにより確定された・ＪｏｎｋｅｒおよびＮ ｏｏｉｊ、　Ｌｅｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　’ｎ　Ｉｌ、　Ｖ。

１、１．　ｐｐ、　３７３−３８７　（１９８６）。

ｄ■【旦旦近 ＣＤ２　ｃＤＮＡインサートを、２つの配回でＭ１３１ｐ１９　（’／１ｅｉｒ ａおよびＭｅｓｓｊＢ、　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８　（１９Ｂ２＞）に サブクローニングし、ジデオ手ジヌクレオチド法により配列決定した（図２）。

Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ’、ＵＳＡ　７４：５４ ６３−５４６７　（１９７７）。

オーブンリーディングフレームは、翻訳開始コドンのＫｏｚａｋ　（Ｌ工し■± （社）１ヒ：　１−４７：４５　（１９１１３）の）コンセンサス基準を満足す るＡＴＧトリプレットから３６０個の残基にまで亘るのが観察されたく図１）。

予想されたアミノ酸配列は、かなり大きな細胞質内ドメインで終止する疎水性ア ンカーにまで亘る単一膜に統合された膜タンパク質を示す。Ｎ末端アミノ酸配列 と、ｙｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　（Ｎｕｃ　、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌｌ：４６ ８３−４６９０　（１９８６））により構築されたシグナル配列残基頻度のマト リックスとを比較すると、成熟ＣＤ２ペプチドが、１９番目（Ｓｅｔ）の残基と ２０番目（Ｌｙｓ）の残基との間の前駆体ペプチドの開裂により形成されること が示唆される。

この配列の驚（べき、かつ予想外の特徴は、提案された開裂部位にごく近位な位 置に潜在的なＮ連結グリコジル化部位が存在することである。得られたポリペプ チド骨格は、３ｇ、　９ｋｄの予想された分子量を有し、これは、２１．９ｋｂ 質量の外部ドメインと１４．６ｋｄ質量の細胞質ドメインとに分割される。３個 のＮ連結グリコジル化部位は、細胞外ドメイン中に存在する。

膜まで亘るドメインは、疎水性優位の特徴をもつ２６個の不変残基を含む。これ に続（９個の残基のうち７個は、リジンまたはアルギニンの塩基性残基である。

塩基性残基が後に続く疎水性優位の残基が出現することは、カルボキシル末端ア ンカーをａするトランスメンブレンタンパク質に共通の機構的な特徴である。

トランスメンブレンドメインのもう１つの驚（べき特徴は、疎水性残基（しばし ば、βターンの側部に位置しているのが見られる〉が側部に位置する、ａｙｓ− ｇｉｙ−ｇｔｙ−ｇｔｙのβターンモチーフ（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、　 Ａｎ　ｕａ　Ｒｖｉｅｖ　ｏ　°Ｃ′ＳｔＺ　４７：２５１−２７６　（１９７ １１））の出現である。理論的には、αヘリックスに配室されたわずか２０個の 残基が、３ｎ■の膜の二重層を横切るのに必要とされ（Ｔａｎｆｏｒｄ、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２００：１０１２−１０１８　（１９１Ｂ）＞　、わずか１４個の 疎水性残基が、統合膜タンパク質を挿入および排出させることが可能であるため （ＡｄａｍｓおよびＲｏｓｅ。

薊■口・１００７−１０１５　（１９８５＞）　、ＣＤ２抗原のトランスメンブ レンのセグメントは、湾曲またはもつれ（ｋｉｎｋ）を含み得る。

細胞質ドメインのサイズが大きいほどは、ＣＤ２は、固有の酵素活性を有する可 能が大きくなる。細胞質ドメインは、プロリンが非常に豊富で、ターン確率の高 い３個の部位を含む。

アミノ酸配列とＮＢＲＦデータベースとを比較すると、他のタンパク質との実質 的な相同性は示されなかった。特に、Ｔ細胞レセフターαまたはβ鎖との相同性 は観察されず、このことにより、ＣＤ２が始原Ｔ細胞レセプターであることが示 唆される。

Ｍｉｌａｎｅｓｅら、５Ｃ１ｅｎＣｅ２３１：１１１８−１１２２　（１９８６ ）。

タンパク質の細胞質置の丁度内側には、セリン残基で終わる塩基性タンパク質が あり、このパターンは、ＥＧＦレセプターおよびクラス■組轍適合性遺伝子の両 方において同一の位置に見いだされ、それぞれの場合において、それぞれタンパ ク質牛ナーゼＣまたはサイクリックＡＭＰ依存性タンパク質牛ナーゼによる、イ ンビボ（ＥＧＦ）またはインビトロ（ＨＬＡ）でのリン酸化のための既知の部位 である。Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　ＬＬＬ＋４８０−４８２　（１９１１ ４）：　ＤａｖｉｓおよびＣｚｅｃｈ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ｃａｄ、Ｓｃ＋ 。

１１２：１９７４−１９７８　（１９８５）：　ＧｕｉｌｄおよびＳｔｒｏｍｉ ｎｇｅｒ、　Ｌ」ｌ剋−並記」４ハ９：　９２３５−９２４０および１３５０４ −１３５１０　（１９ｇ４）。同様の部位は、インターロイキン２レセプターの 細胞質内ドメインにおいて見いだされ、タンパク質キナーゼＣによりインビボで リン酸化される。Ｌｅｏｎａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ　３１ユニ　６２６−６３１ 　（１９８４）；　Ｎ１ｋａ　ｉｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３１ユニ　６３１−６ ３５　＜１９８４）；　５ｈａｃｋｅｌｆｏｒｄおよびＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、 Ｊ、Ｂ’ｏ、Ｃｈｅｍ、ｉｐ：１１７０６−　（１９８４）。

トランスフェクトされた　によ　れたＣＤ２　の裏Ｉ ＣＯ３細胞を、ＣＤ２発現プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクシ ョンの６０時間後、ラクトペルオキシダーゼ法により１２５１で表面標識した。

細胞溶解産物を調製し、各部分をモノクローナル抗マウス抗体（０！［Ｔ１１） または外来性の（０ＫＴ４：抗−ＣＤ４）抗体を用いて、４℃で２時間インキコ ベートした。

セファロースに結合した抗マウス抗体を加え、数回の洗浄工程後、吸収されたタ ンパク質を溶出し、フィトヘマグルチニン活性化１９７２球、ｃＤＮＡドナー系 ＨＰＢ−ＡＬＬ、またはこの実験室で生成された長期Ｔ細胞系から同様に調製し た免疫沈降物と共に、１１．２５％のアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ た。

