PT98326B - PROCESSES FOR THE PREPARATION OF ANTIGENES OF CELL SURFACE, CD27, CD53 AND TLISA, AND OF PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS UNDERSTANDING THE ANTIGENES - Google Patents

Description

Alguns métodos normalmente usados estão descritos por exemplo em Maniatis et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).Some commonly used methods are described for example in Maniatis et al. Molecular Clonine: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982).

Uma vez construída uma biblioteca de cDNA genómico, é necessário isolar a partir de milhares de células hospedeiras a célula contendo o gene humano particular com interesse. Têm sido utilizados muitos métodos diferentes de isolamento de genes alvo a partir de bibliotecas de cDNA com sucesso variável. Estes incluem por exemplo a utilização de sondas de ácido nucleico, as quais são fragmentos de mRNA marcado tendo sequências de ácido nucleico complementares da sequência de DNA do gene alvo. Quando este método se aplica a clones de cDNA de mRNAs abundantes em hospedeiros bacterianos transformados, colónias que hibridam fortemente com a sonda provavelmente contêm as sequências de DNA alvo. A identidade do clone pode então ser provada por exemplo por hibridação/selecção in situ (Goldberg et al.. Methods Enzvmol.. 68:206 (1979)) tradução parada por híbridos (Paterson et al.f Proceedinas of the National Academv of Sciences. 74:4370 (1977)), ou sequenciação directa de DNA (Maxam e Gilbert, Proceedinqs of the Natural Academv of Sciences. 74:560 (1977); Maat e Smith, Nucleic Acids Res.. 5:4537 (1978)).Once a genomic cDNA library is constructed, it is necessary to isolate from the thousands of host cells the cell containing the particular human gene of interest. Many different methods of isolating target genes from cDNA libraries with variable success have been used. These include for example the use of nucleic acid probes, which are fragments of labeled mRNA having nucleic acid sequences complementary to the target gene's DNA sequence. When this method is applied to cDNA clones of mRNAs abundant in transformed bacterial hosts, colonies that strongly hybridize with the probe likely contain the target DNA sequences. The identity of the clone can then be tested for example by in situ hybridization / selection (Goldberg et al., Methods 68: 206 (1979)) for hybrid translation (Paterson et al., Proceedings of the National Academies of Sciences (1978), 74: 4370 (1977)), or direct DNA sequencing (Maxam and Gilbert, Proceedings of the Natural Academy of Sciences, 74: 560 (1977), Maat and Smith, Nucleic Acids Res., 5: 4537 (1978)). .

No entanto tais métodos têm desvantagens quando o objectivo é clonar mRNAs de relativamente pouca abundância a partir de bibliotecas de cDNA. Por exemplo, usando hibridação directa de colónias in situ. é muito díficil detectar clones contendo cDNA complementar de espécies de mRNA presentes na população da biblioteca inicial numa quantidade inferior a 1/200. Como resultado disto foram desenvolvidos vários métodos para enriquecimento de mRNA na população total (e.g. fraccionamento por tamanho, utilização de oligodesoxinucleótidos sintéticos, hibridação diferencial ou imunopurificação) e são muitas vezes 4However such methods have drawbacks when the aim is to clone mRNAs of relatively low abundance from cDNA libraries. For example, using direct colony hybridization in situ. it is very difficult to detect clones containing cDNA complementary to mRNA species present in the initial library population in an amount less than 1/200. As a result of this a number of methods have been developed for enriching mRNA in the total population (e.g., size fractionation, use of synthetic oligodeoxynucleotides, differential hybridization or immunopurification) and are often 4

usados quando são clonados mRNAs pouco abundantes. Tais métodos estão descritos, por exemplo, em Maniatis et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual, supra.mRNAs are cloned. Such methods are described, for example, in Maniatis et al., Molecular Clonidine: A Laboratorv Manual, supra.

Muitas proteínas eucarióticas funcionais existem inicialmente na forma de moléculas precursoras que contêm sequências líder ou sinal nos seus extremos N-terminais. Estas sequências líder ligam-se à membrana celular e conduzem a restante proteína através da bicamada lípidica, após o que a sequência sinal é clivada a partir da proteína por uma enzima sinal-pepti-dase. A proteína funciona assim apenas apôs secreção das células (por exemplo, insulina, albumina sérica, anticorpos e enzimas do tracto digestivo) ou após as proteínas terem sido ancoradas à superfície externa de uma membrana celular (por exemplo, anti-génios de histocompatibilidade).Many functional eukaryotic proteins exist initially in the form of precursor molecules which contain leader or signal sequences at their N-terminal ends. These leader sequences bind to the cell membrane and carry the remaining protein through the lipid bilayer, whereupon the signal sequence is cleaved from the protein by a signal-peptidicase enzyme. The protein thus functions only after secretion of the cells (e.g., insulin, serum albumin, antibodies and enzymes from the digestive tract) or after the proteins have been anchored to the outer surface of a cell membrane (e.g., histocompatibility antigens).

Os antigénios de superfície celular característicos dos linfócitos T de mamífero são outros exemplos de proteínas que se ancoram à superfície celular. Nos mamíferos, certas células derivadas de medula óssea maturam para dar linfócitos, os quais estão presentes nos orgãos linfóides, incluindo o timo, baço, nódulos linfáticos e agregados linfóides e também circulam activamente pelo sangue e nos sistemas linfáticos. As células de linfócitos maduros podem ser divididas em duas populações: linfócitos dependentes do timo (T) e linfócitos independentes do timo (B). Os linfócitos T migram para o interior do timo onde sofrem proliferação e diferenciação. Durante o seu processo de diferenciação, eles expressam aloantigénios característicos da membrana celular, incluindo Thy-1, TLA, gv-1, Ly-1, Ly-2, Ly-3 e Ly-5. À medida que sofrem maturação os linfócitos T perdem os antigénios TLA e alguns dos antigénios Thy-1 e ganham antigénios de histocompatibilidade, adquirindo a conformação de membrana típica dos linfócitos T circulantes. Isto está descrito, por 5Cell surface antigens characteristic of mammalian T lymphocytes are other examples of proteins that are anchored to the cell surface. In mammals, certain bone marrow-derived cells mature to give lymphocytes, which are present in lymphoid organs, including the thymus, spleen, lymph nodes and lymphoid aggregates and also circulate actively through the blood and lymphatic systems. Mature lymphocyte cells can be divided into two populations: thymus dependent (T) lymphocytes and thymus independent lymphocytes (B). T lymphocytes migrate into the thymus where they undergo proliferation and differentiation. During their differentiation process, they express characteristic alloantigens of the cell membrane, including Thy-1, TLA, gv-1, Ly-1, Ly-2, Ly-3 and Ly-5. As they mature, T lymphocytes lose the TLA antigens and some of the Thy-1 antigens and gain histocompatibility antigens, acquiring the membrane conformation typical of circulating T lymphocytes. This is described by 5

exemplo, por Mota, "Activity of immune Cells" em Bier et al.. eds. Fundamentais of Immunoloav. 2d Ed., Springer-Verlag, Berlin, pp. 35-62 (1986).for example, by Mota, " Activity of immune Cells " in Bier et al., eds. Fundamental of Immunoloav. 2d Ed., Springer-Verlag, Berlin, pp. 35-62 (1986).

Os linfócitos T estão envolvidos indirectamente na formação de anticorpos e as suas actividades necessitaram pois de análise complexa da função celular, para além de simples medição do título de anticorpos. Em parte devido a isto, a sua importância no desenvolvimento de competência imunológica não foi reconhecida até há relativamente pouco tempo. Os linfócitos T maduros sintetizam e expressam um padrão único dos antigénios glicopro-teína de superfície que servem como marcas para a identificação de diferentes subpopulações de linfócitos T, incluindo células T auxiliares, células T supressoras e células T citotóxicas. Cada uma destas subpopulações desempenha um papel muito importante na regulação do sistema imune. (Mota, supra).T lymphocytes are indirectly involved in the formation of antibodies and their activities therefore require complex analysis of cellular function, in addition to simple measurement of antibody titer. In part because of this, its importance in the development of immunological competence was not recognized until relatively recently. Mature T lymphocytes synthesize and express a unique pattern of the surface glycoprotein antigens that serve as tags for the identification of different subpopulations of T lymphocytes, including helper T cells, suppressor T cells, and cytotoxic T cells. Each of these subpopulations plays a very important role in regulating the immune system. (Mota, supra).

JJ

Nos humanos, a heterogeneidade funcional e fenotípica dos linfócitos T está bem aceite. Conhecem-se duas duas subpopulações principais: células T efectoras medeiam a imunidade celular; e células T reguladoras contendo linfócitos T auxiliares e supressores. Estas duas subpopulações foram definidas com heteroanti-soro, autoanticorpos e anticorpos monoclonais dirigidos contra antigénios de superfície celular. Por exemplo, no inicio do seu desenvolvimento as células linfóides humanas no timo expressam um antigénio designado Til que reage fortemente com um anticorpo monoclonal designado Conjunto de Diferenciação 2 ("Cluster of Differentiation 2 (CD2) e reage ligeiramente com o anticorpo monoclonall CD5 contra o antigénio de superfície celular Tl. Durante a maturação, estas células perdem Til (CD2) e adquirem três antigénios novos definidos por anticorpos monoclonais CD4, CD8 e CDl. Com mais maturação, os timócitos cessam de expressar os antigénios de superfície celular reactivos com o 6 Λ !In humans, the functional and phenotypic heterogeneity of T lymphocytes is well accepted. Two major subpopulations are known: effector T cells mediate cellular immunity; and regulatory T cells containing helper and suppressor T lymphocytes. These two subpopulations were defined with heteroantibody, autoantibodies and monoclonal antibodies directed against cell surface antigens. For example, at the outset of its development human lymphoid cells in the thymus express a Til antigen that reacts strongly with a monoclonal antibody designated Cluster of Differentiation 2 (CD2) and reacts lightly with the monoclonal antibody CD5 against Tl cell surface antigen. During maturation, these cells lose Til (CD2) and acquire three new antigens defined by CD4, CD8 and CD1 monoclonal antibodies. With more maturation, the thymocytes cease to express the cell surface antigens reactive with 6 Λ!

II

anticorpo monoclonal CD1, expressam o antigénio T3 reactivo com o anticorpo monoclonal CD3 e depois segregam-se em duas subpopula-ções que expressam o antigénio T4 (CD4) ou T8 (CD8). A competência imunológica é adquirida nesta fase, mas não está totalmente desenvolvida até os linfócitos tímicos migrarem para fora do timo. (Mota, supra.) Pelo contrário expressam os antigénios Tl (CD5) e T3 (CD3). 0 antigénio T4 (CD4) está presente em aproxima-damente 55-65% dos linfócitos T periféricos, enquanto o antigénio T8 (CD8) é expresso em 20-30%. Estas duas subpopulações correspondem a células T auxiliares e supressoras e citotóxicas, respectivamente.CD1 monoclonal antibody, express T3 antigen reactive with CD3 monoclonal antibody and then secreted into two subpopulations expressing T4 (CD4) or T8 (CD8) antigen. Immune competence is acquired at this stage, but is not fully developed until the thymic lymphocytes migrate out of the thymus. (Mota, supra.) On the contrary, they express Tl (CD5) and T3 (CD3) antigens. T4 antigen (CD4) is present in about 55-65% of peripheral T lymphocytes, while the T8 (CD8) antigen is expressed in 20-30%. These two subpopulations correspond to helper and suppressor and cytotoxic T cells, respectively.

Para além de proporcionar um meio conveniente de distinguir subpopulações de linfócitos T, estes antigénios de superfície celular são importantes para a activação de células T maduras e função efectora. A activação de células T envolve uma série complexa de interacções na superfície celular entre a célula Te a célula alvo ou célula estimuladora para além da ligação ao seu antigénio específico.In addition to providing a convenient means of distinguishing subpopulations of T lymphocytes, these cell surface antigens are important for mature T cell activation and effector function. Activation of T cells involves a complex series of interactions at the cell surface between the T cell and the target cell or stimulator cell in addition to binding to its specific antigen.

Por exemplo, CD2, o receptor dos eritrócitos para células T humanas, permite que timócitos e linfócitos T adiram às células alvo (e.g., eritrócitos) e ao epitélio tímico. Isto ocorre via um ligando molecular específico para CD2, designado LFA-3, em humanos, que é um antigénio de superfície largamente distribuído. Este fenómeno foi empregue para detectar, testar e purificar células humanas produtoras de anticorpos contra eritrócitos de carneiro e servem como base para o teste das rosetas E, pela primeira vez descrito por Zaalberg, Nature 202: 1231 (1964). Também se encontrou que as interacções CD2/LFA-3 medeiam a conjugação citolítica com o alvo (Shaw et al.. Nature 323:262--264 (1986) e a reacção mista de linfócitos (Martin et al.. J.For example, CD2, the erythrocyte receptor for human T cells, allows thymocytes and T lymphocytes to adhere to target cells (e.g., erythrocytes) and thymic epithelium. This occurs via a CD2-specific molecular ligand, designated LFA-3, in humans, which is a broadly distributed surface antigen. This phenomenon was employed to detect, test and purify human erythrocyte antibody producing cells and serve as the basis for the E rosette test for the first time described by Zaalberg, Nature 202: 1231 (1964). CD2 / LFA-3 interactions were found to mediate cytolytic conjugation to the target (Shaw et al., Nature 323: 262--264 (1986) and the mixed lymphocyte reaction (Martin et al., J.

Immunol. 131: 180-185 (1983). Os anticorpos monoclonais anti-CD2 podem activar directamente os linfócitos T periféricos através de uma via independente de antigénio (Meuer et al.. Cell 36:897-906 (1984)), indicando um papel imuno-regulador mais largo para CD2. O reconhecimento de que os linfócitos T são os principais efectores da imunidade celular e que estão também envolvidos como células auxiliares ou supressoras na modulação da resposta imune resultou numa contribuição significativa para a crescente aplicação prática da imunologia clínica à medicina. O âmbito deste pedido inclui defesa contra infecções, prevenção de doenças por imunização, transplante de orgãos, bancos de sangue e tratamento de deficiências do sistema imune e uma variedade de perturbações que são mediadas por mecanismos imunológicos. Ainda, as técnicas imunológicas frequentemente são usadas em laboratório clínico, como seja na medição de hormonas e drogas. A imunologia clínica está descrita, por exemplo, em Weir, ed., Handbook of experimental Immunoloqy in Four Volumes: Volume 4: Applications of Immunoloaical Methods in Biomedical Sciences. 4a ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986); Boguslaski et al.. eds., Clinicai Immunochemistrv: Principies of Methods and Applications. Little, Brown Co., Boston (1984); Holborow et al♦. eds., Immunoloqy in Medicine: A Comprehensive Guide to ClinicaiImmunol. 131: 180-185 (1983). Anti-CD2 monoclonal antibodies can directly activate peripheral T lymphocytes through an antigen-independent pathway (Meuer et al., Cell 36: 897-906 (1984)), indicating a broader immuno-regulatory role for CD2. The recognition that T lymphocytes are the major effectors of cellular immunity and are also involved as helper or suppressor cells in modulating the immune response has resulted in a significant contribution to the increasing practical application of clinical immunology to medicine. The scope of this application includes defense against infections, prevention of diseases by immunization, organ transplantation, blood banks and treatment of deficiencies of the immune system and a variety of disorders that are mediated by immunological mechanisms. Yet, immunological techniques are often used in a clinical laboratory, such as in the measurement of hormones and drugs. Clinical immunology is described, for example, in Weir, ed., Handbook of experimental Immunology in Four Volumes: Volume 4: Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences. 4a ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986); Boguslaski et al., Eds., Clinical Immunochemistry: Principles of Methods and Applications. Little, Brown Co., Boston (1984); Holborow et al. eds., Immunology in Medicine: A Comprehensive Guide to Clinical

Immunoloqy. 2d Ed., Grune & Stratton, London (1983); e Petersdorf et al.. eds., Harrisoms Principies of Internai Medicine. 10a ed., McGraw-Hill, New York, pp. 344-391 (1983). Claramente será importante uma comparação mais exaustiva das proteínas que medeiam o sistema imune para imunologia clínica. A utilização de bibliotecas de expressão de mamíferos para isolar cDNAs codificadores de proteínas de memífero tais como as descritas atrás oferecem várias vantagens. Por exemplo, a proteína expressa numa célula hospedeira de mamífero deverá ser funcional e deverá sofrer qualquer modificação pós-tradução normal. Uma proteína normalmente transportada através do sistema de membranas intracelulares para a superfície celular deverá sofrer o processo completo de transporte. Um sistema de expressão de mamífero também permitirá o estudo de mecanismos de transporte intracelular e do mecanismo que insere e ancora as proteínas de superfície celular às membranas.Immunoloqy. 2d Ed., Grune & Stratton, London (1983); and Petersdorf et al., eds., Harrisoms Principles of Internal Medicine. 10th ed., McGraw-Hill, New York, pp. 344-391 (1983). Clearly, a more exhaustive comparison of the proteins that mediate the immune system to clinical immunology will be important. The use of mammalian expression libraries to isolate cDNAs encoding for memantine proteins such as those described above offer several advantages. For example, the protein expressed in a mammalian host cell should be functional and must undergo any normal post-translational modification. A protein normally transported through the intracellular membrane system to the cell surface must undergo the complete transport process. A mammalian expression system will also allow the study of intracellular transport mechanisms and the mechanism that inserts and anchors cell surface proteins into membranes.

Uma célula hospedeira de mamífero, designada uma célula "COS", é formada por infecção de células de reim de macaco com um vector virai mutante, designado vírus símio 40 (SV40), o qual tem genes precoces e tardios funcionais, mas não possui uma origem funcional de replicação. Nas células COS, qualquer DNA estranho clonado num vector contendo a origem de replicação de SV40 que se replica devido ao antigénio T de SV40 estar presente em células COS. 0 DNA estranho replicará transitoriamente, independentemente do DNA celular.A mammalian host cell, designated a " COS " cell, is formed by infection of monkey reed cells with a mutant viral vector, designated simian virus 40 (SV40), which has both early and late functional genes but does not possess a functional origin of replication. In COS cells, any foreign DNA cloned into a vector containing the SV40 origin of replication that replicates due to the SV40 T antigen is present in COS cells. The foreign DNA will replicate transiently, regardless of the cellular DNA.

Com excepção de alguns cDNAs recentes de linfoquinas isolados por expressão em células COS (Wong, G.G., et al. Science 228: 810-815 (1985); Lee, F. et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:2061-2065 (1986); Yokota, T., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:5894-5898 (1986); Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)), no entanto, poucos cDNAs em geral foram isolados a partir de bibliotecas de expressão de mamífero. Parece haver duas razões prinicipais para isto: primeiro, a tecnologia existente (Okayama, H. et al.. Mol. Cell. Biol. 2:161-170 (1982)) para construção de bibliotecas grandes de plasmídeos é difícil de manipular e o tamanho da biblioteca raramente se aproxima às acessíveis pelas técnicas de clonagem em fagos. (Huynh, T. et al.. Em:DNA Cloninq Vol. I, A Praticai Approach. Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78). Segundo, os vectores existentes estão, com excepção de um (Wong, G.G., et al.. Science 228:810-815 (1985)), mal adaptados a níveis altos de expressão, particularmente em células COS. Os sucessos descritos com cDNAs de linfoquina não implicam um êxito geral dos métodos usados, uma vez gue estes cDNAs são particularmente fáceis de isolar a partir de bibliotecas de expressão. Os bioensaios com linfoquinas são muito sensíveis ((Wong, G.C., et al.. Science 228:810-815 (1985); Lee, F. et al. Proceedinas of the National Academy of Sciences. USA 83:2061-2065 (1986); (1986): Yokota, T. et al♦. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83:5894-5898 (1986); Yang, Y. et al.. Cell 47:3-10 (1986)) e os mRNAs são tipicamente abundantes e curtos (Wong, G.C. et al.. Science 228:810-815 (1985); Lee, F., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA. 83:2061-2065 (1986); Yokota, T., et al.. Proceedinqs of the National Academv of Sciences. USA 83: 5894-5898 (1986); Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)).With the exception of a few recent lymphokine cDNAs isolated by expression in COS cells (Wong, GG, et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee, F. et al., Proceedings of the National Academic of Sciences. , Yokota, T., et al .. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83: 5894-5898 (1986); Yang, Y., et al., Cell 47: 3-10 (1986)), however, few cDNAs were generally isolated from mammalian expression libraries. There appear to be two main reasons for this: first, the existing technology (Okayama, H. et al., Mol. Cell Biol. 2: 161-170 (1982)) for the construction of large plasmid libraries is difficult to manipulate and the size of the library rarely approximates those accessible by phage cloning techniques. (Huynh, T. et al .. In: DNA Cloninq Vol. I, A Practical Approach, Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78). Second, existing vectors are, with the exception of one (Wong, G.G., et al., Science 228: 810-815 (1985)), poorly adapted to high levels of expression, particularly in COS cells. The described successes with lymphokine cDNAs do not imply a general success of the methods used, since these cDNAs are particularly easy to isolate from expression libraries. Lymphokine bioassays are very sensitive (Wong, GC, et al., Science 228: 810-815 (1985), Lee, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83: 2061-2065 (1986) (1986): Yokota, T. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83: 5894-5898 (1986); Yang, Y. et al., Cell 47: 3-10 (1986)) and mRNAs are typically abundant and short (Wong, GC et al., Science 228: 810-815 (1985); Lee, F., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83: 2061-2065 (1986) Yokota, T., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 83: 5894-5898 (1986); Yang, Y., et al., Cell 47: 3-10 (1986)) .

Assim, a expressão em hospedeiros mamíferos anterior-mente essencialmente empregue como um meio de verificação da identidade da proteína codificada por um gene isolado por métodos de clonagem mais tradicionais. Por exemplo, Stuve et al.. J. Virol. S1S2X.* 327-335 (1987), clonaram o gene da glicoproteína gB2 de herpes simplex tipo II estirpe 333 por hibridação de placas dos vectores fágicos recombinantes baseados em M13 usados para transformar E. coli JM101 competentes. A identidade da proteína codificada pelo clone assim isolado foi verificada por transfec-ção de células de mamífero COS e de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão foi demonstrada por imunofluorescência e radio-imunoprecipitação.Thus, mammalian host expression is essentially employed as a means of verifying the identity of the protein encoded by a gene isolated by more traditional cloning methods. For example, Stuve et al., J. Virol. S1S2X. * 327-335 (1987), cloned the herpes simplex glycoprotein gB2 gene type II strain 333 by plaque hybridization of the recombinant M13-based phage vectors used to transform competent E. coli JM101. The identity of the protein encoded by the clone thus isolated was verified by transfection of COS mammalian and Chinese hamster ovary (CHO) cells. Expression was demonstrated by immunofluorescence and radioimmunoprecipitation.

Oshima et al. usaram hibridação em placas para fazer o rastreio de uma biblioteca de cDNA no fago lambda gtll relativamente ao gene codificador da beta-glucuronidase de placenta humana. Oshima et al.f Proceedinqs of the National Academv ofOshima et al. used plaque hybridization to screen a lambda gtll phage cDNA library relative to the gene encoding human placenta beta-glucuronidase. Oshima et al., Proceedings of the National Academv of

Sciences, USA 84:685-689 (1987). A identidade dos clones de cDNA isolados foi verificada por imunoprecipitação da proteína expressa por células COS-7 transfectadas com inserções clonadas usando o promotor tardio do SV40. A expressão transitória em células de mamífero foi empregue como um meio de confirmar a identidade dos genes ante-riormente isolados por outros métodos de rastreio. Gerald et al.. Journal of General viroloqy 67:2695-2703 (1986). Mackenzie, Journal of Biolocrical Chemistry 261:14112-14117 (1986); Seif et al. . Gene 43.:1111-1121 (1986); Orkin et al. . Molecular and Cellular Bioloqy 5(4):762-767 (1985). Estes métodos muitas vezes são ineficazes e demorados e requerem vários ciclos de rastreio para identificar clones de tamanho completo ou sobreponíveis. Os métodos de rastreio anteriores baseados na expressão de proteínas de fusão são ineficazes e requerem grandes quantidades de anticorpos monoclonais. Tais desvantagens são acentuadas pela utilização de vectores de expressão ineficazes os quais resultam em níveis de proteína expressa que são inadequados para permitir selecção eficaz.Sciences, USA 84: 685-689 (1987). The identity of the isolated cDNA clones was verified by immunoprecipitation of the expressed protein by COS-7 cells transfected with cloned inserts using the SV40 late promoter. Transient expression in mammalian cells was employed as a means of confirming the identity of the genes previously isolated by other screening methods. Gerald et al., Journal of General Virology 67: 2695-2703 (1986). Mackenzie, Journal of Biological Chemistry 261: 14112-14117 (1986); Seif et al. . Gene 43: 1111-1121 (1986); Orkin et al. . Molecular and Cellular Biol., 5 (4): 762-767 (1985). These methods are often ineffective and time consuming and require several rounds of screening to identify full-length or overlapping clones. Earlier screening methods based on the expression of fusion proteins are ineffective and require large amounts of monoclonal antibodies. Such disadvantages are accentuated by the use of ineffective expression vectors which result in levels of expressed protein that are inadequate to allow effective selection.

Sumário do invento 0 presente invento está relacionado com um novo método para a clonagem de cDNA codificador de antigénios da superfície celular, com um método para a construção de bibliotecas de cDNA com vectores de expressão altamente eficazes particularmente adequados à expressão de níveis elevados de expressão em células eucarióticas hospedeiras e com as sequências de nucleótidos isoladas e seus produtos codificados. A técnica de clonagem altamente eficaz do presente invento baseia-se na expressão transitória de antigénio em 11SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a novel method for cloning cDNA encoding cell surface antigens with a method for constructing cDNA libraries with highly efficient expression vectors particularly suited to expression of high levels of expression in host eukaryotic cells and with the isolated nucleotide sequences and their encoded products. The highly effective cloning technique of the present invention is based on the transient expression of antigen in 11

células eucarióticas e selecção física de células que expressam o antigénio por adesão das células a um substrato revestido com anticorpo, como seja uma placa de cultura. Os métodos do presente invento são úteis para o isolamento e clonagem molecular de qualquer proteína que possa ser expressa e transportada para a membrana da superfície celular de uma célula eucariótica.eukaryotic cells and physical selection of antigen expressing cells by adhesion of the cells to an antibody coated substrate, such as a culture dish. The methods of the present invention are useful for the isolation and molecular cloning of any protein that can be expressed and transported to the cell surface membrane of a eukaryotic cell.

0 método para a clonagem de cDNA codificador de um antigénio de superfície celular do presente invento compreende a preparação de uma biblioteca de cDNA; introdução desta biblioteca de cDNA num mamífero eucariôtico de preferência células em cultura de tecidos; a cultura destas células em condições que permitem a expressão do antigénio de superfície celular; exposição das células a um primeiro anticorpo ou anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície celular, permitindo assim a formação de um complexo antigénio de superfície celular-primeiro anticorpo; exposição subsequente das células a um substrato revestido com um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo, causando assim que as células que expressam o antigénio de superfície celular adiram ao substrato através da formação de um complexo antigénio de superfície celular-primeiro anticorpo-segundo anticorpo; e separação das células aderentes e não aderentes.The method for cloning cDNA encoding a cell surface antigen of the present invention comprises the preparation of a cDNA library; introduction of this cDNA library into a eukaryotic mammal preferably cells in tissue culture; culturing these cells under conditions allowing the expression of the cell surface antigen; exposing the cells to a first antibody or antibodies directed against the cell surface antigen, thus allowing the formation of a cell surface antigen-first antibody complex; subsequent exposure of the cells to a substrate coated with a second antibody directed against the first antibody, thereby causing cells expressing the cell surface antigen to adhere to the substrate through the formation of a cell surface antigen-first antibody-second antibody complex; and separation of adherent and non-adherent cells.

Por meio do método de clonagem do presente invento, foi conseguido o isolamento e clonagem molecular de genes codificadores de antigénios de superfície tais como: o CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLÍSa e Leu8. As sequências de nucleótidos dos genes clonados pelo método do presente invento foram determinadas e identificadas as sequências de aminoácidos das proteínas codificadas. Um gene clonado, como % 12By the cloning method of the present invention, the isolation and molecular cloning of genes encoding surface antigens such as CDLA, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD14, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD27, CD28, CD28, CD33, CD33, CD34, CD34, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLISa and Leu8. The nucleotide sequences of the genes cloned by the method of the present invention have determined and identified the amino acid sequences of the encoded proteins. A cloned gene, such as% 12

seja um codificador de CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CO26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 é também um objec-tivo do presente invento.CD36, CD36, CD22, CD28, CD28, CD28, CD28, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD36, CD37, CD38, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa and Leu8 is also an object of the present invention.

Uma vez clonado o gene codificador de um antigénio de acordo com o método do presente invento, aquele gene pode ser expresso numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica para produzir a proteína codificada ou parte dela numa forma substancialmente pura numa forma que não existe na natureza. Um outro aspecto do presente invento está relacionado com antigénios de superfície celular substancialmente puro, particularmente: antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 e seus análogos funcionais e equivalentes. As sequências de aminoácidos primárias dos antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8 foram determinadas, o invento também está pois relacionado com as sequências de aminoácidos daqueles antigénios e seus equivalentes funcionais e com as sequências de nucleótidos codificadoras daqueles antigénios.Once the gene encoding an antigen according to the method of the present invention is cloned, that gene may be expressed in a prokaryotic or eukaryotic host cell to produce the encoded protein or part thereof in a substantially pure form in a form that does not exist in nature. A further aspect of the present invention is related to substantially pure cell surface antigens, particularly: CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD6, CD7, CD7, CD14, CD16, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31 antigens CD38, CD33, CD34, CD33, CD34, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa and Leu8 and functional analogs thereof. The primary amino acid sequences of the CD3, CD28, CD32, CD32, CD32, CD33, CD34, CD34, CD36, CD36, CD27, CD28, CD28, , CD38, CD39, CD40, CD43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa and Leu8 were determined, the invention is therefore also related to the amino acid sequences of those antigens and their functional equivalents and sequences of nucleotides encoding those antigens.

Este invento também está relacionado com vectores de expressão que permitem a obtenção de bibliotecas de expressão de mamífero muito grandes e dão grandes quantidades de proteína em células hospedeiras de mamífero, resultando numa selecção eficaz. Numa realização particular deste invento, um vector de expressão de cDNA compreende um gene de tRNA supressor; uma origem de SV40; uma unidade de transcrição sintética, compreendendo um promotor 13 J*This invention also relates to expression vectors that allow the production of very large mammalian expression libraries and give large amounts of protein in mammalian host cells, resulting in an effective selection. In a particular embodiment of this invention, a cDNA expression vector comprises a suppressor tRNA gene; an SV40 origin; a synthetic transcription unit, comprising a 13 J * promoter,

quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de AD169 do citomegalovírus humano fundidas com sequências da LTR -60 a +80 do HIV, inseridas entre o gene de tRNA supressor e a origem do SV40; uma unidade de transcrição sintética, compreendendo um promotro quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de AD169 de citomegalovírus humano fundida com as sequências LTR -60 a +80 do HIV, inseridas entre o gene do tRNA supressor e a origem do SV40; um poliadaptador compreendendo dois sítios BstXI separados por uma sequência de DNA substituível e delimitada por sítios Xbal; e sinais de "splicing" do antigénio t pequeno e de poliadenilação da região precoce do SV40.chimeric fusion protein composed of immediate early potentiating sequences of human cytomegalovirus AD169 fused to HIV LTR -60 to +80 sequences, inserted between the suppressor tRNA gene and the SV40 origin; a synthetic transcription unit comprising a chimeric promoter composed of immediate early potentiating sequences of human cytomegalovirus AD169 fused to HIV LTR -60 to +80 sequences inserted between the suppressor tRNA gene and the SV40 origin; a polyadapter comprising two BstXI sites separated by a substitutable DNA sequence and delimited by XbaI sites; and " splicing " of the small antigen t and polyadenylation of the SV40 early region.

Um outro aspecto do presente invento compreende uma unidade de transcrição sintética para usar num vector de expressão de cDNA, compreendendo um promotor quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imedatas de AD162 de citomegalovírus humano fundidas com sequências LTR -60 a +80 do HIV. 0 tamanho pequeno e o arranjo particular das sequências do vector de expressão de cDNA do presente invento permite uma replicação altamente eficaz em células de mamífero em cultura de tecidos, tais como células COS. Ainda, este vector emprega um poliadaptador contendo dois sítios BstXI invertidos separados por um pequeno segmento de DNA substituível, o que permite a utilização de uma estratégia muito eficaz de inserção de cDNA baseada em oligonucleótidos.A further aspect of the present invention comprises a synthetic transcription unit for use in a cDNA expression vector comprising a chimeric promoter composed of early human cytomegalovirus AD162 DNA primer fused with HIV LTR -60 to +80 sequences. The small size and particular arrangement of the cDNA expression vector sequences of the present invention allows highly efficient replication in tissue culture mammalian cells, such as COS cells. In addition, this vector employs a polyadapter containing two inverted BstXI sites separated by a small segment of substitutable DNA, which allows the use of a very efficient oligonucleotide-based cDNA insertion strategy.

Num outro aspecto, o presente invento compreende um vector tendo dois sítios BstI idênticos numa orientação invertida um em relação ao outro, sítios BstXI esses que estão separados por um pequeno fragmento de DNA substituível. Um outro aspecto do invento é um poliadaptador como descrito atrás.In another aspect, the present invention comprises a vector having two identical BstI sites in an inverted orientation one to the other, BstXI sites which are separated by a small, replaceable DNA fragment. A further aspect of the invention is a polyadapter as described above.

Um outro aspecto do invento está relacionado com um método de inserção de cDNA baseado em oligonucleótidos, caracte-rizado pela ligação de oligonucleótidos de DNA sintético ao segmento de cDNA pretendido a ser inserido num vector, os oligo-nucleõtidos de DNA sintético dando as mesmas sequências terminais do fragmento pequeno de DNA substituível do poliadaptador do invento e inserção do segmento de cDNA resultante mais sequências terminais de oligonucleótidos sintéticos no poliadaptador do vector, do qual foi removido o fragmento pequeno de DNA substituível.Another aspect of the invention relates to an oligonucleotide-based cDNA insertion method, characterized by the ligation of synthetic DNA oligonucleotides to the desired cDNA segment to be inserted into a vector, synthetic DNA oligonucleotides giving the same sequences termini of the small fragment of the DNA substitutable polyadapter of the invention and insertion of the resulting cDNA segment plus terminal sequences of synthetic oligonucleotides into the vector polyadapter from which the small fragment of the replaceable DNA was removed.

Na preparação de bibliotecas de cDNA de acordo com o presente invento, descobriu-se que muitos tumores são altamente infiltrados por macrófagos e linfócitos e podem assim ser empregues como uma fonte de produtos de transcrição de macrófagos ou de linfócitos com bom efeito em vez das linhas de células tumo-rais normalmente usadas. Num outro aspecto, então o presente invento está relacionado com a utilização de células tumorais, particularmente células tumorais humanas, para preparar bibblio-tecas de cDNA para usar de acordo com os métodos do presente invento.In the preparation of cDNA libraries according to the present invention, it has been found that many tumors are highly infiltrated by macrophages and lymphocytes and can thus be employed as a source of macrophage or lymphocyte transcription products with good effect instead of the lines of commonly used tumor cells. In a further aspect, the present invention relates to the use of tumor cells, particularly human tumor cells, to prepare cDNA libraries for use in accordance with the methods of the present invention.

Uma outra vantagem do poderoso sistema de selecção do presente invento é que a inserção direccionada do cDNA não é necessária. O método do presente invento resulta em eficiências de construção de bibliotecas que estão a par com as descritas para os vectores fágicos tais como lambda gtlO e lambda gtll, com a vantagem adicional de os clones gerados de acordo com os métodos do presente invento serem mais fáceis de manipular. A técnica de imuno-selecção do presente invento permite a utilização eficiente de anticorpos, os quais podem ser monno-clonais ou policlonais, em quantidades absolutas relativamente pequenas. 0 método do presente invento também é bastante rápido. De um modo geral, três ou menos ciclos de imuno-selecção e pescagem são necessários para isolar um clone de cDNA alvo. Assim, o método do presente invento também resulta na utilização eficaz de trabalho e materiais quando da clonagem dos genes codificadores de antigénios de superfície celular. Como descrito atrás, este método tem sido empregue para clonar com êxito genes codificadores de antigénios de superfície celular associados a linfócitos T de mamífero (e.g. antigénios CDla, CDlb, CDlc, CD2, CD6, CD7, Cdl3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD22, CD26, CD27, CD28, CD31, CDw32a, CDw32b, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, Cd43, CD44, CD53, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa e Leu8).A further advantage of the powerful selection system of the present invention is that targeted insertion of the cDNA is not necessary. The method of the present invention results in library construction efficiencies which are in line with those described for phage vectors such as lambda gt10 and lambda gt11, with the additional advantage that the clones generated according to the methods of the present invention are easier to manipulate. The immuno-screening technique of the present invention allows the efficient use of antibodies, which may be mononuclear or polyclonal, in relatively small absolute amounts. The method of the present invention is also fairly rapid. Generally, three or fewer immuno-screening and fishing cycles are required to isolate a target cDNA clone. Thus, the method of the present invention also results in the efficient use of labor and materials when cloning genes encoding cell surface antigens. As described above, this method has been employed to successfully clone genes encoding cell surface antigens associated with mammalian T lymphocytes (eg, CD1a, CD1b, CD1c, CD2, CD6, CD7, CD14, CD14, CD14, CD16, CD19, CD20 antigens CD38, CD39, CD40, CD40, CD44, CD44, CD44, CD33, ICAM, LFA-3, FcRIa, FcRIb, TLiSa and Leu8).

Os genes e proteínas purificados do presente invento são úteis para aplicações em imunodiagnóstico e imunoterapia, incluindo o diagnóstico e tratamento de infecções, doenças e peturbações mediadas pelo sistema imune em animais, incluindo humanos. Eles podem também ser usados para identificar, isolar e purificar outros anticorpos e antigénios. Tais utilizações em diagnóstico e terapia compreendem ainda um outro aspecto do presente invento. Ainda, as proteínas substancialmente puras do presente invento podem ser preparadas como medicamentos ou composições farmacêuticas para administração terapêutica. 0 presente invento está ainda relacionado com tais medicamentos e composições.The purified genes and proteins of the present invention are useful for immunodiagnostic and immunotherapeutic applications, including the diagnosis and treatment of infections, diseases, and immune mediated disorders in animals, including humans. They may also be used to identify, isolate and purify other antibodies and antigens. Such diagnostic and therapeutic uses further comprise a further aspect of the present invention. In addition, the substantially pure proteins of the present invention may be prepared as medicaments or pharmaceutical compositions for therapeutic administration. The present invention further relates to such medicaments and compositions.

Breve Descrição dos DesenhosBrief Description of Drawings

Fiaura 1. Sequência de nucleótidos do vector de expressão ΡΪΗ3Fiaura 1. Nucleotide sequence of expression vector ΡΪΗ 3

Os nucleótidos 1-589 derivam da origem do pMBl (pBR322 ori); os nucleótidos 598-799 derivam do gene sintético do tRNA supressor da tirosina (gene supF); os nucleótidos 800-947 derivam de um vestígio do fragmento LTR de ASV (PvuII a Miul); os nucleótidos 948-1500 derivam do potenciador de AD169 de citomegalovírus humano; os nucleótidos 1501-1650 derivam da TATAde HIV e de elementos que respondem a tat; os nucleótidos 1651-1716 derivam do poliadaptador piLNAXN (HindIII a Xba); nucleótidos 1717-2569 derivam de pSV para "splicing" e sinais de poliadenilação; os nucleótidos 2570-2917 derivam da origem de replicação do SV40 (PvuII a HindIII); e os nucleótidos 2918-2922 derivam de piVX, o que resta do sítio RI do poliadaptador.Nucleotides 1-589 are derived from the origin of pMB1 (pBR322 ori); nucleotides 598-799 are derived from the synthetic tyrosine suppressor tRNA gene (supF gene); nucleotides 800-947 are derived from a trace of the ASV LTR fragment (PvuII to Miul); nucleotides 948-1500 are derived from the human cytomegalovirus AD169 enhancer; nucleotides 1501-1650 are derived from HIV TATA and tat responding elements; nucleotides 1651-1716 are derived from the piLNAXN polyadapter (HindIII to Xba); nucleotides 1717-2569 are derived from pSV for " splicing " and polyadenylation signals; nucleotides 2570-2917 are derived from the SV40 origin of replication (PvuII to HindIII); and nucleotides 2918-2922 are derived from piVX, which remains from the RI site of the polyadapter.

Figura 2. Sequência de nucleótidos da inserção de cDNA de CD2 A numeração dos nucleótidos é dada entre parêntesis à direita, a numeração de aminoácidos à esquerda. Estão apresentadas a localizações dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO), assim como a sequência transmembranar prevista. A sequência de aminoácidos estánumerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora.Figure 2. Nucleotide sequence of the CD2 cDNA insert Nucleotide numbering is given in parentheses to the right, amino acid numbering on the left. Locations of the potential asparagine-linked sugar addition sites (CHO), as well as the predicted transmembrane sequence, are presented. The amino acid sequence is enumerated from the projected cleavage site of the secretory signal sequence.

Figura 3. Mapa de restrição do vector de expressão CDM8 O vector CDM8 inclui uma versão com deleções de uma região precoce mutante do vírus polioma seleccionado relativamente a expressão de alta eficácia em células de murganho e de macaco. Essencialmente toda a região do promotor da imunodefici-ência humana foi substituída com as sequências cognatas do promotor precoce imediato do citomegalovírus e por inclusão de um promotor do bacteiofago T7 entre o promotor eucariótico e o sítio de inserção de cDNA. As setas indicam a direcção da transcrição.Figure 3. CDM8 expression vector restriction map CDM8 vector includes a deletion version of a mutant early region of the polyoma virus selected relative to expression of high efficacy in mouse and monkey cells. Essentially the entire human immunodeficiency promoter region was replaced with the cognate sequences of the cytomegalovirus immediate early promoter and by inclusion of a T7 bacteriophage promoter between the eukaryotic promoter and the cDNA insertion site. The arrows indicate the direction of the transcription.

Figura 4. Sequência de nucleótidos e correspondente sequência de aminoácidos do antigénio LFA-3 Células WOP transfectadas com um clone codificador do antigénio LFA-3 foram detectadas por imunofluorescência indirec-ta, amplificadas e seguenciadas. (A) mostra a inserção de S74 pares de bses contendo uma grelha de leitura aberta de 237 resíduos começando um codão metionina e terminando numa série de resíduos hidrófobos. As regiões hidrófobas e hidrófilas dentro desta grelha de leitura aberta estão apresentados em (B).Figure 4. Nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of the LFA-3 antigen WOP cells transfected with a clone encoding the LFA-3 antigen were detected by amplified and sequenced indirect immunofluorescence. (A) shows the insertion of S74 pairs of bses containing a 237 residue open reading frame starting a methionine codon and ending in a series of hydrophobic residues. The hydrophobic and hydrophilic regions within this open reading frame are shown in (B).

Figura 6. Sequência de nucleótidos do vector PÍH3MFigure 6. Nucleotide sequence of the vector PÍH3M

Existem 7 segmentos. Os resíduos 1-587 são da origem de replicação do pBR322, 588-1182 da origem do M13, 1183-1384 do gene supF, 1385-2238 são do promotor quimérico de citomegaloví-rus/vírus da imunodeficiência humano, 2239-2647 são do fragmento substituível, 2648-3547 do plasmídeo pSV2 (sinais de "splicing" e de poliadenilação) e 3548-3900 da origem do vírus SV40.There are 7 segments. Residues 1-587 are from the replication origin of pBR322, 588-1182 from the origin of M13, 1183-1384 from the supF gene, 1385-2238 from the cytomegalovirus / human immunodeficiency virus chimeric promoter, 2239-2647 are from 2648-3547 of plasmid pSV2 (" splicing " and polyadenylation signals) and 3548-3900 of the SV40 virus origin.

Figura 7. Sequência de nucleótidos do cDNA de CD28Figure 7. Nucleotide sequence of the CD28 cDNA

Numeração de nucleótidos está dada entre parêntesis à direita, numeração de aminoácidos, centro e esquerda. Estão apresentados a localização dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO) assim como a sequência trans-membranar (TM) prevista. A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora.Nucleotide numbering is given in parentheses to the right, amino acid numbering, center and left. The location of the potential asparagine-linked sugar addition sites (CHO) as well as the predicted trans-membrane (TM) sequence are shown. The amino acid sequence is numbered from the projected cleavage site of the secretory signal sequence.

Figura 8.Figure 8.

Sequência de nucleótidos da inserção de cDNA de CD7 A numeração de nucleótidos é dada entre parêntesis à direita. Os sítios dador e aceitador de ,,splicing,, indicados por (/). Está apresentada a localização dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO), o potencial sítio de esterificação de ácidos gordos está assinalado por (*) e o domínio transmembranar específico (TM) está sublinhado. As sequências de nucleótidos potencialmente envolvidas na formação de estruturas em gancho estão assinalados por (.). O presumível sinal de poliadenilação está sublinhado.Nucleotide sequence of the CD7 cDNA insert Nucleotide numbering is given in parentheses to the right. The donor and acceptor sites are indicated by (/). The location of potential asparagine-bound sugar addition sites (CHO) is shown, the potential fatty acid esterification site is denoted by (*) and the specific transmembrane (TM) domain is underlined. The nucleotide sequences potentially involved in the formation of hook structures are denoted by (.). The presumed polyadenylation signal is underlined.

Figura 9. Sequência de nucleótidos do cDNA de CDw32 0 número dos nucleótidos é dado entre parêntesis à direita, a numeração de aminoácidos no centro e à esquerda. As localizações dos potenciais sítios para adição de açúcar ligado a asparagina (CHO) estão aresentadas, assim como a sequência transmembranar (TM). A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado da sequência sinal secretora. Os resíduos císteina estão assinalados com asteriscos.Figure 9. Nucleotide sequence of CDw32 cDNA The number of nucleotides is given in parentheses to the right, center and left amino acid numbering. The locations of the potential asparagine-linked sugar addition sites (CHO) are shown, as well as the transmembrane (TM) sequence. The amino acid sequence is numbered from the projected cleavage site of the secretory signal sequence. Cysteine residues are marked with asterisks.

Figura 10. Sequência do cDNA CD20.4Figure 10. CD20.4 cDNA sequence

A. Os sítios de potencial glicosilação ligada em N estão assinalados pelo símbolo -CHO-; as regiões hidrófobas estão assinaladas. O sítio da cauda poli(A)+ no clone CD20.6 está representado por um asterisco. B. O perfil de hidrofobicidade da sequência em A.A. Sites of potential N-linked glycosylation are denoted by -CHO-; the hydrophobic regions are marked. The poly (A) + tail site in clone CD20.6 is represented by an asterisk. B. The hydrophobicity profile of the sequence in A.

Fiaura 11.Fiaura 11.

Sequência de ICAM-1Sequence of ICAM-1

Sequência completa de nucleótidos da inserção de cDNA de ICAM-1 e sequência proteica prevista. Numeração de nucleótidos está à esquerda, numeração de aminoácidos no centro. 0 motivo RGE na posição 128 está sublinhado, os potenciais sítios de glicosi-lação ligados em N estão indicados por -CHO- e o domínio trans-membranar por -TM-. A sequência de aminoácidos está numerada a partir do sítio de clivagem projectado do peptídeo sinal. A sequenciação foi por terminação de cadeias didesoxi (Sanger, F., et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977)), usando uma combinação de subclones e oligonucleótidos específicos.Complete nucleotide sequence of the ICAM-1 cDNA insert and predicted protein sequence. Nucleotide numbering is on the left, amino acid numbering in the center. The RGE motif at position 128 is underlined, the potential N-linked glycosylation sites are indicated by -CHO- and the trans-membrane domain by -TM-. The amino acid sequence is numbered from the projected cleavage site of the signal peptide. Sequencing was by termination of dideoxy chains (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 74: 5463-5467 (1977)) using a combination of specific subclones and oligonucleotides.

Figura 12. Figura 13. Figura 15. Figura 16. Figura 17.Figure 12. Figure 13. Figure 15. Figure 16. Figure 17.

Sequência de nucleótidos de CD19 Sequência de nucleótidos de CD20 Sequência de nucleótidos de CDw32a Sequência de nucleótidos de CDw32b Sequência de nucleótidos de CD40.CD19 Nucleotide Sequence CD20 Nucleotide Sequence CDw32a Nucleotide Sequence CDw32b Nucleotide Sequence CD40 Nucleotide Sequence.

Descricão Detalhada do InventoDetailed Description of the Invention

Este invento está relacionado com um novo método para a clonagem de cDNA codificador de um antigénio de superfície celular e com um método para a construção de bibliotecas de cDNA. Ele está também relacionado com vectores particulares de expressão de cDNA e seus componente, sequências de nucleótidos ou genes isolados pelo método, antigénios de superfície celular substancialmente puros codificados pelos segmentos de cDNA e métodos de 20This invention relates to a novel method for the cloning of cDNA encoding a cell surface antigen and to a method for constructing cDNA libraries. It is also related to particular cDNA expression vectors and their component, nucleotide sequences or genes isolated by the method, substantially pure cell surface antigens encoded by the cDNA segments and methods of 20

utilização das sequências de nucleótidos isoladas e produtos codificados.use of the isolated nucleotide sequences and encoded products.

Na descrição que segue, será feita referência a várias metodologias conhecidas dos familiarizados com a genética de recombinantes. Publicações e outros materiais que descrevem tais metodologias a que aqui é feita referência são aqui incluídos como referência na sua totalidade. Trabalhos cuja referência é muito usada e que descrevem os princípios gerais da tecnologia de DNA recombinante incluem Darnell, J.E. et al.. Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc., editor, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II. John Wiley & Sons, editor, New York, N-Y. (1985); Old, R.W. et al.. Principies of Gene Maniou-lation: An Introduction to Genetic Enaineerina. 2a edição, University of Califórnia Press, Berkeley, CA (1981); e Maniatis, T. et al.. Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, NY (1982).In the following description, reference will be made to various methodologies known to those skilled in the art of recombinant genetics. Publications and other materials which describe such methodologies to which reference is made herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Papers whose reference is widely used and which describe the general principles of recombinant DNA technology include Darnell, J.E. et al., Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc., editor, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II. John Wiley & Sons, publisher, New York, N-Y. (1985); Old, R.W. et al. Principles of Gene Mania-lation: An Introduction to Genetic Enneineerin. 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); and Maniatis, T. et al .. Molecular Clonine: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, NY (1982).

Por "clonagem" pretende-se significar a utilização de técnicas de recombinação in vitro para inserir um gene particular ou outra sequência de DNA numa molécula vector. Para clonar com êxito um gene pretendido é necessário empregar métodos para obter fragmentos de DNA, para ligar os fragmentos a moléculas de vector, para introdução da molécula de DNA composta numa célula hospedeira em que se possa replicar e para selecção do clone tendo o gene alvo de entre as células hospedeiras recipientes.By " cloning " is meant the use of in vitro recombination techniques to insert a particular gene or other DNA sequence into a vector molecule. In order to successfully clone a desired gene it is necessary to employ methods to obtain DNA fragments, to link the fragments to vector molecules, to introduce the compound DNA molecule into a replicable host cell and to select the clone having the target gene from among recipient host cells.

Por ,,cDNA" pretende-se significar DNA complementar ou cópia produzido a partir de um molde de RNA pela acção de uma DNA-polimerase RNA-dependente (transcriptase reversa). Assim um "clone de cDNA"significa uma sequência de DNA de cadeia dupla complementar de uma molécula de RNA com interesse, transportada num veículo de clonagem. 21By, ,, cDNA " is meant complementary DNA or copy produced from an RNA template by the action of an RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase). Thus a " cDNA clone " means a double stranded DNA sequence complementary to an RNA molecule of interest, carried in a cloning vehicle. 21

Por “biblioteca de cDNA" pretende-se significar uma colecção de moléculas de DNA recombinante contendo inserções de cDNA que em conjunto compreendem todo o genoma de um organismo. Tal biblioteca de cDNA pode ser preparada por métodos reconhecidos dscritos por exemplo em Maniatis et al.. Molecular Cloninq: A _ Laboratorv Manual, supra. De um modo geral o RNA é primeiro isolado a partir das células de um organismo em cujo genoma se pretende clonar um gene particular. São preferidas para fins do presente invento linhas celulares de mamífero e particularmente humanas. São preferidas a linha de células tumorais humanas v ^ HPB-ALL e a linha celular linfoblastóide humana JY. Como alterna tiva, o RNA pode ser isolado a partir de uma célula tumoral, derivada de um tumor animal e de preferência de um tumor humano. Assim, pode ser preparada uma biblioteca por exemplo a partir de um tumor adrenal humano mas pode ser usado qualquer tumor.By " cDNA library " is meant a collection of recombinant DNA molecules containing cDNA inserts which together comprise the entire genome of an organism. Such a cDNA library can be prepared by recognized methods described for example in Maniatis et al., Molecular Cloning in Laborator, supra. Generally RNA is first isolated from the cells of an organism in whose genome it is desired to clone a particular gene. Mammalian and particularly human cell lines are preferred for purposes of the present invention. Preferred are the human tumor cell line HPV-ALL and the human lymphoblastoid cell line JY. Alternatively, RNA can be isolated from a tumor cell, derived from an animal tumor and preferably from a human tumor. Thus, a library can be prepared for example from a human adrenal tumor but any tumor can be used.

