PT98124A

PT98124A - Processo para a preparacao de novos analogos de insulina com accao prolongada e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT98124A
Application number: PT98124A
Authority: PT
Inventors: Jan Markussen; Liselotte Langkjaer; Kjeld Norris; Leo Boye Snel
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1990-06-28
Filing date: 1991-06-27
Publication date: 1992-04-30
Also published as: DK155690D0; JPH05508406A; AU8054391A; NZ238718A; ZA914830B; WO1992000321A1; IL98596A0; IE912247A1; EP0536245A1

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS ANALOGOS DE INSULINA COM ACÇAO PROLONGADA E DE COM POSIÇÕES FARMACÊUTICAS <«UE OS CONTÉM"

Campo da Invrnção A presente invenção refere-se a novos análogos da insulina com lima acção prolongada, a um processo para a prepara ção destes análogos de insulina e a soluções injectáveis contendo os novos análogos de insulina.

Antecedentes da Invenção

Os análogos da insulina com uma acção de insylina pro longada foram descritos previamente nas patentes de invenção europeias EP 019^86^A e EP 025^516α .

Ba patente de invenção europeia EP ΟΙ^δόΗ-Α descreve--se análogos de insulina humana prolongados nos quais o grupo carboxilo do C-terminal da cadeia B está bloqueado com u« resíduo amido ou áster e o resíduo do aminoácido na posição A*t, AI7, B13 e B21 podem estar substituídos por Glâ. Na patente te de invenção europeia EP G25*f5l6A descreve-se uma insulina hu mana do mesmo tipo descrito na patente de invenção europeia EP OI9M+86A mas ainda contendo uma modificação na posição A21,

Alguns dos análogos de insulina podem, contudo, exibir uma potência biológica demasiado baixa ou um grau de prolongamento que pode ser demasiado curto para os fins em vista. É um objectivo da presente invenção desenvolver novos análogos de insulina com acção de insulina prolongada que não apresentem os inconvenientes citados anteriormente.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, verificou-se de for ma surpreendente que a introdução de uma carga positiva na extremidade N-terminal da cadeia B dá origem a análogos de insulina com uma acção de insulina muito prolongada, quando comparada com a insulina humana, e ainda com uma grande potência in vivo.

No seu aspecto mais amplo, a presente invenção está, portanto, relacionada com novos análogos de insulina humana nos quais pelo menos um dos resíduos de aminoácido de BI a B6 foi substituído por um resíduo de um aminoácido básico, isto é, um resíduo de lisina ou um resíduo de arginina (Lys ou Arg).

Para se obter uma estabilidade melhorada dos novos análogos de insulina, a asparagina na posição A21 (Asn) pode ainda ser substituída por um outro resíduo de aminoácido.

Também pode ser introduzida uma carga positiva adicional mediante bloqueamento do grupo carboxilo C-terminal na posição B30, de preferência, por meio de um grupo amido ou éster.

Se os presentes análogos de insulina forem preparados pelo método designado por transpeptidação (para pormenores ver adiante) deve ser ainda uma vantagem que o grupo amino ligado â extremidade C-terminal do substituinte resíduo Lys ou Arg seja um resíduo de prolina. 3

A invenção refere-se ainda a um método para a prepara çio dos novos análogos de insulina pelo meio do qual um precursor de biossíntese do análogo de insulina se converte em análogos de insulina por conversão enzimática e química e refere-se a soluções de insulina que contêm os novos análogos de insulina. A designação "análogos de insulina", tal como aqui se utiliza, significa um composto que apresenta uma estrutura molecular similar â de insulina incluindo as pontes de dissu]. fureto entre Cys^ e Cys®^ e entre Cys^^ e Cys®^ e uma pon- A6 All te interna de dissulfureto entre Cys e Cys e que apresen tam actividade de insulina.

Descrição pormenorizada da presente invenção

Os presentes análogos de insulina são representados pe la seguinte formula geral rs_sn

A(l-6)-Cys-A(8-19)-Cys-Z

I I (I) s s

I I s s

I I X1-X2-X3-X4-X5-X6-Cys-B(8-18)-Cys-B(20-29)-Y na qual Z representa Asn ou outro aminoácido natural X-^ representa Phe, Lys ou Arg, X2 representa Vai, Lys ou Arg, X3 representa Asn, Lys, Arg ou Pro, X^ representa Gin, Lys, Arg, ou Pro, X^ representa His, Lys, Arg ou Pro, representa Lys, Arg,Leu ou Proj e Y representa um resíduo de treonina no qual a grupo carboxilo se encontra, eventualmente bloqueado por um grupo éster ou amido, com a condição de pelo menos um dos símbolos X-p X2> X^, X^, Xjj e X^ representar Lys ou Arg.

