JP2008148695A - Apo−2レセプター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Apo-2レセプターポリペプチド、Apo-2に対する抗体、異種性アミノ酸とApo−2とのキメラ分子、およびそれらポリペプチドをコードする遺伝子核酸、さらにそれらを発現する宿主細胞とトランスジェニック動物。また、それらを利用する癌の治療法。
【選択図】なし
Description
〔発明の分野〕
本発明は、一般に、ここにApo-2と命名する新規ポリペプチドの同定、単離、及び組換え生産、及び抗Apo-2抗体に関する。
アポトーシス又は「プログラムされた細胞死」
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される[例えば、Barrら,Bio Technology,12:487-493(1994);Stellerら,Science,267:1445-1449(1995)を参照]。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる[Itohら,Cell,66:233-243(1991)]。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、癌、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している[Thompson,Science,267:1456-1462(1995)]。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している[Thompson,上掲を参照]。
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「TNF-α」)、腫瘍壊死因子-β(「TNF-β」すなわち「リンホトキシン」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX-40リガンド、4-1BBリガンド、アポ1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、及びApo-2リガンド[トレイル(TRAIL)とも称される]が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーのメンバーとして同定された[例えば、Gruss及びDower,Blood,85:3378-3404(1995);Wileyら,Immunity,3:673−682(1995);Pittiら,J.Biol.Chem.,271;12687-12690(1996);1997年1月16日に公開されたWO97/01633]。これらの分子のなかでも、TNF-α、TNF-β、CD30リガンド、4-1BBリガンド、アポ1リガンド、及びApo-2リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。TNF-αとTNF-βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘導することが報告されている[Schmidら,Proc.Natl.Acad.Sci.,83:1881(1986);Dealtryら,Eur.J.Immunol.,17:689(1987)]。ゼングらは、TNF-αがCD8ポジティブT細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している[Zhengら,Nature,377:348-351(1995)]。他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性T細胞の欠失に関与していることを報告している[Amakawaら,プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)]。
このようなTNFファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。
約55-kDa(TNFR1)と75-kDa(TNFR2)の2つの異なるTNFレセプターが同定されており[Hohmanら,J.Biol.Chem.,264:14927-14934(1989);Brockhausら,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);1991年3月20日に公開されたEP417563]、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスcDNAが単離され、特徴付けされている[Loetscherら,Cell,61:351(1990);Schallら,Cell,61:361(1990);Smithら,Science,248:1019-1023(1990);Lewisら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:2830-2834(1991);Goodwinら,Mol.Cell.Biol.,11:3020-3026(1991)]。広範な多型性が、双方のTNFレセプター遺伝子に関連している[例えば、Takaoら,Immunogenetics,37:199-203(1993)を参照]。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性TNF結合タンパク質として天然に見出される[Nophar,Yら,EMBO J.,9:3269(1990);及びKohno,Tら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:8331(1990)]。組換え体可溶性TNFレセプターのクローニングはヘイル(Hale)らにより報告されている[J.Cell.Biochem. 増補15F,1991,p.113(P424)]。
これに対して、今日までに同定されているTNFレセプター(TNFR)ファミリーのレセプター類はI型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバーで同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ECD」)において見出されている。TNF-α、アポ1リガンド及びCD40リガンドを含むTNFファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク質分解的に切断され;各場合に得られたタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、TNFレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク質分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのECDを放出する。
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも3つの重要な成分−活性化因子、阻害剤及びエフェクターを含む;線虫(C.elegans)において、これらの成分はそれぞれ3つの遺伝子、Ced-4、Ced-9及びCed-3によりコード化されている[Steller,Science,267:1445(1995);Chinnaiyanら,Science,275:1122-1126(1997)]。TNFRファミリーのメンバーの2つ、TNFR1及びFas/Apol(CD95)は、アポトーシス性細胞死を活性化し得る[Chinnaiyan及びDixit,Current Biology,6:555-562(1996);Fraser及びEvan,Cell,85:781-784(1996)]。また、TNFR1は転写因子、NF-κBの活性化を媒介することも知られている[Tartagliaら,Cell,74:845-853(1993);Hsuら,Cell,84:299-308(1996)]。ある程度のECD相同性に加えて、これら2つのレセプターは、デスドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ICD)での相同性を共有する[Tartaglia,上掲;Nagata,Cell,88:355(1997)]。また、デスドメインはアポトーシスを調節するいくつかの後生動物タンパク質、すなわちFADD/MORT1、TRADD及びRIPと称されるショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)及び哺乳動物タンパク質中においても見出されている[Cleaveland及びIhle,Cell,81:479-482(1995)]。ラベンらは、酵母-二重ハイブリッド系を使用して、TNFR1デスドメインに結合するタンパク質wsl-1の同定を報告している[Ravenら,Programmed Cell Death Meeting,9月 20-24,1995、127頁の要約;Ravenら,European Cytokine Network,7.:210頁の要約.82(1996年4-6月)]。wsl-1タンパク質はTNFR1に相同で(48%の同一性)、制限的な組織分布を有すると記載されている。ラベン(Raven)らに依れば、wsl−1の組織分布は、TNFR1結合タンパク質、TRADDとは顕著に異なる。
言われるところによれば、CD95はFADDに直接結合する一方、TNFRIはTRADDを介して間接的にFADDに結合する[Chinnaiyanら,Cell,81:505-512(1995);Boldinら,J.Biol.Chem.,270:387-391(1995);Hsuら,上掲;Chinnaiyanら,J.Biol.Chem.,271:4961-4965(1996)]。FADDは、Ced-3-関連プロテアーゼ、MACHα/FLICE(カスパーゼ8)を、死シグナル伝達複合体に補充するアダプターとなることが報告されている[Boldinら,Cell,85:803-815(1996);Mizuoら,Cell,85:817-827(1996)]。MACHα/FLICEは、細胞死プログラムのいくつかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン-1β変換酵素(ICE)及びCPP32/Yamaを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる[Fraser及びEvan,上掲]。
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、上掲のグラス(Gruss)及びダゥアー(Dower)を参照されたい。
本出願人は、本出願において「Apo-2」と命名される新規ポリペプチドをコード化したcDNAクローンを同定した。Apo-2はTNFRファミリーのメンバーであると信じられる:全長の天然配列ヒトApo-2ポリペプチドは、細胞質デスドメイン領域を含むいくつかの既知のTNFRに対してある程度の類似性を示す。また、全長の天然配列ヒトApo-2は、細胞外のシステインに富んだ反復部についてTNFRファミリーとの類似性を示す。Apo-2ポリペプチドは、カスパーゼ(caspase)依存性アポトーシスを惹起しNF-κBを活性化し得ることが見出された。本出願人は、驚くべきことに、Apo-2の可溶性細胞外ドメインがApo-2リガンド(「Apo-2L」)に結合し、Apo-2リガンドの機能を阻害可能であることを見出した。現在、Apo-2リガンドは、少なくとも2つの異なるレセプター、DR4とここに新たに記載したApo-2を介してシグナル化可能であると考えられる。
他の実施態様において、本発明はApo-2の単離されたデスドメイン配列を提供する。場合によっては、単離されたデスドメイン配列は図1のアミノ酸残基324〜391(配列番号:1)を含む。
(a)残基1〜残基411をコードする図1の核酸配列(配列番号:2)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド140−142〜1370−1372);
(b)残基1〜残基182をコードする図1の核酸配列(配列番号:2)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド140−142〜683−685);
(c)残基54〜残基182をコードする図1の核酸配列(配列番号:2)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド299−301〜683−685);