0 método de clonagem com imunoselecção do presente invento compreende a preparação de uma biblioteca de cDNA por extracção de RNA total incuindo um gene particular derivado de uma célula, síntese de uma série de fragmentos de cDNA complementares de cadeia dupla a partir do RNA e introdução destes fragmentos de cDNA em células de mamífero em cultura de tecidos. As células de mamífero são mantidas em condições que permitem a expressão da proteína (i.e. o antigénio de superfície celular). As células resultantes são expostas a um primeiro anticorpo ou grupo de anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície celular. Isto resulta na formação de um complexo antigénio de superfície-primeiro anticorpo. Os complexos são expostos a um substrato o qual está revestido ou foi ligado a um segundo anticorpo dirigido contra o primeiro anticorpo. As células que expressam o antigénio de superfície celular aderem ao substrato (devido â formação de um complexo antigénio de superfície 22The immunoselection cloning method of the present invention comprises the preparation of a cDNA library by extraction of total RNA including a particular gene derived from a cell, synthesis of a series of complementary double stranded cDNA fragments from RNA and introduction of these fragments of cDNA in mammalian cells in tissue culture. Mammalian cells are maintained under conditions that allow expression of the protein (i.e., cell surface antigen). The resulting cells are exposed to a first antibody or group of antibodies directed against the cell surface antigen. This results in the formation of a surface antigen-first antibody complex. The complexes are exposed to a substrate which is coated or ligated to a second antibody directed against the first antibody. Cells expressing the cell surface antigen adhere to the substrate (due to the formation of a surface antigen complex 22

celular-primeiro anticorpo segundo anticorpo). As células aderentes são separadas das células não aderentes.cell-first antibody second antibody). Adherent cells are separated from non-adherent cells.

Isolamento de RNA totalTotal RNA Isolation

Para o isolamento de RNA total é preferido o método de tiocianato/CsCl. É mais preferido uma variante tiocianato de guanidinio /LiCl do método GusSCN/CsCl, o qual tem maior capacidade e é mais rápido. Resumidamente, para cada ml da mistura pretendida, são dissolvidos 0,5 g de GuSCN em 0,58 ml de 25% LiCl (solução stock filtrada através de um filtro de 0,45 microns) e adicionado 20 μΐ de mercaptoetanol. As células foram sedimentadas e o sedimento disperso nas paredes por agitação, adicionado 1 ml de solução para 5 x 107 células. A combinação resultante é tratada com polytron até perder a viscosidase. Para preparações em pequena escala (menos de 1θ8 células) colocar 2 ml de mistura tratada em 1,5 ml de 5,7M CsCl (sem RNase; 1,26 g de CsCl adicionado a cada ml de 10 mM EDTA pH8), cobrir com água sem RNase e centrifugação em SW55 50K rpm 2 horas. Para preparações em larga escala, umaa camada de 25 ml e m 12 ml de CsCl num tubo SW28, coberta e centrifugada a 24K rpm 8 h. Aspirar o conteúdo cuidadosamente com ima pipeta pasteur estéril ligada a um frasco de vácuo. Uma vez passada a interface de CsCl, raspa-se uma banda à volta do tubo com a ponta da pipeta para evitar que c camada na parede do tubo desça. A restante solução de CsCl é aspirada. Os sedimentos são ressuspensos em água (não tentar redissolver). Adiciona-se 1/10 do vol. de NaOAc e 3 vol. de EtOH e a combinação resultante é centrifugada. Se necessário, o sedimento é ressus-penso em água (e.g., a 70°C). Ajusta-se a concentração a 1 mg/ml e congela-se. O pequeno RNA (e.g. 5S) não sedimenta. Para pequenas quantidades de células, baixam-se os volumes e cobre-se GuSCN com água sem RNase no gradiente. (a precipitação é ineficax quando o RNA está diluído).For the isolation of total RNA the thiocyanate / CsCl method is preferred. More preferred is a guanidinium thiocyanate / LiCl variant of the GusSCN / CsCl method, which has higher capacity and is faster. Briefly, for each ml of the desired mixture, 0.5 g of GuSCN are dissolved in 0.58 ml of 25% LiCl (stock solution filtered through a 0.45 micron filter) and 20 μΐ of mercaptoethanol is added. The cells were pelleted and the pellet dispersed on the walls by shaking, 1 ml of solution was added to 5 x 107 cells. The resulting blend is treated with polytron until the viscosity is lost. For small-scale preparations (less than 1θ8 cells) place 2 ml of the treated mixture in 1.5 ml of 5.7 M CsCl (without RNase, 1.26 g of CsCl added to each ml of 10 mM EDTA pH8), cover with water without RNase and centrifugation at SW55 50K rpm 2 hours. For large-scale preparations, a 25 ml layer and 12 ml CsCl in a SW28 tube, covered and centrifuged at 24K rpm for 8 h. Aspirate the contents carefully with a sterile pasteur pipette attached to a vacuum flask. Once the CsCl interface is passed, a band is scraped around the tube with the tip of the pipette to prevent the layer on the tube wall from descending. The remaining CsCl solution is aspirated. The sediments are resuspended in water (do not try to redissolve). 1/10 vol. NaOAc and 3 vol. of EtOH and the resulting combination is centrifuged. If necessary, the pellet is resuspended in water (e.g., at 70 ° C). Adjust the concentration to 1 mg / ml and freeze. Small RNA (e.g. 5S) does not settle. For small amounts of cells, the volumes are lowered and GuSCN is coated with RNase-free water in the gradient. (precipitation is ineficax when RNA is diluted).

Preparação de RNA poliA+Preparation of RNA polyA +

Em seguida pode-se preparar RNA poliA+, de preferência pelo método de selecção com oligo dT. Resumidamente, prepara-se uma coluna rejeitável de polipropileno lavando com 5M NaOH e depois lavando com água sem RNase. Por cada miligrama de RNA total usa-se cerca de 0,3 ml (volume empacotado final) de oligo dT celulose. A oligo dT celulose é preparada ressuspendendo cerca de 0,5 ml de pó seco em 1 ml de 0,1M NaOHe transferindo-a para a coluna ou por infiltração de 0,1 NaOH através de uma coluna já anteriormente usada (as colunas podem ser reutilizadas muitas vezes). Esta é lavada com vários volumes de coluna de água sem RNase, até o pH ser neutro e equilibrada com 2-3 ml de tampão de aplicação. O conteúdo da coluna é então removido para um tubo estéril de 15 ml usando 4-6 ml de tampão de aplicação. O RNA total é aquecido a 70°C durante 2-3 minutos., adiciona-se LiCl do stock sem RNase (para 0,5 M) e combina-se com oligo dT celulose num tubo de 15 ml. Isto é seguido de vortex ou agitação durante 10 minutos. O resultado é vertido sobre uma coluna e lavado com 3 ml de tampão de aplicação e depois com 3 ml de tampão de lavagem. O mRNA é eluido directamente para um tubo SW55 com 1,5 ml de 2 mM EDTA, 0,1% SDS; as duas ou três primeiras gotas são rejeitadas. 0 mRNA eluido é precipitado pela adição de 1/10 de vol. de NaOAc e cheio o tubo com EtOH. Este é então misturado, arrefecido durante 30 minutos a -20°C e centrifugado a 50K rpma 5°C durante 30 minutos. 0 sedimento de mRNA é ressuspenso em 50-100 μΐ de água sem RNAse. Aproximadamente 5 μΐ é fundido a 70°C em MOPS/EDTA/formaldeído e corrido num gel de 1% de agarose a 1% para avaliar a qualidade.PolyA + RNA can then be prepared, preferably by the oligo dT selection method. Briefly, a reject polypropylene column is prepared by washing with 5M NaOH and then washing with water without RNase. For each milligram of total RNA, about 0.3 ml (final packed volume) of oligo dT cellulose is used. The oligo dT cellulose is prepared by resuspending about 0.5 ml of dry powder in 1 ml of 0.1M NaOH and transferring it to the column or by infiltration of 0.1 NaOH through a previously used column (the columns can be reused many times). This is washed with several column volumes of RNase-free water until the pH is neutral and equilibrated with 2-3 ml of application buffer. The contents of the column are then removed into a 15 ml sterile tube using 4-6 ml of application buffer. The total RNA is heated at 70øC for 2-3 minutes. LiCl is added from the stock without RNase (to 0.5 M) and is combined with oligo dT cellulose in a 15 ml tube. This is followed by vortexing or stirring for 10 minutes. The result is poured onto a column and washed with 3 ml of application buffer and then with 3 ml of wash buffer. The mRNA is eluted directly into a SW55 tube with 1.5 ml of 2 mM EDTA, 0.1% SDS; the first two or three drops are discarded. The eluted mRNA is precipitated by the addition of 1/10 vol. of NaOAc and the tube filled with EtOH. This is then mixed, cooled for 30 minutes at -20øC and centrifuged at 50K rpm at 5øC for 30 minutes. The mRNA pellet is resuspended in 50-100 μl of water without RNAse. About 5 μΐ is fused at 70øC in MOPS / EDTA / formaldehyde and run on a 1% agarose 1% gel to evaluate the quality.

Síntese de cDNASynthesis of cDNA

Para isto sintetiza-se cDNA. Um método preferido de síntese de cDNA é uma variante do descrito por Gubler e Hoffman (Gene, 25:263-269 (1982)). Isto é realizado como segue: a. Primeira cadeia. 4 μg de mRNA aquecidos a cerca de 100°C num tubo de microtubo durante 30 seguinds e parado o aquecimento em gelo. Adiciona-se o seguinte: 20 θμΐ de tampão RT1, 2 μΐ de inibidor de RNases (Boehringer 36 u/μΐ), 1 μΐ de 5 μg/ml de oligo dT (Collaborative Research), 2,5 μΐ de 20 mM dXTPs (ultrapuros), 1 μΐ de 1 M DTT e 4 μΐ de RT-LX (Life Science, 24 u/μΐ). A combinação resultante é incubada a 42°C durante 40 minutos. Ela é aquecida para inactivar (70°C 10 minutos). b. Segunda cadeia. 320 μΐ de água sem RNase, 80 μΐ de tampão RT2, 5 μΐ de DNA-polimerase I (Boehringer, SU/μΙ). Incubar a 15°C durante 1 hr e 22°C durante 1 hr. Adicionar 20 μΐ de 0,5M EDTA pH 8,0, extrair com fenol e precipitar com EtOH pela adição de NaCl para 0,5M, poliacrilamida linear (veículo) para 20 μg/ml e enchimento do tubo com EtOH. Centrifugar 2-3 minutos numa microfuge, remover, vortex para remover o precipitado da parede do tubo e centrifugar novamente 1 minuto. c. Adaptadores. Ressuspender o cDNA precipitado em 240 μΐ de TE (10/1). adicionar 30 μΐ de tampão de baixo teor salino lOx, 30 μΐ de tampão de ligação lOx, 3 μΐ (2,4 μg) de adptador 12-meros desfosforilado, 2 μΐ (1,6 μg) de adaptador 8-meros desfosforilado e 1 μΐ de DNA-ligase de T4 (BioLabs, 400 U/μΙ ou Boehringer, 1 unidade Weiss/ml). Incubar a 15°C durante a noite. Extrair com fenol clorofórmio e precipitar com EtOH como atrás (não é necessário veículo extra), e ressuspenso em 100 μΐ de TE. 25For this purpose cDNA is synthesized. A preferred method of cDNA synthesis is a variant of that described by Gubler and Hoffman (Gene, 25: 263-269 (1982)). This is accomplished as follows: a. First chain. 4 μg of mRNA heated to about 100 ° C in a microtube tube for 30 seconds and heating on ice stopped. The following are added: 20æg of RT1 buffer, 2μ of RNase inhibitor (Boehringer 36u / μ), 1μg of 5μg / ml oligo dT (Collaborative Research), 2.5μg of 20mM dXTPs ( ultrapure), 1 μl of 1 M DTT and 4 μ of RT-LX (Life Science, 24 μ / μ). The resulting combination is incubated at 42 ° C for 40 minutes. It is heated to inactivate (70 ° C 10 minutes). B. Second string. 320 μΐ water without RNase, 80 μΐ RT2 buffer, 5 μΐ DNA polymerase I (Boehringer, SU / μΙ). Incubate at 15 ° C for 1 hr and 22 ° C for 1 hr. Add 20 μl of 0.5M EDTA pH 8.0, extract with phenol and precipitate with EtOH by the addition of 0.5M NaCl, linear polyacrylamide (carrier) to 20 μg / ml and fill the tube with EtOH. Centrifuge 2-3 minutes in a microfuge, remove, vortex to remove the precipitate from the wall of the tube and centrifuge again 1 minute. W. Adapters. Resuspend the precipitated cDNA in 240 μΐ TE (10/1). add 30 μl 10x low saline buffer, 30 μl 10x ligation buffer, 3 μg (2.4 μg) dephosphorylated 12-mer adapter, 2 μg (1.6 μg) dephosphorylated 8-mer adapter and 1 μl μl of T4 DNA ligase (BioLabs, 400 U / μΙ or Boehringer, 1 Weiss unit / ml). Incubate at 15 ° C overnight. Extract phenol chloroform and precipitate with EtOH as above (no extra vehicle required), and resuspend in 100 μl TE. 25

Utilização de fragmentos de cDNA em vectores de expressãoUse of cDNA fragments in expression vectors

Para usar com os vectores de expressão de cDNA baseados em BstXI do invento (ver infra), os segmentos de oligonucleótidos contendo sequências terminais correspondendo a sítios BstXInos vetores são ligados ao fragmento de cDNA pretendido a ser inserido. Os fragmentos resultantes são reunidos por fraccionamento. Um método preferido é como se segue:For use with the BstXI-based cDNA expression vectors of the invention (see below), the oligonucleotide segments containing terminal sequences corresponding to BstXI sites on the vectors are attached to the desired cDNA fragment to be inserted. The resulting fragments are pooled by fractionation. A preferred method is as follows:

Preparar uma solução de 20% KOA, 2mM EDTA/ 1 jLíg/ml de EtBr e uma solução de 5% KOAc, 2 mM EDTA, 1 jug/ml de EtBr. Adicionar 2,6 ml de uma solução KOAc â câmara de trás de um formador de gradientes. Remover a bolha de ar do tubo que liga as duas câmaras permitindo que a solução corra para a câmara de frente e depis volte para trás. Fechar a passagem entre as câmaras e adicionar 2,5 ml da solução a 5% à câmara da frente. Se existir líquido na tubagem de um gradiente anterior, deixar a solução a 5% correr até ao fim do tubo e depois voltar para a câmara. Colocar o aparelho numa placa de agitação, colocar a barra de agitação a mover-se tão rápido quanto possível, abrir a torneira entre as duas câmaras e depois abrir a torneira de saída. Encher um tubo de polialómero SW55 do fundo para o cimo com a solução de KOAc. Preparar um tubo para equilibrar e centri-fugar o gradiente durante 3 horas a 50t rpm a 22°C. Colher as fraeções do gradiente, furar o tubo com um sistema de infusão em borboleta (com o centro apertado) perto do fundo do tubo e colher três fraeções de 0,5 ml e 6 de 0,25 ml para microtubos (cerca de 22 e 11 gotas respectivamente.). Precipitar com EtOH as fraeções adicionando poliacrilamida linear a 20jug/ml e enchendo o tubo até ao cimo com EtOH. Após arrefecimento dos tubos centrifugá-los numa microfuge durante 3 minutos. Vortex e centrifugar novamente 1 minuto. Lavar os sedimentos com EtOH a 70% (centrifugar de novo). Não secar totalmente. Ressuspender cada uma das fraeções de 0,25 ml em 10 μΐ de TE. Correr 1 μΐ num minigel de 1% de agarose. Reunir as três primeiras fracções e as seis últimas que não contêm material inferior a 1 Kb.Prepare a solution of 20% KOA, 2mM EDTA / 1æg / ml EtBr and a solution of 5% KOAc, 2mM EDTA, 1æg / ml EtBr. Add 2.6 ml of a KOAc solution to the back chamber of a gradient former. Remove the air bubble from the tube connecting the two chambers allowing the solution to flow into the front chamber and then back to the chamber. Close the passage between the chambers and add 2.5 ml of the 5% solution to the front chamber. If there is liquid in the pipeline of a previous gradient, let the 5% solution run to the end of the tube and then return to the chamber. Place the appliance on a stirring plate, set the stir bar to move as fast as possible, open the tap between the two chambers and then open the outlet tap. Fill a SW55 polyalomer tube from the bottom to the top with the KOAc solution. Prepare a tube to equilibrate and centrifuge the gradient for 3 hours at 50 t rpm at 22 ° C. Collect the gradient fractions, drill the tube with a butterfly infusion system (center tight) near the bottom of the tube and collect three 0.5 ml and 6 ml fractions of 0.25 ml for microtubes (about 22 and 11 drops respectively.). Precipitate the fractions with EtOH by adding linear polyacrylamide at 20æg / ml and filling the tube to completion with EtOH. After cooling the tubes centrifuge them in a microfuge for 3 minutes. Vortex and centrifuge again 1 minute. Wash the pellets with 70% EtOH (centrifuge again). Do not dry completely. Resuspend each of the 0.25 ml fractions in 10 μΐ TE. Run 1 μΐ in a 1% agarose minigel. Assemble the first three fractions and the last six that do not contain material less than 1 Kb.

Os plasmídeos de tRNA supressor podem ser propagados por métodos conhecidos. Num método preferido de acordo com o presente invento, plasmídeos supF podem ser seleccionados em hospedeiros não supressores contendo um segundo plasmídeo, p3, o qual contem ampicilibna mutagenizada em amber e elementos de resistência à tetraciclina (Seed, 1983). 0 plasmídeo p3 deriva de PR1, tem 57 Kb de comprimento e é mantido estavelmente como um epissoma de cópia simples. A resistência à ampicilina deste plasmídeo não pode ser usada em estirpes contendo p3. A selecção da resistência a tet sózinha é quase tão boa quanto a selecção da resistência amp+tet. No entanto, o aparecimento de mutações espontâneas no tRNA supressor cromossómico apresenta um fundo inevitável (frequência de aproximadamente 10-9) neste sistema. As colónias que surgem de mutações espontâneas no supressor são geralmente maiores do que as clónias que surgem da transformação com plasmídeos. Os plasmídeos supressores tipicamente são seleccionados em meio LBcontendo amp a 12,5 /ig/ml e tet a 7,5 ^g/ml. Para preparações grandes de plasmídeo pode usar-se meio M9 com casaminoácidos contendo glicerol (0,8%) como fonte de carbono e a bactéria crescida até saturação. 0 DNA vector pode ser isolado por métodos conhecidos. 0 método que se segue é preferido para plasmídeos derivados de 1 litro de células saturadas:Suppressor tRNA plasmids can be propagated by known methods. In a preferred method according to the present invention, supF plasmids can be selected from non-suppressor hosts containing a second plasmid, p3, which contains amber mutagenized ampicillin and tetracycline resistance elements (Seed, 1983). Plasmid p3 is derived from PR1, is 57 kb in length and is stably maintained as a single copy episomal. The ampicillin resistance of this plasmid can not be used in strains containing p3. The selection of the tet resistance alone is almost as good as the selection of the amp + tet resistance. However, the appearance of spontaneous mutations in the chromosomal suppressor tRNA has an unavoidable background (frequency of approximately 10-9) in this system. Colonies arising from spontaneous mutations in the suppressor are generally larger than the clones arising from transformation with plasmids. Suppressor plasmids are typically selected in LBcontent amp 12.5 μg / ml and tet at 7.5 μg / ml. For large plasmid preparations M9 medium may be used with casamino acids containing glycerol (0.8%) as carbon source and the bacteria grown to saturation. The vector DNA can be isolated by known methods. The following method is preferred for plasmids derived from 1 liter of saturated cells:

Centrifugar as células em frascos de 1 litro J6, 4,2K rpm, 25 minutos. Ressuspender em 40 ml de 10 mM EDTA pH 8 (bater numa superfície macia). Adicionar 80 ml de 0,2M NaOH, 1% SDS, agitar até clarificar e ficar viscoso. Adicionar 40 ml de 5M 27Centrifuge the cells in 1 liter J6 bottles, 4.2K rpm, 25 minutes. Resuspend in 40 ml of 10 mM EDTA pH 8 (beat on a soft surface). Add 80 ml of 0.2M NaOH, 1% SDS, stir until clarified and viscous. Add 40 ml of 5M 27

KOAc, pH 4,7 (2,5M KOAc, 2,5M HOAc) agitar não muito fortemente (até os grumos terem 2-3 mm de tamanho). Centrifugar (mesmo tubo) 4,2K rpm, 5 minutos. Verter o sobrenadante através de gase para uma garrafa de de 250 ml. Encher a garrafa com álcool isopropí-lico. Centrifugar na J6, 4,2K rpm, 5 minutos. Decantar a garrafa, lavar suavemente com EtOH a 70% (evitar fragmentar o sedimento). Inverter a garrafa e remover vestígios de EtOH com papel absorvente. Ressuspender em 3,5 ml de Tris/EDTA 20 mM/10mM. Adicionar 3,75 ml do sedimento ressuspenso a 4,5 g de CsCl. Adicionar 0,75 ml de brometo de etídio a 10 mg/ml, misturar. Encher tubos VTÍ80 com a solução. Correr a uma velocidade de 80K rpm durante 2,5 horas ou mais. Extrair as bandas com luz vísivel usando uma seringa de l ml e uma agulha de 20 gauge ou menos. Cortar o topo do tubo, inserir a agulha inclinada para cima no tubo num ângulo de aproximadamente 30°C relativamente ao tubo, (i.e., tão inclinado quanto possível). numa posição cerca de 3mm abaixo da banda com o bisel da agulha para cima. Após remoção da banda, colocar o conteúdo do tubo em lexívia. Colocar as bandas extraídas em tubos Sarsted de 13 ml Encher o tubo até ao topo com n-butanol saturado com 1M NaCl, extrair. Se se obtiver uma grande quantidade de DNA deve-se extrair novamente. Aspirar o butanol para uma ratoeira contendo 5M NaOH (para destruir o etídio). Adicionar aproximadamente igual volume de acetato de amónio 1M ao DNA (esguicho). Centrifugar a 10K rpm, 5 min. J2-21. Lavar o sedimento cuidadosamente com etanol a 70%. Secar com zaragatoa ou liofilizador. 0 vector pode ser preparado para clonagem por métodos conhecidos. Um método preferido começa com o corte de 20 μg de vector num volume de reacção de 200 μΐ com 100 unidades de BstXI (New York Biolabs), clivando a 50°C durante a noite num banho--maria termostatizado (i.e., banho-maria com circulação de água). Preparar 2 gradientes de 5-20% KOAc em tubos SW55 como descrito atrás. Adicionar 100 μΐ do vector digerido a cada um dos tubos e correr durante 3 horas, 50K rpm a 22°C. Examinar o tubo sob luz UV de 300 nm. A banda pretendida migrará 2/3 do comprimento do tubo. Maior migração da banda significa que o gradiente está com mais material do que o devido. Remover a banda com uma seringa de 1 ml e agulha de 20 gauge. Adicionar poliacrilamida linear e precipitar o plasmídeo adicionando 3 volumes de EtOH. Ressuspen-der em 50 μΐ de TE. Fazer ligações usando uma quantidade constante de vector e quantidades crescentes de cDNAs. Com base nestes ensaios de ligação estabelecer ligação em larga escala o que pode ser conseguido por métodos conhecidos, Geralraente toda a preparação de cDNA requere 1-2 μg de vector cortado.KOAc, pH 4.7 (2.5M KOAc, 2.5M HOAc) shake not too strongly (until the lumps are 2-3 mm in size). Centrifuge (same tube) 4.2K rpm, 5 minutes. Pour the supernatant through the gas into a 250 ml bottle. Fill the bottle with isopropyl alcohol. Centrifuge at J6, 4.2K rpm, 5 minutes. Decant the bottle, wash gently with 70% EtOH (avoid fragmenting the pellet). Invert the bottle and remove traces of EtOH with absorbent paper. Resuspend in 3.5 ml of 20 mM Tris / EDTA / 10mM. Add 3.75 ml of the resuspended pellet to 4.5 g of CsCl. Add 0.75 ml of 10 mg / ml ethidium bromide, mix. Fill VTÍ80 tubes with the solution. Run at a speed of 80K rpm for 2.5 hours or more. Extract the bands with visible light using a 1 ml syringe and a 20 gauge needle or less. Cut the top of the tube, insert the needle inclined up into the tube at an angle of approximately 30 ° C relative to the tube, (i.e., as sloped as possible). in a position about 3mm below the band with the needle bevel up. After removing the band, place the contents of the tube in lexívia. Place the extracted strips in 13 ml Sarsted tubes Fill the tube to the top with 1M NaCl saturated n-butanol, extract. If a large amount of DNA is obtained, it must be extracted again. Aspirate the butanol to a trap containing 5M NaOH (to destroy the ethidium). Add approximately equal volume of 1M ammonium acetate to the DNA (squirt). Centrifuge at 10K rpm, 5 min. J2-21. Wash the pellet thoroughly with 70% ethanol. Dry with a swab or lyophilizer. The vector may be prepared for cloning by known methods. A preferred method begins with cutting 20 μg of vector in a 200 μ reaction volume with 100 units of BstXI (New York Biolabs), cleaving at 50 ° C overnight in a thermostated water bath (ie, water bath with water circulation). Prepare 2 gradients of 5-20% KOAc in SW55 tubes as described above. Add 100 μl of the digested vector to each of the tubes and run for 3 hours, 50K rpm at 22 ° C. Examine the tube under 300nm UV light. The desired band will migrate 2/3 of the length of the tube. Increased bandwidth migration means that the gradient is more material than due. Remove the band with a 1 ml syringe and 20 gauge needle. Add linear polyacrylamide and precipitate the plasmid by adding 3 volumes of EtOH. Resuspend in 50 μΐ TE. Make links using a constant amount of vector and increasing amounts of cDNAs. Based on these binding assays establish large-scale binding which can be achieved by known methods. Generally the entire cDNA preparation requires 1-2 μg of cut vector.

Os adaptadores podem ser preparados por métodos conhecidos, mas prefere-se ressuspender os adaptadores brutos numa concentração de 1 μg/μl. adicionar MgS04 para 10 mM e precipitar pela adição de 5 volumes de EtOH. Lavar com EtOH a 70% e ressuspender em TEnuma concentração de lμg/μl. Para desfosforilar tomar 25 μΐ de adaptadores ressuspensos, adicionar 3 μΐ de tampão de desfosforilação lOx e 20 unidades de quinase; incubar a 37°C durante a noite. A preparação dos tampões referidos na descrição atrás dos métodos preferidos de acordo com o presente invento serão evidentes para os familiarizados com a área. Por conveniência as composições preferidas dos tampões são as seguintes:The adapters may be prepared by known methods, but it is preferred to resuspend the crude adapters at a concentration of 1 μg / μl. add MgSO4 to 10 mM and precipitate by the addition of 5 volumes of EtOH. Wash with 70% EtOH and resuspend in TE at a concentration of 1 μg / μl. To dephosphorylate take 25 μΐ of resuspended adapters, add 3 μ l of 10-dephosphorylation buffer and 20 units of kinase; incubate at 37 ° C overnight. The preparation of the buffers referred to in the description behind the preferred methods according to the present invention will be apparent to those familiar with the area. For convenience the preferred compositions of the buffers are as follows:

Tampão de aplicação: 0,5M LiCl, 10mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA 0,1% SDS. Tampão de lavagem: 0,15M LiCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA 0,1% SDS. Tampão Rtl: 0,25 M Tris pH 8,8 (8,2 a 42°C), 0,25M KC1, 30 mM MgCl2· Tampão Rt2: 0,1M Tris pH 7,5, 25 mM MgCl2, 0,5M KC1, 0,25 mg/ml BSA, 50 mM DTT. Sais baixos lOx: 60 mM Tris pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 2,5 mg/ml BSA, 70 mM Me.Application buffer: 0.5M LiCl, 10mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA 0.1% SDS. Wash Buffer: 0.15M LiCl, 10mM Tris pH 7.5, 1mM EDTA 0.1% SDS. Rt1 Buffer: 0.25 M Tris pH 8.8 (8.2 at 42 ° C), 0.25M KCl, 30 mM MgCl 2 · Buffer Rt 2: 0.1M Tris pH 7.5, 25 mM MgCl 2, 0.5M KCl, 0.25 mg / ml BSA, 50 mM DTT. Low Salts 10x: 60 mM Tris pH 7.5, 60 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 2.5 mg / mL BSA, 70 mM MeOH.

Adições de ligação lOx: lmM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 10 mMAdditions of 10x binding: 1 mM ATP, 20 mM DTT, 1 mg / mL BSA, 10 mM

Tampão de desfosforilação lOx: espermidina. 0,5M Tris pH 7,5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, lOmM espermidina, 1 mg/mlBSA 100 mM MgCl2.Deoxyphosphorylation buffer 10x: spermidine. 0.5M Tris pH 7.5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, 10 mM Spermidine, 1 mg / ml BSA 100 mM MgCl 2.

Por "vector" pretende-se significar uma molécula de DNA, derivada de um plasmídeo ou bacteriofago, na qual podem ser inseridos ou clonados fragmentos de DNA. Um vector conterá um ou mais sítios de restrição únicos e podem ser capazes de replicação autónoma num hospedeiro definido ou organismo veículo de tal forma que a sequência clonada é reprodutível. Assim, por "vector de expressão de DNA" pretende-se significar qualquer elemento autónomo capaz de se replicar num hospedeiro independentemente do cromossoma do hospedeiro após sequências adicionais de DNA terem sido incorporadas no genoma do elemento autónomo. Tais vectores de expressão incluem plasmídeos bacterianos e fagos.By " vector " is meant a DNA molecule, derived from a plasmid or bacteriophage, into which DNA fragments may be inserted or cloned. A vector will contain one or more unique restriction sites and may be capable of autonomous replication in a defined host or carrier organism in such a way that the cloned sequence is reproducible. Thus, by " DNA expression vector " is meant any autonomous element capable of replicating in a host independently of the host chromosome after additional DNA sequences have been incorporated into the genome of the autonomous element. Such expression vectors include bacterial plasmids and phages.

No entanto, são preferidos para fins do presente invento vectores virais tais como os derivados do vírus símio 40 (SV40). SV40 é um papovavírus tendo um peso molecular de 28 Mdal e contem uma molécula de DNA de cadeia dupla circular tendo um peso molecular de 3 Mdal, a qual compreende todo o genoma do vírus. Toda a sequência de nucleõtidos desta pequena molécula de DNA circular covalentemente fechada foi sequenciada. Fiers et al.. Nature 273:113-120 (1978); Reddy et al.. Science 200:494-502 (1978). O DNA virai do SV40 pode ser obtido em grandes quantidades e as regiões genómicas responsáveis pelas várias funções virais foram localizadas com precisão em relação a um mapa físicodetalhado do DNA. Fiers et al.. supra; Reddy et al.. supra. 0 genoma virai do SV40 pode multiplicar-se vegetativamente ou como uma parte integral dos cromossomas celulares e existe muita informação sobre a replicação e expressão deste genoma.However, viral vectors such as those derived from simian virus 40 (SV40) are preferred for purposes of the present invention. SV40 is a papovavirus having a molecular weight of 28 Mdal and contains a circular double stranded DNA molecule having a molecular weight of 3 Mdal, which comprises the entire genome of the virus. The entire nucleotide sequence of this small covalently closed circular DNA molecule was sequenced. Fiers et al., Nature 273: 113-120 (1978); Reddy et al., Science 200: 494-502 (1978). SV40 viral DNA can be obtained in large quantities and the genomic regions responsible for the various viral functions have been precisely located to a physically detailed map of the DNA. Fiers et al. Supra; Reddy et al., Supra. The SV40 viral genome may multiply vegetatively or as an integral part of the cellular chromosomes and there is a great deal of information about the replication and expression of this genome.

Também são preferidos para fins do presente invento um veículo de clonagem bacteriófago de cadeia dupla, designado M13, tendo um genoma de DNA circular fechado de aproximadamente 6,5 Kb. Uma vantagem da utilização de M13 como veículo de clonagem é que as partículas fágicas libertadas a partir de células infectadas contêm DNA de cadeia simples homólogo de apenas uma das duas cadeias complementares do DNA clonado, o qual pode pois ser usado como molde para análise de sequenciação de DNA. São ainda mais preferidos para fins do presente invento os vectores de expressão designados piH3, pÍH3M e CDM8, depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. piH3M e CDM8, depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 31Also preferred for purposes of the present invention are a double-stranded bacteriophage cloning vehicle designated M13 having a closed circular DNA genome of approximately 6.5 Kb. One advantage of using M13 as a cloning vehicle is that the phage particles released from infected cells contain single stranded DNA homologous to only one of the two complementary strands of the cloned DNA, which can therefore be used as a template for sequencing analysis of DNA. Further preferred for the purposes of the present invention are the expression vectors designated p1H3, pH3M and CDM8, deposited with the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. pIH3M and CDM8, deposited with the American Type Culture Collection ( ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 31

MD 20852. piH3 foi depositado na ATCC era 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67634. piH3M foi depositado na ATCC em 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67633. CDM8 foi depositado na ATCC em 24 de Fevereiro de 1988 e tem o número de acesso ATCC 67635.MD 20852. PiH 3 was deposited with the ATCC on February 24, 1988 and has accession number ATCC 67634. PiH3M was deposited with the ATCC on February 24, 1988 and has the accession number ATCC 67633. CDM8 was deposited with the ATCC in 24 of February 1988 and has the accession number ATCC 67635.

Por "cultura de tecidos" pretende-se sugnificar a manutenção ou crescimento de células de tecidos animais in vitro de forma a permitir posterior diferenciação e preservação da arquitectura celular ou função ou ambas. "Células de tecidos primárias" são as que derivam directamente de uma população consistindo em células do mesmo tipo desempenhando a mesma função num organismo. 0 tratamento de tais células em cultura de tecidos com a enzima proteolítica tripsina, por exemplo, dissocia-as em células de tcidos primárias individuais que crescem bem quando semeadas em placas de cultura em densidades elevadas. As culturas celulares que derivam da multiplicação de células primárias em cultura de tecidos são designadas "culturas de células secundárias". A maior parte das células secundárias dividem-se um número finito de vezes e depois morrem. No entanto, algumas células secundárias podem passar este "período de crise", após o que são capazes de se multiplicar indefinitivamente para formar uma "linha celular contínua". As linhas celulares muitas vezes contêm cromossomas extra e geralmente são também anormais noutros aspectos. A imortalidade destas células é uma característica partilhada com as células cancerosas.By " tissue culture " it is intended to provide for the maintenance or growth of cells from animal tissues in vitro in order to allow subsequent differentiation and preservation of the cellular architecture or function or both. " Primary tissue cells " are those derived directly from a population consisting of cells of the same type performing the same function in an organism. Treatment of such tissue culture cells with the proteolytic enzyme trypsin, for example, dissociates them into individual primary cell cells that grow well when sown on culture plates at high densities. Cell cultures derived from the multiplication of primary cells in tissue culture are termed " secondary cell cultures ". Most of the secondary cells divide a finite number of times and then die. However, some secondary cells may pass through this " crisis period ", after which they are able to multiply indefinitely to form a " continuous cell line ". Cell lines often contain extra chromosomes and are also usually abnormal in other respects. The immortality of these cells is a feature shared with cancer cells.

As linhas celulares preferidas para usar com células em cultura de tecidos de acordo com o presente invento incluem a linha de células de rim de macaco "COS". As células COS são as que foram transformadas por DNA de SV40 contendo uma região de genes precoces funcionais mas uma origem de replicação do DNA virai defectiva. 0 clone M6 das células COS é particularmente 32Preferred cell lines for use with tissue culture cells according to the present invention include the monkey kidney cell line " COS ". COS cells are those that have been transformed by SV40 DNA containing a region of functional early genes but an origin of defective viral DNA replication. The M6 clone of the COS cells is particularly 32

preferido para usar de acordo com o método do invento. São também preferidos para fins do presente invento células de murganho "WOP", as quais são células NIH 3T3 transfectadas com DNA de polioma com uma delecção da origem. 0 cDNA pode ser introduzido nas células hospedeiras em cultura de tecidos do presente invento por quaisquer métodos conhecidos. A transfecção pode ser conseguida por exemplo por fusão de protoplastos, por fusão de esfero-plastos ou pelo método do DEAE dextrano (Sussman et al.. Cell Biol. 4:1641-1643 (1984)). ipreferred for use according to the method of the invention. Also preferred for the purposes of the present invention are WOP " mouse cells ", which are NIH 3T3 cells transfected with polyoma DNA with a deletion of the origin. The cDNA can be introduced into the tissue culture host cells of the present invention by any known methods. Transfection can be achieved for example by protoplast fusion, spheroplast fusion or the DEAE dextran method (Sussman et al., Cell Biol. 4: 1641-1643 (1984)). i

Se se empregar fusão de esferoplastos, um método preferido é a seguinte variante baseada em Sandri-Goldrin et al.. Mol. Cell Biol. 1:743-752 (1981). Resumidamente, por exemplo, uma série de seis fusões requere 100 ml de células em caldo. Crescer as células contendo o plasmídeo amplificável para DO 600=0,5 em LB. Adicionar espectinomicina para 100 ^g/ml (ou cloranfenicol para 150 ^g/ml). Continuar a incubação a 37°C com agitação durante 10-16 horas. (As células começam a lisar com incubação prolongada em meio com espectinomicina ou cloranfenicol). Centrifugar 100 ml da cultura (rotor JA14/GSA, garrafa de 250 ml) 5 minutos a 10000 rpm. Decantar bem, ressuspender o sedimento na garrafa com 5 ml de sucrose a 20% fria, 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Incubar em gelo 5 minutos. Adicionar 2 ml de 0,25M EDTA pH 8,0, incubar 5 minutos a 37°C (banho maria). Colocar em gelo, testar a percentagem de conversão em esferoplastos por microscopia. Num fluxo adicionar lentamente 20 ml de DME/10% sucrose/10 mM MgCl2 frio (gota a gota, ca. 2 gotas por segundo). Remover o meio das células semeadas no dia anterior em placas de 6 cm (50% de confluência). Adicionar 5 ml de suspensão de esferoplastos a cada placa. Colocar as placas no topo de suportes de tubos numa centrífuga basculante. De uma só vez podem ser colocadas a placas. As placas podem ser empilhadas umas sobre as outras, mas 3 numa pilha não é aconselhável pois a camada de esferoplastos na placa de cima verte ou descola-se após centrifugação. Centrifugar a lOOOxg 10 min. A força é calculada com base no raio da placa do fundo. Aspirar o fluido das placas cuidadosamente. Pipetar 1,5-2 ml de PE6 a 50% (p/p) (ou PEG 1000) /50% DME (sem soro) sobre o centro da placa, se necessário, andar com a ponta da pipeta à volta para assegurar que o PEG se espalha uniformemente e radialmente por toda a placa. Após a adição de PEG à última placa inclinar todas as placas sobre as suas tampas de forma a que a solução de PEG venha para o fundo. Aspirar o PEG. A camada fina de PEG residual que fica nas células é suficiente para promover a fusão; é melhor retirar a camada de PEG por lavagem e pode-se obter melhor viabilidade celular, do que se deixar o grosso do PEG. Após 90 a 120 segundos (PEG 1000) ou 120 a 150 segundos (PEG 1450) de contacto com a solução de PEG, pipetar 1,5 ml de DME(sem soro) para o centro da placa. A camada de PEG será espalhada radialmente pelo DME. Inclinar as placas e aspirar. Repetir a lavagem com DMEM. Adicionar 3 ml de DME/10% soro contendo 15 gg/mp de sulfato de gentamicina. Incubar 4-6 horas numa estufa. Remover o meio e a suspensão de bactérias residuais adicionar mais meio e incubar 2-3 dias. Lavagem extensiva da camada de células para remover o PEG tende a remover muitas das células sem qualquer benefício substancial. Se as células sedimentarem numa segunda lavagem com DMEM durante alguns minutos, a maior parte da camada de esferoplastos descolará espontaneamente; no entanto prefere-se lavar rapidamente e deixar que a camada descole em meio completo a 37°C. A solução de PEG pode ser convenientemente preparada fundindo uma garrafa fresca de PEG a 60°C e vertendo aproximada-mente quantidades de 50 ml por meio de um tubo de centrífuga de 50 ml para garrafas previamente pesadas. 0 PEG distribuído é guardado a 5°c no escuro. Para reconstituir uma garrafa fresca, pesar a quantidade, fundir novamente e adicionar um volume igual 34If fusion of spheroplasts is employed, a preferred method is the following variant based on Sandri-Goldrin et al. Mol. Cell Biol. 1: 743-752 (1981). Briefly, for example, a series of six fusions requires 100 ml of cells in broth. Grow the cells containing the amplifiable plasmid to OD 600 = 0.5 in LB. Add spectinomycin to 100æg / ml (or chloramphenicol to 150æg / ml). Continue incubation at 37 ° C with shaking for 10-16 hours. (Cells start to lyse with prolonged incubation in medium with spectinomycin or chloramphenicol). Centrifuge 100 ml of the culture (JA14 / GSA rotor, 250 ml bottle) 5 minutes at 10,000 rpm. Decant well, resuspend the pellet in the bottle with 5 ml of cold 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.0. Incubate on ice 5 minutes. Add 2 ml of 0.25M EDTA pH 8.0, incubate 5 minutes at 37øC (water bath). Place on ice, test the percentage conversion into spheroplasts by microscopy. In a stream, slowly add 20 ml of DME / 10% sucrose / 10 mM cold MgCl 2 (dropwise, ca. 2 drops per second). Remove the medium from the cells seeded the previous day in 6 cm dishes (50% confluence). Add 5 ml of spheroplast suspension to each plate. Place the plates on top of tube supports in a tilting centrifuge. At one time they can be plated. The plates may be stacked on top of each other, but in a stack it is not advisable because the spheroplast layer on the top plate sheds or takes off after centrifugation. Centrifuge at 10000xg 10 min. The force is calculated based on the radius of the bottom plate. Aspirate the fluid from the plates carefully. Pipette 1.5-2 ml of 50% (w / w) PE6 (or PEG 1000) / 50% DME (serum free) onto the center of the plate, if necessary, walk with the tip of the pipette around to ensure that the PEG spreads evenly and radially across the entire plate. After the addition of PEG to the last plate, tilt all plates over their caps so that the PEG solution comes to the bottom. Aspirate the PEG. The thin layer of residual PEG remaining in the cells is sufficient to promote fusion; it is better to remove the PEG layer per wash and better cell viability can be achieved than to leave the bulk of the PEG. After 90 to 120 seconds (PEG 1000) or 120 to 150 seconds (PEG 1450) contact with the PEG solution, pipette 1.5 ml of DME (without serum) to the center of the plate. The PEG layer will be spread radially by the DME. Tilt the plates and inhale. Repeat washing with DMEM. Add 3 ml of DME / 10% serum containing 15 g / g gentamicin sulfate. Incubate for 4-6 hours in an oven. Remove medium and suspension of residual bacteria add more medium and incubate 2-3 days. Extensive washing of the cell layer to remove PEG tends to remove many of the cells without any substantial benefit. If the cells sediment in a second wash with DMEM for a few minutes, most of the spheroplast layer will spontaneously detach; however, it is preferred to rinse quickly and allow the layer to peel off in complete medium at 37øC. The PEG solution can be conveniently prepared by melting a fresh bottle of PEG at 60øC and pouring approximately 50 ml quantities by means of a 50 ml centrifuge tube for pre-weighed bottles. The distributed PEG is stored at 5 ° C in the dark. To reconstitute a fresh bottle, weigh the quantity, merge again and add an equal volume

de DME (sem soro). Ajusttar o pH com solução de bicarbonato de sódio a 7,5% se necessário e esterilizar por filtração. A solução de PEG resultante pode ser guardada até 3 meses à temperatura ambiente sem consequências adversas detectáveis. iof DME (without serum). Adjust the pH with 7.5% sodium bicarbonate solution if necessary and sterilize by filtration. The resulting PEG solution can be stored for up to 3 months at room temperature with no detectable adverse consequences. i

As células hospedeiras ttransfectadas serão cultivadas de acordo com o invento de forma a conseguir-se expressão da proteína codificada pelo clone de cDNA e a aumentar os números absolutos de células disponíveis para subsequente imuno-selecção. Os familiarizados com a matéria conhecerão métodos e meios adequados a esta finalidade, tendo em consideração o tipo de células e outras variáveis normalmente consideradas. As células COS, por exemplo, podem ser cultivadas em meio de Eagle modificação de Dulbecco (DME) suplementado com 10% de soro fetal e sulfato de gentamicina. A expressão transitória de células transfectadas normalmente pode-se esperar entre 48 e 72 horas após a transfecção. No entanto, este período de tempo pode variar dependendo do tipo ou estirpe da célula hospedeira usada e das condições da cultura celular, como será aparente para os familiarizados com a matéria.The transfected host cells will be cultured according to the invention in order to achieve expression of the protein encoded by the cDNA clone and to increase the absolute numbers of cells available for subsequent immunoscreening. Those familiar with the subject will know methods and means suitable for this purpose, taking into account the type of cells and other variables normally considered. COS cells, for example, can be cultured in Dulbecco's Eagle Modification Medium (DME) supplemented with 10% fetal serum and gentamicin sulfate. Transient expression of transfected cells can usually be expected between 48 and 72 hours post-transfection. However, this time period may vary depending on the type or strain of the host cell used and the conditions of the cell culture, as will be apparent to those skilled in the art.

Imunoprecipitação, transferência e sequenciação de cDNA dos genes clonados de acordo com os métodos do presente invento podem ser realizados por meios convenientes conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, prefere-se o protocolo de imunoprecipitação de Clark et al.. Leukocvte Τνοΐηα II. Vol. II, pp. 155-167 (1986). Podem ser empregues Southern, Northern ou outros métodos de análise de transferências conhecidos dos familiarizados com a matéria, usando sondas de hibridação preparadas por métodos conhecidos, tais como os de Hu et al. (Gene 18:271-277 (1982)). A sequenciação de cDNA também pode ser conseguida por métodos conhecidos, incluindo o método de didesoxinucleótidos de Sanger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USAI 74i5463-5467 (1977).Immunoprecipitation, transfer and cDNA sequencing of the cloned genes according to the methods of the present invention may be carried out by convenient means known to those skilled in the art. For example, the immunoprecipitation protocol of Clark et al. Leukocvte Τνοΐηα II is preferred. Vol. 155-167 (1986). Southern, Northern or other transfer analysis methods known to those skilled in the art may be employed using hybridization probes prepared by known methods such as Hu et al. (Gene 18: 271-277 (1982)). Sequencing of cDNA can also be achieved by known methods, including the dideoxynucleotide method of Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Know. (USAI 74: 543-5467 (1977)).

Os anticorpos usados de acordo com o presente invento podem ser policlonais ou monoclonais. Estes podem ser usados isoladamente ou juntamente com outros anticorpos policlonais ou monoclonais para efectuar a imuno-selecção de células expressando o antigénio ou antigénios pretendidos pelos métodos do presente invento. Os métodos de preparação de anticorpos ou seus fragmentos parausar de acordo com o presente invento são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria.Antibodies used in accordance with the present invention may be polyclonal or monoclonal. These may be used alone or together with other polyclonal or monoclonal antibodies to effect the immuno-screening of cells expressing the antigen or antigens desired by the methods of the present invention. Methods of preparing antibodies or fragments thereof according to the present invention are well known to those skilled in the art.

Trabalhos de referência convencionais estabelecendo os princípios gerais de imunologia incluem Klein, J., Immunolocrv: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, editor, New York (1982); Kennett, R. et al. eds., Monoclonal Antibodies, Hvbridoma: A New Dimension in Biological Analvsis. Plenum Press, editor, New York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology" em Burden, R., et al.. eds., laboratory Techniques in Biochemistrv and Molecular Bioloqy. Vol.13, Elsevere, aditor, Amsterdam (1984). 0 termo "anticorpo" pretende incluir a molécula intacta assim como seus fragmentos, tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab)»2f os quais também são capazes de se ligar ao antigénio. As preparações de anticorpos policlonais podem ser derivadas directamente do sangue da espécie animal pretendida apôs imunização com o antigénio de interesse ou um seu fragmento, usando qualquer um dos protocolos convencionais conhecidos dos familiarizados com a matéria. De forma semelhante, os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos connhecidos (Kohler et al.. Eur. J. Immunol.. 6:292 (1976)). Prefere-se a utilização de anticorpos monoclonais para fins do presente invento.Conventional reference works setting out the general principles of immunology include Klein, J., Immunolocrv: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, ed., New York (1982); Kennett, R. et al. eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analvsis. Plenum Press, ed., New York (1980); Campbell, A., " Monoclonal Antibody Technology " in Burden, R., et al., eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Vol.13, Elsevere, Aditor, Amsterdam (1984). The term " antibody " is intended to include the intact molecule as well as fragments thereof, such as, for example, Fab and F (ab) 2 fragments which are also capable of binding to the antigen. Polyclonal antibody preparations may be derived directly from the blood of the desired animal species upon immunization with the antigen of interest or a fragment thereof using any of the standard protocols known to those skilled in the art. Similarly, the monoclonal antibodies can be prepared using methods known (Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6: 292 (1976)). The use of monoclonal antibodies for purposes of the present invention is preferred.

Para fins de imuno-selecção de acordo com o presente invento, as células hospedeiras em cultura de tecidos que foram expostas a anticorpos dirigidos contra o antigénio de superfície da célula alvo são separadas das células hospedeiras que não expressam o antigénio alvo distribuindo as células num substrato revestido com anticorpo dirigido contra anticorpo contra o antigénio. Esta técnica, designada "panning" será conhecida dos familiarizados com a matéria e está descrita por exemplo por Mage et al.. J. Immunol. Meth. 15:47-56 (1977) e Wysocki e sato, Proc. Natl Acad. Sei. USA^ 75:2844-2848 (1978). "Panning” de acordo com os métodos do presente invento pode ser realizado como se segue: a. Placas revestidas com anticorpos. Podem ser usadas placas bacteriológicas de 60 mm, Falcon 1007 ou equivalentes ou placas de 10 cm tais como as Fisher 8-757-12. Anticorpo de carneiro anti-murganho purificado por afinidade (por exemplo da CooperBiomedical (Cappell)) foi diluido para 10/zg/ml em 50 mM Tris HC1, pH 9,5. Adicionar 3 ml por placa de 6 cm ou 10 ml por placa de 10 cm. Deixar em repouso ca. 1,5 horas, remover para a placa seguinte às 1,5 horas e depois para uma terceira placa. Lavar as placas 3x com 0,15M NaCl (é conveniente uma garrafa de lavagem para isto), incubar com 3 ml de 1 mg/ml BSA em PBS durante a noite, aspirar e congelar. b. "Panning". As células estarão em placas de 60 mm. Aspirar o meio da placa, adicionar 2 ml de PBS/0,5 mM EDTA/0,02% de azida e incubar as placas a 37°C durante 30 minutos para descolar as células da placa. Triturar as células fortemente com 37\ ΛFor immuno-screening purposes according to the present invention, tissue culture host cells that have been exposed to antibodies directed against the surface antigen of the target cell are separated from the host cells that do not express the target antigen by delivering the cells on a substrate coated with antibody directed against antibody against the antigen. This technique, called " panning " will be known to those skilled in the art and is described, for example, by Mage et al., J. Immunol. Meth. 15: 47-56 (1977) and Wysocki and Sato, Proc. Natl Acad. Know. USA 75: 2844-2848 (1978). " Panning " according to the methods of the present invention can be carried out as follows: a. Plates coated with antibodies. Bacteriological plaques of 60 mm, Falcon 1007 or equivalent or 10 cm plates such as Fisher 8-757-12 may be used. Affinity-purified sheep anti-mouse antibody (for example CooperBiomedical (Cappell)) was diluted to 10 μg / ml in 50 mM Tris-HCl pH 9.5. Add 3 ml per 6 cm dish or 10 ml per 10 cm dish. Let stand at ca. 1.5 hours, remove to the next plate at 1.5 hours and then to a third plate. Wash the plates 3x with 0.15M NaCl (a wash bottle is convenient for this), incubate with 3 ml of 1 mg / ml BSA in PBS overnight, aspirate and freeze. B. " Panning ". The cells will be in 60 mm plates. Aspirate the medium from the plate, add 2 ml of PBS / 0.5 mM EDTA / 0.02% azide and incubate the plates at 37 ° C for 30 minutes to peel the cells from the plate. Triturate the cells strongly with 37 Λ

uma pipeta de pasteur curta e colher as células de cada placa num tubo de centrífuga. Centrifugar 4 min. marcando 2,5 (200 xg) (demora 5 minutos). Ressuspender as células em 0,5-1,0 ml de PBS/EDTA/azida/5%FBS e adicionar os anticorpos. Incubar pelo menos 30 minutos em gelo. Adicionar igual volume de PBS/EDTA/-azida, colocar cuidadosamente sobre 3 ml de PBS/EDTA/azida/2% Ficoll e centrifugar 4 min. marcando 2,5. Aspirar o sobrenadante suavemente. Ressupender as células em 0,5 ml de PBS/EDTA/azida e adicionar pequenas quantidades a placas revestidas com anticorpos contendo 3 ml de PBS/EDTA/azida/5%FBS pipetando através de um filtro de 100 micron de Nylon (Tetko). Adicionar células no máximo de duas placas de 60 mm a uma placa de 60 mm revestida com anticorpo. Deixar em repouso à temperatura ambiente ambiente 1-3 horas, remover o excesso de células que não aderiram à placa por lavagem suave com PBS/5% soro ou com meio. 2 ou 3 lavagens de 3 ml são geralmente suficientes. c. Sobrenadante de Hirt. Uma variante preferida do método de Hirt, J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967) é como se segue: Adicionar 0,4 ml de 0,6% SDS, 10 mM EDTA a uma placa revestida contendo células aderentes. Deixar em repouso 20 minutos (1 min. pode ser suficiente se praticamente não existirem células na placa). Pipetar a mistura viscosa para um microtubo. Adicionar 0,1 ml de 5M NaCl, misturar, colocar em gelo pelo menos 5 horas. Mantendo tão frio quanto possível parece melhorar a qualidade do Hirt. Centrifugar 4 min., remover o sobrenadante cuidadosamente, extrair com fenol (duas vezes se a primeira inrterface não estiver limpa), adicionar 10 μg de poliacrilamida linear (ou outro veículo), encher o tubo até cima com EtOH, precipitar e ressuspender em 0,1 ml. Adicionar 3 volumes de EtOH/NaOAc, precipitar novamente e ressuspender em 0,1 ml. Transformar MC106l/p3, de preferência usando o protocolo de alta eficácia descrito a seguir. Se o volume de DNA exceder 2% da quantidade de células competentes, a eficácia de transformação baixará. 5% dá o mesmo número de colónias de 2,5% (metade da eficácia).a short pasteur pipette and scoop the cells from each plate into a centrifuge tube. Centrifuge 4 min. scoring 2.5 (200 xg) (delay 5 minutes). Resuspend the cells in 0.5-1.0 ml PBS / EDTA / azide / 5% FBS and add the antibodies. Incubate for at least 30 minutes on ice. Add equal volume of PBS / EDTA / -azide, carefully place over 3 ml of PBS / EDTA / azide / 2% Ficoll and centrifuge 4 min. scoring 2.5. Aspirate the supernatant gently. Resuspend the cells in 0.5 ml of PBS / EDTA / azide and add small amounts to antibody-coated plates containing 3 ml of PBS / EDTA / azide / 5% FBS by pipetting through a 100 micron Nylon (Tetko) filter. Add cells at most two 60 mm plates to a 60 mm plate coated with antibody. Allow to stand at room temperature for 1-3 hours, remove excess cells that did not adhere to the plate by gentle washing with PBS / 5% serum or medium. 2 or 3 3 ml washes are generally sufficient. W. Supernatant of Hirt. A preferred variant of the method of Hirt, J. Molec. Biol. 26: 365-369 (1967) is as follows: Add 0.4 ml of 0.6% SDS, 10 mM EDTA to a coated plate containing adherent cells. Allowing to stand for 20 minutes (1 min may be sufficient if there are virtually no cells on the plate). Pipette the viscous mixture into a microtube. Add 0.1 ml of 5M NaCl, mix, place on ice for at least 5 hours. Keeping it as cold as possible seems to improve the quality of Hirt. Centrifuge for 4 min, remove the supernatant carefully, extract with phenol (twice if the first interface is not cleaned), add 10 μg linear polyacrylamide (or other vehicle), fill the tube with EtOH, precipitate and resuspend at 0 , 1 ml. Add 3 volumes of EtOH / NaOAc, precipitate again and resuspend in 0.1 ml. Transform MC106l / p3, preferably using the high-efficiency protocol described below. If the DNA volume exceeds 2% of the amount of competent cells, the transformation efficiency will drop. 5% gives the same number of colonies 2.5% (half efficacy).

