PT981618E - ''anticorpo anti-apo-2'' - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Anticorpo anti-Apo-2"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se genericamente à identificação, ao isolamento e à produção recombinante de polipéptidos, aqui designados como Apo-2, e em particular a anticorpos anti-Apo-2, a composições compreendendo-os e a suas utilizações.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Apoptose ou "Morte Celular Programada"

Crê-se que o controlo do número de células nos mamíferos seja determinado, em parte, por um equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular. Uma forma de morte celular, por vezes referida como morte celular necrótica, é tipicamente caracterizada como uma forma patológica de morte celular resultante de algum traumatismo ou danos celulares. Em contraste, existe outra forma "fisiológica" de morte celular que habitualmente prossegue de um modo ordenado ou controlado. Esta forma ordenada ou controlada de morte celular é frequentemente referida como "apoptose" (ver, p.ex., Barr et al., Bio/Technology 12: 487-493, 1994; Steller et al., Science 267: 1445-1449, 1995). A morte celular apoptótica ocorre naturalmente em muitos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário e a selecção clonal no sistema imunitário (Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991). Níveis reduzidos de morte celular apoptótica foram associados a uma variedade de condições patológicas, incluindo cancro, lúpus e infecção por herpesvírus (Thompson, Science 267: 1456-1462, 1995). Maiores níveis de morte celular apoptótica podem ser associados a uma variedade de outras condições patológicas, incluindo SIDA, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, retinite pigmentosa, degenerescência do cerebelo, anemia aplásica, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, danos de reperfusão e doença hepática induzida por toxinas (ver Thompson, supra). 2 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ A morte celular apoptótica é tipicamente acompanhada de uma ou mais mudanças morfológicas e bioquímicas características nas células, tais como condensação do citoplasma, perda das microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda de função mitocondrial. Crê-se que uma variedade de sinais extrínsecos e intrínsecos desencadeie ou induza tais mudanças celulares morfológicas e bioquímicas (Raff, Nature 356: 397-400, 1992; Steller, supra; Sachs et al., Blood 82: 15, 1993). Por exemplo, podem ser desencadeadas por estímulos hormonais, tais como hormonas glucocorticóides para timócitos imaturos, bem como pela retirada de certos factores de crescimento (Watanabe-Fukunaga et al., Nature 356: 319-317, 1992). Também, alguns oncogenes identificados tais como myc, rei e EIA e supressores tumorais, como p53, foram relatados como tendo um papel na indução de apoptose. Tem sido igualmente observado que certos fármacos de quimioterapia e algumas formas de radiação têm actividade indutora de apoptose (Thompson, supra).

Família TNF de Citoquinas Várias moléculas, tais como o factor de necrose tumoral-a ("TNF-a"), o factor de necrose tumoral-β ("TNF-β" ou "linfotoxina"), o ligando de CD30, o ligando de CD27, o ligando de CD40, o ligando de OX-40, o ligando de 4-1BB, o ligando de Apo-1 (também referido como ligando de Fas ou ligando de CD95) e o ligando de Apo-2 (também referido como TRAIL) foram identificadas como membros da família de citoquinas factor de necrose tumoral ("TNF") (Ver, p.ex., Gruss e Dover, Blood 85: 3378-3404, 1995; Wiley et al., Immunlty 3: 673-682, 1995; Pitti et al., J. Biol. Chem. 271: 12687-12690, 1996; WO 97/01633 publicado a 16 de Janeiro de 1997). Entre estas moléculas, foi relatado que o TNF-α, o TNF-β, o ligando de CD30, o ligando de 4-lBB, o ligando de Apo-1 e o ligando de Apo-2 (TRAIL) estão envolvidos na morte celular apoptótica. Foi relatado que tanto o TNF-α como o TNF-β induzem morte celular apoptótica em células tumorais susceptíveis (Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 1881, 1986; Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17: 689, 1987). Zheng et al. relataram que o TNF-α está envolvido em apoptose pós-estimulação de células T CD8-positivas (Zheng et al., 3 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ Nâture 377: 348-351, 1995). Outros investigadores relataram que o ligando de CD30 pode estar envolvido na supressão de células T auto-reactivas no timo (Amakawa et al., "Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death", Res. N. ° 10, 1995) .

Mutações nos genes do receptor ou do ligando de Fas/Apo-1 de ratinho (designados lpr e gld, respectivamente) foram associados a alguns distúrbios auto-imunes, indicando que o ligando de Apo-1 pode ter um papel na regulação da supressão clonal de linfócitos autorreactivos na periferia (Krammer et al., Curr. Op. Immunol. 6: 279-289, 1994; Nagata et al., Science 267: 1449-1456, 1995). Foi também relatado que o ligando de Apo-1 induz apoptose pós-estimulação em linfócitos T CD4-positivos e em linfócitos B, e que pode estar envolvido na eliminação de linfócitos activados quando a sua função já não é necessária (Krammer et al., supra; Nagata et al., supra). Foi relatado que anticorpos monoclonais agonistas de ratinho que se ligam especificamente ao receptor Apo-1 exibem uma actividade de morte celular que é comparável ou semelhante à de TNF-α (Yonehara et al., J. Exp. Med. 169: 1747-1756, 1989).

Família de Receptores de TNF

Crê-se que a indução de várias respostas celulares mediadas pela tal família TNF de citoquinas seja iniciada pela sua ligação a receptores celulares específicos. Foram identificados dois receptores de TNF distintos de aproximadamente 55 kDa (TNFRl) e 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934, 1989; Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3127-3131, 1990; EP 417563, publicada a 20 de Março de 1991) e os ADNc humano e de ratinho correspondentes a ambos os tipos de receptor foram isolados e caracterizados (Loetscher et al., Cell 61: 351, 1990; Schall et al., Cell 61: 361, 1990; Smith et al., Science 248: 1019-1023, 1990; Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2830-2834, 1991; Goodwin et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3020-3026, 1991). Polimorfismos extensos foram associados a ambos os genes de receptores de TNF (ver, p.ex., Takao et al., Immunogenetics 37: 199-203, 1993). Ambos os TNFR partilham a estrutura típica dos receptores de superfície celular 4 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ incluindo regiões extracelulares, transmembranares e intracelulares. As porções extracelulares de ambos os receptores encontram-se naturalmente também como proteínas de ligação a tnf solúveis (Nophar, Y. et al., embo j. 9: 3269, 1990; e Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8331, 1990) . A clonagem de receptores de TNF solúveis recombinantes foi relatada por Hale et al. [J. Cell. Bíochem. Suplemento 15F, 1991, pág. 113 (P424)]. A porção extracelular dos TNFR de tipo 1 e tipo 2 (TNFRl e TNFR2) contém um padrão repetitivo na sequência de aminoácidos de quatro domínios ricos em cisteinas (CRD) designados 1 a 4, a começar no terminal NH2. Cada CRD tem cerca de 40 aminoácidos de comprimento e contém 4 a 6 resíduos de cisteina em posições que são bem conservadas (Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra-,

Nophar et al., supra-, Kohno et al., supra). Em TNFRl, os limites aproximados das quatro CRD são como se segue: CRD1 -aminoácidos 14 a cerca de 53; CRD2 - aminoácidos de cerca de 54 a cerca de 97; CRD3 - aminoácidos de cerca de 98 a cerca de 138; CRD4 - aminoácidos de cerca de 139 a cerca de 16 7. Em TNFR2, CRDl inclui os aminoácidos 17 a cerca de 54; CRD2 - aminoácidos de cerca de 55 a cerca de 97; CRD3 - aminoácidos de cerca de 98 a cerca de 140; e CRD4 - aminoácidos de cerca de 141 a cerca de 179 (Banner et al., Cell 73: 431-435, 1993). O potencial papel das CRD na ligação ao ligando é também descrito por Banner et al., supra.

Um padrão repetitivo semelhante ao das CRD existe também em várias outras proteínas da superfície celular, incluindo o receptor do factor de crescimento dos nervos p75 (NGFR) (Johnson et al., Cell 47: 545, 1986; Radeke et al., Nature 325: 593, 1987), o antigénio das células B CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989), o antigénio das células T 0X40 (Mallet et al., EMBO J. 9: 1063, 1990) e o antigénio Fas (Yonehara et al., supra e Itoh et al., supra). As CRD são também encontradas nas proteínas T2 solúveis semelhantes a TNFR (sTNFR) dos poxvírus Shope e mixoma (Upton et al.,

Virology 160: 20-29, 1987; Smith et al., Bíochem. Biophys.

Res. Commun. 176: 335, 1991; Upton et al., Virology 184: 370, 1991) . O alinhamento óptimo destas sequências indica que as posições dos resíduos de cisteina são bem conservadas. Estes 5 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ receptores são por vezes colectivamente referidos como membros da superfamília de receptores de TNF/NGF. Estudos recentes sobre p75NGFR mostraram que a deleção de CRDl (Welcher, A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 159-163, 1991) ou uma inserção de 5 aminoácidos neste domínio (Yan, H. e Chao, M.V., J. Biol. Chem. 266: 12099-12104, 1991) teve pouco ou nenhum efeito na ligação de NGF (Yan, H. e Chao, M.V., supra). p75NGFR contém um trecho rico em prolinas de cerca de 60 aminoácidos, entre a sua região CRD4 e transmembranar, que não está envolvido na ligação a NGF (Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol. 41: 414-419, 1988; Seckinger, P. et ai., J. Biol. Chem. 264: 11966-11973, 1989; Yan, H. e Chao, M.V., supra). Uma região semelhante rica em prolina encontra-se em TNFR2 mas não em TNFRl.

Itoh et al. divulgam que o receptor Apo-1 pode sinalizar uma morte celular apoptótica semelhante à sinalizada pelo TNFRl de 55 kDa (Itoh et al., supra). Foi também relatado que a expressão do antigénio Apo-1 é infra-regulada juntamente com a de TNFRl quando as células são tratadas com TNF-α ou anticorpo monoclonal de ratinho anti-Apo-1 (Krammer et al., supra; Nagata et al., supra). Assim, alguns investigadores colocaram a hipótese de que as linhas celulares que co-expressam tanto o receptor Apo-1 como TNFRl podem mediar morte celular através de vias de sinalização comuns (Id.). A família de ligandos TNF identificados até à data, com excepção da linfotoxina-α, são proteínas transmembranares de tipo II, cujo terminal C é extracelular. Em contraste, os receptores na família de receptores de TNF (TNFR) identificados até à data são proteínas transmembranares de tipo I. No entanto, tanto na família TNF de ligandos como de receptores, a homologia identificada entre os membros da família verificou-se principalmente no domínio extracelular ("ECD") . Várias das citoquinas da família TNF, incluindo TNF-α, ligando de Apo-1 e ligando de CD40, são clivadas proteoliticamente à superfície celular; a proteína resultante em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica que funciona como uma citoquina solúvel. As proteínas da família dos receptores de TNF são também habitualmente clivadas proteoliticamente para libertar ECD receptores solúveis que podem funcionar como inibidores das citoquinas cognatas. 6 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Recentemente, foram identificados outros membros da família TNFR de mamífero. Em Marsters et al., Curr. Biol. 6: 750, 1996, os investigadores descrevem um polipéptido humano de sequência nativa inteira, designado Apo-3, que exibe semelhança com a família TNFR nas suas repetições extracelulares ricas em cisteína e se assemelha a TNFRl e CD95 por conter uma sequência de domínio de morte citoplasmático (ver também Marsters et al., Curr. Biol. 6: 1669, 1996). Apo-3 foi também referido por outros investigadores como DR3, wsl-1 e TRAMP (Chinnaiyan et al., Science 274: 990, 1996; Kitson et al., Nature 384: 372, 1996; Bodmer et al., Immunity 6: 79, 1997) .

Pan et al. divulgaram outro membro da família de receptores de TNF referido como "DR4" (Pan et al., Science 276: 111-113, 1997). Foi relatado que DR4 contém um domínio de morte citoplasmático capaz de envolver o aparelho de suicídio celular. Pan et al. divulgam que se crê que DR4 seja um receptor para o ligando conhecido como ligando de Apo-2 ou TRAIL.

Complexo de Sinalização Indutor de Apoptose

Tal como actualmente se entende, o programa de morte celular contém pelo menos três elementos importantes activadores, inibidores e efectores; em C. elegans, estes elementos são codificados respectivamente por três genes, Ced-4, Ced-9 e Ced-3 (Steller, Science 267: 1445, 1995;

Chinnaiyan et al., Science 275: 1122-1126, 1997). Dois dos membros da família TNFR, TNFRl e Fas/Apol (CD95), podem activar a morte celular apoptótica (Chinnaiyan e Dixit, Current Biology 6: 555-562, 1996; Fraser e Evan, Cell 85: 781-784, 1996) . Sabe-se também que TNFRl medeia a activação do factor de transcrição NF-κΒ (Tartaglia et al., Cell 74: 845— 853, 1993; Hsu et al., Cell 84: 299-308, 1996). Para além de alguma homologia do ECD, estes dois receptores partilham homologia no seu domínio intracelular (ICD) numa interface de oligomerização conhecida como o domínio de morte (Tartaglia et al., supra; Nagata, Cell 88: 355, 1997). Os domínios de morte são também encontrados em várias proteínas de metazoários que regulam a apoptose, nomeadamente a proteína de Drosophila, Reaper, e as proteínas de mamífero referidas como FADD/MORT1, 7 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ TRADD e RIP (Cleaveland e Ihle, Cell 81: 479-482, 1995).

Utilizando o sistema de levedura de dois híbridos, Raven et al. relatam a identificação da proteína wsl-1, que se liga ao domínio de morte de tnfrI (Raven et al., "Programmed Cell Death Meeting", 20-24 de Setembro de 1995, Resumo na página 127; Raven et al., "European Cytokine Network", 7: Resumo 82 na página 210 (Abril-Junho de 1996). A proteína wsl-1 é descrita como sendo homóloga a TNFRI (48% de identidade e possuindo uma distribuição restrita a alguns tecidos. De acordo com Raven et al., a distribuição tecidular de wsl-1 é significativamente diferente da proteína de ligação a TNFRI, TRADD.

Após ligação do ligando e agrupamento dos receptores, crê-se que TNFRI e CD95 recrutam FADD para um complexo de sinalização indutor de morte. Alegadamente CD95 liga-se directamente a FADD, enquanto TNFRI se liga indirectamente a FADD através de TRADD (Chinnaiyan et al., Cell 81: 505-512, 1995; Boldin et al., J. Biol. Chem. 270: 387-391, 1995; Hsu et al., supra·, Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem. 271: 4961-4965, 1996). Foi relatado que FADD serve como uma proteína adaptadora que recruta a protease aparentada com Ced-3, MACHa/FLICE (caspase 8), para o complexo de sinalização de morte (Boldin et al., Cell 85: 803-815, 1996; Muzio et al., Cell 85: 817-827, 1996). MACHa/FLICE parece ser o gatilho que inicia uma cascata de proteases apoptóticas, incluindo a enzima conversora da interleucina-ΐβ (ICE) e CPP32/Yama, que pode executar alguns aspectos críticos do programa de morte celular (Fraser e Evan, supra).

Foi recentemente divulgado que a morte celular programada envolve a actividade de membros de uma família de cisteina-proteases relacionados com o gene de morte celular de C. elegans, ced-3, e com a enzima conversora de IL-1 de mamífero, ICE. A actividade da ICE e das proteases CPP32/Yama pode ser inibida através do produto do gene do vírus da varíola bovina, crmA (Ray et al., Cell 69: 597-604, 1992; Tewari et al., Cell 81: 801-809, 1995). Estudos recentes mostram que CrmA pode inibir morte celular induzida por TNFRI e CD95 (Enari et al., Nature 375: 78-81, 1995; Tewari et al., J. Biol. Chem. 270: 3255-3260, 1995) . 8 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Tal como revisto recentemente por Tewari et al., TNFR1, TNFR2 e CD40 modulam a expressão de citoquinas pró-inflamatórias e co-estimuladoras, receptores de citoquinas e moléculas de adesão celular através da activação do factor de transcrição NF-κΒ (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop. 6: 39-44, 1996) . NF-κΒ é o protótipo de uma familia de factores de transcrição diméricos cujas subunidades contêm regiões Rei conservadas (Verma et al., Genes Develop. 9: 2723-2735, 1996 ; Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14: 649-681, 1996). Na sua forma latente, NF-κΒ é complexado com membros da familia de inibidores IkB; após inactivação do IkB em resposta a certos estímulos, o NF-κΒ libertado é transladado para o núcleo onde se liga a sequências de ADN especificas e activa a transcrição de genes.

Para uma revisão da familia TNF de citoquinas e seus receptores, ver Gruss e Dower, supra.

SUMÁRIO DO INVENTO

Os requerentes identificaram clones de ADNc que codificam os polipéptidos, designados no presente pedido como "Apo-2". Crê-se que Apo-2 seja um membro da familia TNFR; o polipéptido Apo-2 humano com a sequência nativa inteira exibe algumas semelhanças com alguns TNFR conhecidos, incluindo uma região de dominio citoplasmático de morte. O Apo-2 humano com a sequência nativa inteira exibe também semelhanças com a familia TNFR nas suas repetições extracelulares ricas em cisteina. Verificou-se que o polipéptido Apo-2 era capaz de desencadear apoptose dependente de caspases e de activar NF-κΒ. Os requerentes verificaram surpreendentemente que um dominio extracelular solúvel de Apo-2 se liga ao ligando de Apo-2 ("Apo-2L") e pode inibir a função do ligando de Apo-2. Acredita-se actualmente que o ligando de Apo-2 pode sinalizar através de pelo menos dois receptores diferentes, DR4 e o aqui descrito de novo Apo-2.

Num aspecto, o presente invento proporciona um anticorpo monoclonal que (a) se liga ao polipéptido Apo-2 consistindo nos resíduos de aminoácido 1 a 411 de SEQ ID N0:1 e (b) induz apoptose em pelo menos um tipo de célula de mamífero in vivo ou ex vivo que expressa o referido polipéptido Apo-2. 9 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Noutro aspecto, ο presente invento proporciona uma molécula homodimérica compreendendo quaisquer dois anticorpos do presente invento.

Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal ou uma molécula homodimérica do presente invento.

Noutro aspecto, o presente invento proporciona um anticorpo monoclonal ou uma molécula homodimérica do presente invento para utilização em terapia e mais particularmente para o tratamento de cancro.

Noutro aspecto, o presente invento proporciona a utilização de um anticorpo de Apo-2 do presente invento para a preparação de um medicamento para indução de apoptose em células de mamífero expressando o receptor Apo-2. Para fins exemplificativos, as células de mamífero que expressam o receptor Apo-2 podem ser células de cancro, tais como células de cancro do pulmão, células de cancro do cólon, células de sarcoma, células de linfoma ou células de glioma. Noutro aspecto, o presente invento proporciona a utilização de um anticorpo de Apo-2 do presente invento para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro, por exemplo, cancro do pulmão, cancro do cólon, sarcoma, linfoma ou glioma.

Noutro aspecto, o presente invento proporciona um método in vitro para indução de apoptose em células de mamífero expressando o receptor Apo-2 compreendendo a exposição de células de mamífero que expressem o receptor Apo-2 a um anticorpo de Apo-2 do presente invento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência nucleotídica de um ADNc de Apo-2 humano de sequência nativa (SEQ ID NO:2) e a sua sequência de aminoácidos derivada (SEQ ID N0:1). A Figura 2A mostra a sequência de aminoácidos derivada de um Apo-2 humano de sequência nativa - a putativa sequência de sinal está sublinhada, o putativo domínio transmembranar está numa caixa e a putativa sequência do domínio de morte está 10 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ sublinhada a tracejado. As cisteínas dos dois domínios ricos em cisteína estão sublinhadas individualmente. A Figura 2b mostra um alinhamento e a comparação das sequências do domínio de morte de Apo-2 humano de sequência nativa, DR4, Apo-2/DR3, TNFRl e Fas/Apo-1 (CD95). Os asteriscos indicam resíduos que são essenciais para a sinalização de morte por TNFRl (Tartaglia et al., supra). A Figura 3 mostra a interacção do ECD de Apo-2 com Apo-2L. Os sobrenadantes de células 293 falsamente transfectadas ou de células 293 transfectadas com ECD de Apo-2 marcado com o epítopo Flag foram incubados com Apo-2L marcado com poli-His e sujeitos a imunoprecipitação com contas de agarose conjugadas com anti-Flag ou conjugadas com Níquel. As proteínas precipitadas foram resolvidas através de electroforese em géis de poliacrilamida e detectadas através de "immunoblot" com anticorpo anti-Apo-2L ou anti-Flag. A Figura 4 mostra a indução de apoptose através de Apo-2 e a inibição da actividade de Apo-2L através do ECD solúvel de Apo-2. Células 293 humanas (A, B) ou células HeLa (C), foram transfectadas pelo vector pRK5 ou por plasmídeos baseados em pRK5 codificando Apo-2 e/ou CrmA. A apoptose foi avaliada através da morfologia (A), fragmentação do ADN (B), ou através de FACS (C-E). O Apo-2L solúvel foi pré-incubado com tampão ou ECD de Apo-2 purificado por afinidade juntamente com anticorpo anti-Flag ou imunoadesina do ECD de Apo-2 ou imunoadesinas de DR4 ou TNFRl e adicionado às células HeLa. As células foram mais tarde analisadas quanto a apoptose (D). Foi também determinada a análise de resposta à Dose utilizando Apo-2L com imunoadesina de ECD de Apo-2 (E). A Figura 5 mostra a activação de NF-κΒ por Apo-2, DR4 e Apo-2L. (A) Células HeLa foram transfectadas com plasmídeos de expressão codificando as proteínas indicadas. Foram preparados extractos nucleares e analisados através de um ensaio de mudança da mobilidade electroforética. (B) Células HeLa ou células MCF7 foram tratadas com tampão, Apo-2L ou TNF-alfa e ensaiadas quanto à actividade de NF-κΒ. (C) Células HeLa foram pré-incubadas com tampão, ALLN ou ciclo-hexamida antes da 11 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ adição de Apo-2L. A apoptose foi depois analisada através de FACS. A Figura 6A mostra a expressão de ARNm de Apo-2 em tecidos humanos analisada através de hibridação de Northern de membranas de ARN poli-A de tecidos humanos. A Figura 6B mostra a expressão de ARNm de Apo-2 em linhas celulares de cancro humano analisada através de hibridação de Northern de membranas de ARN poli-A de linhas celulares de cancro humano. A Figura 7 mostra a análise de FACS de um anticorpo de Apo-2, 3F11.39.7 (ilustrado através das linhas a cheio) em comparação com controlos de IgG (linhas ponteadas). 0 anticorpo 3F11.39.7 reconheceu o receptor Apo-2 expresso em células 9D humanas. A Figura 8 é um gráfico mostrando a percentagem (%) de apoptose induzida em células 9D pelo anticorpo de Apo-2 3F11.39.7, na ausência de Fc de cabra anti-IgG de ratinho. A Figura 9 é um diagrama de barras mostrando a percentagem (%) de apoptose, em comparação com Apo-2L, em células 9D pelo anticorpo de Apo-2 3F11.39.7 na presença ou ausência de Fc de cabra anti-IgG de ratinho. A Figura 10 é um diagrama de barras ilustrando a capacidade do anticorpo Apo-2 3F11.39.7 para bloquear a apoptose induzida por Apo-2L em células 9D. A Figura 11 é um gráfico mostrando resultados de um ELISA testando a ligação do anticorpo de Apo-2 3F11.39.7 a Apo-2 e a outros receptores conhecidos de Apo-2L referidos como DR4, DcRl e DcR2. A Figura 12A é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio ELISA avaliando a ligação do anticorpo 16E2 a Apo-2, DR4, DcRl, DcR2 e CD4-Ig. 12 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ A Figura 12Β é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio ELISA avaliando a ligação do anticorpo 20E6 a Apo-2, DR4, DcRl, DcR2 e CD4-Ig. A Figura 12C é um gráfico mostrando os resultados de um ensaio ELISA avaliando a ligação do anticorpo 24C4 a Apo-2, DR4, DcRl, DcR2 e CD4-Ig. A Figura 13A é um gráfico mostrando a actividade agonista do anticorpo 16E2, em comparação com Apo-2L, num ensaio de apoptose (coloração de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1. A Figura 13B é um diagrama de barras mostrando a actividade agonista do anticorpo 16E2, em comparação com o anticorpo scFv 7D5 (um anticorpo anti-factor tecidual), num ensaio de apoptose (coloração de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1. A Figura 13C é um diagrama de barras mostrando a actividade agonista do anticorpo 16E2, em comparação com o anticorpo scFv 7D5, num ensaio de apoptose (anexina V-biotina/estreptavidina-[S35]) utilizando células SK-MES-1. A Figura 14A é um gráfico mostrando a actividade agonista do anticorpo 20E6, em comparação com Apo-2L, num ensaio de apoptose (coloração de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1. A Figura 14B é um gráfico mostrando a actividade agonista do anticorpo 20E6 através de uma comparação entre os resultados obtidos nos ensaios de apoptose de violeta cristal e de anexina V-biotina/estreptavidina-[S35] . A Figura 14C é um gráfico mostrando a actividade agonista do anticorpo 16E2 marcado com gD, em comparação com Apo-2L, num ensaio de apoptose (coloração de violeta cristal) utilizando células SK-MES-1. 13 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ A Figura 15Α mostra a sequência nucleotídica do fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) referido como 16E2 (SEQ ID NO:6). A Figura 15B mostra a sequência nucleotidica do fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) referido como 20E6 (SEQ ID NO:7). A Figura 15C mostra a sequência nucleotídica do fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) referido como 2404 (SEQ ID NO:8). A Figura 16 mostra os fragmentos de anticorpo de cadeia simples (scFv) referidos como 16E2, 20E6 e 24C4, com as respectivas sequências de aminoácidos para a sequência de sinal e as regiões CDR das cadeias pesada e leve identificadas (as regiões CDRl, CDR2, e CDR3 estão sublinhadas).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições

Os termos "polipéptido Apo-2" e "Apo-2" quando aqui utilizados englobam Apo-2 de sequência nativa e variantes de Apo-2 (que são melhor definidas aqui). Estes termos englobam Apo-2 de uma variedade de mamíferos, incluindo humanos. O Apo-2 pode ser isolado a partir de uma variedade de fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparado através de métodos recombinantes ou sintéticos.