(d)残基324〜残基391をコードする図1の核酸配列(配列番号:2)のコード領域(すなわち、ヌクレオチド1109−1111〜1310−1312);又は、 (e)遺伝コードの縮退の範囲内において(a)、(b)、(c)又は(d)配列に相当する配列;
から選択される。単離された核酸には、Apo-2ポリペプチドをコード化したヌクレオチド配列を含む、ATCC 209021として寄託されているベクターのApo-2ポリペプチドcDNA挿入断片が含まれ得る。
他の実施態様において、本発明はApo-2に特異的に結合する抗体を提供する。抗体はアゴニスト、アンタゴニスト又は中和抗体であってよい。また、Apo-2抗体を含有するホモ二量体分子等の二量体分子及び単鎖抗体も提供する。
他の実施態様において、本発明は非ヒト、トランスジェニック又はノックアウト動物を提供する。
本発明のさらなる実施態様では、Apo-2又はApo-2抗体を含む製造品及びキットが提供される。
1. 配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなる天然配列Apo-2ポリペプチドと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離Apo-2ポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する請求項1に記載のApo-2ポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する請求項2に記載のApo-2ポリペプチド。
4. 配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなる単離Apo-2ポリペプチド。
5. 配列番号:1のアミノ酸残基54〜182を含んでなるApo-2ポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
6. 配列番号:1のアミノ酸残基1〜182を含んでなる請求項5に記載の細胞外ドメイン配列。
7. 配列番号:1のアミノ酸残基324〜391を含んでなるApo-2ポリペプチドの単離されたデスドメイン配列。
8. 異種性アミノ酸配列に融合した請求項5に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項1に記載のApo-2ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
9. 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項8に記載のキメラ分子。
10. 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項8に記載のキメラ分子。
11. 前記免疫グロブリン配列がIgGである請求項10に記載のキメラ分子。
12. 請求項1に記載のポリペプチド、請求項5に記載の細胞外ドメイン配列、又は請求項7に記載のデスドメイン配列をコードするDNAを含んでなる単離された核酸。
13. 前記DNAが配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなるApo-2ポリペプチドをコードする請求項12に記載の核酸。
14. 請求項12に記載の核酸を含んでなるベクター。
15. ベクターで形質転換した宿主細胞により認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項14に記載のベクター。
16. ATCC寄託受入番号209021を含んでなる請求項14に記載のベクター。
17. 請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
18. CHO細胞を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
19. 大腸菌を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
20. 酵母細胞を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
21. Apo-2ポリペプチドの発現に十分な条件下で請求項17に記載の宿主細胞を培養し、培養物から発現したApo-2ポリペプチドを回収することを含んでなるApo-2ポリペプチドの生成方法。
22. ATCC寄託受入番号209021のcDNA挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られうるApo-2ポリペプチド。
23. Apo-2ポリペプチドをコードするDNAを発現する細胞を含む非ヒト、トランスジェニック動物。
24. マウス又はラットである請求項23に記載の動物。
25. Apo-2ポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。
26. マウス又はラットである請求項25に記載の動物。
27. Apo-2ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
28. モノクローナル抗体である請求項27に記載の抗体。
29. アゴニスト抗体を含んでなる請求項27に記載の抗体。
30. 阻止抗体を含んでなる請求項27に記載の抗体。
31. キメラ抗体を含んでなる請求項24に記載の抗体。
32. 前記抗体がIgG抗体である請求項28に記載の抗体。
33. 前記抗体がFabフラグメントを含んでなる請求項28に記載の抗体。
34. 前記抗体がscFvフラグメントを含んでなる請求項28に記載の抗体。
35. 前記抗体がF(ab')2フラグメントを含んでなる請求項28に記載の抗体。
36. 前記抗体がヒト抗体を含んでなる請求項27に記載の抗体。
37. ATCC寄託番号HB-12456として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体の生物学的特徴を有している請求項28に記載の抗体。
38. ATCC寄託番号HB-12456として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体に対するエピトープと同じエピトープに結合する請求項28に記載の抗体。
39. 請求項28に記載の抗体を生成するハイブリドーマ株化細胞。
40. ATCC受入番号HB-12456として寄託されているハイブリドーマ株化細胞。
41. ATCC受入番号HB-12456として寄託されているハイブリドーマ株化細胞により生成されるモノクローナル抗体。
42. 前記抗体が単鎖抗体である請求項27に記載の抗体。
43. 前記抗体が16E2抗体を含んでなる請求項42に記載の抗体。
44. 前記抗体が20E6抗体を含んでなる請求項42に記載の抗体。
45. 前記抗体が24C4抗体を含んでなる請求項42に記載の抗体。
46. 前記抗体がエピトープタグ配列に融合している請求項42に記載の抗体。
47. 異種性アミノ酸配列に融合している請求項27に記載の抗体を含んでなるキメラ分子。
48. 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列を含んでなる請求項47に記載のキメラ分子。
49. 請求項27に記載のApo-2抗体と異種性抗体を含んでなるダイマー分子。
50. 第1のApo-2抗体と第2のApo-2抗体を含んでなるホモダイマー分子。
51. 請求項43に記載のApo-2抗体をコードするDNAを含んでなる単離された核酸。
52. 請求項44に記載の抗体をコードするDNAを含んでなる単離された核酸。
53. 請求項45に記載の抗体をコードするDNAを含んでなる単離された核酸。
54. 請求項51、52又は53のいずれか1項に記載の核酸を含んでなるベクター。
55. 請求項54に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
56. DNAが発現する条件下で請求項55に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、Apo-2抗体の生成方法。
57. 請求項27に記載の抗体と担体を含んでなる組成物。
58. 前記キャリアが製薬的に許容可能な担体である請求項57に記載の組成物。
59. 請求項29に記載のApo-2アゴニスト抗体の有効量に哺乳動物の癌細胞を暴露させることを含んでなる、哺乳動物の癌細胞においてアポトーシスを誘導させる方法。
60. 前記アゴニスト抗体が単鎖抗体を含んでなる請求項59に記載の方法。
61. Apo-2を活性化する薬剤に哺乳動物の癌細胞を暴露することを含んでなる哺乳動物の癌細胞を治療する方法。
62. 前記薬剤がApo-2アゴニスト抗体を含んでなる請求項61に記載の方法。
63. 容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がApo-2ポリペプチド又はApo-2抗体を含む製造品。
64. インビボ又はエキソビボにおいてApo-2ポリペプチド又はApo-2抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項63に記載の製造品。
I.定義
ここで使用される際の「Apo-2ポリペプチド」及び「Apo-2」という用語には、天然配列Apo-2及びApo-2変異体(ここでさらに定義される)が含まれる。これらの用語には、ヒトを含む種々の哺乳動物由来のApo-2が含まれる。Apo-2は種々の供給源、例えばヒト組織型又は他の供給源から単離されたもの、あるいは組換え又は合成法により調製されたものであってよい。
Apo-2の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
単離されたApo-2核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたApo-2核酸分子は、天然の細胞中に存在するApo-2核酸細胞とは区別される。しかし、単離されたApo-2核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色***置にあるApo-2を通常発現する細胞に含まれるApo-2核酸分子を含む。
そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここで、モノクローナル抗体は、起源の種又は免疫グロブリンクラス又はサブクラスの命名に拘わらず、定常ドメインを有する抗Apo-2抗体の可変(過剰可変を含む)ドメイン、又は重鎖を有する軽鎖、他の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、あるいは異種タンパク質との融合体をスプライシングすることによって得られるハイブリッド及び組換え抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体断片(例えばFab、F(ab')2及びFv)を特に含む。例えば、米国特許第4816567号、及Mageら,Monoclonal Antibody Productuon Techniques and Applications,pp.79-97(Marcel Dekker,Inc.:ニューヨーク1987)を参照。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、神経芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頚部の癌が含まれる。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物として分類されるあらゆる動物を指す。本発明の好ましい実施態様においては、哺乳動物はヒトである。
本発明は、新規に同定され、単離されたApo-2ポリペプチド及びApo-2抗体を提供する。特に本出願人は、種々のヒトApo-2ポリペプチドを同定し、分離した。これらApo-2ポリペプチド及び抗Apo-2抗体のいくつかのものの性質と特徴は、以下の実施例においてさらに詳細に記載する。ここで開示されるApo-2ポリペプチドの性質と特徴に基づき、Apo-2はTNFRファミリーのメンバーであるというのが本出願人の信ずるところである。
A.Apo−2の調製
以下の説明は、主として、Apo-2核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養してApo-2を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてApo-2を調製することはできると考えられる。