Para este aspecto do presente invento prefere-se usar "bloqueadores" no meio de incubação. Os bloqueadores asseguram que proteínas inespecíficas, proteases ou anticorpos presentes não se liguem ou destruam os anticorpos presentes no substrato ou na superfície da célula hospedeira, para dar resultados falsos positivos ou falsos negativos. A seleção dos bloqueadores pode melhorar substancialmente a especificidade do passo de imunose-lecção do presente invento. Pode-se usar como bloqueadores uma série de anticorpos monoclonais inespecíficos, por exemplo, da mesma classe ou subclasse (isotipo) dos usados no passo de imuno-selecção (e.g., IgGi, IgG2A, IgGm, etc.). A concentração dos bloqueadores é importante para manter a sensibilidade adequada ainda que inibindo a interferência indesejável. Os familiarizados com a matéria reconhecerão que o sistema tampão usado para incubação pode ser seleccionado para optimizar a acção de blo-queamento e diminuir a ligação inespecífica.For this aspect of the present invention it is preferred to use " blockers " in the incubation medium. Blockers ensure that non-specific proteins, proteases or antibodies present do not bind or destroy the antibodies present on the substrate or the surface of the host cell, to give false positive or false negative results. Selection of the blockers can substantially improve the specificity of the immunoassay step of the present invention. A series of non-specific monoclonal antibodies, for example, of the same class or subclass (isotype) as those used in the immuno-screening step (e.g., IgG1, IgG2A, IgGm, etc.) may be used as a blocker. The concentration of the blockers is important to maintain adequate sensitivity while still inhibiting undesirable interference. Those skilled in the art will recognize that the buffer system used for incubation may be selected to optimize the blocking action and decrease nonspecific binding.

Uma população de células a ser "panned" relativamente às que expressam o antigénio de superfície celular alvo é primeiro descolada da sua placa de cultura de tecidos (colhida) sem tripsina. As células são então expostas a um primeiro anticorpo, o qual pode ser policlonal ou monoclonal, dirigido contra o antigénio de interesse ou contra uma família de genes relacionados. Nesta fase inicial pode-se usar um único anticorpo ou um grupo de anticorpos, a escolha dependendo da natureza do antigénio alvo, da sua frequência prevista e outras variáveis que serão aparentes para os familiarizados com a matéria. Os antigénios alvo expressos nas superfícies de células hospedeiras formarão vun complexo antigénio-anticorpo.A population of cells to be " panned " relative to those expressing the target cell surface antigen is first detached from its (harvested) tissue culture plate without trypsin. The cells are then exposed to a first antibody, which may be polyclonal or monoclonal, directed against the antigen of interest or against a family of related genes. At this initial stage, a single antibody or a group of antibodies may be used, depending on the nature of the target antigen, its predicted frequency and other variables which will be apparent to those skilled in the art. Target antigens expressed on the surfaces of host cells will form an antigen-antibody complex.

As células são subsequentemente colocadas em aposição estreita a um substrato, como seja uma placa de cultura de tecidos, disco de filtro ou similares, que previamente foi revestida com um segundo anticorpo ou grupos de anticorpos. Este segundo anticorpo será dirigido contra o primeiro anticorpo e a sua escolha será uma questão decidida pelos utilizadores ditada por exemplo pelo animal em que foi induzido o primeiro anticorpo. Por exemplo, se o primeiro anticorpo for induzido em murganhos, o segundo anticorpo deve ser dirigido contra imunoglobulinas de murganho, induzidos em cabras ou carneiros. As células expressando o antigénio alvo aderirão ao substrato através do complexo formado entre o antigénio, primeiro anticorpo e o segundo anticorpo. As células aderentezs podem então ser separadas das células não aderentes por lavagem. 0 DNA codificador do antigénio alvo é preparado a partir de células aderentes por métodos conhecidos, tais como o de Hirt, J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967). Este DNA pode ser então usado para transformar E. coli ou outras células hospedeiras adequadas ao longo de outros ciclos de fusão e selecção, para conseguir o grau pretendido de enriquecimento .The cells are subsequently placed in close apposition to a substrate, such as a tissue culture dish, filter disc or the like, which has previously been coated with a second antibody or groups of antibodies. This second antibody will be directed against the first antibody and its choice will be a matter decided by the users dictated for example by the animal in which the first antibody was induced. For example, if the first antibody is induced in mice, the second antibody should be directed against mouse immunoglobulins, induced in goats or sheep. Cells expressing the target antigen will adhere to the substrate through the complex formed between the antigen, the first antibody and the second antibody. Adherent cells can then be separated from the non-adherent cells by washing. DNA encoding the target antigen is prepared from adherent cells by known methods, such as that of Hirt, J. Molec. Biol. 26: 365-369 (1967). This DNA can then be used to transform E. coli or other suitable host cells over other cycles of fusion and selection to achieve the desired degree of enrichment.

No caso geral, os ciclos iniciais de imuno-selecção empregarão um painel de primeiros anticorpos dirigidos contra um epítopo ou grupo de epítopos comuns à família de antigénios a que pertence o antigénio alvo. Este será suficientemente para estreitar significativamente o número de clones para futuros ciclos. Dois destes ciclos geralmente serão adequados, mas o número de ciclos pode variar como foi referido atrás. Daqui em diante é empregue um único ciclo de selecção empregando um único primeiro anticorpo ou um grupo de primeiros anticorpos que reconhecem apenas o antigénio alvo. 40In the general case, the initial immunostaining cycles will employ a panel of first antibodies directed against an epitope or group of epitopes common to the antigen family to which the target antigen belongs. This will be sufficient to significantly narrow the number of clones for future cycles. Two of these cycles will generally be suitable, but the number of cycles may vary as outlined above. Hereafter a single round of selection is employed employing a single first antibody or a group of first antibodies that recognize only the target antigen. 40

Por "substrato" pretende-se significar uma superfície sólida à qual os anticorpos podem ser ligados para imuno-selecção de acordo com o presente invento. Substratos adequados conhecidos incluem vidro, polistireno, polipropileno, dextrano, nylon e outros materiais. Podem ser usados tubos, esferas, placas de microtitulação, placas de cultura bacteriológicas e similares feitos ou revestidos com tais materiais. Os anticorpos podem ser ligados covalentemente ou fisicamente ao substrato por técnicas conhecidas, tais como ligação covalente via uma ligação araida ou éster ou por adsorção. Os familiarizados com a matéria conhecerão outros substratos e métodos adequados para imobilização de anticorpos ou serão capazes de determinar tais substratos e métodos usando não mais do que rotina de experimentação.By " substrate " is meant a solid surface to which the antibodies may be bound for immuno-screening in accordance with the present invention. Suitable suitable substrates include glass, polystyrene, polypropylene, dextran, nylon and other materials. Tubes, beads, microtiter plates, bacteriological culture plates and the like made or coated with such materials may be used. Antibodies can be covalently or physically linked to the substrate by known techniques, such as covalent attachment via an araid or ester bond or by adsorption. Those skilled in the art will know of other substrates and methods suitable for immobilizing antibodies or will be able to determine such substrates and methods using no more than routine experimentation.

A escolha das células hospedeiras em cultura de tecidos para usar de acordo com o presente invento de preferência deverá ser de forma a evitar a situação em que os anticorpos usados no "panning" reconheçam determinantes em células transfectadas. Assim, se bem que as células COS sejam preferidas para a expressão transitória de certos antigénios de superfície, são mais preferidas para as células murinas WOP. Destas últimas, células WOP 3027 são ainda mais preferidas. Células WOP permitem virtualmente que sejam utilizados todos os anticorpos pois são raras as reacções cruzadas entre anticorpos de murganho e determinantes da superfície de células de murganho. 0 tamanho da inserção da molécula de DNA recombinante deverá ser escolhido de forma a optimizar a probabilidade de obtenção de uma sequência codificadora na sua totalidade. Os familiarizados com a matéria conhecerão vários métodos pelos quais um determinação preliminar do tamanho óptimo da inserção para um dado gene pode ser feita.The choice of tissue culture host cells for use in accordance with the present invention should preferably be such as to avoid the situation where the antibodies used in " panning " recognize determinants in transfected cells. Thus, while COS cells are preferred for the transient expression of certain surface antigens, they are more preferred for murine WOP cells. Of these latter, WOP 3027 cells are even more preferred. WOP cells virtually allow all antibodies to be used since cross-reactions between mouse antibodies and mouse cell surface determinants are rare. The size of the insert of the recombinant DNA molecule should be chosen in order to optimize the probability of obtaining a coding sequence in its entirety. Those familiar with the subject will know of various methods by which a preliminary determination of the optimal insertion size for a given gene can be made.

Construção de vectores e inserção de cDNAConstruction of vectors and cDNA insertion

Os vectores adequados para expressão de cDNA em células de mamíferos em cultura de tecidos podem ser construídos por métodos conhecidos. São preferidos para fins do presente invento um vector de expressão contendo a origem de SV40. 0 vector pode conter um uma origem de transcrição sintética ou natural e o promotor da região precoce do SV40. Mesmo mais preferido é um promotor quimérico composto por sequências potenciadoras precoces imediatas de citomegalovírus humano. Várias "sequências potencia-doras" podem também ser usadas com os vectores de SV40. Estas estão descritas, por exemplo, por Banerji et al.. Cell 27:299-308 (1981); Levinson et al.. Nature 295:568-572 (1982); e Conrad et al.. Mol. Cell. Biol. 2:949-965 (1982). A inserção de cDNA nos vectores do presente invento pode ocorrer, por exemplo, por colocação de caudas homopoliméri- cas com transferase terminal. No entanto, as caudas homopolimé-ricas localizadas 5/ relativamente às inserções de cDNA pode inibir a expressão in vitro e in vivo. Assim, é preferido para fins do presente invento a utilização de sítios de clivagem invertidos idênticos separados por um pequeno segmento de DNA substituível. Tais sítios de clivagem idênticos invertidos, de preferência empregando a endonuclease de reestrição BstXI. podem ser usados em paralelo com os oligonucleótidos sintéticos de cDNA, dando os mesmos extremos do segmento substituível do vector. Desta forma, o cDNA não se pode ligar a si próprio mas pode ligar-se ao vector. Isto permite a utilização mais eficaz do cDNA e do vector.Suitable vectors for expression of cDNA in mammalian cells in tissue culture can be constructed by known methods. An expression vector containing the SV40 origin is preferred for purposes of the present invention. The vector may contain either a synthetic or a natural transcript source and the SV40 early region promoter. Even more preferred is a chimeric promoter composed of immediate early potentiating sequences of human cytomegalovirus. Various " power sequences " may also be used with the SV40 vectors. These are described, for example, by Banerji et al., Cell 27: 299-308 (1981); Levinson et al., Nature 295: 568-572 (1982); and Conrad et al., Mol. Cell. Biol. 2: 949-965 (1982). The insertion of cDNA into the vectors of the present invention may occur, for example, by placement of homopolymeric tails with terminal transferase. However, homopolymeric tails located with respect to cDNA inserts may inhibit expression in vitro and in vivo. Thus, it is preferred for purposes of the present invention the use of identical reversed cleavage sites separated by a small segment of replaceable DNA. Such reversed identical cleavage sites, preferably employing the BstXI restraint endonuclease. can be used in parallel with the synthetic cDNA oligonucleotides, giving the same ends of the substitutable segment of the vector. In this way, the cDNA can not bind itself but can bind to the vector. This allows for more efficient use of the cDNA and vector.

Uma outra realização do presente invento é a estratégia baseada em oligonucleótidos atrás descrita para promover a inserção de cDNA no vector. 0 vector piH3M do presente invento é 42Another embodiment of the present invention is the above-described oligonucleotide-based strategy for promoting cDNA insertion into the vector. The piH3M vector of the present invention is 42

preferida e emprega os sítios de endonucleases invertidos. Este vector pode conter uma origem de replicação do SV40, mas uma forma mais preferida contem uma origem de M13. Este vector, contendo a origem de M13, permite níveis elevados de expressão em células COS de sequências codificadoras colocadas sob o seu controle. Também, o tamanho pequeno e arranjo particular de sequências no plasmídeo permite níveis elevados de replicação em células COS.and employs the inverted endonuclease sites. This vector may contain an SV40 origin of replication, but a more preferred form contains an origin of M13. This vector, containing the origin of M13, allows high levels of expression in COS cells of coding sequences placed under their control. Also, the small size and particular arrangement of sequences in the plasmid allows for high levels of replication in COS cells.

Por "antigénio de superfície celular" pretende-se significar qualquer proteína que seja transportada através do sistema de membranas intracelulares para a superfície celular. Tais antigénios normalmente estão ancorados â membrana de superfície celular através de um domínio terminal carbonilo contendo aminoácidos hidrófobos que ficam na bicamada lipídica da membrana e ali exercem os seus efeitos biológicos e antigénicos. Os antigénios tais como os dos linfócitos T são particularmente adequados para a clonagem de genes pelo método do presente invento. No entanto, os antigénios de superfície celular de quaisquer células podem ser clonados de acordo com opresente método. Ainda, proteínas normalmente não expressas na superfície celular podem ser clonadas de acordo com o presente método por exemplo usando separação de células por activação de fluorescência (FACS) para enriquecer em células fixadas expressando os antigénios intracelulares.&Quot; cell surface antigen " is meant any protein that is transported through the intracellular membrane system to the cell surface. Such antigens are normally anchored to the cell surface membrane through a carbonyl terminal domain containing hydrophobic amino acids that remain in the membrane lipid bilayer and exert their biological and antigenic effects therein. Antigens such as those of T lymphocytes are particularly suitable for the cloning of genes by the method of the present invention. However, the cell surface antigens of any cells can be cloned according to the present method. In addition, proteins not normally expressed on the cell surface can be cloned according to the present method for example using cell sorting by fluorescence activation (FACS) to enrich in fixed cells expressing the intracellular antigens.

Por "substancialmente puro" pretende-se significar qualquer antigénio do presente invento ou qualquer gene codificador de tal antigénio, que esteja essencialmente livre de outros antigénios ou genes, respectivamente, ou outros contaminantes com os quais possa ser normalmente encontrado na natureza e como tal exista numa forma não encontrada na natureza. Por "derivado funcional" pretende-se significar "fragmentos", "variantes", 43By " substantially pure " is meant any antigen of the present invention or any gene encoding such antigen which is essentially free of other antigens or genes respectively or other contaminants with which it can normally be found in nature and as such exists in a form not found in nature. &Quot; functional derivative " is meant " fragments ", " variants ", 43

"análogos" ou "derivados químicos" de uma molécula. Um "fragmento" de uma molécula, como seja qualquer um dos antigénios do presente invento, pretende referir-se a qualquer sub-série de polipeptídeos da molécula. Uma "variante" de tais moléculas pretende referir-se a uma molécula natural substancialmente semelhante à totalidade da molécula ou a um seu fragmento. Um "análogo" da molécula pretende referir-se a uma molécula substancialmente semelhante à molécula na sua totalidade ou a um seu fragmento." analogs " or " chemical derivatives " of a molecule. A " fragment " of a molecule, such as any of the antigens of the present invention, is intended to refer to any sub-array of polypeptides of the molecule. A " variant " of such molecules is intended to refer to a natural molecule substantially similar to the entire molecule or to a fragment thereof. An " analog " of the molecule is intended to refer to a molecule substantially similar to the molecule in its entirety or to a fragment thereof.

Um fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico de um antigénio é referido como sendo substancialmente semelhante a um outro fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio se a sequência de aminoácidos em ambas as moléculas for substancialmente a mesma, i.e., tiver pelo menos cerca de 50% de homologia e se ambas as moléculas possuírem a uma actividade biológica semelhante. Uma sequência de nucleótidos é referida como sendo "substancialmente semelhante" a uma outra sequência de nucleótidos se ambas as sequências forem substancialmente iguais, i.e., a primeira sequência de nucleótidos codifica um fragmento um fragmento, variante, análogo, derivado químico ou antigénio tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 50% de homologia relativamente à codificada pela segunda sequência de nucleótidos e o fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio codificado pela primeira sequência de nucleótidos possuir uma actividade biológica semelhante à actividade biológica do fragmento, variante, análogo, derivado químico e/ou antigénio codificado pela segunda sequência de nucleótidos. Assim, desde que duas moléculas possuam uma actividade semelhante, elas são consideradas variantes pois esse termo é aqui usado mesmo se uma das moléculas possuir resíduos de aminoácidos não encontrados na outra, ou se a sequência de resíduos de aminoácidos não for idêntica. Tal como aqui é usado, uma molécula é referida como 44A fragment, variant, analogue and / or chemical derivative of an antigen is said to be substantially similar to another fragment, variant, analogue, chemical derivative and / or antigen if the amino acid sequence in both molecules is substantially the same, ie , has at least about 50% homology and if both molecules have a similar biological activity. A nucleotide sequence is referred to as " substantially similar " to a further nucleotide sequence if both sequences are substantially equal, ie, the first nucleotide sequence encodes a fragment a fragment, variant, analogue, chemical derivative or antigen having an amino acid sequence with at least about 50% homology to and the fragment, variant, analogue, chemical derivative and / or antigen encoded by the first nucleotide sequence has a biological activity similar to the biological activity of the fragment, variant, analogue, chemical derivative and / or antigen encoded by second nucleotide sequence. Thus, since two molecules have similar activity, they are considered variants because that term is used herein even if one of the molecules has amino acid residues not found in the other, or if the amino acid residue sequence is not identical. As used herein, a molecule is referred to as 44

sendo um "derivado químico" de uma outra molécula quando possui fracções químicas adicionais normalmente não encontradas como parte da molécula. Tais fracções podem melhorar a solubilidade da molécula, adsorção, semi-vida biológica, etc. As fracções podem alternativamente decrescer a toxicidade da molécula, eliminar ou atenuar quaisquer efeitos secundários indesejáveis da molécula, etc. As fracções capazes de mediar tais efeitos estão descritas, por exemplo em Remincrton/s Pharmaceutical Sciences. 16a edição,being a " chemical derivative " of another molecule when it has additional chemical fractions not normally found as part of the molecule. Such fractions may improve the solubility of the molecule, adsorption, biological half-life, etc. The fractions may alternatively decrease the toxicity of the molecule, eliminate or attenuate any undesirable side effects of the molecule, etc. Fractions capable of mediating such effects are described, for example in Remington's Pharmaceutical Sciences. 16th edition,

Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

II

De forma semelhante, um "derivado funcional" de um gene de qualquer um dos antigénios do presente invento pretende incluir "fragmentos", "variantes" ou "análogos" do gene, os quais podem ser "substancialmente semelhantes" na sequência de nucleó-tidos e que codificam uma molécla possuidora de actividade semelhante.Similarly, a " functional derivative " of a gene of any of the antigens of the present invention is intended to include " variants " " variants " or " analogs " of the gene, which may be " substantially similar " in the nucleotide sequence and encoding a molecule having similar activity.

JJ

Um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico é referido como possuindo "actividade biológica semelhante" a um outro antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico se o primeiro possuir actividade biológica de pelo menos 25% da do último. As actividades biológicas são aquelas operações, funções ou processos que são característicos de organismos vivos. As actividades biológicas podem também incluir a reprodução, extensão ou adaptação de processos vivos a sistemas in vitro ou não naturais, tais como a actividade biológica apresentada quando um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico é artificialmente introduzido num animal a testar para induzir a produção de anticorpos. Um antigénio, fragmento, variante, análogo e/ou derivado químico pode ter uma ou mais actividades biológicas, as actividades biológicas podem ser detectadas ou medidas por métodos ou ensaios que sejam característicos daquela actividade. Para um derivado funcional 45An antigen, fragment, variant, analogue and / or chemical derivative is referred to as having " similar biological activity " to another antigen, fragment, variant, analogue and / or chemical derivative if the former possesses biological activity of at least 25% of the latter. Biological activities are those operations, functions or processes that are characteristic of living organisms. Biological activities may also include reproduction, extension or adaptation of living processes to in vitro or non-natural systems, such as the biological activity exhibited when an antigen, fragment, variant, analogue and / or chemical derivative is artificially introduced into a test animal to induce the production of antibodies. An antigen, fragment, variant, analogue and / or chemical derivative may have one or more biological activities, biological activities may be detected or measured by methods or assays which are characteristic of that activity. For a functional derivative 45

possuir uma actividade biológica semelhante à do antigénio ele deve ter uma actividade biológica de pelo menos 25% da do antigénio conforme medido por um ensaio característico daquela actividade e que é conhecido.has a biological activity similar to that of the antigen, it must have a biological activity of at least 25% of the antigen as measured by an assay characteristic of that activity and known.

Os antigénios substancialmente puros que foram expressos por métodos do presente invento podem ser usados por métodos de ensaio de imunodiagnóstico bem conhecidos dos familiarizados com a matéria, incluindo radio-imunoensaios (EIAs) e ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISAs). As proteínas substancialmente puras do presente invento, na forma solúvel, podem ser administradas sózinhas ou em combinação com outros antigénios do presente invento ou com outros agentes, incluindo linfoquinas e monoquinas ou drogas, para o tratamento de doenças relacionadas com o sistema imune e perturbações e desordens em animais, incluindo humanos. Como exemplos de tais desordens que podem beneficiar do tratamento com as proteínas substancialmente puras do presente invento podem ser referidas doenças de imunodeficiên-cias, doenças do tipo hipersensibilidade imediata, asma, pneumo-nite de hipersensibilidade, doença de complexos imunes, vasculi-te, lupus sistémico eritematoso, artrite reumatóide, perturbações renais imunopatogénicas, inflamação aguda e crónica, anemias hemóliticas, perturbações das plaquetas, neoplasmas de células do plasma e de outras, amiloidose, doenças provocadas por parasitas, esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barre, paralisia miopá-tica aguda e subaguda, miastenia gravis, endocrinopatias imunes e rejeição de treansplantes de tecidos e orgãos, todos como descrito em Petersdorf et al.. eds., Harrison/s Principlaes of InternaiSubstantially pure antigens which have been expressed by methods of the present invention may be used by immunodiagnostic assay methods well known to those skilled in the art, including radioimmunoassays (EIAs) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). The substantially pure proteins of the present invention in soluble form may be administered alone or in combination with other antigens of the present invention or with other agents, including lymphokines and monokines or drugs, for the treatment of diseases related to the immune system and disorders and disorders in animals, including humans. As examples of such disorders which may benefit from treatment with the substantially pure proteins of the present invention may be referred to immunodeficiency diseases, diseases of the immediate hypersensitivity type, asthma, hypersensitivity pneumonitis, immune complex diseases, vasculitis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, immunopathogenic renal disorders, acute and chronic inflammation, hemolytic anemias, platelet disorders, plasma and other cell neoplasms, amyloidosis, parasitic diseases, multiple sclerosis, Guillain-Barre syndrome, myopia paralysis acute and subacute diseases, myasthenia gravis, immune endocrinopathies, and rejection of tissue and organ transplantations, all as described in Petersdorf et al., eds., Harrison / s Principles of Internal

Medicine. supra. Ver também Weir, ed., supra: Boguslaski et al.. eds., supra; e Holborow et al.. eds., supra.Medicine. above. See also Weir, ed., Supra: Boguslaski et al., Eds., Supra; and Holborow et al., eds., supra.

Quando usados em imunoterapia, os antigénios do presente invento podem ou não ser marcados com um agente terapêutico.When used in immunotherapy, the antigens of the present invention may or may not be labeled with a therapeutic agent.

Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser acoplados aos antigénios do invento para imunoterapia são drogas, radioisóto-pos, lectinas e toxinas.Examples of therapeutic agents that can be coupled to the antigens of the invention for immunotherapy are drugs, radioisotopes, lectins, and toxins.

As gamas de dosagens para a administração dos antigénios do presente invento são os suficientemente grandes para produzir o efeito imunoterapêutico, mas não tão grandes de forma a causar efeitos secundários adversos, tais como reacções cruzadas indesejáveis, reacçõea anafiláticas e similares. De um modo geral, a dosagme empregue variará com a idade, condição, sexo e grau da doença no paciente. As contraindicações (se existirem), tolerância imune e outras variáveis também afectarão a dosagem adequada. A administração pode ser parenteral, por injecção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. A administração pode também ser intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intradérmi-ca.The dosage ranges for the administration of the antigens of the present invention are sufficiently large to produce the immunotherapeutic effect, but not so great in order to cause adverse side effects, such as undesirable cross reactions, anaphylactic reactions and the like. In general, the dosage employed will vary with the patient's age, condition, sex and degree of disease. Contraindications (if any), immune tolerance, and other variables will also affect the appropriate dosage. Administration may be parenterally, by injection or by gradual infusion over time. Administration may also be intravenous, intramuscular, subcutaneous or intradermal.

As preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos oncluem polipropilenoglicol, polietile-noglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções aquosas e alcoólicas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer ou óleos fixados. Os veículos intravenosos incluem agentes de enchimento fluidos e nutrientes, agentes de enchimento electrólitos, tais como os baseados em destrose de Ringer e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes anti-microbianos, anti-oxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Tais preparações e o modo e método de as fazeer são conhecidos e estão descritos, por exemplo, em Reminaton/s Pharmaceutical Science. 16a ed., supra.Preparations for parenteral administration include aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions. Examples of non-aqueous solvents include polypropylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, aqueous and alcoholic solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer's solution or fixed oils. Intravenous vehicles include fluid and nutrient fillers, electrolyte fillers, such as those based on Ringer's destrose and the like. Preservatives and other additives may also be present, such as, for example, antimicrobial agents, anti-oxidants, chelating agents, inert gases and the like. Such preparations and the method and method of making such preparations are known and are described, for example, in Reminaton / s Pharmaceutical Science. 16th ed., Supra.

Os antigénios do presente invento podem também ser preparados como medicamentos ou cmposições farmacêuticas compreendendo os antigénios, sozinhos ou em combinação com outros antigénios ou outros agentes tais como linfoquinas, monoquinas e drogas, os medicamentos sendo usados para terapia animal, incluindo humanos, e indicações relacionadas com o sistema imune.The antigens of the present invention may also be prepared as medicaments or pharmaceutical compositions comprising the antigens, alone or in combination with other antigens or other agents such as lymphokines, monokines and drugs, medicaments being used for animal therapy, including humans, and related indications with the immune system.

Se bem que os antigénios do presente invento possam ser administrados sozinhos prefere-se que eles sejam administrados como uma composição farmacêutica. As composições do presente invento compreendem pelo menos um antigénio ou o seu sal farma-ceuticamente aceitável, juntamente com um ou mais veículos aceitáveis e facultativamente outros agentes terapêuticos. Por "aceitável" pretende-se significar que o agente ou veículo é compatível com outros ingredientes da composição e não são prejudiciais para o paciente. As composições incluem as adequadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (incluindo bocal e sublingual), vaginal ou parenteral. As composições convenientemente podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos em farmácia. Tais métodos incluem associação do ingrediente activo com o veículo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas associando uniforme e intimamente o ingrediente activo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e dotando o produto de uma forma caso seja necessário.While the antigens of the present invention may be administered alone, it is preferred that they be administered as a pharmaceutical composition. The compositions of the present invention comprise at least one antigen or its pharmaceutically acceptable salt together with one or more acceptable carriers and optionally other therapeutic agents. By " acceptable " it is meant that the agent or carrier is compatible with other ingredients of the composition and are not harmful to the patient. The compositions include those suitable for oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), vaginal or parenteral administration. The compositions conveniently may be presented in unit dosage form and may be prepared by methods well known in the art of pharmacy. Such methods include association of the active ingredient with the carrier which constitutes one or more accessory ingredients. In general, the compositions are prepared by uniformly and intimately associating the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers or both and providing the product in a form if necessary.

As composições farmacêuticas administradas oralmente de acordo com o presente invento podem ter qualquer forma 48The orally administered pharmaceutical compositions according to the present invention may be any form

conveniente, incluindo cápsulas, saquetas ou comprimidos cada um dos quais contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo. Os pós ou grânulos são também possíveis, assim como soluções ou suspensões em líquidos aquosos ou não aquosos, ou emulsões líquidas de óleo-em-água ou emulsões líquidas de água-) -em-óleo. 0 ingrediente activo pode também ser apresentado como um bolus, eletuário ou pasta.convenient, including capsules, sachets or tablets each containing a predetermined amount of the active ingredient. The powders or granules are also possible, as are solutions or suspensions in aqueous or non-aqueous liquids, or liquid oil-in-water emulsions or liquid water-in-oil emulsions. The active ingredient may also be presented as a bolus, filler or paste.

Tendo agora descrito o invento, o mesmo será mais detalhadamente compreendido por referência aos exemplos que se seguem, os quais não pretendem de forma alguma limitar o âmbito do invento.Having now described the invention, it will be more fully understood by reference to the following examples, which are in no way intended to limit the scope of the invention.

Exemplo I Isolamento. Clonaqem Molecular e Estrutura doExample I Isolation. Clonaqem Molecular and Structure of

Anticfénio CD2 Humano O vector de expressão de cDNA piH3Human CD2 Antibody The pH3 cDNA expression vector

Construiu-se um vector de expressão para células COS a partir de piSV (Little et al.. Mol. Biol. Med. 1:473-488 (1983)) por inserção de uma unidade de transcrição sintética entre o gene do tRNA supressor e a origem do SV40. A unidade de transcrição consistiu num promotor quimérico composto por sequências poten-ciadoras precoces imediatas de AD169 do citomegalovírus humano fundidas com as sequências LTR -67 a +80 do HIV. Imediatamente a jusante da sequência LTR +80 foi inserido um poliadaptador contendo dois sítios BstXI separados por uma sequência de 350 pb; os sítios BstXI foram flanqueados por sítios Xbal. os quais também podem ser usados para excisão da inserção. A jusante do poliadaptador foram colocados os sinais de splicing do antigénio t pequeno do SV40 e de poliadenilação da região precoce do SV40 derivadas dp pSV2. A sequência de nucleótidos do vector está apresentada na Figura 1.An expression vector for COS cells was constructed from piSV (Little et al., Mol. Biol. Med. 1: 473-488 (1983)) by insertion of a synthetic transcription unit between the suppressor tRNA gene and the origin of SV40. The transcription unit consisted of a chimeric promoter composed of immediate early potentiating sequences of human cytomegalovirus AD169 fused to HIV LTR-67 to +80 sequences. Immediately downstream of the LTR +80 sequence was inserted a polyadapter containing two BstXI sites separated by a 350 bp sequence; the BstXI sites were flanked by XbaI sites. which can also be used for excision of the insert. Downstream of the polyadapter were spliced SV40 small t antigen splice signals and SV40 early region polyadenylation derived from pSV2. The nucleotide sequence of the vector is shown in Figure 1.

Construção da biblioteca de cDNAConstruction of the cDNA library

Preparou-se RNA derivado de células HPB-ALL pelo método do tiocianato de guanidinio/CsCl como descrito atrás. Preparou-se RNA poliA+ a partir do RNA total por selecção oligo dT. Maniatis et al. . Molecular Clonincr: A Laboratorv Manual, supra. Sinteti-zou-se cDNA pelo método de Gubler e Hoffman (Gene 25:263-269 (1982)). Ligaram-se adaptadores BstXI ao cDNA e os produtos de reacção foram fraccionados por centrifugação através de um gradiente de acetato de potássio de 5-20% contendo 1 mM EDTA durante 3 horas a 50r rpm num rotor SW55. Colheram-se fracções de 50RNA derived from HPB-ALL cells was prepared by the guanidinium thiocyanate / CsCl method as described above. PolyA + RNA was prepared from the total RNA by oligo dT selection. Maniatis et al. . Molecular Clonidine: A Laboratorv Manual, supra. CDNA was synthesized by the method of Gubler and Hoffman (Gene 25: 263-269 (1982)). BstXI adapters were bound to the cDNA and the reaction products were fractionated by centrifugation through a gradient of 5-20% potassium acetate containing 1 mM EDTA for 3 hours at 50rpm in a SW55 rotor. Fractions of 50

0,5 ml manualmente com uma agulha de seringa ou borboleta inserida imediatamente abaixo da curva do tubo. Fracções individuais foram precipitadas com etanol após adição de poliacrilamida linear (Strauss e Varshavsky, Cell 37:889-901 (1984)) para 20 μg/ml. As fracções contendo cDNA maior do que 700 pb foram reunidas e ligadas ao vector piH3 purificado em gradiente e digerido com BstXI.0.5 ml by hand with a syringe or butterfly needle inserted just below the curve of the tube. Individual fractions were precipitated with ethanol after addition of linear polyacrylamide (Strauss and Varshavsky, Cell 37: 889-901 (1984)) to 20 μg / ml. Fractions containing cDNA greater than 700 bp were pooled and ligated to the graded purified and digested BstXI vector piH3.

O DNA ligado foi usado para transformar E. coli MC1061/p3 tornada competente pelo seguinte protocolo: A estirpe pretendida e semeada numa placa LB. No dia seguinte uma colónia isolada é inoculada em 20 ml de caldo TYM (receita dada abaixo) num frasco de 250 ml. As células foram cultivadas até meio da fase logarítmica (Οϋροο cerca de 0,2-0,8), vertidas para um frasco de 21 contendo 100 ml de TYM e agitadas fortemente até as células crescerem para 0,5-0,9 OD, depois diluídas novamente para 500 ml no mesmo vaso. Quando as células atingem uma densidade de DO600=°f6r o frasco foi colocado num banho de água com gelo e agitado suavemente para assegurar arrefecimento rápido. Quando aBound DNA was used to transform E. coli MC1061 / p3 made competent by the following protocol: The desired strain is seeded onto an LB plate. The next day an isolated colony is inoculated into 20 ml of TYM broth (recipe given below) in a 250 ml flask. Cells were grown to mid-log phase (Οϋροο about 0.2-0.8), poured into a 21-vial containing 100 ml of TYM and shaken vigorously until the cells grew to 0.5-0.9 OD, then diluted back to 500 ml in the same pot. When the cells reached a density of OD600 = 0, the vial was placed in an ice water bath and gently shaken to ensure rapid cooling. When the

J cultura estava fria, centrifugou-se a 4,2K rpm durante 15 minutos (J6). 0 sobrenadante foi decantado e o sedimento ressuspenso em cerca de 100 ml de TfB I (abaixo) por agitação suave em gelo. Em seguida foi novamente centrifugada no mesmo frasco a 4,2K rpm durante 8 minutos (J6). 0 sobrenadante foidecantado e o sedimento ressuspenso em 20 ml de TfB II frio por agitação suave em gelo. Quantidades de 0,1 a 0,5 ml foram colocadas em microtubos previa-mente arrefecidos em azoto líquido e guardado a -70°C. Para transformação, retirou-se uma pequena quantidade, descongelou-se à temperatura ambiente só até fundir e colocou-se em gelo. O DNA foi adicionado, deixado em gelo 15-30 minutos e incubado a 37°c durante 5 minutos (6 minutos para quantidades de 0,5 ml). Em seguida as suspensões contendo DNA foram diluídas a 1:10 em LB e cultivadas durante mais 90 minutos antes de serem semeadas ou aplicação da selecção com antibiótico. Como alternativa, A mistura de transformação a que foi dado o choque térmico foi semeada directamente em placas com antibiótico nas quais foi espalhada uma camada fina (4-5 ml) de agar LB sem antibiótico imediatamente antes da sementeira.The culture was cold, centrifuged at 4.2K rpm for 15 minutes (J6). The supernatant was decanted and the pellet resuspended in about 100 ml of THF (below) by gentle shaking on ice. Then it was again centrifuged in the same flask at 4.2K rpm for 8 minutes (J6). The supernatant was removed and the pellet resuspended in 20 ml of cold TfB II by gentle shaking on ice. Amounts of 0.1 to 0.5 ml were placed in microtubes pre-cooled in liquid nitrogen and stored at -70 ° C. For the transformation, a small amount was removed, thawed at room temperature only to melt and placed on ice. The DNA was added, left on ice 15-30 minutes and incubated at 37øC for 5 minutes (6 minutes for 0.5 ml quantities). Then the suspensions containing DNA were diluted 1:10 in LB and cultured for another 90 minutes before being seeded or application of antibiotic selection. Alternatively, the heat exchange reaction mixture was seeded directly onto antibiotic plates in which a thin layer (4-5 ml) of LB agar was spread without antibiotic immediately before sowing.

Meios e Tampões: TYM: 2% Bacto-Tryptone, 0,5% YeastMeans and Buffers: TYM: 2% Bacto-Tryptone, 0.5% Yeast

Extract, ο, 1M NaCl, 10 mM MgSC>4 (pode ser adicionado antes da autoclavagem). TfB 1:30 mM KOAc, 50 mM MnCl2, 100 mM KC1, 10 mM CaCl2, 15% (v/v) glicerol. TfB II: 10 mM Na-MOPS, pH 7,0, 75mM CaCl2, 10 mM KC1, 15% glicerol.Extract, ο, 1M NaCl, 10 mM MgSO 4 (may be added prior to autoclaving). TfB 1:30 mM KOAc, 50 mM MnCl 2, 100 mM KCl, 10 mM CaCl 2, 15% (v / v) glycerol. TfB II: 10 mM Na-MOPS, pH 7.0, 75 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% glycerol.

Recuoeracão de clones de cDNA por "oannina11Retrieval of cDNA clones by " oannina11

Placas de cultura para bacteriologia (Falcon 1007) foram preparadas para ••panning" por revestimento com um anticorpo de carneiro anti-IgG de murganho como descrito por Wysocki e Sato (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2844-2848 (1978)), excepto as placas serem lavadas com 0,15M NaCl de uma garrafa de lavagens em vez de PBS e os sítios que não reagiram foram bloqueados por incubação durante a noite em PBS contendo 1 mg/ml de BSA. As placas foram tipicamente preparadas em grandes lotes e guardadas congeladas após aspiração do PBS/BSA. No primeiro ciclo de rastreio, 24 placas de 6 cm de células COS confluentes foram transfectadas por fusão de protoplastos de acordo com o método de Sandri-Goldrin et al.. Mol. Cell. Biol. l_:743-752 (1981). 72 horas após a fusão as células foram descoladas por incubação em PBS/1 mM EDTA/0,2% azida de sódio a 37°C durante 30 minutos. As células descoladas foram reunidas, centrifugadas e ressuspensas em PBS/EDTA/5% soro fetal bovino contendo anticorpos monoclonais, geralmente derivados de ascites numa diluição de 1:1000, mas também como reagentes comerciais nas concentrações sugeridas pelos fabricantes. Após 1 hora em gelo, as células foram diluidas a 1:1 com PBS/EDTA/azida contendo 2% Ficoll 400. Após centrifugação (400xg, 5 minutos) o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado, o sedimento ressuspenso numa pequena quantidade de PBS/EDTA/5% FBS e as células distribuídas por placas de "panning" contendo 3 ml de PBS/EDTA/5% FBS. As placas forma então tratadas essencialmente como descrito por Wysocki e Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2844-2848 (1978). O DNA epissómico foi recuperado a partir de células aderentes pelo processo de Hirt (J. Mol. Biol. 26:365-269 (1967)) e usado para transformar MC1061/p3.Culture plates for bacteriology (Falcon 1007) were prepared for •• panning " by coating with an anti-mouse IgG sheep antibody as described by Wysocki and Sato (Proc Natl Acad Sci USA 75: 2844-2848 (1978)), except the plates are washed with 0.15M NaCl of one bottle washings instead of PBS and the unreacted sites were blocked by overnight incubation in PBS containing 1 mg / ml BSA. The plates were typically prepared in large batches and stored frozen after aspiration of PBS / BSA. In the first round of screening, 24 6-cm plates of confluent COS cells were transfected by fusion of protoplasts according to the method of Sandri-Goldrin et al. Mol. Cell. Biol. Chem., 743-752 (1981). 72 hours post-fusion the cells were detached by incubation in PBS / 1mM EDTA / 0.2% sodium azide at 37Â ° C for 30 minutes. The detached cells were pooled, centrifuged and resuspended in PBS / EDTA / 5% fetal bovine serum containing monoclonal antibodies, generally derived from ascites at a 1: 1000 dilution, but also as commercial reagents at the concentrations suggested by the manufacturers. After 1 hour on ice the cells were diluted 1: 1 with PBS / EDTA / azide containing 2% Ficoll 400. After centrifugation (400xg, 5 minutes) the supernatant was carefully aspirated, the pellet resuspended in a small amount of PBS / EDTA / 5% FBS and the cells distributed by " panning " containing 3 ml of PBS / EDTA / 5% FBS. Plates are then essentially treated as described by Wysocki and Sato, Proc. Natl. Acad. Know. USA 75: 2844-2848 (1978). The episomal DNA was recovered from adherent cells by the Hirt method (J. Mol. Biol. 26: 365-269 (1967)) and used to transform MC1061 / p3.

Linhas celulares e cultura de células Células COS clone M6 foram propagadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal e sulfato de gentamicina a 15^g/ml (DME/10% soro de vitela). As células foram distribuídas no dia antes da transfecção por placas de 6 cm a aproximadamente 1:8 a partir de placas stock mantidas tão densas quanto possível sem danificar as células. As linhas de células T foram cultivadas em meio de Dulbecco modificação de Iscove (IMDM) contendo gentamicina como atrás, e NuSerum (Collaborative Research) ou soro bovino fetal a 10%.Cell lines and cell culture COS cell clones M6 were propagated in Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with 10% fetal serum and 15æg / ml gentamicin sulfate (DME / 10% calf serum). The cells were distributed the day before transfection by 6 cm to approximately 1: 8 plates from stock plates kept as dense as possible without damaging the cells. The T cell lines were cultured in Dulbecco's Iscove modification medium (IMDM) containing gentamicin as above, and NuSerum (Collaborative Research) or 10% fetal bovine serum.

Transfeccão de células COS para estudos de imunofluorescência Células COS a 50% de confluência em placas de 6 cm foram transfectadas num volume de 1,5 ml com uma mistura consistindo em meio DME ou IMDM contendo 10% NuSerum (Collaborative Ressearch), 400 μg/ml de DEAE dextrano, 10 μΜ difosfato de cloroquina e ln μg/ml de DNA. Após 4 horas a 73°C (ou mais cedo se as células ficarem com mau aspecto), a mistura de transfecção foi removida e as células foram tratadas com 10% DMSOem PBS durante 2 minutos. Sussman e Milman, Cell Biol. 4:1641-1643 (1984). As células passaram então novamente para DME/10% soro de vitela durante 48 a 72 horas para permitir a expressão.Transfection of COS cells for immunofluorescence studies 50% confluency COS cells in 6 cm dishes were transfected into a volume of 1.5 ml with a mixture consisting of DME or IMDM medium containing 10% NuSerum (Collaborative Ressearch), 400 μg / ml DEAE dextran, 10 μ cloro chloroquine diphosphate and 1 μg / ml DNA. After 4 hours at 73 ° C (or earlier if the cells look poor), the transfection mixture was removed and the cells were treated with 10% DMSO in PBS for 2 minutes. Sussman and Milman, Cell Biol. 4: 1641-1643 (1984). The cells were then passed again to DME / 10% calf serum for 48 to 72 hours to allow expression.

Imunoprecioitações. Northerns e SouthernsImmunopretioitations. Northerns and Southerns

As células T foram marcadas por tratamento com lactope-roxidase, lisadas e imunoprecipitadas pelo processo de Clark e Einfeld (Leukocvte Tvpinq II. Vol.II, pp. 155-167 (1986)), usando esferas de agarose com anticorpos de cabra anti-IgG de murganho (Cooper Biomedical). Células COS foram transfectadas pelo método de DEAE-dextrano e tripsinizadas e passadas sem diluição para novas placas 24 horas após transfecção. 36 horas mais tarde, as células foram descoladas por exposição a PBS/EDTA como atrás, centrifugadas e marcadas pelo método da lactoperoxidase. Preparou-se um lisado límpido como para as imunoprecipitações de células T, excepto o tampão de lise conter 1 mM PMSF e a incubação com o anticorpo primário foi realizada durante apenas 2 horas a 4°C. Amostras eluidas foram fraccionadas em géis descontínuos de 11-25% de poliacrilamida usando o sistema tampão de Laemmli (Nature 227:680-685 (1970)). A análise de transferências Northern foi realizada essencialmente como descrito (Maniatis et al.. Molecular Clonina a Laboratorv Manual (1982)), excepto o DMSO ser omitido do tampão de aplicação, a desnaturação foi realizada a 70eC durante 5 minutos e o gel continha 0,6% de formaldeído em vez de 6%. O gel foi corado em dois volumes de água contendo 1/íg/ml de brometo de etídio, fotografado e transferido para nylon (GeneScreen, Dupont) no líquido de coloração. 0 RNA transferido foi irradiado por exposição a uma lâmpada germicida através de Saran (Church, Proc.T cells were labeled by treatment with lactopexidase, lysed and immunoprecipitated by the method of Clark and Einfeld (Leukocvte Tvpinq II, Vol. II, pp. 155-167 (1986)) using agarose beads with goat anti- Mouse IgG (Cooper Biomedical). COS cells were transfected by the DEAE-dextran method and trypsinized and passed undiluted to fresh plates 24 hours post-transfection. 36 hours later, the cells were peeled off by exposure to PBS / EDTA as above, centrifuged and labeled by the lactoperoxidase method. A clear lysate was prepared as for T-cell immunoprecipitations, except the lysis buffer contained 1 mM PMSF and incubation with the primary antibody was performed for only 2 hours at 4 ° C. Eluted samples were fractionated in 11-25% polyacrylamide discontinuous gels using the Laemmli buffer system (Nature 227: 680-685 (1970)). Northern blot analysis was performed essentially as described (Maniatis et al., Molecular Clonine to Laboratorv Manual (1982)), except that DMSO was omitted from the application buffer, denaturation was performed at 70 ° C for 5 minutes and the gel contained 0 , 6% formaldehyde instead of 6%. The gel was stained in two volumes of water containing 1æg / ml ethidium bromide, photographed and transferred to nylon (GeneScreen, Dupont) in the staining liquid. The transferred RNA was irradiated by exposure to a germicidal lamp through Saran (Church, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 8:1991-1995 (1984)) durante 5 minutos a um fluxo de 0,22 mW/cm2 (medido a 254 nm). A análise de transferências Southern foi realizada por transferência alcalina para nylon (GeneScreen, DuPont) como descrito por Reed e Mann (Nucl. Acids Res. 13:7207-7221 (1986)). Preparam-se sondas de hibridação pelo método de Hu e Messing (Gene 18:271-277 (1982)), e as transferências foram pré-hibridadas em SDS/tampão fosfato (Church e Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8:1991-1995 (1984)) contendo 10 equivalentes microgramas de DNA do fago M13 mpl9.Natl. Acad. Know. USA 8: 1991-1995 (1984)) for 5 minutes at a flow rate of 0.22 mW / cm 2 (measured at 254 nm). Southern blot analysis was performed by alkaline transfer to nylon (GeneScreen, DuPont) as described by Reed and Mann (Nucl. Acids Res. 13: 7207-7221 (1986)). Hybridization probes were prepared by the method of Hu and Messing (Gene 18: 271-277 (1982)), and the blots were prehybridized in SDS / phosphate buffer (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad Sci USA 8: 1991-1995 (1984)) containing 10 micrograms equivalents of phage M13 mpl9 DNA.

Formação de rosetas de eritrôcitosFormation of erythrocyte rosettes

Preparam-se eritrôcitos a partir de sangue total por três centrifugações em PBS. Células COS foram transfectadas em placas de 6 cm com CD2 ou outros clones de expressão de anti-génios de superfície pelo método de DEAE. 48 a 72 horas após transfecção o meio foi aspirado e adicionado 2 ml de PBS/5% FDS/azida de sódio por placa, seguido de 0,4 ml das amostras adequadas de eritrôcitos como suspensões a 20% em PBS. Após 1 hora à temperatura ambiente, os eritrôcitos não aderentes foram lavados suavemente e examinadas as placas.Erythrocytes are prepared from whole blood by three centrifugations in PBS. COS cells were transfected into 6 cm plates with CD2 or other surface antigen expression clones by the DEAE method. 48 to 72 hours after transfection the medium was aspirated and 2 ml of PBS / 5% FDS / sodium azide per plate was added, followed by 0.4 ml of the appropriate erythrocyte samples as 20% suspensions in PBS. After 1 hour at room temperature, the non-adherent erythrocytes were washed gently and examined for plaques.

Um cDNA codificador de determinantes antigénicos CD2 foi isolado como se segue: preprou-se cDNA a partir de RNA extraído da linha de células T tumorais humana HPB-ALL e inserido no vector de expressão baseado na origem de SV40 piH3 como descrito atrás. Construiu-se uma biblioteca de cDNA de aproxima-damente 3 x 105 recombinantes e a biblioteca foi introduzida em células COS por fusão de protoplastos. Três dias mais tarde as células foram descoladas por exposição a EDTA e tratadas com um conjunto de anticorpos monoclonais, incluindo três (0KT11, Leu5b e Coulter Til) dirigidos contra determinantes de CD2. As células tratadas com anticorpo foram distribuídas por placas revestidas com anticorpos de carneiro anti-IgG de murganho, deixadas ligar e separadas das células não aderentes por lavagem suave. Este 55 método de enriquecimento é conhecido da literatura de imunologia (Mage et al.. J. Immunol. Methods 15:47-56 (1977).A cDNA encoding CD2 antigenic determinants was isolated as follows: cDNA was preproduced from RNA extracted from human HPB-ALL tumor T cell line and inserted into the SV40 origin pH3 origin expression vector as described above. A cDNA library of about 3 x 10 5 recombinants was constructed and the library was introduced into COS cells by protoplast fusion. Three days later the cells were excised by exposure to EDTA and treated with a set of monoclonal antibodies, including three (0KT11, Leu5b and Coulter Til) directed against CD2 determinants. Antibody treated cells were plated with sheep anti-mouse IgG antibody plates, allowed to bind and separated from the non-adherent cells by gentle washing. This enrichment method is known from the immunology literature (Mage et al., J. Immunol., Methods 15: 47-56 (1977).

As colónias resultantes foram reunidas, fundidas com células COS e sujeitas a uma segunda volta de "panning" como 1 anteriormente. Na terceira volta uma fracção das células descola das foi tratada com uma mistura de três anticorpos monoclonais específicos de CD2 e preparou-se novamente sobrenadante de Hirt e usado em transformação de E. coli. Preprou-se DNA a partir de oito das colónias resultantes e usou-se para transfectar células COS. Após três dias, a expressão na superfície do antigénio CD2 foi detectada por imunofluorescência indirecta em seis de oito placas transfectadas. A digestão do DNA dos plasmídeos correspondentes com enzimas de restrição revelou uma inserção de 1,5 Kb nos seis isolados.The resulting colonies were pooled, fused with COS cells and subjected to a second round of " panning " as 1 previously. On the third turn a fraction of the cells were treated with a mixture of three monoclonal antibodies specific for CD2 and the Hirt supernatant was again prepared and used in E. coli transformation. DNA was preproced from eight of the resulting colonies and used to transfect COS cells. After three days, expression on the surface of the CD2 antigen was detected by indirect immunofluorescence in six of eight transfected plaques. DNA digestion of the corresponding plasmids with restriction enzymes revealed a 1.5 Kb insert in the six isolates.

