JPH06504186A - Cd53細胞表面抗原とその使用 - Google Patents
Cd53細胞表面抗原とその使用Info
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- JPH06504186A JPH06504186A JP3515602A JP51560291A JPH06504186A JP H06504186 A JPH06504186 A JP H06504186A JP 3515602 A JP3515602 A JP 3515602A JP 51560291 A JP51560291 A JP 51560291A JP H06504186 A JPH06504186 A JP H06504186A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
CD53細胞表面抗原とその使用
本発明は、同時係属中の1988年2月25日出願の米国特許出願番号160.
416号の一部継続出願である、同時係属中の1989年7月13日出願の米国
特許出願番号379.076号の一部継続出願である、同時継続中の1990年
3月23日出願の米国特許出願番号498.809号の一部継続出願である。
l且旦!景
組換え遺伝子学の分野における基本的な手法は、ポ’J(A)”mRNAを二本
鎖(ds)cDNAへ変換し、次にその二本鎖cDNAをクローニングベクター
に挿入し、適切な宿主細胞中で発現させることである。ds cDNAに対する
分子クローニング法は、例えばWilliamson編集のGenetic n
1neerin 、 Mo1. L p、2. Academic Pres
s、 New York (1981)のWilliamsのr The Pr
eparation and Screening of a cDNA C1
one BankJ 、Prescott編集の堕且」胆堕…、 Academ
ic Press、New York (1980)のManiatisのrR
ecombinant DNAJ 、および5teloらのGenetic E
nn競丘■、 Vol、 1. p、 15. Plencv+ Press、
New York (1979)のEfstratiadisらのr Clo
ning of Double−Stranded DNAJの中で考察がなさ
れている。
相当な数の要因が特定の遺伝子のクローニングに影響を及ぼすため、cDNAク
ローニングのための戦略は注意深く選択しなければならない。多くのcDNAク
ローニング戦略に共通する方法には、目的の生物の細胞からの全ボ’) (A)
”mRNA由来のcDNAクローンの集合体であるr cDNAライブラリー」
を構築スることが含まれる。
哺乳動物細胞は30.000にも上る異なるmRNA配列を含み得、例えば存在
量の少ないmRNAを得るために必要なりローンの数はさらに多数で有り得る。
バクテリオファージλ、コスミド、およびウィルスベクターを含む異なる発現ベ
クター中で、真核細胞のゲノムDNAライブラリーを構築する方法が知られてい
る。一般的に用いられる方法のいくつかが、例えばManiatisらのMo1
ecular C1onin : A Laborator Manual、C
o1d Spring Harbor Laboratory出版、Co1d
Spring Harbor、 New York(1982)に記載されてい
る。
一旦ゲツムcDNAライブラリーが構築されると、目的の特定のヒト遺伝子を含
む細胞を何千という宿主細胞の中から単離することが必要である。cDNAライ
ブラリーから標的遺伝子を単離するために多くの異なる方法が採用され、その成
功度は様々である。これらの方法には、例えば、標的遺伝子のDNA配列に相補
的な核酸配列を有する標識された+gRNAフラグメントである核酸プローブの
使用が含まれる。この方法を形質転換された細菌宿主中での多数のmRNAのc
DNAクローンに適用スると、プローブと強固にハイブリダイズするコロニーは
標的DNA配列を含むことが期待される。次にクローンの同定が、例えば、in
5ituハイブリダイゼ一ンヨン/選択(Goldbergら、Method
s Enz mol、、 68:206 (1979)) 、ハイブリッド阻害
翻訳法(Patersonら、ヒ立井1壮l旺二」」上り違匹二ュ[−値玉上証
一ゴ5ciences、 74:4370 (1977)) 、あるいは直接的
なりNAの配列決定(MaxamおよびG11bert、Proceedin
s of the NationaAcadem of 5ciences、
74:560 (1977)、MaatおよびSm1th。
Nucleic Ac1ds Res、、 5:4537 (1978))によ
り行われる。
しかしながらこのような方法は、cDNAライブラリーから比較的存在量の少な
いmRNAをクローニングすることが目的であるときには大きな欠点を有する。
例えば、直接的な江」匝」コロニーハイブリダイゼーションを用いる際、最初の
ライブラリーポピユレーションにおいて、200中に1より小さい割合で存在す
るlllRNA種に相補的なcDNAを含むクローンを検出するのは非常に困難
である。その結果、全ポビニレーシ1ン中の+5RNAをを増やす種々の方法(
例えば、サイズ分画、合成オリゴヌクレオチドの使用、示差ハイブリダイゼーシ
ョン、あるいは免疫的精製)が開発され、しばしば存在量の少ない@RNAのク
ローニングに用いられてきた。このような方法は例えば、上述のManiati
sら、Moecula Con1 : b ato Manu虹に記載されてい
る。
多くの機能的な真核細胞タンパク質が、最初からそれらのN末端にリーダーある
いはシグナル配列を含む前駆体分子の形で存在している。これらのリーダー配列
は細胞膜に結合し、脂質二分子層を介して残りのタンパク質を引き寄せ、その後
シグナル配列がシグナルペプチダーゼ酵素によって開裂する。
従って、このタンパク質は細胞から分泌された後でのみ(例えば、インシュリン
、血清アルブミン、抗体および消化管酵素)、あるいはこのタンパク質が細胞膜
の外側表面に固定された後でのみ(例えば、組織適合性抗原)機能する。
哺乳動物1978球に特有の細胞表面抗原は、細胞表面に固定されるタンパク質
のさらなる例である。哺乳動物においては、骨髄由来の特定の細胞はリンパ球に
成熟し、そのリンパ球は胸腺、膵臓、リンパ節およびリンパ集合体を含むリンパ
組織に存在し、さらに血液およびリンパ系を介して能動的に循環する。成熟リン
パ球細胞は2種のポピーレーション:胸腺依存性(T)IJンパ球および胸腺非
依存性(B)IJンパ球に分類し得る。T’Jンバ球は胸腺内部に移動し、そこ
で分化的な***増殖をする。分化過程においてそれらは、Thy−1、TLA%
gv−1、Ly−1、t、y−z、Ly−3およびt、y−sを含む特有の細胞
表面膜アロ抗原を発現する。それらが成熟するにつれ、1928球はTLA抗原
およびThy−1抗原のいくつかを失い、そして組織適合性抗原を得、再循環1
978球を衰微する膜コンフォメーシヲンを得る。このことは例えば、Bier
ら編集 u dam ntals o In ud五「策2版、Springe
r−Verlag、 Berlins pp、 35−62 <1986)のM
OtalこよるrActrvity of I@5ane Ce1lsJに記載
されている。
1928球は抗体の形成に間接的に関わり、従ってその活性は、単に抗体力価の
測定以上に細胞機能の複雑な解析を必要とした。幾分かはこのことのせいで、比
較的最近まで、それらの免疫学的応答能の発達における重要性が認識されなかっ
た。成熟1928球は、Tヘルパー細胞、Tサプレッサー細胞、およびT細胞障
害性細胞を含む、異なる丁すンパ球すブポピュレーシ1ンの同定のためのマーカ
ーとして機能する表面膜タンパク質の固有のパターンを合成しそして発現する。
これらのサブポピニレーションのそれぞれは、免疫系を調節する上で非常に重要
な役割を果たしている(前記Mota)。
ヒトにおいて、1928球の機能的および表現型の異質性は十分認識されている
。2つの主要なサブポピニレーシ目ンが知られている:細胞性免疫を仲介するエ
フェクターT細胞;およびヘルパーおよびサプレッサーTリンパ球を含むレギュ
レーターT細胞。これらの2つのサブポビニレーションは、ヘテロ抗血清、自己
抗体、および細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体によって確定されてる
。例えば、発生の初期には、胸腺内のヒトリンパ球細胞はCD分類2(CD2)
と称するモノクローナル抗体と強く反応し、細胞表面抗原T1に対するモノクロ
ーナル抗体CD5とわずかに反応するTllと称する抗原を発現する。成熟過程
において、これらの細胞はTl1(CD2)を失い、そして、モノクローナル抗
体CD4、CD8、およびCDIによって確定される3つの新しい抗原を獲得す
る。さらに成熟するにしたがって、この胸腺細胞はモノクローナル抗体CDIに
反応性の細胞表面抗原の発現を終始し、モノクローナル抗体CD3に反応性のT
3抗原を発現し、次に74 (CD4)あるいはT8(CD8)を発現する2つ
のサブポピニレーシ1ンに分離する。免疫学的応答能はこの段階で獲得されるが
、胸腺リンパ球が胸腺外に移行するまでは、完全には発達しない(前記Mota
)。多数の胸腺細胞とは対象的に、循環TIJンパ球はTl(CD5)およびT
3(CD3)抗原を発現する。T4(CD4)抗原は、末梢1971球のおよそ
55−65%に存在するが、T8(CD8)抗原は20−30%に発現される。
これらの2つのサブポビュレーシ1ンは、それぞれヘルパーT細胞、およびサプ
レッサー並びに細胞障害性T細胞に対応する。
これらの細胞表面抗原は、1973球サブポピユレーションを区別する便利な方
法を提供するのに加えて、成熟T細胞の活性化およびエフェクター機能にとって
重要である。TJi[IIF!活性化は、T細胞レセプターのその特異的な抗原
への結合に加えて、Twi胞と標的細胞あるいは刺激細胞との開の細胞表面相互
作用の複雑な過程を包含する。
例えばCD2、ヒトT細胞赤血球レセプターは、胸腺細胞および1928球を標
的細胞(すなわち赤血球)および胸腺上皮に結合させる。このことは、LFA−
3と称する、ヒトに広く分布する表面抗原であるCD2に対する特異的な分子リ
ガンドを介して起こる。この現象は長い間、ヒツジ赤血球に対する抗体を産する
ヒト細胞の検出、ア・yセイ、および精製に用いられてきており、E−ロゼツト
試験における基礎をなすものである。これについては、Zaalbergによっ
て■鳳Lil:1231 (1964)に初めて記載された。CD2/LFA−
3相互作用もまた細胞溶解性標的接合(5havら、Nature 323:2
62−264 (1986)) 、および混合リンパ球反応(Martinら、
L−工m3□ lu:1110−185 (1983))を仲介することが示さ
れている。抗CD2モノクローナル抗体は、抗原非依存性の経路を介して直接的
に末梢Tリンパ球を活性化し得(Meuerら、!1L136:[197−90
6(1984)) 、CD2に対するより広い免疫的調節の役割を示している。
1928球が細胞媒介免疫の主たるエフェクターであり、そしてまたヘルパーあ
るいはサプレッサー細胞として免疫応答の調節に関わっているという2識により
、臨床免疫学が医学へ実際的に適用されることに太き(寄与するものとなった。
この適用の範囲には感染に対する防御、免疫感作による疾患の予防、臓器移植、
血液貯蔵、および免疫系の欠損および免疫学的な機構によ)て仲介される種々の
病気の治療が包含される。さらに、免疫学的な技法は、ホルモンおよび薬物の測
定に用いられるように、臨床検査室において、しばしば用いられる。臨床免疫学
は、例えば、Weirli集、■晟匝吐」Lムe ’me ta +uu ol
o ° Fo Vo uvaes: Vo use : A ’ati ns
o mmunolo ’ca M t ods ” wed ca Sc’e
c且、 4th Ed、、 Blackwell 5cientific Pu
blications、 0xford(19116)HBoguslaski
ら編集、C’n’ca m+loc m’st :’ c’ s Met od
a d ’cat’ ns、 Little、 Brown &Co、、 B
oston (1984); Holborowら編集、 mmu ’ M ’
cine: A Cow eensiv Gui etoCi tea 1m+
1uoo 、 2dEd、、 Grune & 5tratton、 Lond
on (1983):およびPetersd。
rfらm集、 a ’son’s ’eileso Int na Md’c’
、10th ed、、 McGrav−Hill、 New York出版、
pp、344−391 (19+13)に記載されている。明確には、免疫系を
媒介するタンパク質のより完全な理解は臨床免疫学において重要な宵月性がある
。
上述のような哺乳動物タンパク質をコードするcDNAを単離するために、哺乳
動物の発現ライブラリーを使用することは、いくつかの有利な点を提供する。例
えば、哺乳動物宿主細胞において発現するタンパク質はI!能的で、そしてあら
ゆる通常の翻訳後の改変を受ける。通常、細胞内膜系を介して細胞表面に輸送さ
れるタンパク質は、完全な輸送工程を経る。哺乳動物発現系はまた、細胞内輸送
機構および細胞表面タンパク質の膜への挿入および固定の機構に関する研究を可
能にする。
「CO幻細胞と呼ばれる、1つの一般的な哺乳動物宿主細胞は、サル腎臓細胞を
、シミアンウィルス株40(SV40)と称する変異ウィルスベクターで感染さ
せることによって形成される。
このベクターは、機能的な初期遺伝子および後期遺伝子を有するが、機能的複製
起点が欠如している。CO5細胞において、SV40?I製起点を含むベクター
でクローニングされたあらゆる外来DNAが複製されるが、これはSV40 T
抗原がCos細胞中に存在することによる。この外来DNAは一過性に、細胞D
NAとは独立してnI製する。
CO3細胞での発現によって単離された、最近のい(っかのリンホカインcDN
A (long、 G、G、ら、5cience 228:810−815 (
1985): Lee、F、ら、Proceed’n s o the Nat
ional Academ ofSciences USA 83:2061−
2065 (1986)+ Yokota、T、ら、ヒl」e ’n s of
the Nat’ona Ac de+n of 5ciences USA
83:5894−5898 (1986): Yang、 Y、ら、堕且47
:3−10 (19116))という例外はあるものの、一般には哺乳動物発現
ライブラリーからcDNAが単離されることはほとんどない。このことの主な原
因として次の2つが挙げられる:第1に、大きなプラスミドライブラリーの構築
のための現行の技法(Okayalla、 H,ら、靭上−貞Uニー」土(社)
−ス: 161−170 (19a2))は習得するのが困難なこと、そしてフ
ァージのクローニング技法によって得られるもの(Huynh、T、ら、 n+
DNACo1nVo、IAPactica r。
ash、 Glover、 D、M、 (ed)、 IRL Press、 0
xford (1985)、 pp、49−78)とライブラリーのサイズがほ
とんど一致しないこと。
第2に、1つの例外(long、 G、G、ら、5cience 7Lw:81
0−815 (1985))はあるものの、既存のベクターは、とりわけCO3
細胞中での高レベルの発現には適合しないことである。リンホカインcDNAで
の報告された成功例は、これらのcDNAの発現ライブラリーからの単離が特に
容易であるためであって、用いられる方法の一般的な適合性を意味するものでは
ない。リンホカインのパイオアフセイは非常に鋭敏であり((long、 G、
G、ら、鈴±a岨2JLi+810−815 (1985): Lee、F、ら
、Proceedin s oft t’ a Aeaea+ o Sc’en
ces US 83:2061−2065 (1985): Yokota、T
、ら、oceedin s of the Nat’ona AcademSc
’ n es US 83:51194−5898 (1986); Yang
、Y、ら、 江kl 47+ 3−10 (1986)) 、ソしrmRNAハ
典型的に、豊富で短い(long、G、 G、ら、紅オ瓜劇出:810−815
(1985); Lee、P、ら、ational Ac dem of 5
ciences USA 83:5894−5898 (1986);Yang
、Y ら、Ce1l 47:3−10 C1986>)。
従って、哺乳動物宿主における発現は以前は、より常習的なりローニング方法に
よって単離された遺伝子によってフードされるタンパク質の同定を確認する方法
としてのみ、最も頻繁に用いられてきた。例えば、5tuveら、J、 Vir
ol、 61工a:327−335 (1987)、は単純ヘルペスII型33
3株の糖タンパク質(gB2)の遺伝子を、受容能力を有するE、 coli
JMIOIを形質転換するのに用いるM13ベースの組換えファージベクターの