Apo-2をコードするDNAは、Apo-2mRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトApo-2DNAは、実施例1に記載されたヒトの膵臓及び腎臓cDNAのバクテリオファージライブラリのように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。
またApo-2コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
Apo-2変異体はApo-2DNAに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のApo-2ポリペプチドを合成することにより、調製することができる。
アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、膜係留特性の変更のように、Apo-2の翻訳後過程を改変し得ることは当業者であれば理解されることである。
アラニン置換により適切な量の変異体を生じない場合には、アイソテリックアミノ酸を使用することができる。
場合によっては、突然変異に好適なApo-2配列中の代表的な部位には、細胞外ドメイン、特にシステインに富んだドメインの一方又は両方の範囲内の部位が含まれる。このような変異は上述の方法を使用することにより達成される。
Apo-2をコードした核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、さらなるクローニング又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
Apo-2は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ぺプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるApo-2DNAの一部である。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。シグナル配列は、例えばアルカリンホスファターゼ、ぺニシリナーゼ、1ppあるいは熱安定なエンテロトキシンHリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許第WO90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、における天然配列Apo-2プレ配列の発現においては、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、単純ヘルペスグリコタンパク質Dシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列がタンパク質の直接分泌に使用されるが、インビボにおけるヒト細胞の細胞膜へのApo-2の挿入を通常指示する天然Apo-2プレ配列が十分である。
このような前駆体領域のDNAは、好ましくは、Apo-2をコードするDNAにリーディングフレームが結合される。
発現とクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
DNAは宿主ゲノムに挿入することによって増殖され得る。これは、例えばベクターにバシラスゲノムDNAに見られる配列と相補的なDNA配列を含めることにより、宿主としてバシラス(Bacillus)種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及びApo-2DNAの挿入をもたらす。しかし、Apo-2をコードするゲノムDNAの回収は、Apo-2DNAを切除するのに制限酵母による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択的マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換していない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、(c)例えばバシリ(Bacilli)に対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる[Bianchiほか.,Curr.Genet.,12:185(1987)]。より最近では、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている[Van den Berg,Bio/Technology,8:135(1990)]。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている[Fleerほか.,Bio/Technology,9:968-975(1991)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Apo-2核酸に作用可能に結びついているプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合しているApo-2核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約100ないし1000bp)の開始コドンの上流側(5')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘導的なクラス及び構成的なクラスの2つのクラスに属する。誘導的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件の変化に対応してその制御の下でDNAからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源DNAからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Apo-2をコードするDNAに作用的に結合している。天然のApo-2プロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもApo-2DNAの直接増幅及び/又は発現に用いることができる。
大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端にポリA尾部が付加されていることを示すシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復配列を用いたCV−1サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、及びマウスNIH-3T3細胞における細菌CAT配列の発現について、Gormanほか,Proc.Natl.Acas.Sci.USA,79:6777-6781(1982)を参照のこと]。
より高等の真核生物による本発明のApo-2をコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300bpで、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に方向及び位置に独立しており、転写ユニットの5'[Laiminsほか,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:993(1981)]及び3'[Luskyほか,Mol.Cell Bio.,3:1108(1983)]、イントロン内部[Banerjiほか,Cell,33:729(1983)]並びにコード配列自身の内部[Osbornほか,Mol.Cell Bio.,4:1293(1984)]に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100-270)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv,Nature,297:17-18(1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Apo-2コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライスされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終止及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Apo-2をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの組立てには標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はDNA断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
組立てられたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC 31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び/又はMessingほか,Nucleic Acids Res.,9:309(1981)の方法又はMaximほか,Methods in Enzymology,65:499(1980)の方法によって配列決定する。
Apo-2をコードしているDNAの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む[Sambrookほか,上掲]。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたDNAによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、Apo-2変異体を同定する目的のために特に有用である。
組換え脊椎動物細胞培養でのApo-2の合成に適応するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingほか,Nature,293:620-625(1981);Manteiほか,Nature,281:40-46(1979);欧州特許第117060号;及び欧州特許第117058号に記載されている。
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は上述の高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリシアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、1989年4月12日に公開されたDD 266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
トランスフェクションは、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り上げを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
本発明のApo-2ポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookほかにより記載されているような適切な培地で培養される。
Apo-2の生産に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(Sigma)、最小必須培地(「MEM」,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」Sigma)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質も又当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,:5201-5205(1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に32Pである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Apo-2ポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はApo-2DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