Um dos seis clones foi preparado em grandes quantidades para posterior análise. Após transfecção de células COS, a análise de imunofluorescência indirecta com um painel parcial de anticorpos proporcionados pelo Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens mostrou que todos os anticorpos proporcionados deram reacções positivas com excepção de uma amostra de uma amostra que também não reagiu com linfócitos T activados com fito-hemaglutinina. Entre os 17 anticorpos testados foram pelo menos oito os grupos distintos definidos pelos seus padrões diferentes de reactividade com linfócitos de várias espécies de primatas. Jonker e Nooij, Leukocvte Tvoina II. Vol. I, pp. 373-387 (1986). 56One of the six clones was prepared in large quantities for further analysis. After transfection of COS cells, indirect immunofluorescence analysis with a partial panel of antibodies provided by the Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens showed that all provided antibodies gave positive reactions except for one sample from a sample that also did not react with T lymphocytes activated with phytohemagglutinin. Among the 17 antibodies tested were at least eight distinct groups defined by their different patterns of reactivity with lymphocytes from various primate species. Jonker and Nooij, Leukocvte Tvoina II. Vol. I, p. 373-387 (1986). 56

Análise da sequência de cDNAAnalysis of the cDNA sequence

A inserção de cDNA de CD2 foi subclonada em M13 mpl9 (Vieira e Messing, Gene 19:259-268 (1982)). em ambas as orientações e a sequência determinada pelo método de didesoxinucleótidos (Figura 2). Sanger et al.. Proc. Natl Acad. Sei. USA 74:5463-5467 (1977). Um grelha de leitura aberta foi observada estendendo-se por 360 resíduos a partir de um ATG satisfazendo o critério de consensus de Kozak fMicrobiol. Rev.: 1-47:45 (1983)) para codões de inciação da tradução (Figura 1). A sequência de aminoácidos prevista evoca uma proteína de membrana integral com uma única âncora hidrófoba atravessando a membrana terminando num domínio intracitoplásmico grande. A comparação da sequência de aminoácidos N-terminal com a matrix de frequências de resíduos de sequência sinal construída por von Heijne (Nucl. Acids Res. 14:4683--4690 (1986)) sugere que o peptídeo maduro CD2 é formado por clivagem de um peptídeo precursor entre os resíduos 192 (Ser) e 202 (Lis).The CD2 cDNA insert was subcloned into M13 mpl9 (Vieira and Messing, Gene 19: 259-268 (1982)). in both orientations and the sequence determined by the dideoxynucleotide method (Figure 2). Sanger et al., Proc. Natl Acad. Know. USA 74: 5463-5467 (1977). An open reading frame was observed extending 360 fold from an ATG satisfying the consensus criterion of Kozak (Microbiol). Rev. 1-47: 45 (1983)) for translation initiation codons (Figure 1). The predicted amino acid sequence evokes an integral membrane protein with a single hydrophobic anchor traversing the membrane ending in a large intracytoplasmic domain. Comparison of the N-terminal amino acid sequence with the signal sequence residue frequency matrix constructed by von Heijne (Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)) suggests that the mature CD2 peptide is formed by cleavage of a precursor peptide between residues 192 (Ser) and 202 (Lys).

Uma característica surpreendente e inesperada desta sequência é a presença de um potencial sítio de N-glicosilação muito perto do sítio de clivagem proposto. 0 esqueleto polipep-tídico resultante tem um peso molecular previsto de 38,9 Kd dividido por um domínio externo de 21,9 Kb e um domínio citoplas-mático de 14,6 Kd. Três sítios de N-glicosilação estão presentes no domínio extracelular. 0 domínio que atravessa a membrana compreende 26 resíduos não alterados de carácter predominantemente hidrofóbico. Nos nove resíduos imediatamente a seguir estão sete resíduos básicos, lisinas ou argininas. 0 aparecimento de resíduos predominantemente hidrofôbicos seguidos de resíduos básicos é uma característica de organização típica das proteínas transmembra-nares portadoras de âncoras no extremo carbonilo.A surprising and unexpected feature of this sequence is the presence of a potential N-glycosylation site very close to the proposed cleavage site. The resulting polypeptide backbone has a predicted molecular weight of 38.9 Kd divided by an external domain of 21.9 Kb and a cytoplasmic domain of 14.6 Kd. Three N-glycosylation sites are present in the extracellular domain. The membrane spanning domain comprises 26 unchanged residues of predominantly hydrophobic character. In the nine residues immediately following are seven basic residues, lysines or arginines. The appearance of predominantly hydrophobic residues followed by basic residues is a typical organizational feature of the transmembrane proteins carrying anchors at the carbonyl end.

Uma outra característica surpreendente do domínio transmembranar é o aparecimento de um motivo de volta beta cis-gli-gli-gli (Chou e Fasman, Annual Review of Biochemistry 47:251-276 (1978)), delimitado por resíduos hidrofóbicos (os quais são frequentemente encontrados delimitando as voltas beta). Devido a apenas 20 resíduos arranjados numa hélice alfa serem teoricamente necessários para atravessar a bicamada da membrana de 3 nm (Tanford, Science 200:1012-1018 (1978)) e apenas 14 resíduos hidrofóbicos podem permitir a inserção e exportação de uma proteína de membrana integral (Adams e Rose, Cell 41: 1007--1015 (1985)), o segmento transmembranar do antigénio CD2 pode conter uma dobra ou nó. 0 tamanho relativamente grande do domínio citoplasmáti-co deixa em aberto a possibilidade de CD2 possuir uma actividade enzimática intrínseca. 0 domínio citoplasmático é muito rico em prolinas e contem três sítios com grande probabilidade de torsão. A comparação da sequência de aminoácidos com a base de dados NBRF não revelou homologias substanciais com outras proteínas. Em particular, nenhuma homologia com as cadeias alfa ou beta do receptor das células T, excluindo a sugestão de que CD2 seja um receptor primordial de células T. Milanese et al.. Science 231:1118-1122 (1986).Another surprising feature of the transmembrane domain is the appearance of a cis-gli-gli-gli beta motif (Chou and Fasman, Annual Review of Biochemistry 47: 251-276 (1978)), delimited by hydrophobic residues (which are often found delimiting the beta turns). Because only 20 residues arranged in an alpha helix are theoretically required to cross the 3 nm membrane bilayer (Tanford, Science 200: 1012-1018 (1978)) and only 14 hydrophobic residues may allow the insertion and export of a membrane protein integral (Adams and Rose, Cell 41: 1007-1015 (1985)), the CD2 antigen transmembrane segment may contain a fold or a knot. The relatively large size of the cytoplasmic domain leaves open the possibility that CD2 possesses an intrinsic enzymatic activity. The cytoplasmic domain is very rich in proline and contains three sites with a high probability of torsion. Comparison of the amino acid sequence with the NBRF database did not reveal substantial homologies with other proteins. In particular, no homology to the T cell receptor alpha or beta chains, excluding the suggestion that CD2 is a primordial T cell receptor Milanese et al., Science 231: 1118-1122 (1986).

Imediatamente dentro da face citoplasmática da proteína está um segmento de aminoácidos básicos seguido de um resíduo serina, um padrão encontrado no mesmo local tanto no receptor de EGF como nos genes de histocompatibilidade classe I e em cada um dos casos um sítio conhecido para fosforilação in vivo (EGF) e in vitro (HLA) pela proteína-cinase C ou proteína-cinase dependente de AMP cíclico, respectivamente. Hunter et al.. Nature 311:480--482 (1984); Davis e Czech, Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1974-1978 (1985); Guild e Strominger, J. Biol. Chem. 259:9235-9240 e 13504-13510 (1984). Um sítio semelhante foi encontrado no domínio intracitoplasmático do receptor da interleuquina 2 e é fosfori-lado in vivo pela proteína cinase C. Lenard et al.. Nature 311:626-631 (1984); Nikaido et al.. Nature 311:631-635 (1984);Immediately within the cytoplasmic face of the protein is a segment of basic amino acids followed by a serine residue, a pattern found at the same site in both the EGF receptor and the class I histocompatibility genes and in each case a known site for in vivo phosphorylation (EGF) and in vitro (HLA) by protein kinase C or cyclic AMP-dependent protein kinase, respectively. Hunter et al., Nature 311: 480--482 (1984); Davis and Czech, Proc. Natl. Acad. Know. 82: 1974-1978 (1985); Guild and Strominger, J. Biol. Chem. 259: 9235-9240 and 13504-13510 (1984). A similar site was found in the intracytoplasmic domain of the interleukin 2 receptor and is phosphorylated in vivo by protein kinase C. Lenard et al., Nature 311: 626-631 (1984); Nikaido et al., Nature 311: 631-635 (1984);

Shackelford e Trowbridge, J Biol. Chem. 259:11706-(1984).Shackelford and Trowbridge, J Biol. Chem. 259: 11706- (1984).

Imunoprecipitacão do anticrénio CD2 expresso pelas células trans-fectadasImmunoprecipitation of CD2 antigen expressed by transfected cells

As células COS foram transfectadas com o plasmídeo de expressão de CD2 e marcadas na superfície com 125χ pelo método da lactoperoxidase 60 horas após-transfecção. Preparou-se um lisado de células e fraeções dele foram incubadas com o anticorpo monoclonal anti-CD2 (OKT11) ou com um anticorpo estranho (OKT4; anti-CD4) durante 2 horas a 4°C. Adicionou-se anticorpo anti-mur-ganho ligado a Sepharose e após vários passos de lavagem as proteínas adsorvidas foram eluidas e submetidas a electroforese através de um gel de 11,25% de poliacrilamida juntamente com imunoprecipitados preparados de forma semelhante derivados de linfócitos T activados com fito-hemaglutinina, a linha HPB-ALL dadora de cDNA ou de uma linha de células T a longo termo gerada neste laboratório. A autorradiografia demonstrou uma banda proeminente de material imuno-reactivo precipitado a partir de células COS transfectadas pelo anticorpo anti-CD2, mas não pela testemunha. O peso molecular médio calculado para o material derivado de células COS foi de 51 Kd, comparado com um peso molecular médio de 54 Kd para o material derivado de blastócitos T we dalinha de células T; encontrou-se que o antigénio derivado de células HPB-ALL possui um peso molecular de aproximadamente 61COS cells were transfected with the CD2 expression plasmid and 125χ surface labeled by the lactoperoxidase method 60 hours post-transfection. A cell lysate was prepared and fractions thereof were incubated with either the anti-CD2 monoclonal antibody (OKT11) or a foreign antibody (OKT4; anti-CD4) for 2 hours at 4 ° C. Anti-mur-gain antibody bound to Sepharose was added and after several washing steps the adsorbed proteins were eluted and electrophoresed through an 11.25% polyacrylamide gel along with similarly prepared immunoprecipitates derived from activated T lymphocytes with phytohemagglutinin, the HPB-ALL line cDNA donor or a long-term T cell line generated in this laboratory. Autoradiography demonstrated a prominent band of immuno-reactive material precipitated from COS cells transfected by the anti-CD2 antibody, but not by the control. The calculated average molecular weight for the COS cell derived material was 51 Kd, compared to an average molecular weight of 54 Kd for the T-cell T-cell and B-cell derived material; the antigen derived from HPB-ALL cells has been found to have a molecular weight of about 61

Kd. As diferenças observadas no tamanho foram atribuídas a diferentes padrões de glicosilação nos diferentes tipos celulares. Uma banda menor de peso molecular aparente 38 Kd estava presente no material imunoprecipitado a partir de células COS mas não a partir de células T ou de células HPB-ALL. O tamanho destas espécies está de acordo com o peso molecular previsto do peptídeo maduro não glicosilado, 39 Kd. Células COS expressando CD2 formam rosetas com eritrócitos de carneiro Células COS transfectadas com o clone de expressão de CD2 foram tratadas durante 1 hora com o anticorpo MT910 purificado anti-CD2 (IgG, kapa) (Rieber et al.. Leukocvte Tvpinq IIf Vol. I, pp. 233-242 (1986)) a uma concentração de 1 μg/ml ou com MB40.5 purificado (IgGl, kapa; Kawata et al.. J. Exp. Med. 160:633-651 (1984)) na mesma concentração. MB40.5 reconhece um determinante monomórfico HLA-ABC e dá reacção cruzada com antigé-nios de histocompatibilidade de Macaco Verde Africano; ele foi escolhido por representar um anticorpo do mesmo isotipo reconhecendo um antigénio de superfície com aproximadamente a mesma abundância do antigénio CD2 expresso pelas células transfectadas. As rosetas de eritrócitos de carneiro foram observadas na presença de MB40.5, mas não na de MT910. A inibição das rosetas foi também observada com o anticorpo OKT11 e não com vários outros anticorpos testemunha. Células COS transfectadas formam rosetas com outros eritrócitos animaisKd. The differences observed in size were attributed to different glycosylation patterns in the different cell types. A minor band of apparent molecular weight 38 Kd was present in the immunoprecipitated material from COS cells but not from T cells or HPB-ALL cells. The size of these species is in accordance with the predicted molecular weight of the mature, non-glycosylated peptide, 39 Kd. COS-expressing COS cells form rosettes with sheep erythrocytes COS cells transfected with the CD2 expression clone were treated for 1 hour with purified anti-CD2 (IgG, kappa) MT910 antibody (Rieber et al., Leukocyte Tvpinq IIf Vol. I , pp. 233-242 (1986)) at a concentration of 1 μg / ml or with purified MB40.5 (IgG1, kappa; Kawata et al., J. Exp. Med. 160: 633-651 (1984)) in same concentration. MB40.5 recognizes an HLA-ABC monomorphic determinant and cross-reacts with African Green Monkey histocompatibility antigens; it was chosen because it represents an antibody of the same isotype recognizing a surface antigen with approximately the same abundance of the CD2 antigen expressed by the transfected cells. Rats of sheep erythrocytes were observed in the presence of MB40.5, but not in MT910. Inhibition of rosets was also observed with the OKT11 antibody and not with several other control antibodies. Transfected COS cells form rosettes with other animal erythrocytes

Para além dos eritrócitos de carneiro, as células T humanas formam rosetas com eritrócitos de cavalo, porco, cão, 60In addition to sheep erythrocytes, human T cells form rosettes with erythrocytes of horse, pig, dog, 60

cabra e coelho, mas não com as de murganho ou rato. Johansen et al.. J. Allerav Clin. Immunol. 54:86-94 (1974); Amiot et al.. em A. Bernard et al.. eds. Leucocyte Typinq. Springer, editor, New York, N.Y., pp. 281-293 (1984); Nalet e Fournier, Cell. Immunol. 96,: 126-136 (1985). Também foram observadas auto-rosetas entre eritrócitos humanos e timócitos humanos (Baxley et al.. Clin. exp. Immunol♦ 15:385-393 (1973)). Células COS transfectadas com o clone de expressão CD2 foram tratadas com MT910 ou com o anticorpo testemunha, MB40.5 e expostas a eritrócitos da espécie acima. As rosetas foram observadas com eritrócitos de cavalo, porco, cão, cabra, carneiro, coelho e humanos, mas não com eritrócitos de murganho ou de rato. A formação de rosetas foi bloqueada pelo pré-tratamento de células COS com MT910, mas não com MB40.5. Nestas experiências, observou-se que eritrócitos de cavalo formaram rosetas invulgarmente grandes os eritrócitos de cabra formaram rosetas esparsas, possivelmente devido ao seu pequeno tamanho ficam mais susceptíveis à lavagem. Os eritrócitos de murganho apresentaram ligação espontânea fraca à placa de cultura assim como às células pré-tratadas com MT910 e MB40.5, enquanto que os eritrócitos não mostraram ligação detectável de qualquer tipo.goat and rabbit, but not mouse or rat. Johansen et al., J. Allerav Clin. Immunol. 54: 86-94 (1974); Amiot et al. In A. Bernard et al., Eds. Leucocyte Typinq. Springer, ed., New York, N.Y., pp. 281-293 (1984); Nalet and Fournier, Cell. Immunol. 96, 126-136 (1985). Self-rosettes were also observed between human erythrocytes and human thymocytes (Baxley et al., Clin. Exp. Immunol., 15: 385-393 (1973)). COS cells transfected with the CD2 expression clone were treated with MT910 or with the control antibody, MB40.5 and exposed to erythrocytes of the above species. Rosettes were observed with erythrocytes of horse, pig, dog, goat, sheep, rabbit and humans, but not with mouse or rat erythrocytes. Rosette formation was blocked by pre-treatment of COS cells with MT910, but not with MB40.5. In these experiments, horse erythrocytes were found to form unusually large rosettes; goat erythrocytes formed sparse rosettes, possibly due to their small size being more susceptible to washing. Mouse erythrocytes showed weak spontaneous binding to the culture dish as well as cells pretreated with MT910 and MB40.5, whereas erythrocytes showed no detectable binding of any kind.

Ligação de eritrócitos humanos bloqueada pelo anticorpo LFA3Binding of human erythrocytes blocked by the LFA3 antibody

Devido a ter sido sugerido com base nos estudos de anticorpos bloqueadores que LFA3 é a estrutra alvo para o anti-génio CD2 (Shaw et al.. Nature 323:262-264 (1986)), a capacidade do anticorpo anti-LFA3 para evitar a formação de rosetas foi estudada, células transfectadas foram expostas a eritrócitos humanos pré-tratados durante 2 horas com anti-LFA3 (IgGl, kapa) como ascites a uma diluição de 1:1000 ou com uma concentração de lO^g/ml de cada um dos quatro anticorposs não aglutinantes do mesmo isotipo dirigidos contra antigénios de eritrócitos humanos 61Because it has been suggested from the blocking antibody studies that LFA3 is the target structure for the CD2 antigen (Shaw et al., Nature 323: 262-264 (1986)), the ability of the anti-LFA3 antibody to prevent rosette formation was studied, transfected cells were exposed to human erythrocytes pretreated for 2 hours with anti-LFA3 (IgG1, kappa) as ascites at a dilution of 1: 1000 or at a concentration of 10æg / ml of each one of the four non-agglutinating antibodies of the same isotype directed against human erythrocyte antigens 61

como prevalentes ou mais prevalentes do que LFA3:G10/B11 e D10, anti-antigénio K14, D6, anti-antigénio Wr*3; e F7/B9, anti-anti- génio K. Nichols et al.. Vox Sana, no prelo. Os eritrócitos foram lavados para remover o excesso de anticorpo LFA3, mas deixou-se que formassem rosetas na presença de anticorpos testemunha para garantir contra a possível perda de poder do anticorpo bloqueador por desadsorção. A formação de rosetas foi observada na presença dos quatro anticorpos testemunha, mas não com eritrócitos pré--tratados com anti-LFA3.as prevalent or more prevalent than LFA3: G10 / B11 and D10, antigen K14, D6, antigen Wr * 3; and F7 / B9, anti-antigen K. Nichols et al. Vox Sana, in press. The erythrocytes were washed to remove excess LFA3 antibody, but allowed to form rosettes in the presence of control antibodies to ensure against possible loss of power of the desorption blocker antibody. Rosette formation was observed in the presence of the four control antibodies, but not with erythrocytes pretreated with anti - LFA3.

Células COS expressando outros antiaénios de células T não formam rosetasCOS cells expressing other T-cell antigens do not form rosettes

Isolou-se uma série de clones pela mesma técnica de expressão usada para clonar CD2 e caracterizou-se por vários graus de reactividade com anticorpos, restrição de ácidos nuclei-cos e análise de sequências e imunoprecipitação. Clones representativos foram usados para transfectar células COS e analizados relativamente à capacidade de suster a formação de rosetas. Os clones CDla, CDlb, CDlc, CD4, CD5, CD6, CD6, CD8 e CD28 (Tp44) não formaram rosetas com eritrócitos humanos.A number of clones were isolated by the same expression technique used to clone CD2 and were characterized by varying degrees of antibody reactivity, nucleic acid restriction, and sequence analysis and immunoprecipitation. Representative clones were used to transfect COS cells and analyzed for the ability to sustain rosetting. Clones CDla, CDlb, CDlc, CD4, CD5, CD6, CD6, CD8 and CD28 (Tp44) did not form rosettes with human erythrocytes.

Análise de transferências de RNAAnalysis of RNA Transfers

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares expressando ou não o antigénio CD2 foram sujeitas a electroforese em géis desnaturantes de agarose e transferidas para nylon. A hibridação do RNA transferido com uma sonda selec-tiva de cadeia (Hu e Messing, Gene 17:271-277 (1982)) preparada a partir do clone M13 contendo uma inserção de cDNA revelou a presença em RNA derivado de populações de timócitos, célula T activada, e de células T senescentes. Quantidades menores foram encontradas em RNA extraído da linha dadora de cDNA, HPB-ALL e 62Equal amounts of total RNA prepared from cell types expressing or not the CD2 antigen were subjected to electrophoresis on denaturing agarose gels and transferred to nylon. Hybridization of the RNA transferred with a chain selective probe (Hu and Messing, Gene 17: 271-277 (1982)) prepared from clone M13 containing a cDNA insert revealed the presence in RNA derived from populations of thymocytes, activated T cell, and senescent T cells. Smaller amounts were found in RNA extracted from the cDNA donor line, HPB-ALL and 62

ainda menos a partir de MOLT4; níveis escassamente detectáveis foram registados em RNA da linha HSB-2. Não se observou reactivi-dade com RNA das linhas Namalwa (linfoma de Burkitt), U937 (leucemia histiocítica), HuT-78 (leucemia de células T de adultos), PEER (leucemia de células T) ou Jurkat clone J3R7 (leucemia de células T). O padrão de reactividade está de acordo com o padrão conhecido ou medido da expressão de antigénio CD2, o qual estava ausente ou indetectável nas linhas celulares Namalwa, *937, HuT-78, J3R7, PEER e HSB-2, fracamente presente em M0LT4, mais fortemente presente em EPB-ALL e mais fortemente presente em células T activadas. Também é conhecido que os timócitos expressam níveis elevados do antigénio CD2. A avaliação da sequência do clone de cDNA sugeriu que mRNA de 1,3 Kb deve surgir pela formação de um extremo 3/ alterno distai relativamente ao sinal de poliadenilação canónico AATAAA na posição 1085 na sequência de cDNA. Para testar esta noção, RNA de HPB-ALL e células T activadas foi sujeito a análise de transferências Northern e hibridado com uma sonda de cDNA completa ou com uma sonda derivada da fracção 3/ do cDNA distai relativamentestill less from MOLT4; poorly detectable levels were recorded in HSB-2 RNA. No reactivity was observed with RNA from the Namalwa (Burkitt's lymphoma), U937 (histiocytic leukemia), HuT-78 (adult T cell leukemia), PEER (T-cell leukemia), or Jurkat clone J3R7 (cell leukemia T). The reactivity pattern is in accordance with the known or measured pattern of CD2 antigen expression, which was absent or undetectable in the Namalwa, * 937, HuT-78, J3R7, PEER and HSB-2 cell lines, weakly present in M0LT4, more strongly present in EPB-ALL and more strongly present in activated T cells. It is also known that thymocytes express high levels of the CD2 antigen. Evaluation of the cDNA clone sequence suggested that 1.3 Kb mRNA should arise by the formation of a 3κ distal endpoint relative to the canonical polyadenylation signal AATAAA at position 1085 in the cDNA sequence. To test this notion, HPB ALL-ALL RNA and activated T cells were subjected to Northern blot analysis and hybridized with a complete cDNA probe or with a probe derived from the cDNA moiety

ao nucleótido 1131. Esta última sonda reagiu apenas com a espécie de 1,65 Kb, se bem a primeira mostrasse o mesmo padrão de reactividade observado na Figura 5. Este resultado é consistente com a origem sugerida para o produto de transcrição de 1,3 Kb.to nucleotide 1131. This latter probe reacted only with the 1.65 Kb species, although the former showed the same pattern of reactivity observed in Figure 5. This result is consistent with the suggested origin for the transcription product of 1.3 Kb.

Tanto em preparações de RNA de células T activadas como de células senescentes, foi detectado um produto de transcrição de 0,75 Kb que hibridou fracamente. Presentemente a origem deste RNA é desconhecida.In both activated T cell and senescent cell RNA preparations, a 0.75 kb transcriptional product was detected which weakly hybridized. At present the origin of this RNA is unknown.

Organização qenómica do gene CD2Genomic organization of the CD2 gene

Análise de transferências Southern de DNA genómico derivado de placenta, linfócitos do sangue periférico, células T, células HeLa ou as linhas tumorais usadas na análise de RNA atrás mostrou padrões de digestão BamHI idênticos, indicando que o rearranjo não está envolvido na expressão normal do gene CD2 durante o desenvolvimento. De forma semelhante, não se observa grande alteração genómica que suporte a ausência de expressão do antigénio CD2 nas linhas de células T tumorais examinadas. A análise de restrição de DNA genómico total com uma série de outras enzimas, assim como resultados preliminares com uma colecção incompleta de fagos recombinantes portadores da sequência CD2, mostra que o gene está dividido em pelo menos quatro exões.Analysis of Southern blots of placental derived genomic DNA, peripheral blood lymphocytes, T cells, HeLa cells or the tumor lines used in RNA analysis above showed identical BamHI digestion patterns indicating that the rearrangement is not involved in the normal expression of the gene CD2 during development. Similarly, no major genomic change is observed to support the absence of CD2 antigen expression in the examined T cell lines. Restriction analysis of total genomic DNA with a number of other enzymes, as well as preliminary results with an incomplete collection of recombinant phages bearing the CD2 sequence, shows that the gene is divided into at least four exons.

Exemplo II Isolamento e Clonagem Molecular do Antigénio LFA-3 Humano 0 exemplo anterior mostra que os cDNAs codificadores de antigénios de superfície, como seja CD2 podem ser isolados pelo sistema de expressão transitória do presente invento, no qual as células COS transfectadas com bibliotecas de cDNA se ligam a placas revestidas com anticorpo ("panned"). 0 DNA de plasmídeo foi recuperado a partir de células aderentes às placas, usado para transformar E. coli e o processo repetido, geralmente duas vezes, para isolar o clone pretendido. Se bem que poderosa esta abordagem não pode ser usada quando os anticorpos monoclonais usados no "panning" reconhecem determinantes nas células transfectadas. Isto parece ser o caso do monoclonal TS2/9 anti-LFA3. No entanto, um sistema de expressão transitória semelhante baseado era células competentes para a replicação do vírus polioma deverá permitir que quase todos os monoclonais sejam usados pois a probabilidade de reacção cruzada entre anticorpos murinos e determinantes de superfície celular murinos deverá ser geralmente pequena.Example II Isolation and Molecular Cloning of Human LFA-3 Antigen The above example shows that cDNAs encoding surface antigens such as CD2 can be isolated by the transient expression system of the present invention in which COS cells transfected with cDNA libraries bind to antibody coated plates (" panned "). Plasmid DNA was recovered from plaque-adherent cells used to transform E. coli and the repeated procedure, generally twice, to isolate the desired clone. While powerful this approach can not be used when the monoclonal antibodies used in " panning " recognize determinants in the transfected cells. This appears to be the case for the anti-LFA3 monoclonal TS2 / 9. However, a similar transient expression system based on cells competent for the replication of the polyoma virus should allow almost all monoclonals to be used since the likelihood of cross-reactivity between murine antibodies and murine cell surface determinants should be generally small.

Criou-se um novo vector de expressão, CDM8 (Figura 3) a partir do vector de células COS piH3M descrito anteriormente. O novo vector difere pela inclusão de uma versão com deleções de uma região precoce mutante do vírus polioma seleccionada pela elevada eficácia de expressão tanto em células murinas como em células de macaco, pela substituição de substancialmente toda a região do promotor do vírus da imunodeficiência humana com as sequências cognatas do promotor precoce imediato de citomegalo-vírus humano e pela inclusão de um promotor do bacteriofago T7 entre o promotor eucariõtico e o sítio da inserção de cDNA. A expressão em células COS de cloranfenicol-acetiltransferase por todos os vectores foi equivalente.A new expression vector, CDM8 (Figure 3) was created from the pyH3M COS cell vector described above. The novel vector differs by including a deletioned version of a mutant early region of the selected polyoma virus by the high expression efficiency in both murine and monkey cell cells by substituting substantially the entire promoter region of the human immunodeficiency virus the cognate sequences of the human cytomegalovirus immediate early promoter and by the inclusion of a bacteriophage T7 promoter between the eukaryotic promoter and the cDNA insertion site. Expression in COS cells of chloramphenicol acetyltransferase by all vectors was equivalent.

Preparou-se uma biblioteca de 1,9 x 106 recombinantes tendo inserções superiores a 0,8 Kb no vector CDM8 a partir de um micrograma de RNA poli A+ isolado a partir da linha celular linfoblastóide humana JY. A biblioteca foi introduzida em células WOP (células NIH 3T3 transfectadas com DNA com deleções da origem do polioma) por fusão de esferoplastos e sujeito a três ciclos de "panning" e reintrodução em E. coli como descrito no Exemplo I.A library of 1.9 x 10 6 recombinants having insertions greater than 0.8 Kb in the CDM8 vector was prepared from a microgram of poly A + RNA isolated from the human lymphoblastoid cell line JY. The library was introduced into WOP cells (NIH 3T3 cells transfected with deletions of the polyoma origin) by fusion of spheroplasts and subjected to three cycles of " panning " and reintroduction into E. coli as described in Example I.

Um clone codificador do antigénio LFA-3 foi identificado por imunofluorescência indirecta de células WOP transfectadas, amplificado e sequenciado (Figura 4). Dentro da inserção de 874 pb, uma grelha de leitura aberta de 237 resíduos iniciada no codão metionina quase correspondendo â sequência consensus sugerida por Kozak, Microbiol. Rev. 42:1-45 (1983). A grelha de leitura termina numa série de resíduos hidrofóbicos sem os resíduos básicos de ancoragem característicos das proteínas de 65A clone encoding the LFA-3 antigen was identified by indirect immunofluorescence of transfected, amplified and sequenced WOP cells (Figure 4). Within the 874 bp insert, an open reading frame of 237 residues initiated at the methionine codon almost corresponding to the consensus sequence suggested by Kozak, Microbiol. Rev. 42: 1-45 (1983). The reading grid terminates in a series of hydrophobic residues without the basic anchor residues characteristic of the 65

membrana internas, mas partilhando características com proteínas de membrana superficiais ligadas a fosfatidilinositol. As características incluem conjuntos de resíduos serina ou treonina numa região hidrofílica imediatamente precedendo o domínio hidrofóbico e a presença de serinas e treoninas na fracção hidrofôbica.membranes but sharing characteristics with surface membrane proteins linked to phosphatidylinositol. Characteristics include sets of serine or threonine residues in a hydrophilic region immediately preceding the hydrophobic domain and the presence of serines and threonines in the hydrophobic moiety.

A sequência de aminoácidos prevista a partir da sequência de nucleótidos doclone LFA-3 foi comparada com a base de dados NBRF e não foram descobertas homologias significativas; as homologias mais significativas foram com a proteína do invólucro do HIV. Dentro dos 200 resíduos compreendendo a presumível proteína madura estão 6 sítios de glicosilação ligada em N e 5 resíduos seguidos de serina ou treonina que frequentemente aparecem em proteínas glicosiladas em O. Dez resíduos císteina aparecem na sequência completa, 6 dos quais estão distribuídos na última metade da proteína madura e dos quais um está no domínio hidrofóbico do extremo carbonilo. Se bem que a esterificação de tióis da císteina para ácidos gordos seja comum em proteínas de membrana integrais e possa desempenhar um papel alternado na ancoragem à membrana de LFA-3, são conhecidos dois exemplos de resíduos de císteina dentro ou na margem da região hidrofôbica de proteínas ligads a fosfatidilinositol.The predicted amino acid sequence from the doclone LFA-3 nucleotide sequence was compared to the NBRF database and no significant homology was found; the most significant homologies were with the envelope protein of HIV. Within the 200 residues comprising the presumed mature protein are 6 N-linked glycosylation sites and 5 residues followed by serine or threonine which often appear in O-glycosylated proteins. Ten cysteine residues appear in the complete sequence, 6 of which are distributed over the last half of the mature protein and of which one is in the hydrophobic domain of the carbonyl end. Although the esterification of thiols from the cysteine to fatty acids is common in integral membrane proteins and may play an alternate role in the membrane anchoring of LFA-3, two examples of cysteine residues are known within or at the margin of the hydrophobic region of proteins bound to phosphatidylinositol.

A sequência prevista sugere que as manipulações conhecidas para aumentar a adesão de eritrócitos a células T possa ter explicação física directa na estrutura da molécula de LFA-3. 0 brometo de aminoetilisotiouronio, o aditivo tioureia de bromo-etilamina, sofre rearranjo espontâneo para mercaptoetilguanidina a pH alcalino. 0 último igualmente tem acesso a ligações dissul-fureto inacessíveis a agentes redutores menos caotrópicos e pode assim reduzir e promover o desenrolamento da molécula LFA-3. De forma semelhante, a neuraminidase pode decrescer a interferência espacial pelas muitas cadeias de açúcar na molécula. A análise de hibridação de transferências de RNA e DNA mostraram que o gene LFA-3 não partilha sequências estreitamente relacionadas no genoma e codifica uma única espécie de RNA de cerca de 1 Kb de comprimento. Linhas celulares que expressam grandes quantidades de LFA-3 de superfície têm maiores quantidades de RNA de LFA-3 do que as que expressam quantidades pequenas ou não detectáveis. A radioimunoprecipitação do antigénio expresso em células transfectadas COS e murinas mostra uma banda larga de aproximadamente 50 Kd de peso molecular médio, semelhante ao encontrado nas células JY.The predicted sequence suggests that manipulations known to increase erythrocyte adhesion to T cells may have direct physical explanation in the structure of the LFA-3 molecule. Aminoethylisothiouronium bromide, the thiourea additive of bromoethylamine, undergoes spontaneous rearrangement to mercaptoethylguanidine at alkaline pH. The latter also has access to disulfide bonds inaccessible to less chaotropic reducing agents and can thereby reduce and promote the unwinding of the LFA-3 molecule. Similarly, neuraminidase can decrease spatial interference by the many sugar chains in the molecule. Hybridization analysis of RNA and DNA blots showed that the LFA-3 gene does not share closely related sequences in the genome and encodes a single RNA species of about 1 Kb in length. Cell lines expressing large amounts of surface LFA-3 have larger amounts of LFA-3 RNA than those expressing small or undetectable amounts. Radioimmunoprecipitation of the antigen expressed on COS and murine transfected cells shows a broad band of approximately 50 Kd average molecular weight, similar to that found in JY cells.

Exemplo III Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNA do Antigénio CD28Example III Isolation and Molecular Clonaqem of CD28 Antigen cDNA

Os exemplos anteriores ilustram a técnica baseada em anticorpos monoclonais do presente invento para enriquecimento em cDNAs codificadores de antigénios de superfície. No presente invento, está descrito um método de construção de bibliotecas de expressão que permite que a técnica de enriquecimento seja totalmente explorada. O método do presente invento para fazer bibliotecas de expressão em plasmídeos é de utilização geral para a clonagem de expressão. A técnica de selecção de anticorpos do presente invento também foi aplicado para isolar um clone de cDNA codificador do antigénio CD28. O antigénio partilha homologia substancial com membros da superfamília de imunoglobulinas e forma uma estrutura em dímero na superfície de células COS transfectadas semelhante à estrutura de dímero encontrada em linfócitos T.The foregoing examples illustrate the technique based on monoclonal antibodies of the present invention for enrichment in cDNAs encoding surface antigens. In the present invention, there is described a method of constructing expression libraries that allows the enrichment technique to be fully exploited. The method of the present invention for making expression libraries into plasmids is of general use for expression cloning. The antibody selection technique of the present invention has also been applied to isolate a cDNA clone encoding the CD28 antigen. The antigen shares substantial homology with members of the immunoglobulin superfamily and forms a surface dimer structure transfected COS cells similar to the dimer structure found on T lymphocytes.

Preparação de bibliotecas de cDNA RNA poli(A)+ foi preparado a partir da linha HPB-ALL de células T tumorais humanas por cromatografia em oligo(dT) celulose do RNA total isolado pelo método do tiocianato de guanidinio (Chirgwin, J.M. et al. . Biochemistrv 18.:5294-5299 (1979)).Preparation of poly (A) + RNA cDNA libraries was prepared from HPB-ALL line of human tumor T cells by oligo (dT) cellulose chromatography of total RNA isolated by the guanidinium thiocyanate method (Chirgwin, JM et al. Biochemistry 18: 294-5299 (1979)).

Preparou-se cDNA por um protocolo baseado no método de Gubler e Hoffman (Gubler, U. et al.. Gene 25:263-269 (1989)). 4 μg de mRNA foi aquecido a aproximadamente 100°C num tubo de centrífuga de 1,5 ml durante 30 segundos, arrefecido em gelo e o volume ajustado a 70 μΐ com água sem RNase. A isto adicionou-se 20 μΐ deCDNA was prepared by a protocol based on the method of Gubler and Hoffman (Gubler, U. et al., Gene 25: 263-269 (1989)). 4 μg mRNA was warmed to approximately 100 ° C in a 1.5 ml centrifuge tube for 30 seconds, cooled on ice and the volume adjusted to 70 μΐ with RNase-free water. To this was added 20 .mu.l of

tampão (0,25M Tris pH 8,8 (8,2 a 42°C), 0,25M KC1, 30 mM MgCl2), 2 μΐ de de inibidores de RNAses (Boehringer 36 u/μΐ), 1 μΐ de 1M DTT, 1 μΐ de 5 μg/μl de oligo dT (Collaborative Research), 2 μΐ de trifosfatos de desoxinucleótidos 25 mM cada (US Biochemicals) e 4 μΐ de transcriptase reversa (Life Sciences, 24 u/μΐ). Após 40 minutos a 42°c, a reacção foi parada por aquecimento a 70°C durante 10 minutos. A esta mistura de reacção foi então adicionado 320 μΐ de água sem RNase, 80 μΐ de tampão (0,1M Tris pH 7,5, 25 mM MgCl2, 0,5M KC1, 0,25 mg/ml BSA e 50 mM DTT), 25 unidades de RNaseH (BRL). Após 1 hora a 15°C e 1 hora a 22°C, foram adicionados 20 μΐ de 0,5M EDTA, a mistura de reacção foi extraída com fenol, adicionado NaCl para 0,5M, adicionada poliacrilamida linear (veículo; Strauss, F. et al.. Cell 37:889-901 (1984)) para 20 μg/ml e o tubo foi cheio com etanol. Após centrifugação durante 2-3 minutos a 12000 xg, o tubo foi removido, vortexado para desprender o precipitado espalhado pela parede do tubo e novamente centrifugado durante 1 minuto.buffer (0.25M Tris pH 8.8 (8.2 at 42 ° C), 0.25M KCl, 30 mM MgCl 2), 2 μM of inhibitors of RNAses (Boehringer 36 μ / μ), 1 μM of 1M DTT , 1 μg of 5 μg / μl oligo dT (Collaborative Research), 2 μg of 25 mM deoxynucleotide triphosphates (US Biochemicals) and 4 μg of reverse transcriptase (Life Sciences, 24 μg / μg). After 40 minutes at 42øC, the reaction was stopped by heating at 70øC for 10 minutes. To this reaction mixture was then added 320 μΐ of RNase-free water, 80 μΐ buffer (0.1M Tris pH 7.5, 25 mM MgCl₂, 0.5M KCl, 0.25 mg / ml BSA and 50 mM DTT) , 25 units of RNaseH (BRL). After 1 hour at 15 ° C and 1 hour at 22 ° C, 20 μΐ of 0.5M EDTA was added, the reaction mixture was phenol extracted, NaCl added to 0.5M, added linear polyacrylamide (vehicle; Strauss, F . et al., Cell 37: 889-901 (1984)) to 20 μg / ml and the tube was filled with ethanol. After centrifugation for 2-3 minutes at 12,000 xg, the tube was removed, vortexed to release the precipitate scattered across the wall of the tube and again centrifuged for 1 minute.

Os oligonucleótidos não purificados tendo a sequência CTCTAAAG e CTTTAGAGCACA foram dissolvidos numa concentração de 1 mg/ml, MgS04 foi adicionado para 10 mM e o DNA precipitado pela adição de 5 volumes de EtOH. 0 sedimento foi lavado com EtOH a 68The unpurified oligonucleotides having the sequence CTCTAAAG and CTTTAGAGCACA were dissolved in a concentration of 1 mg / ml, MgSO4 was added to 10 mM and the DNA precipitated by the addition of 5 volumes of EtOH. The pellet was washed with EtOH at 68

70% e ressuspenso em TE numa concentração de lmg/ml. 25 μΐ dos oligonucleótidos ressuspensos foram fosforilados pela adição de 3 μΐ de tampão (0,5 M Tris pH 7,5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, espermi- dina, 1 mg/ml BSA e 10 mM MgCl2) e 20 unidades de cinase de polinucleótidos seguido de incubação a 37°C durante a noite.70% and resuspended in TE at a concentration of 1mg / ml. 25 μΐ of the resuspended oligonucleotides were phosphorylated by the addition of 3 μl of buffer (0.5 M Tris pH 7.5, 10 mM ATP, 20 mM DTT, spermidine, 1 mg / ml BSA and 10 mM MgCl 2) and 20 units of polynucleotide kinase followed by incubation at 37 ° C overnight.

3 μΐ dos oligonucleótidos 12-meros e 2 μΐ dos oligonucleótidos 8-meros fosforilados foram adicionados ao cDNA preparado como atrás numa mistura de reacção de 300 μΐ contendo 6 mM3 μΐ of the 12-mer oligonucleotides and 2 μΐ of the 8-mer phosphorylated oligonucleotides were added to the cDNA prepared as above in a 300 μ mistura reaction mixture containing 6 mM

II

Tris pH 7,5, 6 mM MgCl2, 5 mM NaCl, 0,35 mg/ml BSA, 7 mM mercap-toetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM espermidina e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (New England Biolabs) a 15°C durante a noite. Adicionou-se 10 μΐ de 0,5M EDTA, a reacção foi extraída com fenol, precipitada com etanol, ressupensa num volume de 100 μΐ e colocada sobre um gradiente de 5 ml de 5-20% de acetato de potássio em lmM EDTA, 1 jug/ml de brometo de etídio. O gradiente foi centrifugado 3 horas a 50000 rpm (rotor SW55) e fraccionado manualmente, colhendo três fracções de aproximadamente 0,5 ml seguido de seis de aproximadamente 0,25 ml em microtubos por meio de um sistema de infusão em borboleta inserido imediatamente abaixo da curva do tubo. Poliacrilamida linear foi adicionada para 20 μg/ml, os tubos foram cheios com etanol, arrefecidos, centrifugados, agitados com vortex e novamente centrifugados como atrás. 0 precipitado foi lavado com etanol a 70%, seco e ressuspenso em ΙΟμΙ. 1 μΐ das 6 últimas fracções foi corrido num gel para determinar quais as fracções a reunir e tipicamente rejeitou-se material com menos de 1 Kb de tamanho. As restantes fracções foram reunidas e ligadas ao vector. A sequência completa e derivação do vector estão apresentados na Figura 5. O vector foi preparado para clonagem por digestão com BstXI e fraccionamento num gradiente de 5-20% de acetato de potássio como descrito para o cDNA. A banda adequada 69Tris pH 7.5, 6 mM MgCl 2, 5 mM NaCl, 0.35 mg / ml BSA, 7 mM mercaptoethanol, 0.1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidine and 400 units of T4 DNA ligase (New England Biolabs) at 15 ° C overnight. 10 μΐ of 0.5 M EDTA was added, the reaction was phenol extracted, precipitated with ethanol, resuspended in a volume of 100 μΐ and placed on a 5 ml gradient of 5-20% potassium acetate in 1 mM EDTA, 1 ml of ethidium bromide. The gradient was centrifuged 3 hours at 50000 rpm (SW55 rotor) and fractionated manually, harvesting three fractions of approximately 0.5 ml followed by six of approximately 0.25 ml in microtubes by means of a butterfly infusion system inserted just below the curve of the tube. Linear polyacrylamide was added to 20 μg / ml, the tubes were filled with ethanol, cooled, centrifuged, vortexed and centrifuged again as above. The precipitate was washed with 70% ethanol, dried and resuspended in ΙΟμΙ. 1 μΐ of the last 6 fractions were run on a gel to determine which fractions to collect and typically material of less than 1 Kb in size was typically discarded. The remaining fractions were pooled and bound to the vector. The complete sequence and derivation of the vector are shown in Figure 5. The vector was prepared for cloning by digestion with BstXI and fractionation in a 5-20% gradient of potassium acetate as described for the cDNA. The proper band 69

foi colhida com uma seringa sob luz UV de 300 nme precipitada com etanol como atrás. cDNA e vector foram titulados em ligações teste. Geralmente 1-2 μg de vector purificado foram usados para o cDNA derivado de 4 /xg de RNA poli A+. As reacções de ligação foram compostas como descrito para adição do adaptador atrás. As reacções de ligação foram usadas para transformar células MC106l/p3 tornadas competentes como descrito atrás. A eficácia de transformação para o vector superenrolado foi de 3-5 x 108 colónias /jug.was collected with a syringe under 300nm UV light precipitated with ethanol as above. cDNA and vector were titrated on test leads. Generally 1-2 μg of purified vector were used for cDNA derived from 4 μg of poly A + RNA. Binding reactions were composed as described for addition of the backer adapter. Binding reactions were used to transform MC106l / p3 cells made competent as described above. The transformation efficiency for the supercoiled vector was 3-5 x 108 colonies / g.

Recuperação e caracterização do clone de CD28 "Panning" da biblioteca foi realizado como descrito atrás, usando o anticorpo 9.3 purificado (Dupont) numa concentração de 1 jug/ml na mistura de anticorpos. Os métodos usados para a transfecção de células COS, radioimunoprecipitação, hibridação de transferências de RNA e DNA e seguenciação de DNA foram todas como descrito atrás.Recovery and characterization of the CD28 clone " Panning " of the library was performed as described above, using purified antibody (Dupont) at a concentration of 1 μg / ml in the antibody mixture. Methods used for transfection of COS cells, radioimmunoprecipitation, hybridization of RNA and DNA blots and DNA sequencing were all as described above.

Para isolar o cDNA de CD28, construiu-se uma biblioteca grande de cDNA e plasmídeo num vector de elevada eficácia de expressão contendo uma origem de replicação do SV40. Uma versão preferida do vector, contendo uma origem de M13, está apresentada na Figura 6. Três características do vector tornam-no particularmente adequado a este fim: (i) a unidade de transcrição eucarió-tica permite níveis de expressão elevados em células COS de sequências codificadoras colocadas sob o seu controle; (ii)o tamanho pequeno e o arranjo particular das sequências no plasmídeo permitem nível elevado de replicação em células COS; e (iii) a presença de dois sítios idênticos BstXI em orientação invertida e separados por um pequeno fragmento substituível permite a utilização de uma estratégia eficaz baseada em oligonucleótidos para promover a inserção de cDNA no vector. 70To isolate the CD28 cDNA, a large cDNA and plasmid library was constructed in a high expression efficacy vector containing an SV40 origin of replication. A preferred version of the vector containing an M13 origin is shown in Figure 6. Three characteristics of the vector make it particularly suitable for this purpose: (i) the eukaryotic transcription unit allows high expression levels in COS cells of coding sequences placed under their control; (ii) the small size and particular arrangement of the sequences in the plasmid allow high level of replication in COS cells; and (iii) the presence of two identical BstXI sites in inverted orientation and separated by a small, replaceable fragment allows the use of an effective oligonucleotide-based strategy to promote cDNA insertion into the vector. 70

O sítio de clivagem BstXI, CCAN/5NTGG, cria uma extensão 3f de quatro bases que varia de sítio para sítio. Criou-se umThe BstXI cleavage site, CCAN / 5NTGG, creates a fourfold 3f extension spanning from site to site. A

vector em que dois sítios idênticos foram colocados em orientação invertida relativamente um em relação ao outro e separados por um curto segmento de DNA substituível. A digestão com BstXI seguido de remoção do segmento substituível deu uma molécula de vector capaz de se ligar a fragmentos tendo os mesmos extremos do segmento substituível, mas não a si próprio. Paralelamente, oligonucleótidos de cDNA sintético foram empregues dando os mesmos extremos do segmento substituível. 0 cDNA não podendo ser então ligado a si próprio liga-se ao vector. Deste modo o cDNA e o vector foram usados tão eficazmente quanto possível. A colocação de caudas com transferase terminal consegue o mesmo fim, mas com menos conveniência e menos eficácia global. Ainda, os segmentos homopoliméricos situados 5/ relativamente às inserções de cDNA foi descrito como inibindo a expressão in vitro e in vivo (YOkota, T., et al.. Nucl. Acids Res. 14:1511-1524 (1986); Riedel, H.. EMBO J. 3:1477-1483 (1985)). Recentementevector in which two identical sites were placed in inverted orientation relative to each other and separated by a short segment of replaceable DNA. BstXI digestion followed by removal of the substitutable segment gave a vector molecule capable of binding to fragments having the same ends of the replaceable segment, but not to itself. In parallel, synthetic cDNA oligonucleotides were employed giving the same ends of the replaceable segment. The cDNA can not then be bound to itself binds to the vector. In this way the cDNA and vector were used as efficiently as possible. Placement of tails with terminal transferase achieves the same end, but with less convenience and less overall effectiveness. In addition, the homopolymer segments located with respect to the cDNA inserts were described as inhibiting in vitro and in vivo expression (YOkota, T., et al., Nucl Acids Res. 14: 1511-1524 (1986); Riedel, H .. EMBO J. 3: 1477-1483 (1985)). Recently

foram descritas abordagens semelhantes baseadas na utilização de sítios de restrição parcialmente preenchidos para favorecer a inserção de DNAs genómicos (Zabarovsky, E.R., et al.. Gene 42:119-123 (1986)) e cDNAs (Yang, Y., et al.. Cell 47:3-10 (1986)). Estas abordagens dão extremos de 2 a 3 bases complementares, as quais geralmente se ligam menos eficazmente do que as extensões de 4 bases aqui descritas.similar approaches have been described based on the use of partially filled restriction sites to favor the insertion of genomic DNAs (Zabarovsky, ER, et al., Gene 42: 119-123 (1986)) and cDNAs (Yang, Y., et al. Cell 47: 3-10 (1986)). These approaches give ends of 2 to 3 complementary bases, which generally bind less efficiently than the 4-base extensions described herein.

Se bem que o esquema de clonagem do presente invento não resulte numa inserção direcional do cDNA, a capacidade para fazer grandes bibliotecas facilmente, acoplada a um processo de selecção poderos, torna desnecessária a inserção direcional. As eficácias de construção da biblioteca observadas de acordo com o presente invento, entre 0,5 e 2 x 106 recombinantes por μg de 71While the cloning scheme of the present invention does not result in a directional insertion of the cDNA, the ability to make large libraries readily coupled with a powerful selection process makes directional insertion unnecessary. The library building efficiencies observed according to the present invention, between 0.5 and 2 x 106 recombinants per μg of 71

mRNA, com menos de 1% de fundo e um tamanho de inserção superiormRNA, with less than 1% background and an upper insertion size

a 1 Kb, comparou favoravelmente aos descritos para os vectores fágicos lambda gtlO (7f5 x 105//ig de mRNA) e lambda gtll (1,5 x 106^g de mRNA) (Huynh, T., et al.« Em: DNA Cloninq Vol. I. A1 kb, compared favorably to those described for lambda gt10 phage vectors (7-5 x 105æg mRNA) and lambda gtll (1.5 x 106æg mRNA) (Huynh, T., et al., In: DNA Cloninq Vol. I. A

Praticai Approach. Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78); mas os clones resultantes foram mais fáceis de manipular.Practice Approach. Glover, D.M. (ed.), IRL Press, Oxford (1985), pp. 49-78); but the resulting clones were easier to handle.

Os cDNAs de antigénio de superfície podem ser isolados a partir destas bibliotecas usando o método de enriquecimento do presente invento. Neste método, a biblioteca é introduzida em células COS (por exemplo, por fusão de esferoplastos ou de protoplastos), onde se replica e expressa as suas inserções. As células foram colhidas por descolamento sem tripsina, tratadas com anticorpos monoclonais específicos contra os antigénios de superfície pretendidos e distribuídas por placas revestidas com anticorpo contra imunoglobulinas de murganho purificado por afinidade. As células expressando o antigénio de superfície aderem e as restantes células podem removidas por lavagem. A partir das células aderentes preparou-se uma fracção de Hirt (Hirt, B., J. Molec. Biol. 26:365-369 (1967)) e o DNA resultante foi usado para transformar E. coli para mais ciclos de fusão e selecção. Tipicamente, após dois ciclos de selecção com anticorpos monoclonais que reconhecem diferentes antigénios de superfície, realiza-se um só ciclo de selecção com um único anticorpo ou conjunto de anticorpos que reconhecem o mesmo antigénio.Surface antigen cDNAs can be isolated from these libraries using the enrichment method of the present invention. In this method, the library is introduced into COS cells (for example, by fusion of spheroplasts or protoplasts), where it replicates and expresses its insertions. Cells were collected by trypsin-free detachment, treated with specific monoclonal antibodies against the desired surface antigens, and delivered by antibody coated plates against affinity purified mouse immunoglobulins. Cells expressing the surface antigen adhere and the remaining cells can be removed by washing. A Hirt fraction (Hirt, B., J. Molec. Biol., 26: 365-369 (1967)) was prepared from the adherent cells and the resulting DNA was used to transform E. coli for further cycles of fusion and selection. Typically, after two rounds of selection with monoclonal antibodies that recognize different surface antigens, a single round of selection is performed with a single antibody or set of antibodies recognizing the same antigen.