プラークハイブリダイゼーションによってクローニングした。このようにして単
離したクローンによってコードされるタンパク質の同定は、哺乳動物CO3およ
びチャイニーズハムスター卵巣(CIIO)細胞のトランスフェクションにより
確認した。
Oshimaらは、ヒト胎盤β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子について
ファージλgtll cDNAライブラリーをスクリーニングするためにプラー
クハイプリダイゼータ1ンを用いた。
Oshimaら、P oceedin s of the National
Academ o Sc’ences U、S、A、 84:685−689
(1987)。単離されたcDNAクローンの同定は、SV40後期プロモータ
ーを用いてクローニングされたインサートでCO5−7細胞をトランスフェクト
することによって発現するタンパク質の免疫沈降によって確認された。
哺乳動物細胞における一過性の発現は、他のスクリーニング法によって前もって
単離された遺伝子の同定を確認する方法として用いられてきた。Geraldら
、Journal of General VD1土榎「67:2fi95−2
703(1986)。Mackenzie、Journal of Biolo
teal Chemistr 26ユ:14112−14117 (1986
); 5eifら、Gene43:1111−1121 (1986); 0r
kinら、Mo1ecula and Ce1lular Bm且り璽銭仕ニア
62−767 (105)。これらの方法は、しばしば全長のあるいはオーバー
ラツプするクローンを同定するためには、非能率的で退屈で、モしてスクリーニ
ングを何度も繰り返す必要がある。従来の融合タンパク質の発現に基づいたスク
リーニング方法は、非能率的で、大量のモノクローナル抗体を必要とする。これ
らの欠点は、非能率的な発現ベクターの使用により倍加され、そのことがタンパ
ク質発現レベルを効率的な選択には不適当なものにしている。
及囲旦!且
本発明は、細胞表面抗原をコードするcDNAのクローニングのための有力な新
規な方法、効率の良い発現ベクター、特に真核宿主細胞における高いレベルの発
現に適したcDNAライブラリーを構築する方法、およびその単離されたヌクレ
オチド配列並びにそれらのコードされる産生物に関する。
本発明の高度に効率的なりローニング技法は、真核細胞における抗原の一過性の
発現、および培養皿のような抗体でコートされた基質への結合による、該抗原を
発現する細胞の物理的な選択に基づ(。本発明の方法は、発現され得そして真核
細胞の膜表面に輸送され得るあらゆるタンパク質の単離および分子クローニング
に有用である。
本発明の細胞表面抗原をコードするcDNAをクローニングする方法は、cDN
Aライブラリーを調製すること、このcDNAライブラリーを真核の哺乳動物、
好ましくは組織培養細胞に挿入すること、細胞表面抗原の発現を行わせる条件下
でこれらの細胞を培養すること、これらの細胞を細胞表面抗原−第1抗体複合体
の形成が行われるように細胞表面抗原に特異的な第1の抗体あるいは抗体群に曝
すこと、続いて、細胞表面抗原−第1抗体−箪2抗体複合体の形成を介して細胞
表面抗原を発現する細胞の基質への結合を生じさせるように第1抗体に特異的な
第2抗体でコートした基質に細胞を曝すこと、および結合細胞を結合していない
細胞から単離することを包含する。
本発明のクローニング方法によって、以下のような細胞表面抗原をコードする遺
伝子の単離および分子クローニングが達成された: CD1a、 CD1b、、
CD1c、 CD2、CD6、CD?、CD13、CDI4、CD16、CD1
9、CD20. CD22、CD26、CD27、CD211、CD31、CD
w32a、CDv32b% CD33、 CD34、 CD36、 CD37、
CD38、 CD39、 CD40、CD43、CD44、CD53、ICA
M、、、LFA−3、FcRIa、 FeRIb、 TLiSa、およびLeu
8抗原。本発明の方法によってクローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列が
決定され、それにコードされたタンパク質のアミノ酸配列が同定された。CD1
a、 CD1b、 CD1c。
CD2、CD6、CD?、CD13、CD14、CD16、CDI 9、CD2
0、CD22、CD26、CD27、CD28、CD31、CDv32a、 C
Dw32b%CD33、CD34、CD36、CD37、CD3g、CD39、
CD40、CD43、CD44、CD53、IcAM、 LFA−3、FcRI
a、 FcRIb、 TLiSa、およびLeuflをコードするようなりロー
ニングされた遺伝子もまた本発明の目的である。
一旦抗原をコードする遺伝子が本発明の方法に従ってクローニングされると、そ
の遺伝子は原核細胞あるいは真核細胞宿主において発現され得、天然には存在し
ないような実質的に純粋な形態でそれにコードされたタンパク質あるいはその一
部分を産生ずる。本発明の別の局面は、実質的に純粋な細胞表面抗原、とりわけ
: CD1a、 CD1b、、CD1c、 CD2、CD7、CD14、CD1
6、CDl9、CD20、CD22、CD27、CD2g、CDv32aSCD
v32b%CD33、CD34、CD36、CD37、CD3g、CD40、C
D44、CD53、ICAM、 LFA−3、FcRla、 FeRIb、 T
LiSa、およびLeu8抗原およびそれらの機能性アナログおよび同等物に関
する。CD1a、 CD1b、 CD1c。
CD2、CD6、CD?、CD13、CD14、CD16、CD19、CD20
、CD22、CD26、 CD27、 CD2g、 CD31、 CDv32a
、CDw32b、CD33、 CD34、 CD36、CD37、CD3g、C
D39、CD40. CD43、CD44、CD53、ICAM、 LFA−3
、FcRIa%FcR1b、 TLiSa、およびLeu8抗原の一次アミノ酸
配列が決定されている。従って本発明はまた、これらの抗原およびそれらの機能
的同等物のアミノ酸配列、およびこれらの抗原をコードするヌクレオチド配列に
も関する。
本発明はまた、非常に大きな哺乳動物発現ライブラリーを発生させ、モして哺乳
動物宿主細胞において多量のタンパク質を産し、その結果として効率的な選択を
行わせる、非常に効率的なcDNA発現ベクターにも関する。本発明の特定の実
施態様においては、cDNA発現ベクターは、サプレッサーt RNA遺伝子;
SV40起点: HIV LTRノー60から+80位の配列に融合シタヒト
サイトメガロウィルスAD169の即時型エンハンサ−配列で構成されるキメラ
プロモーターをサブレ1サーtRNA遺伝子とSV40オリジンとの間に挿入し
て含有する合成転写単位;置換可能なりNA配列によって隔てられ、モしてXb
a1部位に隣接する2つのBstXI部位を含有するポリリンカー;およびSV
40スモール1抗原スプライス並びに初期領域ポリアデニル化シグナルを含む。
本発明のさらなる局面は、HIvLTRの一60位から+80位の配列に融合し
たヒトサイトメガロウィルスAD169即時型エンハンサ−配列で構成されるキ
メラプロモーターを含むcDNA発現ベクターに用いられる合成転写ユニットを
包含する。本発明のcDNA発現ベクターの配列の小さなサイズでかつ特定の調
節は、CO3細胞のような宿主哺乳動物組織培養細胞における高度に効率的な複
製を可能とさせる。さらにこのベクターは、短い置換可能なりNA上セグメント
よって隔てられた2つの逆配向の■tX1部位を含むポリリンカーを使用するこ
とにより、非常に効率的なオリゴヌクレオチドベースのcDNA挿入戦略の使用
を可能にする。
他の局面においては、本発明は他方に対し互いに逆向きの配向の2つの同一の…
X1部位を含有するベクターを包含し、このBstX1部位は短い置換可能なり
NAフラグメントにより隔てられる。本発明の他の局面は上述のポリリンカーで
ある。
本発明のさらなる局面は、合成りNAオリゴヌクレオチドをベクターに挿入する
ことが所望されるcDNAに連結すること、この合成オリゴヌクレオチドに本発
明のポリリンカーの短い置換可能なりNAフラグメントと同一の末端配列を与え
ること、および得られた合成りNAオリゴヌクレオチド末端配列を有するCDN
Aセグメントを、予めこのベクターから短い置換可能なりNAフラグメントが取
り除かれているベクターのポリリンカーに挿入することを包含する、オリゴヌク
レオチドベースのcDNA挿入法に関する。
本発明に従ってcDNAライブラリーを調製する際に、多くの腫瘍にマクロファ
ージおよびリンパ球が深く侵入しており、従って、この腫瘍を一般に用いられて
いる腫瘍細胞系の代わりにマクロファージあるいはリンパ球の効果的な転写のソ
ースとして効果的に用い得ることが発見された。従って他の局面では、本発明は
、本発明の方法によって使用するcDNAライブラリーを調製するための腫瘍細
胞、とりわけヒト腫瘍細胞に関する。
本発明の強力な選択系の他の宵利な点は、cDNAの挿入に際し方向を決める必
要が無いことである。本発明の方法により、λgtlQおよびλgtllのよう
なファージベクターについて記載されているのと同様のライブラリー構築効率が
得られ、しかも本発明の方法に従って得られるクローンの複製が容易であるとい
うさらなる利点がある。
本発明の免疫選択技法は、モノクローナルあるいはポリクローナルでもあり得る
抗体の、比較的少ない絶対量での効率的な使用を可能にする。本発明の方法は極
めて迅速である。
一般に、標的のc DNAクローンを単離するために、3回ある(1はツレより
少ない免疫選択と開放とのサイクルが必要テする。
従って、本発明の方法は、細胞表面抗原をコードする遺伝子をクローニングする
ときに労力と材料の効率的な利用を可能にする。上述したように、この方法は、
哺乳動物Tリンパ球に関連する細胞表面抗原(例えば、CD1a、 CD1b、
CD1c、 CD2、CD6、CD?、CD13、CDI4、CD16、CD
19、CD20、CD22、CD26、CD27、CD2[1,CD31、CD
w32a、 CDw32b%CD33、CD34、CD36、CD37、CD3
8、CD39、CD40.、CD43、CD44、CD53、ICAM、 LF
A−3、Fc[ila。
FcRIb、 TLrSa、およびI、eu8抗原)をコードする遺伝子を首尾
よくクローニングする方法として用いられる。
本発明の精製された遺伝子およびタンパク質は免疫学的診断および免疫学的治療
の適用に有用であり、これらには、ヒトを含む動物における免疫に媒介された感
染、疾患、異常の診断および治療が包含される。これらはまた、他の抗体および
抗原を同定し、単離し、精製するために用いられ得る。このような診断的および
治療的な使用は、本発明の他の局面を包含する。さらに本発明の実質的に純粋な
タンパク質は、治療的な投与のための薬剤あるいは薬学的組成物として調製され
得る。本発明はさらにこのような薬剤および組成物に関する。
区」しυW胆
図1. ベクター013のヌクレオチド 1ヌクレオチド番号1−589はpM
B l起点由来であり(pBR322ori)、ヌクレオチド番号590−59
7は5acl+リンカ−由来であり(ACCGCGT)、ヌクレオチド番号59
8−799は合成チロシンサプレッサー tRNA遺伝子由来であり(supF
遺伝子)、ヌクレオチド番号800−947はASW LTRフラグメントの残
りの部分由来であり(PvullからMlul) 、ヌクレオチド番号948−
1500はヒトサイトメガロウィルスAD169エンハンサ−由来であり、ヌク
レオチド番号1501−1650はFilvTATAおよびtat応答エレメン
ト由来であり、ヌクレオチド番号1551−1716はpiLNXANポリリン
カー由来であり(U!!! I I IからXba) 、Xクレオチド番号17
17−2569はpsVからスプライスおよびポリー付加シグナル由来であり、
ヌクレオチI’2570−2917はSV40複製起点由来でありQ511か叡
り図目■)、およびヌクレオチド番号2911!−2922は、ポリリンカー由
来のR1部位の残りの部分であるpiVX由来である。
図2. CD2cDNインサートのヌクレオチド 1ヌクレオチド番号を右側括
弧内に、アミノ酸番号を左側に示している。アスパラギン結合炭化水素(CHO
)が付加する潜在部位の位置および推定のトランスメンブレン(TM)配列が示
されている。アミノ酸配列については、分泌シグナル配列の推定開裂部位から番
号をつけている。
図3. DM8 ベタ −の
CDMIIベクターは、マウスおよびサル細胞の両方における効率の高い発現の
ために選択された変異体ポリオーマウィルスの初期領域の欠失変異体を含む。実
質的にすべてのヒト免疫不全プロモーター領域がヒトサイトメガロウィルスの即
時型プロモーターの同族配列により、および真核のプロモーターとcDNA挿入
部位との間でのバクテリオファージエフプロモーターの挿入により置換される。
矢印は転写の方向を示す。
図5. 1に3Mベクターの ′
転写の方向は矢印で示される。Bs tX Iクローニング部位をはさむ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を示す。
図6.pjH3Mベクターのヌクレオチド I7つのセグメントが存在する。1
−587残基はpBR322複製起点由来であり、588−1182はML3起
点由来、11113−13114は5upF遺伝子由来、1385−2238は
キメラサイトメガロウィルス/ヒト免疫不全ウィルスプロモーター由来、223
9−2647は置換可能なフラグメント由来、264g−3547はプラスミド
pSV2 (スプライスおよびポリアデニル化シグナル)由来、および3541
1−3900はSV40ウィルス起点由来である。
図17.CD40のヌクレオチド 1
1豆ユ1史屋X里
本発明は細胞表面抗原をコードするcDNAをクローニングする新規な方法、お
よびcDNAを構築する方法に関する。本発明はまた特定のcDNA発現ベクタ
ーおよびベクターの構成成分、この方法によって単離されたヌクレオチド配列あ
るいは遺伝子、そのcDNAセグメントにコードされた実質的に純粋な細胞表面
抗原および単離されたヌクレオチド配列およびコードされた産生物を用いる方法
に関する。
以下の記載において、参照される種々の方法は、組み換え遺伝子工学の当該分野
には周知である。刊行物および他の参照される周知の方法において示される材料
はその全体がここに参考として援用されている。一般的な組換えDNA技法を記
述する標準的な参考文献として、I)arnell、 J、ε、ら、初お目■肛
Ce1l Biolo 、5cientific American Book
s、Inc、出版、 Nev York、 N、Y、(1986); Levi
n、 B、M、、 L坦し■、John Wiley& 5ons出版New
York、 N、Y、(1985): Old、R,W、ら、なn亘les o
f Gene Mani ulation: An l t oductio
to Genet’cbLヨ狙■u、2d edition、 Univers
ity of Ca1ifornia Press、 Berkeley、CA
(191111); およびManfatfs、 T、ら、Ln剋ムr C1
onin : Laborator Manual、 Co1d Spring
Flarbor、 NY(1982)が挙げられる。
用語「クローニング」は、特定の遺伝子あるいは他のDNA配列をベクター分子
内に挿入する、インビトロでの組換え技法の使用を意味する。所望の遺伝子のク
ローニングを成功させるために、DffAフラグメントを得る方法、その7ラグ
メントをベクター分子に結合させる方法、その混成りNA分子を、DNAが複製
できる宿主細胞に導入する方法、および受け入れ宿主細胞の中から標的遺伝子を
有するクローンを選択する方法を使用することが必要である。
用語rcDNAJは、RNA依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)の作用に
よってRNAm型から生産された相補的DNAあるいはコ+:’ −DNAを意
味する。従ってr cDNAクローン」は、目的のRNA分子に相補的で、クロ
ーニングベクター内に保持される二重らせんのDNA配列を意味する。
用4 r cDNAライブラリー」は、一つの生物の全遺伝子を−そろいcDN
A挿入物として含む組換えDNA分子の集合体を意味する。このようなcDNA
ライブラリーは、当該分野で認識された方法、例えば、上記Maniatisら
のMo1ecula C1onin : A Lab匹」1幻l−淘り且11に
記載の方法によって調製し得る。一般に、まず、特定の遺伝子をクローニングす
ることが所望されるゲノムを有する生物の細胞からRNAが単離される。本発明
の目的としては好ましくは哺乳動物、特にヒトの細胞株である。さらに好ましく
はヒト膿瘍細胞株HPB−ALLおよびヒトリンパ芽球細胞株JYである。ある
いは、RNAは動物の膿瘍由来の腫瘍細胞から単離され得、そして好ましくはヒ
ト腫瘍から単離される。
従ってライブラリーは、例えばヒト副腎膿瘍から調製され得るが、任意の腫瘍が
使用し得る。
本発明の免疫選択クローニング方法は、細胞から特定の遺伝子を含む全RNAを