Apo-2は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。Apo-2が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又はその細胞外ドメインを酵素的に切断して引き離すことができる。
Apo-2がヒト起源以外の組換え細胞でつくられるときは、Apo-2はヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Apo-2に関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからApo-2を精製することが望ましい。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Apo-2を、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;及びIgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラムである。
例えばフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の増殖を防止するために抗生物質を含めることができる。天然配列Apo-2に適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるApo-2又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
Apo-2の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。Apo-2の共有結合的修飾の一つの型は、Apo-2の標的アミノ酸残基を、Apo-2のN末端又はC末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入することができる。
本発明の範囲内に含まれるApo-2ポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列Apo-2に見出される一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び/又は天然配列Apo-2に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。
O結合グリコシル化は、ヒドロキシルアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニン(5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられるが)に、糖類N-アセチルガラクトーサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味する。
Apo-2の共有結合的修飾の他のタイプは、米国特許番第4640835号;第4496689号;第4301144号;第4670417号;第4791192号又は第4179337号に記載されているように、Apo-2ポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含む。
また本発明は、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したApo-2を含むキメラ分子を提供する。
一実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのApo-2の融合体を含む。エピトープタグは一般にApo-2のアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Apo-2のこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Apo-2を抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。
エピトープタグApo-2は、抗タグ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。アフィニティー抗体が付着されるマトリックスには、例えばアガロース、調製穴明きガラス又はポリ(スチレンジビニル)ベンゼンが含まれる。ついで、エピトープタグApo-2は、当該分野において知られた技術を使用して、アフィニティーカラムから溶出される。
次の図は、いくつかの例示的なモノマー、ホモ-及びヘテロダイマー及びホモ-及びヘテロマルチマー構造を示している。これらの図は単に例証するためのものであって、マルチマーの鎖は、天然免疫グロブリンと同様にジスルフィド結合していると考えられる。
本明細書に開示されているように、Apo-2は、治療的に使用することが可能で、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する。この治療法は、例えばインビボ又はエキソビボの遺伝子療法を使用することによりなすことができ、ここで開示しているデスドメイン配列の使用を含む。また、免疫グロブリン配列を含むApo-2キメラ分子(Apo-2の細胞外ドメイン配列を含むキメラ分子を含む)も治療的に使用することができ、Apo-2L又はApo-2が結合する他のリガンドによりアポトーシス又はNF-κB誘導を阻害する。
また、本発明のApo-2は非治療的用途においても有用性を有している。Apo-2をコードしている核酸配列を、組織特異性の分類のための診断に使用することもできる。例えば、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザン及びサザンブロット法、及びPCR分析のような手順を、Apo-2をコードするDNA及び/又はRNAが評価されている細胞型中に存在しているか否かを決定するために使用することができる。Apo-2核酸は、ここに記載されている組換え技術によるApo-2の調製にもまた有用である。
Apo-2の修飾型、例えば前述のApo-2-IgGキメラ分子(イムノアドヘシン)は、抗Apo-2抗体の生産における免疫原として使用することができる。
本発明は、さらに抗Apo-2抗体を提供するものである。Apo-2に対する抗体は以下のようにして調製することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及び異種抱合体抗体が含まれる。
Apo-2抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、Apo-2ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。適切な免疫化剤の例は、Apo-2-IgG融合タンパク質、例えばApo-2EDC-IgG融合タンパク質である。また、その表面にApo-2を発現する細胞を使用してもよい。免疫化されている哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に免疫化剤を抱合させることが有用である。使用され得るそのような免疫原性タンパク質の例は、限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。また、哺乳動物の免疫反応を増強するために、ミョウバンのような凝集剤を使用してもよい。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。哺乳動物から採血し、血清を検定して抗体価を求める。望まれるならば、抗体価が増加又はプラトーするまで哺乳動物に追加免疫を施す。
あるいは、Apo-2抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein,上掲に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、(上述したようにして)免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘導する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定されたら、クローンを制限希釈工程を経てサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる[Goding,上掲]。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。更に、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインAセファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培地又は腹水液から分離又は精製される。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFabフラグメントの調製は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。例えば、消化はパパインの使用により行うことができる。パパイン消化の例は、94/22/12に公開された国際特許第WO94/29348号、及び米国特許第4342566号に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、Fabフラグメントと呼ばれ、各々が単一の抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合フラグメントと、残りのFcフラグメントを生成する。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、抗原の架橋が尚も可能なF(ab')2フラグメントが得られる。
本発明のApo-2抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jonesほか,Nature,321:522-525(1986);Riechmannほか,Nature,332:323-329(1988);及びPresta,Curr.Op Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
場合によっては、Apo-2に対するscFv抗体は、16E2、20E6又は24C4抗体に対して図16において同定された一又は複数の相補性決定領域(CDR)アミノ酸配列を含むVH及びVL鎖を含む抗体を含みうる。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はApo-2に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を生成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成方法は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Millstein及びCuello,Nature,305:537-539(1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のランダムな混合のため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成でき、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際特許第93/08829号、及びTrauneckerほか,EMBO J.,10:3655-3656(1991)に開示されている。
融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインで起きる。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CHl)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これは、構築に使用する三つのポリペプチド鎖が不等の比である時に最高の収率が得られる実施態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調整する際に大なる柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が同比率で発現すると高収率が得られる場合や比率が特に重要ではない場合には、一つの発現ベクターに二つ又は三つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。このアプローチの好適な形態では、二重特異性抗体は、一方のアームの第一結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖/軽鎖対(第二の結合特異性をもたらす)からなる。このような非対称的構造は、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在すると容易な方法で分解できるので、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分解し易くすることが見出された。このアプローチは1994年3月3日公開の国際特許第94/04690号によって開示されている。二重特異性抗体を生成するためのさらなる詳細については、例えばSureshほか,Methods in Enzymology,121:210(1986)を参照されたい。