オートラジオグラフィーにより、抗ＣＤ２抗体によりトランスフェクトされたＣ Ｏ３細胞から沈降した免疫反応物質の明確なバンドが示されたが、コントロール によるものからは示されなかった。Ｔ芽細胞およびＴ細胞系物質の平均分子量５ ４ｋｄと比較して、ＣＯ３Ｏ３細胞物事均分子量は５１ｋｄと計算され、■ＰＢ −ＡＬＬ細胞からの抗原は、約６１ｋｄの分子量であることが見いだされた。

観察されたようにサイズが異なっていたのは、異なる細胞型における異なるグリ コジル化のパターンのためであった。見かけの分子量が３８ｋｄの小さいバンド は、ＣＯ３細胞から免疫沈降された物貫中に存在し、Ｔ細胞またはＨＰＢ−ＡＬ Ｌ細胞からの免疫沈降物には存在しなかった。この種のサイズは、実験的エラー の範囲内で、成熟非グリコジル化ペプチドの予想された分子量３９ｋｄと一致し ている。

ＣＤ２を　るＣＯ３はヒツジ、　・　ロゼツトをヅ　るＣＤ２発現クローンでト ランスフェクトしたＣＯ３細胞を、精製したＭＴ９１０　（ＩｇＧ、ｋａｐｐａ ）抗−ＣＤ２抗体（Ｒ４ｅｂｅｒら、ｉｊ空江堕二■ｎＬ旦、　Ｖｏｌ、１．１ ）ｌ）、　２３３−２４２　（１９８６））を用いて、ｌｕｇ／ｍｌの濃度で１ 時間、または精製したＭａ２Ｏ，５（ＩｇＧ１．　ｋａｐｐａ；にａｖａｔａら 、Ｌユ■−紅ＬＬＬｑ：６３３−６５１　（１９１１４））抗体を用いて同一濃 度で１時間、処理した。Ｍａ２Ｏ，５は、単形悪性のＨＬＡ−ＡＢＣ決定基を認 識し、アフリカ緑ザル（Ａｆｒｉｃａｎ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ）組織適合 性抗原と交差反応する。アフリカ緑ザル組織適合性抗原を選択したのは、トラン スフェクトされた細胞により発現されたＣＤ２抗原とほぼ同量の表面抗原を認職 するイソタイプ適合の抗体を示すためである。ヒツジ赤血球ロゼツトは、ＭＢ４ ０５の存在下で見いだされたが、ＭＴ９１０の存在下では見いだされなかった。

ロゼ、ト阻害はまた、０ＫＴＩＩ抗体により観察され、他の様々なコントロール 抗体では観察されなかった。

トランスフェクト　れたＣｏＳ　は　の　の、　ロゼΣ工ｍゑ ギおよびウサギの赤血球とロゼ、トを形成するが、マウスまたはラットの赤血球 とは形成しないことが公知である。Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｊ、Ａ　ｌｅｒ　Ｃ１ １ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、５４：８６−９４　（１９７４）；Ａｍｉ。

ｔら、Ａ、Ｂｅｒｎａｒｄら編、Ｌｅｕｃｏｃ　ｔｅ　Ｔ」江ｎ２．　Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ出版、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、、　ｐｐ、　２８１−２９３　（ １９ｇ４）；　Ｎａ１ｅｔおよびＦｏｕｒｎｉｅｒ、　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　９６：１２６−１３６　（１９８５）。ヒト赤血球とヒト胸腺細胞との 自家ロゼツト形成（Ｂａｘｌｅｙら、ＣＩ’　、ｘ、Ｉｍｕｎ匝口：３８Ｓ−３ ９３（１９７３））もまた報告されている。ＣＤ２発現クローンでトランスフェ クトされたＣＯ３細胞を、ＭＴ９１０またはコントロール抗体Ｍ８４０．５で処 理し、上記の種からの赤血球に曝した。ロゼツトは、ウマ、ブタ、イヌ、ヤギ、 ヒツジ、ウサギおよびヒトの赤血球とで観察されたが、マウスまたはう。

トの赤血球とでは観察されなかった。ロゼツト形成は、トランスフェクトされた ＣＯ３細胞をＭＴ９１０で予め処理することにより阻害されたが、Ｍａ２Ｏ，５ により予め処理しても阻害されなかった。これらの実験において、ウマ赤血球は 非常に濃密なロゼツトを形成し、ヤギ赤血球はむしろ低密なロゼツトを形成し、 これはヤギ赤血球のサイズが小さいために、洗浄により洗い流されやすいためで あろうと考えられた。マウス赤血球は、培養皿、ならびにＭＴ９１０およびＭａ ２Ｏ，５で予め処理された細胞への自発的結合力が弱いこと示したが、ラット赤 血球は、いずれとも検出可能な結合を示さなかった。

ヒト　、の　ＡはＦＡ３　によ　れ 抗体阻害の研究に基づいて、ＬＦＡ３が、ＣＤ２抗原の標的構造であることが示 唆されている（　Ｓｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３：２６２−２６４　（１９ ８６））ため、ロゼ、ト形成を防止する抗−ＬＦＡ３抗Ａ３抗調べた。トランス フェクトされた細胞を、１：１０００の希釈の腹水のように、抗ＬＦＡ３　（　 ＩｇＧ１、”ｐｐａ）　、またはＬＦＡ３：ＧＩＯ／Ｂｌｌおよびｏｉｏ、抗に １４抗原、Ｄ６、抗Ｗｒ’抗原；およびＦ７／Ｂ９、抗に抗原と同等またはそれ よりも有効である、それぞれの濃度が１０ｕｇ／■ｌの、ヒト赤血球抗原に対す る４個のイソタイプ適合非凝集抗体で、予め２時間処理したヒト赤血球に曝した 。Ｎ１ｃｈｏｌｓら、ニＬｈ■，出版。赤血球を、過剰なＬＦＡ３抗Ａ３抗し、 放出による抗体阻害力の損失を防ぐために、コントロール抗体の存在下でロゼツ トを形成させた。ロゼツト形成は、４個のすべてのコントロール抗体の存在下で 観察されたが、抗ＬＦＡ３で予め処理された赤血球では観察されなかった。