Isolamento de um cDNA de CD28 0 cDNA de CD28 foi isolado a partir de uma biblioteca de aproximadamente 3 x 105 recombinantes preparados a partir de cDNA derivado de 0,8 gg de RNA poli A+ usando uma versão anterior do protocolo descrito nos Materiais e Métodos. A biblioteca foi 72Isolation of a CD28 cDNA The CD28 cDNA was isolated from a library of approximately 3 x 105 recombinants prepared from cDNA derived from 0.8 gg of poly A + RNA using an earlier version of the protocol described in the Materials and Methods. The library was 72

despistada relativamente a clones de cDNA de CD28 (e outro antigénio de superfície) pelo método descrito atrás. Após a terceira transfecção, as células COS foram "panned" com o anticorpo 9.3 sozinho. Preparou-se um sobrenadante de Hirt a partir de células aderentes e usou-se para transformar E. coli. 0 DNA de _ plasmídeo foi isolado a partir de oito colónias e usado para transfectar individualmente culturas de células COS. A presença do antigénio CD28 foi detectada em três de oito culturas trans-fectadas por imunofluorescência indirecta. Os três DNAs de plasmídeo continham uma inserção de aproximadamente 1,5 Kb.cloned relative to CD28 (and other surface antigen) cDNA clones by the method described above. After the third transfection, the COS cells were " panned " with antibody 9.3 alone. A Hirt supernatant was prepared from adherent cells and used to transform E. coli. Plasmid DNA was isolated from eight colonies and used to individually transfect COS cell cultures. The presence of the CD28 antigen was detected in three of eight cultures transfected by indirect immunofluorescence. The three plasmid DNAs contained an insertion of approximately 1.5 Kb.

II

Análise da sequência de cDNAAnalysis of the cDNA sequence

I O cDNA de CD28 codifica uma grelha de leitura aberta grande de 220 resíduos tendo as características típicas de uma proteína de membrana integral (Figura 17). A remoção de uma sequência sinal N-terminal prevista dá uma proteína madura de 202 resíduos compreendendo um domínio extracelular com cinco potenciais sítios de glicosilação ligados em N (Asn-X-Ser/Tre), um domínio hidrofóbico que atravessa a membrana de 27 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 41 aminoácidos. Comparação da sequência de aminoácidos de CD28 com a base de dados da National Biomedical Research Foundation (Versão 10.0) revelou homologia substancial com as regiões variáveis da cadeia pesada de imuno-globulina num domínio que abrange quase toda a fracção extracelular de CD28. Dentro deste domínio dois resíduos císteina nos blocos de homologia Leu-(Ser ou Tre)-Cis e Tir-(Tir ou Fen)-Cis são partilhados por CD28, CD4, CD8 e sequências variáveis de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina e moléculas relacionadas com aproximadamente o mesmo espaço (Maddon et al.. Annu. Rev. Biochem. 48:961-997 (1979)). 73CD28 cDNA encodes a large open reading frame of 220 residues having typical characteristics of an integral membrane protein (Figure 17). Removal of a predicted N-terminal signal sequence gives a mature 202-residue protein comprising an extracellular domain with five potential N-linked glycosylation sites (Asn-X-Ser / Thr), a membrane-spanning hydrophobic domain of 27 amino acids and a cytoplasmic domain of 41 amino acids. Comparison of the CD28 amino acid sequence with the National Biomedical Research Foundation (Version 10.0) database revealed substantial homology to the variable regions of the immunoglobulin heavy chain in a domain encompassing almost the entire extracellular fraction of CD28. Within this domain two cysteine residues in the Leu- (Ser or Tre) -Cis and Tir- (Tir or Fen) -Cis homology blocks are shared by CD28, CD4, CD8 and variable sequences of heavy and light chains of immunoglobulin and related molecules with approximately the same space (Maddon et al., Annu Rev. Biochem 48: 961-997 (1979)). 73

cDNA de CD28 dirige a produção de um homodimero em células COS transfectadasCD28 cDNA directs the production of a homodimer in transfected COS cells

A imunoprecipitação do antigénio CD28 a partir de células COS transfectadas foi realizada usando o anticorpo monoclonal 9.3 (Hansen, J.A., et al.. Immunoaenetics 10:247-260 (1980)). o material obtido a partir de células COS migrou com um peso molecular de 74 Kd em condições não redutoras e 39 Kd em condições redutoras, um padrão consistente com a formação de homodímeros. Nas mesmas condições células T activadas dão bandas com pesos moleculares de 87 e 44 Kd, e células HPB-ALL dão bandas de 92 e 50 Kd, em condições não redutoras e redutoras respectiva-mente. A variação no peso molecular do material obtido a partir de diferentes tipos celulares surge devido a um resultado de diferentes padrões de glicosilação característico de cada um dos tipos. Resultados semelhantes foram observados com outros antigé-nios de superfície de leucócitos (Seed et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1987)). A sequência de nucleótidos do cDNA de CD28 prevê uma proteína madura com peso molecular de 23 Kd, muito mais pequeno do que observado nestas experiências e provavelmente atribuído à utilização dos sítio de glicosilação ligados em N previsto pela sequência de aminoácidos.Immunoprecipitation of CD28 antigen from transfected COS cells was performed using monoclonal antibody 9.3 (Hansen, J.A., et al., Immunoaenetics 10: 247-260 (1980)). the material obtained from COS cells migrated with a molecular weight of 74 Kd under non-reducing conditions and 39 Kd under reducing conditions, a pattern consistent with the formation of homodimers. Under the same conditions activated T cells give bands with molecular weights of 87 and 44 Kd, and HPB-ALL cells give bands of 92 and 50 Kd, under non-reducing and reducing conditions respectively. The variation in molecular weight of the material obtained from different cell types arises due to a result of different patterns of glycosylation characteristic of each of the types. Similar results were observed with other leukocyte surface antigens (Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 87 (1987)). The nucleotide sequence of the CD28 cDNA provides for a mature protein having a molecular weight of 23 Kd, much smaller than observed in these experiments and probably attributed to the use of the N-linked glycosylation sites predicted by the amino acid sequence.

Análise de transferências de RNAAnalysis of RNA Transfers

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares que expressam ou não CD28 foram sujeitas a análise de transferências de DNA como descrito atrás. Quatro bandas com pesos moleculares de 3,7, 3,5, 1,5 e 1,3 Kb foram visíveis nas faixas contendo RNA de timócitos, blastócitos T células T senescentes e as linhas celulares de elucemia de cálulas T PEER e HPB-ALL. Não foram detectadas bandas nas faixas contendo RNA preparado a partir das linhas celulares U937 74Equal amounts of total RNA prepared from cell types expressing or not expressing CD28 were subjected to DNA blot analysis as described above. Four bands with molecular weights of 3.7, 3.5, 1.5 and 1.3 Kb were visible in the bands containing thymocyte RNA, senescent T-cell T-cells and PEER and HPB-ALL T cell elucemia cell lines . No bands were detected in the RNA-containing bands prepared from U937 cell lines.

(leucemia histiocitica), HuT-78 (Leucemia de células T de adulto) , Jurkata (leucemia de células T), Namalwa (linfoma de Burkitt), M0LT4 e HSB-2, todas elas não expressam CD28. 0 produto da transcrição de 1,5 Kb presumivelmente corresponde ao cDNA isolado e as espécies de 3,7 e 3,5 Kb refletem "splicing" incompleto ou utilização de sítios de poliadenilação alternativos. 0 produto de transcrição de 1,3 Kb pode terminar num sinal de poliadenilação não convencional, uma vez que não existe candidato obvio na sequência.(histiocytic leukemia), HuT-78 (adult T cell leukemia), Jurkata (T cell leukemia), Namalwa (Burkitt's lymphoma), M0LT4 and HSB-2 all do not express CD28. The 1.5 kb transcript product presumably corresponds to the isolated cDNA and the 3.7 and 3.5 Kb species reflect " splicing " incomplete or use of alternative polyadenylation sites. The 1.3 Kb transcription product may terminate in an unconventional polyadenylation signal, since there is no obvious candidate in the sequence.

0 gene de CD28 não está rearraniadoThe CD28 gene is not rearranged

A análise das transferências de DNA (Seed, et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1987)) de DNA genómico derivado de placenta, linfócitos do sangue periférico, células T, células HeLa ou das linhas tumorais usadas na análise de transferências de RNA atrás mostrou padrões de digestão Dral idênticos indicando que o rearranjo não está envolvido na expressão normal do gene CD28 durante o desenvolvimento. De forma semelhante não parece haver grandes rearranjos genómicos que suportem a ausência de expressão do antigénio CD28 nas linhas tumorais das células T examinadas. Pode-se deduzir do padrão de fragmentos Dral que o gene CD28 contem pelo menos dois intrões.DNA transfer analysis (Seed, et al., Proc. Natl. Acad Sci USA (1987)) of placental derived genomic DNA, peripheral blood lymphocytes, T cells, HeLa cells or tumor lines used in analysis of RNA rearrangements showed identical Dral digestion patterns indicating that the rearrangement is not involved in the normal expression of the CD28 gene during development. Similarly, there do not appear to be large genomic rearrangements that support the absence of expression of the CD28 antigen on the T cell tumor lines examined. It can be deduced from the Dral fragment pattern that the CD28 gene contains at least two introns.

Exemolo IV Isolamento e Clonaoem Molecular de dois cDNAs de Antigénio CD7 Humano 0 conjunto de anticorpos contra CD7 (Palker, et al.. Leukocvte Tvoing II. Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985)) reconheceu uma glicoproteina de 40 Kd (gp40) na superfície de células T do sangue periférico e timócitos. Estudos preliminares com anticorpos anti-CD7 mostraram que as células T CD7+ aumentam a síntese de imunoglobulina (Ig) pelas células B (Miroshima et 75Exemol IV Isolation and Clone Molecular of two Human CD7 Antigen cDNAs The CD7 antibody pool (Palker, et al., Leukocot Tvoing II, Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985)) recognized a 40 Kd glycoprotein (gp40) on the surface of peripheral blood T cells and thymocytes. Preliminary studies with anti-CD7 antibodies have shown that CD7 + T cells increase immunoglobulin (Ig) synthesis by B cells (Miroshima et al.

II

al.. J. Immunol. 129:1091-1098 (1982)), suprimem a síntese de Ig pelas células Bquando estimuladas com concanavalina A (Haynes et al.. Proc. Natl. Acad. sei. U.S.A. 76:5829-5833 (1979)) e são precursores das células T citotóxicas geradas na cultura de linfócitos mistos (Morishima et al.. J. Immunol. 129:1091-1098 (1982)). Ainda, CD7 foi encontrado como sendo a marca mais reprodutível para a identificação de leucemia linfoblástica aguda de células T (Link et al.. Blood 62:722-728 (1983)). Como tal, foram realizados estudos em que as citotoxinas acopladas ao anticorpo 3A1 anti-CD7 foram usadas para purgar a medula óssea antes da reinfusão para evitar reincidência precoce em transplantes autólogos de medula óssea ou como profiláxia contra enxerto vs. doença do hospedeiro em transplantes alogeneicos de medula óssea (Ramakrishnan et al♦. J. Immunol. 135:3616-3622 (1985)). De forma semelhante anticorpos anti-CD7 também se mostraram promissores como agentes imuno-supressores no tratamento de rejeições de alo-enxertos (Raftery et al.. Transo!. Proc. 17:2737-2739 (1985)) o que está de acordo com a observação recente de que o anticorpo 7G5 anti-CD7 inibe significativamente a reacção primária de linfócitos mistos (Lazarovits et al.. Leukocvte Τνοίηα III. Oxford Univ. Press. Oxford (1987)).al. J. Immunol. 129: 1091-1098 (1982)), suppress Ig synthesis by concanavalin A-stimulated B cells (Haynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 76: 5829-5833 (1979)) and are precursors of cytotoxic T cells generated in the culture of mixed lymphocytes (Morishima et al., J. Immunol., 129: 1091-1098 (1982)). In addition, CD7 has been found to be the most reproducible marker for the identification of acute T-cell lymphoblastic leukemia (Link et al., Blood 62: 722-728 (1983)). As such, studies were carried out in which the cytotoxins coupled to the anti-CD7 3A1 antibody were used to purge the bone marrow prior to reinfusion to prevent early relapse in autologous bone marrow transplants or as prophylaxis versus graft vs. host disease in allogeneic bone marrow transplants (Ramakrishnan et al., J. Immunol., 135: 3616-3622 (1985)). Similarly, anti-CD7 antibodies have also been shown to be promising as immunosuppressive agents in the treatment of allograft rejections (Raftery et al., Transo! Proc. 17: 2737-2739 (1985)) which is in accordance with the recent observation that 7G5 anti-CD7 antibody significantly inhibits the primary mixed lymphocyte reaction (Lazarovits et al., Leukocyte Τνοίηα III, Oxford Univ. Press, Oxford (1987)).

Presentemente não está compreendido o papel fisiológico de CD7. Sabe-se que os anticorpos anti-CD7 não são mitogénicos e que não bloqueiam a resposta de células T a PHA, ou toxóide do tétano (Palker et al.. Leukocyte Tvpincr. Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985)). Alguns autores observaram que a expressão de CD7 em timócitos ocorre antes do etabelecimento do rearranjo da cadeia beta do receptor das células T (Pittaluga et al.. Blood 68:134-139 (1986)) e apontam para um possível papel de CD7 neste rearranjo e subsequente expressão do receptor de células T. É claro que a clonagem do antigénio CD7 facilitará a compreensão do seu papel na fisiologia das células T. Sequenciação de 76At present the physiological role of CD7 is not understood. Anti-CD7 antibodies are known to be non-mitogenic and do not block the T cell response to PHA, or tetanus toxoid (Palker et al., Leukocyte Tvpincr Springer-Verlag, New York, 303-313 (1985) ). Some authors have observed that CD7 expression in thymocytes occurs prior to the establishment of T-cell receptor beta-chain rearrangement (Pittaluga et al., Blood 68: 134-139 (1986)) and point to a possible role of CD7 in this rearrangement and subsequent expression of the T cell receptor. Of course, cloning of the CD7 antigen will facilitate understanding of its role in T cell physiology. Sequencing of 76

nucleótidos e caracterização preliminar de dois cDNAs codificadores do antigénio CD7 foram efectuadas de acordo com o método do presente invento. Levados pela recente sugestão de que CD7 pode ser ou ser parte do receptor de IgM das células T (andrin et al.. Leukocyte Tvoinq III. Oxford Univ. Press. Oxford (1987)), foi avaliada a capacidade de células COS expressando CD7 para se ligarem a IgM ou a complexos imunes de IgM. Os resultados não suportam a simples noção de que CD7 seja ele próprio um receptor de IgM.nucleotides and preliminary characterization of two cDNAs encoding the CD7 antigen were performed according to the method of the present invention. Taken by the recent suggestion that CD7 may be or be part of the T cell IgM receptor (Andrin et al., Leukocyte Tvoinq III, Oxford Univ. Press, Oxford (1987)), the ability of COS cells expressing CD7 to binding to IgM or to IgM immune complexes. The results do not support the simple notion that CD7 is itself an IgM receptor.

Preparação duma biblioteca de cDNA e recuperação e caracterização de clones de CD7 A preparação de uma biblioteca de de cDNA em HPB-ALL no vector de expressão piH3 foi realizado como descrito atrás. "Panning" da biblioteca foi realizado de acordo com o método do presente invento, usando o anticorpo purificado Leu9 anti-CD7 (Bencton Dickinson) e o anticorpo 7G5 como fluido de ascites foi diluido a 1/1000. Métodos para transfecção de células, radioimu-noprecipitação, hibridação de transferências de DNA e de RNA e sequenciação de DNA foram todos já aqui descritos.Preparation of a cDNA library and recovery and characterization of CD7 clones The preparation of a cDNA library on HPB-ALL in the expression vector piH3 was performed as described above. " Panning " of the library was performed according to the method of the present invention, using the purified anti-CD7 Leu9 antibody (Bencton Dickinson) and the 7G5 antibody as the ascites fluid was diluted to 1/1000. Methods for cell transfection, radioimprecipitation, hybridization of DNA and RNA blots and DNA sequencing were all already described herein.

Liaacão de IgM e IaG pelas células COS transfectadas com CD7 e CDw32Ligation of IgM and IaG by COS cells transfected with CD7 and CDw32

Anticorpos IgM, IgG e IgA humanos, anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas humanas (anti-Ig(G+M+A)) purificados e conjugados com FITC, eritrócitos bovinos lavados e preservados e fracções IgG e IgM de anticorpos de coelho anti-eritrócitos bovinos foram adquiridos â Cooper Biomedical (Malverne, PA). Células COS foram transfectadas pelo método do DEAE-dextrano com cDNAs codificadores dos antigénios de superfície CD7, CDw32 e CD28. 48 horas após transfecção as células foram lavadas com 77Human IgM, IgG and IgA antibodies, goat anti-human immunoglobulins (anti-Ig (G + M + A)) purified and conjugated to FITC, washed and preserved bovine erythrocytes, and IgG and IgM fractions of rabbit anti-erythrocyte antibodies cattle were purchased from Cooper Biomedical (Malverne, PA). COS cells were transfected by the DEAE-dextran method with cDNAs encoding the surface antigens CD7, CDw32 and CD28. 48 hours after transfection the cells were washed with 77

PBS/0,5% BSA e incubadas com anticorpos IgM, IgG ou IgA numa concentração de jug/ml a 4°C durante 2 horas. Subseguentemente as células foram lavadas com PBS/0,5% BSA e incubadas durante 30 minutos a 4°C com anticorpos de coelho anti-imunoglobulinas humanas conjugados com FITC a 4°C. Após lavagem as células foram examinadas com um microscópio de fluorescência. As experiências foram também realizadas na presença de 0,1% de azida com os mesmos resultados.PBS / 0.5% BSA and incubated with IgM, IgG or IgA antibodies at a concentration of æg / ml at 4øC for 2 hours. Subsequently the cells were washed with PBS / 0.5% BSA and incubated for 30 minutes at 4 ° C with rabbit anti-human immunoglobulin antibodies conjugated to FITC at 4 ° C. After washing the cells were examined with a fluorescence microscope. The experiments were also run in the presence of 0.1% azide with the same results.

Os eritrócitos bovinos para os ensaios de rosetas foram preparados como descrito por Ercolani et al.. J. Immunol. 127;2044-2051 (1981). Resumidamente, uma suspensão a 2% de eritrócitos bovinos foi lavada com PBS/0,5% BSA e tratada com quantidades subaglutinantes da fracção de IgG ou de IgM dos dos anticorpos de coelho anti-eritrócitos bovinos a 4°C durante 1 hora. Os eritrócitos foram então lavados duas vezes com PBS/0,5% BSA e ajustados a uma solução de 2%. 2 ml de eritrócitos revestidos com anticorpos foram colocados em placas de 60 mm contendo células COS que foram transfectados 48 horas antes com CD7, CD32 ou CD28 pelo método do DEAE-dextrano. As placas foram então centrifugadas a 150xg a 4°C durante 15 minutos. Após mais 45 minutos de incubação a 4°C, as placas foram suavemente lavadas 5 vezes com 5 ml de PBS/0,5% BSA e as células COS foram examinadas quanto à formação de rosetas. Estas experiências foram também realizadas na presença de 0,1% de azida de sódio sem alteração dos resultados.The bovine erythrocytes for the roset assays were prepared as described by Ercolani et al., J. Immunol. 127, 2044-2051 (1981). Briefly, a 2% suspension of bovine erythrocytes was washed with PBS / 0.5% BSA and treated with sub-agglutinating amounts of the IgG or IgM fraction of rabbit anti-bovine erythrocyte antibodies at 4 ° C for 1 hour. The erythrocytes were then washed twice with PBS / 0.5% BSA and adjusted to a 2% solution. 2 ml of antibody-coated erythrocytes were plated onto 60 mm plates containing COS cells which were transfected 48 hours earlier with CD7, CD32 or CD28 by the DEAE-dextran method. The plates were then centrifuged at 150xg at 4øC for 15 minutes. After a further 45 minutes of incubation at 4øC, the plates were gently washed 5 times with 5 ml of PBS / 0.5% BSA and the COS cells were examined for rosetting. These experiments were also performed in the presence of 0.1% sodium azide without changing the results.

Formação de rosetas de células T com eritrócitos revestidos com anticorposFormation of T-cell rosettes with erythrocytes coated with antibodies

Os linfócitos de sangue periférico foram obtidos a partir de sangue heparinizado por centrifugação a 4°C sobre um 78Peripheral blood lymphocytes were obtained from heparinized blood by centrifugation at 4øC on a 78

gradiente de Ficoll-Hypaque a 400xg durante 30 minutos. Os leucócitos na interface foram lavados duas vezes com PBS. Os leucócitos foram ajustados a 10xl07 células/ml em IMDM/10% SoroFicoll-Hypaque gradient at 400xg for 30 minutes. Leukocytes at the interface were washed twice with PBS. The leukocytes were adjusted to 10x107 cells / ml in IMDM / 10% Serum

Fetal Bovino (FBS) e incubados em placas de cultura de tecidos a 37°C durante 30 minutos. As células não aderentes foram transferidas para novas placas e o PHA foi adicionado para estimular a proliferação de linfócitos T. No dia seguinte as células foram lavadas com PBS e colocadas em IMDM fresco/10%FBS.Fetal Bovine (FBS) and incubated in tissue culture plates at 37 ° C for 30 minutes. The non-adherent cells were transferred to new plaques and PHA was added to stimulate proliferation of T lymphocytes. The next day the cells were washed with PBS and placed in fresh IMDM / 10% FBS.

Realizaram-se ensaios de foramção de rosetas três dias mais tarde. As células foram lavadas com PBS/0,5% BSA e uma suspensão de 10 μΐ de 2% eritrócitos revestidos com Ig preparados como descrito atrás adicionada a 10 μΐ de PBS/0,5% BSA contendo 5xl06 células/ml. As misturas foram colocadas em placas de 96 cavidades de fundo redondo Falcon e centrifugadas a 150 xg durante 15 minutos a 4°C. Após uma incubação adicional de 45 minutos a 4°C os sedimentos foram ressuspensos com 10 μΐ de PBS/0,5% BSA e as rosetas contadas em microscopia de contraste de fase. As experiências foram realizadas na presença e na ausência de 0,1% de azida de sódio sem diferença detectável.Rosetting trials were performed three days later. Cells were washed with PBS / 0.5% BSA and a suspension of 10 μg of 2% Ig coated erythrocytes prepared as described above added to 10 μg PBS / 0.5% BSA containing 5x106 cells / ml. The blends were plated in 96-well Falcon round-bottomed dishes and centrifuged at 150 xg for 15 minutes at 4 ° C. After an additional 45 min incubation at 4øC the pellets were resuspended with 10 μ PBS / 0.5% BSA and the rosettes counted under phase contrast microscopy. The experiments were performed in the presence and absence of 0.1% sodium azide with no detectable difference.

Isolamento de cDNAs codificadores do anticénio CD7 humanoIsolation of cDNAs encoding the human CD7 antigen

Para isolar os cDNAs de CD7 construiu-se uma biblioteca grande em plasmídeo no vector de expressão π3Μ como descrito atrás. A biblioteca foi introduzida em células COS por fusão de esferoplastos e deixada a replicar e exprimir as suas inserções. As células COS foram colhidas por descolamento sem tripsina 48 a 72 horas após transfecção, tratadas com anticorpos monoclonais específicos de antigénios de superfície para antigénios de superfície que se pensa serem codificadas com anticorpos anti--murganho purificados por afinidade como aqui descrito. Nestas condições as células que expressam o antigénio de superfície aderem e as restantes células podem removidas por lavagem.To isolate the CD7 cDNAs a large plasmid library was constructed in the π3 expression vector as described above. The library was introduced into COS cells by fusion of spheroplasts and allowed to replicate and express their insertions. COS cells were harvested by trypsin-free detachment at 72 hours post-transfection, treated with surface antigen-specific monoclonal antibodies to surface antigens thought to be encoded with affinity-purified anti-mouse antibodies as described herein. Under these conditions cells expressing the surface antigen adhere and the remaining cells can be removed by washing.

Preparou-se uma fracção de Hirt (Hirt, J. Mol. Biol. 26.:365-369 (1967)) foi preparada a partir de células aderentes e o DNA resultante foi usado para transformar E. coli para mais ciclos de fusão e selecção. No terceiro ciclo de selecção as células descoladas foram tratadas com uma mistura de anticorpos monoclonais específicos para CD7 (765 e Leu9) e um sobrenadante de Hirt foi novamente gerado e usado para transformar E. coli. Após transformação de E. coli com o DNA picaram-se 8 colónias e o DNA de plasmídeo preparado a partir delas por um processo de minipreparação alcalina (Maniatis, et al.. Molecular Cloninc: A laboratorv Manual. Cold Spring Harbor, New York (1982)). Preparou-se DNA a partir de 8 colónias resultantes e usou-se para transfectar células COS. Após 3 dias detectou-se a expressão na superfície do antigénio CD7 por imunofluorescência indirecta em 7 de 8 placas transfectadas. A digestão com enzimas de restrição dos DNAs de plasmídeos correspondentes revelou duas espécies. Uma continha uma inserção de de 1,2 Kb e a outra uma inserção de 1,3Kb.A Hirt fraction (Hirt, J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1967)) was prepared from adherent cells and the resulting DNA was used to transform E. coli for further cycles of fusion and selection. In the third round of selection the detached cells were treated with a mixture of monoclonal antibodies specific for CD7 (765 and Leu9) and a Hirt supernatant was again generated and used to transform E. coli. After transformation of E. coli with the DNA, 8 colonies and the plasmid DNA prepared from them were pooled by an alkaline mini-preparation process (Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1982)). DNA was prepared from the resulting 8 colonies and used to transfect COS cells. After 3 days the expression on the surface of the CD7 antigen was detected by indirect immunofluorescence in 7 of 8 transfected plaques. Restriction enzyme digestion of the corresponding plasmid DNAs revealed two species. One contained a 1.2 kb insert and the other a 1.3Kb insert.

Análise da sequência de cDNA de CD7Analysis of the CD7 cDNA sequence

Ambos os isolados foram sequenciados pelo método de didesoxinucleótidos. 0 cDNA de 1,2 Kb codifica uma grelha de leitura aberta de 240 resíduos tendo as características típicas de uma proteína de membrana integral. A localização inicial do sítio de clivagem da sequência sinal pelo método de von Heijne ÍNucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) foi no 182 resíduo. No entanto, mais tarde determinou-se que a homologia com as regiões variáveis das imunoglobulinas prevê o extremo maduro no resíduo 26; esta localização também está de acordo com a posição do 80Both isolates were sequenced by the dideoxynucleotide method. The 1.2 kb cDNA encodes an open reading frame of 240 residues having the typical characteristics of an integral membrane protein. The initial location of the cleavage site of the signal sequence by the von Heijne method. Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)) was in residue. However, it was later determined that the homology with the variable regions of the immunoglobulins predicts the mature end at residue 26; this location also conforms to the position of the 80

Λ(I.e.

intrão como discutido abaixo na Figura 8. A remoção da sequência sinal N-terminal prevista dá uma proteína madura de 215 resíduos com um peso molecular previsto de 23 Kd. No domínio extracelular estão dois sítios de glicosilação ligados em N (Asn-X-Ser Tre), de acordo com os resultados de Sutherland et al. (J. Immunol. 133:327-333 (1984)), que também mostraram a presença de glicanos ligados em o e ácido palmítico ligado covalentemente na proteína madura. No domínio hidrofóbico de 27 aminoácidos que atravessam a membrana está um único resíduo císteina que pode ser o sítio de acilação com ácidos gordos (Rose et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:2050-2054 (1984); Kaufman et al.. J. Biol. Chem. 259:7230-7238 (1984)). 0 comprimento do domínio citoplasmático, 39 resíduos, está de acordo com os 30-40 aminoácidos previsto por digestão com protease do precursor de CD7 nas fraeções de membranas micorssomais com ribossomas (Sutherland et al.. J. Immunol. 131:327-333 (1984)). A análise da sequência do clone de 1,7 Kb (Figura 8) revelou a presença de um intrão situado a 121 pb do extremo 5/. 0intron as discussed below in Figure 8. Removal of the predicted N-terminal signal sequence gives a mature protein of 215 residues with a predicted molecular weight of 23 Kd. In the extracellular domain are two N-linked glycosylation sites (Asn-X-Ser-Thr), according to the results of Sutherland et al. (J. Immunol., 133: 327-333 (1984)), which also showed the presence of covalently linked glycans and palmitic acid in the mature protein. In the hydrophobic domain of 27 amino acids traversing the membrane is a single cysteine residue which may be the site of acylation with fatty acids (Rose et al., Proc. Natl Acad Sci USA 81: 2050-2054 (1984); Kaufman et al., J. Biol. Chem. 259: 7230-7238 (1984)). The length of the cytoplasmic domain, 39 residues, is in agreement with the 30-40 amino acids predicted by protease digestion of the CD7 precursor on the fractions of micormsomal membranes with ribosomes (Sutherland et al., J. Immunol. 131: 327-333 ( 1984)). Sequence analysis of the 1.7 Kb clone (Figure 8) revealed the presence of an intron located at 121 bp at the 5 'end. 0

intrão de 411 pb contem codões de paragem nas três grelhas de leitura abertas e está situado imediatamente a jusante da sequência sinal secretora, como é frequentemente observado para as proteínas secretadas e de superfície. Ambos os extremos 5/ e 3t do intrão estão de acordo com o sítio consensus dador/aceitador de "splicing" AAG GTRAGA/.../Yg-nNYAG A (Mount, Nucl. Acids Res. 10:459-472 (1982)). Devido aos clones de 1,2 e 1,7 Kb expressarem o antigénio CD7 igualmente bem em células COS, o intrão deve ser removido em células COS de forma pouco eficaz. A comparação da sequência de aminoácidos com a base de dados da National Biomedical Research Foundation revelou homolo-gia substancial com a cadeia kapa de imunoglobulina humana e de murganho e com as regiões variáveis da cadeia gama do receptor de 81411 bp intron contains stop codons in the three open reading frames and is situated immediately downstream of the secretory signal sequence as is often observed for secreted and surface proteins. Both the 5 'and 3' ends of the intron are in accordance with the consensus sender / acceptor site of " splicing " AAG GTRAGA / ... / YG-nNYAG A (Mount, Nucl Acids Res. 10: 459-472 (1982)). Because the 1.2 and 1.7 Kb clones express the CD7 antigen equally well in COS cells, the intron must be removed in COS cells inefficiently. Comparison of the amino acid sequence with the National Biomedical Research Foundation database revealed substantial homology to the human and mouse immunoglobulin kappa chain and to the gamma receptor variable gamma regions

11

células T em quase todo o segmento extracelular da molécula. Dois resíduos císteina partilhados com espaços aproximadamente iguais pelas três estruturas caem nas sequências conservadas Ile-Tre-Cis e Tir-X-Cis. Nas regiões variáveis da cadeia kapa estas císteinas formam um ponte dissulfureto. A presença de pelo menos uma ponte dissulfureto intracadeia na estrutura CD7 foi anteriormente proposto por Sutherland et al.. (J. Immunol. 133:327-333 (1984)), que observaram que a imunoprecipitação de CD7 dá origem a uma-banda com um peso molecular aparente de 40 Kd em condições redutoras e 38 Kd em condições não redutoras.T cells in almost the entire extracellular segment of the molecule. Two cysteine residues shared with approximately equal spaces by the three structures fall into the conserved Ile-Tre-Cys and Tir-X-Cys sequences. In the variable regions of the kappa chain these cysteines form a disulfide bridge. The presence of at least one intracholesterol disulfide bridge in the CD7 structure was previously proposed by Sutherland et al. (J. Immunol. 133: 327-333 (1984)), who observed that CD7 immunoprecipitation gives rise to a band- an apparent molecular weight of 40 Kd under reducing conditions and 38 Kd under non-reducing conditions.

Com base na homologia com regiões V de imunoglobulina prevê-se que CD7 contenha uma ligação dissulfureto ligando Cis 23 e Cis 89. Uma segunda ponte dissulfureto, ligando Cis 10 e Cis 117 foi proposta com base na semelhança estrutural entre CD7 e Thy-1. Os domínios extracelulares de Thy-1 e CD7 têm 4 resíduos de císteina, em posições praticamente homólogas. Os 4 resíduos de císteina de Thy-1 estão ligados em duas pontes dissulfuretos internas entre Cis 9-111 e Cis 19-85 (Williams et al.. Science 216:696-703 (1982)). Em Thy-1, Cis 111 forma uma ligação amida com a fracção etanolamina de fosfatidilinositol substituído e é portanto o último resíduo da molécula madura (Tse et al.. Science 230:1003-1008 (1985)). Em CD7, Cis 117 é seguido de quatro repetições de uma sequência cujo consensus é Xaa-Pro-Pro-Xaa-Ala--Ser-Ala-Leu-Pro e que é proposto que desempenhe o papel de um pedúnculo projectando o domínio tipo V para fora da superfície celular.Based on homology with immunoglobulin V regions CD7 is expected to contain a disulfide bond linking Cys 23 and Cys 89. A second disulfide bond, Cys 10 and Cys 117 ligand was proposed based on the structural similarity between CD7 and Thy-1. Extracellular domains of Thy-1 and CD7 have 4 residues of cysteine, in substantially homologous positions. The 4 residues of Thy-1 cysteine are linked at two internal disulfide bridges between Cys 9-111 and Cys 19-85 (Williams et al., Science 216: 696-703 (1982)). In Thy-1, Cys 111 forms an amide bond with the ethanolamine fraction of substituted phosphatidylinositol and is therefore the last residue of the mature molecule (Tse et al., Science 230: 1003-1008 (1985)). In CD7, Cys 117 is followed by four replicates of a sequence whose consensus is Xaa-Pro-Pro-Xaa-Ala-Ser-Ala-Leu-Pro and which is proposed to play the role of a peduncle by projecting the V-like domain off the cell surface.

Para além das homologias apresentadas na Figura 20 e referidas atrás, o domínio extracelular de CD7 tem homologia significativa com ambas as cadeias do heterodímero de CD8 de rato (Johnson et al.. Nature 323:74-76 (1986)) e a proteína P0 da mielina (Lemke et al.. Cell 40:501-508 (1985)). CD7 dirige a produção de uma proteína de 40 Kd nas células COS transfectadas A imunoprecipitação do antigénio CD7 a partir de células COS transfectadas foi realizada como aqui descrito usando o anticorpo monoclonal 7G5 (Lazarovits et al.. Leukocvte Tvping III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987). O material obtido a partir de células COS migrou como uma banda larga com peso molecular de 40 Kd em condições redutoras. Nas mesmas condições células HPB-ALL (a linha dadora de cDNA) e células T activadas deram bandas com pesos moleculares de 41 e 39 Kd respectivamente. Tanto nas células COS como nas células HPB-ALLfoi também observada uma banda fraca com peso molecular de 30 τd, possivelmente correspondendo a um precursor parcialmente glicosilado (Sutherland, D.R., et al.. J. Immunol. 133:327-333 (1984)).In addition to the homologies presented in Figure 20 and referred to above, the CD7 extracellular domain has significant homology to both the rat CD8 heterodimer chains (Johnson et al., Nature 323: 74-76 (1986)) and the P0 protein of myelin (Lemke et al., Cell 40: 501-508 (1985)). CD7 drives the production of a 40 Kd protein in transfected COS cells. Immunoprecipitation of CD7 antigen from transfected COS cells was performed as described herein using 7G5 monoclonal antibody (Lazarovits et al., Leukocyte Tvp III, Oxford Univ. Press, The material obtained from COS cells migrated as a broadband with a molecular weight of 40 Kd under reducing conditions under the same conditions. HPB-ALL cells (the cDNA donor line) and activated T cells (Table 2). In both COS and HPB-ALL cells, a weak band with a molecular weight of 30 d d was observed, possibly corresponding to a partially glycosylated precursor (Sutherland, DR, et al. J. Immunol., 133: 327-333 (1984)).

Análise de transferências de RNAAnalysis of RNA Transfers

Quantidades iguais de RNA total preparado a partir de tipos celulares expressando ou não tendo CD7 foram sujeitas a análise de transferências Northern como aqui descrito. Uma única espécie de 1,3 Kb foi visível nas faixas contendo RNA de timóci-tos, células T activadas, células T em repouso e de linhas de leucémias de células T, HuT-78, HPB-ALL, Jurkat J3R7, HSB-2 e PEER. Com excepção da linha de células PEER, nenhum dos tumores de células T apresentou sobre-expressão significativa dos transcritos CD7. 0 RNA de CD7 foi detectado em todas as células derivadas do timo, mas não em RNA de células U937 (leucemia histiocítica) e Namalwa (Linfoma de Burkitt). Não se detectou qualquer banda correspondendo ao cDNA de 1,7 Kb, sugerindo que esta espécie é artificialmente enriquecida durante o processo de clonagem ou de amplificação da biblioteca. 83Equal amounts of total RNA prepared from cell types expressing or not having CD7 were subjected to Northern blot analysis as described herein. A single 1,3 Kb species was visible in the lanes containing thymocytes, activated T cells, resting T cells, and T cell leukemia lines, HuT-78, HPB-ALL, Jurkat J3R7, HSB-2 and PEER. With the exception of the PEER cell line, none of the T cell tumors showed significant overexpression of CD7 transcripts. CD7 RNA was detected in all cells derived from the thymus, but not in RNA from U937 (histiocytic leukemia) and Namalwa (Burkitt's Lymphoma) cells. No band corresponding to the 1.7 Kb cDNA was detected, suggesting that this species is artificially enriched during the cloning or amplification process of the library. 83

» O enriquecimento durante a amplificação parece improvável pois o clone de cDNA de 12 Kb propaga-se tão bem em E. coli como o clone 1.7 Kb. No entanto, imediatamente a montante e a jusante do sítio da inserção do intrão estão sequências que poderão formar um estrutura em pé e ansa interrompida. Oito dos 10 pares de bases do potencial pé são pares GC, talvez dando a estrutura estabilidade suficiente para interferir com a elongação da primeira cadeia de cDNA. A presença do intrão separa grandemente as duas metades do pé, potencialmente eliminando a estrutura através de uma entropia de ansa desfavorável e permitindo a síntese eficaz de uma primeira cadeia. O gene CD7 não é rearraniado A análise de transferências Southern do DNA genómico derivado de placenta, linfócitos de sangue periférico, células T, células HeLa ou as linhas de células tumorais usadas na análise de transferências de RNA atrás mostrou padrões idênticos de digestão com Dral. Assim, o gene CD7 não é grandemente alterado durante o desenvolvimento e o nível elevado de expressão na linha celular PEER não é a consequência de um rearranjo genómico substancial.»Enrichment during amplification seems unlikely since the 12 Kb cDNA clone propagates as well in E. coli as the 1.7 Kb clone. However, immediately upstream and downstream of the intron insertion site are sequences which may form a disrupted standing and loop structure. Eight of the 10 base pairs of the potential foot are GC pairs, perhaps giving the structure sufficient stability to interfere with the elongation of the first strand of cDNA. The presence of the intron greatly separates the two halves of the foot, potentially eliminating the structure through unfavorable loop entropy and allowing effective synthesis of a first strand. The CD7 gene is not rearranged. Southern blot analysis of genomic DNA derived from placenta, peripheral blood lymphocytes, T cells, HeLa cells or the tumor cell lines used in the analysis of RNA blots showed identical patterns of Dral digestion. Thus, the CD7 gene is not greatly altered during development and the high level of expression in the PEER cell line is not the consequence of substantial genomic rearrangement.

JJ

Células COS expressando CD7 não se ligam a IoMCOS cells expressing CD7 do not bind to IoM

Os linfócitos T humanos do sangue periférico expressam receptores de anticorpos IgM (FcRu: Moretta et al.. Eur. J. Immunol. 5:565-569 (1975); McConnell et al.. islmmunol. 30:835--837 (1976)). Recentemente foi descrito que CD7 deve desempenhar um papel na ligação de IgM a células T (Sandrin et al.. LeukocvteHuman peripheral blood T lymphocytes express IgM antibody receptors (FcRu: Moretta et al., Eur. J. Immunol. 5: 565-569 (1975); McConnell et al., Immunol., 30: 835-837 (1976) )). It has recently been described that CD7 should play a role in IgM binding to T cells (Sandrin et al., Leukocyte

Tvninq III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)). As células L, normalmente CD7” e FcRu~, tornam-se CD7+e FcRu+ quando transfectadas com um fragmento genómico de 16 Kb 84Tnnq III. Oxford Univ. Press, ed., Oxford, England (1987)). L cells, usually CD7 + and FcR11 +, become CD7 + and FcRu + when transfected with a 16 Kb genomic fragment

codificador do antigénio CD7 (Sandrin et al.. Leukocvte Tvpinq III.. Oxford Ubniversity Press, editor, Oxford, England (1987)). Ainda, a ligação de IgM a células CD7 positivas pode ser bloqueada pelo anticorpos monclonal anti-CD7 Hully-m2 (Thurlow et al.. Transolantation 38:143-147 (1984)) e as colunas de IgM ligam uma proteína de 37 Kd derivada de lisados marcados radioactivamente de linfócitos T de sangue periférico (Sandrin et al.. Leukocvte Tvpinq III. Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)).encoding the CD7 antigen (Sandrin et al., Leukocyte Tvpinq III .. Oxford Ubniversity Press, ed., Oxford, England (1987)). In addition, binding of IgM to CD7-positive cells can be blocked by monoclonal anti-CD7 Hully-m2 antibodies (Thurlow et al., Transolantation 38: 143-147 (1984)) and IgM columns bind a 37 Kd protein derived of radioactively labeled lysates of peripheral blood T lymphocytes (Sandrin et al., Leukocyte Tvpinq III, Oxford Univ. Press, ed., Oxford, England (1987)).

Assim, células COS expressando CD7 foram testadas relativamente à sua capacidade para ligar IgM. A actividade de receptor de IgM foi ensaiada por ligação directa (Hardin et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:912-914 (1979)) ou por um ensaio de rosetas com eritrócitos de boi revestidos com uma fraeção de IgM de soro de coelho anti-eritrócitos bovinos como descrito por Ercolani et al.. J. Immunol. 127:2044-2051 (1981)). As células expressando CD7 não se ligam a IgM humano nem forma rosetas com eritrócitos revestidos com IgM. Nas mesmas condições, as células COS transfectadas com um cDNA codificador do receptor CDw32 de IgG humana liga-se directamente a IgG e forma rosetas com eritrócitos revestidos com IgG. Os eritrócitos revestidos com anticorpos IgM ou IgG também aderem a uma fraeção de linfócitos periféricos como descrito (Moretta et al.r Eur. J. Immunol. 5:565.569 (1975).Thus, COS cells expressing CD7 were tested for their ability to bind IgM. IgM receptor activity was assayed by direct binding (Hardin et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 76: 912-914 (1979)) or by an assay of rosettes with ox erythrocytes coated with a fraction of IgM from rabbit serum to bovine erythrocytes as described by Ercolani et al., J. Immunol. 127: 2044-2051 (1981)). CD7 expressing cells do not bind to human IgM or form rosettes with erythrocyte coated with IgM. Under the same conditions, COS cells transfected with a cDNA encoding the human IgG CDw32 receptor bind directly to IgG and form rosettes with IgG coated erythrocytes. Erythrocytes coated with IgM or IgG antibodies also adhere to a peripheral lymphocyte fraction as described (Moretta et al., Eur. J. Immunol., 5: 565-569 (1975).

Estes resultados não apoiam a noção de que o antigénio CD7 seja por si só um receptor de IgM, se bem que eles não excluam a possibilidade de as células COS suprimirem a actividade de ligação de IgM de alguma forma ou que CD7 seja parte do receptor de IgM ou modificado para o ser. Que CD7 não é por si só um receptor de IgM é apoiado pela observação de que uma série de linhas de células T CD7+ são FcRu- (Sandrin et al.f LeukocvteThese results do not support the notion that the CD7 antigen is in itself an IgM receptor, although they do not exclude the possibility that COS cells suppress IgM binding activity in some way or that CD7 is part of the receptor. IgM or modified to be. That CD7 is not by itself an IgM receptor is supported by the observation that a number of CD7 + T cell lines are FcRu- (Sandrin et al., Leukocvte

Tvpinq III Oxford Univ. Press, editor, Oxford, England (1987)).Tvpinq III Oxford Univ. Press, ed., Oxford, England (1987)).

Exemplo VExample V

Isolamento e Clonacrem Molecular do Anticrénio CDw32 HumanoIsolation and Cloning of Human CDw32 Anticrene Molecular

Um cDNA codificador do antigénio CDw32 humano, umA cDNA encoding the human CDw32 antigen, a

receptor humano dos domínios constantes da imunoglobulina G (receptor Fc), foi isolado pelo método do presente invento, devido â sua afinidade para o seu ligando, igG. A sequência do clone isolado está estreitamente relacionada com o receptor Fc beta murino, mas diverge completamente na fracção codificador dohuman receptor for immunoglobulin G (Fc receptor) constant domains was isolated by the method of the present invention, owing to its affinity for its ligand, IgG. The isolated clone sequence is closely related to the murine Fc beta receptor, but completely diverges in the coding moiety from

domínio citoplasmático. 0 receptor expresso em células COS apresentou uma preferência para IgGi entre os subtipos de IgG e nenhuma afinidade para IgM, IgA ou IgE.cytoplasmic domain. The receptor expressed in COS cells showed a preference for IgGi between the IgG subtypes and no affinity for IgM, IgA or IgE.

Para isolar o clone do receptor Fc, preparam-se bibliotecas de cDNA a partir de linhas de células tumorais ou a partir de um tumor humano e transfectaram-se células COS. Após 48 horas, as células foram tratadas com anticorpos IgG de murganho ou humanos e deixadas em repouso nas placas revestidas com anticorpos de carneiro anti-IgG de murganho ou com anticorpos de cabra anti-IgG humana purificadas por afinidade. Após lise, recuperação de DNA e transformação de E. coli. o ciclo foi repetido durante mais duas vezes. Se bem que não tenham sido isolados clones positivos a partir das bibliotecas de linhas tumorais, um clone de cDNA codificador de um receptor Fc foi isolado a partir de uma biblioteca preparada a partir de um tumor adrenal humano. Desco-briu-se que muitos tumores estão altamente infiltrados por macrófagos e linfócitos. Assim,, o RNA tumoral pode ser uma boa fonte em geral para transcritos de macrófagos humanos.In order to isolate the Fc receptor clone, cDNA libraries are prepared from tumor cell lines or from a human tumor and COS cells are transfected. After 48 hours, the cells were treated with mouse or human IgG antibodies and allowed to stand on the plates coated with sheep anti-mouse IgG antibodies or with affinity-purified goat anti-human IgG antibodies. After lysis, DNA recovery and transformation of E. coli. the cycle was repeated for two more times. Although no positive clones were isolated from the tumor line libraries, a cDNA clone encoding an Fc receptor was isolated from a library prepared from a human adrenal tumor. It has been discovered that many tumors are highly infiltrated by macrophages and lymphocytes. Thus, tumor RNA may be a good source in general for transcripts of human macrophages.

Por ensaio de imunofluorescência indirecta, o receptor humano expresso em células COS ligou todas as IgGs de murganho e humanas com afinidade relativamente baixalO”7M) e observou-se uma discriminação clara entre anticorpos humanos para IgGi· IgM,By indirect immunofluorescence assay, the human receptor expressed on COS cells bound all mouse and human IgGs with relatively low affinity for Î "7M) and a clear discrimination was observed between human antibodies to IgGÎ ± IgM,

IgAi, IgA2 e IgE humanas não se ligam nem tal acontece com IgM ou IgA murina. Conforme esperado Fc humano mas não os fragmentos Fab ligaram-se âs células transfectadas. Entre os anticorpos monoclo-nais apresentados ao Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens, três deram forte imunofluorescência positiva: dois (de entre dois) reconhecendo o determinante CDw32 do receptor Fc e um (de entre quatro) reconhecendo o determinante CD23 (receptor Fc de IgE em células B). Os monoclonais que reconhecem o antigénio CD16 do receptor Fc de células T/macrófa-gos deu apenas uma imunofluorescência fraca comparável com a mostrada pelas ascites testemunha. A radio-imunoprecipitação de células cos transfectadas com anticorpos Cdw32 mostrou a presença de uma única espécie de 40 Kd, comparável em tamanho com o antigénio reconhecido na superfície da linha mielóide CDw32+ HL-60 e com o antigénio menos abundante presente na linha leucémica histiocítica U937. Este resultado reforça a noção de que o receptor isolado é CDw32, pois o receptor CD16 está descrito como sendo substancialmente maior (60-70 Kd). A sequência de nucleótidos do receptor isolado (Figura 9) é altamente homóloga da dos membros da família recentemente isolada de receptores murinos e mais estreitamente relacionada com o receptor beta2 murino por homologia de ácidos nucleicos. Surpreendentemente, o receptor beta2 murino é encontrado em linfócitos B e T e macrófagos; no sistema humano, CDw32 (mostrado aqui como sendo do tipo beta2) está restringido a macrófagos enquanto um outro receptor Fc (CD16) é encontrado linfócitos e macrófagos. A sequência humana parece ter divergido da sequência de murganho pela inserção de aproximadamente 1 Kb de DNA algumas bases 3/ relativamente à junção entre os domínios transmembranar e citoplasmático. As junções do sítio de inserção não mostram 87Human IgA1, IgA2 and IgE do not bind nor does this occur with murine IgM or IgA. As expected human Fc but not the Fab fragments bound to the transfected cells. Among the monoclonal antibodies presented to the Third International Workshop on Leukocyte Differentiation Antigens, three gave a strong positive immunofluorescence: two (out of two) recognizing the CDw32 determinant of the Fc receptor and one (out of four) recognizing the CD23 determinant IgE in B cells). Monoclonals that recognize the CD16 antigen of the T cell receptor / macrophage Fc gave only a weak immunofluorescence comparable to that shown by the control ascites. Radioimmunoprecipitation of cos cells transfected with Cdw32 antibodies showed the presence of a single 40 Kd species, comparable in size with the recognized antigen on the surface of the CDw32 + HL-60 myeloid line and with the less abundant antigen present on the histiocytic leukemic line U937 . This result reinforces the notion that the receptor alone is CDw32, since the CD16 receptor is described as being substantially larger (60-70 Kd). The nucleotide sequence of the isolated receptor (Figure 9) is highly homologous to that of the members of the newly isolated murine receptor family and more closely related to the murine beta2 receptor by nucleic acid homology. Surprisingly, the murine beta2 receptor is found on B and T lymphocytes and macrophages; in the human system, CDw32 (shown herein as being of the beta2 type) is restricted to macrophages whereas another Fc receptor (CD16) is found lymphocytes and macrophages. The human sequence appears to have diverged from the mouse sequence by inserting approximately 1 Kb of DNA into some bases 3 / to the junction between the transmembrane and cytoplasmic domains. The insertion site junctions do not show 87

relações óbvias com sequências dadoras e aceitadoras de "splicing". A comparação das sequências peptídicas humana e murina mostraram que a sequência peptídica diverge no final do domínio transmembranar, antes da sequência de nucleõtidos divergir sugerindo a existência de uma pressão selectiva favorecendo a criação de um domínio citoplasmático diferente.obvious relationships with " splicing " acceptor " sequences. Comparison of the human and murine peptide sequences showed that the peptide sequence diverged at the end of the transmembrane domain, before the nucleotide sequence diverged suggesting the existence of a selective pressure favoring the creation of a different cytoplasmic domain.

A análise de transferências de RNA mostrou que linhas mielóides mas não linhas celulares linfocíticas expressavam RNA homólogo da sonda CDw32. A análise de transferências de DNA mostrou múltiplas bandas consistentes com a existência de uma pequena família de multigenes.Analysis of RNA transfers showed that myeloid lines but not lymphocytic cell lines expressed RNA homologous to the CDw32 probe. DNA transfer analysis showed multiple bands consistent with the existence of a small family of multigenes.

Exemplo VI Isolamento e Clonaaem Molecular de Dois Clones de cDNA Codificadores do Antiaénio CD20 Específico de LinfÓcitOS B f Bl, Bp35)Example VI Isolation and Molecular Cloning of Two Clones of cDNA Encoders of Antigen CD20 Specific to Lymphocytes B f Bl, Bp35)

Estudos recentes sugerem que o antigénio CD20 das células B (Bl, Bp35) desempenha um papel importante na activação de células B. Os anticorpos monoclonais (mAb) contra CD20 induzem diferentes respostas celulares dependendo do anticorpo usado e da fase de diferenciação ou activação das células B alvo. 0 anticorpo monoclonal 1F5 activa as células B em repouso através da iniciação da transcrição da fase Gq para a fase do ciclo celular e induz a proliferação de células B densas das amígdalas (Clark et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:1766 (1985); Clark e Shu, J. Immunol. 138:720 (1987)). No entanto, 1F5 não induz um aumento no cálcio citoplasmático livre e não induz a proliferação de células B circulantes (Rabinovitch et al. . Em: Leukocvte Typino III (McMichael, Ed.), p. 435, Oxford University Press (1987)). Encontrou-se que outros mAbs anti-CD20, como seja Bl, bloqueiam a activação das células B (Tedder et al.. J. Immunol. 135:973 (1985)) e tanto 1F5 como Bl podem inibir a diferenciação 88Recent studies suggest that B cell antigen CD20 plays a role in B cell activation. Monoclonal antibodies (mAb) against CD20 induce different cell responses depending on the antibody used and the phase of differentiation or activation of cells B target. Monoclonal antibody 1F5 activates resting B cells by initiating transcription of the Gq phase into the cell cycle phase and induces proliferation of dense tonsil B cells (Clark et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 82 : 1766 (1985), Clark and Shu, J. Immunol., 138: 720 (1987)). However, 1F5 does not induce an increase in free cytoplasmic calcium and does not induce proliferation of circulating B cells (Rabinovitch et al., In: Leukocyte Typino III (McMichael, Ed.), 435, Oxford University Press (1987)). . Other anti-CD20 mAbs, such as B1, have been found to block B cell activation (Tedder et al., J. Immunol. 135: 973 (1985)) and both 1F5 and B1 can inhibit differentiation.

de células B (Golay et al.. J. Immunol. 135:3795 (1985)). Recentemente foi sugerido que a fosforilação e internalização de CD20 podem ser passos necessário para a entrada das células B na faseof B cells (Golay et al., J. Immunol., 135: 3795 (1985)). It has recently been suggested that phosphorylation and internalization of CD20 may be steps necessary for the entry of B cells into the

Gi do ciclo celular (Valentine, Ed.)# Em: Leukocyte Tvpincr III p.440, Oxford University Press (1987)). No presente exemplo, dois clones de cDNA de CD20 foram isolados e expressos usando os métodos do presente invento.Gi of the cell cycle (Valentine, Ed.) # In: Leukocyte Tvpincr III p.440, Oxford University Press (1987)). In the present example, two CD20 cDNA clones were isolated and expressed using the methods of the present invention.