抽出することによりcDNAライブラリーを調製すること、そのRNAから相捕
的な一連の二重鎖cDNAフラグメントを合成すること、およびこれらのeDN
Aフラグメントを組織培養中の哺乳動物細胞に導入することを包含する。哺乳動
物細胞は、タンパク質(すなわち、細胞表面抗原)の発現を可能にする条件下で
維持される。得られた細胞を細胞表面抗原に特異的な第1抗体あるいは抗体のプ
ール(グループ)に曝す。これにより、細胞表面抗原−第1抗体複合体が形成さ
れる。
この複合体を、第1抗体に特異的な第2抗体でコートされたあるいは結合した基
質に曝す。細胞表面抗原を発現する細胞は基質に結合する(細胞表面抗原−第1
抗体−第2抗体の複合体が起こるため)。結合している細胞を結合していない細
胞から分離する。
k」人へ1風
総RNAの単離にはチオシアン酸グアニジン/CsC1法が好ましい。さらに好
ましくは、GuSCN/ CsC1法の変法のチオシアン酸グアニジン/LiC
1法であり、こちらの方が処理能力、速さにおいて優れている。簡単に述べると
、所望の混合物1mlに対して、25%のLiC1(0,45ミクロンのフィル
ターで濾過したものを保存)0.58■lに溶解した0、5gのGuSCNおよ
び20μlのメルカプトエタノールを加える。細胞を遠心し、ペレットを振動(
フリッキング)によって壁土に分散し% 5 x 107までの細胞に対し1s
lの溶液を加える。得られた混合物をポリトロンによって粘稠性がなくなるまで
剪断する。小さな規模の試料(108細胞以下)に対し、1.5slの5.7M
CsC1(RNアーゼを含まない;pH8,1hM EDTA各1slに対し
1.26gのCsC1を加える)上に剪断混合物2mlを層にし、RNアーゼを
含まない水を重層し、5w5sを50k rpmで2時間遠心する。大きな規模
の試料に対しては、5W28チユーブ中の12m1のCsC1上に25i1を層
にし、24k rpmで8時間遠心する。内容物を減圧フラスコにつないだ滅菌
したパスツールピペットを用いて注意深く吸引する。一旦CsC1界面を通り越
したら、ピペットの先でチューブの周りのバンドをかき集め、チューブの壁土の
層が落ちるのを防ぐ。残ったCsC1溶液を吸引する。ペレットを水中に取る(
再溶解しないようにする)。1/10容量のNa0Acおよび3容量のEtOH
を加え、得られた混合物を遠心する。必要であれば、ペレットを水中に再懸濁す
る(例えば70°で)。濃度を1mg/mlに調整し、凍結する。小さなRNA
(例えば5S)は落ちない。少量の細胞に対しては容量を小さくし、グラジェ
ント上でGuSCNにRNアーゼを含まない水を重層する(沈降はRNAを希釈
するとき能率が悪い)。
二二r1佳へ鳳I
次に、ポリA“RNAは、好ましくはオリゴdT選択法によって調製し得る。簡
単に述べると、使い捨てのポリプロピレンカラムを5MのNaOHで洗浄し、そ
して次にRNアーゼを含まない水ですすぐことによって調製する。各1mgの全
RNAに対し約0.3slのオリゴdTセルロース(最終的にベッドをパ・ツク
する)を使用する。オリゴdTセルロースを1slの0.IM NaOH中に約
0.5slの乾燥粉末を再懸濁してカラム内に移すか、あるい以前に使用したカ
ラムにO,IN NaOHを浸透させて調製する(カラムは何回も再利用できる
)。これをカラム容量の数倍のRNアーゼを含まない水で、pFIが中性になる
まで洗浄し、2−3slのローディングバッファーですすぐ。次にカラムベッド
を取り除き、4−6m1のローディングバッファーを用いて、滅菌したlSm1
のチューブに入れる。全RNAを2−3分間70℃に加温し、RNアーゼを含ま
ないストックからLiC1を0.5Mまで加え、15m1チユーブ中でオリゴd
Tセルロースと結合させる。次に10分間渦状に混合するか攪拌する。生成物を
カラムに注ぎ入れ、3slのローディングバッファーおよび続いて31の中間洗
浄バッファーで洗浄する。
a+RNAを1.5slの2mM EDTA、 0.1%SDSを用いて、sw
s sチューブに直接溶出する。最初の2〜3滴は捨てる。
溶出したmRNAを1/10容量の3M Na0Acを加えることによって沈降
させ、EtOHでチューブ満たす。次にこれを混合し、30分間−20℃で冷却
し、50k 1mで5°Cにて30分間遠心する。EtOHを注ぎ出して、チュ
ーブを風乾する。mRNAペレットを5O−100ulのRNアーゼを含まない
水に再懸濁する。約5ulを70℃でMOPS/EDTA/ホルムアルデヒドに
溶解し、品質をチェックするためにRNアーゼを含まない1%アガロースゲル上
で泳動させる。
Q…皇底
次にcDNAを合成する。cDNA合成の好ましい方法はGub lerおよび
Hoffman (蝕皿、 LL:263−269 (1982))に記載の方
法の変法である。この方法は以下のように行われる:a。第1鎖。4ugの+*
RNAをマイクロッエージチューブに入れ、30秒間約100℃に加熱し、氷上
で冷却する。RNアーゼを含まない水で容量を70ulに調整する。以下のもの
を加える: 20ulのRTIバッファー、2ulのRNアーゼインヒビター(
Boehringar 36u/ul)、lulの5ug/ulのオリゴdT(
Collaborative Re5earch)、’1.5ulの20mM
dXTP’s(超純粋)、lulのLM DTT、および4ulのRT−LX(
Life 5cience、 24 u/ul)。得られた混合物を42℃で4
0分間インキコベートする。加熱して不活性化する(70℃で10分間)。
b、第2鎖。320ulのRNアーゼを含まない水、80ulのRT2バ’tフ
ァー、5ulのDNAポリメラーゼ l(Boehringer、5 U/ul
)、2u1のRNアーゼH(BRL 2 u/ul)。15℃で1時間インキュ
ベートし、22℃で1時間インキュベートする。 20ulの0.5M EDT
A、 pi(a、oを加えフェノール抽出し、0.5MまでNaC1を加えるこ
とによってEtOH沈降させ、直鎖のポリアクリルアミド(キャリア)を20%
g/mlまで加え、チューブをEtOHで満たす。マイクロッエージチューブ中
で2−3分間遠心し、取り出し、沈降がチューブの壁の高くまで上がるように渦
状に攪拌し、さらに1分間遠心する。
C,アダプター。沈降したcDNAを240ulのTE(10/1)中に再懸濁
する。30ulの10x低塩バツフアー、30ulの10X低塩バツフアー、3
0ulのIOX結合反応付加物、3ul(2,4■g)のキナーゼ処理12−m
arアダプター、2ul(1,6■g)の牛ナーゼ処理8−marアダプター、
および1u177)T4 DNAリガーゼ(BioLabs、 400u/ul
、あるいはBoehringer、 I Weiss unit/ml)を加え
る。 15°Cで一晩インキュベートする。上記のようにフェノール抽出し、E
tOH沈降させ(今回は余分なキャリアは不要である) 、100ulのTE中
に再懸濁させる。
ベク −におけるcDNAフラグメントの本発明の1iix1ベースのcDNA
発現ベクター(下記参照)とともに使用するために、ベクター上のBs tX
1部位に相当する末端配列を有するオリゴヌクレオチドのセグメントを、挿入を
所望するcDNAフラグメントに連結させる。得られたフラグメントを分画して
プールする。好ましい方法は、以下のようにして行う:
20%KOA、 2mM EDTA、lug/mlのl:thBr溶液、および
5%KOAc。
2mM EDTA、 tug/ml EthBr溶液を調製する。2. f+s
lの20%にOAc溶液を小さなグラジェントマーカーのバックチャンバーに加
える。2つのチャンバーを結合させているチューブから、溶液を前方のチャンバ
ーに流入させ、後ろに傾けることによって気泡を取り除く。チャンバー間の通路
を閉じ、2.5mlの5%溶液を前方のチャンバーに加える。もし前回の遠心に
よってチューブ内に液体が残っていたら、5%溶液をチューブの端まで流し、そ
の後チャンバーにもどす。装置を攪拌板の上に置き、かき混ぜ棒が可能な限り速
く動くようにセットし、2つのチャンバーをつないでいるストップコックを開き
、次に前方のストップコックを開く。ポリアロマ−5vssチユーブをKOAc
溶液で底から満たす。グラジェントに100μlのcDNA溶液を重層する。バ
ランスチューブを準備しグラジェントを22℃で3時間50k rpyaで遠心
する。グラジェントから画分を回収するために、5W55チユーブの底の近くに
バタフライ注入セットを用いて穴をあけ(1uer bubは取り外しておく)
、3つの0.5!II画分、次に6つの0.25m1画分をマイクロフニージチ
ューブ内に集める(それぞれ約2z滴および11滴)。線状のポリアクリルアミ
ドを20μg/mlまで加えそしてチューブを上端までEtOHで満たすことに
より分画をEtOH沈降させる。チューブを冷却した後、マイクロッ二−ジで3
分間遠心する。攪拌し1分間再遠心する。
ペレットを70%EtOHですすぐ(再遠心する)。完全には乾燥させない。各
0.25m1II分を10μmのTE中に再懸濁する。1%アガロースミニゲル
上で1 ulを流す。最初の3画分とlkbより小さないかなる物質をも含まな
い最後の6画分をプールする。
サプレッサーt RNAプラスミドは既知の方法によって増殖させ得る。本発明
による好適な方法においては、5upl”プラスミドは第2のプラスミドである
p3を含む非サブレッシング宿主中で選択され、このp3はアンバー突然変異し
た、アンピシリンおよびテトラサイクリン薬剤耐性エレメント(Seed、 1
983)を含む。p3プラスミドはPRI由来であり、57kbの長さを有し安
定して維持されるノングルコビーのエビソームである。このプラスミドのアンピ
シリン耐性は高率で機能を失うので、amp’プラスミドは通常p3含有株中で
は使用し得ない。teuW性のみに対する選択でも、amp+ tet耐性に対
する選択と同様に良好である。しかしながら、自然発生する染色体サプレッサー
t RNAの突然変異は、この系において避は難いバックグラウンド(約10−
9の頻111i:)を呈示する。自然発生的なサプレッサー突然変異から生じる
コロニーは通常プラスミド形質転換から生じるコロニーよりも大きい。サプレッ
サープラスミドは典型的に12.5kg/mlのampおよび?、 51t g
/mlのtetを含むLB培地中で選択される。大きなプラスミド調製物に対し
ては、グリセロール(08%)を含むM9カサミノ酸培地が炭素源として用いら
れ得、細菌が飽和状態まで増殖する。
ベクターDNAは既知の方法で単離し得る。以下に示す方法は1リツターの飽和
細胞から得たプラスミドに好適である。
lワ/ターのJ6瓶に入れた細胞を、4.2k rpraで25分間遠心する。
pH8の40m1の101II101II中に再懸濁する(柔らかい表面をたた
()。1lhlのQ、2M NaOH,1%SDSを加え、透明で粘稠になるま
で渦状に攪拌するa 40m1の5M KOAc、 pH4,7(2,5M K
OAc、2.5M HOAc)を加え、やや勢いよく振盪する(塊が2−3■の
大きさになるまで)。(同じ容器で) 4.2k rpmで5分間遠心する。
上清を荒巨薄地の綿布を通して250m1の瓶に注ぐ。瓶をイソプロピルアルコ
ールで満たす。J6瓶を4.2k rpmで5分間遠心する。
瓶から水分を流出させ、70%EtOHで穏やかにすすぐ(ペレットが7ラグメ
ント化するのを避ける)。瓶を逆さにして、キムワイブで残ったEtOHを除去
する。3.5mlのTris塩基/ EDTA2Qd/10mM中に再懸濁する
。3.75m1の再懸濁ペレットをCsC14,5gに加える。0.75m1の
10mg/+1臭化エチジウムを加えて混合する。VTfllOチューブを溶液
で満たす。80rprxの速度で2.5時間以上遠心する。ll1lのシリンジ
および20ゲージ以下の針を用いて可視光でモニターしてバンドを抽出する。チ
ューブの先端を切り、バンドの約3+am下方で針の斜面を上にしてチューブに
対して約30’の角度で針を上向きに挿入する(即ち、できるだけ浅く)。バン
ドを取り除いた後、チューブの内容物を漂白剤に注ぎ入れる。抽出したバンドを
13slの5arsteatチユーブに入れる。チューブの上までIM NaC
1飽和n−ブタノールで満たし、抽出する。もし非常に大量のDNAが得られた
ら再抽出する。ブタノールを5M NaOHを含むトラップ内に吸引する(エチ
ジウムを分解するため)。DNAにほぼ等容量の1M酢酸アンモニウムを加える
(スカート瓶)。約2容量の95%エタノールを加える(スカート瓶)。IOK
rpmで5分間、J2−21で遠心する。ぺレットを注意2<70%エタノー
ルですすぐ。綿棒あるいは凍結乾燥器を用いて乾燥させる。
クローニングに用いるベクターは既知の方法で調製し得る。
好ましい方法では、まず20Mgのベクターを200μlの反応溶液中で100
ユニツトのBstXI CNew York Biolabs)で切断し、十分
に温度制御された水浴(即ち、循環水浴)中で1晩50℃で切断する。上述の5
W55チユーブ中に2つのKOAc 5−20%の濃度勾配を:luする。各チ
ューブに100μmの消化されたベクターを加え、22℃で3時間50K rp
mで遠心する。300nmのUV光の下でチューブを試験する。所望のバンドは
チューブの273の長さ分移動り、ている。バンドが前方に引きずっているのは
グラジェントが過負荷状態であることを意味している。1mlのシリンジおよび
20ゲージの針を用いてバンドを取り除く。直鎖のポリアクリルアミドを加え3
容量のEtOHを加えることによってプラスミドを沈降させる。50μlのTE
中に再懸濁させる。一定量のベクターおよび増加する量のc DNAを用いて連
結反応を行わせる。
これらの試験的連結反応を基に大きな規模の連結反応を既知の方法で開始する。
通常は全cDNAm製物に対し、1−2Mgの切断されたベクターが必要である
。
アダプターは既知の方法で調製され得るが、粗製アダプターを1Mg/μlの濃
度に再懸濁し、Mg5Oaを1hMまで加え、5容量のE tol(を加えるこ
とによって沈降させることが好ましい。
70%EtOHですすぎ、TE中に1Mg/μlの濃度で再懸濁する。キナーゼ
処理に対しては、25μmの再懸濁アダプターを取り、3μlのIOXキナーゼ
処理用バッファーおよび20ユニツトのキナーゼを加え、37℃で1晩インキユ
ベートする。
本発明による上記の好ましい方法におけるバッファーの調製は当業者には明らか
である。簡便のために好適なバッファー組成を以下に示す:
ローディングバッファ一: 0.5M LiC1,10mM )リスpH7,5
,1mM EDTA 0.1%SDS。
中間洗浄バッファー: 0.15M LiC1,1011MトリスpH7,5、
IIIM EDTA 0.1%SDS。
Rtlバッファー: 0.25M トリス pH11,8(42℃で8.2)、
0.25MMCl、 30mM MgCh、
Rt2バッフy :0.IM)リスp■7.5.25mM MgCl2.0.5
MKCl、 0.25mg/it BSA、 50mM DTT。
taX低塩:6011M011MトリスルS、60mM MgCl2.50a+
M NaC1,25mg/ml BSA、 ?hM Me。
iox連結付加物:1mM ATP、 20+*M DTT、 1mg/ml
BSA、 10mMスペルミジン、
10Xキナーゼ処理用ハツ7y :0.5M )リスpH7,5,10mMAT
P、 20mM DTT、 1hMスペルミジン、1mg/ml BSA 10
0鵬M MgC+2゜
(以下余白)
用語「ベクター」は、プラスミドあるいはバクテリオファージ由来で、その中に
DIiAフラグメントが挿入されるか、あるいはクローニングされ得るDNA分
子を意味する。1個のベクターは1以上の固有の制限部位を含有し、クローニン
グした配列が再生産されるような限定された宿主あるいはビークル生物中で自律
的に復製し得る。従って、用語rDNA発現ベクター」は、自律性のエレメント
のゲノムに付加的なりNA配列が組み込まれた後に宿主中で宿主の染色体とは独
立に複製し得る、あらゆる自律性のエレメントを意味する。そのようなりNA発
現ベクターには、最近のプラスミドおよびファージが含まれる。
しかしながら、本発明の目的のために好ましいのは、シミアンウィルス株40(
SV40)由来のベクターのようなウィルスベクターである。SV40は28M
dalの分子量を有するパボーバウイルスで、3Mdalの分子量を有する環状
の2本鎖DNAを含有しており、このDNAはウィルスのすべてのゲノムを含ん
でいる。この1本鎖の小さな共有結合によって閉環している環状DNA分子の全
ヌクレオチド配列は決定されている。Fjersら、Nature 273:1
13−120 (1978)+ Reddyら、5cience 200:49
4−502 (1978)。
SV40のウィルス性DNAは大量に得られ、種々のウィルス性機能に関連する
ゲノム領域は、このDNAの詳細な物理的マツプどおりに正確に位置している。
前述のFiersら、Redd yら。SV40のウィルスゲノムは無性的に増
殖しながら、あるいは細胞染色体の不可欠部分として増殖し、ゲノムの復製と発
現により豊富な情報が存在する。
また本発明の目的にとって好ましいのは、M2Sと称する1本鎖のバクテリオフ
ァージクローニングビークルである。このM2Sは約6.5kbの閉環DNAゲ