のＴ　を　るＣＯ３　はロゼツトを≦　しない多数のクローンを、ＣＤ２をクロ ーニングするのに使用したのと同一の発現技術により単離し、抗体反応性、核酸 制限消化および配列分析、および免疫沈降により様々な程度に特徴づけた。代表 的なりローンは、ＣＯ３細胞にトランスフェクトし、ロゼツト形成を維持する能 力を分析した。ＣＤｌａ％ＣＤ１ｂ，　ＣＤ１ｃ。

ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ６、ＣＤＩＩおよびＣＤ２８　（Ｔｐ４４）クロ ーンは、ヒト赤血球とはロゼツトを形成しなかった。

■ｒ乙し二二立丘 ＣＤ２抗原を発現または欠失する細胞型から調製した等量の全ＲＮＡを、アガロ ースゲルを変性することにより電気泳動にかけ、ナイロンに転移した。転移され たＲＮＡを、ＣＤ２　ｅＤＮＡインサートを含むＭ１３クローンから調製したス トランド選択プローブ（ｌ（ＵおよびＭｅｓｓｉｎｇ．　Ｇｅｎｅ　１７：２７ １−２７７　（１９８２））とハイブリダイズさせることにより、胸腺細胞、活 性化Ｔ細胞、および衰弱Ｔ細胞群から得たＲＡＮには、顕著な１．６５および１ 、３ｋｂの転写物が存在しているのが示された。ｃＤＮＡドナー系およびＩ（Ｐ Ｂ−ＡＬＬから抽出された［ｌＮＡには転写物の量は比較的少なく、ＭＯＬＴ４ からのＲＮＡでは転写物の量はさらに少なく、かろうじて検出可能なレベルの量 が、ｌｌ５Ｂ−２系からのＲＮＡにおいて記録された。Ｎａａ＋ａｌｖａ（バー キットリンパ腫）　、Ｕ９３７　（組織法白血病）　、ＨｕＴ−７８　（成人Ｔ 細胞白血病）　、ＰＥＥＲ　（Ｔ細胞白血病）、またはＪｕｒｋａｔクローンＪ ３Ｒ７　（Ｔ細胞白血病）系からのＲＮＡでは、いかなる反応性も観察されなか った。反応性のパターンは，　ＣＤ２抗原の既知のまたは測定されたパターンと よく一致しており、これは、Ｎａｍａｌｖａ，　＄９３７、ＨｕＴ−７８、Ｊ３ Ｒ７、ＰＥＥＲおよびＨＳＢ−２細胞系には存在しないまたは検出不可能であり 、ＭＯＬＴ４においてはわずかに存在し、ＥＰＢ−ＡＬＬにおいてより多（存在 し、活性化Ｔ細胞において最も多く存在していた。胸腺細胞はまた、高いレベル のＣＤ２抗原を発現することが公知である。

ｃＤＮＡクローンの配列を調べると、１．　３ｋｂのＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列に おける１０８５位の標準ポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡに遠位なもう１つ の３°末端の形成により生じ得ることが示唆された。

このことをテストするために、ＨＰＢ−ＡＬＬおよび活性化Ｔ細胞からのＲＮＡ を、ノーザンプロット分析にかけ、完全なｃ　ＤＮＡプローブ、またはヌクレオ チド１１３１に遠位なｃＤＮＡの３°部分から得られたプローブとハイブリダイ ズした。後者のプローブは、１。

６５ｋｂ種とのみ反応したが、前者は、図５で観察されるのと同一の反応性パタ ーンを示した。この結果は、示唆された１．３ｋｂ転写物の起源と一致している 。

活性化および衰弱Ｔ細胞ＲＮＡＫ１１製物の両方において、約０．７５ｋｂの弱 （ハイブリダイズする転写物が検出された。現在、このＲＮＡの起源は分かって いない。

Ｃ２　のゲノム 胎盤、末梢血リンパ球、Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、または上記のＲＮＡ分析に用い られた腫瘍系からのゲノムＤＩＪＡをサザンプロット分析することにより、同一 のＢａｍ旧消化パターンが示され、このことは、再配置が、発達中のＣＤ２遺伝 子の正常な発現に関与していないことを示した。同様に、全体的なゲノムの改変 は、調べたＴ細胞腫瘍系がＣＤ２抗原を発現しなかったことの原因ではない。多 数の他の酵素による全ゲノムＤＮＡの制限分析、およびＣＤ２配列を有する１フ アージによる組換え体の不完全な集合体による予備結果は、遺伝子が、少なくと も４個のエクソンに分割されることを示す。

（以下余白） 実ｍ例ＩＸ　ＣＤ３６のクローニング　ＩおよびＣＤ３　６をコードするｃＤＮ Ａクローンを単離するために、促進因子（実施例Ｉ、前出）としてＤＥＡＥ−デ キストランを用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡ（Ｓｉｍｍｏｎｓおよび５ｅｅｄ　（１ ９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：５６８−５７０）をｃｏｓｍｍに輸送した。

トランスフェクションから４８時間後に、トリプシンなしで細胞を皿から取り出 し、モノクローナル抗ＣＤ３６抗体５Ｆ１　（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（１９８２ ）　Ｊ．　ＩＩＩｌｍｕｎｏＬ．　１２８：８７６−８８１）　（Ａｎｄｒｅｖ ｓら（１９８４）　Ｊ．　Ｉｍ＋ｌ１ｕｎｏ１．　Ｌ２ｉ：３９８−４０４）と ともにインキコベートし、ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体によりコード口た皿 上で洗浄した。穏やかな洗浄により非付着細胞を除去し、付着細胞を溶解させ、 細胞から回収されたエピソームブラスミドを精製してε．　ｃｏｌｉ．に形質転 換した。スフェロプラスト融合に続いて２回同じ濃縮を行った後、ランダムに選 択された１２のコロニーのうち１１のコロニーから回収されたプラスミドＤＮＡ が、トランスフェクトされたＣＯ３細胞中のＣＤ３　６決定基の外見を管理して いることを発見した。