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、2つの共有的に結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療(WO 91/00360、WO92/200373;EP 03089)のために提案された。本抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4676980号に開示されているものが含まれる。
トリアボディも本発明の範囲に入る。このような抗体は、例えばIliadesら,FEBS Letters,409:437-441(1997)及びKorrtら,Protein Engineering,10:423-433(1997)に記載されている。
Apo-2抗体の他の修飾について考察する。例えば、抗体の治療効果を高めるために、エフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましい。例えば、システイン残基(類)をFc領域に導入し、この領域において鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにする。このようにして産生されたホモダイマー抗体は、内部移行能力が改善され及び/又は補体性細胞死滅性が増加している[例えば、Caronら,J.Exp.Med.,176:1191-1195(1992);Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1922)を参照のこと]。また、ホモダイマー抗体は、Wolffら,Cancer Research,53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性クロスリンカー(cross-llnkers)を使用して調製することもできる。さらに、Ghetieらは、Proc.Natl.Acad.Sci.,94:7509-7514(1997)において、IgG-IgGホモダイマーの調製について記載しており、このようなホモダイマーがモノマーと比較してア ポトーシス活性を高めることが可能であることを開示している。また、抗体は二重Fc領域を有するように操作することができる[Stevensonら,Anti-CancerDrugDesign,3:219-230(1989)を参照]。
また、抗体は他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例えばエピトープタグに融合又は結合させてもよい。エピトープタグポリペプチド及びそれらの使用方法は、A部8項に上述されている。ここで記載された任意のタグを抗体に結合させてもよい。例えば、以下の実施例には、His-タグ及びgD-タグ単鎖抗体が記載されている。
本発明のApo-2抗体は治療的な有用性を有している。例えば、アゴニストApo-2抗体は癌細胞においてアポトーシスを活性化又は刺激するために使用することができる。従って、本発明は、このようなApo-2抗体を使用する癌の治療方法を提供する。もちろん、本発明の方法は外科術等の他の治療方法と組合せて使用することができると考えられる。
アゴニストは好ましくは担体によって哺乳動物に投与される。適切な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集された、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th ed.,1980,Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のpHは、好ましくは約5〜8、さらに好ましくは約7〜7.5である。さらに担体には、アゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の徐放性製剤が含まれ、このマトリックスは、例えばフィルム状、リポソーム状又はマイクロ粒子状等の成形物の形態をしている。例えば投与されるアゴニストの投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
また、本発明のApo-2抗体は、例えばADCC又は補体結合により、Apo-2を発現している細胞における免疫媒介性細胞死を高めるのに有用である。
また、アンタゴニスト抗体は、NF-κBの活性化の結果生じるApo-2の潜在的自己免疫/炎症効果を阻止するか、又は過度のアポトーシス(例えば、神経変性症)を阻止するために使用することもできる。このようなアンタゴニスト抗体は、上述の治療方法及び技術に従って利用することができる。
さらに、Apo-2抗体はApo-2の診断検定法、例えば特異的細胞、組織又は血清における発現を検出する検定法に使用することができる。当該分野において知られている様々な診断検定技術、例えば、競合的結合検定、直接的又は間接的サンドイッチ検定及び不均一又は均一相の何れにおいても実施される免疫沈降検定を使用することができる[Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.,(1987)pp.147-158]。診断検定法に使用される抗体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能成分は、直接的に又は間接的に検出可能なシグナルをつくりだすことができなければならない。例えば検出可能成分は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、蛍光イソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、もしくはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又は酉洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素であってもよい。Hunterほか,Nature,144:945(1962)、Davidほか,Biochemistry,13:1014(1974)、Painほか,J.Immunol.Meth.,40:219(1981)及びNygrenほか,J.Histochem.and Cytochem.,30:407(1982)等に記載されている方法を含み、検出可能部分に抗体を抱合させるための当該分野において知られている任意の方法を使用することができる。
本発明のさらなる実施態様においては、例えば上述の治療的又は非治療的用途に使用可能なApo-2又はApo-2抗体を含むキット及び製造品が提供される。製造品にはラベルが付された容器が含まれる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、上述の治療的又は非治療的用途に有効な活性剤を含む組成物を収容する。組成物中の活性剤は、Apo-2又はApo-2抗体である。容器のラベルには、組成物が特定の治療的又は非治療的用途に使用されることが示され、また上述のもののようなインビボ又はインビトロのいずれかの使用の指示が示されている。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに援用する。
実施例において言及されている全ての制限酵素は、ニューイングランドバイオラボ社(New England Biolabs)から購入し、製造者の使用説明書に従い使用した。実施例で言及されていろ全ての他の市販試薬は、特に示していない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。ATCC受入番号により次の実施例及び明細書全体を通して特定している細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas,VA)である。
ヒトApo−2をコードしているcDNAクローンの単離 発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQTM,Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto,CA)を検索し、アポ3レセプター[Marstersら,Curr.Biol.,6:750(1996)]のデスドメインに相同であったあるESTを同定した。ヒト膵臓及び腎臓のlgt10バクテリオファージcDNAライブラリ(両方ともClontech社から購入)を、以下のようにしてpRKベクター中に結合させた。試薬を添加し、16℃で16時間インキュベートした:5X T4リガーゼバッファー(3ml);pRK5、Xho1、Not1消化ベクター、0.5mg、1ml);cDNA(5ml)及び蒸留水(6ml)。続いて、さらに蒸留水(70ml)と10mg/mlのtRNA(0.1ml)を添加し、全反応物をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)により抽出した。水相を取り出し、収集し、5MのNaCl(10ml)と無水エタノール(−20℃、250ml)に希釈した。ついで、これを14000xgで20分間遠心分離し、デカントし、ペレットを70%エタノール(0.5ml)に再懸濁し、再度、14000xgで2分間遠心分離した。ついで、DNAペレットをスピードバク中で乾燥させ、次の処理で使用できるように蒸留水(3ml)に溶解した。
3つのcDNAの全体を配列決定した。cDNAの重複コード領域はコドン410を除き同一であった(図1の番号付けを使用);おそらくは多型性であるため、この位置は、両膵臓cDNAのロイシン残基(TTG)、及び腎臓cDNAのメチオニン残基(ATG)をコード化した。
DR4のように、Apo-2は2つの細胞外のシステインに富んだ擬性反復部を含む(図2A)が、これに対し他の同定されている哺乳動物TNFRファミリーのメンバーは3又はそれ以上のこのようなドメインを含む[Smithら,Cell,76:959(1994)]。
全長配列のアラインメント分析(ALIGMTMコンピュータプログラムを使用)に基づくと、Apo-2は他のアポトーシス関連レセプター、例えばTNFR1(19%);CD95(17%);又はアポ3(DR3、WSL-1又はTRAMPとも称される)(29%)に対してよりも、DR4(55%)に対してより高い配列同一性を示す。
A.Apo-2ECDの発現
可溶性の細胞外ドメイン(ECD)融合カセットを調製した。Apo-2ECD(図1に示すアミノ酸残基1-184)をPCR法により得て、C末端フラッグエピトープタグ(Sigma)に融合させた。(残基183及び184は膜貫通領域にあることが予想されていても、Apo-2ECD作成物は図1に示す残基183及び184を含んでおり、接合部に可撓性を付与する)。ついで、フラッグエピトープタグ分子をpRK5に挿入し、ヒト293細胞(ATCC CRL 1573)に一過性トランスフェクションして発現させた。
48時間インキュベートした後、細胞上清を収集し、共沈試験(実施例3を参照)に直接使用するか、製造者(Sigma)の使用説明書に従い、抗フラッグアガロースビーズによるアフィニティークロマトグラフィーによりApo-2ECD-フラッグの精製を行った。
可溶性のApo-2ECDイムノアドヘシン作成物を調製した。Apo-2ECD(図1に示すアミノ酸1-184)を、過去に記載されているようにして[Ashkenaziら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:10535-10539(1991)]、pRK5のヒト免疫グロブリンG1重鎖のヒンジ及びFc領域に融合した。イムノアドヘシンは、ヒト293細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した。
Apo-2とApo-2リガンド間の結合相互作用を示す免疫沈降アッセイ