Um "Apo-2 de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que um Apo-2 derivado da natureza. Assim, um Apo-2 de sequência nativa pode ter a sequência de aminoácidos do Apo-2 de ocorrência natural de qualquer mamífero. Tal Apo-2 de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido através de meios recombinantes ou sintéticos. O termo "Apo-2 de sequência nativa" engloba especificamente formas de Apo-2 truncadas ou segregadas de ocorrência natural (p.ex., uma sequência do domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (p.ex., formas de processamento alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do Apo-2. Uma forma variante de 14 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ ocorrência natural do Apo-2 inclui um Apo-2 possuindo uma substituição de aminoácidos no residuo 410 na sequência de aminoácidos mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO:l). Numa concretização de tal forma variante de ocorrência natural, o residuo de leucina na posição 410 é substituído por um residuo de metionina. Na Fig. 1 (SEQ ID NO:l), o residuo de aminoácido na posição 410 é identificado como "Xaa" para indicar que o aminoácido pode, opcionalmente, ser leucina ou metionina. Na Fig. 1 (SEQ ID NO:2), o nucleótido na posição 1367 é identificado como "W" para indicar que o nucleótido pode ser adenina (A) ou timina (T) ou uracilo (U) . Numa concretização da divulgação, o Apo-2 de sequência nativa é um Apo-2 de sequência nativa maduro ou inteiro compreendendo os aminoácidos 1 a 411 da Fig. 1 (SEQ ID NO:l). Opcionalmente, o Apo-2 é obtido ou obtenível através da expressão do polipéptido codificado pela inserção de ADNc do vector depositado como ATCC 209021. O "dominio extracelular de Apo-2" ou "ECD de Apo-2" refere-se a uma forma de Apo-2 que é essencialmente isenta dos dominios transmembranar e citoplasmático de Apo-2. Vulgarmente, o ECD de Apo-2 terá menos de 1% de tais domínios transmembranar e/ou citoplasmático e, de preferência, terá menos de cerca de 0,5% de tais domínios. Opcionalmente, o ECD de Apo-2 compreenderá os resíduos de aminoácido 54 a 182 da Fig. 1 (SEQ ID NO:l) ou os resíduos de aminoácido 1 a 182 da Fig. 1 (SEQ ID NO:l). Opcionalmente, o ECD de Apo-2 compreenderá um ou mais domínios ricos em cisteína e, de preferência, um ou ambos os domínios ricos em cisteína aqui identificados (ver Figura 2A) . Os peritos entenderão que o domínio transmembranar identificado para o polipéptido Apo-2 daqui é identificado segundo critérios rotineiramente empregues na especialidade para identificação desse tipo de domínio hidrófobo. Os limites exactos de um domínio transmembranar podem variar mas muito provavelmente em não mais de cerca de 5 aminoácidos em cada extremidade do domínio especificamente aqui mencionado. "Variante de Apo-2" significa um Apo-2 biologicamente activo tal como definido abaixo possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos com o Apo-2 possuindo a sequência de aminoácidos deduzida mostrada na 15 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Fig. 1 (SEQ ID ΝΟ:1) para um Αρο-2 humano de sequência nativa inteira ou das sequências aqui identificadas para o ECD de Apo-2 ou o dominio de morte. Tais variantes de Apo-2 incluem, por exemplo, polipéptidos Apo-2 em que é adicionado ou suprimido um ou mais resíduos de aminoácido no terminal N ou no terminal C da sequência da Fig. 1 (SEQ ID N0:1) ou das sequências aqui identificadas para o ECD de Apo-2 ou o dominio de morte. Vulgarmente, uma variante de Apo-2 terá pelo menos cerca de 80% de identidade da sequência de aminoácidos, de preferência pelo menos cerca de 90% de identidade da sequência de aminoácidos e ainda de maior preferência pelo menos cerca de 95% de identidade com a sequência de aminoácidos da Fig. 1 (SEQ ID NO:l) ou com as sequências aqui identificadas para o DEC de Apo-2 ou o dominio de morte. A "Percentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos" em relação às sequências de Apo-2 aqui identificadas é definida como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de Apo-2, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para se alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser conseguido de vários modos que estão dentro da perícia na especialidade, por exemplo, utilizando suporte lógico de computador disponível ao público tal como o suporte lógico ALIGN™ ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros apropriados para a medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se alcançar um alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. O termo "marcado com epítopo" quando aqui utilizado refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo Apo-2 ou o anticorpo de Apo-2, ou a sequência de um domínio destes, fundido com um "polipéptido marcador". O polipéptido marcador possui resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual pode ser produzido um anticorpo, contudo é suficientemente curto de modo a que não interfira com a actividade de Apo-2 ou do anticorpo de Apo-2. O polipéptido 16 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ marcador é também de preferência quase único de modo a que o anticorpo não reaja substancialmente de forma cruzada com outros epitopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácido e habitualmente entre cerca de 8 e cerca de 50 resíduos de aminoácido (de preferência, entre cerca de 10 e cerca de 20 resíduos). "isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos aqui divulgados, significa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas do polipéptido e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para se obterem pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna através da utilização de um sequenciador de copo rotativo ou (2) até à homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando azul de Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. O polipéptido isolado inclui polipéptido in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural de Apo-2 não estará presente. Vulgarmente, no entanto, o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação.

Uma molécula de ácido nucleico de Apo-2 "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está vulgarmente associada na fonte natural do ácido nucleico de Apo-2. Uma molécula de ácido nucleico de Apo-2 isolada está numa forma ou arranjo diferente do qual se encontra na natureza. As moléculas de ácido nucleico de Apo-2 isoladas são portanto distintas da molécula de ácido nucleico de Apo-2 tal como existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico de Apo-2 isolada inclui moléculas de ácido nucleico de Apo-2 contidas em células que vulgarmente expressam Apo-2 onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da das células naturais. 17 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ Ο termo "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num determinado organismo hospedeiro. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência de operador e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e estimuladores. 0 ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando de secreção está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a permitir a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. No entanto, os estimuladores não têm de ser contíguos. A ligação é conseguida através da ligação em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, são utilizados adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais anti-Apo-2 (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e de bloqueio ou neutralizantes) e composições de anticorpo anti-Apo-2 com especificidade poliepitópica. 0 termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com 18 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ as preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio.

Os anticorpos monoclonais daqui incluem anticorpos híbridos e recombinantes produzidos através do processamento de um domínio variável (incluindo hipervariável) de um anticorpo anti-Apo-2 com um domínio constante, ou de uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou de uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independentemente da espécie de origem ou da designação da classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpos (p.ex., Fab, F(ab')2 e Fv), desde que exibam a actividade biológica desejada. Ver, p.ex., Pat. U.S. N.° 481656 7 e Mage et al., em "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", págs. 79-97 (Mareei Dekker, Inc.: New York, 1987).

Assim, o adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante tais como descritos na Pat. U.S. N.° 4816567. Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas fágicas geradas utilizando, por exemplo, as técnicas descritas em McCafferty et al.r Nature 348: 552-554, 1990.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de scFv ver, p.ex., Pluckthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, págs. 269-315, 1994. 19 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Os fragmentos de anticorpo scFv do presente invento incluem mas não se limitam aos anticorpos 16E2, 20E6 e 24C4 descritos em pormenor abaixo. Dentro do âmbito dos anticorpos scFv do presente invento estão anticorpos scFv compreendendo os domínios VH e VL que incluam uma ou mais das regiões CDR identificadas para os anticorpos 16E2, 20E6 e 24C4.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murideo) são imunoglobulinas quiméricas especificas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio dos anticorpos) que contêm uma sequência minima derivada da imunoglobulina não humana. Na maioria, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo aceitador) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do aceitador são substituídos por residuos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, residuos da região estrutural de Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos residuos não humanos correspondentes. Para além disso, o anticorpo humanizado pode compreender residuos que não se encontram nem no anticorpo aceitador nem na CDR importada nem nas sequências estruturais. Estas modificações são feitas para refinar e optimizar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, dominios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado compreenderá também de modo óptimo pelo menos uma porção de uma região ou dominio constante de uma imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. "Biologicamente activo" e "actividade biológica desejada" para os fins daqui significam (1) possuir a capacidade de modular apoptose (de um modo agonista ou estimulador ou de um modo antagonista ou bloqueador) em pelo menos um tipo de célula de mamifero in vivo ou ex vivo; (2) possuir a capacidade de se ligar ao ligando de Apo-2; ou (3) possuir a 20 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ capacidade de modular a sinalização do ligando de Apo-2 e a actividade do ligando de Apo-2.

Os termos "apoptose" e "actividade apoptótica" são utilizados num sentido amplo e referem-se à forma ordenada ou controlada de morte celular em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais mudanças celulares características, incluindo condensação do citoplasma, perda das microvilosidades da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do ADN cromossómico ou perda da função mitocondrial. Esta actividade pode ser determinada e medida, por exemplo, através de ensaios de viabilidade celular, análise de FACS ou electroforese de ADN, as quais são todas conhecidas na especialidade.

Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia" tal como aqui utilizados referem-se a terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro do pulmão das células pequenas, cancro do pulmão das células não pequenas, blastoma, cancro gastrointestinal, cancro renal, cancro pancreático, glioblastoma, neuroblastoma, cancro cervical, cancro dos ovários, cancro do fígado, cancro do estômago, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro do cólon, cancro colorrectal, carcinoma do endométrio, carcinoma das glândulas salivares, cancro do rim, cancro do fígado, cancro da próstata, cancro da vulva, cancro da tiróide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e do pescoço. 0 termo "mamífero" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer mamífero classificado como mamífero, incluindo seres humanos, vacas, cavalos, cães e gatos. Numa concretização preferida do presente invento, o mamífero é um ser humano. 21 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ II. Composições e Métodos do Invento O presente invento proporciona anticorpos de Apo-2. Em particular, os Requerentes identificaram e isolaram vários polipéptidos Apo-2 humanos. As propriedades e características de alguns destes polipéptidos Apo-2 e dos anticorpos anti-Apo-2 são descritas em mais pormenor nos Exemplos abaixo. Com base nas propriedades e características dos polipéptidos Apo-2 aqui divulgados, os Requerentes acreditam actualmente que Apo-2 é um membro da família TNFR.

Segue-se uma descrição quanto a como pode ser preparado Apo-2, bem como moléculas quiméricas de Apo-2 e anticorpos anti-Apo-2. A. Preparação de Apo-2 A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de Apo-2 através da cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector contendo o ácido nucleico de Apo-2. Está, como é claro, contemplado que métodos alternativos, que são bem conhecidos na especialidade, podem ser empregues para preparar Apo-2. 1. Isolamento de ADN Que codifica Apo-2 0 ADN que codifica Apo-2 pode ser obtido a partir de qualquer biblioteca de ADNc preparada a partir de tecidos que se crê que possuam o ARNm de Apo-2 e que o expressem a um nivel detectável. Assim, ADN de Apo-2 humano pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecidos humanos, tais como as bibliotecas de bacteriófagos de ADNc de pâncreas e de rim humanos descritas no Exemplo 1. 0 gene de codificação de Apo-2 pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou através de sintese oligonucleotidica.

As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como anticorpos para o Apo-2 ou oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. A pesquisa da biblioteca de ADNc ou genómica com a sonda seleccionada pode 22 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ ser conduzida utilizando procedimentos padrão, tais como os descritos em Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codifica Apo-2 é utilizar metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Um método preferido de pesquisa emprega sequências seleccionadas de oligonucleótidos para pesquisar bibliotecas de ADNc de vários tecidos humanos. O Exemplo 1 abaixo descreve técnicas para pesquisa de uma biblioteca de ADNc. As sequências oligonucleotidicas seleccionadas como sondas devem ter um comprimento suficiente e serem suficientemente inequívocas para que sejam minimizados os falsos positivos. 0 oligonucleótido é de preferência marcado de modo a que possa ser detectado após hibridação com o ADN na biblioteca a pesquisar. Os métodos de marcação são bem conhecidos na especialidade e incluem a utilização de radiomarcadores como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo rigor moderado e rigor elevado, são proporcionadas em Sambrook et al., supra. 0 ácido nucleico possuindo toda a sequência de codificação da proteína pode ser obtido através da pesquisa de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui divulgada pela primeira vez, e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de extensão de iniciadores tal como descritos em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e processar intermediários de ARNm que possam não ter sido transcritos de forma inversa em ADNc.

As variantes de Apo-2 podem ser preparadas através da introdução de mudanças de nucleótidos apropriadas no ADN de Apo-2 ou através da síntese do polipéptido Apo-2 desejado. Os peritos na especialidade notarão que as alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução do Apo-2, tais como a mudança do número ou da posição de locais de glicosilação ou a alteração das características de ancoragem na membrana. 23 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

As variações na sequência nativa inteira de Apo-2 ou em vários domínios do Apo-2 aqui descritas, podem ser feitas, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e linhas orientadoras para mutações conservativas e não conservativas expostas, por exemplo, na Patente U.S. N.° 5364934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões que codificam o Apo-2 que resulta numa mudança na sequência de aminoácidos do Apo-2 em comparação com a sequência nativa. Opcionalmente a variação é através de substituição de pelo menos um aminoácido por outro aminoácido num ou mais dos domínios da molécula de Apo-2. As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na especialidade tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alaninas e mutagénese por PCR. A mutagénese dirigida ao local (Cárter et al., Nuc. Acids Res. 13: 4331, 1986; Zoller et al., Nuc. Acids Res. 10: 6487, 1987), a mutagénese por cassetes (Wells et al., Gene 34: 315, 1985), a mutagénese de selecção por restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London serA 317: 415, 1986) ou outras técnicas conhecidas podem ser efectuadas sobre o ADN clonado para produzir o ADN da variante de Apo-2. A análise de varrimento de aminoácidos pode também ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua que esteja envolvida na interacção com um determinado ligando ou receptor. Entre os aminoácidos de varrimento preferidos estão aminoácidos relativamente pequenos e neutros. Tais aminoácidos incluem a alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é o aminoácido de varrimento preferido de entre este grupo porque elimina a cadeia lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante. A alanina é também preferida porque é o aminoácido mais vulgar. Mais, é frequentemente encontrada tanto em posições ocultas como expostas [Creighton, "The Proteins", (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150: 1, 1976]. Se a substituição da alanina não produzir quantidades adequadas de variante, pode ser utilizado um aminoácido isotérico.

Uma vez produzidas as variantes de Apo-2 seleccionadas, estas podem ser colocadas em contacto, por exemplo, com Apo-2L e a interacção, se existir, pode ser determinada. A interacção 24 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ entre a variante de Apo-2 e Apo-2L pode ser medida através de um ensaio in vitro, tal como descrito nos Exemplos abaixo. Embora possam ser utilizadas várias medições analíticas para comparar as actividades e propriedades entre um Apo-2 de sequência nativa e uma variante de Apo-2, uma conveniente para a ligação é a constante de dissociação Kd do complexo formado entre a variante de Apo-2 e Apo-2L em comparação com a Kd para o Apo-2 de sequência nativa. Geralmente, um aumento ou uma diminuição > 3 vezes na Kd por resíduo substituído indica que o resíduo ou resíduos substituídos são activos na interacção do Apo-2 de sequência nativa com o Apo-2L.

Opcionalmente, locais representativos na sequência de Apo-2 adequados para mutagénese incluirão locais dentro do domínio extracelular e particularmente dentro de um ou de ambos os domínios ricos em cisteína. Tais variações podem ser conseguidas utilizando os métodos descritos acima. 2. Inserção do Ácido Nucleico num Vector Replicável 0 ácido nucleico (p.ex., ADNc ou ADN genómico) que codifica Apo-2 pode ser inserido num vector replicável para posterior clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Estão disponíveis ao público vários vectores. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento estimulador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição, cada um dos quais é descrito abaixo. i) Componente Sequência de Sinal

0 Apo-2 pode ser produzido de forma recombinante não só directamente como também na forma de um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou do polipéptido maduro. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte do ADN de Apo-2 que é inserida no vector. A sequência de sinal heteróloga seleccionada é de preferência uma que seja reconhecida e processada (i.e., clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. A 25 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, de entre o grupo dos comandos da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina li termoestável. Para secreção em levedura a sequência de sinal pode ser, p.ex., o comando da invertase de levedura, o comando do factor alfa (incluindo os comandos do factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, o último descrito na Patente U.S. N.° 5010182), ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans (ep 362179 publicada a 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado a 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero a pré-sequência do Apo-2 nativo que normalmente dirige a inserção de Apo-2 na membrana celular de células humanas in vivo é satisfatória, embora possam ser utilizadas outras sequências de sinal de mamífero para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies aparentadas, bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal da glicoproteína D de herpes simplex. O ADN para tal região precursora é de preferência ligado em enquadramento de leitura ao ADN que codifica Apo-2. ii) Componente Origem de Replicação

Ambos os vectores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector se replique numa ou em mais células hospedeiras seleccionadas. Geralmente, em vectores de clonagem esta sequência é uma que permite que o vector se replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências que se replicam autonomamente. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras e várias origens virais (SV4 0, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Geralmente, o componente origem de replicação não é necessário para vectores de expressão de mamífero (a origem de SV40 pode tipicamente ser utilizada porque contém o promotor inicial). 26 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ A maioria dos vectores de expressão são vectores vaivém, i.e., são capazes de replicação em pelo menos uma classe de organismos mas podem ser transfectados para outro organismo para expressão. Por exemplo, um vector é clonado em E. coli e depois o mesmo vector é transfectado para células de levedura ou de mamífero para expressão apesar de não ser capaz de se replicar independentemente do cromossoma da célula hospedeira. 0 ADN pode também ser amplificado através de inserção no genoma do hospedeiro. Isto é facilmente conseguido utilizando espécies de Bacillus como hospedeiros, por exemplo, através da inclusão no vector de uma sequência de ADN que seja complementar a uma sequência encontrada no ADN genómico de Bacillus. A transfecção de Bacillus com este vector resulta em recombinação homóloga com o genoma e em inserção do ADN de Apo-2. No entanto, a recuperação do ADN genómico que codifica Apo-2 é mais complexa que a de um vector replicado exogenamente porque é necessária digestão com enzimas de restrição para excisar o ADN de Apo-2. iii) Componente Gene de Selecção

Os vectores de expressão e clonagem contêm tipicamente um gene de selecção, também designado marcador seleccionável. Este gene codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou o crescimento de células hospedeiras transformadas criadas num meio de cultura selectivo. As células hospedeiras não transformadas com o vector contendo o gene de selecção não sobreviverão no meio de cultura. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, p.ex., o gene que codifica a D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de selecção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína conferindo resistência a fármacos e sobrevivem assim ao regímen de selecção. Exemplos de tal 27 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ selecção dominante utilizam os fármacos neomicina (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327, 1982), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209: 1922, 1980) ou higromicina (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413, 1985). Os três exemplos dados acima empregam genes bacterianos sob controlo eucariótico para conferir resistência ao fármaco apropriado G418 ou neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina, respectivamente.

Outro exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamifero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico de Apo-2, tais como DHFR ou timidina-quinase. Os transformantes de células de mamifero são colocados sob pressão selectiva para a qual apenas os transformantes estão unicamente adaptados para sobreviver em virtude da tomada do marcador. A pressão selectiva é imposta através da cultura dos transformantes sob condições nas quais a concentração de agente de selecção no meio é sucessivamente mudada, conduzindo deste modo à amplificação tanto do gene de selecção como do ADN que codifica Apo-2. A amplificação é o processo pelo qual os genes com maior procura para a produção de uma proteína crítica para o crescimento são reiterados em cadeia dentro dos cromossomas das sucessivas gerações de células recombinantes. A partir do ADN amplificado são sintetizadas maiores quantidades de Apo-2. Outros exemplos de genes amplificáveis incluem a metalotioneína-i e li, a adenosina-desaminase e a ornitina-descarboxilase.

As células transformadas com o gene de selecção de DHFR podem primeiro ser identificadas através da cultura de todos os transformantes num meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR de tipo selvagem é a linha celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980. As células transformadas são então expostas a níveis crescentes de metotrexato. Isto conduz à síntese de múltiplas cópias do gene de DHFR, e, concomitantemente, a múltiplas cópias de outro ADN compreendendo os vectores de expressão, tal como o ADN que codifica Apo-2. Esta técnica de 28 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ amplificação pode ser utilizada com qualquer outro hospedeiro de outro modo adequado, p.ex., ATCC N.° CCL61 CHO-Kl, apesar da presença de DHFR endógeno se, por exemplo, for empregue um gene de DHFR mutante que seja altamente resistente a Mtx (EP 117060) .

Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros de tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com sequências de adn que codificam Apo-2, proteína DHFR de tipo selvagem e outro marcador seleccionável tal como aminoglicósido-3'-fosfotransferase (APH) podem ser seleccionadas através de crescimento celular em meio contendo um agente de selecção para o marcador seleccionável tal como um antibiótico aminoglicosidico, p.ex., canamicina, neomicina ou G418. Ver Patente U.S. N.° 4965199.

Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmideo YRp7 de levedura (Stinchcomb et al., Nature 282: 39, 1979; Kingsman et al.r Gene 7: 141, 1979; Tschemper et al., Gene 10: 157, 1980). O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N.° 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85: 12, 1977) . A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detecção da transformação através de crescimento na ausência de triptofano. De modo semelhante, estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20622 ou 38626) são complementadas por plasmideos conhecidos possuindo o gene Leu2.

Adicionalmente, vectores derivados do plasmideo circular de 1,6 pm pKDl podem ser utilizados para transformação de leveduras Kluyveromyces (Bianchi et al., Curr. Genet. 12: 185, 1987) . Mais recentemente, foi relatado um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de vitelo recombinante para K. lactis (Van den Berg, Bio/Technology 8: 135, 1990). Foram também divulgados vectores de expressão estável de múltiplas cópias para secreção de albumina de soro humano recombinante madura por estirpes industriais de Kluyveromyces (Fleer et al., Bio/Technology 9: 968-975, 1991). 29 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ iv) Componente Promotor

Os vectores de expressão e clonagem contêm habitualmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operativamente ligado à sequência de ácido nucleico de Apo-2. Os promotores são sequências não traduzidas situadas a montante (5') do codão de iniciação de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição e a tradução de uma determinada sequência de ácido nucleico, tal como a sequência de ácido nucleico de Apo-2, à qual estão operativamente ligados. Tais promotores recaem tipicamente em duas classes, indutíveis e constitutivos. Os promotores indutíveis são promotores que iniciam níveis maiores de transcrição a partir do ADN sob o seu controlo em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, p.ex., a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança de temperatura. Nesta altura é conhecido um grande número de promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Estes promotores são operativamente ligados ao ADN que codifica Apo-2 através da remoção do promotor do ADN fonte através de digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vector. Tanto a sequência promotora nativa de Apo-2 como muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou a expressão do ADN de Apo-2.

Promotores adequados para utilizar com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da β-lactamase e da lactose (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), da fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8: 4057, 1980; EP 36776), e promotores híbridos tais como o promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25, 1983). No entanto, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. As suas sequências nucleotídicas foram publicadas, permitindo deste modo que um perito os possa ligar operativamente ao ADN que codifica Apo-2 (Siebenlist et al., Cell 20: 269, 1980) utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer quaisquer locais de restrição necessários. Os promotores para utilizar em sistemas bacterianos conterão também uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN que codifica Apo-2. 30 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ São conhecidas sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT situada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CXCAAT onde X pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode o sinal para adição de uma cauda poli A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências estão adequadamente inseridas em vectores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilizar com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicoliticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1: 149, 1968; Holland, Biochemistry 17: 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutiveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase-2, o isocitocromo C, a fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Vectores e promotores adequados para utilizar em expressão em levedura são ainda descritos em EP 73657. Estimuladores de levedura são também vantajosamente utilizados com promotores de levedura. A transcrição de Apo-2 a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de virus tais como o virus de polioma, virus da variola aviária (UK 2211504 publicado a 5 de Julho de 1989), adenovirus (tais como o Adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus do sarcoma aviário, citomegalovirus, um retrovirus, virus da hepatite B e de preferência o Virus Simio 40 (SV40), de promotores heterólogos 31 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ de mamífero, p.ex., ο promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico e do promotor normalmente associado à sequência de Apo-2, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros.

Os promotores inicial e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que contém também a origem de replicação virai de SV40 (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Mulligan e Berg, Science 209: 1422-1427, 1980; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 7398-7402, 1981). O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E (Greenaway et al., Gene 18: 355-360, 1982) . Um sistema para expressão de ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o papilomavírus bovino como vector é divulgado na Patente U.S. N.° 4419446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. N.° 4601978 (ver também Gray et al., Nature 295: 503-508, 1982 sobre a expressão de ADNc que codifica um interferão imunitário em células de macaco; Reyes et al., Nature 297: 598-601 1982 sobre a expressão de ADNc de interferão-β humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina-quinase do vírus herpes simplex; Canaani e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 5166-5170, 1982 sobre a

expressão do gene do interferão humano em células de ratinho e de coelho em cultura; e Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6777-6781, 1982 sobre a expressão de sequências CAT bacterianas em células de rim de macaco CV-1, fibroblastos de embrião de galinha, células de ovário de hamster chinês, células HeLa, e células NIH-3T3 de ratinho utilizando a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous como promotor). v) Componente Elemento Estimulador A transcrição de um ADN que codifica o Apo-2 por eucariotas superiores pode ser aumentada através da inserção de uma sequência estimuladora no vector. Os estimuladores são elementos de ADN de acção cís habitualmente com 10 a 300 pb, que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. Os estimuladores são de orientação e posição relativamente independentes, tendo sido encontrados a 5' (Laimins et al., 32 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 993, 1981) e a 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108, 1983) da unidade de transcrição, dentro de um intrão (Banerji et al., Cell 33: 729, 1983), bem como dentro da própria sequência de codificação (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293, 1984). Muitas sequências estimuladoras são agora conhecidas de genes de mamifero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina. Tipicamente, no entanto, utilizar-se-á um estimulador de um virus de células eucarióticas. Exemplos incluem o estimulador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus, o estimulador de polioma no lado tardio da origem de replicação e estimuladores de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297: 17-18, 1982 sobre elementos estimuladores para activação de promotores eucarióticos. O estimulador pode ser unido no vector numa posição a 5' ou a 3' da sequência de codificação de Apo-2, mas é situado de preferência num local a 5' do promotor. vi) Componente Terminação da Transcrição

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão vulgarmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', dos ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica Apo-2. vii) Construção e Análise dos Vectores A construção de vectores adequados contendo um ou mais dos componentes acima listados emprega técnicas de ligação padrão. Os plasmídeos ou fragmentos de ADN isolados são clivados, cortados à medida e novamente ligados na forma desejada para gerar os plasmídeos necessários.

Para que a análise confirme as sequências correctas nos plasmídeos construídos, as misturas de ligação podem ser utilizadas para transformar a estirpe 294 de E. coli K12 (ATCC 31446) e os transformantes bem sucedidos são seleccionados por 33 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ resistência a ampicilina ou tetraciclina conforme apropriado. Os plasmideos dos transformantes são preparados, analisados através de digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciados através do método de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309, 1981 ou através do método de Maxim et al.r Methods in Enzymology 65: 499, 1980. vii) Vectores de Expressão Transiente

Podem ser empregues vectores de expressão que proporcionem a expressão transiente em células de mamífero do ADN que codifica Apo-2. Em geral, a expressão transiente envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de se replicar eficientemente numa célula hospedeira, tal que a célula hospedeira acumula muitas cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetiza elevados níveis de um polipéptido desejado codificado pelo vector de expressão (Sambrook et al., supra). Os sistemas de expressão transiente, compreendendo um vector de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva conveniente de polipéptidos codificados pelos adn clonados, bem como a rápida pesquisa de tais polipéptidos quanto a propriedades biológicas ou fisiológicas desejadas. Assim, os sistemas de expressão transiente são particularmente úteis para fins de identificação de variantes de Apo-2. ix) Vectores Exemplificativos de Células de Vertebrado Adequados

Outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para se adaptarem à síntese de Apo-2 em cultura de células de vertebrado recombinantes são descritos em Gething et al., Nature 293: 620-625, 1981; Mantei et al., Nature 281: 40-46, 1979; EP 117060; e EP 117058. 3. Selecção e Transformação de Células Hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN em vectores daqui são as células de procariotas, levedura ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para este fim incluem mas não se limitam a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, p.ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, 34 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ex., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ex., Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtílis e B. licheniformis (p.ex., B. licheniformis 41P divulgado em DD 266710 publicada a 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. De preferência, a célula hospedeira deve segregar quantidades mínimas de enzimas proteoliticas.

Para além dos procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão de vectores codificando Apo-2. Saccharomyces cerevisiae, ou a vulgar levedura de padeiro, é o mais utilizado de entre os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros géneros, espécies e estirpes estão vulgarmente disponíveis e são úteis aqui. Células hospedeiras adequadas para a expressão de Apo-2 glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Tais células hospedeiras são capazes de um processamento complexo e de actividades de glicosilação. Em princípio, qualquer cultura de células eucarióticas superiores é praticável, seja uma cultura de vertebrado ou de invertebrado. Exemplos de células de invertebrado incluem células vegetais e de insecto. Numerosas estirpes e variantes de baculovírus e correspondentes células hospedeiras de insecto permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas [ver, p.ex., Luckow et ai., Bio/Technology 6: 47-55, 1988; Miller et al., em "Genetic Engineering", Setlow et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), págs. 277-279; e Maeda et al., Nature 315: 592-594, 1985]. Está disponível ao público uma variedade de estirpes virais para transfecção, p.ex., a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de NPV de Bombyx mori.

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco podem ser utilizadas como hospedeiras. Tipicamente, as células vegetais são transfectadas através de incubação com certas estirpes da bactéria Agrobacteríum tumefaciens. Durante a incubação da 35 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ cultura de células vegetais com A. tumefaciens, o ADN que codifica Apo-2 pode ser transferido para a célula hospedeira vegetal de modo a que esta seja transfectada e que, sob condições apropriadas, expresse o adn que codifica Apo-2. Adicionalmente, estão disponíveis sequências reguladoras e de sinal compatíveis com células vegetais tais como o promotor e sequências de sinal de poliadenilação da nopalina-sintetase (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 561, 1982). Adicionalmente, os segmentos de adn isolados a partir da região a montante do gene 780 do ADN-T são capazes de activar ou aumentar os níveis de transcrição de genes expressáveis em plantas em tecido vegetal contendo ADN recombinante (EP 321196 publicada a 21 de Junho de 1989) . A propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecidos) é também conhecida na especialidade (ver, p.ex., "Tissue Culture", Academic Press, Kruse e Patterson, editores, 1973). Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linha CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescerem em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59, 1977); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216, 1980); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 293-251, 1980); células de rim de macaco (CVl ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383: 44-68, 1982); células MRC 5; e células FS4.

As células hospedeiras são transfectadas e de preferência transformadas com os vectores de expressão ou clonagem acima descritos para produção de Apo-2 e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. 36 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ A transfecção refere-se a tomada de um vector de expressão pela célula hospedeira seja ou não realmente expressa qualquer sequência de codificação. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, CaP04 e electroporação. A transfecção com sucesso é geralmente reconhecida quando ocorre dentro da célula hospedeira qualquer indicação da operação deste vector. A transformação significa a introdução de ADN num organismo de modo a que o ADN seja replicável, como elemento extracromossómico ou através de integração cromossómica. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utilizando técnicas padrão apropriadas para tais células. 0 tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação é geralmente utilizado para procariotas ou outras células que contenham barreiras substanciais de parede celular. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et al., Gene 23: 315, 1983 e WO 89/05859 publicado a 29 de Junho de 1989. Adicionalmente, as plantas podem ser transfectadas utilizando tratamento de ultra-sons tal como descrito em WO 91/00358 publicado a 10 de Janeiro de 1991.

Para células de mamífero sem tais paredes celulares, é preferível o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology 52: 456-457, 1978. Aspectos gerais de transformações do sistema de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. N.° 4399216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact. 130: 946, 1977 e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3829, 1979. No entanto, outros métodos para introdução de ADN nas células, tais como através de micro-injecção, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina, podem também ser utilizados. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527-537, 1990 e Mansour et al., Nature 336: 348-352, 1988. 37 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 4. Cultura das Células Hospedeiras

As células procarióticas utilizadas para produzir Apo-2 podem ser cultivadas em meios adequados tais como os descritos geralmente em Sambrook et al., supra.

As células hospedeiras de mamífero, utilizadas para produzir Apo-2, podem ser cultivadas numa variedade de meios. Exemplos de meios comercialmente disponíveis incluem FIO de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ("DMEM", Sigma). Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormonas e/ou outros factores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou factor de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o fármaco Gentamicina™), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos habitualmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar) e glucose ou uma fonte energética equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes ao vulgar perito.

Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximização da produtividade de culturas de células de mamífero podem ser encontrados em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) .

As células hospedeiras referidas nesta divulgação englobam células em cultura bem como células que estão dentro de um animal hospedeiro. 5. Detecção de Amplificação/Expressão dos Genes A amplificação e/ou expressão dos genes pode ser medida directamente numa amostra, por exemplo, através de Southern 38 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ blotting, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201-5205, 1980), dot blotting (análise do ADN) ou hibridação in situ convencionais, utilizando um sonda marcada de modo apropriado, com base nas sequências aqui proporcionadas. Podem ser empregues vários marcadores, mais vulgarmente radioisótopos e particularmente P. No entanto, podem também ser empregues outras técnicas, tais como a utilização de nucleótidos modificados com biotina para introdução num polinucleótido. A biotina serve então como local para a ligação a avidina ou a anticorpos, que podem ser marcados com uma ampla variedade de marcadores, tais como radionucleótidos, fluorescentes ou enzimas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer dúplices específicos, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridos de ADN-ARN ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos podem por sua vez ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando o dúplex está ligado a uma superfície, de modo a que após a formação do dúplex à superfície, possa ser detectada a presença do anticorpo ligado ao dúplex. A expressão génica pode, alternativamente, ser medida através de métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica das células ou de secções de tecido e ensaio de uma cultura celular ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Com técnicas de coloração imuno-histoquímica, é preparada uma amostra celular, tipicamente através de desidratação e fixação, seguida de reacção com anticorpos marcados específicos para o produto do gene ligado, em que os marcadores são habitualmente visualmente detectáveis, tais como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes ou marcadores luminescentes.

Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido Apo-2 de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com o ADN de Apo-2 e codificando um epítopo de anticorpo específico. 39 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 6. Purificação do Polipéptido Αρο-2

As formas de Apo-2 podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou a partir de lisados das células hospedeiras. Se o Apo-2 estiver ligado à membrana, pode ser libertado da membrana utilizando uma solução detergente adequada (p.ex., Triton-X 100) ou o seu dominio extracelular pode ser libertado através de clivagem enzimática.

Quando o Apo-2 é produzido numa célula recombinante diferente de uma de origem humana, o Apo-2 está livre de proteínas ou de polipéptidos de origem humana. No entanto, pode ser desejado purificar Apo-2 de proteínas ou polipéptidos da célula recombinante para obter preparações que sejam substancialmente homogéneas quanto ao Apo-2. Como primeiro passo, o meio de cultura ou o lisado pode ser centrifugado para remover os restos celulares particulados. O Apo-2 é depois purificado de proteínas e polipéptidos solúveis contaminantes, com os seguintes procedimentos exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: através de fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação em etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; e colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG.

As variantes de Apo-2 nas quais foram suprimidos, inseridos ou substituídos resíduos podem ser recuperadas do mesmo modo que o Apo-2 de sequência nativa, tendo em conta as mudanças nas propriedades ocasionadas pela variação. Por exemplo, a preparação de uma fusão de Apo-2 com outra proteína ou polipéptido, p.ex., um antigénio bacteriano ou virai, uma sequência de imunoglobulina ou uma sequência de um receptor pode facilitar a purificação; uma coluna de imunoafinidade contendo anticorpo para a sequência pode ser utilizada para adsorver o polipéptido de fusão. Podem também ser utilizados outros tipos de matrizes de afinidade.

Um inibidor de proteases tal como o fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) pode também ser útil para inibir a degradação proteolítica durante a purificação e podem ser 40 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. Um perito na especialidade anotará que os métodos de purificação adequados para o Apo-2 de sequência nativa podem requerer modificação para justificar as alterações no carácter de Apo-2 ou das suas variantes após expressão em cultura celular recombinante. 7. Modificações Covalentes de Polipéptidos Apo-2

Modificações covalentes de Apo-2 são possíveis. Um tipo de modificação covalente do Apo-2 é introduzido na molécula através da reacção de resíduos de aminoácido alvo do Apo-2 com um agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N-terminais ou C-terminais do Apo-2. A derivação com agentes bifuncionais é útil para ligação cruzada de Apo-2 com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilizar no método para purificação de anticorpos anti-Apo-2 e vice-versa. A derivação com um ou mais agentes bifuncionais será também útil para ligar de modo cruzado moléculas de Apo-2 para gerar dímeros de Apo-2. Tais dímeros podem aumentar a avidez de ligação e prolongar a semivida da molécula in vivo. Agentes de ligação cruzada vulgarmente utilizados incluem, p.ex., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidilo tais como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivação tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato produzem intermediários fotoactiváveis que são capazes de formar ligações cruzadas na presença de luz. Alternativamente, matrizes reactivas insolúveis em água tais como hidratos de carbono activados com brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas Patentes U.S. Nos 3969287; 3691016; 4195128; 9247642; 4229537 e 4330440 são empregues para imobilização da proteína.

Outras modificações incluem desamidação dos resíduos glutaminilo e asparaginilo nos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e 41 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ lisina, fosforilação dos grupos hidroxilo dos resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais da lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86, 1983), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal. As formas modificadas dos resíduos recaem dentro do âmbito do presente invento.

Outro tipo de modificação covalente do polipéptido Apo-2 compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do polipéptido. "Alteração do padrão de glicosilação nativo" pretende, para os fins daqui, significar a deleção de uma ou mais porções de hidrato de carbono encontradas no Apo-2 de sequência nativa e/ou a adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no Apo-2 de sequência nativa. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à ligação da porção hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripepetidicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido excepto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. Assim, a presença de uma destas sequências tripeptidicas num polipéptido cria um potencial local de glicosilação. A glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, muito frequentemente serina ou treonina, embora possa também ser utilizada 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação ao polipéptido Apo-2 pode ser conseguida através da alteração da sequência de aminoácidos de modo a que contenha uma ou mais das sequências tripeptidicas descritas acima (para locais de glicosilação ligada a N). A alteração pode também ser feita através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina ao Apo-2 de sequência nativa (para locais de glicosilação ligada a 0) . A sequência de aminoácidos de Apo-2 pode opcionalmente ser alterada através de alterações ao nível 42 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ do ADN, particularmente através da mutação do ADN que codifica o polipéptido Apo-2 em bases pré-seleccionadas para que sejam gerados codões que serão traduzidos nos aminoácidos desejados. A mutação ou mutações do ADN podem ser feitas utilizando os métodos descritos acima e na Pat. U.S. N.° 5364934, supra.

Outro meio de aumentar o número de porções hidrato de carbono no polipéptido Apo-2 é através de conjugação química ou enzimática de glicósidos ao polipéptido. Dependendo do modo de conjugação utilizado, o açúcar ou açúcares podem ser ligados a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres tais como os da cisteína, (d) grupos hidroxilo livres tais como os da serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como os da fenilalanina, tirosina ou triptofano ou (f) o grupo amida da glutamina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicado a 11 de Setembro de 1987 e em Aplin e Wriston, "CRC Crit. Rev. Biochem.", págs. 259-306, 1981. A remoção das porções hidrato de carbono presentes no polipéptido Apo-2 pode ser conseguida quimicamente ou enzimaticamente ou através de substituição por mutação de codões que codificam para resíduos de aminoácido que servem como alvos para glicosilação. Por exemplo, a desglicosilação química através de exposição do polipéptido ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou a um composto equivalente pode resultar na clivagem da maioria dos açúcares excepto do açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina) ao mesmo tempo que deixa o polipéptido intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52, 1987 e por Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131, 1981. A clivagem enzimática das porções hidrato de carbono nos polipéptidos pode ser conseguida através da utilização de uma variedade de endo- e exoglicosidases tal como descrito por Thotakura et al.r Meth. Enzymol. 138: 350, 1987. A glicosilação em potenciais locais de glicosilação pode ser prevenida através da utilização do composto tunicamicina tal como descrito por Duksin et al.r J. Biol. Chem. 257: 3105, 1982. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicósido. 43 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Outro tipo de modificação covalente de Apo-2 compreende a ligação do polipéptido Apo-2 a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, p.ex., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos do modo exposto nas Patentes U.S. Nos 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 ou 4179337. 8. Quimeras de Apo-2

Podem ser preparadas moléculas quiméricas compreendendo Apo-2 fundido com outra sequência polipeptídica ou de aminoácidos heteróloga. A molécula quimérica pode compreender uma fusão do Apo-2 com um polipéptido marcador que proporciona um epítopo ao qual um anticorpo anti-marcador se pode ligar selectivamente. O marcador epitópico é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do Apo-2. A presença de tais formas do Apo-2 marcadas com epítopo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Também, o proporcionar do marcador epitópico permite que o Apo-2 seja facilmente purificado através de purificação por afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao marcador epitópico. Vários polipéptidos marcadores e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na especialidade. Exemplos incluem o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165, 1988); o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al.r Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616, 1905); e o marcador glicoproteína D (gD) do vírus Herpes Slmplex e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553, 1990). Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology 6: 1204-1210, 1988); o péptido epitópico KT3 (Martin et al., Science 255: 192-194, 1992); um péptido epitópico de α-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266: 15163-15166, 1991); e o marcador peptídico da proteína do gene 10 de T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 6393 — 6397, 1990). Uma vez seleccionado o polipéptido marcador, pode 44 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ ser gerado um anticorpo para ele utilizando as técnicas aqui divulgadas.

Geralmente, o Apo-2 marcado com epítopo pode ser construído e produzido de acordo com os métodos descritos acima. 0 Apo-2 marcado com epítopo é também descrito nos Exemplos abaixo. As fusões Apo-2-polipéptido marcador são de preferência construídas através da fusão da sequência de ADNc que codifica a porção Apo-2 enquadrada com a sequência de ADN do polipéptido marcador e expressando a construção de fusão de ADN resultante em células hospedeiras apropriadas. Vulgarmente, quando se preparam as quimeras Apo-2-polipéptido marcador do presente invento, o ácido nucleico que codifica o Apo-2 será fundido na sua extremidade 3' com o ácido nucleico que codifica o terminal N do polipéptido marcador, no entanto são também possíveis fusões a 5'. Por exemplo, uma sequência de poli-histidina de cerca de 5 a cerca de 10 resíduos de histidina pode ser fundida no terminal N ou no terminal C e utilizada como pega de purificação em cromatografia de afinidade. O Apo-2 marcado com epítopo pode ser purificado através de cromatografia de afinidade utilizando o anticorpo anti-marcador. A matriz à qual o anticorpo de afinidade se liga pode incluir, por exemplo, agarose, vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno. O Apo-2 marcado com epítopo pode então ser eluído da coluna de afinidade utilizando técnicas conhecidas na especialidade. A molécula quimérica pode compreender um polipéptido Apo-2 fundido com uma sequência de imunoglobulina. A molécula quimérica pode também compreender uma determinada sequência de um domínio de Apo-2, tal como uma sequência do domínio extracelular de Apo-2 fundida com uma sequência de imunoglobulina. Isto inclui quimeras em formas monoméricas, homo- ou heteromultiméricas e particularmente homo- ou heterodiméricas ou tetraméricas; opcionalmente as quimeras podem estar em formas diméricas ou formas de cadeia pesada homodiméricas. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão unidades estruturais conhecidas representadas pelos seguintes diagramas: 45 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ X ou Α

\_CH ou CL

X ou A \_Y_Ch ou Cl

A

A \_CL

\_CH

A

VH \_CL

\_CH

Vl

A \_CL

X A \_Cl

A

X \_CL

\_CH

Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma em que existem IgG, IgD e IgE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de maior peso molecular; a IgM existe geralmente como um pentâmero de unidades básicas de quatro cadeias mantidas juntas através de ligações dissulfureto. A globulina IgA e ocasionalmente a globulina IgG podem também existir no soro numa forma multimérica. No caso dos multimeros, cada unidade de quatro cadeias pode ser a mesma ou diferente. 46 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ Os seguintes diagramas representam algumas estruturas exemplificativas de monómeros, homo- e heterodimeros e homo- e heteromultímeros. Estes diagramas são meramente ilustrativos e crê-se que as cadeias dos multímeros sejam ligadas por ligações dissulfureto do mesmo modo que nas imunoglobulinas nativas. monómero:

A CL ou Ch homodímero: A\/ A heterodimero: A\/ X homotetrâmero: A\/ A heterotetrâmero: A\/ CL ou Ch Cl ou Ch

Cl ou Ch Cl ou Ch

A \- CL _ Cl OU Ch - Cl OU Ch - CL/ A A \- CL _ CL OU Ch - Cl OU Ch - CL/ e

X

X 47 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ Α X V\_

CL

Cl OU Cr Cl ou Ch

CL /

Α / X

Nos diagramas antecedentes, "A" significa uma sequência de Apo-2 ou uma sequência de Apo-2 fundida com uma sequência heteróloga; x é um agente adicional, que pode ser o mesmo que A ou diferente, uma porção de um membro da superfamilia de imunoglobulinas tal como uma região variável ou um dominio semelhante a uma região variável, incluindo uma região variável de imunoglobulina nativa ou quimérica, uma toxina tal como uma exotoxina de Pseudomonas ou rícino, ou uma sequência que se ligue funcionalmente a outra proteína, tal como outra citoquinas (i.e., IL-1, interferão-γ) ou moléculas da superfície celular (i.e., NGFR, CD40, 0x40, antigénio Fas, proteínas T2 de Shope e poxvírus de mixoma) ou um agente terapêutico polipeptídico de outro modo não normalmente associado a um domínio constante; Y é um ligante ou outra sequência receptora; e VL, VH, CL e CH representam os domínios variáveis ou constantes das cadeias leves ou pesadas de uma imunoglobulina. As estruturas compreendendo pelo menos uma CRD de uma sequência de Apo-2 como "A" e outra proteína da superfície celular possuindo um padrão repetitivo de CRD (tal como TNFR) como "X" estão especificamente incluídas.