さらなる分析のために、クローンのうち２つをランダムに選択した。両方共、約 １．９ｋｂのインサートを有し、同一の制限酵素フラグメントパターンを示した 。これらのクローンのいずれか一方によりトランスフェクトされたＣＯ３細胞は 、モノクローナル抗体５Ｆ１およびＦ１３、そしてＯＫＭＳ　（Ｏｒｔｈｏ．　 Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ）と反応した。トランスフェクトされた細胞を、抗ＣＤ ３６抗体のプールにより免疫沈降させることにより、１１３　ｋｄの分子がトラ ンスフェクトされたＣＯ３細胞およびＣ３２メラノーマ細胞上に存在し、コント ロール（ＣＤ２５のトランスフェクトされた）ＣＯ３細胞には不在であることが 判明した。高分子量種、おそらく二量体ＣＤ３６が、トランスフェクトされたＣ ｏｓ細胞溶解物から免疫沈降したが、Ｃ３２細胞溶解物からは免疫沈降しなかっ た。ヌクレオチド配列を表１に示す。表１において、ヌクレオチド配列の番号を 、各ラインの冒頭の左マージンに示す。推定アミノ酸配列を、各コーディングヌ クレオチドトリブレットの最初の塩基の下に単一文字コードとして示し、開始メ チオニンを開始コドン上の番号１で示す。誘導されたアミノ酸配列中の、Ｎ連結 グリコジル化部位である可能性のある部位には、−重の破線でアンダーラインを 引いている。推定トランスメンブレン領域には二重のアンダーラインを引いてい る。ｃＤＮＡ中には２個のフンセンサスポリアデニル化（ＡＡＴＡＡＡ）モチー フが見られるが、ポリ（Ａ）テールは見られず、プロブトハイブリダイゼーシ首 ンにより観察されたＲＮＡ種の中には、これらの部位においてポリアデニル化に 対応するために十分短いものはない。このことは、転写物が、クローン中で観察 されたものと同一の隣接５°末端を有しているということを示唆している。

推定される開始コドンは、クローン中に見られる最初のＡＴＧではなく、前記２ 個のモチーフのすぐ後にフレーム内終止コドンが続いている。予想される開始メ チオニンには、短い疎水性領域が続いている。前記短い疎水性領域は、分泌シグ ナル配列に類似であるが、これに対する開裂部位は明白に同定し得ない。表１を 用いた最近の決定によると、アミノ末端３６アミノ酸配列（ＴａｎｄｏｎらＪ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２６４ニア５）Ｏ−７５７５（１９１１９））は、成 熟ポリペプチドが、開始メチオニンのすぐ後に続くアミノ酸残基において始まる ということを示している。疎水性の領域の前の単一のＡｒｇ残基がアミノ末端膜 アンカリングを許可するために十分であるかどうかは明白でない。得られたポリ ペプチドは、４７１個の残基を所有し、分子質量は約５３　ｋｄであると推定さ れる。提案される細胞外領域には、トランスメンブレン領域に相当する、はとん どが疎水性である２７個の残基および希薄細胞内領域に相当する６個の残基（内 ３個は塩基性である）が続いている。Ｎ連結グリコジル化部位である可能性のあ る部位が１０個存在するということは、予想されるポリペプチドと免疫沈降によ って発見された８３　ｋｄ種との間の分子質量の不一致を説明するために十分で あるように思われる。配列全体を、周知のタンパク質の様々なデータペースに比 較した結果、重要な相同性は検出されなかった。しかし、いくつかの内部構造は 明かであった。細胞外領域中の全システィン残基は、ヌクレオチド配列の残基９ ３７から１２０９によって定義される領域に閉じ込められている。システィン配 置をガイドとして用いて、細胞外領域を３つのセグメントに分割し得た。前記３ つのセグメントのうち、システィンを有さない２つの領域は、その前後にシステ ィンの豊富なセグメントを有した。しかし、現在のデータベースにおいては、こ れらのセグメントを用いた配列の比較は、他の分子に対する重要な関係も、特に トロンポスボンジンに対する重要な関係も示さなかった。

ＣＤ３６タンパク質を免疫沈降により精製した。急速な免疫選択クローニング法 は、トランスフェクトされたＣＯ３細胞の発現に依存するため、ＣＤ３６　ｃＤ ＮＡがクローニングされた、互いに同一の細胞系もまた発現タンパク質量として 使用し得るということになる。

Ｃ３２メラノーマ細胞、ＣＤ３６のトランスフェクトされたＣＯ３細胞、および ＣＤ２５　（コントロール）のトランスフェクトされたＣＯ５細胞をＮ　ａ　Ｉ 　２　Ｓ　（表面標識し、１　ｔｘＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド 、　Ｏ，５％　ＮＰ−４０、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含むリン 酸緩衝生理食塩溶液中で溶解した。抗ＣＤ３６モノクローナル抗体を添加し、４ ℃で１２時間溶解物中に吸収させた。その後、ヤギ抗マウス免疫グロブリンビー ズ（Ｃａｐｐｅｌ）を添加し、２時間混合し、記載されている（Ｃ１ａｒｋおよ びＥｉｎｒｅＩｄ　Ｊ、−土ｉｍｕｎｏ１．１ｆｆ５：１５５−１５７　（１９ １１５＞）ように洗浄した。免疫親和性カラム精製により、トランスフェクトさ れたＣＯ５細胞溶解物から、より大量のタンパク質もまた、精製された形態で得 られ得る。ＣＤ３６タンパク質を用いて、ＣＤ５６に対する他の抗体も得られ得 、記載されているように免疫原として発現および／または精製され得る。

ＣＤ３６は、本発明の発明者および０ｃｋｅｎｈｏｕｓｅ、　Ｃ，Ｄ、ら（１９ ８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　■：１４６９−１７４１によって、熱帯熱マラリア原虫 が寄生した赤血球の細胞付着の結合部位であると同定されている。

寄生された赤血球の細胞付着は、ＣＤ３６に対するモノクローナル抗体によって 阻止されることが示されている。感染した赤血球を、ＣＤ３６　ｃＤＮＡでトラ ンスフェクトされたＣＯＳ細胞とインキュベートすると、明白な細胞付着を示し た。熱帯熱マラリア原虫が寄生した赤血球の、末梢血管床への付着により牌性ク リアランスを回避する能力は、熱帯熱マラリアの病原性において重要な役割を果 たし、且つ、脳の小さな血管の閉塞を引き起こすことにより大脳マラリアの致命 的症状に寄与すると考えられている。したがって、本発明のｃＤＮＡおよび精製 タンパク質は、治療用モノクローナル抗体を生産するために十分な精製ＣＤ３６ を提供するために有用である。