Apo-2とApo-2Lが相互作用するか又は互いに結合するかを測定するために、擬似トランスフェクト293細胞又はApo-2ECD-フラッグ(上記の実施例2に記載されたもの)がトランスフェクトした293細胞(5ml)からの上清を、5μgのポリ-ヒスチジンタグ可溶性Apo-2Lと室温で30分間インキュベートし[Pittiら,上掲]、ついで共沈アッセイにより複合体形成について分析した。
さらに、結合相互作用を、抗フラッグビーズ(実施例2を参照)を用い、トランスフェクションした293細胞上清からApo-2ECDを精製し、ついでBIACORETM装置で試料を分析することにより、分析した。BIACORETM分析により、約1nMの解離定数(Kd)が示された。また、BIACORETM分析により、Apo-2ECDが他のアポトーシス誘導性TNFファミリーのメンバー、すなわちTNF-α[Genentech,Inc.,Pennicaら,Nature,312:712(1984)、lymphotoxin−α(Genentech,Inc.),又はFas/アポ1リガンド(Alexis Biochemicals)]と結合不可能であることが示された。よって、これらのデータは、Apo-2がApo-2Lに特異的なレセプターであることを示している。
Apo-2によるアポトーシスの誘導
デスドメインはオリゴマー化界面として機能するため、デスドメインを含むレセプターの過剰発現により、リガンドの不在下においてシグナル伝達が活性化する[Frazerら,上掲,Nagataら,上掲]。Apo-2が細胞死を誘導可能であるか否かを測定するために、ヒト293細胞又はHeLa細胞(ATCC CCL 2.2)をリン酸カルシウム沈殿法(293細胞)又は電気穿孔法(HeLa細胞)により、Apo-2及び/又はCrmAをコードしているpRK5系プラスミド又はpRK5ベクターで一過性トランスフェクションした。適用できる場合に、プラスミドDNAの全体量を、ベクターDNAを添加することにより調節した。アポトーシスを、形態学的(図4A)、DNA断片化(図4B)、又はMarstersら,Curr.Biol.,6:1669(1996)に記載されているようなホスファチジルセリン暴露のFACS分析(図4C)により、トランスフェクション24時間後に評価した。図4A及び4Bに示すように、Apo-2トランスフェクション293細胞には、顕著なアポトーシスが発生した。
可溶性Apo-2ECDによるApo-2L活性の阻害
可溶性Apo-2L(0.5μg/ml、Pittiら,上掲に記載されたようにして調製)を、抗フラッグ抗体(Sigma)と共に、PBSバッファー又はアフニティー精製されたApo-2ECD(5μg/ml)と室温で1時間、プレインキュベートし、HeLa細胞に添加した。インキュベート5時間後、細胞をFACS(上述)(図4D)によりアポトーシスについて分析した。
Apo-2LはHeLa細胞において顕著なアポトーシスを誘導し、可溶性Apo-2ECDはApo-2Lの作用を阻止でき、Apo-2LとApo-2との間に特異的な相互作用があることが確認された。同様の結果がApo-2ECDイムノアドヘシンでも得られた(図4D)。用量-反応分析では、約0.3nMのApo-2イムノアドヘシンで最大半減阻害が示されている(図4E)。
Apo-2によるNF-κBの活性化
Apo-2がNF-κBを活性化させるか否かを測定するためのアッセイを行った。
HeLa細胞を、全長天然配列Apo-2、DR4又はアポ3をコードするpRK5発現プラスミドでトランスフェクションし、トランスフェクション24時間後に収集した。核抽出物を調製し、1μgの核タンパク質を、32P標識NF-κB特異性合成オリゴヌクレオチドプローブATCAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCG(配列番号:4)[MacKayら,J.Immunol.,153:5274-5284(1994)も参照のこと]と、単独又は50倍過剰の非標識プローブと共に、又は関連のない32P標識合成オリゴヌクレオチドAGGATGGGAAGTGTGTGATATATCCTTGAT(配列番号:5)と反応させた。いくつかの試料に、NF-κBのp65/Re1Aサブユニットに対する抗体(1μg/ml;Santa,Cruz Biotechnology)を添加した。DNA結合性を、Hsuら,上掲;Marstersら,上掲、及びMacKayら,上掲に記載されたようにして、電気泳動移動度シフトアッセイにより分析した。
さらに、Apo-2Lそれ自体がNF-κB活性を調節可能であるか否かを測定するアッセイを行った。HeLa細胞又はMCF7細胞(ヒト胸腺癌株化細胞、ATCCHTB22)を、PBSバッファー、可溶性Apo-2(Pittiら,上掲)又はTNF-α[Genentech,Inc.,Pennicaら,Nature,312:721(1984)を参照](1μg/ml)で処理し、上述のようにしてNF-κB活性をアッセイした。結果を図5Bに示す。Apo-2Lは、処理されたHeLa細胞においては有意なNF-κB活性化を誘導したが、処理されたMCF7細胞においては誘導しなかった:TNF-αは両方の株化細胞においてより著しい活性化を誘導した。いくつかの研究においては、TNFによるNF-κBの活性化で、TNF誘導性アポトーシスに対し、細胞を保護できることが開示されている[Nagataら,上掲]。
結果を図5Cに示す。ALLN及びシクロヘキサミドの両方とも、HeLa細胞におけるApo-2L誘導性アポトーシスのレベルを増加させた。データは、Apo-2Lが保護性NF-κB依存性遺伝子を誘導可能であることを示している。また、データは、Apo-2Lがある種の株化細胞においてNF-κβを活性化することができ、Apo-2とDR4の両方がその機能を媒介し得ることを示している。
哺乳動物組織におけるApo-2の発現
A.ノーザンブロット分析
ヒト組織におけるApo-2mRNAの発現を、ノーザンブロット分析によって検査した。ヒトRNAブロットを、全長Apo-2cDNAをベースにした4.6キロベースの32標識DNAプローブにハイブリダイズした;プローブはEcoRIでpRK5-Apo-2プラスミドを消化することにより産生した。ヒト胎児RNAブロットMTN(Clontech)、ヒト成人RNAブロットMTN-11(Clonetech)、及びヒト癌株化細胞RNAブロット(Clonetech)をDNAプローブと共にインキュベートした。ブロットをハイブリダイゼーション用バッファー[5X SSPE;2X デンハード溶液;100mg/mLの変性剪断されたサケ***DNA;50%のホルムアミド;2%のSDS]に入ったプローブと共に、42℃で60時間インキュベートした。ブロットを2X SSC;0.05%のSDSを用い、室温で1時間、数回洗浄し、ついで0.1XSSC;0.1%のSDSを用い、50℃で30分間洗浄した。ブロットを一晩さらした後、展開させた。
Apo-2が発現したいくつかの成人組織、例えばPBL、卵巣及び脾臓は、DR4を発現することが以前に見出されているが[Panら,上掲]、各レセプターmRNAの発現の相対レベルが異なっているようである。
正常及び癌のあるヒト組織におけるApo-2の発現を、インサイツハイブリダイゼーションにより検査した。さらに、いくつかの異なるチンパンジー及びアカゲザル組織についてのApo-2の発現も検査した。これらの組織には:ヒト胎児組織(E12-E16週)-胎盤、脾帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大動脈、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢;成人ヒト組織-腎臓、膀胱、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、網膜、肝臓;チンパンジー組織-唾液腺、胃、甲状腺、上皮小体、舌、胸腺、卵巣、リンパ節、及び末梢神経;アカゲザル組織-大脳皮質、海馬、小脳及び陰茎;ヒト腫瘍組織-肺腺癌、精巣、肺癌、乳癌、線維腺腫、柔組織肉腫が含まれる。
成人組織におけるApo-2の発現は、原小胞の休止卵母細胞で、低レベルの発現はチンパンジーの卵巣の、発育途上にある小胞の顆粒膜細胞で観察された。
発現は、硬変症のある肝臓の小節縁部の肝細胞(すなわち、ダメージ領域、正常な成人肝臓は陰性であった)で観察された。他の組織では発現はみられなかった。
線維腺腫においては、上皮及びストロマエレメントの両方に発現が現れた。また、柔組織肉腫も陽性であった。検査した他の組織は陰性であった。
Apo-2遺伝子の染色体局在化
ヒトApo-2遺伝子の染色体局在化を、放射線ハイブリッド(RH)パネル分析により検査した。RHマッピングを、ヒト-マウス細胞の放射線ハイブリッドパネル(Research Genetics)とApo-2cDNAのコード領域に基づくプライマーを使用するPCRにより、実施した[Gelbら,Hum.Genet.,98:141(1996)]。スタンフォードヒトゲノムセンターデータベースを使用したPCRデータの解析では、Apo-2は11.05LODを有するマーカーD8S481に結合しており;D8S481はD8S2055と今度は結合しており、これがヒト染色体8p21に位置する。また、DR4の類似した分析においては、DR4は、ヒト染色体8p21に位置するマーカーD8S2127に結合していることが示された。
本出願人の知る限りでは、今日まで、TNFR遺伝子ファミリーのメンバーで染色体8に位置しているものはなかった。
Apo-2に特異的なモノクローナル抗体の調製
0.5μg/50μlのApo-2ECDイムノアドヘシンタンパク質(Ribi Immunochemical Research Inc.,Hamilton,MTから購入したMPL-TDMアジュバントで希釈)を、各々の後足の裏の柔らかい部分に、3-4日の間隔で11回注射することで、Balb/cマウス(チャールズリヴァー研究所から得たもの)を免疫化した。過去に開示されたように[Ashkenaziら、Proc.Natl.Acad.Sci.,38:10535-10539(1991)]、pRK5においてヒト免疫グロブリンG1重鎖のヒンジ及びFc領域に、Apo-2の細胞外ドメイン配列を融合させることにより、Apo-2ECDイムノアドヘシンタンパク質を産生した。イムノアドヘシンタンパク質を、ヒト293細胞に一過性トランスフェクションして発現させ、前掲のAshkenaziらにより記載されたように、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより細胞上清から精製した(上述の実施例2Bを参照)。
洗浄工程に続き、100μlのハイブリドーマ上清又は精製した抗体(プロテインA-セファロースカラムを使用)(1μg/ml)を、CD4-IgGが存在する指定ウェルに添加した。100μlのP3X63AgU.1骨髄腫細胞の条件培地を、対照として他の指定ウェルに添加した。プレートを振盪装置上で、室温で1時間インキュベートし、続いて洗浄用バッファーで3回洗浄した。
アポトーシスを拮抗的に誘導するApo-2抗体の能力のアッセイ
ハイブリドーマ上清及び精製した抗体(上記の実施例9に記載)について、Apo-2媒介性9D細胞アポトーシスの誘導活性を試験した。9D細胞(5×105細胞/0.1ml)を、100μlの完全RPMI培地に種々の濃度の抗体が入ったものと共に、4℃で15分間インキュベートした。ついで細胞を37℃で5分間インキュベートし、300μlの完全RPMIに10μgのヤギ抗マウスIgG Fc抗体(Cappel研究所)が入ったものを細胞試料のいくつかに添加した。この時点で、細胞を、7%のCO2の存在下、37℃で一晩インキュベートした。
Apo-2リガンド誘導性アポトーシスを阻止する抗体能力のアッセイ
ハイブリドーマ上清及び精製した抗体(上記の実施例9に記載)について、Apo-2リガンド誘導性9D細胞アポトーシスを阻止する活性を試験した。9D細胞(5×105細胞/0.1ml)を、完全RPMI培地(RPMIに10%FCS、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムを加えたもの)に懸濁させ、個々のファルコン2052管に配した。ついで、細胞を、200μlの培地に10μlの抗体が入ったものと共に、氷上で15分間インキュベートした。0.2mlのApo-2リガンド(2.5μg/ml)(WO 97/25428に記載されているようにして調製された可溶性HisタグApo-2L;さらに、Pittiら,上掲を参照)を、完全RPMI培地に懸濁し、ついで9D細胞が収容された管に添加した。9D細胞を7%のCO2の存在下、37℃で一晩インキュベートした。ついでインキュベートされた細胞を収集し、PBSで1回洗浄した。細胞の生存力を、製造者の推奨(Clontech)に従い、ホスファチジルセリンに結合するFITC-アネキシンVの染色により測定した。特に、細胞をPBSで洗浄し、20μlの結合用バッファーに再懸濁させた。10μlのアネキシン-V-FITC(1μg/ml)と10μlのヨウ化プロピジウムを細胞に添加した。暗所で15分間インキュベートした後、9D細胞をFACSにより分析した。