Entender-se-á que os diagramas de cima são meramente exemplificativos das possíveis estruturas das quimeras do presente invento e não englobam todas as possibilidades. Por exemplo, pode haver desejavelmente vários "A", "X" ou "Y" diferentes em qualquer uma destas construções. Também, os domínios constantes das cadeias pesadas e leves podem ser originários da mesma ou de diferentes imunoglobulinas. Todas as permutações possíveis das estruturas ilustradas e semelhantes estão dentro do âmbito do invento daqui.

Em geral, as moléculas quiméricas podem ser construídas de um modo semelhante ao dos anticorpos quiméricos nos quais um domínio variável de um anticorpo de uma espécie é 48 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ substituído pelo domínio variável de outra espécie. Ver, por exemplo, EP 0125023; EP 173494; Munro, Nature 312: 604-608 (13 de Dezembro de 1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (13 de Dezembro de 1984); Sharon et al., Nature 309: 364-367 (24 de Maio de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984; Morrison et al., Science 229: 1202-1207, 1985; Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (13 de Dezembro de 1984); Capon et al., Nature 337: 525-531, 1989; Traunecker et al., Nature 339: 68-70, 1989.

Alternativamente, as moléculas quiméricas podem ser construídas como se segue. O ADN incluindo uma região que codifica a sequência desejada, tal como uma sequência de Apo-2 e/ou TNFR, é clivado por uma enzima de restrição próximo ou na extremidade 3' do ADN que codifica o domínio ou os domínios semelhantes a imunoglobulina num ponto ou próximo do ADN que codifica a extremidade N-terminal do polipéptido Apo-2 ou TNFR (onde está contemplada a utilização de um comando diferente) próximo ou na região de codificação N-terminal para TNFR (onde é empregue o sinal nativo). Este fragmento de ADN é então prontamente inserido próximo do ADN que codifica uma região constante de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina e, se necessário, a construção resultante é cortada à medida através de mutagénese de deleção. De preferência, a Ig é uma imunoglobulina humana quando se pretende a molécula quimérica para terapia in vivo em humanos. O ADN que codifica as regiões constantes das cadeias leves e pesadas de imunoglobulina é conhecido ou está prontamente disponível a partir de bibliotecas de ADNc ou é sintetizado. Ver por exemplo, Adams et al., Biochemistry 19: 2711-2719, 1980; Gough et al., Biochemistry 19: 2702-2710, 1980; Dolby et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 6027-6031, 1980; Rice et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 7862-7865, 1982; Falkner et al., Nature 298: 286-288, 1982; e Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 239-256, 1984.

Mais detalhes de como preparar tais fusões encontram-se em publicações relacionadas com a preparação de imunoadesinas. As imunoadesinas em geral, e as moléculas de fusão CD4-Ig especificamente, são divulgadas em WO 89/02922, publicado a 6 de Abril de 1989. As moléculas compreendendo a porção extracelular de CD4, o receptor para o vírus da 49 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ imunodeficiência humana (VIH), ligada à região constante da cadeia pesada de IgG são conhecidas na especialidade e verificou-se terem uma semivida marcadamente mais longa e uma menor eliminação que a porção extracelular solúvel de CD4 (Capon et al., supra; Byrn et al., Nature 344: 667, 1990). A construção de moléculas quiméricas específicas TNFR-lgG é também descrita em Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539, 1991; Lesslauer et al. [J. Cell. Biochem. Suplemento 15F, 1991, pág. 115 (P 432)]; e Peppel e Beutler, J. Cell. Biochem., Suplemento 15F, 1991, pág. 118 (P 439). B. Utilizações Terapêuticas e Não Terapêuticas para Apo-2 O Apo-2, tal como divulgado no presente fascículo, pode ser empregue terapeuticamente para induzir apoptose em células de mamífero. Esta terapia pode ser conseguida por exemplo, utilizando técnicas de terapia génica in vivo ou ex vivo e inclui a utilização das sequências do domínio de morte aqui divulgadas. As moléculas quiméricas de Apo-2 (incluindo as moléculas quiméricas contendo uma sequência do domínio extracelular de Apo-2) compreendendo sequências de imunoglobulina podem também ser empregues terapeuticamente para inibir apoptose ou a indução de NF-κΒ por Apo-2L ou por outro ligando ao qual se ligue o Apo-2.

As sequências de ácido nucleico que codificam o Apo-2 podem ser utilizadas como meio de diagnóstico para tipificação específica do tecido. Por exemplo, podem ser utilizados procedimentos como hibridação in situ, de Northern e de Southern blotting e análise de PCR para determinar se o ADN e/ou o ARN codificando o Apo-2 estão presentes no tipo ou tipos celulares a avaliar. O ácido nucleico de Apo-2 será também útil para a preparação de Apo-2 através das técnicas recombinantes aqui descritas. O Apo-2 isolado pode ser utilizado em ensaios de diagnóstico quantitativos como um controlo contra o qual podem ser preparadas amostras contendo quantidades desconhecidas de Apo-2. As preparações de Apo-2 são também úteis na criação de anticorpos, como padrões em ensaios para Apo-2 (p.ex., através da marcação de Apo-2 para utilizar como padrão num radioimunoensaio, ensaio de radiorreceptores ou imunoensaio 50 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ enzimático), em técnicas de purificação por afinidade e em ensaios de ligação ao receptor de tipo competitivo quando marcado com, por exemplo, iodo radioactivo, enzimas ou fluoróforos.

Formas modificadas de Apo-2, tais como as moléculas quiméricas Αρο-2-lgG (imunoadesinas) descritas acima, podem ser utilizadas como imunogénios na produção de anticorpos anti-Apo-2.

Os ácidos nucleicos que codificam Apo-2 ou as suas formas modificadas podem também ser utilizados para gerar animais transgénicos ou animais "knockout" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e na pesquisa de reagentes terapeuticamente úteis. Um animal transgénico (p.ex., um ratinho ou rato) é um animal possuindo células que contêm um transgene, transgene esse que foi introduzido no animal ou num antepassado do animal num estádio pré-natal, p.ex., embrionário. Um transgene é um ADN que é integrado no genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve o animal. ADNc que codifica Apo-2 ou uma sequência apropriada deste (tal como Αρο-2-IgG) pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica Apo-2 de acordo com técnicas estabelecidas e as sequências genómicas utilizadas para gerar animais transgénicos que contenham células que expressem ADN que codifica Apo-2. Os métodos para a criação de animais transgénicos, particularmente animais tais como ratinhos ou ratos, tornaram-se convencionais na especialidade e são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4736866 e 4870009. Tipicamente, seriam alvejadas determinadas células para a incorporação do transgene de Apo-2 com estimuladores específicos do tecido. Os animais transgénicos que incluírem uma cópia de um transgene que codifica Apo-2 introduzida na linha germinal do animal num estádio embrionário podem ser utilizados para examinar o efeito de maior expressão do ADN que codifica Apo-2. Tais animais podem ser utilizados como animais de teste para reagentes concebidos para conferir protecção, por exemplo, de condições patológicas associadas a apoptose excessiva. Animais transgénicos que transportam uma forma solúvel de Apo-2 tais como o ECD de Apo-2 ou uma quimera de imunoglobulina de tal forma podiam ser construídos para testar o efeito da neutralização crónica de Apo-2L, um ligando de Apo-2. 51 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Alternativamente, homólogos não humanos de Apo-2 podem ser utilizados para construir um animal "knockout" para Apo-2 que tenha um gene deficiente ou alterado codificando Apo-2 em resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica Apo-2 e o ADN genómico alterado que codifica Apo-2 introduzido numa célula embrionária do animal. Por exemplo, ADNc que codifica Apo-2 pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica Apo-2 de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do ADN genómico que codifica Apo-2 pode ser suprimida ou substituída por outro gene, tal como um gene que codifica um marcador seleccionável que possa ser utilizado para monitorizar a integração. Tipicamente, são incluídos no vector vários quilobases de ADN flanqueador inalterado (em ambas as extremidades 5' e 3') (ver p.ex., Thomas e Capecchi, Cell 51: 503, 1987 para uma descrição de vectores de recombinação homóloga). O vector é introduzido numa linha celular estaminal embrionária (p.ex., através de electroporação) e as células nas quais o ADN introduzido se recombinou de modo homólogo com o ADN endógeno são seleccionadas (ver p.ex., Li et al., Cell 69: 915, 1992). As células seleccionadas são então injectadas num blastocisto de um animal (p.ex., um ratinho ou rato) para formar quimeras de agregação (ver p.ex., Bradley, em "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987, págs. 113-152). Um embrião quimérico pode então ser implantado numa fêmea adoptiva pseudo-grávida adequada e o embrião levado a termo para criar um animal "knockout”. A descendência ancorando o ADN recombinado homologamente nas suas linhas germinais pode ser identificada através de técnicas padrão e utilizada para criar animais nos quais todas as células do animal contêm o ADN homologamente recombinado. Os animais "knockout" podem ser caracterizados por exemplo, quanto à sua capacidade para se defenderem de certas condições patológicas e quanto ao seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipéptido Apo-2, incluindo por exemplo, desenvolvimento de tumores. C. Preparação de Anticorpos Anti-Apo-2 O presente invento proporciona ainda anticorpos anti-Apo-2 tal como exposto nas reivindicações. Os anticorpos contra Apo-2 podem ser preparados como se segue. Anticorpos 52 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ exemplificativos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos e heteroconjugados. 1. Anticorpos Policlonais

Os anticorpos de Apo-2 podem compreender anticorpos policlonais. Os métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos dos peritos na especialidade. Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamifero, por exemplo, através de uma ou mais injecções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injectados no mamífero através de múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais. 0 agente imunizante pode incluir o polipéptido Apo-2 ou uma proteína de fusão deste. Um exemplo de um agente de imunização adequado é uma proteína de fusão Αρο-2-lgG, tal como uma proteína de fusão ECD de Αρο-2-IgG. Podem também ser empregues células que expressem Apo-2 à sua superfície. Pode ser útil conjugar o agente imunizante com uma proteína que se saiba ser imunogénica no mamífero a imunizar. Exemplos de tais proteínas imunogénicas que podem ser empregues incluem mas não se limitam a hemocianina da lapa, albumina do soro bovino, tiroglobulina bovina e inibidor da tripsina da soja. Um agente de agregação tal como alúmen pode também ser empregue para estimular a resposta imunitária do mamífero. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante mpl-tdm (monofosforil-lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). 0 protocolo de imunização pode ser seleccionado por um perito na especialidade sem demasiada experimentação. 0 mamífero pode então ser sangrado e o soro ser ensaiado quanto ao título de anticorpo. Se desejado, o mamífero pode ser reforçado até o título do anticorpo aumentar ou atingir um patamar. 2. Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos de Apo-2 podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridoma tais como os descritos por Kohler e Milstein, supra. Num método de hibridoma, um ratinho, hamster ou outro animal hospedeiro 53 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ apropriado, é tipicamente imunizado (tal como descrito acima) com um agente imunizante para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 0 agente imunizante incluirá tipicamente o polipéptido Apo-2 ou uma proteína de fusão deste. Um exemplo de um agente de imunização adequado é uma proteína de fusão ou molécula quimérica Αρο-2-IgG. Um exemplo específico de um imunogénio ECD de Αρο-2-IgG é descrito no Exemplo 9 abaixo. Células que expressem Apo-2 à sua superfície podem também ser empregues. Geralmente, são utilizados linfócitos do sangue periférico ("PBL") se forem desejadas células de origem humana, ou são utilizadas células do baço ou células dos nódulos linfáticos se forem desejadas fontes de mamífero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, 1986 págs. 59-103). As linhas celulares imortalizadas são habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origem em roedor, bovina e humana. Habitualmente, são empregues linhas celulares de mieloma de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais transformadas não tiverem a enzima hipoxantina-fosforibosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

Linhas celulares imortalizadas preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam um elevado nível de expressão estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Linhas celulares imortalizadas mais preferidas são linhas de mieloma de murídeo, que podem ser obtidas, por exemplo, em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia 54 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ e em American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", Mareei Dekker, Inc., New York, 1987 págs. 51-63) . O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode então ser ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra Apo-2. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um imunoensaio enzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na especialidade. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem. 107: 220, 1980.

Após identificação das células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, supra). Meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco e RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como ascites num mamífero.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou do fluido de ascites através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia de proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser produzidos através de métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente U.S. N.° 4816567. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais do presente invento pode ser prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as 55 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ cadeias pesada e leve de anticorpos de murideo). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteina imunoglobulina, para obter a sintese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição da sequência de codificação para domínios constantes de cadeias pesadas e leves humanas em vez das sequências homólogas de murideo (Patente U.S. N.° 4816567; Morrison et al., supra) ou através de ligação covalente à sequência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulina. Tal polipéptido não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo do presente invento ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo do presente invento para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Tal como descrito nos Exemplos abaixo, foram preparados anticorpos monoclonais anti-Apo-2. Um desses anticorpos, 3F11.39.7, foi depositado na ATCC e foi-lhe atribuído o número de acesso de depósito HB-12456. Numa concretização, os anticorpos monoclonais do presente invento terão as mesmas características biológicas que os anticorpos monoclonais segregados pela linha ou linhas celulares de hibridoma depositadas sob o N.° de Acesso HB-12456. 0 termo "características biológicas" é utilizado para referir actividades ou propriedades in vitro e/ou in vivo do anticorpo monoclonal, tais como a capacidade para se ligar especificamente a Apo-2 ou para substancialmente bloquear, induzir ou estimular a activação de Apo-2. Tal como divulgado no presente fascículo, o anticorpo monoclonal 3F11.39.7 (HB-12456) é caracterizado como possuindo actividade agonista para induzir apoptose, de ligação ao receptor Apo-2, possuindo actividade de bloqueio tal como descrito nos Exemplos abaixo, e possuindo alguma reactividade cruzada com DR4 mas não com DcRl ou DcR2. Opcionalmente, o anticorpo monoclonal ligar-se-á ao mesmo epítopo que o anticorpo 3F11.39.7 aqui divulgado. Isto pode ser determinado através da condução de vários 56 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ ensaios, tal como aqui descrito e nos Exemplos. Por exemplo, para determinar se um anticorpo monoclonal tem a mesma especificidade que o anticorpo 3F11.39.7 especificamente divulgado pode-se comparar a actividade em ensaios de bloqueio de Apo-2 e de indução de apoptose, tais como os descritos nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos do presente invento podem também compreender anticorpos monovalentes. Os métodos para preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, um método envolve expressão recombinante da cadeia leve e da cadeia pesada modificada da imunoglobulina. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc de modo a prevenir a ligação cruzada de cadeias pesadas. Alternativamente, de modo a prevenir ligação cruzada os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são suprimidos. Métodos in vitro são também adequados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão dos anticorpos para produzir fragmentos destes, particularmente, fragmentos Fab, pode ser conseguida utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade. Por exemplo, a digestão pode ser efectuada utilizando papaína. Exemplos de digestão com papaína estão descritos em WO 94/29348 publicado a 22/12/94 e na Patente U.S. N.° 4342566. A digestão com papaína de anticorpos produz tipicamente dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, designados fragmentos Fab, cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento Fc residual. 0 tratamento com pepsina rende um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antigénio e é ainda capaz de se ligar de forma cruzada ao antigénio.

Os fragmentos Fab produzidos na digestão do anticorpo contêm também os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHi) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CHi da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação daqui para Fab' em que o resíduo ou resíduos de cisteína dos domínios constantes 57 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares dos fragmentos Fab' que possuem cisteínas de charneira entre eles. Outras ligações químicas de fragmentos de anticorpo são também conhecidas. 3. Anticorpos Humanizados

Os anticorpos de Apo-2 do presente invento podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (p.ex., de murídeo) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antigénio) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo aceitador) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do aceitador são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos estruturais de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo aceitador nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também de modo óptimo pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992) .

Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na especialidade. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácido 58 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tomados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colegas (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et ai., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988), através da substituição de CDR ou de sequências de CDR de um anticorpo humano pelas sequências correspondentes de roedor. Assim, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N.° 4816567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto da cadeia leve como pesada, a utilizar na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra a biblioteca inteira de sequências conhecidas do domínio variável humano. A sequência humana que estiver mais próxima da do roedor é então aceite como a estrutura (FR) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296, 1993; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987). Outro método utiliza uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves e pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151: 2623, 1993). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção da elevada afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados 59 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares dos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam prováveis estruturas conformacionais tridimensionais das sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do provável papel dos residuos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise dos residuos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, os residuos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir da sequência de consenso e de importação de modo a que seja conseguida a característica do anticorpo desejada, tal como uma maior afinidade para o antigénio ou antigénios alvo. Em geral, os residuos de CDR estão directamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio (ver, WO 94/04679 publicado a 3 de Março de 1994).

Podem ser empregues animais transgénicos (p.ex., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. A transferência da série génica de imunoglobulinas da linha germinal humana para ratinhos com uma tal linha germinal mutante resultará na produção de anticorpos humanos após confronto com o antigénio (ver, p.ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551-255, 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993; Bruggemann et al., Year in Immuno. 7: 33, 1993).

Anticorpos humanos podem também ser produzidos em bibliotecas de apresentação por fagos (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol. 227: 381, 1992; Marks et al., J. Mol. Blol. 222: 581, 1991). As técnicas de Cole et al. e de Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77, 1985 e Boerner et al., J. Immuno1. 147(1): 86-95, 1991). Os métodos adequados para a preparação de bibliotecas fágicas foram revistos e estão descritos em Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55, 1994; Soderlind et al., Iimunological Reviews 130: 109-123, 1992; Hoogenboom, Tibtech, Fevereiro de 1997, vol. 15; Neri et 60 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ al., Cell Biophysics 27: 47-61, 1995. Podem também ser preparadas bibliotecas de anticorpos de cadeia simples através dos métodos descritos em WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 e WO 95/15388. Estão também comercialmente disponíveis bibliotecas de anticorpos, por exemplo, em Cambridge Antibody Technologies (C.A.T.), Cambridge, UK. A selecção de ligação contra um antigénio, neste caso Apo-2, pode ser realizada tal como descrito em maior detalhe nos Exemplos abaixo.

Tal como descrito nos Exemplos abaixo, anticorpos Fv de cadeia simples (scFv) anti-Apo-2 foram identificados utilizando uma biblioteca de apresentação por fagos. Três destes anticorpos, aqui referidos como 16E2, 2404 e 20E6, foram sequenciados e caracterizados. As respectivas sequências de ADN e de aminoácidos e as regiões determinantes de complementaridade destes anticorpos são mostradas nas Figuras 15A-15C e 16. Numa concretização do presente invento, os anticorpos scFv de Apo-2 terão as mesmas características biológicas que os anticorpos 16E2, 24C4 ou 20E6 aqui identificados. O termo "caracteristicas biológicas" é utilizado para referir as actividades ou propriedades in vitro e/ou in vivo do anticorpo scFv, tais como a capacidade para se ligar especificamente a Apo-2 ou para substancialmente induzir ou estimular a activação de Apo-2. Tal como divulgado no presente fasciculo, os anticorpos 16E2, 24C4 e 20E6 são caracterizados como ligando-se a Apo-2, possuindo actividade agonista para induzir apoptose e não possuindo reactividade cruzada com DR4 ou várias das outras moléculas conhecidas reconhecidas pelo ligando de Apo-2. Opcionalmente, o anticorpo scFv de Apo-2 ligar-se-á ao mesmo epítopo ou epítopos reconhecidos pelos anticorpos 16E2, 24C4 ou 20E6 aqui divulgados. Isto pode ser determinado através da condução de vários ensaios, tais como os aqui descritos e nos Exemplos. Por exemplo, para determinar se um anticorpo scFv possui a mesma especificidade que os anticorpos 16E2, 24C4 ou 20E6 especificamente divulgados, pode-se comparar a actividade em ensaios de indução de apoptose, tais como os descritos nos Exemplos abaixo.

Opcionalmente os anticorpos scFv para Apo-2 podem incluir anticorpos que contenham uma cadeia VH e VL que inclua uma ou 61 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ mais das sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDR) identificadas na Figura 16 para os anticorpos 16E2, 20E6 ou 24C4. 4. Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, de preferência humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para o Apo-2, a outra é para qualquer outro antigénio e de preferência para uma proteína ou receptor ou subunidade de receptor da superfície celular.

Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na especialidade. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature 305: 537-539, 1983) . Devido ao arranjo aleatório das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta é habitualmente conseguida através de passos de cromatografia de afinidade. São divulgados procedimentos semelhantes em WO 93/08829, publicado a 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et ai., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991.