（以下余白） 実施例ＸＩ　Ｔリンパ　Ｔ′ＳＡ　コード　るｃＤＮの　おＴＬｉＳＡｌをコー ドするｃＤＮＡクローンを、記載されているように、ＣＯ３細胞に形質転換され たヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーから得て、本発明の迅速免疫選択クローニン グ法を行った。モノクローナル抗体ＡＣＴ−Ｔ−ＳＥＴ　ＴＬｉＳＡｌ　（Ｔ− Ｃｅｌｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いることにより、クローニングされたｃＤＮＡを発現 するトランスフェクトされたＣＯ３細胞を、正の間接的蛍光抗体法によって検出 した。正のプラスミドは１．７ｋｂのインサートを含んでいた。

前出の実施例ＩＸに記載したように、免疫沈降により、ＴＬｉＳＡタンパク質を 単離した。ゲル電気泳動によって測定したところ、タンパク質は約５０　ｋｄの 分子質量を有していた。

ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、上記したように、ジデオキシヌクレオチド法に よって決定した。１７１４個の残基の配列を表３に示す。また、推定アミノ酸配 列を、各コーディングトリプレットの最初のヌクレオチドの下に単一の文字コー ドにより示す。推定される開始メチオニンをコードするＡＴＧの後には、分泌シ グナル配列に一致する、短い疎水性の領域が続いている。切断部位である可能性 が最も高い部位はリーディングフレームの１９個の残基である。得られたポリペ プチドは、さらにプロセッシングされない場合は、３１７個の残基を所有し、予 想される分子質量は３６　ｋｄである。提案される細胞外領域には、細胞内領域 に相当する、はとんどが疎水性である２５個の残基が続いている。（表３におい て、二重のアンダーラインで示す。）Ｎ連結グリコジル化部位である可能性のあ る部位（表３において一重の破線で示す）が９個存在するということは、予想さ れるポリペプチドと免疫沈降によって発見された５０　ｋｄ種との間の分子質量 の不一致を説明するために十分であるように思われる。

ＴＬｔＳＡは、Ｔ細胞の、ＩＬ−２に誘導された分化を媒介して細胞溶解性形態 にすることに関与している。ＴＬｉＳＡに対する抗体は、ＩＬ−２に刺激された Ｔ細胞の分化を阻止するために、且つ、治療における［Ｌ−２の悪影響を緩和す るために有用である。

（以下余白） 実施例Ｘ１ｌｌ　Ｔす７Ａ　、　−ＣＤ２７　コード　るＣＮＡＣＤ２７をコー ドするｃＤＮＡクローンを、ＣＯＳ細胞に伝達されたヒトＴリンパ球ｃＤＮＡか ら得て、本発明の方法により免疫選択した。Ｌ　ｕｇ／ｍｌフィトヘマグルチン （ＰＨＡ）を含む培地中で４日間培養した後、グアニジウムチオシアネートを用 いて、血液１ユニツトから誘導された単核細胞からＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ が、選択されたポリＡであった。ｃＤＮＡを生産し、ＣＤＭＩＩにクローニング し、Ｃ０８ｗ１胞にトランスフェクトし、そして、ＣＤ２７ｃＤＮＡを、モノク ローナル抗体０ＫＴ１１１ａおよびＣＬＢ−９Ｆ４（ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆ ｏ　ｃ、ａｔｌ、ｅａｄ、　Ｓｃ’、　ｊｉｌ：８５７３−８５７７　（１９１ １７）；そしてＡｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ　ｏｅ、　、ｃａ、ｓ’　Ｕ　ｉｌ ｌ：３３６５−３３６９　（１９８７）に記載されているように供給される）に より免疫選択した。ベクターは１．２ｋｂのｃＤＮＡインサートを含んでいた０ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、上記したように、ジデオキシヌクレオチド法に よって決定した。１２０３個の残基の配列および推定アミノ酸配列を表５に示す 。開始メチオニンを開始コドン上の番号１により示す。推定ＣＤ２７ポリペプチ ドは、タイプ■膜内在性タンパク質の典型的な特徴を示す。前記推定ＣＤ２７ポ リペプチドは、分泌シグナル配列に一致する、２０アミノ酸の疎水性領域で始ま る。この疎水性領域には、１７１残基の細胞外領域、２０残基の疎水性膜スバン ニング領域（二重のアンダーラインにより示す）、および正に帯電した輸送停止 配列で始まる４９アミノ酸の細胞質領域が続いている。ポリ（Ａ）テールはない 。

推定ＣＤ２７アミノ酸配列は、図１７に示すように、全長にわたって、８９７８ 球およびガン腫抗原ＣＤ４０に対して高度に相同性である。ＣＤ２７はまた、細 胞外およびトランスメンブレン領域にわたって、神経成長因子のレセプター（Ｎ ＧＦＲ）に対しても高度に相同性である（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、［ｉ：１ ４０３−１４１０（１９８９）：　Ｊｏｈｎｓｏｎら、堕貝４７：５４５−５５ ４　（１９８９））。これら３つのタンパク質中に見られる最も保護された構造 モチーフは、細胞外領域におけるシスティンまたはヒスチジンの豊富さである。

これらはしばしば、対で見られ、前記対は、亜鉛イオンを結合するためにこの構 造を用いるタンパク質中に見られる配置に類似の、２または４個の干渉アミノ酸 残基によって分離される。システィンおよびヒスチジンが豊富な領域には、セリ ン、トレオニン、およびプロリンが豊富な膜近接領域が続いている。前記膜近接 領域は、生化学的に同定された。連結グリカンがＮＧＦＲに付加される領域であ ると示唆されている（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８９）、前出ＨＧｒｏｂら、Ｊ、 ’ｏ　、Ｃｔｉ、２６０：８０４４−８０４９　（１９８５））。