Preparação da biblioteca de cDNA e recuperação de clones de cDNA por "panninq'1Preparation of the cDNA library and recovery of cDNA clones by " panninq'1

Preparou-se RNA poli (A)+ a partir da linha celular humana Daudi de Burkitt por cromatografia em oligo (dT) celulose de RNA total isolado por processos aqui descritos. A preparação de cDNA e a construção da biblioteca de expressão foram realizadas como descrito.Poly (A) + RNA was prepared from the Burkitt Daudi human cell line by oligo (dT) cellulose chromatography of total RNA isolated by the procedures described herein. The cDNA preparation and the expression library construct were performed as described.

Os anticorpos anti CD20 1F5, 2H7, Bl, L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl e NU-B2 foram adquiridos â International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al.. Em: Leukocyte Tvpinq III (McMichael, Ed.), p. 440, Oxford University Press (1987)). Os mAbs purificados foram usados numa diluição de 1:1000. Fez-se "panning" de acordo com o presente método. No primeiro ciclo de despiste, oito placas de 10 cm de células COS 50% confluentes foram transfectadas pelo método do DEAE-Dextran. Realizaram-se ciclos de despistes subsequentes por fusão de esferoplastos.The anti-CD20 antibodies 1F5, 2H7, B1, L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl and NU-B2 were purchased from the International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., In Leukocyte Tvpinq III (McMichael, Ed. ), p440, Oxford University Press (1987)). Purified mAbs were used in a 1: 1000 dilution. We made " panning " according to the present method. In the first round of screening, eight 10 cm plates of 50% confluent COS cells were transfected by the DEAE-Dextran method. Cycles of subsequent scans were performed by spheroplast fusion.

Imunoprecipitacão. Seauenciacão. Hibridacão de Transferências de RNA e DNAImmunoprecipitation. Seauenciacão. Hibernation of RNA and DNA Transfers

Linhas de células B CESS e Daudi foram marcadas metabo-licamente com 35S-metionina e 35-císteina durante 6 horas a 89CESS and Daudi B cell lines were metabolically labeled with 35 S-methionine and 35-cysteine for 6 hours at 89

37°C. Células COS transfectadas pelo método de DEAE-Dextran foram marcadas de forma semelhante 36 horas pós-infecção. As células marcadas foram incubadas com o mAb BI (Coulter) a 4°C durante 1 hora, lavadas em PBS e lisadas com 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 0,05% desoxicolato e 1 mM PMSF em PBS. Após centrifugação (13000xg, 5 min.), o lisado foi incubado com células S♦ aureus (Calbiochem) durante 1 hora a 4°C. As células S. aureus foramsedimentadas, lavadas 5 vezes com 1% NP-40/PBS, eluidas e sujeitas a electro-forese através de géis de 12,5% de poliacrilamida.37øC. COS cells transfected by the DEAE-Dextran method were similarly labeled 36 hours postinfection. The labeled cells were incubated with the mAb B1 (Coulter) at 4øC for 1 hour, washed in PBS and lysed with 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 0.05% deoxycholate and 1 mM PMSF in PBS. After centrifugation (13000xg, 5 min), the lysate was incubated with S ♦ aureus cells (Calbiochem) for 1 hour at 4 ° C. S. aureus cells were seeded, washed 5 times with 1% NP-40 / PBS, eluted and electrophoresed through 12.5% polyacrylamide gels.

A análise de transferências de DNA e RNA e a preparação de sondas de hibridação foram realizadas como descrito. A sequen-ciação foi feita pelo método de Sanger et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977)). A sequência de nucleótidos do cDNA de CD20.4 está representada na Figura 10.Analysis of DNA and RNA blots and the preparation of hybridization probes were performed as described. Sequencing was done by the method of Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Know. USA 74: 5463 (1977)). The nucleotide sequence of the CD20.4 cDNA is shown in Figure 10.

Dois clones de cDNA, portadores de inserções de 1,5 (CD20.4) e 1,0 Kb (CD20.6), foram isolados a partir de uma biblioteca de DNA de células Daudi por "panning” com um painel de mAbs contra CD20. As células COS transfectadas com qualquer um dos clones reagiu com todos os membros do apinel de anticorpos. A imunoprecipitação de proteína codificada por cDNA a partir de células COS transfectadas mostrou duas bandas de 32 e 30 Kd reminiscentes das bandas de 37 e 35 Kd observadas em diferentes sub-séries e linhas de células B (Valentine et al.. "Structure and Function of the B Cell Specific 35-37 KDa CD20 Protein" Em: Leukocvte Tvpinq III (McMichael, Ed.), p. 440, Oxford University Press (1987)). Foi observado pelos presente inventores que os pesos moleculares dos antigénios de superfície expressos em células COS são consistentemente mais pequenos do que as suas contrapartes nativas. Isto pode ser devido a diferenças na glicosilação. 90Two cDNA clones carrying 1.5 (CD20.4) and 1.0 Kb (CD20.6) inserts were isolated from a Daudi cell DNA library by " panning " with a panel of mAbs against CD20. COS cells transfected with any of the clones reacted with all members of the apinel of antibodies. Immunoprecipitation of cDNA encoded protein from transfected COS cells showed two 32 and 30 Kd bands reminiscent of the 37 and 35 Kd bands observed in different sub-series and B cell lines (Valentine et al. &Quot; Structure and Function of the B Cell Specific 35-37 KDa CD20 Protein " In: Leukocyte Tvpinq III (McMichael, Ed.), P440, Oxford University Press (1987)). It has been observed by the present inventors that the molecular weights of the surface antigens expressed on COS cells are consistently smaller than their native counterparts. This may be due to differences in glycosylation. 90

Ambos os clones de cDNA têm a mesma sequência codificadora e diferem apenas na região 3/ não traduzida. A inserção no clone CD20.6 tem uma pequena cauda poli A e não possui um sinal de poliadenilação consensus, enquanto que a inserção em CD20.4 não possui uma cauda poliA e estende-se 431 pb para lá do extremo 3/ em CD20.6 (Fig. 10A).Both cDNA clones have the same coding sequence and differ only in the 3 / untranslated region. The insert in clone CD20.6 has a small poly A tail and lacks a consensus polyadenylation signal, whereas the insert in CD20.4 lacks a polyA tail and extends 431 bp beyond the 3 'end in CD20. 6 (Fig. 10A).

A análise de transferências de RNA mostrou que três transcritos de 3,8, 3,0 e 1,5 Kb estavam presentes em células B mas ausentes de outros tipos celulares, de acordo com o padrão conhecido de reactividade de anticorpos (Clark et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82.:1766 (1985); Clark et al.. J. Immunol. 138:720 (1987); Tedder et al.. J. Immunol. 135:973 (1985); Golay et al♦. J. Immunol. 135:3795 (1985)). Parece provável que o clone CD20.6 derive do transcrito de 1,5 Kb ou possivelmente de uma espécie ainda mais pequena, mesmo indetectável. Devido ao clone CD20.4 não possuir uma cauda poli(A)+ presentemente não podemos inferir qual a sua fonte.Analysis of RNA transfers showed that three transcripts of 3.8, 3.0 and 1.5 Kb were present in B cells but absent from other cell types, according to the known pattern of antibody reactivity (Clark et al. Proc. Natl Acad Sci USA 82: 1766 (1985), Clark et al., J. Immunol., 138: 720 (1987), Tedder et al., J. Immunol 135: 973 (1985); Golay et al., J. Immunol 135: 3795 (1985)). It seems likely that the CD20.6 clone is derived from the 1.5 Kb transcript or possibly from an even smaller, even undetectable, species. Because clone CD20.4 does not have a poly (A) + tail, we can not currently infer its source.

A análise de transferências de DNA mostrou que as sequências genómicas CD20 não são rearranjadas durante o desenvolvimento e não são amplificadas nas linhas celulares observadas. Observou-se um polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição numa amostra de DNA obtido a partir de placenta. A sequência de aminoácidos prevista pelo cDNA contem 297 resíduos e tem um peso molecular de 33097 daltons. A sequência contem três segmentos hidrofóbicos principais envolvendo os resíduos 51-103, 117-141 e 183-203 (Fig. 10). Duas outras carac-terísticas notáveis são a ausência de um peptídeo sinal amino--terminal e a presença de um domínio terminal carbonilo altamente carregado. Um anticorpo policlonal anti-CD20 que reconheceu os 18 últimos resíduos do extremo carboxilo reage com lisados de células que expressam CD20 mas não com células intactas, sugerindo que o exteemo carbonilo de CD20 está situado dentro do citoplasma. Uma vez que não existe peptídeo sinal amino-terminal, é provável que o extremo amina seja também intracelular e que a primeira região hidrofóbica actue como um sinal de inserção interna na membrana (Zerial et al.. EMBO J.: 5:1543 (1986)). A primeira região hidrofóbica é composta por 53 resíduos é portanto suficientemente longo para atravessar a membrana duas vezes se organizada como uma hélice alfa. Devido a haver duas regiões hidrofóbicas restantes, a localização intracelular do extremo carbonilo requere que o primeiro domínio hidrofóbico saia da membrana lateralmente. Como alternativa, o anticorpo do extremo carbonilo pode reconhecer apenas epítopos expostos pelo tratamento com detergente permitindo que o extremo carbonilo seja extra-celular e forçando o primeiro domínio hidrofóbico a sair da membrana no lado extracelular. A sequência contem 2 potenciais sítios de N-glicosilação (Asn-Xaa-Ser/Tre, onde Xaa não pode ser Pro (Bause, Biochem. J. 209:331 (1983)) nas posições e 293, mas não se espera que qualquer uma destas seja utilizada se situadas no domínio intracelular da molécula. A diferença no peso molecular entre CD20 expresso em células COS e em células B é provavelmente devido à glicosilação ligada em O, se bem que outras formas de modificação pós-tradução não são excluídas. Se o extremo carbonilo for intracelular, o único domínio extracelular ficaria entre os resíduos 142 e 182. Esta região é rica em resíduos serina e treonina que devem suportar glicosilação ligada em N. A observação de duas espécies de proteínas nas células COS não pode ser explicado pela formação de "splicing" alternado pois a sequência de cDNA não contem quaisquer sinais promissores dadores ou aceitadores de "splicing” (Shapiro et al.. Nucl. Acids Res. 15: 7155 (1987)). Uma diferença na selecção do sítio de glicosilação ou no sítio de iniciação da tradução alternado pode 92DNA blot analysis showed that the CD20 genomic sequences are not rearranged during development and are not amplified in the observed cell lines. A restriction fragment length polymorphism was observed in a DNA sample obtained from placenta. The amino acid sequence predicted by the cDNA contains 297 residues and has a molecular weight of 33097 daltons. The sequence contains three major hydrophobic segments involving residues 51-103, 117-141 and 183-203 (Fig. 10). Two other notable features are the absence of an amino-terminal signal peptide and the presence of a highly charged carbonyl terminal domain. An anti-CD20 polyclonal antibody that recognized the last carboxyl end residues reacts with lysates from cells expressing CD20 but not with intact cells, suggesting that the carbonyl exteemo of CD20 is located within the cytoplasm. Since there is no amino-terminal signal peptide, it is likely that the amine end is also intracellular and that the first hydrophobic region acts as an inner membrane insertion signal (Zerial et al., EMBO J .: 5: 1543 (1986 )). The first hydrophobic region is composed of 53 residues is therefore long enough to cross the membrane twice if organized as an alpha helix. Because there are two remaining hydrophobic regions, the intracellular location of the carbonyl end requires the first hydrophobic domain to exit the membrane laterally. Alternatively, the carbonyl end antibody can recognize only epitopes exposed by the detergent treatment allowing the carbonyl end to be extra-cellular and forcing the first hydrophobic domain to exit the membrane on the extracellular side. The sequence contains 2 potential N-glycosylation sites (Asn-Xaa-Ser / Thr, where Xaa can not be Pro (Bause, Biochem, J. 209: 331 (1983)) at positions 293, but it is not expected that any one of these is used if located in the intracellular domain of the molecule.The difference in molecular weight between CD20 expressed in COS cells and in B cells is probably due to O-linked glycosylation, although other forms of post-translational modification are not excluded. If the carbonyl end is intracellular, the only extracellular domain would lie between residues 142 and 182. This region is rich in serine and threonine residues that must support N-linked glycosylation. The observation of two species of proteins in COS cells can not be explained by the formation of " splicing " alternating since the cDNA sequence does not contain any promising donor or splicing signals (Shapiro et al., Nucl. Acids Res.15: 7155 (1987)). A difference in the selection of the glycosylation site or in the alternate translational initiation site may

dar origem às duas espécies observadas. A iniciação do primeiro e do segundo ATG dá pseos moleculares de 33,1 e 30,8 Kd respectiva-mente para as proteínas, de acordo com 7s tamanhos observados em células COS. Nem ATG está embebido na sequência consensus proposta por Kozak fNucl. Acids Res. 12:857 (1984)). A utilização de sítios de iniciação alternados foi descrita para várias proteínas (Kozak, Nucl. Acids Res. 12:857 (1984)).to give rise to the two species observed. The initiation of the first and second ATG gives molecular peaks of 33.1 and 30.8 Kd respectively for the proteins, according to the sizes observed in COS cells. Neither ATG is embedded in the consensus sequence proposed by Kozak fNucl. Acids Res. 12: 857 (1984)). The use of alternate starter sites has been described for various proteins (Kozak, Nucl. Acids Res. 12: 857 (1984)).

A comparação da sequência peptídica com as sequências da base de dados da National Biomedical Research Foundation não mostrou homologia significativa pelo algoritmo de alinhamento rápido de sequências FASTP. Devido ao grosso da proteína parecer star confinada ao interior da membrana e da célula, parece plausível que que ela possa desempenhar um papel na transdução de sinais de outras proteínas transmembranares para o interior celular. Consistente com este papel está a natureza relativamente hidrofílica das regiões hidrofóbicas que devem permitir as interacções das ligações de hidrogénio com as fracções transmembranares de outras proteínas.Comparison of the peptidic sequence with the sequences of the National Biomedical Research Foundation database did not show significant homology by the FASTP sequence fast alignment algorithm. Because the bulk of the protein appears star-bound to the inside of the membrane and the cell, it seems plausible that it may play a role in transducing signals from other transmembrane proteins into the cellular interior. Consistent with this role is the relatively hydrophilic nature of the hydrophobic regions which must allow for the interactions of the hydrogen bonds with the transmembrane fractions of other proteins.

Exemplo VII Isolamento e Clonacrem Molecular de ICAM. umaExample VII Isolation and Molecular Cloning of ICAM. an

Ligando de Adesão de LFA-1LFA-1 Adhesion Ligand

Os contactos celulares específicos de antigénio no sistema imune são fortalecidos pelas interações inespecíficas de antigénio mediadas em parte pelos antigénios associados às funções de linfócitos ou LFA (Springer, T.A., et al.. Annu. Rev. Immunol. 5:175-194 (1987)). O antigénio LFA, um receptor major de células T, células B e granulócitos (Rothlein, R., et al.. Exp. Med, 163:1132-1149 (1987)) está envolvido na formação de conjugados citolíticos, morte das células dependente Pe anticorpos pelas células K e granulócitos e interacções com células T auxiliares. LFA-1 foi colocado na família das intgrinas dos receptores de 93Antigen-specific cell contacts in the immune system are strengthened by non-specific antigen interactions mediated in part by antigens associated with lymphocyte or LFA functions (Springer, TA, et al., Annu Rev. Immunol, 5: 175-194 (1987) )). LFA antigen, a major T cell receptor, B cell and granulocyte (Rothlein, R., et al., Exp. Med, 163: 1132-1149 (1987)) is involved in the formation of cytolytic conjugates, For antibodies to K cells and granulocytes and interactions with helper T cells. LFA-1 was placed in the receptor family of 93

superfície celular devido à alta semelhança de Sequências entre LFA-1 e as cadeias beta da integrina /Kishimoto, T.K., et al.. Cell 48:681-690 (1987); Hynes, R.O. Cell 48:549-554 (1987)). Os ligandos de adesão da família das integrinas são glicoproteínas portadoras do motivo de sequência Arg-Gli-Asp (RGD), e.g., fibronectina, fibrinogénio, vitronectina e factor de von Willebrand (Ruoslahti, E., et al.. Cell 44;517-518 (1987)). )cell surface due to the high similarity of Sequences between LFA-1 and the beta chains of the integrin / Kishimoto, T.K., et al., Cell 48: 681-690 (1987); Hynes, R.O. Cell 48: 549-554 (1987)). The adhesion ligands of the integrin family are glycoproteins carrying the Arg-Gly-Asp (RGD) sequence motif, eg, fibronectin, fibrinogen, vitronectin and von Willebrand factor (Ruoslahti, E., et al., Cell 44, 517 -518 (1987)). )

Neste Exemplo, a Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-l), um ligando para LFA-1 (Rothlein, R., et al.. J. Immunol. 137:1270-1275 (1986); Dustin, M.L., et al.. J. Immunol. 137:245-254 (1986)), foi clonada de acordo com os métodos do presente invento. ICAM não contem motivos RGD e em vez disso é homóloga da molécula de adesão de células neurais NCAM (Cunningham, B.A., et al. Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al.. EMBO J. 6:907-914 (1987)). As células COS Transfec-tadas com o clone de cDNAde ICAM liga-se a células mielóides por uma inteacção específica que pode ser bloqueada pelso anticorpos monoclonais dirigidos contra LFA-1 ou ICAM-1.In this Example, the Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1), a ligand for LFA-1 (Rothlein, R., et al., J. Immunol 137: 1270-1275 (1986); Dustin, ML, et al. al. J. Immunol., 137: 245-254 (1986)), has been cloned according to the methods of the present invention. ICAM does not contain RGD motifs and is instead homologous to the NCAM neural cell adhesion molecule (Cunningham, BA, et al., Science 236: 799-806 (1987); Barthels, D., et al., EMBO J. : 907-914 (1987)). COS cells transfected with the ICAM cDNA clone bind to myeloid cells by a specific interaction that can be blocked by monoclonal antibodies directed against LFA-1 or ICAM-1.

Construiu-se uma biblioteca de cDNA usando RNA preparado a partir de células HL60 induzidas com acetato miristato de forbol PMA). A biblioteca foi usada para transfectar células COS e as células expressando antigénios de superfície foram recuperadas de acordo com os métodos do presente invento por "panning" com os anticorpos monoclonais (mAbs) anti-ICAM 8F5 e 84H10 (McMitchael, A.J., et al.. eds., Leukocvte Tvping III. White Cell Differentiation Anticrens. Oxford University Press (1987)). Recuperou-se DNA epissomal a partir das células "panned" e o ciclo de expressão-"panning" repetido mais 2 vezes para se obter um clone de cDNA designado pICAM-1. 94A cDNA library was constructed using RNA prepared from HL60 cells induced with phorbol myristate acetate (PMA). The library was used to transfect COS cells and cells expressing surface antigens were recovered according to the methods of the present invention by " panning " with the anti-ICAM 8F5 and 84H10 monoclonal antibodies (mAbs) (McMitchael, A.J., et al., Leukocyte Tetting III, White Cell Differentiation Anticrens, Oxford University Press (1987)). Episomal DNA was recovered from the cells " panned " and the expression cycle " panning " repeated 2 more times to obtain a cDNA clone designated pICAM-1. 94

Células COS transfectadas com pICAM-1 deram reacções em imunofluorescência de superfície com três anticorpos anti-ICAM-1: 8F5; 84H10; e RR-1. A imunoprecipitação de células COS transfectadas com pICAM-1 com o mAb 84H10 deu uma banda de peso molecular 100 Kd. 30). Uma proteína ligeiramente mais larga de 110 Kd foi precipitada a partir de células HL60 induzidas durante 48 horas com acetato miristato de forbol (PMA), interferão gama (gamalFN), factor de necrose tumoral (TNF), ou interleuquina-1 beta (IL-1 beta), mas estava ausente das células não induzidas. O peso molecular mais pequeno de ICAM-1 expresso em células COS é consistente com os pesos moleculares mais baixos observados para outros antigénios de superfície expressos em células COS.COS cells transfected with pICAM-1 gave surface immunofluorescence reactions with three anti-ICAM-1: 8F5 antibodies; 84H10; and RR-1. Immunoprecipitation of COS cells transfected with pICAM-1 with mAb 84H10 gave a 100 Kd molecular weight band. 30). A slightly larger protein of 110 Kd was precipitated from HL60 cells induced for 48 hours with phorbol myristate (PMA), interferon gamma (gamalFN), tumor necrosis factor (TNF), or interleukin-1 beta (IL- 1 beta), but was absent from uninduced cells. The smaller molecular weight of ICAM-1 expressed in COS cells is consistent with the lower molecular weights observed for other surface antigens expressed on COS cells.

A análise de transferências de RNA mostrou duas espécies de 3,2 Kb e 1,9 Kb presentes em células HeLa estmuladas com PMA, IFN gama, TNF ou IL-l gama, mas ausente em células não induzidas. Assim, a expressão de ICAM-1 é regulada por uma série de citocinas, aparentemente ao nível da transcrição. Espécies semehantes estão presentes em células B (JY e Raji), células T (blastos Peer e T) e células Assassinas Activadas por Linfoquinas (LAK). A estrutura destes transcritos ICAM-1 e a sua relação com o cDNA de ICAM-1 permanece por estabelecer. A hibridação de transferências de DNA genómico derivado de placenta revelou um padrão consistente com um gene de uma só cópia.Analysis of RNA blots showed two 3.2 Kb and 1.9 Kb species present in HeLa cells stimulated with PMA, IFN gamma, TNF or IL-1 gamma, but absent in non-induced cells. Thus, ICAM-1 expression is regulated by a number of cytokines, apparently at the level of transcription. Similar species are present in B cells (JY and Raji), T cells (Peer and T blasts) and Lymphokine Activated Killer (LAK) cells. The structure of these ICAM-1 transcripts and their relationship to the ICAM-1 cDNA remains to be established. Hybridization of placental derived genomic DNA blots revealed a pattern consistent with a single copy gene.

Para investigar se pICAM-1 codifica uma molécula de desão funcional, as células COS expressando ICAM-1 foram testadas relativamente à sua capacidade para se ligar a células HL60. Após 30 minutos a 37°C na presença de Mg2+, as células HL60 aderiram fortemente às células COS exprerssando ICAM, mas não a células transfectadas testemunhas. A especificidade desta adesão foi demonstrada por pré-incubação das células COS expressnado ICAM-1 com o mAb 84H10. Toda a ligação de HL60 foi abolida nestas condições. Um anticorpo monoclonal do mesmo isotipo, W6/32, que reconhece um determinante monomórfico relacionado com HLA-ABC de aproximadamente igual abundância de ICAM-1 nas células COS transfectadas, não teve efeito na adesão. De modo semelhante, a pré-incubação das células HL60 com 84H10 ou W6/32 não inibe a ligação.To investigate whether pICAM-1 encodes a functional deoxygenation molecule, COS cells expressing ICAM-1 were tested for their ability to bind to HL60 cells. After 30 minutes at 37øC in the presence of Mg 2+, HL60 cells strongly adhered to the COS cells expressing ICAM, but not to transfected control cells. The specificity of this adhesion was demonstrated by preincubation of the ICAM-1 expressed COS cells with mAb 84H10. All binding of HL60 was abolished under these conditions. A monoclonal antibody of the same isotype, W6 / 32, which recognizes an HLA-ABC related monomorphic determinant of approximately equal abundance of ICAM-1 in transfected COS cells, had no effect on adhesion. Similarly, preincubation of the HL60 cells with 84H10 or W6 / 32 does not inhibit binding.

Para determinar se LFA-1 estava a actuar como o recep-tor para ICAM-1 neste sistema, células HL60 foram pré-tratadas com anticorpos contra a cadeia beta de LFA-1 (CD18 (McMichael, A.J., et al, eds., Leukocvte Tvpinq III. White Cell Differen-tiation Antiaens. Oxford University Press (1987)) e depois sujeito ao ensaio de ligação. Toda a adesão a células COS que expressam ICAM foi bloqueada. 0 pré-tratamento de células COS com os anticorpos CD18 não teve qualquer efeito na adesão. Isto proporciona evidência directa de que ICAM-1 está de facto a actuar como um ligando de adesão para LFA-1. A sequência da inserção de CDNA de pICAM-1 consiste em 1846 nucleótidos (Figura 11). A sequência peptídica prevista de 532 resíduos tem as características típicas de uma proteína transmembranar incluindo uma sequência sinal putativa, a qual pode ser clivada entre glicina-25 e asparagina-26 (von Heijne, G. Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) e um único domínio de 25 resíduo que atravessa a membrana terminando num domínio citoplas-mático curto altamente carregado. O domínio extracelular contem sete potenciais sítios de glicosilação ligados em N que podem adequadamente explicar a diferença no tamanho entre o precursor desglicosilado (55 Kd) e o produto final (90-115 Kd) (Dustin, M.L., et al. J. Immunol. 137:245-254 (1986)). A utilização diferencial destes sítios de glicosilação putativos pode também explicar o peso molecular heterogénio de ICAM-1 observado em 96To determine if LFA-1 was acting as the receptor for ICAM-1 in this system, HL60 cells were pretreated with antibodies against the LFA-1 beta chain (CD18 (McMichael, AJ et al., Eds. Leukocvte Tvpinq III, White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press (1987)) and then subjected to the binding assay, all adhesion to COS cells expressing ICAM was blocked. The sequence of the CDNA insert of pICAM-1 consists of 1846 nucleotides (Figure 11). Figure 9 shows the sequence of the pUCAM-1 CDNA insert. The predicted peptide sequence of 532 residues has the typical characteristics of a transmembrane protein including a putative signal sequence, which can be cleaved between glycine-25 and asparagine-26 (von Heijne, G. Nucl. Acids Res. 14: 4683-4690 1986)) and a single 25 residue domain and crosses the membrane terminating in a highly charged short cytoplasmic domain. The extracellular domain contains seven potential N-linked glycosylation sites which may adequately explain the size difference between the deglycosylated precursor (55 Kd) and the final product (90-115 Kd) (Dustin, ML, et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)). The differential use of these putative glycosylation sites may also explain the heterogeneous molecular weight of ICAM-1 observed in 96

diferente tipos celulares (Dustin, M-L., et ai., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). LFA-l é um membro da família das integrinas dos recep-tores celulares (Kishimoto, T.K., et al.. Cell 48:681-690 (1987); ^ Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987)). O motivo tripeptídicodifferent cell types (Dustin, M-L., et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)). LFA-1 is a member of the integrin family of cellular receptors (Kishimoto, T.K., et al., Cell 48: 681-690 (1987); Hynes, R.O., Cell 48: 549-554 (1987)). The tripeptide motif

Arg-Gli-Asp (RGD) é uma caracterísitca comum dos ligandos desta família, e.g., fibronectina, fibrinogénio, vitronectina e factor de von Willebrand e é crucial para a interacção de receptores--ligandos (Ruoslahti, E, et al.. Cell 44:517-518 (1987)). NoArg-Gly-Asp (RGD) is a common feature of the ligands of this family, eg, fibronectin, fibrinogen, vitronectin and von Willebrand factor and is crucial for receptor-ligand interaction (Ruoslahti, E, et al .. Cell 44: 517-518 (1987)). At the

P entanto, ICAM-1 não contem motivos RGD, tendo em seu lugar uma única sequência RGE na posição 152. Uma pesquisa na base de dados da National Bioedical Research Foundation (Dayhoff, M.O., et al. Methods Enzvmol. 91:524-545 (1983)) (NBRF) não revelou semelhanças significativas com outras proteínas. No entanto, uma comparação com uma base de dados de um laboratório contendo proteínas de superfície recentemente publicadas revelou uma semelhança surpreendente e significativa entre ICAM-1 e a molécula de adesão de células neurais NCAM-1 (Cunningham, B.A., et al.. Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al.. EMBO J. 6:907-914 (1987)). A avaliação do alinhamento óptimo obtido usando o programa NBRF ALIGN tem 8 desvios padrões acima da média obtida a partir de 500 permutações ao acaso das sequências. A probabilidade da ocorrência espontânea de uma avaliação igual ou superior é de aproximadamente 10“9.However, ICAM-1 does not contain RGD motifs, having instead a single RGE sequence at position 152. A search in the database of the National Bioedical Research Foundation (Dayhoff, MO, et al., Methods Enzol., 91: 524-545 (1983)) (NBRF) revealed no significant similarities with other proteins. However, a comparison with a laboratory database containing recently published surface proteins revealed a striking and significant similarity between ICAM-1 and the NCAM-1 neural cell adhesion molecule (Cunningham, BA, et al., Science 236: 799-806 (1987); Barthels, D., et al., EMBO J. 6: 907-914 (1987)). The optimal alignment evaluation obtained using the NBRF program ALIGN has 8 standard deviations above the mean obtained from 500 random permutations of the sequences. The probability of a spontaneous occurrence of an equal or greater evaluation is approximately 10%.

Usando uma base de dados de sequências conhecidas relacionadas com imunoglobulina mostrou-se que ICAM-1 pode ser dividida em cinco domínios Ig (28-112, 115-206, 217-310, 312-391 e 399-477) cada um deles apresenta semelhança significativa com outros membros da superfamília de Ig (Williams, A.F., Immunol. Today 8:298-3-3 (1987)). Por exemplo, o domínio I é semelhante a CD3 enquanto que domínios IV e V são semelhantes aos domínios de glicoproteína associada a mielina (Arguint, M., et al.. Mol. Cell Biol. 7:3221-3232 (1987)). Todos os cinco domínios Ig de NCAM alinham com os segmentos de Ig em ICAM e a contribuição principal para a semelhança vem do domínio II e III de ICAM. Finalmente, a molécula CD2 de adesão específica de células T mostra oratica-mente a mesma semelhança com NCAM que ICAM, mas ICAM e CD2 estão apenas fracamente relacionados. Assim, algum precursor de NCAM é anterior a ICAM e a CD2. A capacidade de um cDNA de ICAM-1 funcional permitirá uma melhor abordagem do papel de adesão mediada por ICAM-l/LFA-1 na função de leucócitos específica de antigénios, incluindo morte mediada por células T, respostas de T auxiliares e morte mediada por células dependentes de anticorpos.Using a database of known immunoglobulin-related sequences it has been shown that ICAM-1 can be divided into five Ig domains (28-112, 115-206, 217-310, 312-391 and 399-477) each of which significant similarity with other members of the Ig superfamily (Williams, AF, Immunol. Today 8: 298-3-3 (1987)). For example, domain I is similar to CD3 whereas domains IV and V are similar to domains of myelin-associated glycoprotein (Arguint, M., et al. Mol. Cell Biol. 7: 3221-3232 (1987)). All five Ig domains of NCAM align with Ig segments in ICAM and the major contribution to similarity comes from domain II and III of ICAM. Finally, the T cell-specific adhesion molecule CD2 shows orally the same similarity to NCAM as ICAM, but ICAM and CD2 are only poorly related. Thus, some precursor to NCAM is prior to ICAM and CD2. The ability of a functional ICAM-1 cDNA will allow for a better approach to the ICAM-1 / LFA-1 mediated adhesion role in antigen-specific leukocyte function, including T cell-mediated killing, helper T responses, and dependent cells.

Exemplo VIII Isolamento e Clonagem Molecular dosIsolation and Molecular Cloning of

Antigénios CD19. CD20. CDw32a. CDw32b e CD40 0 método rápido de clonagem com imuno-selecção do presente invento foi aplicado para isolar e clonar os antigénios CD19, CD20, CDw32b e CD40. A sequência de nucleótidos de CD19 está apresentada na Figura 12. A sequência de nucleótidos de CD20 está apresentado na Figura 13. A sequência de nucleótidos de CDw32a está apresentada na Figura 15. A sequência de nucleótidos de CDw32b está apresentado na Figura 16. A sequência de nucleótidos de CD40 está apresentada na Figura 17.CD19 antigens. CD20. CDw32a. CDw32b and CD40 The rapid immuno-selective cloning method of the present invention was applied to isolate and clone the CD19, CD20, CDw32b and CD40 antigens. The CD19 nucleotide sequence is shown in Figure 12. The nucleotide sequence of CD20 is shown in Figure 13. The nucleotide sequence of CDw32a is shown in Figure 15. The nucleotide sequence of CDw32b is shown in Figure 16. The sequence nucleotide of CD40 is shown in Figure 17.

Exemplo IX Clonagem. Sequência e Expressão de CD36Example IX Cloning. Sequence and Expression of CD36

Para isolar um clone de cDNA codificador de CD36, um cDNA de placenta humana (Simmons e Seed (1988) Nature 333:568--570) foi transferido para células COS usando DEAE-Dextran como facilitador (Exenmplo I, supra). 48 horas pós-transfecção as 98To isolate a cDNA clone encoding CD36, a human placenta cDNA (Simmons and Seed (1988) Nature 333: 568-570) was transferred to COS cells using DEAE-Dextran as a facilitator (Example I, supra). 48 hours post-transfection at 98

células foram descoladas das placas sem tripsina, incubadas com os anticorpos monoclonais anti-CD36 5F1 (Bernstein et al. (1982) J. Immunol. 128:876-881) (Andrews et al. (1984) J. Immunol. 128:398-404) foram "panned" em placas revestidas com anticorpos de cabra anti-imunoglobulina de murganho. As células não aderentes foram removidas por lavagem suave, as células aderentes foram lisadas e os plasmídeos epissomais recuperados das células foram purificados e usados para transformar E. coli. Após dois ciclos semelhantes de enriqueimento após fusão de esferoplastos, os DNAs de plasmídeo recuperados a partir de 11 de entre 12 colónias escolhidas ao acaso dirigem o aparecimento de de determinantes CD36 em células COS transfectadas.cells were detached from the trypsin-free plates incubated with the anti-CD36 5F1 monoclonal antibodies (Bernstein et al. (1982) J. Immunol 128: 876-881) (Andrews et al. (1984) J. Immunol. 128: 398 -404) were " panned " on plates coated with goat anti-mouse immunoglobulin antibodies. The non-adherent cells were removed by gentle washing, the adherent cells were lysed and the episomal plasmids recovered from the cells were purified and used to transform E. coli. After two similar cycles of enrichment after fusion of spheroplasts, plasmid DNAs recovered from 11 out of 12 randomly chosen colonies direct the appearance of CD36 determinants on transfected COS cells.

Dois dos clones foram escolhidos ao acaso para posterior análise. Ambos são portadores de inserções com cerca de 1,9 Kb e apresentaram padrões de fragmentos de restrição idênticos. As células COS transfectadas com qualquer um destes clones reagiu com os anticorpos monoclonais 5F1 e F13 e com OKM5 (Ortho, Raritan, NJ).A imunoprecipitação de células transfectadas com um conjunto de anticorpos anti-CD36 revelou a presença de uma molécula de 83 rd presente em células COS transfectadas e células d emelanoma C32 e ausente de células COS testemunha (transfectadas com CD25). Uma espécie de alto peso molecular, possivelmente dimérica CD36 foi imunoprecipitadaa partir de lisados de células COS transfectadas mas não a partir do lisado de células C32. A sequência de nucleótidos está apresentada na Tabela 1. Na Tabela 1, a numeração da sequência de nucleótidos está apresentada na margem esquerda no começo de cada linha. A sequência de aminoáci-dos deduzida está apresentada como um código de uma só letra por debaixo do começo de cada tripleto de nucleótidos codificadores, com a metionina de iniciação indicada pelo número 1 acima do codão de iniciação. Os potenciais sítios de glicosilação ligada em N na sequência de aminoácidos derivada estão sublinhados por uma linha a tracejado. O domínio transmembranar putativo está duplamente sublinhado. Se bem que dois motivos consensus de poliadenilação (AATAAA) sejam encontrados no cDNA, não existe cauda poli (A) e nenhuma das espécies de RNA observadas pela hibridação de transferências é suficientemente curta para corresponder a poliadenilação nestes sítios, assumindo que os transcritos são portadores do mesmo extremo 5/ aproximado como observado no clone. 0 codão de iniciação presumido não é o primeiro ATG encontrado no clone, mas os dois anteriores são seguidos de perto por codões de terminação na mesma grelha de leitura. A metionina iniciadora prevista é seguida de uma região hidrofóbica curta semelhante a uma sequência sinal secretora para a qual no entanto não pode ser feita uma identificação clara do sítio de clivagem. A determinação recente da Tabela 1 a sequência de 36 aminoãcidos amino-termina1 (Tandon et al. J. Biol. Chem. 264:7570-7575 (1989)) indica que o polipeptídeo maduro começa no resíduo de aminoácido imediatamente após a metionina iniciadora.Two of the clones were chosen at random for further analysis. Both carry inserts of about 1.9 Kb and exhibited patterns of identical restriction fragments. COS cells transfected with any of these clones reacted with the monoclonal antibodies 5F1 and F13 and with OKM5 (Ortho, Raritan, NJ). Immunoprecipitation of cells transfected with a set of anti-CD36 antibodies revealed the presence of a 83 rd molecule present in transfected COS cells and C32 emelanoma cells and absent from control COS cells (transfected with CD25). A high molecular weight, possibly dimeric, species CD36 was immunoprecipitated from lysates of transfected COS cells but not from the C32 cell lysate. The nucleotide sequence is shown in Table 1. In Table 1, the nucleotide sequence numbering is shown in the left margin at the beginning of each line. The deduced amino acid sequence is presented as a single letter code below the beginning of each triplet of coding nucleotides, with the initiation methionine indicated by the number 1 above the initiation codon. The potential N-linked glycosylation sites in the derived amino acid sequence are underlined by a dashed line. The putative transmembrane domain is doubly underlined. Although two consensus polyadenylation motifs (AATAAA) are found in the cDNA, there is no poly (A) tail and none of the RNA species observed by hybridization of blots is short enough to match polyadenylation at these sites, assuming transcripts are carriers of the same 5 / close end as observed in the clone. The presumed start codon is not the first ATG found in the clone, but the two above are followed closely by termination codons in the same reading frame. The predicted initiator methionine is followed by a short hydrophobic region similar to a secretory signal sequence for which however a clear identification of the cleavage site can not be made. The recent determination of Table 1, the sequence of 36 amino-terminus amino acids (Tandon et al., J. Biol. Chem. 264: 7570-7575 (1989)) indicates that the mature polypeptide begins at the amino acid residue immediately after the initiator methionine.

100 GAAAAATCCTTCTTAGCCATTTTAAAGATAGCTTTCCAATGATTAGACGAATTGATTCTTTCTGTGACTCATCAGTTCCTTTCCTGTAMATTCATGTCTTGCTGTTGATTTGTGAATAA100 GAAAAATCCTTCTTAGCCATTTTAAAGATAGCTTTCCAATGATTAGACGAATTGATTCTTTCTGTGACTCATCAGTTCCTTTCCTGTAMATTCATGTCTTGCTGTTGATTTGTGAATAA

CD Ο • 1- • ο • υ • ο • Η* *&lt; Ι Η* &lt; μ- Ο Q Ο &gt; &lt; Μ Η &gt;· &lt; Μ Η U &lt; Η Ο U -&lt; U -&lt; ί1- ι ο α&gt; ι ο Ο ο -&lt; &lt; ΙΟ ί- &gt;- Ο ο ι Η h· ο ο ο I &lt;Η υ -J &lt; ο: -&lt; Ζ Η ο Ι- Ο • &lt; ι (3 • Ι ·-&lt; • ο ι -&lt; Ζ ! t ι ο 2 Ο &gt; Η* &lt;J υ χ &lt; &lt; &lt; ο: ο -&lt; ! &lt; X cj ο O tli ·&lt; ^ 1 Ο 1 V* (J μ- Η &lt; -ς ·&lt; ο U- 1 *&lt; 2 U &lt; _ V -I Η* -&lt; Κ* &gt;- &lt; υ ο οι tj _J Η • Ο Q Ο • Η C0 ·&lt; ím -3¾ Ο Ηυ υ Ρ ο &gt; ν_) Ο &lt; κ 1- &lt; !ίζ &lt; ·&lt;&lt; Ι Ο &lt;ο Η- ο •&lt;ο ο υ U V— -&lt; £ ► -&lt; I-&lt; -&lt; -&lt; Η -&lt; ίο VJ * «&lt; &lt; &lt; I--&lt; «&lt; ·&lt; ο ο • &lt; ΗΡ &lt; &lt;&lt; &lt; υ Η&lt; ο Η-ο -&lt; • U ο ο &lt; κ KJ Η* Ο μ* &lt; ΟCD Ο • 1 • • ο • υ • ο • Η * * &lt; Ι Η * &lt; μ- Ο Q Ο &gt; &lt; Μ Η> · < Μ Η U < Η Ο U - < U - &lt; ί1- ι ο α &gt; ι ο Ο ο - < &lt; ΙΟ--Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η---- ο: - &lt; Ζ Η ο Ι- Ο • &lt; (Ι Ι Ι Ι Ι Ι Ι O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O U Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι - <-> <-> <- <<<- <<- <<<- <<- <<-> <-> </ Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η <

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marcadas na superfície com Na125I e lisadas numa solução tampão de fosfatos salina contendo 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 0,5% NP40 e 0,1% de dodecilsulfato de sódio. Adicionou-se anticorpos monoclonais anti-CD36 e deixou-se adsorver ao lisado durante 12 horas a 4°C, após o que se adicionou esferas revestidas com anticorpos de cabra anti-imunoglobulinas de murganho (Cappel), misturou-se durante duas horas e lavou-se como descrito (Clark e Einfeld J. Immunol. 135:155-1667 (1986)). Quantidades maiores de proteína podem também ser obtidas na forma purificada a partir de um lisado de células COS transfectadas por uma purificação em coluna de imunoafinidade. Outros anticorpos contra CD36 podem ser obtidos usando a proteína CD36, expressa e/ou purificada como descrito, como imunogénio. CD36 foi identificado como um sítio de ligação para citoaderência de eritrócitos parasitados com Plasmodium falcioarum. pelos presentes inventores e por Ockenhouse, C.D. et al. (1989) Science 243:1469-1741. A cito-adesão de eritrócitos parasitados foi observada como sendo bloqueada pelos anticorpos monoclonais contra CD36. A incubação de eritrócitos infectados com células COS transfectadas com um cDNA de CD36 mostrou cito--aderência pronunciada. Pensa-se que a capacidade dos eritrócitos parasitados com P. falcioarum para se evadirem à sua eliminação no baço através da sua aderência a superfícies vasculares periféricas desempenhe um papel importante na patogenicidade de malária Falcioarum e contribuam para o síndrome letal da malária cerebral causando oclusão dos vasos pequenos no cérebro. Portanto, o cDNA e a proteína purificada do invento são úteis para proporcionarem CD36 purificado suficiente para fazer anticorpos monoclonais terapêuticos. 103surface labeled with Na125I and lysed in a phosphate buffered saline solution containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.5% NP40 and 0.1% sodium dodecylsulfate. Anti-CD36 monoclonal antibodies were added and allowed to adsorb to the lysate for 12 hours at 4Â ° C, after which beads coated with mouse anti-mouse immunoglobulin (Cappel) antibodies were mixed, mixed for two hours and washed as described (Clark and Einfeld J. Immunol., 135: 155-1667 (1986)). Higher amounts of protein may also be obtained in purified form from a lysate of COS cells transfected by immunoaffinity column purification. Other antibodies against CD36 may be obtained using the CD36 protein, expressed and / or purified as described, as an immunogen. CD36 has been identified as a binding site for cytoadherence of erythrocytes parasitized with Plasmodium falciarum. by the present inventors and by Ockenhouse, C.D. et al. (1989) Science 243: 1469-1741. Cyto-adhesion of parasitized erythrocytes was observed to be blocked by monoclonal antibodies against CD36. Incubation of infected erythrocytes with COS cells transfected with a CD36 cDNA showed pronounced cyto-adhesion. The ability of erythrocytes parasitized with P. falciparum to escape their elimination into the spleen through adherence to peripheral vascular surfaces is believed to play an important role in the pathogenicity of Falciarum malaria and contribute to the lethal syndrome of cerebral malaria causing occlusion of small vessels in the brain. Therefore, the cDNA and purified protein of the invention are useful to provide sufficient purified CD36 to make therapeutic monoclonal antibodies. 103

Exemplo X Isolamento e Clonaaem de Três Clones de cDNAExample X Isolation and Cloneaem of Three Clones of cDNA

Codificadores de FcRI Específico de MacrófagosMacrophage Specific FcRI Encoders

Três clones de cDNA independentes (designados pl35, p90 e p98/X2) codificadores de Fel humano foram isolados pelo método rápido de clonagem com imuno-selecção do presente invento a partir de uma biblioteca de cDNA expressa em células COS. (Ver também Allen, J.M. e Seed B.f Science 243;378-381 (1989)). A biblioteca de cDNA foi construída a partir de RNA poliadenilado obtido a partir de células de um só doente a ser sujeito a terapia de indução com interleuquina extracorporal. A expressão dos três cDNAs em células COS deu origem a ligação a IgG da afinidade adequada e especificidade de subtipo. A análise da sequência de DNA revelou que os cDNAs codificam proteínas de membrana integrais tipo I semelhantes com 3 domínios extracelu-lares de imunoglobulina. O domínio intracelular de p98/X2 diverge do dos outros dois cDNAs. Uma sequência composta dos três cDNAs está apresentada na Tabela 2 com as diferenças nos nucleótidos dos clones p89/X2 ou p90 mostrados respectivamente abaixo ou acima da sequência de pl35. 104 Ο &lt; u &lt; μ.Three independent cDNA clones (designated pl35, p90 and p98 / X2) coding for human Fel were isolated by the rapid immunostaining cloning method of the present invention from a cDNA library expressed on COS cells. (See also Allen, J. M. and Seed B.f. Science 243, 378-381 (1989)). The cDNA library was constructed from polyadenylated RNA obtained from single patient cells to be subjected to extracorporeal interleukin induction therapy. Expression of the three cDNAs in COS cells gave rise to IgG binding of the appropriate affinity and subtype specificity. DNA sequence analysis revealed that cDNAs encode similar type I integral membrane proteins with 3 extracellular immunoglobulin domains. The intracellular domain of p98 / X2 differs from that of the other two cDNAs. A composite sequence of the three cDNAs is shown in Table 2 with the nucleotide differences of the p89 / X2 or p90 clones shown respectively below or above the p35 sequence. 104 Ο &lt; u &lt; μ.

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O tracejado representa intervalos e não estão apresentados resíduos acima ou abaixo onde as sequênicas são iguais. O cDNA de p90 tem a região 5/ não traduzida mais curta, 7 resíduos adicionais entre o motivo de poliadenilação e o segmento poliA e 2 polimorfismos na região codificadora. O cDNA de p98/X2 tem a região 5» não traduzida mais longa, 1 polimorfismo na sequência codificadora e diverge dos outros dois cDNAs no resíduo 1051, tornando-se um padrão complexo de repetições de sequências a montante. 0 clone p98/X2 não possui um sítio de poliadenilação.The dotted line represents ranges and no above or below residues are shown where the sequences are the same. The p90 cDNA has the shorter 5 / untranslated region, 7 additional residues between the polyadenylation motif and the polyA segment, and 2 polymorphisms in the coding region. The p98 / X2 cDNA has the longest untranslated region, 1 polymorphism in the coding sequence, and diverges from the other two cDNAs at residue 1051, making it a complex pattern of upstream sequence repeats. The p98 / X2 clone lacks a polyadenylation site.

A proteína FcRI de cada um dos três clones foi purificada a partir das respectivas linhas de células COS que a expressa, por imuno-adsorção a IgG-agarose. (Ver Stengelin S. et al♦. EMBQ J. 7:1053 (1988)). A electroforese em gel das proteínas purificadas mostrou uma única espécie das células COS pl35 e p90, peso molecular relativo de 70 Kd. As células transfectadas com p98/X2 expressaram uma proteína de 67 Kd. Uma proteína ligeiramente maior de 75 Kd foi adsorvida a partir de promonócitos U937 tratados com interferão gama. 0 peso molecular mais pequeno observado em células COS é consistente com os pesos reduzidos observados na Tabela 2 para outros antigénios de superfície expressos em células COS, ver e.g., Exemplo IX.The FcRI protein from each of the three clones was purified from respective COS cell lines expressing it by immunoblotting to IgG-agarose. (See Stengelin S. et al., EMB. J. 7: 1053 (1988)). Gel electrophoresis of purified proteins showed a single species of COS p35 and p90 cells, relative molecular weight of 70 Kd. Cells transfected with p98 / X2 expressed a 67 Kd protein. A slightly higher protein of 75 Kd was adsorbed from U937 promonocytes treated with gamma interferon. The smallest molecular weight observed in COS cells is consistent with the reduced weights observed in Table 2 for other surface antigens expressed on COS cells, see e.g., Example IX.

As sequências polipeptídicas previstas mostram as características típicas de uma proteína de membrana integral tipo I e incluem uma pequena sequência sinal hidrofóbica, um único domínio hidrofóbico que atravessa a membrana e um domínio cito-plasmático pequeno altamente carregado (Fig. 4). A fracção extracelular contem seis potenciais sítios de glicosilação ligados em N e seis resíduos Cis distribuídos entre três séries de domínios C2 relacionados com Ig.The predicted polypeptide sequences show the typical characteristics of an integral type I membrane protein and include a small hydrophobic signal sequence, a single hydrophobic domain spanning the membrane and a highly charged small cytoplasmic domain (Fig. 4). The extracellular fraction contains six potential N-linked glycosylation sites and six Cys residues distributed among three series of Ig-related C2 domains.

FcRI é um receptor de alta afinidade para a fracção Fc de IgG, normalmente situado na superfície celular de macrófagos. A capacidade para interferir com tal ligação ou para causar a sua ocorrência noutras superfícies que não sejam as de macrófagos é útil em terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de FcRI e um ligando do receptor será útil para aumentar a potência de anticorpos em terapia.FcRI is a high affinity receptor for the Fc fraction of IgG, usually located on the cell surface of macrophages. The ability to interfere with such binding or to cause its occurrence on other surfaces than macrophages is useful in therapy. For example, an FcRI fusion protein and a receptor ligand will be useful to increase the potency of antibodies in therapy.

Exemplo XI Isolamento e Clonaaem de cDNA Codificador doExample XI Isolation and Cloneaem of cDNA

Antiqénio TLiSA de células TT cell TLiSA antigen

Um clone de cDNA codificador de TLiSA foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de células T humanas transferida para células cos como descrito e sujeito ao método rápido de clonagem com imuno-selecção do invento. Um anticorpo monoclonal ACT-T-SET TLiSAI (T-Cell Sciences Corp., Cambridge, Massachu-setts) foi usado para detectar células COS transfectadas expressando o cDNA clonado, por imunofluorescência indirecta positiva. 0 plasmídeo positivo continha uma inserção de 1,7 Kb. A proteína TLiSA foi isolada por imunoprecipitação como descrito supra. Exemplo IX. A proteína tem um peso molecular de aproximadamente 50 Kd, conforme medido por electroforese em gel. A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada por terminação de cadeias didesoxi como descrito supra. A sequência de 1714 resíduos está apresentada na Tabela 3, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida apresentada num código de uma só letra sob o primeiro nucleótido de cada tripleto codificador. 0 ATG codificador da presumível metionina iniciadora ê seguido de uma curta região hidrofóbica consistente com sequências sinais secretoras, o sítio de excisão mais provável sendo 19 resíduos dentro da grelha de leitura aberta. O polipeptídeo resultante se 107A cDNA clone encoding TLiSA was obtained from a human T cell cDNA library transferred to cos cells as described and subject to the rapid immuno-selective cloning method of the invention. A monoclonal ACT-T-SET TLiSAI antibody (T-Cell Sciences Corp., Cambridge, Massachuets) was used to detect transfected COS cells expressing the cloned cDNA by positive indirect immunofluorescence. The positive plasmid contained a 1.7 kb insert. The TLiSA protein was isolated by immunoprecipitation as described supra. Example IX. The protein has a molecular weight of approximately 50 Kd, as measured by gel electrophoresis. The nucleotide sequence of the cDNA was determined by termination of dideoxy chains as described supra. The 1714 residue sequence is shown in Table 3, along with the deduced amino acid sequence presented in a single letter code under the first nucleotide of each coding triplet. The ATG encoding the presumed initiator methionine is followed by a short hydrophobic region consistent with secretory signal sequences, the most likely excision site being 19 residues within the open reading frame. The resulting polypeptide is

não for mais processado possui 317 resíduos com um peso molecular previsto de aproximadamente 36 Kd. O domínio extracelular proposto é seguido de 25 resíduos predominantemente hidrofóbicos correspondendo ao domínio intracelular. (Tabela 3, sublinhado duplo.) A presença de 9 potenciais sítios de glicosilação ligados em N (Tabela 3, linhas a tracejado simples) parece suficiente para justificar a discrepância no peso molecular entre o poli-peptídeo previsto e a espécie de 50 Kd encontrada por imunopre-cipitação.not further processed has 317 residues with a predicted molecular weight of about 36 Kd. The proposed extracellular domain is followed by 25 predominantly hydrophobic residues corresponding to the intracellular domain. (Table 3, double underline.) The presence of 9 potential N-linked glycosylation sites (Table 3, single dashed lines) appears sufficient to warrant the discrepancy in molecular weight between the predicted polypeptide and the 50 Kd species found by immunoprecipitation.