ノムを有する。M2Sをクローニングビークルとして用いることの1つの利点は
、感染細胞から放出されるファージ粒子がクローニングされたDNAの相補的2
本鎖の1方のみに相同な1本鎖DNAを含有することであり、そのことによって
DNA配列決定分析の鋳型として用い得る。
本発明の目的にとってさらにより好ましいのは、pil13、piH3M、およ
びCDM8と称する発現ベクターであり、これらはアメリカンタイプカルチャー
コレクシテン(ATCC)、12301 f’arklavn Drive、
Rockville、 MD208S2に寄託されているO I)iH3はAT
CCに1988年2月24日に寄託され、受託番号はATCC67634である
。
piH3MはATCCに1988年2月24日に寄託され、受託番号はATCC
67633である。CDM8はATCCに1988年2月24日に寄託され、受
託番号はATCC67635である。
用語「組織培養」は、細胞構造あるいは機能あるいはその両方のさらなる分化お
よび保存を可能にするための、インビトロでの動物組繊細胞の維持あるいは成長
を意味する。「1次組繊細胞」とは、1つの生物において同一の機能を行う同種
の細胞からなるポビニレーションから直接に採られた細胞である。例えば、この
ような組繊細胞をタンパク質分解酵素であるトリプシンで処理し、個々の1次組
繊細胞に分離し、高密度で培養皿に蒔くとよく成長する。組織培養中の1次細胞
の増殖から生じる細胞培養は、「2次細胞培養」と称される。はとんどの2次細
胞は有限的に倍数に***し、そして死ぬ。しかしながら、わずかな2次細胞がこ
の「危機期間」を通過し得、この後無限に増殖することが可能になり、連続的な
「細胞系」を形成する。細胞系は多くの場合余分の染色体を含み、通常は他の点
についても異常である。これらの細胞が永代的であることは癌細胞と共通した特
徴である。
本発明による組織培養細胞として用いるのに好適な細胞系には、rcOsJと称
されるサル腎臓細胞系が含まれる。cos細胞は、機能的初期遺伝子領域を含む
が、ウィルスDNAm製起点を欠< SV40 DNAによって形質転換された
細胞である。cos細胞クロりンM6は、本発明の方法に使用するのに特に好適
である。
マウスrfOPJ細胞もまた本発明の目的に好適であり、この細胞はポリオーマ
起点欠失DNAでトランスフェクトされたNIH3T3細胞である。cDNAは
本発明の宿主組織培養細胞に、当業者に既知の任意の方法で導入される。トラン
スフェクシヨンは、例えばプロトプラスト融合、スフェロプラスト融合、あるい
はDEAEデキストラン方法によって行われ得る( Sussmanら、Ω杜L
」■Li:1641−1643 (1984))。
スフェロプラスト融合を行う場合は、1つの好適な方法は、5andri−Go
ldrinら、Mo1. Cel 旧o、 lニア43−752 (1981)
に基づく以下の変形法である。闇単に述べれば、例えば、6個の融合体からなる
1組を得るには、ブロス中の細胞10hlを必要とする。増幅可能なプラスミド
を含有する細胞をLB中OD 600=05に増殖させる。スペクチノマインン
をtoo ug/+11まで添加スる(またはクロラムフェニコールを150
ug/mlまで添加する)。
37℃で振盪しながらto−ts時間インキ二ベーシ1ンを続ける。
(細胞はスペクチ/マイシンまたはクロラムフェニコール培地でインキユベーシ
ョンを長く続けると溶解を始める。)培養物100+alを10.OOOrpm
で5分間、遠心分離して沈澱させる(JA14/GSAロータ、250m1ボト
ル)。十分に排水して、ペレットを5mlの冷たい20%スクロース、50mM
トリス−[ICL pFIB、0を含有するボトル内で再懸濁させる。氷上で5
分間インキュベートする。2*1の冷たい0.25M EDTA pFIB、0
を添加し、37℃で5分間インキュベート(水浴)する。氷上に置き、顕微鏡に
よりスフェロプラストへの転換率を調べる。フローフード内で、20■lの冷た
いDME/ 10%スクロース/ IQmM MgChを徐々に添加する(滴下
、1秒間に約2滴)。6cm皿に前日プレートした細胞かう培地を除去するC5
0%コンフルエンス)、5mlのスフェロプラスト懸濁液を各国に添加する。皿
を拭動するパケット遠心機内の管状搬体の先端部に置く。一度に6皿までの調製
が可能である。皿は互いの上に積み重ね得るが、3段重ねは、最上部の皿のスフ
ェロプラスト層が遠心分離の後に破裂または分離することが多いため推められな
い。1100Oxで10分間遠心分離する。力は底プレートまでの回転半径に基
づいて計夏する。皿から液を慎重に吸引するa 1.5−2m1の50%(w/
v) PEG 1450(またはPEG 1000) 150%DME (血清
なし)を皿のまん中にピペットで移す。必要であれば、PEGが皿全体にわたっ
て均一におよび放射状に確実に広がるようにピペットの先端部を周囲に回しなが
ら移す。PEGを最後の皿に添加した後、すべての皿を各々の蓋の上に立てかけ
て、PEG溶液が底に集まるようにする。PEGを吸引する。融合を促進するに
は、細胞上に残留するPEGの薄層で十分である。残留層は洗い流すのが間車で
あり、またPEGの塊りが後に残る場合より、細胞の生存能力が向上し得る。P
EG溶液との接触後90秒から120秒(PE01000)または120秒から
150秒(PE01450)で、1.5i1のDME (血清なし)を皿の中央
部にピペットで移す。PEG層はDMHにより放射状に押し流される。皿を傾け
て吸引する。DME洗浄を繰り返す。15Mg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含
有する3mlのDME/ 10%血清を添加する。インキュベーター内で4−6
時間インキュベートする。
培地および残留する細菌懸濁物を除去し、さらに培地を添加して、2−3日イン
キュベートする。PEGを除去するために細胞層を洗浄しすぎると、細胞の多く
を除去するため実質的な効果が得られないことが多い。2回目のDME洗浄で細
胞を数分間放置すると、スフェロプラスト層のほとんどが自然に現れてくる。し
かし、蘭単に洗浄して、37゛Cで完全培地にて層を引き離すのが好適である。
PEG溶液は、好適には、60℃で新しいボトルのPEGを溶解させ、50m1
の遠心分離管により約50a+1分量を予め重量を測定したボトルに注ぐことに
より調製され得る。この分量されたPEGを暗室で5℃で保存する。新しいボト
ルの作製は、該分量の重量を測定し、再溶融し、同量のDME (血清なし)を
添加する。
必要であれば、75%Na炭酸水素ナトリウム溶液によりpHを調整し、濾過滅
菌する。得られるPEG溶液は認められるような有害な結果をもたらすことなく
、室昌で3ケ月まで保存し得る。
cDNAクローンによりコードされるタンパク質を発現させ、後の免疫選択にお
いて利用し得る細胞の絶対数を増やすために、トランスフェクトされた宿主細胞
を本発明により培養し得る。この目的のための適切な方法および培地については
、細胞の型およびその他の通常考慮される変数を考慮すれば、当業者には周知で
ある。例えば、CO3細胞は、10%仔ウシ血清および硫酸ゲンタマイシンによ
り補充されるダルベツコの改変イーグル培地(DME)で培養され得る。トラン
スフェクトされた細胞の一過的発現は、通常は、48時間から72時間のポスト
トランスフェクションの間に予想され得る。しかし、当業者に明らかなように、
この期間は使用する宿主細胞の型または細胞株および細胞培養条件により変動し
得る。
本発明の方法によりクローニングされた遺伝子の免疫沈降、プロッティング、お
よびcDNA配列決定は、当業者には周知の都合のよい方法により実行され得る
。例えば、C1arkら、困koc te T in I 、 Vol、II、
pp、155−167(1986)の免疫沈降法のプロトコールが好適である
。サイン法、ノーサン法、または他の当業者には周知のプロット分析方法は、f
luら(江旦18:271−277 (19g2))の方法のような周知の方法
により調製されたハイブリダイゼーシヨンプローブを用いて使用され得る。cD
NA配列決定はまた、Sangerら、Proc、 Natl、 Acad、
ScL剋174:5463−5467 (1977)ノジデオキシヌクレオチド
法を含む周知の方法により実行され得る。
本発明により使用される抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得る
。これらは単独で、または他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体と結合
して使用され、本発明の方法により所望の1つのまたは複数の抗体あるいは抗原
を発現する細胞の免疫選択を行い得る。本発明により使用するために抗体または
そのフラグメントを調製する方法は、当業者には周知である。
免疫学の一般原理を示す標準的な参考文献としては、Klein、 J、、 I
mmunolo : T e 5cie ce of 5elf−Nonse
f D’serimination、出版社John Wiley & 5on
s、 New York (19g2) ;にennett、R,ら編、靭no
c肋ルL」囮1堕疋匡扛」■u山鎮□工1」上、Dimensio ’n 1o
lo iea Anal 5ess 出版社Plenum Press。
New York (1980) ; Caa+pbe11.A、、 −Mon
oclonal Antibody Technology”、Burden、
R,ら編、 aborator Tea ni ues in Bioche+
5ist and Mo1ecular Bio o 、 Vol、13、出版
社Elsevere、 Amsterdam (f9114)がある。
用語「抗体」は、抗原に結合し得る、例えばFabおよびF(ab)2のような
、完全な分子およびそのフラグメントを含むことを意味する。ポリクローナル抗
体の調製は、当業者には周知の標準プロトコルを用いて、問題の抗原またはその
フラグメントによる免疫後、所望の動物柵の血液から直接誘導され得る。同様に
、モノクローナル抗体は周知の方法(Kohlerら、ur、 J、mmuno
l炙:292 (1976)を用いて調製され得る。本発明の目的にとっては、
モノクローナル抗体の使用が好適である。
本発明による免疫選択のために、標的細胞の表面抗原に特異的な抗体に曝された
組織培養宿主細胞を、標的抗原を発現しない宿主細胞から、その抗原に対する抗
体に特異的な抗体をコートした基質上に細胞を散布することにより分離する。
この技法は「パニング(panning) Jと呼ばれ、当業者には周知であり
、例えば、Mageら、J、n++*u o 、 Meth、 li: 47−
56(1977)、および1Vysockiおよび5atOx P oc、 N
atl、cad、c゛k 姐録L■:2844−21148 (1978)il
1m記載されティる。
本発明の方法によるパニングは以下のように実行され得る。
8、抗体をコートした皿。細菌学用の6hmプレートs Falcon1007
またはその等傷物、もしくはFisher 8−757−12のような10c+
o皿を使用し得る。ヒツジの抗マウスアフィニティー精製された抗体(例えばC
ooper BioMedical (Cappell)製)を50■Mトリス
■C1pH9,5で10 ug/i11に希釈する。6cm皿につき3slまた
は10cm皿にっき1011を添加する。約1.5時間放置し、別の皿に移し1
.5時間放置して、次にさらに別の皿に移す。プレー)3xを0.15 NaC
1により洗浄しくこれには洗浄ボトルが便利である) 、lag/mlのBSA
を含有する3slのPBSにより一夜インキュベートし、吸引し、また凍結させ
る。
b、パニング。細胞を60℃1m皿に置く。培地を皿から吸引し、2slのPB
S/ 0.5 sM EDTA/ 0.02%アジ化物を添加し、また皿を37
℃で30分間インキコベートして、細胞を皿から引き離す。
細胞を短いパスツールピペットにより激しく摩砕して、遠心管内の各町から細胞
を収集する。2.5 (2(10K g)にセットして4分間遠心する(5重要
する)。0.5−1.0 mlのPBS/EDTA/アジ化物75%FBS化物
7奢
とも30分間インキュベートする。等容量のPBS/EDTA/アジ化物を添加
し、3i1のPBS/EDTA/アジ化物72%Fic化物7土ことにより上清
を吸引する。0. 5slのPBS/EDTA/アジ化物で細胞を取り出し、3
slのPBS/EDTA/アジ化物(azida)15%FBSを含有する抗体
をコートした皿に、100ミクロンのナイロンメ,シx (Tetko)を通し
てピペットで移すことにより分量を添加する。最大2mの6 0+im皿から得
られる細胞を抗体をコートした1個の60mm皿に添加する。室温で1−3時間
放置する。PBS/S%血清で、または培地で緩やかに洗浄することにより皿に
付着していない過剰の細胞を除去する。通常は、3slを2または3回の洗浄す
ることで十分である。
C1旧rt上清。)Ijrt, J. Mo1ec. Bio+. 25:36
5−369 (1967)の方法の1つの好適な変形法は以下の通りである。0
. 4slの0.6%SDS, 10mM EDTAをバンニングされたプレー
トに添加する。
20分間放置する(プレート上に実質的には細胞が存在しない場合は1分間でよ
い)。粘性混合物を遠心管にピペットで移す。0. 1slの5M NaClを
添加し、混合し、少くとも5時間氷上に置く。混合物をできるだけ冷たく保つと
、Hirtの品質が向上するようにみえる。4分間遠心して上清、フェノール抽
出物を慎重に除去しく最初の界面が透明でないときは二度) 、10ugの線状
ポリアクリルアミド(または他の搬体)を添加し、管にEtOHを先端部まで満
たし、沈澱させ、またO. 1slで再懸濁させる。3容量のEtOH/Nao
Acを添加し、再沈澱させ、また0.1slにて再懸濁させる。好ましくは、後
述の高効率のプロトコルを用いて、MC1061/p3へ形質転換させる。DN
A容量が成分細胞分量の2zを超える場合は、形質転換の効率は低下する。5x
でも与えるコロニーの数は、2.5%の場合と同じである(効率は半減する)。
本発明のこの面においては、インキュベーション培地で「ブロッカ−」を使用す
ることが好適である。ブロッカ−により、存在する非特異タンパク賀、プロテア
ーゼ、または抗体が、基質にまたは宿主細胞の表面に存在する抗体と架橋結合、
またはこれを破壊して、誤った陽性または陰性の結果が生じることが確実に免れ
る。ブロッカ−の選択は、実質的には本発明の免疫選択工程の特異性を向上させ
得る。例えば、免疫選択工程で使用されるものと同じクラスまたはサブクラス(
アイソタイプ)の、多数の非特異モノクローナル抗体(例えば、IgG,、Ig
G2A、IgGmなど)をブロッカ−として使用し得る。
ブロッカ−の濃度(通常は11−1O0u/ul)は、適切な感受性を維持し、
しかも不必要な干渉を阻止するために重要である。
また、インキュベージテンに使用されるバッファーシステムはブロッキング作用
を最適化しまた非特異結合を減少させるように選択され得ることは、当業者には
周知である。
標的細胞表面の抗原を発現するものに対してパニングされる細胞の群は、先ず、
トリプシンの存在しない(集菌された)その細胞培養皿から分離される。次に細
胞を、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、問題の抗原に特異的また
は関連する抗原の7アミIJ−に特異的な策1の抗体に曝す。
この最初の段階で、単一の抗体、または抗体の群を使用し得、選択は標的抗原の
性質、その予想頻度、および当業者には明白な他の変数に依存する。宿主細胞の
表面に発現する標的抗原は抗原−抗体複合体を形成する。
続いて、細胞を、培養皿、フィルターディスクなどの、第2の抗体または抗体の
群により予めコートされた基質に密接した位置に置く。この第2の抗体は第1の
抗体に特異的で、その選択は、例えば箪1の抗体を産生じた動物により指定され
る、当業者には周知の事項である。例えば、第1の抗体をマウスで産生ずると、
第2の抗体はマウスの免疫グロブリンに特異的であり、ヤギまたはヒツジで産生
され得る。標的抗原を発現する細胞は、抗原、第1の抗体、および策2の抗体の
間に形成される複合体を介して基質に付着する。次に、付着した細胞を洗浄によ
り付着しない細胞から分離し得る。標的抗原をコードするDNAを、)IiN、
J、 Mo1ec、 Biol、 ifi:365−369 (1967)の
方法のような周知の方法により付着細胞から調製する。このDNAを、さらに融
合および選択を繰り返すために、E、 coltまたは他の適切な宿主細胞に形
質転換して、所望の程度の濃度を得る。
通常の場合には、免疫選択の最初の繰り返しでは、標的抗原が属する抗原のファ
ミリーに共通のエピトープまたはエピトープ群に特異的な第1の抗体のパネルを
使用する。後の繰り返しのためにクローン数を著しく減らすにはこれで十分であ
る。通常はこのような繰り返しを2度行えば十分であるが、上述のように繰り返
しの回数は変動し得る。この後、標的抗原のみを認識する単一の第1の抗体また
は第1の抗体の群を使用して、1回の選択を行い得る。