De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida, os domínios variáveis dos anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências dos domínios constantes de imunoglobulina. A fusão é de preferência com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, compreendendo pelo menos uma parte das regiões charneira, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação à cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de 62 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ expressão separados e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos polipeptidicos em concretizações em que proporções desiguais das três cadeias polipeptidicas utilizadas na construção proporcionam os rendimentos óptimos. É contudo possivel inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptidicas num vector de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptidicas em proporções iguais resulta em elevados rendimentos ou quando as proporções não têm qualquer significado particular. Numa concretização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecificos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço e um par de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona um modo fácil de separação. Esta abordagem é divulgada em WO 94/04690 publicado a 3 de Março de 1994. Para mais detalhes da criação de anticorpos biespecificos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210. 1986. 5. Anticorpos Heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados estão também dentro do âmbito do presente invento. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. N.° 4676980) e para tratamento de infecção por VIH (WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Está contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de síntese de proteínas, incluindo aqueles envolvendo agentes de ligação cruzada. Por exemplo, as imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou através da formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para este 63 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os divulgados, por exemplo, na Pat. U.S. N.° 4676980. 6. Triacorpos

Os triacorpos estão também dentro do âmbito do presente invento. Tais anticorpos são descritos por exemplo, em Iliades et al., FEBS Letters 409: 437-441, 1997 e Korrt et al.,

Protein Engineering 10: 423-433, 1997. 7. Outras Modificações

Estão contempladas outras modificações dos anticorpos de Apo-2. Por exemplo, pode ser desejável modificar os anticorpos do presente invento em relação à função efectora, de modo a estimular a eficácia terapêutica dos anticorpos. Por exemplo, pode ser introduzido na região Fc um resíduo ou resíduos de cisteína, permitindo deste modo a formação de ligações dissulfureto nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter uma melhor capacidade de internalização e/ou uma maior capacidade de morte de células mediada pelo complemento (ver, p.ex., Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195, 1992; Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922, 1992). Os anticorpos homodiméricos podem também ser preparados utilizando ligantes cruzados heterobifuncionais tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53: 2560-2565, 1993. Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 7509-7514, 1997, descrevem ainda a preparação de homodímeros IgG-IgG e divulgam que tais homodímeros podem estimular a actividade apoptótica em comparação com os monómeros. Alternativamente, os anticorpos podem ser modificados para terem regiões Fc duplas (ver, Stevenson et al., AntiCancer Drug Design 3: 219-230, 1989) .

Pode ser desejável modificar as sequências de aminoácidos dos anticorpos aqui divulgados. As sequências dentro das regiões determinantes de complementaridade ou ligantes de scFv (tal como mostrado na Figura 16) podem ser modificadas, por exemplo para modular as actividades biológicas destes anticorpos. Podem ser feitas variações na sequência inteira de scFv ou em vários domínios das moléculas scFv aqui descritas, por exemplo, utilizando qualquer uma das técnicas e linhas 64 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ orientadoras para mutações conservativas e não conservativas expostas, por exemplo, na Pat. U.S. N.° 5364934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões que codificam um scFv que resulta numa alteração na sequência de aminoácidos do scFv em comparação com o scFv de sequência nativa. Opcionalmente, a variação é através de substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido num ou em mais domínios da molécula de scFv. As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na especialidade tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alanina e mutagénese por PCR. A mutagénese dirigida ao local (Cárter et al., Nucl. Acids Res. 13: 9331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487, 1987), mutagénese de cassete (Wells et al., Gene 39: 315, 1985), mutagénese de selecção por restrição (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415, 1986) ou outras técnicas conhecidas podem ser efectuadas no ADN clonado para produzir o ADNc da variante de scFv.

Os anticorpos podem ser opcionalmente ligados covalentemente ou conjugados com um ou mais grupos químicos. Um poliol, por exemplo, pode ser conjugado com uma molécula de anticorpo num ou em mais resíduos de aminoácido, incluindo resíduos de lisina tal como divulgado em WO 93/00109. Opcionalmente, o poliol é um poli(alquilenoglicol), tal como poli(etilenoglicol) (PEG), no entanto, os peritos na especialidade reconhecem que outros polióis, tais como, por exemplo, poli(propilenoglicol) e copolímeros de polietileno-polipropilenoglicol, podem ser empregues utilizando técnicas para conjugar PEG a polipéptidos. Foi descrita uma variedade de métodos para "peguilação" de polipéptidos. Ver, p.ex., a Patente U.S. N.° 419337 que divulga a conjugação de várias hormonas e enzimas a PEG e a polipropilenoglicol para produzir composições fisiologicamente activas, possuindo reduzidas imunogenicidades.

Os anticorpos podem também ser fundidos ou ligados a outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heterólogo tal como um marcador epitópico. Os polipéptidos marcadores epitópicos e os métodos da sua utilização estão descritos acima na Secção A, parágrafo 8. Qualquer um dos marcadores aqui descritos pode ser ligado aos anticorpos. Os Exemplos 65 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ abaixo, por exemplo, descrevem anticorpos de cadeia simples marcados com His e marcados com gD. D. Utilizações Terapêuticas para os Anticorpos de Apo-2

Os anticorpos de Apo-2 do presente invento têm utilidade terapêutica. Anticorpos de Apo-2 agonistas, por exemplo, podem ser empregues para activar ou estimular apoptose em células cancerígenas. Assim, o presente invento proporciona métodos para tratamento de cancro utilizando tais anticorpos de Apo-2. Está, como é claro, contemplado que os métodos do presente invento podem ainda ser empregues em combinação com outras técnicas terapêuticas tais como cirurgia. 0 agonista é de preferência administrado ao mamífero num transportador. Transportadores adequados e suas formulações são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al. Tipicamente, é utilizada uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável na formulação para tornar a formulação isotónica. Exemplos de um transportador farmaceuticamente aceitável incluem solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é de preferência de cerca de 5 a cerca de 8, e ainda de preferência de cerca de 7 a cerca de 7,5. Mais transportadores incluem preparações de libertação sustida tais como matrizes semi-permeáveis de polímero hidrófobos sólidos contendo o agonista, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, p.ex., películas, lipossomas ou micropartículas. Será aparente para os peritos na especialidade que certos transportadores podem ser preferíveis dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do agonista a administrar. O anticorpo agonista pode ser administrado ao mamífero através de injecção (p.ex., intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular) ou através de outros métodos tais como infusão que assegurem a sua distribuição à corrente sanguínea numa forma eficaz. O agonista pode também ser administrado através das vias intratumoral, peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais bem como sistémicos. É preferida a injecção local ou intravenosa. ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 6 6

As dosagens e os programas eficazes para administração do anticorpo agonista podem ser determinados empiricamente e fazer tais determinações está dentro da pericia na especialidade. Os peritos na especialidade compreenderão que a dosagem de agonista que tem de ser administrada variará dependendo, por exemplo, do mamifero que receberá o agonista, da via de administração, do tipo particular de agonista utilizado e de outros fármacos a administrar ao mamifero. Orientações sobre a selecção das doses apropriadas para anticorpos agonistas encontram-se na literatura sobre utilizações terapêuticas de anticorpos, p.ex., "Handbook of Monoclonal Antibodies", Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, cap. 22 e págs. 303-357; Smith et al., "Antibodies in Human Diagnosis and Therapy", Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pág. 365-389. Uma dose diária típica do agonista utilizado sozinho pode variar de cerca de 1 pg/kg a até 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo dos factores mencionados acima. O anticorpo agonista pode também ser administrado ao mamífero em combinação com quantidades eficazes de um ou mais agentes terapêuticos ou em conjunto com tratamento de radiação. Os agentes terapêuticos contemplados incluem quimioterapêuticos bem como imunoadjuvantes e citoquinas. As quimioterapias contempladas pelo presente invento incluem substâncias químicas ou fármacos que são conhecidos na especialidade e estão comercialmente disponíveis tais como Doxorubicina, 5-Fluorouracilo, Arabinósido de Citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Bussulfano, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalano, Vinblastina e Carboplatina. O agonista pode ser administrado sequencial ou simultaneamente com o outro ou outros agentes terapêuticos. As quantidades de agonista e agente terapêutico dependem, por exemplo, do tipo de fármacos utilizados, do cancro a tratar e do programa e vias de administração mas serão geralmente menos do que se cada um fosse utilizado individualmente.

Após administração do agonista ao mamífero, o cancro do mamífero e a condição fisiológica podem ser monitorizados de vários modos bem conhecidos dos médicos peritos. Por exemplo, a massa tumoral pode ser observada fisicamente ou através de técnicas de imagiologia de raios X padrão. 67 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Os anticorpos de Αρο-2 do presente invento podem também ser úteis a estimular morte celular mediada pelo sistema imunitário em células expressando Apo-2, por exemplo, através da fixação do complemento ou ADCC. Alternativamente, os anticorpos antagonistas podem ser utilizados para bloquear apoptose excessiva (por exemplo, em doença neurodegenerativa) ou para bloquear potenciais efeitos auto-imunes/inflamatórios de Apo-2 resultantes da activação de NF-κΒ. Tais anticorpos antagonistas podem ser utilizados de acordo com os métodos terapêuticos e técnicas descritos acima. E. Utilizações Não Terapêuticas para os Anticorpos de Apo-2

Os anticorpos de Apo-2 podem ainda ser utilizados em ensaios de diagnóstico para Apo-2, p.ex., detecção da sua expressão em células ou tecidos específicos ou no soro. Várias técnicas de ensaio de diagnóstico conhecidas na especialidade podem ser utilizadas, tais como os ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos ou indirectos e ensaios de imunoprecipitação conduzidos em fases heterogéneas ou homogéneas (Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", CRC Press, Inc. 1987 págs. 147-158). Os anticorpos utilizados nos ensaios de diagnóstico podem ser marcados com uma porção detectável. A porção detectável deve ser capaz de produzir, directamente ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3h, 14C, 32p, 35S ou 125l, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano. Qualquer método conhecido na especialidade para conjugar o anticorpo com a porção detectável pode ser empregue, incluindo os métodos descritos por Hunter et al.r Nature 144: 945, 1962; David et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981; e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407, 1982.

Os anticorpos de Apo-2 são também úteis para a purificação de afinidade de Apo-2 a partir de cultura celular recombinante ou de fontes naturais. Neste processo, os anticorpos contra Apo-2 são imobilizados num suporte adequado, tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando 68 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ métodos bem conhecidos na especialidade. O anticorpo imobilizado é então colocado em contacto com uma amostra contendo o Apo-2 a purificar e a partir dai o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra excepto o Apo-2, que fica ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que libertará o Apo-2 do anticorpo. F. Estojos Contendo Apo-2 ou Anticorpos de Apo-2 São proporcionados artigos manufacturados e estojos contendo Apo-2 ou anticorpos de Apo-2 que podem ser utilizados, por exemplo, para as aplicações terapêuticas e não terapêuticas descritas acima. 0 artigo manufacturado compreende um recipiente com uma etiqueta. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser constituídos por uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente guarda uma composição que inclui um agente activo que é eficaz para aplicações terapêuticas e não terapêuticas, tais como as descritas acima. 0 agente activo na composição é Apo-2 ou um anticorpo de Apo-2. A etiqueta no recipiente indica que a composição é utilizada para uma terapia específica ou uma aplicação não terapêutica e pode indicar também instruções para utilização in vivo ou in vitro, tal como descrito acima. 0 estojo compreenderá tipicamente o recipiente descrito acima e um outro ou outros recipientes compreendendo materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folhetos informativos com as instruções para utilização.

Os seguintes exemplos são dados apenas para fins ilustrativos, e não se pretende que de modo algum limitem o âmbito do presente invento.

EXEMPLOS

Todas as enzimas de restrição referidas nos exemplos foram adquiridas a New England Biolabs e utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. Todos os outros reagentes 69 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ disponíveis referidos nos exemplos foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indicado de outro modo. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos, e ao longo do fascículo, pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA. EXEMPLO 1 isolamento de Clones de adnc Que codificam Apo-2 Humano

As bases de dados de ADN de marcadores de sequência expressa (EST) (LlFESEQm, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA) foram pesquisadas e foi identificada uma EST que mostrava homologia com o domínio de morte do receptor Apo-3 (Marsters et al., Curr. Biol. 6: 750, 1996). As bibliotecas de ADNc do bacteriófago ÀgtlO de pâncreas e rim humanos (ambas adquiridas a Clontech) foram ligadas em vectores pRK5 como se segue. Os reagentes foram adicionados juntos e incubados a 16°C durante 16 horas: tampão de ligase de T4 5* (3 ml); vector pRK5, digerido com Xhol, NotI, 0,5 mg, (1 ml); ADNc (5 ml) e água destilada (6 ml). Subsequentemente, foi adicionada mais água destilada (70 ml) e 10 mg/ml de ARNt (0,1 ml) e a reacção inteira foi extraída através de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). A fase aquosa foi removida, recolhida e diluída em NaCl 5 M (10 ml) e etanol absoluto (-20°C, 250 ml). Esta foi então centrifugada durante 20 minutos a 14000 xg, decantada e o sedimento foi ressuspenso em etanol a 70% (0,5 ml) e centrifugado novamente durante 2 minutos a 14000 xg. O sedimento de ADN foi então seco em vácuo ("speedvac") e eluído para água destilada (3 ml) para utilizar no procedimento subsequente. O ADNc/ADN do vector pRK5 ligado preparado anteriormente foi arrefecido em gelo e foi-lhe adicionado bactérias DH10B electrocompetentes (Life Tech., 20 ml). A mistura de bactérias e vector foi então electroporada segundo as recomendações do fabricante. Subsequentemente foi adicionado meio SOC (1 ml) e a mistura foi incubada a 37°C durante 30 minutos. Os transformantes foram então plaqueados sobre 20 placas de LB padrão de 150 mm contendo ampicilina e incubados durante 16 horas (37°C) para permitir o crescimento de colónias. As colónias positivas foram então raspadas e o ADN foi isolado do 70 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ sedimento bacteriano utilizando protocolos de gradiente de

CsCl.

Uma biblioteca enriquecida em 5'-ADNc foi então construída para obter uma tendência de fragmentos de ADNc que representem preferencialmente as extremidades 5' dos ADNc contidos dentro da biblioteca. 10 mg do ADN plasmídico inteiro da biblioteca isolado e reunido (41 ml) foram combinados com tampão de restrição de NotI (New England Biolabs, 5 ml) e NotI (New England Biolabs, 4 ml) e incubados a 37°C durante uma hora. A reacção foi extraída através de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, 50 ml), a fase aquosa foi removida, recolhida e ressuspensa em NaCl 5 M (5 ml) e etanol absoluto (-20°C, 150 ml). Esta foi então centrifugada durante 20 minutos a 14000 xg, decantada, ressuspensa em etanol a 70% (0,5 ml) e novamente centrifugada durante 2 minutos a 14000 xg. O sobrenadante foi então removido, o sedimento foi seco em vácuo ("speedvac") e ressuspenso em água destilada (10 ml).

Os seguintes reagentes foram juntos e incubados a 37°C durante 2 horas: água destilada (3 ml); biblioteca de ADN linearizado (1 mg, 1 ml); mistura de ribonucleótidos (invitrogen, 10 ml); tampão de transcrição (Invitrogen, 2 ml) e mistura de enzima Sp6. A reacção foi então extraída através de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, 50 ml) e a fase aquosa foi removida, recolhida e ressuspensa em NaCl 5 M (5 ml) e etanol absoluto (-20°C, 150 ml) e centrifugada durante 20 minutos a 14000 xg. O sedimento foi então ressuspenso em etanol a 70% (0,5 ml), novamente centrifugado durante 2 minutos a 14000 xg, decantado, seco num "speedvac" e ressuspenso em água destilada (10 ml).

Os seguintes reagentes foram adicionados juntos e incubados a 16°C durante 16 horas: tampão de ligase de T4 5x (Life Tech., 3 ml); vector pRK5 digerido com Cla-Sal, 0,5 mg, (1 ml); ADNc (5 ml); água destilada (6 ml). Subsequentemente, foi adicionada mais água destilada (70 ml) e 10 mg/ml de ARNt (0,1 ml) e a reacção inteira foi extraída através de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, 100 ml). A fase aquosa foi removida, recolhida e diluída em NaCl 5 M (10 ml) e etanol absoluto (-20°C, 250 ml) e centrifugada durante 71 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 20 minutos a 14000 xg. Ο sedimento de ADN foi decantado, ressuspenso em etanol a 70% (0,5 ml) e centrifugado novamente durante 2 minutos a 14000 xg. O sobrenadante foi removido e o sedimento residual foi seco num "speedvac" e ressuspenso em água destilada (3 ml). O ADNc/ADN do vector pSST-amy.l ligado foi arrefecido em gelo e foram-lhe adicionadas bactérias DH10B electrocompetentes (Life Tech., 20 ml). A mistura de bactérias e vector foi então electroporada tal como recomendado pelo fabricante. Subsequentemente foi adicionado meio SOC (Life Tech., 1 ml) e a mistura foi incubada a 37°C durante 30 minutos. Os transformantes foram então plaqueados sobre 20 placas de LB padrão de 150 mm contendo ampicilina e incubados durante 16 horas (37°C) . As colónias positivas foram raspadas das placas e o ADN foi isolado do sedimento bacteriano utilizando protocolos padrão, p.ex. gradiente de CsCl.

As bibliotecas de ADNc foram pesquisadas através de hibridação com uma sonda oligonucleotídica sintética: GGGAGCCGCTCATGAGGAAGTTGGGCCTCATGGACAATGAGATAAAGGTGGCTAAAGCTGAG GCAGC GGG (SEQ ID NO:3) com base na EST.

Foram sequenciados três clones de ADNc na sua totalidade.

As regiões de codificação dos ADNc eram idênticas excepto para o codão 410 (utilizando o sistema de numeração da Fig. 1); esta posição codificava um resíduo de leucina (TTG) em ambos os ADNc pancreáticos e um resíduo de metionina (ATG) no ADNc de rim, possivelmente devido a polimorfismo. A sequência nucleotídica inteira de Apo-2 é mostrada na Figura 1 (SEQ ID NO:2). O clone 27868 (também referido como pRK5-Apo-2 depositado como ATCC 209021, tal como indicado abaixo) contém um único enquadramento de leitura aberto com um local de iniciação da tradução aparente nas posições de nucleótidos 140-142 (Kozak et al.r supra) e terminando no codão stop encontrado nas posições de nucleótidos 1373-1375 (Fig. 1; SEQ ID NO:2). O precursor polipeptídico previsto tem 411 aminoácidos de comprimento, uma proteína transmembranar de tipo I e possui um peso molecular calculado de aproximadamente 45 kDa. A análise de hidropatia (não mostrada) sugeriu a presença de uma sequência de sinal (resíduos 1-53), seguida de 72 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ um domínio extracelular (resíduos 54-182), um domínio transmembranar (resíduos 183-208) e um domínio intracelular (resíduos 209-411) (Fig. 2A; SEQ ID NO:l). A análise da sequência de aminoácidos N-terminal de Αρο-2-lgG expressa em células 293 mostrou que o polipéptido maduro começa no resíduo de aminoácido 54, indicando que a sequência de sinal real compreende os resíduos 1-53. O polipéptido Apo-2 é obtido ou obtenível através da expressão da molécula codificada pela inserção de ADNc do vector depositado ATCC 209021.

As proteínas da família de receptores de TNF são tipicamente caracterizadas pela presença de múltiplos (geralmente quatro) domínios ricos em cisteína nas suas regiões extracelulares - tendo cada domínio rico em cisteína aproximadamente 45 aminoácidos de comprimento e contendo aproximadamente 6 resíduos de cisteína regularmente espaçados. Com base na estrutura cristalina do receptor de TNF de tipo 1, as cisteínas em cada domínio formam tipicamente três ligações dissulfureto nas quais habitualmente as cisteínas 1 e 2, 3 e 5, e 4 e 6 estão emparelhadas umas com as outras. Tal como DR4, Apo-2 contém duas pseudo-repetições extracelulares ricas em cisteína (Fig. 2A), enquanto outros membros identificados da família TNFR de mamífero contêm três ou mais desses domínios (Smith et al., Cell 76:959 1994). A região citoplasmática de Apo-2 contém um domínio de morte (resíduos de aminoácido 324-391 mostrados na Fig. 1; ver também Fig. 2A) que mostram significativamente mais identidade da sequência de aminoácidos com o domínio de morte de DR4 (64%) que o domínio de morte de TNFRl (30%); CD95 (19%) ou Apo-3/DR3 (29%) (Fig. 2B) . Quatro dos seis aminoácidos do domínio de morte que são necessários para sinalização por TNFRl (Tartaglia et al., supra) são conservados em Apo-2 enquanto os outros dois resíduos são semi-conservados (ver Fig. 2B).

Com base numa análise de alinhamento (utilizando o programa de computador ALIGN™) da sequência inteira, Apo-2 mostra mais identidade de sequência com DR4 (55%) que com outros receptores ligados a apoptose, tais como TNFRl (19%); CD95 (17%) ou Apo-3 (também referido como DR3, WSL-1 ou TRAMP) (29%) . 73 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ EXEMPLO 2 A. Expressão do ECD de Apo-2

Foi preparada uma construção de fusão do domínio extracelular solúvel (ECD). Um ECD de Apo-2 (resíduos de aminoácido 1-184 mostrados na Figura 1) foi obtido através de PCR e fundido com um marcador epitópico Flag C-terminal (Sigma). (A construção do ECD de Apo-2 incluiu o resíduos 183 e 184 mostrados na Figura 1 para proporcionar flexibilidade na união, apesar de estar previsto que os resíduos 183 e 184 estejam na região transmembranar). A molécula marcada com o epítopo Flag foi então inserida em pRK5 e expressa através de transfecção transiente em células 293 humanas (ATCC CRL 1573).

Após uma incubação de 48 horas, os sobrenadantes celulares foram colhidos e utilizados directamente para estudos de co-precipitação (ver Exemplo 3) ou sujeitos a purificação do ECD de Αρο-2-Flag através de cromatografia de afinidade em contas de agarose anti-Flag, de acordo com as instruções do fabricante (Sigma). B. Expressão do ECD de Apo-2 como uma Imunoadesina

Foi preparada uma construção solúvel de imunoadesina do ECD de Apo-2. 0 ECD de Apo-2 (aminoácidos 1-841 mostrados na Fig. 1) foi fundido com a região charneira e Fc da cadeia pesada da imunoglobulina humana Gx em pRK5 tal como descrito anteriormente (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539, 1991). A imunoadesina foi expressa através de transfecção transiente em células 293 humanas e purificada a partir dos sobrenadantes celulares através de cromatografia de afinidade de proteína A, tal como descrito por Ashkenazi et ai., supra. EXEMPLO 3

Ensaio de Imunoprecipitação Mostrando a Interacção de Ligação Entre Apo-2 e o Ligando de Apo-2

Para determinar se Apo-2 e Apo-2L interagem ou se associam um com o outro, os sobrenadantes de células 293 74 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ falsamente transfectadas ou de células 293 transfectadas com ECD de Αρο-2-Flag (descrito no Exemplo 2 acima) (5 ml) foram incubados com 5 pg de Apo-2L solúvel marcado com poli-histidina (Pitti et al., supra) durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois analisados quanto à formação de complexos através de um ensaio de co-precipitação.

As amostras foram sujeitas a imunoprecipitação utilizando 25 μΐ de contas de agarose conjugadas com anti-Flag (Sigma) ou contas de agarose conjugadas com Níquel (Qiagen). Após uma incubação de 1,5 horas a 4°C, as contas foram centrifugadas e lavadas quatro vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Através da utilização de agarose anti-Flag, o Apo-2L foi precipitado através do ECD de Apo-2 marcado com Flag; através da utilização de Níquel-agarose, o ECD de Apo-2 foi precipitado através do Apo-2L marcado com His. As proteínas precipitadas foram libertadas fervendo as contas durante 5 minutos em tampão de SDS-PAGE, resolvidas através de electroforese em géis de poliacrilamida a 12% e depois detectadas através de "immunoblot" com anticorpo anti-Apo-2L ou anti-Flag (2 pg/ml) tal como descrito em Marsters et al., J. Biol. Chem. 1997.