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16Θ1 GTGTTGGCAAGATGGCTGCCAACTCTTGGCAATTCATACATCCTTGTTTCTGTCTGGTAGAGAGTTTGCTTCTCAAATGGAGCAAACAAATTTGATTATTTTTTCATTCTTAAATAGGCA TLiSA está envolvido na mediação da diferenciação de células T induzida por IL-2 para formas citolíticas. Os anticorpos contra TLiSA são úteis para prevenir a diferenciação de células T estimulada por IL-2 e para modular os efeitos adversos da IL-2 em terapia.16β1 GTGTTGGCAAGATGGCTGCCAACTCTTGGCAATTCATACATCCTTGTTTCTGTCTGGTAGAGAGTTTGCTTCTCAAATGGAGCAAACAAATTTGATTATTTTTTCATTCTTAAATAGGCA TLiSA is involved in mediating IL-2-induced T cell differentiation to cytolytic forms. Antibodies against TLiSA are useful for preventing IL-2 stimulated T cell differentiation and for modulating the adverse effects of IL-2 on therapy.

Exemplo XII Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNAExample XII Isolation and Clone Molecular of cDNA

Codificador do Antiqénio CD22 especifico de Linfócitos BB-lymphocyte specific CD22 Antigen encoder

Para isolar o cDNA de CD22, construiu-se uma biblioteca de expressão a partir da linha ccelular Daudi de linfoma de Burkitt, introduziu-se em células COS pelo método do DEAE-Dextra descrito supra e submeteu-se a três ciclos de &quot;panning&quot; e re-in-trodução em E. coli como descrito em Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987). De 16 plasmídeos selecciona-dos após o terceiro ciclo, dois apresentaram-se positivos para a expressão de CD22 por imunofluorescência indirecta em células COS. Dos cinco epitopos relacionados com açúcares, A, B, C, D e E, reconhecidos pelos anticorpos monoclonais anti-CD22, apenas os epitopos A e D foram expressos em células COS. A imunoprecipitação de CD22 a partir de células COS transfectadas deu uma única banda correspondendo a um peso molecular de 110 Kd, inferior às espécies de 135 Kd obtidas a partir das células Raji de linfoma de Burkitt. A diferença no peso molecular pode estar relacionada com diferenças na glicosi-lação. Uma vez que os epitopos imunogénicos de C22 estão relacionados com açúcares, estas diferenças devem justificar a ausência de epitopos B, C e E. A análise de transferências de KNA revelou a presença de uma espécie principal de RNA de 3 Kb e 4 espécies menos 110To isolate the CD22 cDNA, an expression library was constructed from the Daudi cell line of Burkitt's lymphoma, introduced into COS cells by the DEAE-Dextra method described supra and subjected to three cycles of &quot; panning &quot;; and re-in-troduction in E. coli as described in Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Know. USA 84: 8573-8577 (1987). Of 16 plasmids selected after the third cycle, two were positive for CD22 expression by indirect immunofluorescence in COS cells. Of the five sugar related epitopes, A, B, C, D and E, recognized by the anti-CD22 monoclonal antibodies, only the A and D epitopes were expressed in COS cells. Immunoprecipitation of CD22 from transfected COS cells gave a single band corresponding to a molecular weight of 110 Kd, lower than the 135 Kd species obtained from the Burkitt lymphoma Raji cells. The difference in molecular weight may be related to differences in glycosylation. Since the C22 immunogenic epitopes are sugar related, these differences should justify the absence of B, C and E epitopes. Analysis of KNA blots revealed the presence of a major 3 Kb RNA species and 4 species less 110

abundantes de 2,6, 2,3, 2,0 e 1,5 Kb em várias linhas de células B. RNA codificador de CD22 não foi encontrado em várias linhas de células T, incluindo células T do sangue periférico, a leucémia de células T Jurkat, as linhas de leucemia mielõide HL60 e U937 e o hepatoma HepG2.abundant of 2.6, 2.3, 2.0 and 1.5 Kb in several B cell lines. RNA encoding CD22 was not found in several T cell lines, including peripheral blood T cells, cell leukemia T Jurkat, the HL60 and U937 myeloid leukemia lines and the HepG2 hepatoma.

Hibridação de transferências de DNA de placenta deu um padrão simples consistente com um gene de uma única cópis. A análise da sequência de DNA pelo método didesoxi descrito supra mostrou que a inserção de 2107 pb codificava um polipeptídeo de 647 aminoácidos. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos aparecem na Tabela 4.Hybridization of placental DNA blots gave a simple pattern consistent with a single copy gene. Analysis of the DNA sequence by the dideoxy method described supra showed that the 2107 bp insert encoded a 647 amino acid polypeptide. Nucleotide and amino acid sequences appear in Table 4.

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Quadro eh ρ U u 0 0 0 0 Eh £ 0 Eh Eh CO 0 &gt;4! 0 X 0 3 „ 3 H 0 Eh 0 W Eh 3 ÊH X 0 0 0 P 0 0 0 α 3 0 3 Eh 0 Eh 0 Oh 0 3 Eh £ 0 Eh 3 g 0 Eh 0 W u 3 _ Eh X 0 Eh Eh (J 3 Eh 3 X 3 0 0 3 Eh 0 &gt; 0 3 3 PS 0 3 &lt;J iJ U 3 0 Oí 0 3 0 a Eh 0 3 x 0 Eh 0 α 0 Eh Eh 0 0 Eh O P 0 Eh 0 &gt; O 3 0 &gt; 0 EH 3 H 0 0 3 2 0 0 3 H 0 Eh , 0 3 Ej 0 0 0 Eh 0 O h5 0 3 PS 0 3 0 CU 0 0 Eh X 3 Eh 0 X ÊH Eh 0 0 0 3 U P Eh 3 υ P 0 3 3 x 0 0 Eh X 0 3 0 W 0 3 0 X 0 0 W Eh 3 0 O 3 0 O h5 0 0 0 θ' EH 0 0 0 0 0 ^ 0 (¾ 0 0 0 cu Eh e-j * 3 0 0 3 1 0 P 0 3 0 w Eh 0 Eh X 0 0 3 X ÊH 0 |h fu 0 0 0 &lt;5 0 0 3 CO 0 PI s 0 3 Eh CO O 0 EH O o 3 0 X Eh 3 0 Pt 0 υ EH X 0 0 0 Q 0 0 u x 0 Eh 0 X Eh 0 Eh W o Eh EH X Eh 3 &lt; ps 0 0 0 u5 0 Eh 3 X Eh o o 0 Eh „ 0 &gt; 0 3 Eh Cu o 0 0 P 0 Eh 0 w EH Pi i 3 &amp;H 0 3 0 i-l Eh 3 O h5 3 Eh 3 X 0 0 3 X o 3 3 H 0 3 Eh co 0 EJ 0 W 0 0 0 X 0 Eh o i-q Eh EH 0 0 0 Eh 0 d Eh 0 EH X Eh Eh 0 &gt; 0 3 0 CU 0 3 0 &gt; Eh Eh 0 X 0 0 0 Q 0 3 Eh d 0 3 3 co 0 0 3 x 0 Eh 0 X 3 ιϋΐ 0 X 0 0 3 g 0 3 3 x 0 Eh Eh 0 U 3 0 W 1¾ 3 0 u5 0 O 0 w 0 0 0 X 0 0 3 EH Eh 3 Eh 0 3 3 Eh O Eh 0 u5 0 EH 0 X 0 3 Eh X 0 0 3 H 3 Eh 0 Eh 3 3 co Eh Eh 0 J O Eh 0 Q 3 0 3 H Eh 3 0 &gt; Eh 3 CO 3 0 o 0 0 0 w 0 0 3 Eh &lt; 0 0 0 EH Eh 0 Pt 0 0 Eh £ EH 3 0 v-5 3 EH 3 3 3 Eh X 3 3 0 &gt; o 0 Q 0 0 0 W 3 ϋ &lt;« w 3 EH 3 Eh 0 3 0 EH Eh , 0 v5 0 Eh 0 W 3 0 0 P 3 0 3 g 0 u 3 CO 0 0 Eh 0 0 3 0 3 0 3 PS 0 0 0 θ' Eh O 0 3 3 3 Eh £ 0 Eh Eh CO 3 0 3 x 0 U 0 0 3 EH 0 3 Eh W 0 3 3 PS 0 3 3 x 0 0 0 Q 0 0 3 x 0 3 3 Eh 3 0 0 EH 3 0 W O 0 Eh X Eh 3 0 W 3 3 Eh CO 0 3 3 x Eh 3 3 0 0 0 Q 0 0 0 a 3 Eh 3 Eh Eh 3 3 Eh EH 0 Eh X 0 Eh 3 x 0 Eh 0 Eh 0 Eh fu 0 3 3 H CJ 0 -Eh 0 0 3 3 x 0 0 3 -0 0 Q 0 3 U 0 0 3 x 3 0 0 w 3 EH 0 CU 0 0 Eh W 3 H H H *—1 H tH VO -4· (M o CO H CO «“1 CN n 4·Table eh ρ U u 0 0 0 0 Eh £ 0 Eh Eh CO 0> 4! 0 X 0 3 "3 H 0 Eh 0 W Eh 3 EH X 0 0 0 P 0 0 0 α 3 0 3 Eh 0 Eh 0 Oh 0 3 Eh £ 0 Eh 3 g 0 Eh 0 W u 3 _ Eh X 0 Eh Eh (J 3 Eh 3 X 3 0 0 3 Eh 0> 0 3 3 PS 0 3 <J iJ U 3 0 0 0 0 0 Eh 0 3 x 0 Eh 0 α 0 Eh Eh 0 0 Eh OP 0 Eh 0> 0 3 0> 0 EH 3 H 0 0 3 2 0 0 3 H 0 Eh, 0 3 Ej 0 0 0 Eh 0 O h 5 0 3 PS 0 3 0 CU 0 0 Eh X 3 Eh 0 X EH Eh 0 0 0 3 UP Eh 3 υ P 0 3 3 x 0 0 Eh X 0 3 0 W 0 3 0 X 0 0 W Eh 3 0 O 3 0 O h 5 0 0 0 θ 'EH 0 0 0 0 0 ^ 0 ( ¾ 0 0 0 cu Eh ej * 3 0 0 3 1 0 P 0 3 0 w Eh 0 Eh X 0 0 3 X ÊH 0 | h fu 0 0 0 <5 0 0 3 CO 0 PI s 0 3 Eh CO O 0 EH O o 3 0 X Eh 3 0 Pt 0 υ EH X 0 0 0 Q 0 0 u 0 0 Eh 0 X Eh 0 Eh W o Eh EH X Eh 3 <ps 0 0 0 u5 0 Eh 3 X Eh oo 0 Eh "0> 0 3 Eh Cu o 0 0 P 0 Eh 0 w EH Pi i 3 & H 0 3 0 il Eh 3 O h 5 3 Eh 3 X 0 0 3 X o 3 3 H 0 3 Eh co 0 EJ 0 W 0 0 0 X 0 Eh o iq Eh EH 0 0 0 Eh 0 d Eh 0 EH X Eh Eh 0> 0 3 0 CU 0 3 0> Eh Eh 0 X 0 0 0 Q 0 3 Eh d 0 3 3 co 0 0 3 x 0 Eh 0 X 3 ιϋΐ 0 X 0 0 3 g 0 3 3 x 0 Eh Eh 0 U 3 0 W 1¾ 3 0 u 5 0 O 0 w 0 0 0 X 0 0 3 EH Eh 3 Eh 0 3 3 Eh O Eh 0 u 5 0 EH 0 X 0 3 Eh X 0 0 3 H 3 Eh 0 Eh 3 3 co Eh Eh 0 JO Eh 0 Q 3 0 3 H Eh 3 0 &gt; Eh 3 CO 3 0 or 0 0 0 w 0 0 3 Eh < 0 0 0 EH Eh 0 Pt 0 0 Eh £ EH 3 0 v-5 3 EH 3 3 3 Eh X 3 3 0 &gt; 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 3 PS 0 0 0 θ 'Eh O 0 3 3 3 Eh £ 0 Eh Eh CO 3 0 3 x 0 U 0 0 3 EH 0 3 Eh W 0 3 3 PS 0 3 3 x 0 0 0 Q 0 0 3 x 0 3 3 Eh 3 0 0 EH 3 0 WO 0 Eh X Eh 3 0 W 3 3 Eh CO 0 3 3 x Eh 3 3 0 0 0 Q 0 0 0 a 3 Eh 3 Eh Eh 3 3 Eh EH 0 Eh X 0 Eh 3 x 0 Eh 0 Eh 0 Eh fu 0 3 3 H CJ 0 -Eh 0 0 3 3 x 0 0 3 -0 0 Q 0 3 U 0 0 3 x 3 0 0 w 3 EH 0 CU 0 0 Eh W 3 HHH (M + H) + (M + H) +

0 Eh , U PS Eh 0 3 H o 0 0 iJ Eh 3 0 3 Eh 3 M 0 Eh 0 X 3 3 0 &gt; 0 Eh 3 H 0 0 3 X 3 0 ^ Eh X 0 0 0 3 0 3 0 PS 0 CJ 0 X 0 0 0 W 0 0 X 3 0 o as 0 «i X 0 3 Eh 0 0 3 3 Eh 0 Eh 3 X 0 Eh 3 x 0 0 3 g u O 0 &gt; o EH 0 0 0 0 0 3 0 o Eh h Ej 0 Eh £ 0 0 0 X 0 3 0 X 3 Eh 3 PS 0 0 Q 0 3 3 H 0 3 0 &gt; 3 3 0 W 0 Eh 0 X Eh 0 3 X EH 0 0 &gt; o O 0 3 3 3 3 Eh 0 0 Eh Ui Eh 3 Eh X 3 3 3 co 0 3 Ο θ' 0 0 O Q U 3 0 a Eh 0 3 Eh 3 0 3 X 0 Eh 0 PS 0 0 3 m 0 3 3 H 0 3 0 PS 3 Eh 0 α 0 α 3 X 0 0 3 H Eh EH 3 Eh 0 0 Eh co 0 ÊH 0 &gt; 3 0 X O 0 0 h5 3 Eh 0 Q 0 Eh 3 Eh 0 0 0 &gt; 0 0 Eh X 0 3 3 EH Eh 0 0 3 0 Eh 0 O* 0 0 M £ Eh 3 Eh J 0 0 3 Ui 0 3 0 Q 0 0 3 Eh 0 0 Eh X EH 0 Eh 0 0 0 0 0 0 0 Eh W 0 Eh O X Eh 3 Eh 0 O 0 0 &gt; 0 Eh 0 θ' 3 0 3 Eh 0 3 0 &gt; 0 3 3 Eh 0 &lt; w 3 X 0 Eh u c* 0 Ej 3 X Eh 3 0 &gt; υ 0 0 &gt; 0 0 3 X EH Eh Eh W EH 3 t 3 W 3 0 J 0 EH 3 X 0 3 3 X 0 0 3 H 0 0 0 a 0 0 3 EH 0 0 Eh Ui 0 Eh 3 CO 0 0 X Eh EH 0 u5 0 Eh &lt;3 X Eh 3 3 H 0 Eh 0 &gt; 0 0 3 X 0 0 0 &gt; Eh 0 0 X 0 3 0 3 0 0 0 0 Eh 3 3 X 0 0 0 3 Eh 3 Eh X 0 Eh Eh Ui Eh ¾ 0 X 0 EH 0 &gt; O 0 0 X 0 3 0 J Eh 3 0 3 0 3 3 X 0 0 3 g 0 3 3 x Eh Eh 0 X 3 3 0 X 0 0 0 &gt; O 0 0 α Eh Eh EH 0 0 0 0 0 0 0 0 &gt; 0 0 Eh W Eh ca 3 ui 0 0 0 0 0 0 3 « 0 3 Eh Ui Eh 0 Eh Ui 0 0 3 x ÊH EH 0 3 0 Eh „ Eh £ 0 Eh 0 t-5 0 3 3 g 0 Eh 0 h5 0 0 0 X 3 3 0 -q 0 0 Eh £ Eh 0 0 ot 0 0 Eh Ui 0 Eh 0 CU 3 3 3 Eh 3 O 3 W Eh 0 0 θ' 0 0 Eh CO 0 Eh 0 CU 0 Eh 0 X 0 3 0 &gt; 0 Eh 0 &gt; 0 0 0 W 0 0 0 &gt; 3 3 Eh O 0 0 EH W 0 0 0 W 0 0 0 0 0 0 3 ÊH 0 0 Eh Ui 0 EH 3 Eh 0 3 Eh £ Eh 3 Eh X 0 3 0 W Eh Eh 0 W 0 3 0 Q 0 0 0 i-5 3 3 _ 0 Q 3 0 3 co 0 Eh 3 X Eh 0 Eh £ Eh 0 0 1-5 0 3 0 0 0 3 CJ X 0 Eh , 3 X 3 0 3 x CÍ Eh 0 i-5 0 3 0-3 EH 0 i-5 0 0 0 W 0- 0 Sx 0 3 Eh Ui 3 0 Eh 0 0 0 W 0 0 0 0 EH P H H rH rH r—( rH 3 VO CN O CO VO o (D VO CO CO σι H0 Eh, U PS Eh 0 3 H o 0 0 iJ Eh 3 0 3 Eh 3 M 0 Eh 0 X 3 3 0 &gt; 0 Eh 3 H 0 0 3 X 3 0 ^ Eh X 0 0 0 3 0 3 0 PS 0 CJ 0 X 0 0 0 W 0 0 X 3 0 o as 0 0 0 0 0 0 Eh 0 0 3 3 Eh 0 Eh 3 X 0 Eh 3 x 0 0 3 gu O 0 &gt; the EH 0 0 0 0 0 3 0 or Eh h Ex 0 Eh £ 0 0 0 X 0 3 0 X 3 Eh 3 PS 0 0 Q 0 3 3 H 0 3 0 &gt; 3 3 0 W 0 Eh 0 X Eh 0 3 X EH 0 0 &gt; 0 0 3 3 3 3 Eh 0 0 Eh Ui Eh 3 Eh X 3 3 3 co 0 3 Ο θ '0 0 OQ 3 0 a Eh 0 3 Eh 3 0 3 X 0 Eh 0 PS 0 0 3 m 0 3 3 H 0 3 0 PS 3 Eh 0 α 0 α 3 X 0 0 3 H Eh EH 3 Eh 0 0 Eh co 0 EH 0 &gt; 3 0 X 0 0 h5 3 Eh 0 Q 0 Eh 3 Eh 0 0 0 &gt; 0 0 Eh X 0 3 3 EH Eh 0 0 3 0 Eh 0 O * 0 0 M £ Eh 3 Eh J 0 0 3 U i 0 3 0 Q 0 0 3 Eh 0 0 Eh X EH 0 Eh 0 0 0 0 0 0 0 Eh W 0 Eh OX Eh 3 Eh 0 O 0 0 &gt; 0 Eh 0 θ '3 0 3 Eh 0 3 0 &gt; 0 3 3 Eh 0 &lt; w 3 X 0 Eh u c * 0 Ex 3 X Eh 3 0> υ 0 0 &gt; 0 0 3 X EH Eh Eh W EH 3 t 3 W 3 0 J 0 EH 3 X 0 3 3 X 0 0 3 H 0 0 0 a 0 0 3 EH 0 0 Eh Ui 0 Eh 3 CO 0 0 X Eh EH 0 u5 0 Eh <3 X Eh 3 3 H 0 Eh 0> 0 0 3 X 0 0 0 &gt; Eh 0 0 X 0 3 0 3 0 0 0 0 Eh 3 3 X 0 0 0 3 Eh 3 Eh X 0 Eh Eh Uh Eh ¾ 0 X 0 EH 0 &gt; 0 0 X 0 3 0 J Eh 3 0 3 0 3 3 X 0 0 3 g 0 3 3 x Eh Eh 0 X 3 3 0 X 0 0 0 &gt; O 0 0 Eh Eh EH 0 0 0 0 0 0 0 0 &gt; 0 0 Eh W Eh ca 3 ui 0 0 0 0 0 0 3 «0 3 Eh Ui Eh 0 Eh Ui 0 0 3 x EH EH 0 3 0 Eh" Eh £ 0 Eh 0 t-5 0 3 3 g 0 Eh 0 h5 0 0 0 X 3 3 0 -q 0 0 Eh £ Eh 0 0 ot 0 0 Eh Ui 0 Eh 0 CU 3 3 3 Eh 3 O 3 W Eh 0 0 θ '0 0 Eh CO 0 Eh 0 CU 0 Eh 0 X 0 3 0 &gt; 0 Eh 0 &gt; 0 0 0 W 0 0 0 &gt; 3 3 Eh O 0 0 EH W 0 0 0 W 0 0 0 0 0 0 3 EH 0 0 Eh Ui 0 EH 3 Eh 0 3 Eh £ Eh 3 Eh X 0 3 0 W Eh Eh 0 W 0 3 0 Q 0 0 0 i-5 3 3 _ 0 Q 3 0 3 co 0 Eh 3 X Eh 0 Eh £ Eh 0 0 1-5 0 3 0 0 0 3 CJ X 0 Eh, 3 X 3 0 3 x CÍ Eh 0 i-5 0 3 0-3 EH 0 i-5 0 0 0 W 0- 0 Sx 0 3 Eh Ui 3 0 Eh 0 0 0 W 0 0 0 0 EH PHH rH rH r- (rH 3 VO CN O CO O O (D VO CO CO σι H

Quadro 4 (pág.2)Table 4 (page 2)

0 U A o Eh 3 0 0 1 0 3 Z 0 u 0 3 0 3 3 3 Eh P O EH , 3 CO 0 3 3 Eh 0 0 &amp; O 0 Q 3 EH 0 a 0 3 0 63 0 0 0 3 0 3 0 0 0 h! 0 0 Eh X 3 0 3 0 O Q Ej 0 3 A EH EH Eh tO O 0 0 0 0 0 3 3 3 CO 0 0 3 H Eh 0 0 3 0 0 0 3 EH X 0 Eh 0 Ph 0 3 EH 0 EH EH 0 0 O M 0 3 0 0 0 3 Z 3 3 0 &gt; 0 EH 3 EH , 0 63 0 0 0 3 0 0 0 Q 3 0- 0 U o ^ EH 3 Eh CO 0 3 0 0 3 3 EH . 3 0 Λ 0 0 3 Z EH EH 0 63 0 0 0 Ol 0 0 U Eh Eh 0 0 0 _ 0 A 0 EH , 0 0 0 0 0 O 0 &gt; 0 3 0 A 0 3 0 J Eh 0 0 0 H CO 0 0 Ol 0 0 0 CU 0 0 0 A 0 3 0 3 3 Eh 0 0 EH 0 EH 0 3 Eh 0 Eh 0 EH O 63 0 0 0 0 0 EH „ Eh CG 3 3 EH 3 3 H EH Eh 3 to 0 0 0 *3 0 0 J 3 Z EH 0 0 EH „ 0 i-P 0 EH to 0 «3 0 A 0 0 0 ϋ O d 0 rfj 3 Z 0 0 0 w 3 3 3 3 E-t tO 3 0 0 « 0 0 0 0 0 0 0 X 0 0 0 o 3 Eh 0 0 0 0 II 0 0 0 A 0 O 0 3 3 Eh 3 0 0 0 1 3 0 A 3 Eh Eh EH O Q 0 d Eh X 0 EH 1 0 Oí 0 Eh Eh J 3 0 0 _ . 0 3 0 EH ^ 0 a 0 0 3 H 3 0 0 P-l Èh £ Eh 0 0 &gt; 3 3 0 0 0 0 Eh * 0 Eh PH b 0 0 A EH 0 i O σ 3 3 0 3 0 0 Eh 0 3 CO 0 0 0 0 1 0 3 3 Z 3 0 Eh 3 . 0 3 0 Eh „ 3 to 0 1 0 0 63 0 0 3 tO 3 13 Z 0 3 ^ 0 h! 0 Eh ^ 1 3 W EH Eh EH to 0 0 O 3 3 64 0 3 0 &gt; 1 0 0 3 a EH 3 0 EH , 3 z 0 0 3 Z EH 1 3 Eh to 0 3 0 α EH U t-9 0 0 3 tO 0 0 i 0 α 0 3 Eh X EH 0 O υ 0 0 3 0 0 3 1 3 Eh , 0 63 EH 0 3 i&lt;! 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A metionina inicial é seguida de 18 aminoácidos predominantemente hidrofóbicos assemelhando-se a uma sequência sinal secretora. A proteína madura, tendo um peso molecular relativo de 71,1 Kd consiste numa fracção extracelular de 491 resíduos, seguido de um domínio de 19 resíduos que atravessa a membrana (sublinhado em duplicado) e um domínio intracelular de 118 aminoácidos. Dez potenciais sítios de glicosilação ligada em N (N-X-S/T, X não é igual a P) foram encontrados no domínio extracelular previsto, assim como um grande número de resíduos serina e treonina que podem ser sítios de adição de glicano ligado em O. A abundância de potenciais sítios de glicosilação e a diferença no peso entre o esqueleto proteico previsto e o produto precipitado a partir de células COS e as linhas de células B sugere que cerca de 50% do peso de CD22 é dado pelo açúcar. A porção extracelular de CD22 consiste em cinco segmentos tendo tendo uma organização de domínios do tipo imunoglobu-lina. O pequeno espaço entre císteinas (63 e 64 resíduos nos domínios 1 e 2 e 42 resíduos nos domínios 3-5) sugere que eles se dobrem na estrutura de 7 cadeias em duas camadas de folhas beta característica das regiões constantes das imunoglobulinas em lugar da estrutura de 9 cadeias das regiões variáveis.The initial methionine is followed by 18 predominantly hydrophobic amino acids resembling a secretory signal sequence. The mature protein having a relative molecular weight of 71.1 Kd consists of an extracellular fraction of 491 residues, followed by a 19-residue membrane spanning domain (duplicate underlining) and an intracellular domain of 118 amino acids. Ten potential N-linked glycosylation sites (NXS / T, X is not equal to P) were found in the predicted extracellular domain, as well as a large number of serine and threonine residues which may be O-linked glycan addition sites abundance of potential glycosylation sites and the difference in weight between the predicted protein skeleton and the product precipitated from COS cells and B cell lines suggests that about 50% of the weight of CD22 is given by sugar. The extracellular portion of CD22 consists of five segments having an organization of immunoglobulin-like domains. The small space between cysteines (63 and 64 residues in domains 1 and 2 and 42 residues in domains 3-5) suggests that they fold in the 7-strand structure into two layers of beta sheets characteristic of the constant regions of the immunoglobulins instead of the structure of 9 chains of the variable regions.

Devido a CD22 ter sido encontrado como altamente homólogo da glicoproteína associada a mielina (MAG), uma proteína de superfície de células neuronais que medeia os contactos célula-célula durante a mielogénese, postulou-se que CD22 tem um papel na adesão de células B. As células COS transfectadas com cDNA de CD22 foram colocadas em contacto com eritrócitos ou células mononucleares do sangue periférico e incubadas em condições que minimizem a interacção inespecífica. Observou-se a formação de rosetas com eritrócitos e células mononucleares com células COS positivas para CD22 mas não com células COS transfec-tadas com um clone de cDNA não relacionado.Because CD22 has been found to be a highly homologous myelin-associated glycoprotein (MAG), a neuronal cell surface protein that mediates cell-cell contacts during myelogenesis, it has been postulated that CD22 has a role in B cell adhesion. COS cells transfected with CD22 cDNA were contacted with erythrocytes or peripheral blood mononuclear cells and incubated under conditions that minimize nonspecific interaction. Roset formation with erythrocytes and mononuclear cells with CD22 positive COS cells but not with COS cells transfected with an unrelated cDNA clone was observed.

Os estudos de adesão de células B envolvendo os anticorpos monoclonais indicaram que epítopos diferentes de CD22 pode participar na adesão de eritrócitos e monócitos e que diferentes ligandos podem ser econhecidos em cada um dos tipos celulares. Os estudos de adesão de células B também sugere que CD22, de forma análoga à adesão de CD2, CD4 e CD8 de células T a células alvo# pode promover o reconhecimento pelo receptor de antigénios das células B através da intensificação dos contactos com células apresentadoras de antigénios. CD22 foi anteriormente implicado na transmissão de sinais de sinergismo com o receptor de antigénios (Pezutto et al.. J. Immunol. 138;98-103 (1987)) e ligação cruzada da IgM de superfície produz um fluxo de cálcio intracelular em células igM±CD22+ mas não em IgM+CD22“ (Pezzuto et al.. J.B cell adhesion studies involving monoclonal antibodies have indicated that different epitopes of CD22 may participate in the adhesion of erythrocytes and monocytes and that different ligands can be recognized in each of the cell types. B-cell adhesion studies also suggest that CD22, analogously to adhesion of CD2, CD4, and CD8 from T cells to target cells, can promote recognition by the B cell antigen receptor by enhancing the contacts with antigens. CD22 has previously been implicated in the transmission of synergism signals to the antigen receptor (Pezutto et al., J. Immunol. 138, 98-103 (1987)) and cross-linking of surface IgM produces an intracellular calcium flux in IgM cells ± CD22 + but not in IgM + CD22 "(Pezzuto et al., J.

Immunol. 140:1791-1795 (1988)). Estes resultados sugerem que tal como as moléculas acessoras de células T, CD22 pode também participar na regulação da transdução de sinais. A capacidade para interferir com a ligação de células positivas para CD22 com células acessoras ou a capacidade para causar tal ligação em superfícies diferentes das dos linfócitos pode ser útil em diagnóstico e terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de CD22 e um ligando de receptor fixado a um substrato será útil na detecção da presença de um antigénio particular em fluídos do corpo. Uma forma solúvel de CD22 pode ter actividade imunomoduladora.Immunol. 140: 1791-1795 (1988)). These results suggest that like the T cell ad- dition molecules, CD22 may also participate in the regulation of signal transduction. The ability to interfere with the binding of CD22 positive cells to accessory cells or the ability to cause such binding on non-lymphocyte surfaces may be useful in diagnosis and therapy. For example, a CD22 fusion protein and a receptor ligand attached to a substrate will be useful in detecting the presence of a particular antigen in body fluids. A soluble form of CD22 may have immunomodulatory activity.

Exemplo XIIIExample XIII

Isolamento e Clonaqem Molecular de cDNA Codificador do Anticrénio CD27 Especifico de Linfócitos TIsolation and Clonaqem Molecular of cDNA CD27 Anticrene Encoder Specific of T lymphocytes

Um clone de cDNA codificador de CD27 foi obtido a partir de cDNA de linfócitos T humanos trasnferidos para células COS e imuno-seleccionado pelo método do presente invento. Extraiu-se RNA a partir de células mononucleares derivadas de uma unidade de sangue, após quatro dias de cultura em meio contendo 1 jtíg/ml de fito-hemaglutinina (PHA) , usando tiocianato de guanidi-nio. O RNA total foi seleccionado relativamente a poli(A). Fez-se cDNA e clonou-se em CDM8, usou-se para transfectar células COS e o cDNA de CD27 foi imuno-seleccionado com os anticorpos monoclo-nais 0KT18a e CLB-9F4 (fornecidos como descrito em Seed e Aruffo Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84;3365-3369 (1987)). O vector continha uma inserção de cDNA de 1,2 Kb. A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada por terminação de cadeias de didesoxinucleótidos como descrito, supra. A sequência de 1203 resíduos e a sequência de aminoácidos deduzida estão apresentadas na Tabela 5. 116A cDNA clone encoding CD27 was obtained from human T lymphocyte cDNA transfected into COS cells and immunoelected by the method of the present invention. RNA was extracted from mononuclear cells derived from one unit of blood after four days of culture in medium containing 1æg / ml phytohemagglutinin (PHA) using guanidinium thiocyanate. Total RNA was selected relative to poly (A). CDNA was cloned and cloned into CDM8, used to transfect COS cells and the CD27 cDNA was immunoelected with the monoclonal antibodies 0KT18a and CLB-9F4 (supplied as described in Seed and Aruffo Proc Natl. Acad Sci USA 84: 3365-3369 (1987)). The vector contained a 1.2 kb cDNA insert. The nucleotide sequence of the cDNA was determined by dideoxynucleotide chain termination as described, supra. The 1203 residue sequence and the deduced amino acid sequence are shown in Table 5.

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Ο O ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Μ Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο II CJ Ε W Ο υ Ο Ο II ο ri ri ri ri Α Α ι ι ι ι Ο Ο Ο α u u u II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II II ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ri ri Ε II ri Ε ri ri II II II "" "" "" "" Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α Α 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο &gt; II ri Β ΕΕΕ ΕΜ II II 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 υ Ε II Ο Ο II II Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο "" "" Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Α Β Α Α Α Α Α, 1,,,,, ri 1 U U U U U U U 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I 0 ri Ο Α ο Ε 1 3 κ ο ri ri Η 1 3 Β ri ri ο Ο 1 Ε ri ο II II & Ε Ο Ο ο ri Α ri ri ri ri ri ri 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri α U U U U U U 0 0 0 0 0 0 0 U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U Α ο U U U Ο Ο Ο 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U W W W W W W W W W W W WU ο Ε Ο ο ri ri CQ Ο Α Α W W W W W W W W W W ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri Ε Ο ri ri Ο ri Ο ri & ri ri ri ri W W W W W ri ri ri ri ri 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Ο Ο Ο Ο Ο Α Α Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο C Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ Λ ο Ο Ο ο U Α Ο υ Α U U U U U U U U U U U U U U U U---------------------------------------- Ε ri ri ο 3 Ε Ο ο U ri Ε Ο Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ε Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri υ ri ο α α ri ri ri ri ri ri ri ri ri U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U ο ο ri ο ο ri ri 3 3 3 3 3 3 ri ri ri ri ri ri ri Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο ri ri ri ri u u ri ri ri ri ri ri ri ri Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri Ε ο ο ο Ο ri ri ri ri ri U U U U ri ri ri ri ri ri U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri. ο Ο Ε 3 < ο, Ε ri ri Ο ri Ο 3 3 3 3 3 3 U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U U Ο ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri ri - ο U ο «- - - Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Ν Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η

A metionina de iniciação está indicada pelo número 1 acima do codão de iniciação. 0 polipeptídeo CD27 deduzido demonstra as características típicas de uma proteína de membrana integral tipol. Ela começa com uma região hidrofóbica de vinte aminoácidos consistente com uma sequência sinal secretora. Esta região hidrofóbica é seguida de um domínio hidrofóbico que atravessa a membrana (duplamente sublinhado) e um domínio cito-plasmático de 49 aminoácidos começando com uma sequência de paragem de transferência carregado positivamente. Não existe uma cauda poli (A).The initiating methionine is indicated by the number 1 above the initiation codon. The deduced CD27 polypeptide demonstrates the typical characteristics of an integral tipol membrane protein. It begins with a hydrophobic region of twenty amino acids consistent with a secretory signal sequence. This hydrophobic region is followed by a membrane-bound (double-underlined) hydrophobic domain and a 49 amino acid cytoplasmic domain beginning with a positively charged transfer stop sequence. There is no poly tail (A).

A sequência de aminoácidos deduzida de CD27 é altamente homóloga do antigénio CD40 de linfócitos B e de carcinoma, descrito supra, ao longo de todo o seu comprimento. CD27 é também altamente homólogo do receptor do factor de crescimento das células nervosas (NGFR) nos domínios extracelulares e transmem-branares (Stamenkovic et al.. EMBO J. 8:1403-1410 (1989); Johnson et al.. cell 47:545-554 (1989)). o motivco estrutural mais conservadonestas três proteínas é a abundância de císteinas ou histidinas na região extracelular. Estas são muitas vezes encontradas aos pares separados por dois ou quatro resíduos de aminoácidos intervenientes semelhantes ao arranjo encontrado em proteínas que usam esta estrutura para ligar um ião zinco. A região rica em císteina e histidinas é seguida de um domínio proximal membranar rico em serina, treonina e prolina que foi sugerido como sendo a região em que glicanos bioquimicamente identificados ligados em O são adicionados a NGFR (Johnson et al. (1986), supra; Grob et al.. J. Biol. Chem. 260:8044-8049 (1985)). A imunoprecipitação de células COS transfectadas com anticorpos anti-CD27 seguido de electroforese em gel revelou a presença de uma espécie de 110 Kd quando não reduzida e uma única banda de 55 Kd na presença de agente redutor. Isto indica que nas 118The deduced amino acid sequence of CD27 is highly homologous to the CD40 antigen of B lymphocytes and carcinoma, described supra, along its entire length. CD27 is also highly homologous to the nerve cell growth factor receptor (NGFR) in extracellular and transmembrane domains (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403-1410 (1989); Johnson et al., Cell 47: 545-554 (1989)). the most conservative structural motivation of these three proteins is the abundance of cysteines or histidines in the extracellular region. These are often found in pairs separated by two or four intervening amino acid residues similar to the arrangement found in proteins that use this structure to bind a zinc ion. The cysteine-rich region and histidines are followed by a membrane proximal domain rich in serine, threonine and proline which has been suggested to be the region in which O-linked biochemically identified glycans are added to NGFR (Johnson et al. (1986), supra , Grob et al., J. Biol. Chem. 260: 8044-8049 (1985)). Immunoprecipitation of COS cells transfected with anti-CD27 antibodies followed by gel electrophoresis revealed the presence of a 110 Kd species when not reduced and a single 55 Kd band in the presence of reducing agent. This indicates that in the

células COS transfectadas, CD27 é um homodímero ligado por pontes dissulfureto compreendido por monómeros de 55Kd, semelhante às formas precipitadas a partir de linfócitos T. (Bigler et al.. J. Immunol. 141:21-28 (1988); Stockinger et al.. Leukocvte Tvpinq II. vol. 1:513-529 (1986); Van Lier et al.. Eur. J. Immunol. 18:811-816 (1987)).transfected COS cells, CD27 is a disulfide bonded homodimer comprised of 55Kd monomers similar to forms precipitated from T lymphocytes (Bigler et al., J. Immunol 141: 21-28 (1988); Stockinger et al. Leukocyte Tvpinq II, 51: 513-529 (1986); Van Lier et al., Eur. J. Immunol., 18: 811-816 (1987)).

CD27 é um antigénio de activação de linfócitos T. A sua estrutura sugere que ele pode funcionar como receptor de uma linfoquina ou factor de crescimento. 0 reconhecimento de CD27 causa a proliferação de células T e aumenta a expressão de certos genes necessários para as funções auxiliares e efectoras da célula T. A expressão de CD27 em células T aumenta duas a cinco vezes com estimulação por fito-hemaglutinina (PHA) ou anticorpos monoclonais contra CD3 e a adição de pelo menos um anticorpo monoclonal contra CD27 pode aumentara proliferação de células T estimulada com PHA (Bigler e Chiorazzi, Leukocvte Tvpincf II. Vol. 1:503-512 (1986); Van Lier, (1987)). Encontrou-se que as células T positivas para CD27 proporcionam auxílio a células B para a síntese de IgM e secretam 11-2 quando adequadamente estimuladas (Van Lier et al.. Eur. J. Immunol. 18:811-816 (1988)).CD27 is a T lymphocyte activation antigen. Its structure suggests that it may function as a receptor for a lymphokine or growth factor. Recognition of CD27 causes T cell proliferation and increases the expression of certain genes required for helper and effector T cell functions. CD27 expression in T cells increases two to five times with phytohemagglutinin (PHA) stimulation or monoclonal antibodies against CD3 and the addition of at least one monoclonal antibody against CD27 can increase PHA stimulated T cell proliferation (Bigler and Chiorazzi, Leukocyte Tppincf II, Vol 1: 503-512 (1986); Van Lier, (1987) ). CD27 positive T cells have been found to aid B cells for IgM synthesis and to secrete 11-2 when properly stimulated (Van Lier et al., Eur. J. Immunol., 18: 811-816 (1988)). .

A capacidade para interferir com a ligação de CD27 a células T positivas com células apresentadoras de antigénios ou a capacidade para causar a ocorrência de tal ligação nas superfícies que não sejam de linfócitos, pode ser útil em diagnósticos e em terapia. Por exemplo, uma proteína de fusão de Cd27 e um ligando de receptores fixado a um substrato serão úteis na detecção da presença de um antigénio particular nos fluidos do corpo. Uma proteína de fusão CD27 solúvel será útil para evitar proliferação de células T indesejável, por exemplo, em certas doenças auto-imunes. 119The ability to interfere with binding of CD27 to T cells positive with antigen presenting cells or the ability to cause such binding to occur on non-lymphocyte surfaces may be useful in diagnostics and therapy. For example, a Cd27 fusion protein and a ligand of receptors attached to a substrate will be useful in detecting the presence of a particular antigen in the body fluids. A soluble CD27 fusion protein will be useful to prevent undesirable T-cell proliferation, for example, in certain autoimmune diseases. 119

Exemplo XIV Isolamento e Clonaaem Molecular de DoisExample XIV Isolation and Cloneaem Molecular of Two

Clones de cDNA Codificadores de Antiqénios Leu8 Específicos de Linfócitos TCDNA clones Encoders of Leu8 T-lymphocyte Specific Antigens

Dois clones de cDNA codificadores de determinantes Leu8 foram isolados a partir de uma biblioteca de células T humanas pelo método do presente invento.Two cDNA clones encoding Leu8 determinants were isolated from a human T cell library by the method of the present invention.

A sequência de nucleótidos do cDNA foi determinada pela terminação de cadeias de didesoxinucleótidos como descrito supra. As análises de sequências de DNA (Tabela 6) mostra que a inserção maior contem 2350 resíduos enquanto que a mais pequena contem não possui 436 resíduos internos mas é idêntica no restante.The nucleotide sequence of the cDNA was determined by the termination of dideoxynucleotide chains as described supra. DNA sequence analysis (Table 6) shows that the largest insert contains 2350 residues while the smallest contains no 436 residues inside but is the same in the remainder.

II

QuadroPainting

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Quadro 6 (Pag.3) 3 3 ο ΕΗ o EH ΕΗ ο o 4 3 3 EH 0 Ο 3 o 3 ΕΗ ΕΗ 0 EH 3 ΕΗ 3 υ 0 ΕΗ 0 EH υ ΕΗ 3 Ej ο ΕΗ 3 &lt; 3 υ 4 0 3 0 4 3 Ο Εη Eh Eh υ Ο Eh O ΕΗ Ο O υ 3 0 3 4 3 g B Β υ 3 ΕΗ O 4 ΕΗ 3 O 0 Εη 3 Ej o ΕΗ 0 3 0 0 ΕΗ Ej Ej Ο ΕΗ 3 ΕΗ Ej 0 EH Ο 3 EH hH 3 D O §H Εη 0 EH EH Ο ΕΗ 3 υ 3 ΕΗ 0 υ 3 ΕΗ EH 4 Ej ΕΗ EH 0 3 3 EH 4 ΕΗ 4 O Ο Εη 0 EH 0 Εη 0 O 0 ΕΗ ΕΗ Eh υ 0 3 3 ο ΕΗ 0 0 ο ΕΗ 3 3 Εη 0 3 0 Ο 4 ΕΗ EH υ υ 0 0 υ υ Εη 4 ο 3 υ 3 ΕΗ υ υ υ ΕΗ ο υ 0 ΕΗ υ 3 EH υ 0 Εη 0 υ 3 ΕΗ 0 ΕΗ 3 0 3 υ υ 0 Eh ΕΗ ΕΗ υ υ υ 3 o ο υ 3 Ej Ej 0 0 3 4 ΕΗ ΕΗ ICC 3 υ Ο 3 3 0 3 0 ο ο ΕΗ EH ΕΗ ο Εη O 4 3 U 3 4 υ ΕΗ 0 0 ΕΗ Εη Eh 4 Ο υ 3 υ ΕΗ 0 0 ΕΗ 3 0 3 ΕΗ υ ΕΗ 3 4 ΕΗ u 0¾ 0 ΕΗ 0 3 Εη ΕΗ Εη O Εη Εη 3 υ |rf 0 3 ο &lt;] ΕΗ Eh ΕΗ ΕΗ Ο O Ej ΕΗ 0 3 - ΕΗ ΕΗ Eh Λ - υ 0 Ej ΕΗ 0 4 Ο ΕΗ 3 H γΗ Η γΗ O C0 \0 *3* O Ο Η Ο] 03 Οί CM οα H 03 n 03Table 6 (Pag.3) 3 3 ο ΕΗ o EH ΕΗ ο o 4 3 3 EH 0 Ο 3 or 3 ΕΗ ΕΗ 0 EH 3 ΕΗ 3 υ 0 ΕΗ 0 EH υ ΕΗ 3 Ex ο ΕΗ 3 < 3 υ 4 0 3 0 4 3 Ο Εη Eh Eh υ Ο Eh O ΕΗ Ο O υ 3 0 3 4 3 g B Β υ 3 ΕΗ O 4 ΕΗ 3 O 0 Εη 3 Eg or ΕΗ 0 3 0 0 ΕΗ Eg Eg Ο ΕΗ 3 ΕΗ Ej 0 EH Ο 3 EH hH 3 DO H H Εη 0 EH EH Ο ΕΗ 3 υ 3 ΕΗ 0 υ 3 ΕΗ EH 4 E Ε E E 0 3 3 EH 4 ΕΗ 4 O Ο Εη 0 EH 0 Εη 0 0 ΕΗ ΕΗ Eh υ 0 3 3 ο ΕΗ 0 0 ο ΕΗ 3 3 Εη 0 3 0 Ο 4 ΕΗ EH υ υ 0 0 υ υη Εη 4 ο 3 υ 3 ΕΗ υ υ ΕΗ ο υ 0 ΕΗ υ 3 EH υ 0 Εη 0 υ 3 ΕΗ 0 ΕΗ 3 0 3 υ υ 0 Eh ΕΗ ΕΗ υ υ υ 3 ο υ 3 Ex Ej 0 0 3 4 ΕΗ ΕΗ ICC 3 υ Ο 3 3 0 3 0 ο ο ΕΗ EH ΕΗ ο Εη O 4 3 U 3 4 υ ΕΗ 0 0 ΕΗ Εη Eh 4 Ο υ 3 υ ΕΗ 0 0 ΕΗ 3 0 3 ΕΗ υ ΕΗ 3 4 ΕΗ u 0¾ 0 ΕΗ 0 3 Εη ΕΗ Εη O Εη Εη 3 υ | rf 0 3 ο < ΕΗ Eh ΕΗ ΕΗ Ο O ΕΗ ΕΗ 0 3 - ΕΗ ΕΗ Eh Λ - υ 0 Ej ΕΗ 0 4 Ο ΕΗ 3 H γΗ Η γΗ O C0 \ 0 * 3 * O Ο Η Ο] 03 Οί CM οα H 03 n 03

123123

Toda a sequência do clone mais longo está apresentada, com a porção eliminada do clone mais curto sublinhado acima. A sequência de aminoácidos prevista está apresentada abaixo da sequência de nucleótidos. Os sítios de potencial glicosilação ligada em N estão designados por —CHO— e a região transmem-branar proposta para a forma mais longa está duplamente sublinhada.The entire longer clone sequence is presented, with the deleted portion of the shorter clone underlined above. The predicted amino acid sequence is shown below the nucleotide sequence. N-linked potential glycosylation sites are designated -CHO- and the proposed transmembrane region for the longer form is doubly underlined.

A hibridação de transferências de DNA do genoma fragmentado de células T humanas mostrou um padrão consistente com um gene de cópia única. A hibridação de transferências de RNA revelou um transcrito principal de 2,4 Kb em células mononuclea-res de sangue periférico, células B das amígdalas e várias linhas de células linfocíticas; e um transcrito pouco abundante de 2,0 Kb, presente em células mononucleares de sangue periférico e as linhas de células T leucémicas HSB-2.Hybridization of DNA transfers from the fragmented genome of human T cells showed a pattern consistent with a single copy gene. Hybridization of RNA blots revealed a major 2.4 kb transcript in peripheral blood mononuclear cells, tonsil B cells and various lymphocyte cell lines; and a low-abundance 2.0 kb transcript present in peripheral blood mononuclear cells and HSB-2 leukemic T cell lines.

A sequência proteica codificada pela inserção maior (a forma convencional) é portadora de um domínio fortemente hidrofó-bico putativo que atravessa a membrana perto do seu extremo C, seguido de vários resíduos carregados positivamente assemelhando--se a uma sequência âncora citoplasmãtica. A proteína está estreitamente relacionada com o receptor murino Mel-14 recentemente descrito (Lasky et al.. Cell 56:1045-1055 (1989); Sieqelmanet al., Science 243:1165-1172 (1989)). A proteína codificada pela sequência mais curta (uma forma com fosfolípidos ancorados) é portadora de um domínio C-terminal fracamente hidrofóbico característico de proteínas de superfície qy«ue estão ligadas à membrana celular por ligação covalente a um glicano substituído com fosfatidilinositol. 124The protein sequence encoded by the major insert (the conventional form) carries a strongly hydrophobic putative domain that crosses the membrane near its C-terminus, followed by several positively charged residues resembling a cytoplasmic anchor sequence. The protein is closely related to the recently described Mel-14 murine receptor (Lasky et al., Cell 56: 1045-1055 (1989); Sieqelmanet et al., Science 243: 1165-1172 (1989)). The protein encoded by the shorter sequence (a form with anchored phospholipids) carries a weakly hydrophobic C-terminal domain characteristic of surface proteins that are bound to the cell membrane by covalent attachment to a glycan substituted with phosphatidylinositol. 124

V )V)

Observou-se que os anticorpos monoclonais TQ1 (Reinherz et al. (1982) J. Immun. 128:463-468) e Mel-14 (Gallatin et al. (1983) Nature 304:30-34) reagem com células CO transfectadas com o clone Leu8. A presença ou ausência de Leu8 em linfócitos T CD4+ identifica as subséries supressora-indutora e auxiliar-indutora de células T CD4+. Leu8 é um receptor de auto-direcionamento, permitindo às células T aderirem a endotélio pós-capilar especializado dos nódulos linfáticos periféricos. A presença ou ausência de Leu8 classifica a célula T em termos de de potencial auto-direcionamento e distribuição nos tecidos. Estudos serológicos indicaram que Leu8 é uma marca de linfócitos em repouso nos nódulos linfáticos periféricos (Poletti et al.. Hum. Pathol. 19:1001-1007 (1988)). A activação de células T por ésteres de forbol mais PHA resulta em expressão reduzida de Leu8 e transcritos reduzidos, com a redução na expressão de Leu8 sendo mais rápida do que a redução dos transcritos Leu8. Parece pois que Leu8 de superfície é perdido mais rapidamente do que previsto pela regeneração de RNA, possivelmente por protecção da forma ligada a fosfatidilinositol (Ferguson &amp; Williams, A. Rev.TQ1 monoclonal antibodies (Reinherz et al. (1982) J. Immun. 128: 463-468) and Mel-14 (Gallatin et al. (1983) Nature 304: 30-34) were reacted with transfected CO cells with the Leu8 clone. The presence or absence of Leu8 in CD4 + T lymphocytes identifies the suppressor-inducing and helper-inducing subsets of CD4 + T cells. Leu8 is a self-targeting receptor, allowing T cells to adhere to specialized post capillary endothelium from peripheral lymph nodes. The presence or absence of Leu8 classifies the T cell in terms of potential self-targeting and distribution in tissues. Serological studies have indicated that Leu8 is a hallmark of lymphocytes resting on peripheral lymph nodes (Poletti et al., Hum. Pathol. 19: 1001-1007 (1988)). Activation of T cells by phorbol esters plus PHA results in reduced expression of Leu8 and reduced transcripts, with reduction in Leu8 expression being faster than the reduction of Leu8 transcripts. It therefore appears that surface Leu8 is lost more rapidly than predicted by RNA regeneration, possibly by protection of the form bound to phosphatidylinositol (Ferguson & Williams, A. Rev.

Biochem. 57:285-320 (1988)). Entre as células T periféricas, a subsérie CD4+ Leu8&quot; proporciona auxílio à síntese de IgM e IgG pelas células B (Reinherz et al.. J. Immun. 128:463-468 (1982);Biochem. 57: 285-320 (1988)). Among peripheral T cells, the CD4 + Leu8 subset &quot; provides aid to the synthesis of IgM and IgG by B cells (Reinherz et al., J. Immun. 128: 463-468 (1982);

Gatenby et al.. J. Immun. 129:1997-2000), enquanto que células CD4+ Leu8“ inibem directamente a síntese de IgG induzida pelo mitogénio erva dos cancros (Kanof et al.. J. Immun. 139:49-54 (1987)). Parece pois que células CD4+ Leu8&quot;, activadas para proporcionar auxílio à síntese de Ig pelas célulasB, saem dos nódulos e circulam perifericamente para encontrar as células apresentadoras de antigénio. 125Gatenby et al., J. Immun. 129: 1997-2000), whereas CD4 + Leu8 cells directly inhibit the mitogen-induced IgG synthesis of cancers (Kanof et al., J. Immun. 139: 49-54 (1987)). It appears therefore that CD4 + Leu8 &quot; cells, activated to provide support for Ig synthesis by B cells, exit the nodules and circulate peripherally to find the antigen presenting cells. 125

A capacidade para interferir com a ligação de células T Leu8“ a células apresentadoras de antigénio ou a capacidade para fazer com que tal ligação ocorra em outras superfícies que não de linfócitos, pode ser útil em diagnósticos e terapia. Por exemplo, o nível de células T Leu8” activadas relativamente a células Leu8+ em repouso poderá servir como uma medida da resposta imune a um antigénio particular.The ability to interfere with the binding of Leu8 'T cells to antigen presenting cells or the ability to cause such binding to occur on surfaces other than lymphocytes may be useful in diagnostics and therapy. For example, the level of Leu8 + T cells activated on Leu8 + cells at rest may serve as a measure of the immune response to a particular antigen.