「基質」は、抗体が本発明による免疫選択のために結合し得る固体表面を意味す
る。周知の適切な基質としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキ
ストラン、ナイロン、および他の材料がある。このような材料により形成または
コートされた管、ビーズ、マイクロタイタープレート、細菌学用培養皿などを使
用し得る。抗体は、アミドまたはエステル結合による共有結合または吸着のよう
な周知の方法により、共有結合によりまたは物理的に基質に結合し得る。当業者
にとっては、多くの他の適切な基質、およびその上に抗体を固定化する方法は周
知である。または、通常の実験のみを用いてこのような基質および方法を確証し
得る。
本発明により使用するための宿主組織培養細胞の選択は、好ましくは、パニング
のために使用される抗体がトランスフェクトされない細胞上に抗原決定基を認識
するという状況を避けるように行われるべきである。従って、CO3細胞は特定
の表面抗原の一過的な発現には好適であるが、より好適なのは、マウスのWOP
細胞である。後者の中でも、WOP 3027細胞はさらに好適である。WOP
細胞では実質的にすべての抗体を使用し得る。これは、マウスの抗体とマウスの
細胞表面の抗原決定基との間の交差反応が希であるためである。
組換えDNA分子の挿入サイズは、全フード配列が得られる可能性を最大限にす
るように選択されるべきである。特定の遺伝子にとって最適な挿入サイズを事前
に決定し得る様々な方法は当業者には既知である。
ベク −の およびcDNAの
哺乳動物の組織培養細胞におけるcDNAの発現に適切なベクターは、周知の方
法により構築され得る。SV40起点を含有する発現ベクターが、本発明の目的
にとっては好適である。ベクターは天然由来のまたは合成の転写起点および5V
4G初期領域プロモーターを含有し得る。さらに好適なものは、ヒトサイトメガ
ロウィルス即時型エン/1ンサー配列よりなるキメラプロモーターである。様々
な「エンハンサー配列」もまた5v40ベクターと共に使用され得る。これらは
、例えば、Banerjlら、Ce1l p:299−308 <1981)
: Lev:n5onら、独よuxa 2M : 568−572 (1982
);およびConradら、Mo1. Ce11. Biol、 i:949−
965 (19+12)に述べられている。
本発明のベクターへのcDNAの挿入は、例えば、末端トランスフェラーゼによ
るホモポリマーテーリングにより起こり得る。しかし、5゛部位でのcDNAイ
ンサートへのホモポリマーの道は、インビトロおよびインビボにおける発現を阻
止し得る。
従って、短い置換可能なりNA上セグメントより分離される逆配回の同一切断部
位を使用することは、本発明の目的には好適である。好ましくはBstXI制限
エンドヌクレアーゼを用いる、このような逆配同の同一切断部位は、ベクターの
置換可能セグメントと同じ末端を提供するため、cDNA合成オリゴヌクレオチ
ドと平行して使用され得る。この方法では、cDNAはそれ自体に結合し得ない
が、ベクターに結合し得る。このため、cDNAおよびベクターの両方を最も効
率的に使用し得る。
本発明の別の実施態様は、cDNAのベクターへの挿入を促進する上述の効率的
なオリゴヌクレオチドに基づく方法である。
本発明のpiH3Mベクターは好適であり、逆配向のエンドヌクレアーゼ部位を
使用する。このベクターは複製のSV40起点を含有し得るが、より好適な形態
はM13起点を含有する。M13起点を含有するこのベクターは、その制御の下
に置かれれるコード配列のCO5細胞に高レベルの発現が可能となる。また、プ
ラスミドの小さなサイズおよび特別配置の配列により、CO8細胞に高レベルの
複製が可能となる。
「細胞表面抗原」は、細胞内膜系を通して細胞表面に輸送されるタンパク質を意
味する。このような抗原は通常は、膜の脂質二重構造体中に存する疎水性アミノ
酸を含有するカルボキシル末端ドメインを通して細胞表面膜に係留され、生体的
および抗原としての効果を示す。T−リンパ球の抗原のような抗原は、本発明の
方法による遺伝子クローニングにとって特に適切である。しかし、すべての細胞
の細胞表面抗原が本発明ニよりクローニングされ得る。さらに、細胞表面に通常
は発現しないタンパク質は、例えば、細胞内抗原を発現する固定細胞に対して富
養化する蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用することにより、本方法により
クローニングが認められ得る。
「実質的に純粋な」は、本発明のすべての抗原、またはこれら抗原をコードする
すべての遺伝子を意味し、これらは本質的には、各々他の抗原または遺伝子から
、もしくは、一般に天然に見られ得る、およびそれ自体としては天然には見られ
ない形態で存在する、他の夾雑物質から遊離している。「機能性誘導体」は、分
子の「フラグメント」、「変異体」、「アナログ」、または「化学的誘導体」を
意味する。本発明の抗原のすべてのような分子の「フラグメント」は、分子のポ
リベブチドサブセ・ノドを意味する。このような分子の「変異体」は、分子全体
またはその7ラグメントと実質的に同様の天然に存在する分子を意味する。分子
の「アナログ」は、分子全体またはそのフラグメントと実質的に同様の非天然の
分子を意味する。
抗原のフラグメント、変異体、アナログ、および/または化学的誘導体と、別の
フラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、および/または抗原とは、両
方の分子におけるアミノ酸配列が実質的に同じ、すなわち、少くとも約50%の
相同性を有する場合、および両方の分子が同様の生物学的活性を有する場合、「
実質的に同様である」といわれる。ヌクレオチド配列と別のヌクレオチド配列と
は、両方の配列が実質的に同じ、すなわち、第1のヌクレオチド配列が、第2の
ヌクレオチド配列によりコードされるものに少くとも約50%の相同性を有する
アミノ酸配列を持つフラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、または抗
原をコードし、また第1のヌクレオチド配列によりコードされるフラグメント、
変異体、アナログ、化学的誘導体、および/または抗原が、第2のヌクレオチド
配列によりコードされるフラグメント、変異体、アナログ、化学的誘導体、およ
び/または抗原の生物学的活性と同様の生物学的活性を有する場合、「実質的に
同様である」といわれる。従って、2つの分子が同様の活性を有する場合は、分
子の一方が他方には見られない付加的なアミノ酸残基を含有する場合でも、また
はアミノ酸残基の配列が同一でない場合でも、本明細書で使用される用語として
の変異体であると見なされる。本明細書で使用される意味では、分子は、通常は
分子の一部ではない付加的な化学部分を含有するとき、別の分子の「化学的誘導
体」であるといわれる。このような部分は分子の溶解度、吸収度、生物学的半減
期などを向上させ得る。これら部分は分子の毒性を低減、もしくは分子の有害な
副作用を除去または低減し得る。このような効果を媒介し得る部分については、
例えば、 emin ton’s P ar■ceutic S ’ c 、
16th ed、、 Mack Publishing Co、、 Easto
n、 Penn、 (198G)にて開示されティる。
同様に、本発明の抗原すべての遺伝子の「機能性誘導体」は、遺伝子の「フラグ
メント」、「変異体」、または「アナログ」を含有することを意味し、ヌクレオ
チド配列において「実質的に同様」であり得、また同様の活性を有する分子をコ
ードする。
抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および/または化学的誘導体と、他の
抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および/または化学的誘導体とは、前
者が後者の少くとも約25%の生物学的活性を有する場合、「同様の生物学的活
性」を有するといわれる。生物学的活性とは、生存する生物に特徴的な作用、機
能、またはプロセスである。生物学的活性はまた、抗原、フラグメント、変異体
、アナログ、および/または化学的誘導体が抗体の産生を誘導するように被検動
物に人工的に導入されるときに示される生物学的活性のような生存プロセスを、
インビトロにおける系または非天然の系に再生、延長、または適用することを含
み得る。抗原、フラグメント、変異体、アナログ、および/または化学的誘導体
は1つ以上の生物学的活性を有し得る。生物学的活性は、その活性に特異的な方
法またはアッセイにより検出または測定され得る。抗原の生物学的活性と同様の
生物学的活性を有する機能性誘導体にとっては、その活性に特異的であり当業者
には周知のアッセイにより測定される抗原の生物学的活性の少くとも約25%の
活性を有する必要がある。
本発明の方法により発現した実質的に純粋な抗原は、放射性免疫測定法(RIA
) 、酵素免疫測定法(EIA) 、および酵素結合免疫吸着検定法(ELIS
A)を含む、当業者には周知の免疫診断アッセイ法において使用され得る。本発
明の実質的に純粋なタンパク質は、可溶性の形態で、単独で、または本発明の他
の抗原、もしくはリンホカインおよびモノカインのような他の薬剤、または薬品
との組合せで、ヒトを含む動物の免疫に関連した疾患および不全の治療のために
投与され得る。
本発明の実質的に純粋なタンパク質による治療から効果が得られ得る不全の例と
しては、免疫不全疾患、即時型過敏症、喘息、過敏性肺臓炎、免疫複合体病、脈
管炎、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、免疫病理学的腎臓疾患、急
性および慢性炎症、溶血性貧血、血小板異常、血漿およびその他の細胞の新生物
、アミロイド症、寄生虫性疾患、多発性硬化症、ギランーバレー症候群、急性お
よび亜急性筋麻痺、重症筋無力症、免疫内分泌障害、および組織および臓器の移
植拒絶がある。これらすべては、Petersdorfら編、■江口njPr’
ne’ s f nte na Med’c’n 、前出、に記載されている口
1feir編、前出HBoguslaskiら編、前出;およびIlolbor
owら編、前出もまた参照。
免疫治療に使用するときは、本発明の抗原は治療剤により標識され得る、または
標識され得ない。免疫治療のため本発明の抗原に結合され得る治療剤の例として
は、放射性同位元素、レクチン、およびトキシンがある。
本発明の抗原の投与のための投与量の範囲は、所望の免疫治療効果を生じるのに
十分な多さであるが、不必要な交差反応、過敏症反応などの宵宮な副作用を引き
起こすほどに多くはない。一般に、使用する投与量は、患者の年齢、症状、性別
、および疾患の程度により変動する。反対徴候(counterindicat
fons) (存在する場合)、免疫寛容、および他の変数もまた適切な投与量
に影響を与える。投与は注射または経時的な漸次潅流による非経口により行われ
得る。投与はまた、静脈、腸管内、筋向、皮下、または皮内への注入によるもの
であり得る。
非経口による投与のための調製物は、滅菌した水性または非水性の溶剤、懸濁剤
、および乳化剤を含む。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチル
のような注射可能有機エステルがある。水性キャリアとしては、水、アルコール
溶液および水溶液、乳化液、または懸濁液があり、生理食塩水およびバッファー
媒体を含む。非経口注射用媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル氏ブド
ウ糖溶液、ブドウ糖および塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンゲル氏溶液、または
固定オイルがある。静脈注射用媒体としては、リンゲル氏ブドウ糖などに基づく
ものなどの、液体および栄養素補給剤、電解質補給剤がある。例えば、抗殺菌剤
、抗酸化剤、不活性ガスなどの保存料およびその他の添加物もまた存在し得る。
このような調製物、およびこれらを作製する作法および方法は周知であり、例え
ばRe5in to ’s Parmaceutical 5cience、
16th ed、、前出、に記載されている〇本発明の抗原はまた、抗原を有す
る薬品または薬学的組成物として、単独で、またはリンホカイン、モノカイン、
および、薬剤のような他の抗原または他の薬剤との組合せで、調製され得る。薬
品は、ヒトを含む動物の免疫関連の適応症の治療のために使用される。
本発明の抗原は単独で投与され得るが、薬学的組成物として投与されるのが好適
である。本発明の組成物は、少くとも1個の抗原またはその薬学的に受容可能な
塩を、1つ以上の受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療剤と共に有す
る。「受容可能な」は、薬剤またはキャリアが、組成物の他の成分と適合し、ま
た患者に対して無害であることを意味する。組成物には、経口、鼻膣、局所(頬
および舌下を含む)、膣内、または非経口の投与に適するものを含む。組成物は
、好適には一定投与量の形態で提供され得、薬学分野では周知の方法により調製
され得る。このような方法は、活性成分を1つ以上の補助成分を構成するキャリ
アと結合させることを含む。一般に、組成物は、活性成分を液体キャリアまたは
微細に粉砕された固形キャリアもしくはその両方と、均一におよび密に結合させ
、また必要であればこれにより形成された産物をシェービングすることにより調
製される。
本発明により経口投与された薬学的組成物は、各々一定量の活性成分を含有する
カプセル、カシェ剤、または錠剤を含む、いかなる好適な形態もとり得る。粉体
または顆粒もまた、水性または非水性溶液、または水中油型乳剤、または油中水
型乳剤における溶液または懸濁液と同様に可能である。活性成分はまたポーラス
、舐剤、またはペーストとして提供され得る。
以上、本発明について述べたが、本発明は以下の実施例を参照することによりさ
らに十分に理解される。これら実施例はいかなる意味においても本発明の範囲を
制限するものではない。
(以下余臼)
実施例■ ヒトCD2 の クローニングおよび 。
cDNA ベク − i)+3
サプレツサーtRNA遺伝子とSV40起点との間に合成転写ユニットを挿入す
ることにより、pisV (Littleら、1. B’o 、 M0工i:4
73−4811 (1983))からcos細胞発現ベクターを構築した。
転写ユニットは、HIV LTR−67から+80配列に融合した、ヒトサイト
メガロウィルスAD169の即時型エン/−ンサー配列を含むキメラプロモータ
ーから構成された。LTR+80のすぐ下流には、350bpスタツフy −(
stuffer)により隔てられた2つの七」11部位を含むポリリンカーを挿
入し、BstX1部位の側部には独虹部位を配置し、インサートを切り出すため
に用いることができた。ポリリンカーの下流側には、SV40 A抗原のスプラ
イスおよびpsV2から得た初期領域ポリアデニル化シグナルを配置した。ベク
ターのヌクレオチド配列は、図1に示す。
c!lAライブラ「−の
上記のように、グアニジニウムチオシアネート/CsC1法により、BPB−A
LL細胞からRNAを調製した。オリゴdT選択により全RNAからポIJ A
″RNAを調製した。Maniatisら、助士に吋μ二匹on’n : A
Laborato Manual、上記。GublerおよびHoffman
(SOk rpmで3時間、1mMのEDTAを含む5m1−20%の酢酸カリ
ウム勾配により遠心分離にかけて分画した。0.5+wlの画分を、管の湾曲部
のすぐ上に挿入した注射針または翼状針を用いて手で回収した。各国分を、線状
ポリアクリルアミドを添加(StrausSおよびl/arshavsky、
cgJl 37:8119−901 (1984)) した後、20ug/ml
にエタノール沈降させた。700bpよりも大きなcDNAを含む両分をプール
し、勾配精製したBstXlで消化したpiH3ベクターに連結した。
連結されたDNAを、以下のプロトコルで反応性をもたせた旦、CO■MC10
61/p3に形質転換した:所望の株をLBプレート上で線状に塗布した。次の
日、単一コロニーを、250m1フラスコ中で、20■lのTYMブロス(以下
の処方)に植え付けた。ミ、yドログ(midlog)相(ODsee約0.2
−0.8)に細胞を増殖し、10hlのTYMを含む21フラスコに注ぎ、細胞
が0.5−0.90Dに増殖するまで激しく攪拌し、次いで同一容器中で再び5
00+*1に希釈した。
細胞が0Dsas 0.6に増殖すると、フラスコを氷水に入れ、すばやく冷却
するようにゆるやかに振盪した。培養物が冷却されたとき、4.2k rpmで
15分間(J6)遠心した。上清を注ぎ出し、ベレットを氷上でゆるやかに振盪
することにより、約100■lの冷えたTfB I (下記)中で再懸濁した。
その後、同一の瓶中で、ベレットを、4.2k rpmで8分間(J6)再び遠
心した。上清を注ぎ出し、ベレットを、水上でゆるやかに振盪することにより、
20m1の冷えたTfBII中で再懸濁した。0.1から0.5e177)分別
部分を、予め冷凍しておいたマイクロヒコージチコーブに入れ、液体窒素中で凍