Os resultados, mostrados na Figura 3, indicam que o ECD de Apo-2 e Apo-2L se podem associar um com o outro. A interacção de ligação foi ainda analisada através da purificação do ECD de Apo-2 a partir dos sobrenadantes de células 293 transfectadas com contas anti-Flag (ver Exemplo 2) e depois análise das amostras num instrumento BIACORE™. A análise de BIACORE™ indicou uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 1 nM. A analise de BIACORE mostrou também que o ECD de Apo-2 não é capaz de se ligar a outros membros da família TNF indutores de apoptose, nomeadamente, TNF-alfa (Genentech, Inc.; Pennica et al., Nature 312: 712, 1984), linfotoxina-alfa (Genentech, Inc.), ou Fas/ligando de Apo-1 (Alexis Biochemicals). Os dados mostram assim que Apo-2 é um receptor específico para Apo-2L. EXEMPLO 4

Indução de Apoptose por Apo-2

Porque os domínios de morte podem funcionar como interfaces de oligomerização, a sobre-expressão de receptores 75 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ que contenham domínios de morte pode conduzir à activação da sinalização na ausência de ligando (Frazer et al., supra; Nagata et al.r supra). Para determinar se Apo-2 era capaz de induzir morte celular, células 293 humanas ou células HeLa (ATCC CCL 2.2) foram transientemente transfectadas através de precipitação em fosfato de cálcio (células 293) ou electroporação (células HeLa) com um vector pRK5 ou plasmídeos baseados em pRK5 codificando Apo-2 e/ou CrmA. Quando aplicável, a quantidade total de adn plasmídico era ajustada através da adição de ADN vector. A apoptose foi avaliada 24 horas após a transfecção através da morfologia (Fig. 4A) ; fragmentação do ADN (Fig. 4B) ; ou através de análise de FACS da exposição a fosfatidilserina (Fig. 4C) ) tal como descrito em Marsters et al., Curr. Bíol. 6: 1669, 1996. Tal como mostrado nas Fig. 4A e 4B, as células 293 transfectadas com Apo-2 sofreram uma marcada apoptose.

Para as amostras ensaiadas através de FACS, as células HeLa foram co-transfectadas com pRK5-CD4 como marcador para a transfecção e a apoptose foi determinada em células expressando CD4; FADD foi co-transfectada com o plasmídeo de Apo-2; os dados são médias ± EPM de pelo menos três experiências, tal como descrito em Marsters et al., Curr. Bíol. 6: 1669, 1996. Os inibidores das caspases, DEVD-fmk (Enzyme Systems) ou z-VAD-fmk (Research Biochemicals Intl.) foram adicionados a 200 μΜ no momento da transfecção. Tal como mostrado na Fig. 4C, os inibidores das caspases CrmA, DEVD-fmk e z-VAD-fmk bloquearam a indução de apoptose por Apo-2, indicando o envolvimento de proteases semelhantes a Ced-3 nesta resposta. FADD é uma proteína adaptadora que medeia a activação da apoptose por CD95, TNFRl e Apo-3/DR3 (Nagata et al., supra), mas não parece ser necessária para a indução de apoptose por Apo-2L (Marsters et al., supra) ou por DR4 (Pan et al., supra). Uma forma mutante dominante-negativa de FADD, que bloqueia a indução de apoptose por CD95, TNFRl ou Apo-3/DR3 (Frazer et al., supra; Nagata et al., supra; Chinnayian et al., supra) não inibiu a indução de apoptose por Apo-2 quando co-transfectada em células HeLa com Apo-2 (Fig. 4C) . Estes resultados sugerem que Apo-2 sinaliza a apoptose independentemente de FADD. Consistente com esta conclusão, uma 76 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ proteína de fusão glutationa-S-transferase contendo a região citoplasmática de Apo-2 não se ligou a FADD transcrita e traduzida in vitro (dados não mostrados). EXEMPLO 5

Inibição da Actividade de Apo-2L pelo ECD de Apo-2 Solúvel 0 Apo-2L solúvel (0,5 pg/ml, preparado tal como descrito em Pitti et al., supra) foi pré-incubado durante 1 hora à temperatura ambiente com tampão PBS ou ECD de Apo-2 purificado por afinidade (5 pg/ml) juntamente com anticorpo anti-Flag (Sigma) (1 pg/ml) e foram adicionados a células HeLa. Após uma incubação de 5 horas, as células foram analisadas quanto à apoptose através de FACS (tal como acima) (Fig. 4D).

Apo-2L induziu uma marcada apoptose em células HeLa, e o ECD de Apo-2 solúvel foi capaz de bloquear a acção de Apo-2L (Fig. 4D), confirmando uma interacção específica entre Apo-2L e Apo-2. Resultados semelhantes foram obtidos com a imunoadesina de ECD de Apo-2 (Fig. 4D). A análise de resposta à dose mostrou uma inibição semi-máxima a aproximadamente 0,3 nM de imunoadesina de Apo-2 (Fig. 4E). EXEMPLO 6

Activação de NF-κΒ por Apo-2

Foi conduzido um ensaio para determinar se Apo-2 activa NF-kB.

Células HeLa foram transfectadas com plasmídeos de expressão pRK5 codificando Apo-2 inteiro de sequência nativa, DR4 ou Apo-3 e colhidas 24 horas após a transfecção. Foram preparados extractos nucleares e fez-se reagir 1 pg de proteína nuclear com uma sonda oligonucleotídica sintética específica de NF-κΒ marcada com 32P ATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG (SEQ ID NO:4) (ver, também, MacKay et al., J. Immunol. 153: 5274-5284, 1994), sozinha ou juntamente com um excesso de 50 vezes de sonda não marcada, ou com um oligonucleótido sintético marcado com 32P irrelevante 77 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ AGGATGGGAAGTGTGTGATATATCCTTGAT (SEQ ID ΝΟ:5). Nalgumas amostras, foi adicionado anticorpo para as subunidades p65/RelA de NF-κΒ (1 pg/ml; Santa Cruz Biotechnology). A ligação do ADN foi analisada através de um ensaio de mudança da mobilidade electroforética tal como descrito por Hsu et al., supra; Marsters et al., supra e MacKay et al., supra.

Os resultados são mostrados na Fig. 5. Tal como mostrado na Fig. 5A, após transfecção para células HeLa, tanto Apo-2 como DR4 induziram uma activação significativa de NF-κΒ medida através do ensaio de mudança da mobilidade electroforética; o nivel de activação foi comparável ao da activação observada para Apo-3/DR3. 0 anticorpo para a subunidade p65/RelA de NF-κΒ inibiu a mobilidade da sonda de NF-κΒ, implicando p65 na resposta a todos os 3 receptores.

Foi também conduzido um ensaio para determinar se o próprio Apo-2L pode regular a actividade de NF-κΒ. Células HeLa ou células MCF7 (linha celular de adenocarcinoma da mama humano, ATCC HTB 22) foram tratadas com tampão PBS, Apo-2L solúvel (Pitti et al., supra) ou TNF-alfa (Genentech, Inc., ver Pennica et al., Nature 312: 721, 1984) (1 pg/ml) e ensaiadas quanto à actividade de NF-ΚΒ como acima. Os resultados são mostrados na Fig. 5B. 0 Apo-2L induziu uma activação significativa de NF-κΒ nas células HeLa tratadas mas não nas células MCF7 tratadas; o TNF-alfa induziu uma activação mais pronunciada em ambas as linhas celulares. Vários estudos divulgaram que a activação de NF-κΒ por TNF pode proteger as células contra apoptose induzida por TNF (Nagata, supra).

Os efeitos de um inibidor de NF-κΒ, ALLN (N-acetil-Leu-Leu-norleucinal) e de um inibidor da transcrição, ciclo-hexamida, foram também testados. As células HeLa (plaqueadas em placas de 6 poços) foram pré-incubadas com tampão PBS, ALLN (Calbiochem) (40 pg/ml) ou ciclo-hexamida (Sigma) (50 pg/ml) durante 1 hora antes da adição de Apo-2L (1 pg/ml). Após uma incubação de 5 horas, a apoptose foi analisada através de FACS (ver Fig. 5C).

Os resultados são mostrados na Fig. 5C. Tanto ALLN como a ciclo-hexamida aumentaram o nível de apoptose induzida por 78 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Apo-2L nas células HeLa. Os dados indicam que Apo-2L pode induzir genes dependentes de NF-κΒ protectores. Os dados indicam também que Apo-2L é capaz de activar NF-κΒ em certas linhas celulares e que tanto Apo-2 como DR4 podem mediar essa função. EXEMPLO 7

Expressão de Apo-2 em Tecidos de Mamífero A. Análise Northern blot A expressão do ARNm de Apo-2 em tecidos humanos foi examinada através de análise Northern blot. As membranas de ARN humano foram hibridadas com uma sonda de ADN de 4,6 quilobases marcada com 32P baseadas no ADNc inteiro de Apo-2; a sonda foi gerada através de digestão do plasmídeo pRK5-Apo-2 com EcoRI. A membrana de ARN fetal humano MTN (Clontech), a membrana de ARN de adulto humano MTN-II (Clontech) e a membrana de ARN da linha celular de cancro humano (Clontech) foram incubadas com as sondas de ADN. As membranas foram incubadas com as sondas em tampão de hibridação (SSPE 5x; solução de Denhardt 2x; 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão fragmentado desnaturado; formamida a 50%; SDS a 2%) durante 60 horas a 42°C. As membranas foram lavadas várias vezes em SSC 2x; SDS a 0,05% durante 1 hora à temperatura ambiente seguido de uma lavagem de 30 minutos em SSC 0,lx; SDS a 0,1% a 50°C. As membranas foram reveladas após exposição de um dia para o outro.

Tal como mostrado na Fig. 6A, foi detectado um transcrito de ARNm predominante de aproximadamente 4,6 kb em múltiplos tecidos. A expressão foi relativamente elevada em fígado e pulmão fetais e de adulto e em ovário e leucócitos do sangue periférico (LSP) de adulto, enquanto não foi detectada expressão de ARNm no cérebro fetal e de adulto. Níveis intermédios de expressão foram observados em cólon, intestino delgado, testículos, próstata, timo, pâncreas, rim, músculo-esquelético, placenta e coração de adulto. Mostrou-se anteriormente que vários tecidos de adulto que expressam Apo-2, p.ex., PBL, ovário e baço, expressam DR4 (Pan et ai., 79 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ supra), no entanto, os níveis relativos de expressão de cada ARNm de receptor parecem ser diferentes.

Tal como mostrado na Fig. 6B, o ARNm de Apo-2 foi expresso de modo relativamente elevado em 6 das 8 linhas celulares de cancro humano examinadas, nomeadamente, HL60 de leucemia promielocítica, HeLa S3 de carcinoma cervical, K562 de leucemia mielogenosa crónica, SW 480 de adenocarcinoma colorrectal, A549 de carcinoma do pulmão e G361 de melanoma. Houve também expressão detectável em células de linfoma de Burkitt (de Raji). Assim, Apo-2 pode ser útil como alvo para a indução de apoptose em células cancerígenas de tumores linfóides bem como não linfóides. B. Hibridação in situ A expressão de Apo-2 em tecidos humanos normais e cancerosos foi examinada através de hibridação in situ. Adicionalmente, foram examinados vários tecidos diferentes de chimpanzé e macaco Rhesus quanto à expressão de Apo-2. Estes tecidos incluíram: tecidos fetais humanos (semanas E12-E16) -placenta, cordão umbilical, fígado, rim, glândulas supra-renais, tiróide, pulmão, coração, grandes vasos, esófago, estômago, intestino delgado, baço, timo, pâncreas, cérebro, olho, espinal medula, parede do corpo, pélvis e membros inferiores; tecidos humanos de adulto - rim, bexiga, glândulas supra-renais, baço, nódulo linfático, pâncreas, pulmão, pele, retina, fígado; tecidos de chimpanzé - glândulas salivares, estômago, tiróide, paratiróide, língua, timo, ovário, nódulo linfático e nervo periférico; tecidos de macaco Rhesus -córtex cerebral, hipocampo, cerebelo e pénis; tecidos de tumores humanos - adenocarcinoma de pulmão, testículos, carcinoma de pulmão, carcinoma da mama, fibroadenoma, sarcoma de tecidos moles.

As amostras de tecidos foram embebidas em parafina e seccionadas. Posteriormente, os tecidos seccionados foram desparafinados e as lâminas colocadas em água. As lâminas foram enxaguadas duas vezes durante cinco minutos à temperatura ambiente em SSC 2x. Após enxaguamento, as lâminas foram colocadas em 20 mg/ml de proteinase K (em tampão livre de ARNases) durante 15 minutos a 37°C (para tecidos fetais) ou 80 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ proteinase Κ 8χ durante 30 minutos a 37°C (para tecidos em formalina). As lâminas foram então enxaguadas novamente em SSC 0,5x e desidratadas. Antes da hibridação, as lâminas foram colocadas numa caixa de plástico forrada com papel de filtro saturado com tampão (SSC 4x, formamida a 50%). Os tecidos foram cobertos com 50 μΐ de tampão de hibridação (3,75 g de sulfato de dextrano mais 6 ml de água; sujeito a vórtice e aquecido durante 2 minutos; arrefecido em gelo e foram adicionados 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de SSC 20x e 9 ml de água) e incubadas a 42°C durante 1 a 4 horas. A hibridação foi conduzida utilizando uma sonda marcada com 32P consistindo nos nucleótidos 706-1259 de SEQ ID NO:2. A sonda foi adicionada às lâminas em tampão de hibridação e incubada de um dia para o outro a 55°C. Foram então efectuados sequencialmente múltiplos passos de lavagem como se segue: duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente em SSC 2x; tampão EDTA (400 ml de SSC 20x, 16 ml de EDTA 0,25 M) ; uma vez durante 30 minutos a 37°C em 20 pg/ml de ARNase A; duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente em SSC 20x, tampão EDTA; uma vez durante 2 horas a 55°C em SSC 0,1χ, tampão EDTA; duas vezes durante 10 minutos à temperatura ambiente em SSC 0,5χ. A desidratação foi efectuada durante 2 minutos em EtOH a 50%, 70% e 90% cada um contendo NH4AC 0,3 M. Finalmente, as lâminas foram secas ao ar durante 2 horas e expostas a película. A expressão de Apo-2 nos tecidos fetais pareceu mais forte em hepatócitos no fígado, em glomérulos em desenvolvimento no rim, no córtex supra-renal e no epitélio do tracto gastrintestinal. Uma expressão moderada foi observada em células epiteliais no pulmão e em locais de vascularização de uma placa óssea em crescimento. Um nível relativamente baixo foi observado nas células epiteliais da tiróide e nas células dos ventrículos cardíacos. Foi observada expressão em células linfóides na medula tímica, nos nódulos linfáticos em desenvolvimento e nos citotrofoblastos da placenta. A expressão de Apo-2 em tecidos de adulto foi observada em oócitos em repouso nos folículos primordiais e a níveis reduzidos em células da granulosa de folículos em desenvolvimento em ovários de chimpanzé. A expressão foi 81 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ observada em fígados cirróticos em hepatócitos no bordo dos nódulos (i.e., área de danos, o fígado normal de adulto era negativo). Outros tecidos foram negativos quanto à expressão.

Nos tecidos de cancro examinados, verificou-se a expressão de Apo-2 em dois adenocarcinomas de pulmão e em dois tumores das células germinativas dos testículos. Dois carcinomas de pulmão adicionais (um escamoso) foram negativos. Um de cinco carcinomas da mama foi positivo (havia expressão em tecido da mama normal). Num fibroadenoma, pareceu haver expressão tanto em elementos epiteliais como do estroma. Um sarcoma de tecido mole também foi positivo. Outros tecidos examinados foram negativos. EXEMPLO 8

Localização Cromossómica do Gene de Apo-2 A localização cromossómica do gene de Apo-2 humano foi examinada através da análise de um painel de híbridos de radiação (RH). 0 mapeamento por RH foi efectuado através de PCR utilizando um painel de híbridos de radiação de células de humano-ratinho (Research Genetics) e iniciadores baseados na região de codificação do ADNc de Apo-2 (Gelb et al., Hum. Genet. 98: 141, 1996). A análise dos dados de PCR utilizando a base de dados Stanford Human Genome Center Database indica que Apo-2 está ligado ao marcador D8S481, com uma LOD de 11.05; D8S481 está por sua vez ligado a D8S2055, que está mapeado no cromossoma humano 8p21. Uma análise semelhante de DR4 mostrou que DR4 está ligado ao marcador D8S2127 (com uma LOD de 13.00), que também está mapeado no cromossoma humano 8p21.

Tanto quanto sabe o Requerente, até à data não foi localizado nenhum outro membro da família de genes de TNFR no cromossoma 8. EXEMPLO 9

Preparação de Anticorpos Monoclonais Específicos para Apo-2

Ratinhos Balb/c (obtidos em Charles River Laboratories) foram imunizados através de injecção de 0,5 pg/50 μΐ de uma 82 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ proteína imunoadesina de ECD de Apo-2 (diluída em adjuvante MPL-TDM adquirido em Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11 vezes na almofada de cada pata traseira a intervalos de 3-4 dias. A proteína imunoadesina de ECD de Apo-2 foi gerada através da fusão de uma sequência do domínio extracelular de Apo-2 (aminoácidos 1-184) mostrada na Fig. 1 com a região charneira e Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina Gi humana em pRK5 tal como descrito anteriormente (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539, 1991). A proteína imunoadesina foi expressa através de transfecção transiente em células 293 e purificada a partir dos sobrenadantes celulares através de cromatografia de afinidade em proteína A, tal como descrito em Ashkenazi et al., supra (ver também Exemplo 2B, acima).

Três dias após o reforço final, os nódulos linfáticos poplíteos foram removidos dos ratinhos e foi preparada uma suspensão de células individuais em meio DMEM (obtido em Biowhitakker Corp.) suplementado com penicilina-estreptomicina a 1%. As células dos nódulos linfáticos foram então fundidas com células de mieloma de murídeo P3X63AgU.l (ATCC CRL 1597) utilizando polietilenoglicol a 35% e foram cultivadas em placas de cultura de 96 poços. Os hibridomas resultantes da fusão foram seleccionados em meio HAT. Dez dias após a fusão, os sobrenadantes da cultura de hibridoma foram pesquisados num ELISA para testar quanto à presença de anticorpos monoclonais que se ligassem à proteína imunoadesina de ECD de Apo-2.

No ELISA, placas de microtítulo de 96 poços (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) foram revestidas através da adição a cada poço de 50 μΐ de Fc a 2 pg/ml de Fc de cabra anti-IgG humana (adquirido em Cappel Laboratories) em PBS e da incubação a 4°C de um dia para o outro. As placas foram então lavadas três vezes com tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05%). Os poços nas placas de microtítulo foram então bloqueados com 50 μΐ de albumina de soro bovino a 2,0% em PBS e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram então novamente lavadas três vezes com tampão de lavagem.

Após o passo de lavagem, foram adicionados a cada poço 50 μΐ de 0,4 pg/ml de proteína imunoadesina de ECD de Apo-2 83 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ (tal como descrito acima) em tampão de ensaio. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente num aparelho de agitação, seguido de lavagem três vezes com tampão de lavagem.

Após os passos de lavagem, foram adicionados aos poços designados 100 μΐ dos sobrenadantes de hibridoma ou de anticorpo purificado (utilizando colunas de proteína A-Sepharose) (1 pg/ml) na presença de CD4-IgG. Foram adicionados a outros poços designados 100 μΐ de meio condicionado de células de mieloma P3X63AgU.l como controlos. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora num aparelho de agitação e depois lavadas três vezes com tampão e lavagem. A seguir, foram adicionados a cada poço 50 μΐ de Fc de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (adquirido em Cappel Laboratories), diluído 1:1000 em tampão de ensaio (albumina de soro bovino a 0,5%, Tween-20 a 0,05%, Timersol a 0,01% em PBS) e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente num aparelho agitador. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem, seguido da adição a cada poço de 50 μΐ de substrato (substrato de peroxidase em micropoços TMB, Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) e de incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos. A reacção foi parada através da adição a cada poço de 50 μΐ de solução de paragem de um componente TMB (dietilglicol, Kirkegaard & Perry), e a absorvância a 450 nm foi lida num leitor de placas de microtítulo automático.

Dos sobrenadantes de hibridoma pesquisados no ELISA, 22 sobrenadantes deram positivo nos testes (calculado como aproximadamente 4 vezes acima do fundo). Os sobrenadantes que deram positivo no ELISA foram ainda analisados através de análise de FACS utilizando células 9D (uma linha celular linfóide B humana que expressa Apo-2; Genentech, Inc.) e de anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com FITC. Para esta análise, foram adicionados a poços de microtítulo de fundo em U 25 μΐ de células suspensas (a 4xl06 células/ml) em tampão de separação de células (PBS contendo FCS a 1% e NaN3 a 0,02%), misturados com 100 μΐ de sobrenadante de cultura ou anticorpo purificado (purificado em colunas de Proteína A-Sepharose) (10 pg/ml) em tampão de separação de células, e 84 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ incubou-se durante 30 minutos em gelo. As células foram então lavadas e incubadas com 100 μΐ anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com FITC durante 30 minutos a 4°C. As células foram então lavadas duas vezes, ressuspensas em 150 μΐ de tampão de separação de células e depois analisadas através de FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . A análise de FACS mostrou que 8/22 sobrenadantes eram positivos para os anticorpos anti-Apo-2. A Figura 7 mostra a coloração de FACS das células 9D incubadas com um dos anticorpos de Apo-2, referido como 3F11.39.7. Tal como mostrado na Figura 7, o anticorpo 3F11.39.7 reconhece o receptor Apo-2 expresso em células 9D. EXEMPLO 10

Ensaio da Capacidade dos Anticorpos de Apo-2 para Induzir Apoptose de modo Agonista

Os sobrenadantes de hibridoma e os anticorpos purificados (tal como descrito no Exemplo 9 acima) foram testados quanto à actividade para induzir apoptose de células 9D mediada por Apo-2. As células 9D (5xl05 células/0,1 ml) foram incubadas com concentrações variáveis de anticorpos em 100 μΐ de meio RPMI completo a 4°C durante 15 minutos. As células foram então incubadas durante 5 minutos a 37°C e foram adicionados a algumas das amostras celulares 10 pg de anticorpo Fc de cabra anti-IgG de ratinho (Cappel Laboratories) em 300 μΐ de RPMI completo. Neste momento, as células foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e na presença de CO2 a 7%. As células foram então colhidas e lavadas uma vez com PBS. A viabilidade das células foi determinada através de coloração por ligação de FITC-anexina V a fosfatidilserina de acordo com as recomendações do fabricante (Clontech). As células foram lavadas em PBS e ressuspensas em 200 μΐ de tampão de ligação. Foram adicionados às células 10 μΐ de anexina V-FITC (1 pg/ml) e 10 μΐ de iodeto de propidio. Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células 9D foram analisadas através de FACS.

Tal como mostrado a Figura 8, o anticorpo 3F11.39.7 (na ausência de Fc de cabra anti-IgG de ratinho) induziu apoptose 85 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ nas células 9D em comparação com os anticorpos de controlo. A actividade agonista, no entanto, foi estimulada através da ligação cruzada do receptor Apo-2 na presença de Fc de cabra anti-igG de ratinho (ver Figura 9). Esta apoptose estimulada (Figura 9) pela combinação de anticorpos é comparável à actividade apoptótica de Apo-2L em células 9D (dados não mostrados). EXEMPLO 11

Ensaio da Capacidade do Anticorpo para Bloquear a Apoptose Induzida pelo Ligando de Apo-2

Os sobrenadantes de hibridomas e os anticorpos purificados (tal como descrito no Exemplo 9 acima) foram testados quanto à actividade para bloquear a apoptose de células 9D induzida pelo ligando de Apo-2. Células 9D (5xl05 células/0,1 ml) foram suspensas em meio RPMI completo (RPMI mais FCS a 10%, glutamina, aminoácidos não essenciais, penicilina, estreptomicina, piruvato de sódio) e foram colocadas em tubos Falcon 2052 individuais. As células foram então incubadas com 10 pg de anticorpos em 200 μΐ de meio durante 15 minutos em gelo. 0,2 ml de ligando de Apo-2 (2,5 pg/ml) (Apo-2L marcado com His solúvel preparado tal como descrito em WO 97/25428; ver também Pitti et al., supra) foram suspensos em meio RPMI completo e depois adicionados aos tubos contendo as células 9D. As células 9D foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e na presença de C02 a 7%. As células incubadas foram então colhidas e lavadas uma vez com PBS. A viabilidade das células foi determinada através de coloração por ligação de FITC-anexina V a fosfatidilserina de acordo com as recomendações do fabricante (Clontech). Especificamente, as células foram lavadas em PBS e ressuspensas em 200 μΐ de tampão de ligação. Foram adicionados às células 10 μΐ de anexina V-FITC (1 pg/ml) e 10 μΐ de iodeto de propidio. Após incubação durante 15 minutos no escuro, as células 9D foram analisadas através de FACS.