0 domínio extracelular da proteína transmembranar Leu8 que medeia a adesão a células endoteliais especializadas dos nódulos linfáticos foi observado como sendo específico no seu reconhecimento do ligando lectina, galactosil-ceramida sulfatada (sulfito). A modificação da especificidade desta ligação pode servir para regular o potencial de auto-direcionamento das células T em repouso. As formas solúveis de LeuSpodem actuar como agentes anti-inflamatórios através da redução da migração de linfócitos.The extracellular domain of the Leu8 transmembrane protein mediating adhesion to specialized endothelial cells from lymph nodes was observed to be specific in its recognition of lectin ligand, sulfated galactosyl ceramide (sulfite). Modification of the specificity of this binding may serve to regulate the self-targeting potential of resting T cells. Soluble forms of LeuSp can act as anti-inflammatory agents by reducing lymphocyte migration.

Exemplo XV Isolamento e Clonaaem Molecular de cDNAsExample XV Molecular Isolation and Clonaaem of cDNAs

Codificadores de Antiqénios CD44Encoders of Antigens CD44

CD44 é uma proteína polimórfica integral de membrana. Análise de dados imunoquímicos e de transferências de RNA suportaram a existência de duas formas de CD44: uma forma de mesên-quima expressa pelas células hematopoiéticas e uma forma epi-telial fracamente expressa pelo epitélio normal mas altamente expressa pelos carcinomas.CD44 is an integral polymorphic membrane protein. Analysis of immunochemical and RNA transfer data supported the existence of two forms of CD44: a form of mesenchyma expressed by hematopoietic cells and an epithelial form weakly expressed by normal epithelium but highly expressed by carcinomas.

Para isolar um clone de cDNA codificador de CD44 (Stamenkovic et al.. Cell 56:1057-1062 (1989)), preparam-se bibliotecas a partir da linha celular de linfoma histiocítico U937, a linha linfoblastóide B JY, a linha Raji de linfoma de Burkitt e a linha de leucemia mielóide KG-1 foram transfectadas 126To isolate a cDNA clone encoding CD44 (Stamenkovic et al., Cell 56: 1057-1062 (1989)), libraries are prepared from the U937 histiocytic lymphoma cell line, the B lymphoblastoid line JY, the Raji line from Burkitt lymphoma and the KG-1 myeloid leukemia line were transfected

separadamente em células COS pelo método do DEAE-Dextran, descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfecção, incubadas com os anticorpos monoclonais J173 anti-CD44 (Pesandro et al.. J. immunol. 137:3689-3695 (1986)) e &quot;panned&quot; em placas revestidas com anticorpo de cabra anti-murganho purificado por afinidade. Após várias lavagens, as células aderentes foram lisadas e purificado DNA epissomal e usado para transfectar E. coli. Após dois ciclos semelhantes após fusão de esferoplastos, encontrou-se que DNA de plasmídeo recuperado a partir de três de entre oito colónias picadas ao acaso dirigem o aparecimento de determinantes CD44 hematopoiéticos em células COS transfectadas.separately in COS cells by the DEAE-Dextran method, described supra. The cells were pooled 48 hours after transfection, incubated with anti-CD44 monoclonal antibodies (Pesandro et al., J. Immunol. 137: 3689-3695 (1986)) and &quot; panned &quot; on plates coated with affinity purified goat anti-mouse antibody. After several washes, the adherent cells were lysed and purified episomal DNA and used to transfect E. coli. After two similar cycles after fusion of spheroplasts, plasmid DNA recovered from three out of eight randomized colonies was found to direct the appearance of hematopoietic CD44 determinants on transfected COS cells.

Dois destes três clones, CD44.5 e CD44.8, são portadores de inserções com cerca de 1,4 Kb, enquanto que o terceiro, CD44.4, continha uma inserção com cerca de 1,7 Kb. As células COS transfectadas com qualquer um destes clones reagiu com os anticorpos monoclonais anti-CD44 J173, F-10-44-2 (Dalchau et al.. Eur. J. Immunol. 10:745-749 (1980)) e o anticorpo monoclonal IM7 anti-Pgp-1 (Trowbridge et al.. Immunoaenetics 15:299-312 (1982)). As células não transfectadas apresentaram reactividade fraca com J173.Two of these three clones, CD44.5 and CD44.8, carry insertions of about 1.4 Kb, while the third, CD44.4, contained an insertion of about 1.7 Kb. COS cells transfected with any of these clones reacted with the anti-CD44 J173, F-10-44-2 (Dalchau et al., Eur. J. Immunol. 10: 745-749 (1980)) monoclonal antibodies and the antibody monoclonal IM7 anti-Pgp-1 (Trowbridge et al., Immunoaenetics 15: 299-312 (1982)). The untransfected cells showed weak reactivity with J173.

A sequência de nucleótidos do cDNA de CD44.5 hematopoi-ético (Tabela 7) consiste em 1354 resíduos terminando numa pequena cauda poli(A) de 19 pares de bases a jusante de uma sequência CATAAA. 127The nucleotide sequence of the hematopoietic CD44.5 cDNA (Table 7) consists of 1354 residues terminating in a small 19 base pair poly (A) tail downstream of a CATAAA sequence. 127

EH CD 2 CD 2 u EH Eh X CD CD &gt; υ 2 2 U CD 2 s u Eh , O « o u υ a EH 2 EH o CD 1 CD PO O CD CD CD 1 CD U Eh 0 EH O EH Eh O 2 « &lt; s 2 Eh „ 2 s CJ CD CD 0 A 1 2 CD 2 i υ a CD 0 „ 2 s υ 2 CD CD CD o U CD 2 CD 2 u CD CD H CD u Eh S 0 Eh CD α EH 2 S υ 0 0 &gt; 2 CD CD 2 υ υ u 2 2 2 EH υ 0 O ffi CJ u CD 2 o u o 0 EH O Pi CD 2 EH Pm CD EH u K 2 EH υ CD EH Eh k1 υ CD CD &gt; U ο Eh Se Eh O u CD CD 2 Eh CD CD _ CD CD υ CD EH £ 2 CD u EH 0 2 ω o EH CD 2 Eh o Eh Pm EH 2 o CD EH 2 S 0 2 Eh Pm u Eh 2 W CJ EH t- o α CD Eh Pm o u 2 „ υ « Eh Eh CD Q υ O •a u CD CD CD 2 (0 CJ Eh Eh υ CD 3 0 2 S u 2 a o O υ 2 w Eh u 2 EH u CD 2 2 o υ CJ Eh Eh O Eh 2 2 H 0 O CD Eh Eh O CD 2 O k) EH U 2 s CJ 2 υ CD 2 0 EH EH CD Q O υ Eh J Eh CD CD Eh CJ U 0 2 CD 2 0 eh CD Q υ EH Eh υ u CD CD EH CD 2 O α 2 H CD υ υ CD 2 EH EH 2 CD W Eh υ O O CD CD α CD υ 0 o U 2 Eh 2 CD CD 2 CD 0 υ CD CD υ CD EH cj ps CD υ υ μ} Eh H u Ο O υ u CD Eh W Eh CD 2 TO υ 0 o CD Eh α Eh Eh 2 H 0 Eh _0 α 2 Eh CD CD u υ O 2 TO o u 0 P) υ pH H H vo H eo H CM υ CJ 2 S υ Eh TO EH Eh to Eh Eh υ υ CD &gt; CD 2 EH 2 s EH Eh u 2 2 H u 2 s Eh O P. υ O u EH 2 Eh 2 EH (M 2 U S υ EH O o 2 H IH EH CJ D 2 H Eh CJ CD 2 2 Eh CD Eh Pm Eh CJ « 2 EH α CJ ãH u 2 Eh υ ρ&lt; α CJ EH 1 CJ Pi Eh CD Q 1 2 2 H Ej O CD CD rtj K CD CD Eh Ehjx υ EH CD &gt; o 1 2 0 2 1 CD Q EH ^ υ α Eh CD &gt; υ Eh EH ο Eh Pm 2 Eh W υ υ a CJ CJ CD υ CD 2 CD 2 Eh 2 CD CD υ $ ^ s 2 S CJ CD PO o υ 2 2 CJ Pi Ej Eh N CD 2 H 2 Eh 0 U CJ k1 Eh 2 Eh o Eh Pm O 2 CD Eh CD Q CD υ &gt;o 2 CD CD υ υ Eh EH 2 Eh 2 2 H CJ Eh &gt;h υ Eh CD 2 CD &gt; CD Eh &gt;h 2 2 Pd CD υ O Eh EH TO CD CD &gt; 2 Eh υ CD υ υ CD 2 Eh ο CD CD Eh 2 EH 2 CD CD U Eh CJ 2 2 Eh EH CD PO υ 2 EH 2 CD Q 2 Eh 2 S Eh Pi υ 2 2 CD PO 2 CD CD CD CJ u 2 CD PO Eh 1 CD 2 Eh 2 H 1 2 O CJ O U CJ P&lt; O PE CD 2 2 2 TO υ EH α CD 1 CD CJ Pi Eh , 1 Eh ϋ Eh CJ κΐ υ O EH EH CD 2 CJ 2 H 2 H H H ΓΊ o CO n *· Η2 0 Q Eh υ r U P&lt; υt* 0 gcn υ a u2 %EH CD 2 CD 2 or EH Eh X CD CD &gt; 2 2 2 U CD 2 E E,, a a a a a a o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o. s 2 Eh "2 s CJ CD CD 0 A 1 2 CD 2 i υ a CD 0" 2 s υ 2 CD CD CD or U CD 2 CD 2 u CD CD H CD u Eh S 0 Eh CD α EH 2 S υ 0 0 &gt; 2 CD CD 2 u u u u u u u u u u u u u u u u u u u 0 0 0 0 0 CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD. U ο Eh If u CD CD 2 CD CD CD CD CD CD EH 0 2 ω EH CD 2 Eh Eh Pm EH 2 o CD EH 2 S 0 2 Eh Pm u Eh 2 W CJ EH α CD CD P m 2 2 2 2 E E E E E E au au au au au au au au au au au au CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD 2 2 C CJ Eh Eh O Eh 2 2 H 0 The CD Eh Eh The CD 2 O k) EH U 2 s CJ 2 υ CD 2 0 EH EH CD QO υ Eh J Eh CD CD Eh CJ U 0 2 CD 2 0 eh CD CD EH CD CD EH CD 2 O 2 CD CD 2 EH EH 2 CD W CD CD CD CD 0 CD CD 2 CD 0 CD CD CD CD EH cj ps CD μ} E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E ) pH pH HH v H e H H CM υ CJ 2 S υ Eh TO EH Eh to Eh Eh υ υ CD &gt; CD 2 EH 2 s EH Eh u 2 2 H u 2 s Eh O P EH 2 Eh 2 EH (M 2 US ν EH O o 2 H IH EH CJ D 2 H Eh CJ CD 2 2 Eh CD Eh Pm Eh CJ «2 EH α CJ ãH u 2 Eh υ ρ <1 CJ EH 1 CJ Pi Eh CD Q 1 2 2 H Ex CD CD CD CD CD EH CD CD 1 2 0 2 1 CD Q EH ^ α EH CD E EH EH E Eh Pm 2 Eh W υ a CJ CJ CD CD CD 2 CD 2 Eh 2 CD CD $ s 2 S CJ CD PO or 2 2 2 CJ Pi Ex Eh N CD 2 H 2 Eh 0 U CJ k1 Eh 2 Eh o Eh Pm O 2 CD Eh CD Q CD υ> 2 CD CD υ υ Eh EH 2 Eh 2 2 H CJ Eh> h υ Eh CD 2 CD & gt CD Eh 2 CD CD EH CD 2 CD EH 2 CD EH 2 CD EH 2 CD Eh 2 CD Eh 2 CD Eh CD 2 CD Q 2 Eh 2 S Eh Pi υ 2 2 CD PO 2 CD CD CD CJ u 2 CD PO Eh 1 CD 2 Eh 2 H 1 2 O CJ OR CJ P &lt; O PE CD 2 2 2 TO Ü EH α CD 1 CD CJ Pi Eh, 1 Eh ϋ Eh CJ κΐ υ The EH EH CD 2 CJ 2 H 2 HHH ΓΊ o CO n · Η Η Η Η Η Η Η Η t t t t a a a a a a a a a a a a a a a a

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A clivagem deste peptldeo dará uma proteína madura de 341 resíduos com um peso molecular previsto de 37,2 Kd. 0 domínio amino-terminal extracelular de 248 resíduos é seguido de 21 aminoácidos predominantemente hidrofóbicos correspondendo ao domínio previsto (duplamente sublinhado) e um domínio hidrofílico de 72 resíduos (citoplasmático). A discrepância entre o peso previsto do esqueleto proteico e as formas desglicosiladas observado em imunoprecipitadas sugere que estão presentes muitos sítios de glicosilação ligada em N, indicados na Tabela 7 por uma designação —CHO— e é rica em resíduos serina e treonina (22% em agregado). o dipeptídeo SG que forma o sítio de ligação mínimo de sulfato de condroitina ligada a serina em proteínas com proteo-glicano aparece nos resíduos 160, 170, 211 e 238 no domínio extracelular previsto; estes potenciais sítios de glicosilação estão sublinhados. A hibridação de transferências de RNA revelou três mensageiros principais de 1.6, 2.2 e 5.0 Kb numa variedade de linhas celulares hematopoiéticas, incluindo a linha CESS linfo-blastóide B, as leucemias de células T HUT-102 e HPB-ALL, células T activadas por linfoquinas, células B das amígdalas e o linfoma histiocítico U937. A imunoprecipitação de CD44 a partir de células COS transfectadas revela que a forma mesenquimatosa ou hematopoiética de CD44 é cerca de 80-90 Kd. Observou-se que CD44 hematopoiético transfectado para uma linha de células B resulta na ligação de linfócitos portadores de CD44 a células do estroma de nódulos linfáticos de rato em cultura primária, indicando que CD44 hematopoiético pode desempenhar um papel no auto-direcionamento 1300 w Eh υ 0 P &lt; Is o * CDi 2 «I u 0 2 ISEiXY2 1 CD PO 2 CD CD Τ-Ϊvo m S H O Q 2 ο κ u Eh II CJ S υ 2 2 H || 2 EH 2 S 0 || Eh EH Pm Eh || CD &gt; 2 u Eh kD II Eh 0 0 2 EH II CJ 2 EH 2 0 II 2 Eh υ 0 0 2 II Eh 2 0 0 0 II CJ 0 Q. 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Cleavage of this peptide will yield a mature 341 residue protein with a predicted molecular weight of 37.2 Kd. The extracellular amino-terminal domain of 248 residues is followed by 21 predominantly hydrophobic amino acids corresponding to the predicted (double-underlined) domain and a 72-residue (cytoplasmic) hydrophilic domain. The discrepancy between the predicted weight of the protein backbone and the deglycosylated forms observed in immunoprecipitates suggests that there are many N-linked glycosylation sites listed in Table 7 by a -CHO- and is rich in serine and threonine residues (22% in aggregate). the SG dipeptide forming the minimal binding site of serine-bound chondroitin sulfate on proteins with glyco-protease appears at residues 160, 170, 211 and 238 in the predicted extracellular domain; these potential glycosylation sites are underlined. Hybridization of RNA blots revealed three major pathogens of 1.6, 2.2 and 5.0 Kb in a variety of hematopoietic cell lines, including the CSF lymphoblastoid B line, HUT-102 and HPB-ALL T cell leukemias, lymphokines, tonsil B cells, and U937 histiocytic lymphoma. Immunoprecipitation of CD44 from transfected COS cells reveals that the mesenchymal or hematopoietic form of CD44 is about 80-90 Kd. It has been found that hematopoietic CD44 transfected into a B cell line results in binding of CD44 bearing lymphocytes to rat lymphatic stromal cells in primary culture, indicating that hematopoietic CD44 may play a role in self-targeting 130

Λ(I.e.

de linfócitos. Mostrou-se que CD44 hematopoiético é um receptor da matrix extracelular com afinidade para colagénios tipo I e VI (Stamenkovic et al.. Cell 56:1057-1062 (1989)). CD44 hematopoiético pode também ter um papel na activação de linfócitos. A capacidade para interferir com a ligação de CD44 hematopoiético a células dos nódulos linfáticos ou a capacidade para causar tal ligação noutras superfícies pode ser útil em diagnóstico e terapia. Por exemplo, a modificação desta ligação pode servir para regular o potencial de auto-direcionamento dos linfócitos. As formas solúveis de CD44 podem ter actividade imuno-moduladora.of lymphocytes. Hematopoietic CD44 has been shown to be an affinity extracellular matrix receptor for type I and VI collagens (Stamenkovic et al., Cell 56: 1057-1062 (1989)). Hematopoietic CD44 may also play a role in lymphocyte activation. The ability to interfere with hematopoietic CD44 binding to lymph node cells or the ability to cause such binding on other surfaces may be useful in diagnosis and therapy. For example, modification of this binding may serve to regulate the self-targeting potential of lymphocytes. Soluble forms of CD44 may have immunomodulatory activity.

Para isolar um clone de cDNA codificador da forma epitelial de CD44, uma biblioteca de cDNA preparada a partir da linha de carcinoma do cólon HT29 foi usada para transfectar células COS pelo método do DEAE-Dextran descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfecção, incubadas com o anticorpo monoclonal F-10-44-2 anti-CD44 (Dalchau et al.. Eur. J. Immunol. 10:745-749 (1980)) e &quot;panned&quot; em placas revestidas com anticorpo de cabra anti-murganho purificado por afinidade. Após várias lavagens as células aderentes foram lisadas e o DNAepis-somal purificado e usado para transformar E. coli. Após dois ciclos semelhantes de enriquecimento após fusão de esferoplastos, como descrito supra. encontrou-se que o DNA de plasmídeo recuperado a partir de sete de entre dez colónias escolhidas ao acaso dirige o aparecimento de determinantes CD44 epiteliais em células COS transfectadas. os sete clones positivos são portadores de inserções de cDNA com cerca de 2,4 Kb. A análise com enzimas de restrição do clone contendo a inserção de cDNA epitelial mostrou que a sequência codificadora 131 (Tabela 8) foi alargada relativamente à inserção de CD44 hemato-poiético pela adição de 496 pares de bases. 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The cells were pooled 48 hours after transfection, incubated with anti-CD44 monoclonal antibody F-10-44-2 (Dalchau et al., Eur. J. Immunol., 10: 745-749 (1980)) and &quot; panned &quot; on plates coated with affinity purified goat anti-mouse antibody. After several washes the adherent cells were lysed and the DNAepis-somal purified and used to transform E. coli. After two similar cycles of spheroplast fusion enrichment, as described supra. plasmid DNA recovered from seven out of ten randomly chosen colonies has been found to drive the onset of epithelial CD44 determinants on transfected COS cells. the seven positive clones carry cDNA inserts of about 2.4 Kb. Restriction enzyme analysis of the clone containing the epithelial cDNA insert showed that the coding sequence 131 (Table 8) was enlarged relative to the hemato-poietic CD44 insert by the addition of 496 base pairs. 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s ã Eh % O A análise da sequência de DNA mostrou que o cDNA de CD44 epitelial é muito semelhante ao cDNA de 44.5 mas codifica mais um domínio extracelular de 165 aminoácidos, inserido cerca de 140 resíduos a montante da secção transmembranar partilhada por ambos os clones. A proteína madura compreenderá 493 resíduos. A análise da transferência de RNA revelou que os transcritos de CD44 epiteliais compreendem espécies de 2,2, 2,7 e 5,5 Kb. CD44 epitelial isolado por imunoprecipitação revelou que a glicoproteína tem cerca de 160 Kd. Células B transfectadas expressando CD44 epitelial não aderem a células do estroma de nódulos linfáticos de rato em cultura primária como acontece com linfócitos transfectados com CD44 hematopoiético. CD44 epitelial é fracamente expresso por carcinomas. É possível que a função do receptor de matrix extracelular de CD44 epitelial seja promover a invasão pelo tumor. A capacidade para interferir com a ligação de CD44 epitelial com matrizes extracelulares pode ser útil em terapia e em diagnósticos. Por exemplo, a interferência da ligação de CD44 epitelial a matrizes extracelulares pode diminuir a probabilidade de metastases em doentes com cancro. As formas solúveis de CD44 podem actuar para evitar o auto-direcionamento das células de metástases para os nódulos linfáticos.Analysis of the DNA sequence showed that the epithelial CD44 cDNA is very similar to the 44.5 cDNA but encodes yet another 165 amino acid extracellular domain, inserted about 140 residues upstream of the transmembrane section shared by both clones. The mature protein will comprise 493 residues. Analysis of RNA transfer revealed that epithelial CD44 transcripts comprise species of 2.2, 2.7 and 5.5 Kb. Epithelial CD44 isolated by immunoprecipitation has revealed that the glycoprotein has about 160 Kd. Transfected B cells expressing epithelial CD44 do not adhere to stromal cells from rat lymph nodes in primary culture as is the case with lymphocytes transfected with hematopoietic CD44. Epithelial CD44 is poorly expressed by carcinomas. It is possible that the function of the epithelial CD44 extracellular matrix receptor is to promote tumor invasion. The ability to interfere with epithelial CD44 binding with extracellular matrices may be useful in therapy and in diagnostics. For example, interference of epithelial CD44 binding to extracellular matrices may decrease the likelihood of metastases in cancer patients. Soluble forms of CD44 may act to prevent auto-targeting of the metastatic cells into the lymph nodes.

Exemolo XVI Isolamento e Clonaoem Molecular de cDNAExemolo XVI Isolation and Clonaoem Molecular cDNA

Codificador de Antigénios CD53 CD53, o antigénio reconhecido pelos anticorpos MEM-53 (Hadam, M.R. (1989) em Leukocvte Tvoinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 674), HD77, HI29 e HI36 e 63-5A3, é uma glicoproteína largamente distribuída entre as células 135CD53 Antigen encoding CD53, the antigen recognized by the MEM-53 antibodies (Hadam, MR (1989) in Leukocvte Tvoinq IV, Knapp, B. et al. (Eds.) Oxford Univ. and HI36 and 63-5A3, is a glycoprotein widely distributed between cells 135

nucleadas das linhas hematopoiéticas, mas restringida apenas a elas (Stevanova, I., et al. (1989) em Leukocyte Typinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678). CD53 é expresso por monócitos e macrófagos, por granulócitos, células dendríticas, osteoclastos e osteoblastos e por células T e B de todas as fases de diferenciação.nucleotides of the hematopoietic lines, but only restricted thereto (Stevanova, I., et al. (1989) in Leukocyte Typinq IV, Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. CD53 is expressed by monocytes and macrophages by granulocytes, dendritic cells, osteoclasts and osteoblasts, and by T and B cells of all stages of differentiation.

Para se obter um clone de cDNA codificador de CD53, bibliotecas de cDNA construídas a partir de linfócitos do sangue periférico e a linha HL6o de células tumorais promielocíticas e usadas para transfectar células COS pelo método de DEAE-Dextran descrito supra. As células foram reunidas 48 horas após transfec-ção, incubadas com anticorpos monoclonais MEM-53 e &quot;panned&quot; como descrito em Seed e Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365--3369 (1987) e Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:8573--8577 (1987). Após dois ciclos subsequentes de enriquecimento após fusão de esferoplastos, o DNA de plasmídeo recuperado a partir de colónias isoladas foi usado para transfectar células COS e avaliada a expressão de CD53 por imunofluorescência.To obtain a cDNA clone encoding CD53, cDNA libraries constructed from peripheral blood lymphocytes and the HL6o line of promyelocytic tumor cells and used to transfect COS cells by the DEAE-Dextran method described supra. Cells were pooled 48 hours post-transfection, incubated with MEM-53 monoclonal antibodies and &quot; panned &quot; as described in Seed and Aruffo, Proc. Natl. Acad. Know. USA 84: 3365-3369 (1987) and Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Know. USA 84: 8573--8577 (1987). After two subsequent enrichment cycles after fusion of spheroplasts, plasmid DNA recovered from isolated colonies was used to transfect COS cells and CD53 expression was evaluated by immunofluorescence.

II

Dois de entre oito transfectantes foram positivos, cada um deles portador de uma inserção de aproximadamente 1,5 Kb. As células COS transfectadas com ambos os clones reagiram com os anticorpos MEM-53, HT29, HI36 e 63-5A3.Two out of eight transfectants were positive, each carrying an approximately 1.5 Kb insert. COS cells transfected with both clones reacted with the MEM-53, HT29, HI36 and 63-5A3 antibodies.

Para isolar CD53 a partir de linfócitos do sangue periférico e as células COS transfectadas para fins de comparação, linfócitos e células COS transfectadas foram marcadas na supefície com 125i usando lactoperoxidase e H2O2 e depois lisadas num tampão de lise de 50 mM Tris-HCl pH 8,0 contendo 1% NP40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 20 mM iodoacetamida e 1 mM fluore-to de fenilmetilsulfonilo. As células foram solubilizadas numa concentração de 2,5 x IO7 células/ml em tampão de lise durante 45 136To isolate CD53 from peripheral blood lymphocytes and COS cells transfected for comparison, lymphocytes and transfected COS cells were labeled on 125i surface using lactoperoxidase and H 2 O 2 and then lysed in a 50 mM Tris-HCl pH 8 lysis buffer , Containing 1% NP40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 20 mM iodoacetamide and 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride. Cells were solubilized at a concentration of 2.5 x 107 cells / ml in lysis buffer for 45

minutos depois centrifugado a 12000 g. Após pré-clarificação com esferas de anticorpos de cabra anti.imunoglobulina de murganho (Cappel, Malvern, PA) as imunoprecipitações foram realizadas cora os anticorpos monoclonais MEM53 ou 63-5A3 e Proteína A-Sepharose CL-4B (Sigma, St. Louis, MO)como descrito por Schneider et al. (J. Biol. Chem. 257:10766 (1982)). Os imunoprecipitados foram eluidos em tampão de amostra com SDS e analisados em géis de 12,5% de acrilamida contendo dodecilsulfato de sódio.minutes later centrifuged at 12000 g. After pre-clarification with beads of goat anti-mouse immunoglobulin (Cappel, Malvern, PA) antibodies the immunoprecipitations were performed with the monoclonal antibodies MEM53 or 63-5A3 and Protein A-Sepharose CL-4B (Sigma, St. Louis, MO) as described by Schneider et al. (J. Biol. Chem. 257: 10766 (1982)). The immunoprecipitates were eluted in SDS sample buffer and analyzed on 12.5% gels of sodium dodecylsulfate-containing acrylamide.

Uma banda larga de proteína marcada com iodo radioacti-vo com um peso entre 34 Kd e 42 Kd foi obtido a partir de linfó-citos do sangue periférico com os anticorpos monoclonais MEM-53 ou 63-5A3, comparável à banda obtida a partir de células COS transfectadas com CD53, estendendo-se entre 36 Kd e 64 Kd. O peso mais elevado nas células COS é atípico, pois as proteínas de superfície celular recuperadas a partir de células COS transfectadas geralmente apresentam peso molecular inalterado ou mais baixo do que o encontrado na célula de onde deriva o clone de cDNA (Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3365-3369 (1987)). Aproximadamente 15 Kd de peso foram libertados da glicoproteína por digestão com endoglicosidade F (N-glicanase), enquanto que o tratamento com neuraminidase e O-glicanase não tem efeito no peso molecular aparente (Hadam, M.R. (1989) em Leukocvte Tvpinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 674); Stevanova, I., et al. (1989) em Leukocvte Tvpinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678). Uma banda adicional fraca de 20 Kd, possivelmente precursor não glicosilado foi detectada em imunoprecipitados de células COS não transfectadas, mas estava ausente de imunoprecipitados de linfócitos do sangue periférico. A hibridação de DNA genómico derivado de uma linha de células de células T PEER digerido com várias enzimas revelou um 137A broad band of radioactively iodinated protein with a weight between 34 Kd and 42 Kd was obtained from peripheral blood lymphocytes with the MEM-53 or 63-5A3 monoclonal antibodies, comparable to the band obtained from COS cells transfected with CD53, ranging from 36 Kd to 64 Kd. The higher weight in COS cells is atypical since cell surface proteins recovered from transfected COS cells generally have unchanged or lower molecular weight than that found in the cell from which the cDNA clone is derived (Aruffo and Seed, Proc. Natl Acad Sci USA 84: 3365-3369 (1987)). Approximately 15 kg of weight were released from glycoprotein by digestion with F (N-glycanase) endoglycoside, whereas treatment with neuraminidase and O-glycanase had no effect on apparent molecular weight (Hadam, MR (1989) on Leukocvte Tvpinq IV. , B. et al (eds.), Oxford University Press, pp. 674); Stevanova, I., et al. (1989) in Leukocvte Tvpinq IV. Knapp, B. et al. (eds.) Oxford Univ. Press, p. 678). An additional weak band of 20 Kd, possibly non-glycosylated precursor was detected in immunoprecipitates of untransfected COS cells, but was absent from immunoprecipitates of peripheral blood lymphocytes. Hybridization of genomic DNA derived from a PEER T cell line digested with various enzymes revealed a 137

padrão consistente com um gene de uma única cópia. A análise de transferências de RNA revelou um único mRNA de 1,8 Kb derivado de linhas celulares mielóides e de linfócitos de sangue periférico. O nível de expressão foi comparável nas diferentes linhas celulares excepto na linha celular THP1, a qual tinha pouco mRNA CD53. Os transcritos de CD53 são mais abundantes em linfócitos de sangue periférico do que em linhas de células cultivadas, consistente com a expressão de CD53 de superfície mais abundante nestas células.consistent with a single copy gene. Analysis of RNA transfers revealed a single 1.8 kb mRNA derived from myeloid cell lines and from peripheral blood lymphocytes. The level of expression was comparable in the different cell lines except the THP1 cell line, which had little CD53 mRNA. CD53 transcripts are more abundant in peripheral blood lymphocytes than in cultured cell lines, consistent with the expression of the most abundant surface CD53 in these cells.

A sequência de nucleótidos do cDNA de CD53 foi determinada por terminação de cadeias didesoxinucleotídicas como descrito supra. usando oligonucleótidos iniciadores sintéticos. A sequência da inserção CD53 consiste em 1452 nucleótidos (Tabela 9) e termina perto de dois motivos AATAAA (sublinhados).The nucleotide sequence of the CD53 cDNA was determined by termination of dideoxynucleotide chains as described supra. using synthetic primer oligonucleotides. The CD53 insert sequence consists of 1452 nucleotides (Table 9) and terminates near two AATAAA motifs (underlined).

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03 LO03 LO

HH

A sequência não codificadora 3/ contém três exemplos da sequência ATTTA (indicado pelas aspas), que se demonstrou mediar a instabilidade de mRNA (Shaw e Kamen, Cell 46:659 (1986)). Uma grelha de leitura aberta começando no resíduo 74 codifica uma proteína de 219 aminoácidos com um peso molecular previsto de 24,340 Kd. O polipeptídeo previsto é invulgar por ser portador de quatro segmentos hidrofóbicos (duplamente sublinhados), três dos quais estão em estreita proximidade do extremo amina da molécula. 0 primeiro segmento hidrofóbico é atipicamente longo para sequência sinal ou simples hélice alfa transmembranar e contem três resíduos císteina e um resíduo glicina situado no meio. Ambas as císteinas e glicina precedem imediatamente o sítio do sinal de clivagem (von Heijne, Nucleic Acids Res. 14:4683 (1986)), sugerindo que o extremo amina da proteína madura começa no meio do primeiro domínio hidrofóbico. É dado algum apoio a este ponto de vista pelo facto de o tamanho do esqueleto polipeptídico de ME491, uma proteína de membrana integral tipo III relacionada, discutido infra, ser mais pequena do que o tamanho previsto a partir da sequência de cDNA, possivelmente como uma consequência da excisão de um peptídeo sinal. Devido a existir apenas dois sítios potenciais para adição de glicano ligado em N (indicado na Tabela 9 pelas designações —CHO—), situado entre o terceiro e quarto segmentos hidrofóbicos, o extremo carbonilo fica dentro da célula, assim como a fracção hidrofílica curta entre o segundo e o terceiro segmentos hidrofóbicos. Se o extremo amina não for processado ele deve permanecer intracelular. CD53 é uma proteína de membrana integral Tipo III relacionada com outra proteínas de membrana: antigénio ME491, uma proteína de melanoma cuja expressão aumentada está bem correlacionada com a progressão de tumores (Hotta, et al.. Câncer Res♦ 48:2955 (1988)); CD37 um antigénio extensivamente glicosilado predominantemente expresso em células B, mas não específico das linhas de células B /Schwartz et al.. J. Immun. 140:905 (1988); e S5.7 um antigénio não glicosilado largamente expresso em células da linhagem hematopoiética (Pressano et al.. Câncer Res. 43:4812 (1983)). Em adição, CD53 está distantemente relacionado com E. coli lac Y permease, uma proteína integral de membrana tipo III que faz a passagem de lactose para a célula bacteriana. Os transcritos de CD53 nos linfócitos de sangue periférico aumentam após estimulação mitogénica por PHA, sugerindo que a proteína pode estar envolvida no transporte de factores essenciais para a proliferação celular.Non-coding sequence 3 contains three examples of the ATTTA sequence (indicated by the double quotation marks), which has been shown to mediate mRNA instability (Shaw and Kamen, Cell 46: 659 (1986)). An open reading frame starting at residue 74 codes for a protein of 219 amino acids with a predicted molecular weight of 24.340 Kd. The predicted polypeptide is unusual in that it bears four hydrophobic segments (doubly underlined), three of which are in close proximity to the amino terminus of the molecule. The first hydrophobic segment is atypically long for signal sequence or simple transmembrane alpha helix and contains three cysteine residues and one glycine residue located in the medium. Both cysteines and glycine immediately precede the site of the cleavage signal (von Heijne, Nucleic Acids Res. 14: 4683 (1986)), suggesting that the amine end of the mature protein begins in the middle of the first hydrophobic domain. Some support is given to this view in that the size of the ME491 polypeptide backbone, a related type III integral membrane protein, discussed below, is smaller than the predicted size from the cDNA sequence, possibly as a consequence of the excision of a signal peptide. Because there are only two potential sites for addition of N-linked glycan (indicated in Table 9 by the designations -CHO-), located between the third and fourth hydrophobic segments, the carbonyl end lies within the cell, as well as the short hydrophilic fraction between the second and third hydrophobic segments. If the amine end is not processed it should remain intracellular. CD53 is a Type III integral membrane protein related to other membrane proteins: antigen ME491, a melanoma protein whose increased expression is well correlated with tumor progression (Hotta, et al., Cancer Res. 48: 2955 (1988) ); CD37 an extensively glycosylated antigen predominantly expressed on B cells, but not specific for B cell lines / Schwartz et al., J. Immun. 140: 905 (1988); and S5.7 a non-glycosylated antigen widely expressed in cells of the hematopoietic lineage (Pressano et al., Cancer Res. 43: 4812 (1983)). In addition, CD53 is distantly related to E. coli lac Y permease, a type III integral membrane protein that passes lactose to the bacterial cell. CD53 transcripts on peripheral blood lymphocytes increase after mitogenic stimulation by PHA, suggesting that the protein may be involved in the transport of factors essential for cell proliferation.

Entre as moléculas com larga reactividade no sistema hematopoiético, CD53 presentemente dá a reactividade mais larga assim como a restrição mais precisa às células hematopoiéticas. Os anticorpos anti-CD53 são um instrumento útil na identificação de neoplasmas hematopoiéticos e podem provar úteis na identificação de células mal definidas morfologicamente, por exemplo em culturas primárias de baço ou de medula óssea.Among molecules with broad reactivity in the hematopoietic system, CD53 presently gives the broader reactivity as well as the more precise restriction to hematopoietic cells. Anti-CD53 antibodies are a useful tool in the identification of hematopoietic neoplasms and may prove useful in identifying poorly defined cells morphologically, for example in primary spleen or bone marrow cultures.

EquivalentesEquivalents

Os familiarizados com a matéria reconhecerão ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina muitos equivalentes às realizações específicas do invento aqui descrito. Tais equivalentes destinam-se a ser incluídos dentro do âmbito deste invento.Those skilled in the art will recognize or be able to determine using no more than routine experimentation many equivalent to the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be included within the scope of this invention.

Claims (1)

REIVINDICAÇÕES: Ia - Processo para a produção da proteína CD53, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de nucleótidos recombinante que codifica a proteína CD53. 2a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína CD53 ter a sequência de aminoácidos do Quadro 9: 143A method for producing the CD53 protein, which comprises expressing a recombinant nucleotide sequence encoding the CD53 protein. 2. A method according to claim 1, characterized in that the CD53 protein has the amino acid sequence of Table 9: 3 S U II O Ο II CJ Ο CJ II CJ CJ cj II cj Εη II Eh Εη J II 3 X Εη II CJ Εη II cd 3 Η II o υ II cj ο II &lt; ΕΗ CJ II u U II Eh CJ II 3 Εη υ II Eh υ 1 3 CJ 1 3 ο ο 1 CJ Εη 1 3 Ο I 3 Εη CJ 1 cj u 1 υ Εη 1 ο 3 Η 1 ο CJ 1 3 CJ 1 3 Εη &amp; 1 3 Εη 1 3 Εη 1 ο Εη Pu 1 0 υ 1 Εη Εη 1 Ο υ ij CJ υ CJ Εη Εη Εη J Ο U CJ &lt; CJ 3 2: 3 υ 3 Εη 1 υ Εη Pu 1 ο υ II 3 Εη 1 ο Εη fu 1 ΕΗ Εη 1 U Εη II 3 Εη Cu II CJ CJ II CJ ΕΗ II 3 CJ Ω II 3 υ II 3 Εη II Ο Ο &gt; II υ Ε&lt; II υ 3 II CJ Εη X II Εη Ο II CJ 3 II Εη 3 a II Εη ο II 3 Εη II 3 U J II 3 Ο II Εη Εη II υ υ Ω II 3 3 ο 3 Εη 3 a 3 cj 3 Εη Εη Εη J 3 Ο CJ CJ CJ 3 ca 3 Εη 3 Ο υ 3 W ΕΗ CJ U Εη - &lt;1 S u cj u cj cj εη eh cj EhO Eh Cu cj u3 EH CJ EHO 3OO Eh ca cj cj U (¾o Eh O J cj á Eh 3 α u Eh Eh CJ Eh fu α j cj Eh CJ &gt; CJ CJ CJ u Eh Eh Cu α sa3 α a cj H Eh O Eh 3 cj CJ O O Eh ^ Pu H H H 10 &gt; 3 S Cj II tr CJ -Μ C· εη , II II á a U Ω II CJ ο II 3 Εη II ο α u ι-5 II 3 Εη 3 CJ CJ W Εη α Εη CJ 3 II Εη X II 3 a 3 II U Εη II 3 α &gt; 11 3 a ΕΗ II 3 ΕΗ II 3 Εη Cu II Ο W υ II CJ ΕΗ II 3 ^ Ο J II 3 Μ ο II α ΕΗ II Εη II Ο Ω II 3 Η II α II ΕΗ II Εη II u II 3 Η II εη ω II U II U II U II ο II Ο 3 II ο ο II ο II CJ II ΕΗ II ΕΗ II ΕΗ Ω II 3 S II υ II ο II ο II CJ II 3 ΕΗ II εη Ο II CJ II ο II Εη II υ II ο &gt; II cj ο II CJ II CJ II 3 II εη „ II CJ Μ II U Ω II Εη II U II α II εη II CJ 3 II Εη Cu II ΕΗ II U II ΕΗ II υ II U II CJ 3 II υ II εη II Εη II Εη II U II ο &gt; II Ο II 3 II ΕΗ II Εη II &lt; Η II ο &gt; II Εη II cj II Εη II Εη II 3 Η II 3 S II Ο II Ο II ΕΗ II Εη II U ^ II 3 Η II U II Εη II Εη II Εη II Ο J II 3 Η II ο II Εη II ΕΗ II υ II Ο ι-5 II Εη W II υ II υ II Εη II ο II 3 Η II u ο II CJ II ο II Εη II Εη II Εη Cu II Ο &gt; II CJ II U II ΕΗ II Εη II Εη Cu II 3 Η II Ο II υ II α II Εη II Εη Μ II CJ &gt; II Ο II Εη II ΕΗ II Η γ*Η 'Τ (Ν ΓΗ η 3 Eh W CJ 1 U ο u CJ ο α 3 Eh U υ eu CJ 1 εη £ υ Eh 1 CD o 3 Η 1 CJ Eh o CJ 1 cj 3 Eh Eh | υ 3 H 1 U Eh W 3 1 Ο 3 3 CJ 1 U O CJ CJ 1 5 « CJ 3 CJ 1 3 Eh | ο υ 3 Η I ο α (¾ Eh I 3 ΕΗ 3 3 α α Eh X I C3 υ cu CJ 1 3 w CJ Eh Εη CJ O 3 3 CJ CJ o 3 a Eh Eh CJ CJ Eh Cu 3 3 ca Eh CJ Ω O 3 3 U 3 a ο ΕΗ W 3 Eh o CJ α CJ CJ Eh ca 3 Eh £ Eh U » Eh 3 ο 3 3 CJ Ω cj a Eh ΕΗ X EH Eh ΕΗ CJ Eh Cu i 3 ca CJ U (¾ 1 CJ CJ CJ o u Eh £ 3 K 3 Eh CJ CJ κ υ u Eh CJ 1 CJ U 3 Εη i cj cj 3 3 Η Ο EH CJ CJ 3 ca υ CJ Éh CJ 3 3 3 3 H Ο Q Eh 3 CJ CJ 3 a U CJ CJ CJ 3 Εη Eh υ U CJ CJ 3 Eh Eh U Eh CJ 1-5 Eh 3 Eh O Eh X O Eh υ α u O o CJ CJ 3 1 Eh CJ % a CJ α 1 Eh CJ O CJ Eh EH a cj cj CJ CJ 3 O CJ CJ 3 Eh 1 3 CJ Eh 1 CJ 3 Eh eh a α O &gt; 3 Eh Eh CJ CJ &gt; 3 Eh ca 3 Eh X CJ 3 O 3 3 a 3 cj α CJ w CJ CJ EH Eh cj a 3 _ 3 H Eh 3 a O 3 CJ O cj α Eh Eh ca 3 O iJ O CJ t—1 rH H o CD 10 rf V m CJ 3 Eh CJ 3 Eh CJ 3 CJ Eh 3 CJ % υ a α CJ α CJ CJ 3 Ε CJ 3 CJ υ 3 CO Eh 3 Eh CJ 3 = O u O Eh = O Ε 3 Eh Eh = Eh = 2 υ Eh 3 a 3 = o 3 O 3 u CJ U Eh u 3 3 3 CJ CJ Q 3 Eh 3 EH 3 Eh U 3 υ O 3 H CJ Eh 3 cg CJ CJ CJ 3 a § EH CJ CJ CJ υ 3 υ u CJ 3 υ 3 Eh CJ CJ Eh CJ CJ CJ cj Eh 3 o CJ U 3 a υ 3 &lt; CJ Eh Eh u Eh , II CJ Eh Eh CJ Ω II EH Eh U H 11 3 Eh 3 y - 1 CJ Eh CJ 3 Eh II Eh O Eh CJ II Eh CJ Eh Eh || EH CJ Eh υ Ω ii CJ EH U 3 II Eh Eh Eh CJ II Eh Eh 3 CJ 3 II CJ CJ 3 EH II 3 O U EH II CJ Eh 3 Eh tu II 3 3 CJ CJ II CJ II CJ 3 α CJ á Eh ca li 3 CJ u O II CJ Eh CJ Eh II Eh CJ 3 3 a II O CJ CJ CJ II CJ Eh CJ CJ 11 EH υ U cj α ii CJ o 3 CJ II Eh Eh u Eh , II CJ 3 Eh eh a ii Eh CJ U CJ II Eh EH Eh Eh ^ II CJ 3 CJ &gt; II 3 CJ V. 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A process according to claim 1, wherein the recombinant nucleotide sequence comprises the nucleotide sequence of Table 9 or functional derivatives thereof. 4. A process for the production of a pharmaceutical composition comprising the inclusion in said pharmaceutical composition of the substantially pure CD53 protein, the CD53 protein being present in a soluble form or in the form of an acceptable salt. 5. A method according to claim 1, wherein said substantially pure CD53 protein comprises the protein containing the amino acid sequence of Table 9 or its functional derivatives. A process according to claim 4, further comprising adding a pharmaceutical carrier. The method according to claim 4, further comprising adding a therapeutic agent. 8. An immunodiagnostic method, characterized in that it comprises the use of an anti-CD53 antibody or a CD53 nucleotide probe for the detection of cells of the hematopoietic lineage. A method according to claim 8, characterized in that said CD53 nucleotide probe is derived from the nucleotide sequence of Table 9. 146 10a - Método de imunodiagnóstico, caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD53 ou de uma sonda de nucleótidos de CD53 para a detecção de neoplasmas hematopoiéticos. 11a - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD53 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 9. 12a - Método para a detecção de anticorpos contra a proteína CD53, caracterizado por compreender a utilização da proteína CD53 substancialmente pura ou dos seus derivados funcionais num imuno-ensaio. 13a - Método para a identificação morfológica de células mal definidas, caracterizado por compreender a utilização de um anticorpo anti-CD53 ou de uma sonda de nucleótidos de CD53 para detectar as referidas células. 14 a _ Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida sonda de nucleótidos de CD53 derivar da sequência de nucleótidos do Quadro 9. 15a - Método para a produção de anticorpos monoclonais contra a proteína CD53, diferentes de MEM-53, HD77, HI29, HI36 e 63-5A3, caracterizado por se empregar a proteína 0D53 substancialmente pura ou os seus derivados funcionais em métodos padrão de produção de anticorpos monoclonais. 16a - Processo para a produção da proteína TLiSA, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de nucleótidos recombinante que codifica a proteína TLiSA. 17* - processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a proteína TLiSA ter a sequência de aminoácidos do Quadro 3: II 148 II 148 GCGGGGAGCTTGCACTGACCAÂGAGGGTGfTGAGGCTAAGAGGCCACGATAAACACGATÂCGÂTÀAAAaTCCTTAACCMGACGCAa\TGGGAAGAAGCGTTAGAGCCXCiCXccACTCAC - h- ll d Be. d d d d • f- to d Q O ca h- d » 1 &lt; d d 1= -* -tf &gt; d o 1 b&gt; &lt; — to u u &lt; h- to &lt; S- — &gt;- • &lt; • h- • d • u u &lt; -tf H u cu i — &gt;- d )- u d ) _ &lt; d d d U X &lt; to d o d o o J I h^1 = u. o &gt; p — d • ν • &lt; • 1 J α &lt; &gt;-H 5 O o d . —» ΙΟ &gt; d d «&lt; 5 Δ d d tf &lt; h- 3 ~ o uj &lt; M c3 uj &lt; 5 d r— d hUUJ d d &lt; • h- IO • l·- to 1 LJ h μ- — d t d O HH U δ o d ) d -&lt; i O 1 &lt; d h- 1 — h* &lt; &lt; | U _J d cr &lt; 2: i h- d U &lt; d d Ρ)ϋ&lt; d cr d ce h- 1 á d d t &lt; LJ &lt; os -tf H· h· U- d u d d d &lt; d μ- H &gt;· d o - U- d &lt; d — h- — LJ U&gt; -tf M d _J Cl 1- o — &lt; • &lt; -tf • d LJ U X &lt;i- 1 d F d d * d P U _J tu. — i &lt;2 i -tf d F d d i F U -J d F5: 5 z ! 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An immunodiagnostic method, comprising the use of an anti-CD53 antibody or a CD53 nucleotide probe for the detection of hematopoietic neoplasms. A method according to claim 10, characterized in that said CD53 nucleotide probe is derived from the nucleotide sequence of Table 9. A method for the detection of antibodies against CD53 protein, characterized in that it comprises the use of the CD53 protein substantially or their functional derivatives in an immunoassay. 13. A method for the morphological identification of ill-defined cells comprising the use of an anti-CD53 antibody or a CD53 nucleotide probe to detect said cells. A method according to claim 13, characterized in that said CD53 nucleotide probe is derived from the nucleotide sequence of Table 9. Method for the production of monoclonal antibodies against the CD53 protein, other than MEM-53, HD77 , HI29, HI36 and 63-5A3, characterized in that the substantially pure 0D53 protein or its functional derivatives are employed in standard methods of producing monoclonal antibodies. 16. A method for producing the TLiSA protein, which comprises expressing a recombinant nucleotide sequence encoding the TLiSA protein. The method according to claim 16, characterized in that the TLiSA protein has the amino acid sequence of Table 3: TABLE 3: TABLE 3: TABLE 3: TABLE 3: d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d t d d 1 = - * -tf> d o 1 b &gt; &lt; - to u u < hto to < S- - &gt; • h- • d • u u < -tf H u cu i -> - d) - u d) _ < d d d U X < All rights reserved. the &gt; p-d • ν • &lt; • 1 J α < &gt; -H5O or d. -> ΙΟ &gt; d d &lt; 5 Δ d d tf &lt; h. 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The invention relates to a process for the preparation of a compound of formula (I): K-1 or the &lt; The compound of claim 1 wherein R 1 and R 2 are as defined above. x tf o < x d - &lt; -tf Z &lt; &gt; H d • I- d &gt; b ~ h ~ < M d V tf vs d u or their functional derivatives. 18. The method of claim 16, wherein the recombinant nucleotide sequence comprises the nucleotide sequence of Table 3 or the functional derivatives thereof. A process for the production of a pharmaceutical composition comprising the inclusion in said pharmaceutical composition of the substantially pure TLiSA protein, the TLiSA protein being present in a soluble form or in the form of an acceptable salt. 20. A method according to claim 19, wherein said substantially pure TLiSA protein comprises the protein containing the amino acid sequence of Table 3 or its functional derivatives. 21. The method of claim 19, further comprising adding a pharmaceutical carrier. 22. A process according to claim 19, further comprising adding a therapeutic agent. 23. A method for the detection of antibodies against the TLiSA protein, characterized in that it comprises the use of the substantially pure TLiSA protein or its functional derivatives in an immunoassay. 24. A method for the production of monoclonal antibodies against the TLiSA protein, other than ACT-T-SET, characterized in that the substantially pure TLiSA protein or its functional derivatives are used in standard methods of producing monoclonal antibodies. 25. A method for inhibiting T-cell differentiation by IL-2, characterized in that the T cells are contacted with antibodies against TLiSA. 26. A method for producing the CD27 protein, which comprises expressing a recombinant nucleotide sequence encoding the CD27 protein. 27. A method according to claim 26, wherein the CD27 protein has the amino acid sequence of Table 5; 151 o u CD &lt;&lt; o CD CJ Eh CA CD u CJ CD CD 3 E&lt; &lt; O A CJ Eh υ CD W &lt; CJ CJ CJ A CD U CD &lt; 3 ÊH υ Eh U A CD o O J CD EH Eh 3 z CD CD U J 3 H 3 Eh Eh S U O &lt; X υ O CJ O A α &lt; &lt; Eh 3 Eh Eh &lt; υ z CJ α Eh U W α Eh CD U i-3 EH CJ Eh A Eh CJ Eh CD &lt; Eh Eh α υ &lt; CA Eh Eh 3 _ O A O O CD &gt; 3 s Eh Eh Eh W Eh α &lt; CD &gt; O Eh CD CD Ω Eh EH CJ J CJ PS Eh &lt; U Ω CJ EH CD Eh X Eh Eh Eh Eh U EH υ E&lt; A CD &gt; CD CJ &lt; eh O O &lt; CJ A CD EH E1 CD « &lt; CJ &lt; X CJ O EH υ A 3 Eh O Eh t-3 CJ CD Eh &lt; EH U CJ CD CD CJ &gt;3? 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Lisboa, 15 de Julho de 1991or their functional derivatives. 28. The method of claim 26, wherein the recombinant nucleotide sequence comprises the nucleotide sequence of Table 5 or the functional derivatives thereof. A process for the production of a pharmaceutical composition comprising the inclusion in said pharmaceutical composition of the substantially pure CD27 protein, said CD27 protein being present in a soluble form or in the form of an acceptable salt. 30. The method of claim 29, wherein said substantially pure CD27 protein comprises the protein containing the amino acid sequence of Table 5 or the functional derivatives thereof. 31. The process of claim 29, further comprising adding a pharmaceutical carrier. 32. A process according to claim 29, further comprising adding a therapeutic agent. 33. An immunodiagnostic method comprising the use of an anti-CD27 antibody or a CD27 nucleotide probe for the detection of T cells. The method of claim 33, wherein said nucleotide probe of CD27 derived from the nucleotide sequence of Table 5. A method for the detection of antibodies against the CD27 protein, which comprises the use of the substantially pure CD27 protein or its functional derivatives in an immunoassay. 36. A method for the production of monoclonal antibodies against CD27 protein, other than 0KT18a and CLB-9F4, characterized in that the substantially pure CD27 protein or its functional derivatives are used in standard methods of producing monoclonal antibodies. Lisbon, July 15, 1991 RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.» 1200 LISBOARUA VtCTOR CORDON, 10-A 3. »1200 LISBOA