結し、−70’Cで保存した。形質転換するために、分別部分を除去し、丁度溶
融するまで室温で解凍し、水上に置いた。DNAを加え、水上で15−30分間
放置し、37°Cで5分間(0、5mlの分別部分につき6分間)インキユベー
トした。その後、DNAを含む懸濁液をLBで1=10に希釈し、プレートまた
は抗生物質選択にかける荊に90分間増殖させた。あるいは、熱パルスした形質
転換混合物を、抗生物質含有プレート上に直接プレートした。この抗生物質含有
プレートには、プレート直前に抗生物質を含まないLB寒天の薄層(4−5ml
)を注入しておいた。
培地およびバッファー: TYM: 2%のバクトドリブトン(Baato−T
ryptone) 、0.5%の酵母抽出物、O,LMのNaC1,105Mの
Mg5O,(加圧滅菌前に加えられる)。TfB I:30mMのにOAc、
50重MのMnCl2.100mMのKCL、 10mMのCaCl2.15%
(v/v)のグリセロールo TfB II:10mMのNa−MOPS%pH
7,0,75MMのCaCl2.10mMのKCl、15%のグリセロール。
パニング annin によるCNクローンの口PBSの代わりに洗浄瓶からの
0. ISMのNaC1で皿を洗浄したこと以外は、Wysockiおよび5a
to (oc、 t 、ca Sc’、 UA 75:2844−2848 (
197g)) l、:より記載されるように、細菌培養皿(Falcon 10
07)を、アフィニテイ精製されたヒツジの抗マウスIgG抗体でコーティング
することよるパニングを行うために調製し、未反応部位を、1mg/mlのBS
Aを含むPBS中で一晩インキユベートすることにより阻害した。皿は、通常、
大量のバッチで調製し、PBS/BSAの吸引後、凍結保存した。最初のスクリ
ーニングでは、50zコンフルエンスのCO3細胞を含む246c1の皿を、5
andri−Goldrinら、Mo、Ce1 io、lニア43−752(1
981)の方法によるプロトプラスト融合でトランスフェクトした。融合の72
時間後、細胞を、PBS/1mM EDTA/、02%のアジ化ナトリウム中、
37℃で30分間インキコベートすることにより分離した。分離した細胞をプー
ルし、遠心分離にかけ、通常は、1:1000希釈の腹水のように、しかし製造
者により示唆された濃度での市販の試薬のように、モノクローナル抗体を含む冷
したPBS/EDTA/S%の胎児ウシ血清中で再懸濁した。水上で1時間放置
した後、細胞を、PBS/EDTA/アジ化物で1:1に希釈し、2%のFic
oll 400を含むlGm1のPBS/EDTA/アジ化物上に積層した。
遠心分離(400xg、 5分間)後、上溝を注意深く吸引し、ベレットを少量
If) PBS/ED丁A15%0) FBS中で再懸濁し、細胞を、3mlの
PBS/EDTA15%のFBSを含むパニングプレートに分配した。次いで、
Wysockiおよび5ato、Proc、 1Jat1. cad、 Sci
、 USA 75:21144−Za4B (1978)により実質的に記載さ
せるように、プレートを処理した。エピ7−ムDNAを、Hirt (ムMo1
. ’o、26:365−269 (1967))の手法により、付着細胞から
回収し、MC1061/p3に形質転換した。
二および 立
10%の仔ウシ面漬および15 ug/m lの硫化ゲンタマイシンを補足した
ダルベツコ変性イーグル培地(DME/10%の仔ウシ血清)で、CO5細胞ク
ロー2M6細胞を増殖させた。細胞をあまり傷つけないようにできるだけ密度を
高くして保持したストックプレートから6cm皿にトランスフェクトする前日に
、細胞を約1:8の比率で分離した。上記のようなゲンタマイシン、および10
%のNuSerum (Collaborative Re5earch)また
は胎児ウシ血清のいずれかを含むl5coveの変性ダルベツコ培地(IMDM
)中でT細胞系を増殖させた。
″のためのCOS の15717129176cm皿中の50%コンフルエンス
のCOS細胞を、10%のNuserul (Collaborative R
e5earch) 、400ug/mlのDEAEデキストラン、10uMのク
ロロキンジホスフェート、およびtug/mlのDNAを含むDMEまたは[M
DM培地からなるカクテル1.5mlでトランスフェクトした。37°Cで4時
間後(または、細胞が弱っているようであればそれよりも早<)、トランスフエ
フシラン混合物を除去し、10%のDMSOを用いてPBS中で2分間細胞を処
理した。SussmanおよびMilman、 騰d上J□ 4:1641−1
643(1984)。次いで、細胞をDME/10%の仔ウシ血清に戻し、48
から7z時間発現させた。
′ ノーザン およびサイン
T細胞をラクトペルオキシダーゼ処理により標識し、溶解させ、C1arkおよ
びEinfeld (euk c te i [、Vol、Il、 pp、15
5−167 (1986))の手法により、市販のヤギ抗マウスIgGアガロー
スビーズ(Cooper Biomedical)を用いて免疫沈降させた。C
O3細胞を、DEAEデキストラン法によりトランスフェクトし、トリプシン処
理し、トランスフエフシランの24時間後、希釈しないで新しいプレートに移し
た。36時間後、細胞を上記のようにPBS/EDTAに曝すことにより分離し
、遠心分離にかけ、ラクトペルオキシデート法により標識した。溶解/<・ノフ
ア−がLdのPMSFを含んでいたこと以外は、■細胞の免疫沈降と同様に、透
明な溶解産物を調製し、第1抗体によるインキコベーンクンを4℃で2時間だけ
行った。溶離した試料は、Laeuili (Nature227:680−6
85 (1970))のバッファー系を用いて、不連続な11.25%のポリア
クリルアミドゲル上で分画した。
DMSOをローディングバッファーから除去し、70℃で5分間変性し、ゲルに
は、6%ではなく0.6%のホルムアルデヒドを含ませたこと以外は、(Man
iatisら、Mo1ecular C1on’n a [、abator M
anual (1982))に実賞的に記載されるように、ノーザンプロット分
析を行った。jug/■1の臭化エチジウムを含む2容置の水中でゲルを染色し
、写真に撮り、染色溶液中でナイロン(GeneScreen、 DCIPOI
IOに転移した。転移したRNAを、5aran Wrap (Churchお
よびG11bert、 oc、 Natl、cad、Sci。
」鎖塁:1991−1995(19114>)を介して滅菌ランプに曝すことに
より、0.22+af/cm2の束密度(254rvで測定した)で5分間照射
した。ReedおよびMann (Nucl、 Ac’ds Res、[ニア2
07−7221(191116)) 1m記載されるように、ナイロ:/ (G
aneScreen、 DuPont)へのアルカリ転移により、サザンプロッ
ト分析を行った。ハイブリダイゼーシヨンプローブを、HuおよびMessin
g (虹吐18:271−277(1982)) +7)方法によす調製し、M
13 mp197 y−ジのl0DNA ミクログラム当量を含むSDS/リン
酸バッファー(ChurchおよびG11bert、 Proc、 Natl、
Acad、Set、 USA i:1991−1995 (1984))にお
いてプロットをプレハイブリダイズした。
N ローディング
PBS中で3回遠心分離にかけることにより、全血液から赤血球を調製した。D
EAE法により、CD2または他の表面抗原発現クローンを含む6cm皿にCO
S細胞をトランスフェクトした。トランスフエフシランの48から72時間後、
培地を吸引し、2mlのPBS/S%FDS/アジ化物を各プレートに加え、次
いでPBS中20%の懸濁液として、0.4mlの適切な赤血球試料を加えた。
室温で1時間放置した後、未付着の赤血球をゆるやかに洗浄し、プレートを調べ
た。
CD2抗原決定基をコードするcDNAを以下のように単離した。
ヒトTil胞腫瘍系HPB−AI、II、から抽出したJiNAからcDNAを
調製し、上記のように、SV40起点をベースとした発現ベクターpiH3に挿
入した。約3X105組換え体のeDNAライブラリーを構築し、このライブラ
リーをプロトプラスト融合法によりCO3細胞に導入した。3日後、細胞をED
TAに曝すことにより分離し、CD2決定基に対する3つのモノクローナル抗体
(OKTIl、 Lau5bおよびCoulter Tl1)を含むプールで処
理した。抗体で処理した細胞を、アフィニティー精製のヒツジ抗マウス+gG抗
体でコーティングした皿に分配し、付着させ、未付着細胞をゆるやかに洗浄する
ことにより分離した。この集積法は、免疫堂文献(Mageら、J、 I++n
uno1. Methods lj−:47−56 (1977))により公知
である。
得られたコロニーをプールし、CO3細胞に融合し、前記のように、2回目のパ
ニングを行った。3回目のパニングにおいて、分離細胞の一部をCD2に特異的
な3つのモノクローナル抗体の混合物で処理し、Hirt上清を再び生成し、L
並置に形質転換した。得られたコロニーのうちの8個からDNAを調製し、CO
8細胞にトランスフェクトした。3日後、8個のトランスフェクトされた皿のう
ちの6個において、間接免疫蛍光法を行うことにより、CD2抗原の表面発現を
検出した。対応するプラスミドDNAを制限酵素で消化することにより、6個の
単離体中のすべてで1.5kbのインサートが示された。
さらなる分析を行うために、6個のクローンのうちの1個を大量にrA製した。
COS細胞にトランスフェクトした後、白血球分化抗原に関する第3回国際ワー
クシタツブにより提供された抗体パネルの一部分で間接的に免疫蛍光分析した結
果、フェトヘマグルチニン活性1973球とも反応しなかった1個の試料を除い
て、提供された抗体のすべてが、陽性反応を示した。
テストした17個の抗体のうち、少なくとも8個の職別可能な群が、様々な霊長
類のリンパ球との異なる反応パターンにより確定された・JonkerおよびN
ooij、 Leukoc te T ’n Il、 V。
1、1. pp、 373−387 (1986)。
d■【旦旦近
CD2 cDNAインサートを、2つの配回でM131p19 (’/1eir
aおよびMessjB、 Gene 19:259−268 (19B2>)に
サブクローニングし、ジデオ手ジヌクレオチド法により配列決定した(図2)。
Sangerら、Proc、Natl、Acad、Sc’、USA 74:54
63−5467 (1977)。
オーブンリーディングフレームは、翻訳開始コドンのKozak (L工し■±
(社)1ヒ: 1−47:45 (19113)の)コンセンサス基準を満足す
るATGトリプレットから360個の残基にまで亘るのが観察されたく図1)。
予想されたアミノ酸配列は、かなり大きな細胞質内ドメインで終止する疎水性ア
ンカーにまで亘る単一膜に統合された膜タンパク質を示す。N末端アミノ酸配列
と、yon He1jne (Nuc 、 Ac1ds Res、 ll:46
83−4690 (1986))により構築されたシグナル配列残基頻度のマト
リックスとを比較すると、成熟CD2ペプチドが、19番目(Set)の残基と
20番目(Lys)の残基との間の前駆体ペプチドの開裂により形成されること
が示唆される。
この配列の驚(べき、かつ予想外の特徴は、提案された開裂部位にごく近位な位
置に潜在的なN連結グリコジル化部位が存在することである。得られたポリペプ
チド骨格は、3g、 9kdの予想された分子量を有し、これは、21.9kb
質量の外部ドメインと14.6kd質量の細胞質ドメインとに分割される。3個
のN連結グリコジル化部位は、細胞外ドメイン中に存在する。
膜まで亘るドメインは、疎水性優位の特徴をもつ26個の不変残基を含む。これ
に続(9個の残基のうち7個は、リジンまたはアルギニンの塩基性残基である。
塩基性残基が後に続く疎水性優位の残基が出現することは、カルボキシル末端ア
ンカーをaするトランスメンブレンタンパク質に共通の機構的な特徴である。
トランスメンブレンドメインのもう1つの驚(べき特徴は、疎水性残基(しばし
ば、βターンの側部に位置しているのが見られる〉が側部に位置する、ays−
giy−gty−gtyのβターンモチーフ(ChouおよびFasman、
An ua Rviev o °C′StZ 47:251−276 (197
11))の出現である。理論的には、αヘリックスに配室されたわずか20個の
残基が、3n■の膜の二重層を横切るのに必要とされ(Tanford、 5c
ience 200:1012−1018 (191B)> 、わずか14個の
疎水性残基が、統合膜タンパク質を挿入および排出させることが可能であるため
(AdamsおよびRose。
薊■口・1007−1015 (1985>) 、CD2抗原のトランスメンブ
レンのセグメントは、湾曲またはもつれ(kink)を含み得る。
細胞質ドメインのサイズが大きいほどは、CD2は、固有の酵素活性を有する可
能が大きくなる。細胞質ドメインは、プロリンが非常に豊富で、ターン確率の高
い3個の部位を含む。
アミノ酸配列とNBRFデータベースとを比較すると、他のタンパク質との実質
的な相同性は示されなかった。特に、T細胞レセフターαまたはβ鎖との相同性
は観察されず、このことにより、CD2が始原T細胞レセプターであることが示
唆される。
Milaneseら、5C1enCe231:1118−1122 (1986
)。
タンパク質の細胞質置の丁度内側には、セリン残基で終わる塩基性タンパク質が
あり、このパターンは、EGFレセプターおよびクラス■組轍適合性遺伝子の両
方において同一の位置に見いだされ、それぞれの場合において、それぞれタンパ
ク質牛ナーゼCまたはサイクリックAMP依存性タンパク質牛ナーゼによる、イ
ンビボ(EGF)またはインビトロ(HLA)でのリン酸化のための既知の部位
である。Hunterら、Nature LLL+480−482 (1911
4): DavisおよびCzech、 Proc、Natl、cad、Sc+
。
112:1974−1978 (1985): GuildおよびStromi
nger、 L」l剋−並記」4ハ9: 9235−9240および13504
−13510 (19g4)。同様の部位は、インターロイキン2レセプターの
細胞質内ドメインにおいて見いだされ、タンパク質キナーゼCによりインビボで
リン酸化される。Leonardら、Nature 31ユニ 626−631
(1984); N1ka idoら、Nature 31ユニ 631−6
35 <1984); 5hackelfordおよびTrowbridge、
J、B’o、Chem、ip:11706− (1984)。
トランスフェクトされた によ れたCD2 の裏I
CO3細胞を、CD2発現プラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクシ
ョンの60時間後、ラクトペルオキシダーゼ法により1251で表面標識した。
細胞溶解産物を調製し、各部分をモノクローナル抗マウス抗体(0![T11)
または外来性の(0KT4:抗−CD4)抗体を用いて、4℃で2時間インキコ
ベートした。
セファロースに結合した抗マウス抗体を加え、数回の洗浄工程後、吸収されたタ
ンパク質を溶出し、フィトヘマグルチニン活性化1972球、cDNAドナー系
HPB−ALL、またはこの実験室で生成された長期T細胞系から同様に調製し
た免疫沈降物と共に、11.25%のアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ
た。
オートラジオグラフィーにより、抗CD2抗体によりトランスフェクトされたC
O3細胞から沈降した免疫反応物質の明確なバンドが示されたが、コントロール
によるものからは示されなかった。T芽細胞およびT細胞系物質の平均分子量5
4kdと比較して、CO3O3細胞物事均分子量は51kdと計算され、■PB
−ALL細胞からの抗原は、約61kdの分子量であることが見いだされた。
観察されたようにサイズが異なっていたのは、異なる細胞型における異なるグリ
コジル化のパターンのためであった。見かけの分子量が38kdの小さいバンド
は、CO3細胞から免疫沈降された物貫中に存在し、T細胞またはHPB−AL
L細胞からの免疫沈降物には存在しなかった。この種のサイズは、実験的エラー
の範囲内で、成熟非グリコジル化ペプチドの予想された分子量39kdと一致し
ている。
CD2を るCO3はヒツジ、 ・ ロゼツトをヅ るCD2発現クローンでト
ランスフェクトしたCO3細胞を、精製したMT910 (IgG、kappa
)抗−CD2抗体(R4eberら、ij空江堕二■nL旦、 Vol、1.1
)l)、 233−242 (1986))を用いて、lug/mlの濃度で1
時間、または精製したMa2O,5(IgG1. kappa;にavataら
、Lユ■−紅LLLq:633−651 (19114))抗体を用いて同一濃
度で1時間、処理した。Ma2O,5は、単形悪性のHLA−ABC決定基を認
識し、アフリカ緑ザル(African Green Monkey)組織適合
性抗原と交差反応する。アフリカ緑ザル組織適合性抗原を選択したのは、トラン
スフェクトされた細胞により発現されたCD2抗原とほぼ同量の表面抗原を認職