Os resultados são mostrados na Figura 10. Uma vez que as células 9D expressam mais de um receptor para Apo-2L, Apo-2L pode induzir apoptose nas células 9D através da interacção com o receptor Apo-2 ou DR4. Assim, para detectar qualquer 86 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ actividade de bloqueio dos anticorpos de Apo-2, era necessário bloquear a interacção entre DR4 e Apo-2L. Em combinação com o anticorpo anti-DR4, 4H6.17.8 (ATCC HB-12455), o anticorpo de Apo-2 3F11.39.7 foi capaz de bloquear aproximadamente 50% da apoptose induzida por Apo-2L. Crê-se que os aproximadamente 50% restantes de actividade apoptótica sejam devidos às actividades agonistas destes dois anticorpos por si mesmos, tal como mostrado na Figura 10. Assim, crê-se que o anticorpo 3F11.39.7 seja um anticorpo de Apo-2 bloqueador ou um anticorpo que se liga a Apo-2 de um modo que compete com a ligação do ligando de Apo-2 a Apo-2. EXEMPLO 12

Ensaio ELISA para Testar a Ligação de Anticorpos de Apo-2 a Outros Receptores do Ligando de Apo-2

Foi conduzido um ELISA para determinar se o anticorpo monoclonal descrito no Exemplo 9 era capaz de se ligar a outros receptores conhecidos de Apo-2L para além de Apo-2. Especificamente, o anticorpo 3F11.39.7 foi testado quanto à ligação a DR4 (Pan et ai., supra), DcRl (Sheridan et al., supra), e DcR2 (Marsters et al., Curr. Biol. 7: 1003-1006, 1997) . O ELISA foi efectuado essencialmente como descrito no Exemplo 9 acima.

Os resultados são mostrados na Figura 11. O anticorpo de Apo-2 3F11.39.7 ligou-se a Apo-2. O anticorpo 3F11.39.7 mostrou também alguma reactividade cruzada com DR4, mas não com DcRl nem DcR2. EXEMPLO 13

Isotipagem dos Anticorpos O isotipo do anticorpo 3F11.39.7 (tal como descrito acima) foi determinado revestindo placas de microtitulo com o isotipo especifico de cabra anti-Ig de ratinho (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) de um dia para o outro a 4°C. As placas foram então lavadas com tampão de lavagem (tal como descrito no Exemplo 9 acima). Os poços das placas de microtitulo foram então bloqueados com 200 μΐ de albumina de 87 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ soro bovino (BSA) a 2% e incubados à temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram novamente lavadas três vezes com tampão de lavagem. A seguir, foram adicionados aos poços designados 100 μΐ de 5 pg/ml de anticorpo 3F11.39.7 purificado. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos e foram depois adicionados a cada poço 50 μΐ de anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com HRP (tal como descrito acima). As placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. O nivel de HRP ligada à placa foi detectado utilizando substrato de HRP tal como descrito acima. A análise de isotipagem mostrou que o anticorpo 3F11.39.7 é um anticorpo IgGl. EXEMPLO 14

Anticorpos de Apo-2 de Cadeia Simples A. Selecção de Fagos do Anticorpo utilizando contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina

Uma biblioteca fágica foi seleccionada utilizando o antigénio biotinilado solúvel e contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. O antigénio, uma imunoadesina de ECD de Apo-2 preparada tal como descrito no Exemplo 2B acima, foi biotinilado utilizando IMMUNOPURE NHS-biotina (biotini-N-hidroxissuccinimida, Pierce) de acordo com as instruções do fabricante.

Foram realizadas duas experiências de selecção. A primeira experiência foi desenhada para isolar clones fágicos específicos para Apo-2 e que não reagiram de modo cruzado com DR4 nem DcRl. Foram realizados três ciclos de selecção. Para o primeiro ciclo, 10 μΐ da biblioteca fágica de Cambridge Antibody Technologies foram bloqueados com 1 ml de MPBST (leite em pó seco a 3%, PBS lx, Tween a 0,2%) contendo 800 pg de CD4-Ig, 300 pg de DR4-Ig e 200 pg de DcRl-Ig durante 1 hora num roda giratória à temperatura ambiente (CD4-Ig, DR4 e DcRl estão descritos em Capon et al., Nature 337: 525, 1989; Pan et al., supra; e Sheridan et al., supra). A imunoadesina de ECD de Apo-2 biotinilada foi então adicionada a uma concentração 88 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ final de 100 ηΜ, e os fagos foram deixados a ligar ao antigénio durante 1 hora a 37°C. Entretanto, 300 μΐ de contas DYNABEADS M-280, revestidas com estreptavidina, (DYNAL) foram lavados 3 vezes com 1 ml de MPBST (utilizando um DYNAL Magnetic Particle Concentrator) e depois bloqueados durante 2 horas a 37°C com 1 ml de MPBST fresco num aparelho rotativo. As contas foram colhidas com MPC, ressuspensas em 50 μΐ de MPBST e adicionadas à solução de fago mais antigénio. A mistura continuou numa roda à temperatura ambiente durante 15 minutos. As DYNABEADS e o fago ligado foram então lavados um total de 7 vezes: 3 vezes com 1 ml de PBS-TWEEN, uma vez com MPBS, seguido de 3 vezes com PBS.

Os fagos foram eluídos das contas através de incubação por 5 minutos à temperatura ambiente com 300 μΐ de trietilamina 100 mM. O sobrenadante contendo os fagos foi removido e neutralizado com 150 μΐ de Tris-HCl 1 M (pH 7,4). Os fagos neutralizados foram utilizados para infectar células hospedeiras TGl em fase semi-logarítmica e plaqueadas em ágar 2YT suplementado com glucose a 2% e 100 pg/ml de carbenicilina. Após crescimento de um dia para o outro a 30°C, as colónias foram raspadas para 10 ml de 2YT. Foram utilizados 50 μΐ desta solução para inocular 25 ml de 2YT com carbenicilina e glucose e incubou-se com agitação durante 2 horas a 37°C. Os fagos ajudantes M13K07 (Pharmacia) foram adicionados a uma m.o.i. de 10. Após adsorção, as células foram sedimentadas e ressuspensas em 25 ml de 2YT com carbenicilina (100 pg/ml) e canamicina (50 pg/ml) e criadas continuamente a 30°C durante 4 horas. A E. coli foi removida dos fagos através de centrifugação e foi utilizado 1 ml destes fagos (aproximadamente 1012 c.f.u.) em subsequentes ciclos de selecção.

Para o segundo ciclo de selecção, o 1 ml de fagos colhidos foi ajustado a leite seco a 3%, PBS lx, Tween a 0,2% e depois foram adicionados 100 pg de DR4-Ig, 65 pg de DcRl-Ig e 500 pg de CD4-ig para bloqueio. Para selecção, foi adicionado Apo-2 biotinilado a 10 ηΜ. O rigor das lavagens foi aumentado para dois ciclos de 7 lavagens.

Para o terceiro ciclo de selecção, os fagos foram bloqueados com apenas MPBST. Foi adicionado Apo-2 biotinilado 89 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ a 1 ηΜ e ο rigor das lavagens foi aumentado para três ciclos de 7 lavagens. Relativamente poucos clones foram obtidos neste ciclo, portanto foi efectuado Sei 2B, Ciclo 3 utilizando 5 nM de Apo-2 biotinilado com todas as outras condições repetidas como anteriormente.

Uma segunda experiência de selecção foi efectuada de modo semelhante ao de cima excepto que nos Ciclos 1 e 2, o bloqueio das soluções de fagos foi conduzido com mpbst contendo 1,0 mg/ml de CD4-Ig (sem outras imunoadesinas) e no Ciclo 3 foi bloqueado apenas com MPBST. Apo-2 biotinilado foi adicionado a 200 nM no Ciclo 1, 60 nM no Ciclo 2 e 12 nM no Ciclo 3. A cada ciclo, os fagos foram eluidos das contas magnéticas com 300 μΐ de trietilamina 100 nM, depois com 300 μΐ de Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5), e depois com 300 μΐ de glicina-HCl 0,1 M (pH 2,2) contendo 1 mg/ml de BSA. Os fagos obtidos a partir das três eluições sequenciais foram reunidos e utilizados para infectar a estirpe hospedeira TG1 tal como acima. B. Pesquisa por ELISA dos clones seleccionados

Após cada ciclo de selecção, as colónias individuais resistentes a carbenicilina foram pesquisadas através de ELISA para identificar as que produzem o fago que se liga a Apo-2. Apenas os clones que eram positivos em dois ou mais formatos de ensaio foram melhor estudados.

Clones individuais foram inoculados em 2TY com glucose a 2% e 100 pg/ml de carbenicilina em placas de cultura de tecidos de 96 poços e criadas até à turbidez. As culturas foram então identificadas a uma m.o.i. de 10 com o fago ajudante M12K07 e as células infectadas foram transferidas para meio 2YT contendo carbenicilina (100 pg/ml) e canamicina (50 pg/ml) para crescimento de um dia para o outro a 30°C com agitação suave.

Placas de microtitulo NUNC MAXISORP foram revestidas com 50 μΐ por poço de imunoadesina de ECD de Apo-2 ou CD4-IgG a 2 pg/ml em tampão carbonato 50 mM (pH 9,6), a 4°C de um dia para o outro. Após remoção do antigénio, as placas foram bloqueadas 90 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ com leite seco a 3% em PBS (MPBS) durante 2 horas à temperatura ambiente.

As culturas de fagos foram centrifugadas e 100 μΐ de sobrenadantes contendo fagos foram bloqueados com 20 μΐ de PBS βχ/leite seco a 18% durante 1 hora à temperatura ambiente. O bloqueio foi removido das placas de título e os fagos bloqueados adicionados e deixados a ligar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, os fagos foram detectados com uma diluição de 1:5000 de anticorpo anti-Ml3 conjugado com peroxidase de rábano (Pharmacia) em MPBS seguido de 3 ', 3 ', 5',5'-tetrametilbenzidina (TMB). As reacções foram paradas através da adição de H2S04 e as leituras tomadas subtraindo a A^nm da A45onm· C. Impressão digital de ADN dos clones A diversidade dos clones que se ligaram a Apo-2 foi determinada através de amplificação por PCR da inserção de scFv utilizando os iniciadores pUC19R (5'AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG 3') (SEQ. ID. NO: 12) que se liga a montante da sequência de comando e fdtetseq (5' GTC GTC TTT CCA GAC GGT AGT 3') (SEQ. ID. NO: 13) que se liga na extremidade 5' do gene III, seguida de digestão com a enzima de restrição de corte frequente BstNI.

Impressão digital de ADN: Protocolo

Mistura A: dH20 67 μΐ tampão ampliTaq 10x 10 MgCl2 25 mM 10 DMSO, 50% 2 iniciador directo 1 Mistura B: dNTP 2,5 mM 8 μΐ AMPLITAQ 0,5 iniciador inverso ι,ο 90 μΐ da Mistura A foram colocados num tubo de reacção e foram depois inoculados com uma porção muito pequena de colónias de E. coli utilizando uma ponta amarela. A mistura reaccional foi então aquecida num bloco de PCR a 98°C, durante 3 minutos, removida e colocada em gelo. 10 μΐ de Mistura B foram então 91 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ adicionados e a mistura reaccional foi sujeita a ciclos térmicos de 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 1 minuto e 20 s, durante 25 ciclos num termociclador Perkin Elmer 2400. 10 μΐ do produto de reacção resultante foram então removidos e corridos num gel de agarose a 1% para testar quanto a uma banda de 1 kb. A mistura restante foi levada para tampão de reacção de BstNl lx, foram adicionadas 5 unidades de BstNl e o ADN foi deixado a digerir durante 2 horas a 60°C. As amostras resultantes foram então sujeitas a electroforese num gel de acrilamida GeneGel Excel a 12,5% (Pharmacia Biotech). D. Sequenciação dos clones

Foi obtida a sequência nucleotídica dos clones representativos de cada padrão de impressão digital. As colónias foram inoculadas em 50 ml de meio LB suplementado com glucose a 2% e 100 pg/ml de carbenicilina e criadas de um dia para o outro a 30°C. O ADN foi isolado utilizando Qiagen Tip-lOOs e o protocolo do fabricante e sequenciação cíclica com terminadores da cadeia didesoxi fluorescentes (Applied Biosystems). As amostras foram corridas num sequenciador de ADN automático Applied Biosystems 373A e as sequências analisadas utilizando o programa "Sequencher" (Gene Codes Corporation). As sequências nucleotídicas dos anticorpos seleccionados 16E2, 20E6 e 24C4 são mostradas em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8, respectivamente (nas Figuras 15A, 15B e 15C, respectivamente). As sequências de aminoácidos correspondentes dos anticorpos 16E2, 20E6 e 24C4 são mostradas em SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, e SEQ ID NO:ll, respectivamente (e na Figura 16). Adicionalmente, a Figura 16 identifica a região de sinal e as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e leve (sublinhadas) destas moléculas scFv. As regiões CDR mostradas na Figura 16 foram também atribuídas de acordo com os métodos de Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publ. N.° 91-3242, 5a Edição. E, Purificação dos scFv com (his)6

Para a purificação proteica do anticorpo solúvel, a estirpe 33D3 de E. coli foi transformada com ADN fagemídico. Foram utilizados 5 ml de 2YT com carbenicilina e glucose para 92 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ criar culturas de um dia para o outro a 30°C. 2,5 ml destas culturas foram diluídos em 250 ml do mesmo meio e criados até uma D06oo de aproximadamente 1,2. As células foram sedimentadas e ressuspensas em 500 ml de 2YT contendo iptg (1 mM) e carbenicilina (100 pg/ml) para induzir a expressão e criadas durante mais 16 horas a 22°C. Os sedimentos celulares foram colhidos e congelados a -20°C.

Os anticorpos foram purificados através de cromatografia de afinidade com quelante metálico imobilizado (IMAC). Os sedimentos congelados foram ressuspensos em 10 ml de tampão de choque gelado (Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM, sacarose a 20%, PMSF 1 mM) através de agitação em gelo durante 1 hora. Foi adicionado imidazole a 20 mM e os restos celulares removidos através de centrifugação. Os sobrenadantes foram ajustados a MgCl2 1 mM e tampão fosfato 50 mM, pH 7,5. A resina de Ni-NTA-agarose de Qiagen foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. A resina foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazole 20 mM e foi adicionado o tampão de choque. A ligação ocorreu em modo de fornada ou numa coluna de fluxo por gravidade. A resina foi então lavada duas vezes com 10 volumes de leito de tampão de equilíbrio e duas vezes com tampão contendo imidazole aumentado para 50 mM. A eluição das proteínas foi com tampão fosfato 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM e imidazole 250 mM. O excesso de sal e de imidazole foi removido numa coluna PD-10 (Pharmacia), e as proteínas foram concentradas utilizando uma Centricom 10 até um volume de cerca de 1 ml. A concentração foi estimada espectrofotometricamente assumindo uma A280nm de 1,0 = 0,6 mg/ml. F. Ensaios para determinar a especificidade de ligação dos scFv anti-Apo-2

Para avaliar a especificidade de cada um dos clones de scFv, foram efectuados ensaios ELISA para avaliar a ligação de 16E2, 20E6 e 24C4 a ECD-Ig de Apo-2, DR4-Ig, DcRl-Ig, DcR2-Ig e CD4-Ig (descritos acima e nos Exemplo 12).

Em resumo, placas de ELISA NUNC foram revestidas com 50 μΐ de uma molécula de imunoadesina receptor-lg a 1 pg/ml em 93 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ tampão carbonato de sódio 0,05 Μ, ρΗ 9,5, e deixadas a incubar de um dia para o outro a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 285 μΐ de diluente de ELISA (PBS suplementado com BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,05%, pH 7,4) durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Foram adicionados 50 μΐ dos scFv às placas numa diluição em série de 1:5 e deixou-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após esta diluição de 1 hora, as placas foram lavadas 6 vezes com PBS/Tween a 0,05%. Após a ligação às placas revestidas com o antigénio, o scFv solúvel foi detectado através da adição de 50 μΐ de Mab 9E10 a 1 pg/ml (um anticorpo anti-c-myc; ATCC CRL 1729) por poço deixando-se as placas a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem das placas 6 vezes com PBS/Tween a 0,05%, foram adicionados às placas 50 μΐ de uma diluição 1:5000 de anticorpo anti-IgG de murideo conjugado com peroxidase de rábano (catálogo Cappel: 55569) em MPBS e deixou-se a incubar durante 1 hora. Gerou-se um sinal observável através da adição de 50 μΐ de substrato da peroxidase, 3',3',5',5'-tetrametilbenzidina (tmb) (kpl n.° de catálogo: 50-76-00). As reacções foram paradas através da adição de H2S04 e as leituras tomadas através da subtracção da A405 nm da a45

Onm ·

Tal como ilustrado nas Figuras 12A, 12B e 12C, os ensaios ELISA mostraram que cada um destes anticorpos exibia um grau relativamente elevado de especificidade para Apo-2.

Ensaios adicionais utilizando células transfectadas mostraram também a especificidade do anticorpo 16E2 para Apo-2. Especificamente, foram efectuadas experiências de imuno-histoquimica para avaliar a especificidade de ligação do anticorpo 16E2 a células transfectadas com Apo-2 e DR4. As células foram transfectadas com vector sozinho ou com vector contendo o gene para Apo-2 ou DR4. As células transfectadas foram removidas das placas de cultura, sedimentadas e lavadas duas vezes com PBS. Os sedimentos foram então ressuspensos em O.C.T. (Fisher), congelados rapidamente em isopentano e n2L, e depois seccionados utilizando protocolos padrão. A coloração das células seccionadas foi efectuada utilizando um estojo Vectastain Elite ABC. As secções foram incubadas com anticorpo anti-Apo-2 16E2 ou um anticorpo de cadeia simples de controlo negativo. O anticorpo secundário empregou um anticorpo 9E10 94 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ anti-c-myc biotinilado ou um anticorpo anti-Penta His (Qiagen) seguido de anti-lgG de ratinho biotinilado.

Este ensaio de imuno-histoquímica mostrou coloração especifica das células transfectadas com Apo-2 mas não das células transfectadas com DR4. A coloração celular foi predominantemente citoplasmática. EXEMPLO 15

Ensaio da Capacidade dos scFv Marcados com His para Induzir Apoptose de Modo Agonista A. Ensaios de 96 Poços de Anexina V-biotina/Estreptavidina-[S35]

Anticorpos scFv purificados (tais como descritos no Exemplo 14 acima) foram testados quanto à capacidade para induzirem apoptose mediada por Apo-2.

Em resumo, células SK-MES-1 (linha celular de carcinoma do pulmão humano; ATCC HTB 58) ou células HCT 116 (linha celular de carcinoma do cólon humano; ATCC CCL 247) (4xl04 células/poço foram divididas em aliquotas em placas de 96 poços em meio de ensaio (mistura 1:1 de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco sem vermelho de fenol e mistura de nutrientes de F12 de Ham sem vermelho de fenol suplementada com soro fetal bovino a 10%, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina) e deixou-se a aderir de um dia para o outro a 37°C. O meio foi então removido e foram adicionados aos poços 0,1 ml do meio de ensaio contendo scFv a uma concentração final de 50 pg/ml (16E2 ou 20E6) (diluições em série de 1:2 efectuadas nas placas) e deixou-se a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Outros anticorpos de cadeia simples foram utilizados como controlos negativos: um clone de scFv anti-factor tecidual, 7D5, ou um scFv referido como 19B8. Após a incubação de 1 hora com anticorpo scFv, foram adicionados aos poços apropriados 0,1 ml do anticorpo anti-His (Qiagen, N.° de cat. 1007671) ou anti-c-myc a 10 pg/ml. Os poços que não receberam um anticorpo de ligação cruzada receberam apenas meio. As placas foram então deixadas a incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. 95 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Após a incubação de 30 minutos, foram adicionados aos poços apropriados 0,1 ml de anticorpo de cabra anti-lgG de ratinho a 10 pg/ml (ICN N.° de cat. 67-029). Os poços que não receberam anticorpo anti-lgG receberam apenas meio. As placas foram então colocadas numa incubadora durante 15 minutos para permitir que o pH regressasse a 7,0. Para os controlos positivos, foi adicionada aos poços apropriados uma solução de 2 pg/ml de ligando de Apo-2 (Apo-2L) (preparada tal como descrito no Exemplo 11) em tampão fosfato de potássio a pH 7,0, com diluições em série de 2 vezes realizadas na placa. Os poços dos controlos negativos receberam apenas meio. As células foram então incubadas de um dia para o outro a 37°C na presença de C02 a 5%. Foram então adicionados aos poços 0,05 ml de anexina V-biotina (1 pg/ml) em tampão de ligação de Ca2+ 2x (NeXins B.V.) e depois deixou-se a misturar num agitador durante 30 minutos. Foram então adicionados aos poços 0,05 ml de estreptavidina-[S35] (concentração final de 2,5xl04 cpm/poço) (Amersham) em tampão de ligação de Ca2+ 2x e deixou-se depois a misturar num agitador durante 30 minutos. As placas foram então seladas e centrifugadas durante 4 minutos a 1500 rpm. Para avaliar a extensão da apoptose, as placas foram então contadas num Contador Trialux Microbeta (Wallace) para se obterem os valores de cpm correspondentes à ligação da Anexina V.

Tal como mostrado nas Figuras 13C e 14B, os anticorpos 16E2 e 20E6 induziram apoptose de modo agonista em células SK-MES-1. B. Ensaios de Violeta Cristal

Para além do ensaio de anexina V-biotina/estreptavidina-[S35] descrito acima, os anticorpos scFv (tal como descritos no Exemplo 14) foram testados quanto à actividade para induzir apoptose mediada por Apo-2 através de ensaios utilizando violeta cristal.

Em resumo, as células SK-MES-1 foram colocadas a 4χ104 células/poço num meio de ensaio (descrito na Secção A acima) e deixadas a aderir de um dia para o outro a 37°C. O meio foi removido e foram adicionados aos poços apropriados 0,1 ml de meio de ensaio contendo scFv (tal como descrito na 96 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Secção A acima) a uma concentração final de 50 pg/ml (os poços sem scFv adicionado receberam uma mudança de meio). Os poços seleccionados receberam amostras "pré-complexadas" nas quais foram combinados 10 pg/ml de scFv 16E2 com 100 pg/ml de anticorpo anti-His durante 5 horas a 4°C com mistura continua antes da adição à placa. As placas foram deixadas a incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. O meio de scFv foi removido e foram adicionados aos poços 0,1 ml de anticorpos anti-His (Qiagen, n.° de cat. 1007671) ou anti-c-myc a 10 pg/ml diluídos num meio de ensaio (os poços sem o agente de ligação cruzada receberam uma mudança de meio) . As placas foram então deixadas a incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. O meio foi então removido e foram adicionados aos poços apropriados 0,1 ml de anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho a 10 pg/ml (Fragmento Fc específico de ICN n.° de cat. 67-029) diluído em meio de ensaio (os poços sem anti-Fc receberam uma mudança de meio). As placas foram então colocadas na incubadora durante 15 minutos para permitir que o pH voltasse a 7,0. O Apo-2L (reserva a 100 pg/ml em tampão fosfato de potássio, pH 7,0) foi diluído a 2 pg/ml e foram adicionados aos poços apropriados 0,1 ml. Foram realizadas duas diluições em série na placa. As placas foram então incubadas de um dia para o outro a 37°C.