抗ＣＤ２７抗体によって、トランスフェクトされたｃｏｓ細胞を免疫沈降し、続 いてゲル電気泳動を行ったところ、還元されない場合に１１０　ｋｄ橿が存在し 、還元剤の存在下では単一の５５　ｋｄバンドが存在するということが明かにな った。このことは、トランスフェクトされたｃｏｓ細胞上においては、ＣＤ２７ は、５５ｋｄモノマーを包含する、ジスルフィド連結ホモダイマーであり、Ｔリ ンパ球から沈降した形態に類似であるということを示している。（Ｂｉｇｌｅｒ ら、Ｊ、！ｍａ＋ｕｎｏ１．　ｉｌｌ：２１−２８　（１９８１１）：　Ｓｔｏ ｃｋｉｎｇｅｒら、Ｌ　ｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ　ＩＩ　Ｌ吐、ユニ５１３− ５２９　（１９８６）；　ｖａｎ　Ｌｉｅｒら、　ｕｒ、Ｊ、ｍｍｕｎｏ　、　 ［：ｌ１１１−８１６　（１９ｇ？））。

ＣＤ２７は、１９７８球活性化抗原である。その構造は、リンホカインまたは成 長因子に対するレセプターとして機能し得るということを示唆している。ＣＤ２ ７の認識は、Ｔ細胞の増殖、モしてＴ細胞のヘルパーおよびエフェクターとして の機能に必要な特定の遺伝子の増加する発現を引き起こす。Ｔ細胞上におけるＣ Ｄ２７の発現は、フィトヘマグルチン（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３モノクローナル 抗体による刺激により、２倍から５倍増加し、且つ、少なくとも１種のＣＤ２７ モノクローナル抗体を添加すると、Ｔ細胞の、ＰＨＡ刺激による増殖を強化し得 る（ＢｉｇｌｅｒおよびＣｈｉｏｒａｚｚｉ、ｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｎ　ＩＩ　 ｎＬ」：５０３−５１２　（１９８６）；　Ｖａｎ　Ｌｉｅｒ、　（１９８７） ）。ＣＤ２７陽性であるＴ細胞は、適度に刺激された場合、ＩｇＭ合成およびＩ ｔ−２分泌のためにＢ細胞を補助するということが発見されている（Ｖａｎ　Ｌ ｉａｒら、ム二−Ｌ−Ｉｌ狙１工ｕ：１１１１−８１６　（１９８８））。

抗原提示細胞によりＣＤ２７陽性Ｔ細胞の結合を干渉する能力、または、このよ うな結合を、リンパ球細胞以外の表面上で引き起こす能力は、診断および治療に おいて有用である６例えば、ＣＤ２７と基質に固定されたレセプターリガンドと の融合タンパク質は、体液中の特定の抗原の存在を検出するために有用である。

可溶性ＣＤ２７融合タンパク質は、例えば特定の自己免疫疾患において、望まし くないＴ細胞の増殖を阻止するために有用である。

（以下余白） 実施例ＸＶＩ　ＣＤ５３　をコード　るｃＤＮＡの　および　り抗体ＭＥＭ−５ ３（Ｈａｄａｔ　Ｍ、Ｒ，（１９８９）、　ｅｕｃｏｃ　ｔｅ　Ｔ　’　ＩＶ。

Ｋｎａｐｐ、　Ｂ、ら（ｉｉ）　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ 、　６７４）、ｌｌＩＤ７７、Ｉｌ［Ｉ２９および旧３６、そして６３−５Ａ３ によりｔＪ！、識される抗原であるＣＤ５３は、造血系列（Ｓｔｅｖａｎｏｖａ 、１．、ら、（１９８９）、はｕｃｏｃ　ｔｅ　Ｔ　Ｉ１上、Ｋｎａｐｐ、　Ｂ 、ら（編）　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、　６７１１）の有 核細胞中に広（分布しているが、前記有核細胞に厳しく制限されている、糖タン パク質である。ＣＤ５３は、単球およびマクロファージにより、顆粒球、樹枝状 細胞、破骨細胞および骨芽細胞により、そして、ＴおよびＢ細胞により、分化の 全段階から発現される。

ＣＤ５３をコードするｃＤＮＡクローンを得るために、末梢リンパ球および前骨 髄球糟瘍細胞系ＨＬ６０を、上記したようにＤＥＡＥ−デキストラン法により、 ＣＯ５細胞にトランスフェクトした。トランスフエフシランから４８時間後、細 胞をプールし、モノクローナル抗体ＭＥＭ−５３とインキュベートし、５ｅｅｄ およびＡｒｕｆｆｏ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｉ４：３３６５−３ ３６９　（１９８７）、そしてＡｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ、　Ｐｒｏ　、　Ｎ ａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃ’、　ＵＳ　ｊｌ：８ｓ７３−８５７７　（１９８７） に記載されているように洗浄した。スフェロプラスト融合に続いて２回の連続的 濃縮を行った後、単一のコロニー＊＊体から回収されたプラスミドＤＮＡをＣＯ ５細胞にトランスフェクトし、蛍光抗体法によってＣＤ５３の発現を評価した。

８個のトランスフェクトントのうち２個が陽性であり、各々約１．５　ｋｂのイ ンサートを有していた。いずれか一方のクローンによりトランスフェクトされた ＣＯ３細胞は、抗体ＭＥＭ−５３、旧２９、［１３６、および６３−５Ａ３の各 々と反応した。

比較のために、末梢リンパ球およびトランスフェクトされたＣＯ３細胞からＣＤ ５３を単離するために、リンパ球およびトランスフェクトされたＣＯ３細胞を、 ラクトペルオキシダーゼおよびＲ２０２を用いて１２５１表面標識し、その後、 １％ＮＰ４０．１５０　ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＭｇＣｈ、５　ｄ　ＫＣＩ、 　２０　ｍＭ″１−ドアセトアミドおよび１■Ｍフェニルメチルスルフォニルフ ルオライドを含む５０ｍＭトリス−）１ｃＩ　ｐ［Ｉ　８．０溶解バツフアー中 で溶解した。細胞を、溶解バフファー中で４５分間、２．５　ｘ　１０７細胞／ ■ｌの濃度で可溶化し、その後、１２，０００　ｇで遠心分離した。ヤギ抗マウ ス免疫グロブリンビーズ（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）により予 め清澄化した後、５ｃｈｎｅｉｄｅｒら（ムーム立Ｌ」１ｕ１庄：１０７６６　 （１９８２））に記載されているように、モノクローナル抗体ＭＥＭ５３または ６３−５Ａ３およびプロティンＡ−セファロースＣＬ−４８（Ｓｉｇｍａ、　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）により免疫沈降を行った。免疫沈降物を、ＳＤＳ試 料バッファー中に溶出させ、ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２．５％アクリル アミドゲル上で分析した。