するイソタイプ適合の抗体を示すためである。ヒツジ赤血球ロゼツトは、MB4
05の存在下で見いだされたが、MT910の存在下では見いだされなかった。
ロゼ、ト阻害はまた、0KTII抗体により観察され、他の様々なコントロール
抗体では観察されなかった。
トランスフェクト れたCoS は の の、 ロゼΣ工mゑ
ギおよびウサギの赤血球とロゼ、トを形成するが、マウスまたはラットの赤血球
とは形成しないことが公知である。Johansenら、J、A ler C1
1n、Immunol、54:86−94 (1974);Ami。
tら、A、Bernardら編、Leucoc te T」江n2. Spri
nger出版、New York、 N、Y、、 pp、 281−293 (
19g4); Na1etおよびFournier、 Ce11. Immun
ol、 96:126−136 (1985)。ヒト赤血球とヒト胸腺細胞との
自家ロゼツト形成(Baxleyら、CI’ 、x、Imun匝口:38S−3
93(1973))もまた報告されている。CD2発現クローンでトランスフェ
クトされたCO3細胞を、MT910またはコントロール抗体M840.5で処
理し、上記の種からの赤血球に曝した。ロゼツトは、ウマ、ブタ、イヌ、ヤギ、
ヒツジ、ウサギおよびヒトの赤血球とで観察されたが、マウスまたはう。
トの赤血球とでは観察されなかった。ロゼツト形成は、トランスフェクトされた
CO3細胞をMT910で予め処理することにより阻害されたが、Ma2O,5
により予め処理しても阻害されなかった。これらの実験において、ウマ赤血球は
非常に濃密なロゼツトを形成し、ヤギ赤血球はむしろ低密なロゼツトを形成し、
これはヤギ赤血球のサイズが小さいために、洗浄により洗い流されやすいためで
あろうと考えられた。マウス赤血球は、培養皿、ならびにMT910およびMa
2O,5で予め処理された細胞への自発的結合力が弱いこと示したが、ラット赤
血球は、いずれとも検出可能な結合を示さなかった。
ヒト 、の AはFA3 によ れ
抗体阻害の研究に基づいて、LFA3が、CD2抗原の標的構造であることが示
唆されている( Shamら、Nature 323:262−264 (19
86))ため、ロゼ、ト形成を防止する抗−LFA3抗A3抗調べた。トランス
フェクトされた細胞を、1:1000の希釈の腹水のように、抗LFA3 (
IgG1、”ppa) 、またはLFA3:GIO/Bllおよびoio、抗に
14抗原、D6、抗Wr’抗原;およびF7/B9、抗に抗原と同等またはそれ
よりも有効である、それぞれの濃度が10ug/■lの、ヒト赤血球抗原に対す
る4個のイソタイプ適合非凝集抗体で、予め2時間処理したヒト赤血球に曝した
。N1cholsら、ニLh■,出版。赤血球を、過剰なLFA3抗A3抗し、
放出による抗体阻害力の損失を防ぐために、コントロール抗体の存在下でロゼツ
トを形成させた。ロゼツト形成は、4個のすべてのコントロール抗体の存在下で
観察されたが、抗LFA3で予め処理された赤血球では観察されなかった。
のT を るCO3 はロゼツトを≦ しない多数のクローンを、CD2をクロ
ーニングするのに使用したのと同一の発現技術により単離し、抗体反応性、核酸
制限消化および配列分析、および免疫沈降により様々な程度に特徴づけた。代表
的なりローンは、CO3細胞にトランスフェクトし、ロゼツト形成を維持する能
力を分析した。CDla%CD1b, CD1c。
CD4、CD5、CD6、CD6、CDIIおよびCD28 (Tp44)クロ
ーンは、ヒト赤血球とはロゼツトを形成しなかった。
■r乙し二二立丘
CD2抗原を発現または欠失する細胞型から調製した等量の全RNAを、アガロ
ースゲルを変性することにより電気泳動にかけ、ナイロンに転移した。転移され
たRNAを、CD2 eDNAインサートを含むM13クローンから調製したス
トランド選択プローブ(l(UおよびMessing. Gene 17:27
1−277 (1982))とハイブリダイズさせることにより、胸腺細胞、活
性化T細胞、および衰弱T細胞群から得たRANには、顕著な1.65および1
、3kbの転写物が存在しているのが示された。cDNAドナー系およびI(P
B−ALLから抽出された[lNAには転写物の量は比較的少なく、MOLT4
からのRNAでは転写物の量はさらに少なく、かろうじて検出可能なレベルの量
が、ll5B−2系からのRNAにおいて記録された。Naa+alva(バー
キットリンパ腫) 、U937 (組織法白血病) 、HuT−78 (成人T
細胞白血病) 、PEER (T細胞白血病)、またはJurkatクローンJ
3R7 (T細胞白血病)系からのRNAでは、いかなる反応性も観察されなか
った。反応性のパターンは, CD2抗原の既知のまたは測定されたパターンと
よく一致しており、これは、Namalva, $937、HuT−78、J3
R7、PEERおよびHSB−2細胞系には存在しないまたは検出不可能であり
、MOLT4においてはわずかに存在し、EPB−ALLにおいてより多(存在
し、活性化T細胞において最も多く存在していた。胸腺細胞はまた、高いレベル
のCD2抗原を発現することが公知である。
cDNAクローンの配列を調べると、1. 3kbのRNAは、cDNA配列に
おける1085位の標準ポリアデニル化シグナルAATAAAに遠位なもう1つ
の3°末端の形成により生じ得ることが示唆された。
このことをテストするために、HPB−ALLおよび活性化T細胞からのRNA
を、ノーザンプロット分析にかけ、完全なc DNAプローブ、またはヌクレオ
チド1131に遠位なcDNAの3°部分から得られたプローブとハイブリダイ
ズした。後者のプローブは、1。
65kb種とのみ反応したが、前者は、図5で観察されるのと同一の反応性パタ
ーンを示した。この結果は、示唆された1.3kb転写物の起源と一致している
。
活性化および衰弱T細胞RNAK11製物の両方において、約0.75kbの弱
(ハイブリダイズする転写物が検出された。現在、このRNAの起源は分かって
いない。
C2 のゲノム
胎盤、末梢血リンパ球、T細胞、HeLa細胞、または上記のRNA分析に用い
られた腫瘍系からのゲノムDIJAをサザンプロット分析することにより、同一
のBam旧消化パターンが示され、このことは、再配置が、発達中のCD2遺伝
子の正常な発現に関与していないことを示した。同様に、全体的なゲノムの改変
は、調べたT細胞腫瘍系がCD2抗原を発現しなかったことの原因ではない。多
数の他の酵素による全ゲノムDNAの制限分析、およびCD2配列を有する1フ
アージによる組換え体の不完全な集合体による予備結果は、遺伝子が、少なくと
も4個のエクソンに分割されることを示す。
(以下余白)
実m例IX CD36のクローニング IおよびCD3 6をコードするcDN
Aクローンを単離するために、促進因子(実施例I、前出)としてDEAE−デ
キストランを用いて、ヒト胎盤cDNA(Simmonsおよび5eed (1
988) Nature 333:568−570)をcosmmに輸送した。
トランスフェクションから48時間後に、トリプシンなしで細胞を皿から取り出
し、モノクローナル抗CD36抗体5F1 (Bernsteinら(1982
) J. IIIlmunoL. 128:876−881) (Andrev
sら(1984) J. Im+l1uno1. L2i:398−404)と
ともにインキコベートし、ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体によりコード口た皿
上で洗浄した。穏やかな洗浄により非付着細胞を除去し、付着細胞を溶解させ、
細胞から回収されたエピソームブラスミドを精製してε. coli.に形質転
換した。スフェロプラスト融合に続いて2回同じ濃縮を行った後、ランダムに選
択された12のコロニーのうち11のコロニーから回収されたプラスミドDNA
が、トランスフェクトされたCO3細胞中のCD3 6決定基の外見を管理して
いることを発見した。
さらなる分析のために、クローンのうち2つをランダムに選択した。両方共、約
1.9kbのインサートを有し、同一の制限酵素フラグメントパターンを示した
。これらのクローンのいずれか一方によりトランスフェクトされたCO3細胞は
、モノクローナル抗体5F1およびF13、そしてOKMS (Ortho.
Raritan、 NJ)と反応した。トランスフェクトされた細胞を、抗CD
36抗体のプールにより免疫沈降させることにより、113 kdの分子がトラ
ンスフェクトされたCO3細胞およびC32メラノーマ細胞上に存在し、コント
ロール(CD25のトランスフェクトされた)CO3細胞には不在であることが
判明した。高分子量種、おそらく二量体CD36が、トランスフェクトされたC
os細胞溶解物から免疫沈降したが、C32細胞溶解物からは免疫沈降しなかっ
た。ヌクレオチド配列を表1に示す。表1において、ヌクレオチド配列の番号を
、各ラインの冒頭の左マージンに示す。推定アミノ酸配列を、各コーディングヌ
クレオチドトリブレットの最初の塩基の下に単一文字コードとして示し、開始メ
チオニンを開始コドン上の番号1で示す。誘導されたアミノ酸配列中の、N連結
グリコジル化部位である可能性のある部位には、−重の破線でアンダーラインを
引いている。推定トランスメンブレン領域には二重のアンダーラインを引いてい
る。cDNA中には2個のフンセンサスポリアデニル化(AATAAA)モチー
フが見られるが、ポリ(A)テールは見られず、プロブトハイブリダイゼーシ首
ンにより観察されたRNA種の中には、これらの部位においてポリアデニル化に
対応するために十分短いものはない。このことは、転写物が、クローン中で観察
されたものと同一の隣接5°末端を有しているということを示唆している。
推定される開始コドンは、クローン中に見られる最初のATGではなく、前記2
個のモチーフのすぐ後にフレーム内終止コドンが続いている。予想される開始メ
チオニンには、短い疎水性領域が続いている。前記短い疎水性領域は、分泌シグ
ナル配列に類似であるが、これに対する開裂部位は明白に同定し得ない。表1を
用いた最近の決定によると、アミノ末端36アミノ酸配列(TandonらJ、
Biol、 Chew、264ニア5)O−7575(19119))は、成
熟ポリペプチドが、開始メチオニンのすぐ後に続くアミノ酸残基において始まる
ということを示している。疎水性の領域の前の単一のArg残基がアミノ末端膜
アンカリングを許可するために十分であるかどうかは明白でない。得られたポリ
ペプチドは、471個の残基を所有し、分子質量は約53 kdであると推定さ
れる。提案される細胞外領域には、トランスメンブレン領域に相当する、はとん
どが疎水性である27個の残基および希薄細胞内領域に相当する6個の残基(内
3個は塩基性である)が続いている。N連結グリコジル化部位である可能性のあ
る部位が10個存在するということは、予想されるポリペプチドと免疫沈降によ
って発見された83 kd種との間の分子質量の不一致を説明するために十分で
あるように思われる。配列全体を、周知のタンパク質の様々なデータペースに比
較した結果、重要な相同性は検出されなかった。しかし、いくつかの内部構造は
明かであった。細胞外領域中の全システィン残基は、ヌクレオチド配列の残基9
37から1209によって定義される領域に閉じ込められている。システィン配
置をガイドとして用いて、細胞外領域を3つのセグメントに分割し得た。前記3
つのセグメントのうち、システィンを有さない2つの領域は、その前後にシステ
ィンの豊富なセグメントを有した。しかし、現在のデータベースにおいては、こ
れらのセグメントを用いた配列の比較は、他の分子に対する重要な関係も、特に
トロンポスボンジンに対する重要な関係も示さなかった。
CD36タンパク質を免疫沈降により精製した。急速な免疫選択クローニング法
は、トランスフェクトされたCO3細胞の発現に依存するため、CD36 cD
NAがクローニングされた、互いに同一の細胞系もまた発現タンパク質量として
使用し得るということになる。
C32メラノーマ細胞、CD36のトランスフェクトされたCO3細胞、および
CD25 (コントロール)のトランスフェクトされたCO5細胞をN a I
2 S (表面標識し、1 txMフェニルメチルスルフォニルフルオライド
、 O,5% NP−40、および0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含むリン
酸緩衝生理食塩溶液中で溶解した。抗CD36モノクローナル抗体を添加し、4
℃で12時間溶解物中に吸収させた。その後、ヤギ抗マウス免疫グロブリンビー
ズ(Cappel)を添加し、2時間混合し、記載されている(C1arkおよ
びEinreId J、−土imuno1.1ff5:155−157 (19
115>)ように洗浄した。免疫親和性カラム精製により、トランスフェクトさ
れたCO5細胞溶解物から、より大量のタンパク質もまた、精製された形態で得
られ得る。CD36タンパク質を用いて、CD56に対する他の抗体も得られ得
、記載されているように免疫原として発現および/または精製され得る。
CD36は、本発明の発明者および0ckenhouse、 C,D、ら(19
89)Science ■:1469−1741によって、熱帯熱マラリア原虫
が寄生した赤血球の細胞付着の結合部位であると同定されている。
寄生された赤血球の細胞付着は、CD36に対するモノクローナル抗体によって
阻止されることが示されている。感染した赤血球を、CD36 cDNAでトラ
ンスフェクトされたCOS細胞とインキュベートすると、明白な細胞付着を示し
た。熱帯熱マラリア原虫が寄生した赤血球の、末梢血管床への付着により牌性ク
リアランスを回避する能力は、熱帯熱マラリアの病原性において重要な役割を果
たし、且つ、脳の小さな血管の閉塞を引き起こすことにより大脳マラリアの致命
的症状に寄与すると考えられている。したがって、本発明のcDNAおよび精製
タンパク質は、治療用モノクローナル抗体を生産するために十分な精製CD36
を提供するために有用である。
(以下余白)
実施例XI Tリンパ T′SA コード るcDNの おTLiSAlをコー
ドするcDNAクローンを、記載されているように、CO3細胞に形質転換され
たヒトT細胞cDNAライブラリーから得て、本発明の迅速免疫選択クローニン
グ法を行った。モノクローナル抗体ACT−T−SET TLiSAl (T−
Cell 5ciences Corp、、 Cambridge、 Mass
achusetts)を用いることにより、クローニングされたcDNAを発現
するトランスフェクトされたCO3細胞を、正の間接的蛍光抗体法によって検出
した。正のプラスミドは1.7kbのインサートを含んでいた。
前出の実施例IXに記載したように、免疫沈降により、TLiSAタンパク質を
単離した。ゲル電気泳動によって測定したところ、タンパク質は約50 kdの
分子質量を有していた。
cDNAのヌクレオチド配列を、上記したように、ジデオキシヌクレオチド法に
よって決定した。1714個の残基の配列を表3に示す。また、推定アミノ酸配
列を、各コーディングトリプレットの最初のヌクレオチドの下に単一の文字コー
ドにより示す。推定される開始メチオニンをコードするATGの後には、分泌シ
グナル配列に一致する、短い疎水性の領域が続いている。切断部位である可能性
が最も高い部位はリーディングフレームの19個の残基である。得られたポリペ
プチドは、さらにプロセッシングされない場合は、317個の残基を所有し、予
想される分子質量は36 kdである。提案される細胞外領域には、細胞内領域
に相当する、はとんどが疎水性である25個の残基が続いている。(表3におい
て、二重のアンダーラインで示す。)N連結グリコジル化部位である可能性のあ
る部位(表3において一重の破線で示す)が9個存在するということは、予想さ
れるポリペプチドと免疫沈降によって発見された50 kd種との間の分子質量
の不一致を説明するために十分であるように思われる。
TLtSAは、T細胞の、IL−2に誘導された分化を媒介して細胞溶解性形態
にすることに関与している。TLiSAに対する抗体は、IL−2に刺激された
T細胞の分化を阻止するために、且つ、治療における[L−2の悪影響を緩和す
るために有用である。
(以下余白)
実施例X1ll Tす7A 、 −CD27 コード るCNACD27をコー
ドするcDNAクローンを、COS細胞に伝達されたヒトTリンパ球cDNAか
ら得て、本発明の方法により免疫選択した。L ug/mlフィトヘマグルチン
(PHA)を含む培地中で4日間培養した後、グアニジウムチオシアネートを用
いて、血液1ユニツトから誘導された単核細胞からRNAを抽出した。全RNA
が、選択されたポリAであった。cDNAを生産し、CDMIIにクローニング
し、C08w1胞にトランスフェクトし、そして、CD27cDNAを、モノク
ローナル抗体0KT111aおよびCLB−9F4(SeedおよびAruff
o c、atl、ead、 Sc’、 jil:8573−8577 (191
17);そしてAruffoおよび5eed oe、 、ca、s’ U il
l:3365−3369 (1987)に記載されているように供給される)に
より免疫選択した。ベクターは1.2kbのcDNAインサートを含んでいた0
cDNAのヌクレオチド配列を、上記したように、ジデオキシヌクレオチド法に