シスの約50%をブロックすることができた。残った約50%のアポトーシス活性は、図10に示されるように、それら自身によるこれら2つの抗体のアゴニスト活性によるもの
であると考えられる。従って、3F11.39.7抗体は、阻止するApo-2抗体又はApo-2に対するApo-2リガンドの結合に競合する形でApo-2に結合する抗体であると考えられる。
他のApo-2リガンドレセプターへのApo-2抗体の結合性をテストするためのELISAアッセイ
実施例9に記載したモノクローナル抗体が、Apo-2以外の他の既知のApo-2Lレセプターに結合することができたか否かを測定するためにELISAを実施した。特に、3F11.39.7抗体の、DR4[Panら,上掲]、DcR1[Sheridanら,上掲]、及びDcR2[Marstersら,Curr.Biol.,7:1003-1006(1997)]に対する結合性を調べた。ELISAは、本質的に上述の実施例9に記載したようにして実施した。
結果を図11に示す。Apo-2抗体3F11.39.7はApo-2に結合した。また3F11.39.7抗体は、DR4に対してはいくらかの交差反応性を示したが、DcR1又はDcR2に対しては示さなかった。
抗体のアイソタイピング
3F11.39.7抗体(上述のもの)のアイソタイプを決定するため、ヤギ抗マウスIg(Fisher Biotech,Pittsburgh,PA)に特異的なアイソタイプで、マイクロタイタープレートを4℃で一晩かけて被覆した。ついでプレートを洗浄用バッファー(上述の実施例9に記載したもの)で洗浄した。ついで、マイクロタイタープレートのウェルを200μlの2%ウシ血清アルブミン(BSA)で閉塞し、室温で1時間インキュベートした。プレートを、再度洗浄用バッファーで3回洗浄した。次に、5μg/mlの精製3F11.39.7抗体を100μl、指定ウェルに加えた。プレートを室温で30分インキュベートし、ついで50μlのHRP-抱合ヤギ抗マウスIgG(上述したもの)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で30分インキュベートした。プレートに結合したHRPのレベルを、上述のHRP基質を使用して検出した。
アイソタイピング分析により、3F11.39.7抗体はIgG1抗体であることが示された。
単鎖Apo-2抗体
A.ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズを使用した抗体ファージ選択
ファージライブラリを、可溶性ビオチン化抗原及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズを使用して選択した。抗原、上述した実施例2Bに記載したようにして調製したApo-2ECDイムノアドヘシンを、製造者の使用説明書に従い、IMMUNO PURENHS-ビオチン(ビオチニ-N-ヒドロキシ-スクシンイミド、Pierce)を使用してビオチン化した。
2つのパニング実験を行った。第1の実験は、Apo-2に特異的であり、DR4又はDcR1と交差反応しないファージクローンを単離するためのものである。3段階のパニングを行った。第1段階において、Cambridge Antibody Technologiesのファージライブラリ10μlを、800μgのCD4−Ig、300μgのDR4-Ig、及び200μgのDcR1-Igを含有するMPBST(3%のドライミルクパウダー、1X PBS、0.2%のトゥイーン)を用い、室温で回転ホイールで1時間ブロックした[CD4-Ig、DR4、及びDcR1は、Caponら,Nature,337:525(1989);パンら,上掲;及びSheridanら,上掲に記載されている]。ついで、ビオチン化Apo-2ECDイムノアドヘシンを最終濃度が100nMになるように添加し、ファージを37℃、1時間で抗原に結合させた。一方、300mlの、ストレプトアビジン(DYNAL)で被覆されたDYNABEAS M-280を1mlのMPBSTで3回洗浄し[DYNAL磁性粒子濃縮器(Magnetic Particle Concentrator)使用]、ついで、ローテータ上で、1mlの新鮮MPBSTを用い、37℃で2時間ブロックした。ビーズをMPCで収集し、50μlのMPBSTに再懸濁させ、ファージプラス抗原溶液に添加した。室温で15分間、ホイールで混合し続けた。ついで、DYNABEADSと付着したファージを、1mlのPBS-TWEENで3回、MPBSで1回、続いてPBSで3回の合計7回洗浄した。
第3段階の選択において、ファージをMPBSTのみでブロックした。ビオチン化Apo-2を1nMまで添加し、洗浄の厳密性を、3サイクルの7回洗浄まで増やした。比較的少ないクローンしかこの段階では得られなかった;よって5nMのビオチン化Apo-2を使用し、全ての他の条件を上述のように繰り返して、パン2B、段階3を実施した。
各段階で選択した後、個々のカルベニシリン耐性コロニーをELISAでスクリーニングし、Apo-2結合性ファージをつくりだすものを確認した。二又はそれ以上のアッセイフォーマットで陽性であってクローンのみをさらに研究した。
個々のクローンを96ウェル組織培養プレートにおいて、2%のグルコースと100μg/mlのカルベニシリンと共に、2TYでインキュベートし、濁るまで増殖させた。ついで培養物に、M12KO7ヘルパーファージを、m.o.i.10で感染させ、感染細胞をカルベニシリン(100μg/ml)とカナマイシン(50μg/ml)を含有する2YT培地に移し、ゆっくりと振とうしながら30℃で一晩増殖させた。
ファージ培養物を遠心分離し、100μlのファージを含有する上清を、20μlの6xPBS/18%のドライミルクで、室温で1時間ブロックした。ブロックをタイタープレートから取り除き、ブロックされたファージを添加し、室温で1時間結合させた。洗浄後、MPBSにファージを酉洋わさびペルオキシダーゼ抱合抗M13抗体(Pharmacia)が入ったもの、続いて3',3',5',5'-テトラメチルベンジジン(TMB)により検出した。反応をH2SO4を添加することにより終止させ、A460nmからA405nmを引いて、読み取りを行った。
Apo-2結合クローンの多様性を、リーダー配列の上流をアニール化したプライマーpUC19R(5'AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG3')(配列番号:12)と、遺伝子IIIの5'末端がアニール化されたfdtetseq(5'GTC GTC TTT CCA GAC GGT AGT3')(配列番号:13)を使用し、scFv挿入物をPCR増幅し、ついで頻繁切断制限酵素BstNIで消化させることにより測定した。
DNAフィンガープリント法:プロトコール混合物A:dH20 67μl 10xampliTagバッファー 10 25mMのMgCl2 10 DMSO、50% 2 前進プライマー 1混合物B: 2.5mMのdNTPs 8μl AMPLITAQ 0.5 リバースプライマー 1.0 90μlの混合物Aを反応管に入れ、ついで黄色チップを使用し、非常に少量の大腸菌コロニーと共にインキュベートした。ついで、反応混合物をPCBブロックで98℃まで、3分間加熱し、取り出し、氷上に置いた。ついで、10μlの混合物Bを添加し、反応混合物を、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分20秒、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)2400サーモサイクラーで25サイクル、サーモサイクルさせた。ついで、10μlの結果として生じた反応生成物を取り出し、1%のアガロースゲル上を移動させ、1kBバンドを試験した。残った混合物を1xBstNI反応バッファーにし、5単位のBstNIを添加し、DNAを60℃で2時間消化した。ついで、得られた試料をGenegel Excelの12.5%アクリルアミドゲル(Pharmacia Biotech)の電気泳動にかけた。
各指紋パターンの代表的クローンのヌクレオチド配列が得られた。コロニーを、2%のグルコースと100μg/mlのカルベニシリンが補足された50mlのLB培地でインキュベートし、30℃で一晩増殖させた。DNAをQiagen Tip-100s及び製造者のプロトコールを使用して単離し、蛍光ジデオキシ鎖ターミネーターでサイクル配列化した(Applied Biosystems)。試料をアプライド・バイオシステムズ373A自動DNAシーケンサーにかけ、プログラム「Sequencher」(Gene Codes Corporation)を使用し、配列を解析した。選択された抗体16E2、20E6及び24C4のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号:6、配列番号:7及び配列番号:8に示す(図15A、15B及び15C)。抗体16E2、20E6及び24C4の対応するアミノ酸配列を、それぞれ配列番号:9、配列番号:10及び配列番号:11に示す(また図16)。加えて、図16においては、これらscRV分子のシグナル領域、及び重及び軽鎖相補性決定領域(下線を付した)が同定されている。図16に示されるCDR領域は、Kabetら,「免疫学的関心のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」,NIH Publ.No.91-3242,第5版、の方法に従い割当てられた。
可溶性抗体のタンパク質精製のために、大腸菌株33D3をファージミドDNAで形質転換した。カルベニシリンとグルコースを有する5mlの2YTを使用し、30℃で一晩培養して増殖させた。2.5mlのこれら培養物を、250mlの同じ培地で希釈し、OD600が約1.2になるまで増殖させた。細胞をペレット状にし、IPTG(1mM)とカルベニシリン(100μg/ml)を含有する500mlの2YTに再懸濁させ、発現を誘導し、22℃でさらに16時間増殖させた。細胞ペレットを収集し、−20℃で凍らせた。
濃度は、A280nmで1.0=0.6mg/mlであると仮定して、分光光度的に推定した。
scFvクローンの各々の特異性を評価するため、ELISAアッセイを行い、Apo-2のECD−Ig、DR4-Ig、DcR1-Ig、DcR2-Ig及びCD4-Ig(上述及び実施例12に記載)に対する16E2、20E6及び24C4の結合性を評価した。
簡単に述べると、NUNC ELISAプレートを、0.05Mの炭酸ナトリウムバッファー(pH9.5)に1μg/mlのレセプターIgイムノアドヘシン分子が入ったもの50μlで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。ついでプレートを285μlのELISA希釈液(0.5%のBSA、0.05%のトゥイーン20が補足されたPBS、pH7.4)で、室温で少なくとも1時間ブロックした。
また、トランスフェクション細胞を利用するさらなるアッセイによっても、Apo-2に対する16E2抗体の特異性が示された。特に免疫組織化学的実験を行い、Apo-2及びDR4-トランスフェクションCHO細胞に対する16E2抗体の結合特異性を評価した。CHO細胞を、ベクター単独又はApo-2又はDR4に対する遺伝子を含むベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を培養プレートから取り出し、ペレット状にし、PBSで2回洗浄した。ついでペレットを、O.C.T.(Fisher)に再懸濁させ、イソペンテイン及びLN2中でフラッシュ冷凍させ、通常のプロトコールを使用し、後者を薄片に切断した。切断細胞の染色をVectastain Elite ABCキットを使用して行った。
この免疫組織化学的アッセイにより、Apo-2トランスフェクション細胞は特異的に染色されるが、DR4トランスフェクション細胞は染色されないことが示された。細胞染色は細胞質が主として染色された。
アポトーシスを拮抗的に誘導するHisタグscFvの能力のアッセイ
A.アネキシン-V-ビオチン/ストレプトアビジン-[S-35]96ウェルアッセイ
精製したscFv抗体(上記の実施例14に記載されたもの)の、Apo-2媒介性アポトーシスを誘導する能力について試験した。