質量３４　ｋｄから４２　ｋｄの範囲の、広バンドの放射線ヨード化タンパク質 を、ＭＥＭ−５３か６３−５Ａ３かのいずれかのモノクローナル抗体を有する末 梢リンパ球から得、これは、３６　ｋｄから４６ｋｄにわたる、ＣＤ５３のトラ ンスフェクトされたＣＯ３細胞から得られるバンドに匹敵する。ＣＯ３細胞中に さらに高分子量のものが含まれることは一般的にない。なぜなら、トランスフェ クトされたＣＯ３細胞から回収された細胞表面タンパク質は、通常、ｅＤＮＡク ローンが由来する細胞上に見られるものと変わらない、またはより低分子量を示 すからである（Ａｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ、　１ｏｃ、　Ｎａｔ　、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃ’、　ＵＳ　８４：３３６５−３３６９　（１９８７）ン。賀■の約 １５　ｋｄのものは、エンドグリコシダーゼＦ　（Ｎ−グリコヵナーゼ）による 消化によって糖タンパク質から遊離する。一方、ノイラミニダーゼおよび０−グ リヵナーゼによるプロセッシングは、見かけ上の分子量にいがなる影響をも与え ない（Ｈａｄａｍ、　Ｍ、Ｒ，（１９８９）、ｕｃｏｃ　ｔｅ　’ｎ　ＩＶ、　 Ｋｎａｐｐ、　Ｂ、ら（編）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、Ｐｒｅｓｓ、ｐ、６７４ ；　５ｔｅｖａｎｏｖａら、ｕｃｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ口、にｎａｐｐ　Ｂ、ら （ＩＩ）　０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、　６７ｇ）。さらに 、かすかな２０　ｋｄのバンド、おそらくグリコジル化されていない前駆体が、 トランスフェクトされたｃｏｓ細胞の免疫沈降物中で検出されたが、末梢リンパ 球の免疫沈降物中では検出されなかった。

いくつかの酵素によって消化されたＴ細胞系ＰＥＥＲからのゲノムＩ）ＮＡをプ ロットハイブリダイゼーションしたところ、単一コピー遺伝子と一致するパター ンを示した。ＲＮＡプロット分析は、Ｂ、Ｔ、および骨髄細胞系由来、そして末 梢リンパ球由来の単一の１．８　ｋｂ　ｍＲＮＡを示した。発現のレベルは、Ｔ Ｆ！ＰＬ細胞系中を除いて、異なる細胞系中で互いに一致した。ＴＨＰＩ細胞系 はＣＤ５３　ｍＲＮＡをほとんど有していなかった。ＣＤ５３の転写物は、培養 された細胞系中よりも末梢リンパ球中で、より豊富であり、このことは、これら の細胞中でＣＤ５３の表面発現がより高いことと一致する。

ＣＤ５３　ＣＤＮＡのヌクレオチド配列を、上記したように、合成オリゴヌクレ オチドブライマーを用いて、ジデオキシヌクレオチド法によって決定した。ＣＤ ５３インサートの配列は、１４５２個のヌクレオチド（表９）から成り、２個の 重複するＡＡＴＡＡＡモチーフ（−重のアンダーラインにより示す）の近傍で終 結する。３°非コ一ド配列は、ＡＴＴＴＡ配列の３つの例（引用符により示す） を含み、ＡＴＴＴＡ配列は、ｍＲＮＡの不安定性の媒介となることが示されてい る（ＳｈａｖおよびＫａｍｅｎ、堕１１［：６５９　（１９８６））。

残基７４で始まるオーブンリーディングフレームは、２４，３４０　ｋｄの分子 質量を有すると予想される２１９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする 。予想されるポリペプチドは、主な疎水性セグメント（二重のアンダーラインに より示す）を４つ冑する点は一般的であって、そのうちの３つは、分子のアミノ 末端近傍に存在する。第１の疎水性セグメントは、シグナル配列か単純なトラン スメンブレンアルファへリックスかのどちらに対しても異常に長く、中間に位置 する３個のシスティン残基およびグリシンを含む。システィンとグリシンは両方 とも１つのシグナル開裂部位の直前に存在するということが発見されている（ｗ ｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ｃ’ｄｓ　ｅｓ、口：４６８３　（１ ９１１６））。このことは、成熟タンパク質のアミノ末端は、第１の疎水性領域 の中間において始まるということを暗示している。この見解は、以下に述べる関 連のタイプＩＩＩ膜内在性タンパク質である、ＭＥ４９１のポリペプチド骨格の サイズが、おそらくシグナルペプチドの切断の結果として、ｃＤＮＡ配列から予 想されるサイズよりも小さいということによって支持される。Ｎ連結グリカン付 加部位である可能性があるのは、第３と東４の疎水性セグメントの間に位置する ２つの部位（表９に−ＣＦｌＯ−で示す）のみであるため、カルボ牛シル末端は 、細胞内、および第２と第３のセグメントの間の短い疎水性部分に存在するに違 いない。アミ／末端は、プロセッシングされない場合は、同様に細胞内に残って いるに這いない。

ＣＤ５３ハ、他の３つの膜タンパク質に関連するタイプＩＩＪＩ！ｌｌ内在性タ ンパク質である。他の３つの膜タンパク質とは、その増加する発現が腫瘍の進行 と相関するメラ／−マタンパク質であるＭＥ４９１抗原（Ｈｏｔｔａら、伽」！ 虹−１目工１ｉ：２９５５　（１９８８））、Ｂｆｉ胞上の大部分に発現する、 高度にグリコジル化された抗原であるが、Ｂ細胞系列特異的ではない、ＣＤ３７ 　（Ｓｃｈｖａｒｔｓら、Ｌ」１１ＬＩＪ４＋９０５　（１９８８）、および造 血系列の細胞上に広く発現するグリフシル化されていない抗原であるＳ５．７　 （ＰｒｅｓｓａｎＯら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３：４８１２　（１９８ ３））である。さらに、ＣＤ５３は、ラクトースを細菌細胞に輸送するタイプ！ ！！膜内在性タンパク質である、Ｌ−１■Ｉａｃ　Ｙパーミアーゼにかすかに関 連する。