Todo o meio foi removido dos poços e as placas foram então inundadas com solução de violeta cristal. As placas foram deixadas a corar durante 15 minutos. O violeta cristal foi removido inundando as placas com água da torneira a correr. As placas foram então deixadas a secar de um dia para o outro.

As placas foram lidas num leitor de placas SLT a 540 nm e os dados analisados utilizando uma macro de Excel e 4p-Fit.

Tal como mostrado nas Figuras 13A, 13B, 14A e 14B, os anticorpos 16E2 e 20E6 induziram apoptose de modo agonista em células SK-MES-1. 97 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ EXEMPLO 16

Ensaio da Capacidade de scFv Marcados com qD para Induzir Apoptose de modo Agonista

Uma forma marcada com gD purificada do scFv 16E2 foi testada quanto à capacidade para induzir apoptose mediada por Apo-2 num ensaio de violeta cristal tal como descrito no Exemplo 15 acima.

A. Construção de scFv com o marcador gD 0 fragmento Sfi I a Not I da forma scFv de 16E2 foi subclonado num derivado de pAK19 (Cárter et al., "Methods: A Companion to Methods in Enzymology", 3: 183-192, 1991) contendo o promotor phoA e a sequência de sinal stll em vez do promotor lacZ e a sequência de sinal híbrida da biblioteca original. Para maior facilidade de purificação, um fragmento de ADN codificando para 12 aminoácidos (met-ala-asp-pro-asn-arg-phe-arg-gly-lys-asp-leu, SEQ ID NO:14) derivado da glicoproteína D do vírus herpes simplex de tipo 1 (Lasky et al., DNA 3: 23-29, 1984) foi sintetizado e inserido na extremidade 3' do domínio VL em vez do epítopo (his)6 e c-myc originalmente presente nos clones da biblioteca de Cambridge Antibody Technologies. B. Expressão em E. coli 0 plasmídeo contendo o gene para scFv 16E2-gD foi transformado para a estirpe 33D3 de E. coli para expressão em culturas em balão de agitação. Foram utilizados 5 ml de 2YT com carbenicilina e glucose para criar culturas de um dia para o outro a 30°C. 2,5 ml destas culturas foram diluídos em 250 ml do mesmo meio e criados até uma D06oo de aproximadamente 1,0. As células foram sedimentadas e ressuspensas em 500 ml de Meio Mínimo AP-5 Modificado contendo carbenicilina (100 pg/ml) e criadas durante mais 16 horas a 30°C. As células foram então sedimentadas e congeladas.

C. Purificação de scFv com o marcador gD A pasta celular congelada foi ressuspensa a 1 g/10 ml de tampão de choque (Tris-HCl 25 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM, sacarose a 20%, pmsf 1 mM, pH 7,2) e suavemente agitada 4 horas em gelo. A suspensão celular foi então processada 98 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ através de uma microfluidificadora Polytron (Brinkman). Os restos celulares foram removidos através de centrifugação a 10000 xg durante 30 minutos. Após filtração através de um filtro de 0,22 micrómetros, o sobrenadante foi carregado numa coluna de afinidade (2,5 χ 9,0 cm) consistindo num anticorpo anti-gD 5B6 (Paborsky et al., Protein Engineering 3: 597-553, 1990) ligado a CNBr-Sepharose que tinha sido equilibrada com PBS. A coluna foi lavada 18 horas com PBS até a absorvância do efluente da coluna ser equivalente ao limiar. Todos os passos foram realizados a 4°C a um caudal linear de 25 cm/hora. A eluição foi efectuada com ácido acético 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 2,9. As fracções da coluna foram monitorizadas através da absorvância a 280 nm e as fracções de pico reunidas, neutralizadas com Tris 1,0 M, pH 8,0, dialisadas contra PBS e esterilizadas por filtração. As preparações proteicas resultantes foram analisadas através de SDS-PAGE não redutor. D. Ensaio de Violeta Cristal O ensaio de apoptose foi efectuado essencialmente tal como descrito no Exemplo 15 (B) acima excepto que as amostras foram diluidas em série 1:3 nas placas e o anticorpo marcado 16E2-gD foi testado para além de outras duas preparações de scFv 16E2 (referidas como Prep. A e Prep. B na Figura 14C). Os resultados do ensaio mostrando indução de apoptose em células SK-MES-1 pelo anticorpo 16E2-gD são ilustrados na Figura 14C.

Depósito de Material O seguinte material foi depositado na American Type Culture Collection, 10801 University Bouevard, Manassas, Virgínia, USA (ATCC):

Material Dep. ATCC N.° Data do Depósito pRK5-Apo-2 209021 8 de Maio de 1997 3F11.39.7 HB-12456 13 de Janeiro de 1988

Este depósito foi efectuado segundo as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seu Regulamento (Tratado de Budapeste). Este assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos desde a data do depósito. O depósito será 99 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ tornado disponível pela ATCC segundo os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e sem restrições da descendência da cultura do depósito ao público após concessão da Patente U.S. pertinente ou após disponibilização ao público de qualquer pedido de patente dos E.U.A. ou estrangeiro, conforme o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da descendência a quem determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks a ela ter direito de acordo com 35 USC Section 122 e as regras do Commissioner que se lhes aplicam (incluindo a 37 CFR Section 1.14 com particular referência a 886 OG 638). 0 cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura dos materiais depositados morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos por outros iguais após notificação. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para a prática do presente invento em contravenção com os direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes. 0 fascículo acima escrito é considerado suficiente para permitir que um perito na especialidade ponha em prática o presente invento. 0 presente invento não deve ser limitado no seu âmbito pela construção depositada, uma vez que a concretização depositada pretende ser uma simples ilustração de certos aspectos do presente invento e quaisquer construções que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito deste invento. 0 depósito do material não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida seja inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto do presente invento, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser entendido como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. De facto, várias modificações do presente invento para além das mostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes para os peritos na especialidade a partir da descrição antecedente e recaem dentro do âmbito das reivindicações anexas. 100 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (1) REQUERENTE: Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DA INVENTO: Anticorpo anti-Apo-2 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 14 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 1 DNA Way (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete 3,5 polegadas, 1,44 Mb

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech) (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/857216 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 15-MAIO-1997 (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 09/020746 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 09-FEV-1998 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Diane L. Marschang, (B) NÚMERO DE REGISTO: 35,600

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: P1101R2PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 650/225-5416 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 411 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Met Glu Gin Arg Gly Gin Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg 1 . 5 10 15

Lys Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro 20 25 30 101 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Gly Leu Arg Vai Pro Lys Thr Leu Vai Leu Vai Vai Ala Ala Vai 35 40 45 Leu Leu Leu Vai Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gin Gin Asp 50 55 60 Leu Ala Pro Gin Gin Arg Ala Ala Pro Gin Gin Lys Arg Ser Ser 65 70 75 Pro Ser Glu Gly Leu Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp 80 85 90 Gly Arg Asp Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gin Asp Tyr Ser Thr 95 100 105 His Trp Asn Asp Leu Leu Phe Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp 110 115 120 Ser Gly Glu vai Glu Leu Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr 125 130 135 Vai Cys Gin Cys Glu Glu Gly Thr Phe Arg Glu Glu Asp Ser Pro 140 145 150 Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Vai 155 160 165 Lys Vai Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile Glu Cys Vai His 170 175 180 Ly s Glu Sei /“ 1 . . oiy Ile Ile I Is . . 13 .Ly 4 ) . I v αχ <PL 1 t IX Vai M , ma Ά 1 ^ γλ x a Vai ιτ-,Τ v αχ 185 190 195 Leu Ile Vai Ala Vai Phe Vai Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys 200 205 210 Vai Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp 215 220 225 Pro Glu Arg Vai Asp Arg Ser Ser Gin Arg Pro Gly Ala Glu Asp 230 235 240 Asn Vai Leu Asn Glu Ile Vai Ser Ile Leu Gin Pro Thr Gin Vai 245 250 255 Pro Glu Gin Glu Met Glu Vai Gin Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly 260 265 270 Vai Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro 275 280 285 Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gin Arg Arg Arg Leu Leu Vai Pro Ala 290 295 300 Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gin Cys Phe Asp Asp 305 310 315 Phe Ala Asp Leu Vai Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg 320 325 330 Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys Vai Ala Lys Ala Glu 335 340 345 102 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trc 350 355 360 Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Aso 365 370 375 Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gin Lys Ile Glu 380 385 390 Asp His Deu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn 395 400 405 Ala Asp Ser Ala Xaa Ser 410 411 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1799 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO : 2 : CCCACGCGTC CGCATAAATC AGCACGCGGC CGGAGAACCC CGCAATCTCT 50 GCGCCCACAA AATACACCGA CGATGCCCGA TCTACTTTAA GGGCTGAAAC 100 CCACGGGCCT GAGAGACTAT AAGAGCGTTC CCTACCGCC ATG GAA 145

Met GlU 1 CAA CGG GGA CAG AAC GCC CCG GCC GCT TCG GGG GCC CGG 184 Gin Arg Gly Gin Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg 5 10 15 AAA AGG CAC GGC CCA GGA CCC AGG GAC- GCG CGG GGA GCC 223 Lys Ara His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala 20 25 AGG CCT GGG CTC CGG GTC CCC AAG ACC CTT GTG CTC GTT 262 Arg Pro Gly Leu Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val 30 35 40 GTC GCC GCG GTC CTG CTG TTG GTC TCA GCT GAG TCT GCT 301 Val Ala Ala Val Leu Leu Leu Val Ser Ala Glu Ser Ala 45 50 CTG ATC ACC CAA CAA GAC CTA GCT CCC CAG CAG AGA GCG 340 Leu Ile Thr Gin Gin Asp Leu Ala Pro Gin Gin Arg Ala 55 60 65 GCC CCA CAA CAA AAG AGG TCC AGC CCC TCA GAG GGA TTG 379 Ala Pro Gin Gin Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 70 75 80 TGT CCA CCT GGA CAC CAT ATC TCA GAA GAC GGT AGA GAT 418 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp 85 90 103 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ TGC ATC TCC TGC AAA TAT GGA CAG GAC TAT AGC ACT CAC 4 57 Cys Ile Ser Cys Lys Tyr Gly Gin Asp Tyr Ser Thr His 95 100 105 TGG AAT GAC CTC CTT TTC TGC TTG CGC TGC 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Ser Gly Gly Gly 215 220 GGG GAC CCT GAG CGT GTG GAC AGA AGC TCA CAA CGA CCT 847 Gly Asp Pro Glu Arg Vai Asp Arg Ser Ser Gin Arg Pro 225 230 235 GGG GCT GAG GAC AAT GTC CTC AAT GAG ATC GTG AGT ATC 886 Gly Ala Glu Asp Asn Vai Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile 240 245 TTG CAG CCC ACC CAG GTC CCT GAG CAG GAA ATG GAA GTC 925 Leu Gin Pro Thr Gin Vai Pro Glu Gin Glu Met Glu Val 250 255 260 CAG GAG CCA GCA GAG CCA ACA GGT GTC AAC ATG TTG TCC 964 Gin Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Vai Asn Met Leu Ser 265 270 275 CCC GGG GAG TCA GAG CAT CTG CTG GAA CCG GCA GAA GCT 1003 Pro Gly Glu Ser Glu Hís Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala 280 285 GAA AC-G TCT CAG AGG AGG AGG CTG CTG GTT CCA GCA AAT 1042 Glu Arg Ser Gin Arg Arg Arg Leu Leu val Pro Ala Asn 290 295 300 104 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ GAA GGT GAT CCC ACT GAG ACT CTG AGA CAG TGC TTC GAT 1081 Glu Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gin Cys Phe Asp 305 310 GAC TTT GCA GAC TTG GTG CCC TTT GAC TCC TGG GAG CCG 1120 ASp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp Ser Trp Glu Pro 315 320 325 CTC ATG AGG AAG TTG GGC CTC ATG GAC AAT GAG ATA AAG 1159 Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile Lys 330 335 340 GTG GCT AAA GCT GAG GCA GCG GGC CAC AGG GAC ACC TTG 1198 Vai Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu 345 350 TAC ACG ATG CTG ATA AAG TGG GTC AAC AAA ACC GGG CGA 1237 Tyr Thr Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg 355 360 365 GAT GCC TCT GTC CAC ACC CTG CTG GAT GCC TTG GAG ACG 1276 Asp Ala Ser Val His Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr 370 375 CTG GGA GAG AGA CTT GCC AAG CAG AAG ATT GAG GAC CAC 1315 Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gin Lys Ile Glu Asp His 380 385 390 TTG TTG AGC TCT GGA AAG TTC ATG TAT CTA GAA GGT AAT 1354 Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu Gly Asn 395 400 405 GCA GAC TCT GCC WTG TCC TAAGTGTG ATTCTCTTCA GGAAGTGAGA 1400 Ala Asp Ser Ala Xaa Ser 410 411 CCTTCCCTGG TTTACCTTTT TTCTGGAAAA AGCCCAACTG GACTCCAGTC 1450 AGTAGGAAAG TGCCACAATT GTCACATGAC CGGTACTGGA AGAAACTCTC 1500 CCATCCAACA TCACCCAGTG GATGGAACAT CCTGTAACTT TTCACTGCAC 1550 TTGGCATTAT TTTTATAAGC TGAATGTGAT AATAAGGACA CTATGGAAAT 1600 GTCTGGATCA TTCCGTTTGT GCGTACTTTG AGATTTGGTT TGGGATGTCA 1650 TTGTTTTCAC AGCACTTTTT TATCCTAATG TAAATGCTTT ATTTATTTAT 1700 TTGGGCTACA TTGTAAGATC CATCTACAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAG 1750 GGCGGCCGCG ACTCTAGAGT CGACCTGCAG AAGCTTGGCC GCCATGGCC : 1799 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 70 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GGGAGCCGCT CATGAGGAAG TTGGGCCTCA TGGACAATGA GATAAAGGTG 50 GCTAAAGCTG AGGCAGCGGG 70 105 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:4: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: ATCAGGGACT TTCCGCTGGG GACTTTCCG 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) 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Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Vai Arg 65 70 75 CAA GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCT GGT ATT 270 GXn Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ser Gly Ile 80 85 90 ΑΑΤ TGG AAT GGT GGT AGC ACA GGA TAT GCA GAC TCT GTG 309 Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Vai 95 100 AAG GGC CGA GTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAC 348 Lys Gly Arg Vai Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 105 110 115 TCC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC 387 Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 120 125 ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA ATC CTG GGT GCC GGA 426 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly 130 135 140 CGG GGC TGG TAC TTC GAT CTC TGG GGG AAG GGG ACC ACG 465 Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Lys Gly Thr Thr 145 150 155 GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT 504 Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 160 165 GGC AGC GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC 543 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp 170 175 180 CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC 582 Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin Thr Vai Arg Ile 185 190 ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC 621 Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 195 200 205 TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC 660 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Val 210 215 220 ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG ccc TCA GGG ATC CCA GAC 699 Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp 225 230 CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG 738 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu 235 240 245 ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT 777 Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 250 255 TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA 816 Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Vai Val 260 265 270 TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT GCG GCC 855 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala 275 280 285 GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA 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AGT AGC TAT TGG ATG AGC TGG GTC CGC 231 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg 65 70 75 CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCC AAC ATA 270 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile 80 85 90 AAG CAA GAT GGA AGT GAG AAA TAC TAT GTG GAC TCT GTG 309 Lys Gin ASp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 95 100 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC GCC AAG AAC 348 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 105 110 115 TCA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC 387 Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 120 125 108 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT CTT TTA AAG GTC 426 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Lys Val 130 135 140 AAG GGC AGC TCG TCT GGG TGG TTC GAC CCC TGG GGG AGA 4 65 Lys Gly Ser Ser Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Arg 145 150 155 GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA GGC GGT TCA 504 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 160 165 GGC GGA GGT GGT AGC GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG 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Leu 275 280 285 GGT GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA 894 Gly Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala 290 295 GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC 933 Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 300 305 310 GCA TAG 939

Ala 312 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 933 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear 109 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTT GGA GCC TTT TTT 36 Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe 1 5 10 TTG GAG ATT TTC AAC GTG AAA AAA TTA TTA TTC GCA ATT 75 Leu Glu Ile Phe Asn Vai Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile 15 20 25 CCT TTA GTT GTT CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG 114 Pro Leu Vai Vai Pro Phe Tyr Ala Ala Gin Pro Ala Met 30 35 GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC 153 Ala Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Vai Vai 40 45 50 CAG CCT GGG CGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCT TCT 192 Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys ALa Ala Ser 55 60 GGG TTC ATT TTC AGT AGT TAT GGG ATG CAC TGG GTC CGC 231 Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Vai Arg 65 70 75 CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GGT ATT 270 Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Gly Ile 80 85 90 TTT TAT GAT GGA GGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 309 Phe Tyr Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 95 100 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC 348 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 105 110 115 ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC 387 Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 120 125 ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT AGG GGC TAC TAC 426 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr 130 135 140 TAC ATG GAC GTC TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC 465 Tyr Met Asp Vai Trp Gly Lys Gly Thr Thr Vai Thr Vai 145 150 155 TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC 504 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 160 165 GGT GGC GGA TCG CAG TCT GTG TTG ACG CAG CCG ccc TCA 543 Gly Gly Gly Ser Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser 170 175 180 110 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ GTG TCT GGG GCC CCA GGA CAG AGG GTC ACC ATC TCC TGC 582 Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Vai Thr Ile Ser Cys 185 190 ACT GGG AGA AGC TCC AAC ATC GGG GCA GGT CAT GAT GTA 621 Thr Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly His Asp Vai 195 200 205 CAC TGG TAC CAG CAA CTT CCA GGA ACA GCC CCC AAA CTC 660 His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 210 215 220 CTC ATC TAT GAT GAC AGC AAT CGG CCC TCA GGG GTC CCT 699 Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Vai Pro 225 230 GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGG TCT GGC ACC TCA GCC TCC 738 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser 235 240 245 CTG GCC ATC ACT GGG CTC CAG GCT GAA GAT GAG GCT GAT 777 Leu Aia Ile Thr Gly Leu Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp 250 255 TAT TAC TGC CAG TCC TAT GAC AGC AGC CTG AGG GGT TCG 816 Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Arg Gly Ser 260 265 270 GTA TTC .GGC GGA GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT GCG 855 Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Gly Ala 275 280 285 GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA GAA CAA 894 Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin 290 295 AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA 930 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 300 305 310 TAG 933 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 309 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile 1 5 10 15 Phe Asn Vai Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Vai Vai Pro 20 25 30 Phe Tyr Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Glu Vai Gin Leu Vai Gin 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Vai Glu Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 50 55 60 111 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp 65 70 75 Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile 80 85 90 Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser val Lys Gly 95 100 105 Arg Vai Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 110 115 120 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 125 130 135 Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Leu Trp 140 145 150 Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 155 160 165 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gin 170 175 180 Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Arg Ile Thr 185 190 195 Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin 200 205 210 Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn 215 220 225 Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 230 235 240 Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu Asp 245 250 255 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 260 265 270 Vai Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala 275 280 285 Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile 290 295 300 Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 305 309 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 312 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10:

Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile 15 10 15 112 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ

Phe Asn Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro 20 25 30 Phe Tyr Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Gly Val Gin Leu Val Glu 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 50 55 60 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp 65 70 75 Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile 80 85 90 Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly 95 100 105 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 110 115 120 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 125 130 135 Ala Arg Asp Leu Leu Lys Val Lys Gly Ser Ser Ser Gly Trp Phe 140 145 150 Asp Pro Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 155 160 165 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu 170 175 180 Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr Val 185 190 195 Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 200 205 210 Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 215 220 225 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 230 235 240 Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin 245 250 255 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser 260 265 270 Gly Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 275 280 285 Gly Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin 290 295 300 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 305 310 312 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 310 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear 113 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID ) NO : 11 : Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Phe Gly Ala Phe Phe Leu Glu Ile 1 5 10 15 Phe Asn Vai Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro 20 25 30 Phe Tyr Ala Ala Gin Pro Ala Met Ala Gin Val Gin Leu Val Gin 35 40 45 Ser Gly Gly Gly Vai Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser 50 55 60 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp 65 70 75 Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile 80 85 90 Phe Tyr Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 95 100 105 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 110 115 120 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 125 130 135 Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly 140 145 150 Thr Thr Vai Thr val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 155 160 165 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro 170 175 180 Ser Vai Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr 185 190 195 Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly HiS Asp Val HiS Trp Tyr 200 205 210 Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp 215 220 225 Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg 230 235 240 Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gin Ala Glu 245 250 255 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Arg 260 265 270 Gly Ser Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Thr Val Leu Gly Ala 275 280 285

Ala Alâ His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu 290 295 300 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 305 310 114 ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:12: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12 AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: Simples (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13 GTCGTCTTTC CAGACGGTAG T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14

Met Ala Asp Pio Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu 1 5 10 12

Lisboa

Claims (21)

1. ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal que (a) se liga ao polipéptido Apo-2 consistindo nos residuos de aminoácido 1 a 411 de SEQ ID NO: 1 e (b) induz apoptose em pelo menos um tipo de células de mamífero in vivo ou ex vivo que expressam o referido polipéptido Apo-2.
2. 2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 que se liga a uma sequência do domínio extracelular de um polipéptido Apo-2 que consiste nos aminoácidos 54 a 182 de SEQ ID NO:1.
3. 3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 que se liga a uma sequência do domínio extracelular de um polipéptido Apo-2 que consiste nos aminoácidos 1 a 182 de SEQ ID NO:1.
4. 4. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 que (a) se liga a uma sequência do domínio extracelular do polipéptido Apo-2 que consiste nos aminoácidos 54 a 182 de SEQ ID N0:1 e (b) induz apoptose em pelo menos um tipo de células de cancro de mamifero in vivo ou ex vivo.
5. 5. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico.
6. 6. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 5, em que o anticorpo está fundido com uma sequência de aminoácidos heteróloga.
7. 7. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 6, em que a sequência de aminoácidos heteróloga compreende uma sequência de imunoglobulina.
8. 8. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado. ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 2/3
9. 9. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo é um anticorpo humano.
10. 10. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o referido pelo menos um tipo de células de mamífero é uma célula de cancro.
11. 11. Molécula homodimérica compreendendo quaisquer dois anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
12. 12. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal ou uma molécula homodimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. 13. Anticorpo monoclonal ou molécula homodimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para utilizar em terapia.
14. 14. Utilização de um anticorpo contra Apo-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para a preparação de um medicamento para induzir apoptose em células de mamífero que expressem o receptor Apo-2.
15. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que as células de mamífero que expressam o receptor Apo-2 são células de cancro.
16. 16. Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que as células de cancro são células de cancro do pulmão, células de cancro do cólon, células de sarcoma, células de linfoma ou células de glioma.
17. 17. Utilização de um anticorpo contra Apo-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro é cancro do pulmão, cancro do cólon, sarcoma, linfoma ou glioma. ΕΡ Ο 981 618/ΡΤ 3/3
19. 19. Método in vitro de indução de apoptose em células de mamífero expressando o receptor Apo-2, que compreende a exposição das células de mamífero que expressam o receptor Apo-2, a um anticorpo contra Apo-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que as células de mamífero que expressam o receptor Apo-2 são células de cancro.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que as células de cancro são células de cancro do pulmão, células de cancro do cólon, células de sarcoma, células de linfoma ou células de glioma. Lisboa,