よって決定した。1203個の残基の配列および推定アミノ酸配列を表5に示す
。開始メチオニンを開始コドン上の番号1により示す。推定CD27ポリペプチ
ドは、タイプ■膜内在性タンパク質の典型的な特徴を示す。前記推定CD27ポ
リペプチドは、分泌シグナル配列に一致する、20アミノ酸の疎水性領域で始ま
る。この疎水性領域には、171残基の細胞外領域、20残基の疎水性膜スバン
ニング領域(二重のアンダーラインにより示す)、および正に帯電した輸送停止
配列で始まる49アミノ酸の細胞質領域が続いている。ポリ(A)テールはない
。
推定CD27アミノ酸配列は、図17に示すように、全長にわたって、8978
球およびガン腫抗原CD40に対して高度に相同性である。CD27はまた、細
胞外およびトランスメンブレン領域にわたって、神経成長因子のレセプター(N
GFR)に対しても高度に相同性である(Stamenkovicら、[i:1
403−1410(1989): Johnsonら、堕貝47:545−55
4 (1989))。これら3つのタンパク質中に見られる最も保護された構造
モチーフは、細胞外領域におけるシスティンまたはヒスチジンの豊富さである。
これらはしばしば、対で見られ、前記対は、亜鉛イオンを結合するためにこの構
造を用いるタンパク質中に見られる配置に類似の、2または4個の干渉アミノ酸
残基によって分離される。システィンおよびヒスチジンが豊富な領域には、セリ
ン、トレオニン、およびプロリンが豊富な膜近接領域が続いている。前記膜近接
領域は、生化学的に同定された。連結グリカンがNGFRに付加される領域であ
ると示唆されている(Johnsonら(1989)、前出HGrobら、J、
’o 、Cti、260:8044−8049 (1985))。
抗CD27抗体によって、トランスフェクトされたcos細胞を免疫沈降し、続
いてゲル電気泳動を行ったところ、還元されない場合に110 kd橿が存在し
、還元剤の存在下では単一の55 kdバンドが存在するということが明かにな
った。このことは、トランスフェクトされたcos細胞上においては、CD27
は、55kdモノマーを包含する、ジスルフィド連結ホモダイマーであり、Tリ
ンパ球から沈降した形態に類似であるということを示している。(Bigler
ら、J、!ma+uno1. ill:21−28 (19811): Sto
ckingerら、L ukoc te T in II L吐、ユニ513−
529 (1986); van Lierら、 ur、J、mmuno 、
[:l111−816 (19g?))。
CD27は、1978球活性化抗原である。その構造は、リンホカインまたは成
長因子に対するレセプターとして機能し得るということを示唆している。CD2
7の認識は、T細胞の増殖、モしてT細胞のヘルパーおよびエフェクターとして
の機能に必要な特定の遺伝子の増加する発現を引き起こす。T細胞上におけるC
D27の発現は、フィトヘマグルチン(PHA)または抗CD3モノクローナル
抗体による刺激により、2倍から5倍増加し、且つ、少なくとも1種のCD27
モノクローナル抗体を添加すると、T細胞の、PHA刺激による増殖を強化し得
る(BiglerおよびChiorazzi、ukoc te T n II
nL」:503−512 (1986); Van Lier、 (1987)
)。CD27陽性であるT細胞は、適度に刺激された場合、IgM合成およびI
t−2分泌のためにB細胞を補助するということが発見されている(Van L
iarら、ム二−L−Il狙1工u:1111−816 (1988))。
抗原提示細胞によりCD27陽性T細胞の結合を干渉する能力、または、このよ
うな結合を、リンパ球細胞以外の表面上で引き起こす能力は、診断および治療に
おいて有用である6例えば、CD27と基質に固定されたレセプターリガンドと
の融合タンパク質は、体液中の特定の抗原の存在を検出するために有用である。
可溶性CD27融合タンパク質は、例えば特定の自己免疫疾患において、望まし
くないT細胞の増殖を阻止するために有用である。
(以下余白)
実施例XVI CD53 をコード るcDNAの および り抗体MEM−5
3(Hadat M、R,(1989)、 eucoc te T ’ IV。
Knapp、 B、ら(ii) 0xford Univ、 Press、 p
、 674)、llID77、Il[I29および旧36、そして63−5A3
によりtJ!、識される抗原であるCD53は、造血系列(Stevanova
、1.、ら、(1989)、はucoc te T I1上、Knapp、 B
、ら(編) 0xford Univ、 Press、 p、 6711)の有
核細胞中に広(分布しているが、前記有核細胞に厳しく制限されている、糖タン
パク質である。CD53は、単球およびマクロファージにより、顆粒球、樹枝状
細胞、破骨細胞および骨芽細胞により、そして、TおよびB細胞により、分化の
全段階から発現される。
CD53をコードするcDNAクローンを得るために、末梢リンパ球および前骨
髄球糟瘍細胞系HL60を、上記したようにDEAE−デキストラン法により、
CO5細胞にトランスフェクトした。トランスフエフシランから48時間後、細
胞をプールし、モノクローナル抗体MEM−53とインキュベートし、5eed
およびAruffo。
Proc、 Nat 、 Acad、 Sci、 USA I4:3365−3
369 (1987)、そしてAruffoおよび5eed、 Pro 、 N
atl、cad、 Sc’、 US jl:8s73−8577 (1987)
に記載されているように洗浄した。スフェロプラスト融合に続いて2回の連続的
濃縮を行った後、単一のコロニー**体から回収されたプラスミドDNAをCO
5細胞にトランスフェクトし、蛍光抗体法によってCD53の発現を評価した。
8個のトランスフェクトントのうち2個が陽性であり、各々約1.5 kbのイ
ンサートを有していた。いずれか一方のクローンによりトランスフェクトされた
CO3細胞は、抗体MEM−53、旧29、[136、および63−5A3の各
々と反応した。
比較のために、末梢リンパ球およびトランスフェクトされたCO3細胞からCD
53を単離するために、リンパ球およびトランスフェクトされたCO3細胞を、
ラクトペルオキシダーゼおよびR202を用いて1251表面標識し、その後、
1%NP40.150 mM NaC1,5mM MgCh、5 d KCI、
20 mM″1−ドアセトアミドおよび1■Mフェニルメチルスルフォニルフ
ルオライドを含む50mMトリス−)1cI p[I 8.0溶解バツフアー中
で溶解した。細胞を、溶解バフファー中で45分間、2.5 x 107細胞/
■lの濃度で可溶化し、その後、12,000 gで遠心分離した。ヤギ抗マウ
ス免疫グロブリンビーズ(Cappel、 Malvern、 PA)により予
め清澄化した後、5chneiderら(ムーム立L」1u1庄:10766
(1982))に記載されているように、モノクローナル抗体MEM53または
63−5A3およびプロティンA−セファロースCL−48(Sigma、 S
t、 Louts、 MO)により免疫沈降を行った。免疫沈降物を、SDS試
料バッファー中に溶出させ、ドデシル硫酸ナトリウムを含む12.5%アクリル
アミドゲル上で分析した。
質量34 kdから42 kdの範囲の、広バンドの放射線ヨード化タンパク質
を、MEM−53か63−5A3かのいずれかのモノクローナル抗体を有する末
梢リンパ球から得、これは、36 kdから46kdにわたる、CD53のトラ
ンスフェクトされたCO3細胞から得られるバンドに匹敵する。CO3細胞中に
さらに高分子量のものが含まれることは一般的にない。なぜなら、トランスフェ
クトされたCO3細胞から回収された細胞表面タンパク質は、通常、eDNAク
ローンが由来する細胞上に見られるものと変わらない、またはより低分子量を示
すからである(Aruffoおよび5eed、 1oc、 Nat 、 Aca
d、 Sc’、 US 84:3365−3369 (1987)ン。賀■の約
15 kdのものは、エンドグリコシダーゼF (N−グリコヵナーゼ)による
消化によって糖タンパク質から遊離する。一方、ノイラミニダーゼおよび0−グ
リヵナーゼによるプロセッシングは、見かけ上の分子量にいがなる影響をも与え
ない(Hadam、 M、R,(1989)、ucoc te ’n IV、
Knapp、 B、ら(編)Oxford Univ、Press、p、674
; 5tevanovaら、ucoc te T in口、にnapp B、ら
(II) 0xford Univ、 Press、 p、 67g)。さらに
、かすかな20 kdのバンド、おそらくグリコジル化されていない前駆体が、
トランスフェクトされたcos細胞の免疫沈降物中で検出されたが、末梢リンパ
球の免疫沈降物中では検出されなかった。
いくつかの酵素によって消化されたT細胞系PEERからのゲノムI)NAをプ
ロットハイブリダイゼーションしたところ、単一コピー遺伝子と一致するパター
ンを示した。RNAプロット分析は、B、T、および骨髄細胞系由来、そして末
梢リンパ球由来の単一の1.8 kb mRNAを示した。発現のレベルは、T
F!PL細胞系中を除いて、異なる細胞系中で互いに一致した。THPI細胞系
はCD53 mRNAをほとんど有していなかった。CD53の転写物は、培養
された細胞系中よりも末梢リンパ球中で、より豊富であり、このことは、これら
の細胞中でCD53の表面発現がより高いことと一致する。
CD53 CDNAのヌクレオチド配列を、上記したように、合成オリゴヌクレ
オチドブライマーを用いて、ジデオキシヌクレオチド法によって決定した。CD
53インサートの配列は、1452個のヌクレオチド(表9)から成り、2個の
重複するAATAAAモチーフ(−重のアンダーラインにより示す)の近傍で終
結する。3°非コ一ド配列は、ATTTA配列の3つの例(引用符により示す)
を含み、ATTTA配列は、mRNAの不安定性の媒介となることが示されてい
る(ShavおよびKamen、堕11[:659 (1986))。
残基74で始まるオーブンリーディングフレームは、24,340 kdの分子
質量を有すると予想される219個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする
。予想されるポリペプチドは、主な疎水性セグメント(二重のアンダーラインに
より示す)を4つ冑する点は一般的であって、そのうちの3つは、分子のアミノ
末端近傍に存在する。第1の疎水性セグメントは、シグナル配列か単純なトラン
スメンブレンアルファへリックスかのどちらに対しても異常に長く、中間に位置
する3個のシスティン残基およびグリシンを含む。システィンとグリシンは両方
とも1つのシグナル開裂部位の直前に存在するということが発見されている(w
on He1jne、 Nucleic c’ds es、口:4683 (1
9116))。このことは、成熟タンパク質のアミノ末端は、第1の疎水性領域
の中間において始まるということを暗示している。この見解は、以下に述べる関
連のタイプIII膜内在性タンパク質である、ME491のポリペプチド骨格の
サイズが、おそらくシグナルペプチドの切断の結果として、cDNA配列から予
想されるサイズよりも小さいということによって支持される。N連結グリカン付
加部位である可能性があるのは、第3と東4の疎水性セグメントの間に位置する
2つの部位(表9に−CFlO−で示す)のみであるため、カルボ牛シル末端は
、細胞内、および第2と第3のセグメントの間の短い疎水性部分に存在するに違
いない。アミ/末端は、プロセッシングされない場合は、同様に細胞内に残って
いるに這いない。
CD53ハ、他の3つの膜タンパク質に関連するタイプIIJI!ll内在性タ
ンパク質である。他の3つの膜タンパク質とは、その増加する発現が腫瘍の進行
と相関するメラ/−マタンパク質であるME491抗原(Hottaら、伽」!
虹−1目工1i:2955 (1988))、Bfi胞上の大部分に発現する、
高度にグリコジル化された抗原であるが、B細胞系列特異的ではない、CD37
(Schvartsら、L」11LIJ4+905 (1988)、および造
血系列の細胞上に広く発現するグリフシル化されていない抗原であるS5.7
(PressanOら、 Cancer Res、 43:4812 (198
3))である。さらに、CD53は、ラクトースを細菌細胞に輸送するタイプ!
!!膜内在性タンパク質である、L−1■Iac Yパーミアーゼにかすかに関
連する。
末梢リンパ球中のCD53の転写物は、PHAによるマイトジェン刺激に続いて
大量に増加する。このことは、細胞増殖に不可欠な因子の輸送にタイプ+111
1!内在性タンパク質が関与し得るということを示唆している。
造血系中の、広い反応性を宵する分子のなかでも、CD53は、現在、最も広い
反応性、および造血細胞に対する最も厳格な制限を有する。抗CD53抗体は、
造血系新生物の同定にとって有用な道具であり、形態学的定義が不十分な細胞、
例えば、膵臓内の細胞または骨髄の一次培養細胞を同定するために有用であると
いうことが証明し得る。
(以下余白)
−中 −へ 門 菅 マ 111ill r+ 中 の工i惣
当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施例に対する等価物を、ルーチ
ンの実験以上のものを用いることなく、認識し、または確かめることができる。
このような等価物は、本発明の範囲内のものである。
1 GGCGTAATCT GCTGCTrGCA AACMAAAAA CC
ACCGCTACCAGCGGTGGT1701 TGCGCCTGCA GG
TCGCGGCC頷ひσCTに聰TCηTGTひに弘ACCFIG、 1−2
FIG、 2−2
151 GGCCACCACT TCAAGAACTCTGTAGCACCG
CCTACATACCTCGCTCTGCT1301 AGGQAGCAGA
C丁CTMATCT GCCGTCATCG ACnCGAAGG ncGAA
TccT2301 MGTTGGTGG ACATATrATG mATcAG
TG ATAAAGTGTCMGCAT(、ACAFIG、 6−3
3501 TCTAGTrGTG GmGTCCAA ACTCATCAAT
GTATCTTATCATGTCTGGATFIG、 6−4
AGAcyacAmcncccxircccvcmcxcnccccicAcx
6−4AGAcyacAαt (60)FIG、 77−
1acAaCAccTccAcAraCAcrc頷MにTcrccuiccxc
xcxcxrmAcrrccA (1140)FIG、 7−2
FIG、 9−1
FIG、 9−2
=2 =91で==で−一
1 、 、GGAGAGTCTGACCACCAT GCCACCTCCT C
GCCTCCTCT TCTTCCTCCT1151 ATGGAMCCCGA
GCAGcGACGTCCAGGCGG ATαxc<cm 印弱rccccc
1201 AGCCGCCGGG AGTGGGCCCA GAAGAAGAG
G Mα;GGAGGG CTATGAGGM1901 MTGAGCTCT
TCCAAAAAAA AAAA1 ACAAAGACAA ACTGCACC
CA CTGAACTCCG CAGCTAGCAT CCAAATCAGCF
IG、 13−1
1101 ATCTGGCC’rr TGCATGGAGT GACCATAG
CT CCTrCTCTCT TACATTGAAT1451 ! AGAGC
ACAAT GGATCTl CCCAMTGTCTCAGAATGTA TG
TCCCAGM ACCTGTGGCT GCTTCAACCAFIG、 15
−1
FIG、 15−2
FIG、 16−1
1701 GGGTCTCAGA GCTGAGCCAA GACCTCCCG
G GTCCTCTGCG G丁rffrTGTG2151 mGTrATcA
GTTTCCAC’rr TFIG、 16−2
1 GCCTCGCTCG GGCGCCCAGT GGTCCTGCCG C
CTGGTCTCA CCTCGCCATGFIG、 17
補正書の写しく翻訳文)提出書(特許法第184条の8)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.CD53細胞表面抗原をコードする組換えDNAセグメントまたはその機能 性誘導体。 2.表9に示されるヌクレオチド配列を含む組換えDNAセグメントまたはその 機能性誘導体。 3.実質的に純粋なCD53タンパク質またはその機能性誘導体。 4.表9に示されるアミノ酸配列を有する、実質的に純粋なタンパク質またはそ の機能性誘導体。 6.実質的に純粋なCD53細胞表面抗原を含む薬学的組成物であって、該細胞 表面抗原が、可溶な形態または受容可能な塩形態で存在する、薬学的組成物。 7.受容可能なキャリアをさらに含む、請求項6に記載の薬学的組成物。 8.治療剤をさらに含む、請求項6に記載の薬学的組成物。 9.実質的に純粋なCD53細胞表面タンパク質、受容可能なキャリア、および 治療剤を含む、免疫治療剤。 10.可溶な形態の実質的に純粋なCD53細胞表面抗原および含有手段を含む 、免疫診断アッセイに有用なキット。
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