末梢リンパ球中のＣＤ５３の転写物は、ＰＨＡによるマイトジェン刺激に続いて 大量に増加する。このことは、細胞増殖に不可欠な因子の輸送にタイプ＋１１１ １！内在性タンパク質が関与し得るということを示唆している。

造血系中の、広い反応性を宵する分子のなかでも、ＣＤ５３は、現在、最も広い 反応性、および造血細胞に対する最も厳格な制限を有する。抗ＣＤ５３抗体は、 造血系新生物の同定にとって有用な道具であり、形態学的定義が不十分な細胞、 例えば、膵臓内の細胞または骨髄の一次培養細胞を同定するために有用であると いうことが証明し得る。

（以下余白） −中　−へ　門　菅　マ　１１１ｉｌｌ　ｒ＋　中　の工ｉ惣 当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施例に対する等価物を、ルーチ ンの実験以上のものを用いることなく、認識し、または確かめることができる。

このような等価物は、本発明の範囲内のものである。

１　ＧＧＣＧＴＡＡＴＣＴ　ＧＣＴＧＣＴｒＧＣＡ　ＡＡＣＭＡＡＡＡＡ　ＣＣ ＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴ１７０１　ＴＧＣＧＣＣＴＧＣＡ　ＧＧ ＴＣＧＣＧＧＣＣ頷ひσＣＴに聰ＴＣηＴＧＴひに弘ＡＣＣＦＩＧ、　１−２ ＦＩＧ、　２−２ １５１　ＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴ　ＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧ　 ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴ１３０１　ＡＧＧＱＡＧＣＡＧＡ　 Ｃ丁ＣＴＭＡＴＣＴ　ＧＣＣＧＴＣＡＴＣＧ　ＡＣｎＣＧＡＡＧＧ　ｎｃＧＡＡ ＴｃｃＴ２３０１　ＭＧＴＴＧＧＴＧＧ　ＡＣＡＴＡＴｒＡＴＧ　ｍＡＴｃＡＧ ＴＧ　ＡＴＡＡＡＧＴＧＴＣＭＧＣＡＴ（、ＡＣＡＦＩＧ、　６−３ ３５０１　ＴＣＴＡＧＴｒＧＴＧ　ＧｍＧＴＣＣＡＡ　ＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴ　 ＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＦＩＧ、　６−４ ＡＧＡｃｙａｃＡｍｃｎｃｃｃｘｉｒｃｃｃｖｃｍｃｘｃｎｃｃｃｃｉｃＡｃｘ ６−４ＡＧＡｃｙａｃＡαｔ　（６０）ＦＩＧ、　７７− １ａｃＡａＣＡｃｃＴｃｃＡｃＡｒａＣＡｃｒｃ頷ＭにＴｃｒｃｃｕｉｃｃｘｃ ｘｃｘｃｘｒｍＡｃｒｒｃｃＡ　（１１４０）ＦＩＧ、　７−２ ＦＩＧ、　９−１ ＦＩＧ、　９−２ ＝２　＝９１で＝＝で−一 １　、　、ＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＡＴ　ＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴ　Ｃ ＧＣＣＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴ１１５１　ＡＴＧＧＡＭＣＣＣＧＡ ＧＣＡＧｃＧＡＣＧＴＣＣＡＧＧＣＧＧ　ＡＴαｘｃ＜ｃｍ　印弱ｒｃｃｃｃｃ １２０１　ＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧ　ＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡ　ＧＡＡＧＡＡＧＡＧ Ｇ　Ｍα；ＧＧＡＧＧＧ　ＣＴＡＴＧＡＧＧＭ１９０１　ＭＴＧＡＧＣＴＣＴ　 ＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡ１　ＡＣＡＡＡＧＡＣＡＡ　ＡＣＴＧＣＡＣＣ ＣＡ　ＣＴＧＡＡＣＴＣＣＧ　ＣＡＧＣＴＡＧＣＡＴ　ＣＣＡＡＡＴＣＡＧＣＦ ＩＧ、　１３−１ １１０１　ＡＴＣＴＧＧＣＣ’ｒｒ　ＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴ　ＧＡＣＣＡＴＡＧ ＣＴ　ＣＣＴｒＣＴＣＴＣＴ　ＴＡＣＡＴＴＧＡＡＴ１４５１　！　ＡＧＡＧＣ ＡＣＡＡＴ　ＧＧＡＴＣＴｌ　ＣＣＣＡＭＴＧＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＴＡ　ＴＧ ＴＣＣＣＡＧＭ　ＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴ　ＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＦＩＧ、　１５ −１ ＦＩＧ、　１５−２ ＦＩＧ、　１６−１ １７０１　ＧＧＧＴＣＴＣＡＧＡ　ＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡ　ＧＡＣＣＴＣＣＣＧ Ｇ　ＧＴＣＣＴＣＴＧＣＧ　Ｇ丁ｒｆｆｒＴＧＴＧ２１５１　ｍＧＴｒＡＴｃＡ 　ＧＴＴＴＣＣＡＣ’ｒｒ　ＴＦＩＧ、　１６−２ １　ＧＣＣＴＣＧＣＴＣＧ　ＧＧＣＧＣＣＣＡＧＴ　ＧＧＴＣＣＴＧＣＣＧ　Ｃ ＣＴＧＧＴＣＴＣＡ　ＣＣＴＣＧＣＣＡＴＧＦＩＧ、　１７ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＣＤ５３細胞表面抗原をコードする組換えＤＮＡセグメントまたはその機能 性誘導体。 ２．表９に示されるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡセグメントまたはその 機能性誘導体。 ３．実質的に純粋なＣＤ５３タンパク質またはその機能性誘導体。 ４．表９に示されるアミノ酸配列を有する、実質的に純粋なタンパク質またはそ の機能性誘導体。 ６．実質的に純粋なＣＤ５３細胞表面抗原を含む薬学的組成物であって、該細胞 表面抗原が、可溶な形態または受容可能な塩形態で存在する、薬学的組成物。 ７．受容可能なキャリアをさらに含む、請求項６に記載の薬学的組成物。 ８．治療剤をさらに含む、請求項６に記載の薬学的組成物。 ９．実質的に純粋なＣＤ５３細胞表面タンパク質、受容可能なキャリア、および 治療剤を含む、免疫治療剤。 １０．可溶な形態の実質的に純粋なＣＤ５３細胞表面抗原および含有手段を含む 、免疫診断アッセイに有用なキット。