簡単には、SK-MES-1細胞(ヒト肺癌株化細胞;ATCC HTB 58)又はHCT116細胞(ヒト結腸癌株化細胞;ATCC CCL 247)(4X104細胞/ウェル)を、アッセイ用培地(フェノールレッドフリーのダルベッコ変性イーグル培地と、10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン及び100ug/mlのストレプトマイシンが補足されたフェノールレッドフリーのハムF-12栄養混合物との1:1混合物)にある96ウェルに等分し、37℃で一晩付着させた。ついで培地を除去し、最終濃度が50ug/mlであるscFv(16E2又は20E6)を含有するアッセイ用培地をウェルに0.1ml添加し(プレートにおいて1:2の連続的希釈を行った)、室温で1時間インキュベートした。他の単鎖抗体:抗組織因子scFvクローン、7D5、又は19B8と称されるscFvを負の対照として使用した。scFv抗体と1時間インキュベートした後、10ug/mlの抗His(Qiagen、カタログ番号1007671)又は抗-c-myc抗体を0.1ml、適切なウェルに添加した。架橋抗体を受け入れていないウェルは、培地を単独で受け入れた。ついで、プレートを室温で30分間インキュベートした。30分のインキュベート後、10ug/mlのヤギ抗マウスIgG(ICN cst.No.67-029)を0.1ml、適切なウェルに添加した。抗IgG抗体を受け入れていないウェルは、培地を単独で受け入れている。ついで、プレートを15分間インキュベーターに配し、pHを7.0に戻した。正の対照用として、pH7.0のリン酸カリウムバッファーにApo-2リガンド(Apo-2L)(実施例11で記載したようにして調製)が入った2ug/ml溶液を適切なウェルに添加し、プレートで2倍の段階希釈を行った。負の対照用ウェルは、培地を単独で受け入れている。ついで、細胞を5%のCO2の存在下で37℃で一晩インキュベートした。2XCa2+結合バッファー(NeXins B.V.)にアネキシン-V-ビオチン(1ug/ml)が入ったものを0.05ml、ウェルに添加し、振盪器で30分間混合した。2XCa2+結合バッファー(NeXins B.V.)に0.05mlのストレプタビジン-[S−35]が入ったもの(最終濃度は2.5x104cpm/ウェル)(Amersham)をウェルに添加し、振盪器で30分間混合した。ついでプレートを密封し、1500rpmで4分間遠心分離した。アポトーシスの程度を評価するため、ついでプレートをTrialux Microbeta計測器(Wallace)で計測し、アネキシン-V-結合に相当するcpm値を得た。
図13C及び14Bに示すように、16E2と20E6抗体は、SK-MES-1細胞において、アポトーシスを拮抗的に誘導した。
上述のアネキシン-V-ビオチン/ストレプトアビジン-[S-35]アッセイに加えて、scFv抗体(上述の実施例14に記載)の、Apo-2媒介性アポトーシスを誘導する能力について、クリスタルバイオレットを利用するアッセイを介してテストした。
簡単には、SK-MES-1細胞を、4X104細胞/ウェルでアッセイ用培地(上記のA部に記載)に配し、37℃で一晩付着させた。培地を除去し、最終濃度が50ug/mlであるscFvを含有するアッセイ用培地(上記のA部に記載)を適切なウェルに0.1ml添加した(scFvが添加されていないウェルは培地交換を受ける)。選択されたウェルには、10ug/mlのscFv16E2と100ug/mlの抗His抗体とを、プレートへの添加前に4℃で5時間混合し続けて組合せた「前複合」試料が収容されている。プレートを室温で1時間インキュベートした。
ついで培地を除去し、アッセイ用培地に希釈された10ug/mlのヤギ抗マウスIgG(Fcフラグメント特異性-ICN cst.No.67-029)を0.1ml、適切なウェルに添加した(抗Fcのないウェルは培地交換を受ける)。ついで、プレートを15分間インキュベーターに配し、pHを7.0に戻した。
Apo-2L(pH7.0のリン酸カリウムバッファーに100μg/mlで保存)を2μg/mlに希釈し、0.1mlを適切なウェルに添加した。プレートにつき段階2倍希釈を実施した。ついでプレートを37℃で一晩インキュベートした。
プレートを、540nmにおいてSLTプレート読取器で読み、Excel macro及び4p-fitを使用し、データを分析した。
図13A、13B、14A及び14Bに示すように、16E2と20E6抗体は、SK-MES-1細胞において、アポトーシスを拮抗的に誘導した。
アポトーシスを拮抗的に誘導するgDタグscFvの能力のアッセイ
16E2scFvの精製したgDタグ型の、Apo-2媒介性アポトーシスを誘導する能力について、上記の実施例15に記載されたクリスタルバイオレットアッセイで試験した。
A.gDタグを有するscFvの作成
16E2のscFv形態のSfi IからNot Iフラグメントを、元のライブラリのlacZプロモーターとハイブリッドシグナル配列ではなく、phoAプロモーターとstIIシKグナル配列を含むpAK19の誘導体[Carterら,Methods:A Companion to Methods in Enzymolngy,3:183-192(1991)]にサブクローン化した。精製を容易にするため、単純ヘルペスウィルス1型糖タンパクD[Laskyら,DNA,3:23-29(1984)]由来の12アミノ酸(met-ala-asp-pro-asn-arg-phe-arg-gly-lys-asp-leu、配列番号:14)をコードするDNAフラグメントを合成し、Cambridge Antibody Technologiesのライブラリクローンに当初は存在する(his)6及びc-mycエピトープの代わりに、VLドメインの3'末端に挿入した。
scFv16E2-gDに対する遺伝子を含むプラスミドを、振盪フラスコ培養で発現させるために、大腸菌株33D3中に形質転換させた。カルベニシリンとグルコースを含有する2YTを5ml使用し、30℃で一晩培養して増殖させた。2.5mlのこれらの培養物を250mlの同じ培地で希釈し、OD600が約1.0になるまで増殖させた。細胞をペレット状にし、カルベニシリン(100μg/ml)を含有する変性AP-5最小培地500mlに再懸濁させ、30℃でさらに16時間増殖させた。ついで細胞をペレット状にし、凍らせた。
冷凍細胞のペーストを、1gm/10mlのショッカートバッファー(25mMのトリス-HCl、1mMのEDTA、500mMのNaCl、20%のスクロース、1mMのPMSF、pH7.2)に再懸濁させ、氷上で4時間ゆっくりと攪拌した。ついで細胞懸濁液をPolytronマイクロ流動化装置(Brinkman)により加工した。細胞屑を10000xgで30分間遠心分離することにより除去した。0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した後、PBSで平衡にしたCNBrセファロースに結合した抗gD抗体5B6[Paborskyら,タンパク質工学(Protein Engineering,3:547-553(1990)]からなるアフィニティーカラム(2.5x9.0cm)に上清を充填した。カラム流出液の吸光度がベースラインに等しくなるまで、カラムをPBSで18時間洗浄した。全ての工程を、25cm/時間の線形流量で4℃において実施した。溶出は、0.1Mの酢酸、0.5MのNaCl、pH2.9で行った。カラムフラクションを280nmの吸光度でモニターし、ピークのフラクションをプールして、1.0Mのトリス(pH8.0)で中和し、PBSで透析して滅菌濾過した。得られたタンパク質調製物を、非還元SDS-PAGEにより分析した。
試料がプレートにおいて滅菌希釈1:3され、16E2-gDタグ抗体を、16E2scFvの2つの他の調製物(図14Cにおいて調製物A及び調製物Bと称されているもの)に加えて試験していることを除けば、本質的に実施例15(B)に記載されたようにして、アポトーシスアッセイを行った。16E2-gD抗体により、SK-MES-1細胞において誘導されるアポトーシスを示すアッセイの結果を図14Cに図示する。
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 UniversityBoulevard,Manassas,Virginia,USA(ATCC)に寄託した:材料 ATCC寄託番号 寄託日pRK-アポ2 209021 1997年5月8日3F11.39.7 HB-12456 1998年1月13日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
Claims (29)
- 配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなる天然配列Apo-2ポリペプチドと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離Apo-2ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する請求項1に記載のApo-2ポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する請求項2に記載のApo-2ポリペプチド。
- 配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなる単離Apo-2ポリペプチド。
- 配列番号:1のアミノ酸残基54〜182を含んでなるApo-2ポリペプチドの単離された細胞外ドメイン配列。
- 配列番号:1のアミノ酸残基1〜182を含んでなる請求項5に記載の細胞外ドメイン配列。
- 配列番号:1のアミノ酸残基324〜391を含んでなるApo-2ポリペプチドの単離されたデスドメイン配列。
- 異種性アミノ酸配列に融合した請求項5に記載の細胞外ドメイン配列又は請求項1に記載のApo-2ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
- 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項8に記載のキメラ分子。
- 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリン配列である請求項8に記載のキメラ分子。
- 前記免疫グロブリン配列がIgGである請求項10に記載のキメラ分子。
- 請求項1に記載のポリペプチド、請求項5に記載の細胞外ドメイン配列、又は請求項7に記載のデスドメイン配列をコードするDNAを含んでなる単離された核酸。
- 前記DNAが配列番号:1のアミノ酸残基1〜411を含んでなるApo-2ポリペプチドをコードする請求項12に記載の核酸。
- 請求項12に記載の核酸を含んでなるベクター。
- ベクターで形質転換した宿主細胞により認識される対照配列に作用可能に結合した請求項14に記載のベクター。
- ATCC寄託受入番号209021を含んでなる請求項14に記載のベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- CHO細胞を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
- 大腸菌を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
- 酵母細胞を含んでなる請求項17に記載の宿主細胞。
- Apo-2ポリペプチドの発現に十分な条件下で請求項17に記載の宿主細胞を培養し、培養物から発現したApo-2ポリペプチドを回収することを含んでなるApo-2ポリペプチドの生成方法。
- ATCC寄託受入番号209021のcDNA挿入物によりコードされたポリペプチドを発現させることにより得られた又は得られうるApo-2ポリペプチド。
- Apo-2ポリペプチドをコードするDNAを発現する細胞を含む非ヒト、トランスジェニック動物。
- マウス又はラットである請求項23に記載の動物。
- Apo-2ポリペプチドをコードする変更遺伝子を有する細胞を含む、非ヒト、ノックアウト動物。
- マウス又はラットである請求項25に記載の動物。
- Apo-2を活性化する薬剤に哺乳動物の癌細胞を暴露することを含んでなる哺乳動物の癌細胞を治療する方法。
- 容器と該容器に入れられる組成物を含んでなり、組成物がApo-2ポリペプチド又はApo-2抗体を含む製造品。
- インビボ又はエキソビボにおいてApo-2ポリペプチド又はApo-2抗体を使用するための使用説明書をさらに含んでなる請求項28に記載の製造品。
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