Comparado com a insulina humana, a modificação áa car ga obtém-se pela substituição de um ou mais resíduos de amino-ácidos nas posições de BI a Bô por um resíduo de arginina ou de lisina. Além disso, o grupo carboxilo C-terminal da cadeia--B pode ser bloqueado com um grupo éster ou amido.

Se o símbolo Z não representar a asparagina pode representar um aminoácido neutro, por exemplo, valina, glutamina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tiros iria, çetionina ou, de preferência, glicir^seríns,treonina ou alaninçwZ pçde aindarepre sentar um aminoácido acídico como o ácido glutâmico ou o ácido aspártico, ou um aminoácido básico, como, por exemplo, lisina, arginina ou histidina. De preferência, Z representa glicina, alanina ou serina. São exemplos de grupos que bloqueiam o grupo carboxilo C-terminal no resíduo de aminoácido na posição B30 (treonina) os grupos éster, tais como, alcoxi inferior, de preferência com não mais de 8 átomos de carbono, vantajosamente com menos de 5 átomos de carbono. São grupos alcoxi preferidos os grupos metoxi, etoxi e tert-butoxi. 1

0 grupo bloqueador pode ainda ser ura grupo amido de ffênnulá· geral -NR^ na qual e R2, iguais ou diferentes, re presentam cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, de preferência com até 8'átomos de carbono. De preferência, »1 e representam, cada um, um átomo de hidrogénio.

Uma vez que os compostos de fórmula geral I se podem aplicar em clinica sob a forma de soluções possuindo uma acçao prolongada, pode ocorrer uma diminuição na imunogenicidade quando se compara com as suspensões correntemente utilizadas de insulina porcina ou humana. 0 grau de prolongamento pode ser aumentado e controlado pela adição de iões de zinco.

Os parâmetros que podem controlar o grau de prolongamento do efeito da insulina são a concentração de zinco e a escolha do composto de fórmula geral I. Os valores preferidos para o teor de zinco situam-se entre 0 e cerca de 2 mg/ml, de preferência entre Θ e 200JUg/ml, de zincoj ô ôom maior preferência entre cerca de 20 e 200Jig/ml, numa preparação contendo cerca de 2^0 nmoles de um composto de fórmula geral I por ml. Quando se utiliza outras concentrações do composto de fórmula geral I, o teor do zinco deverá ser ajustado de forma correspondente . A acção prolongada das soluções dos compostos de fdrmu la geral I na presença de iões zinco, está relacionada com a baixa solubilidade destes compostos a pH neutro. 0 pH da solução injectável da presente invenção deve ser, de preferência, inferior ao pH fisiológico, sendo o limi te superior o valor de pH ao qual ocorre a precipitação. No 6

r valor de pH fisiológico, os compostos de fórmula geral I des ta invenção apresentam baixa solubilidade. Obtiveram-se solu ções estiveis contendo cerca de 2^-0 nmoles/ml dos compostos de fórmula geral I, a um pH de cerca de 5*5· 0 limite supe rior depende dos componentes da solução, isto é, reagente de isotonia, agente conservante e concentração de zinco e, final mente do composto de fórmula geral I escolhido. Não existe limite inferior de pH para as soluções e a estabilidade quími ca dos compostos de fdrmula geral I na qual Z não representa um resíduo de asparagina, é grande, mesmo a pH 3. 0 inter valo de pH preferido para as soluções injectéveis desta inven ção situa-se entre cerca de 2,5 e 8,5, de preferência entre cerca de ^,5 e 8. São especialmente preferidos intervalos de pH compreendidos entre cerca de 2,5 e 5>5> com maior preferência entre cerca de 3 e U·, 5·

Um outro aspecto desta invenção consiste em proporcio nar uma melhor flexibilidade para os doentes. Com duas soluções aquosas, uma contendo um composto de fdrmula geral I e a outra contendo um sal de zinco, o doente pode obter o grau prg, tendido de acção prolongada e 0 perfil desejado, pela mistura das duas soluções de forma apropriada. Assim, o doente tem, utilizando duas soluções de reserva, a possibilidade de escolher uma acção e um esquema para a injecção da manhã e uma ou tra acção e um outro esquema para a injecção da noite. De preferência, a solução de zinco desta invenção contém cerca de 2 jig a 20 mg de zinco por ml.

Alternativamente, ambas as soluções de reserva podem conter zinco, quer em concentrações iguais quer diferentes e/ou ambas as soluções de reserva podem conter um composto de fór mula geral I, quer com o mesmo composto quer com um composto diferente.

De preferência, as soluções injectáveis desta invenção têm uma concentração compreendida entre cerca de 60 e 6 000 nmoles de um composto de fórmula geral I por ml.

Sao exemplos dos novos análogos de insulina de acordo com esta invenção:

ArgB3, SerA2\ Thr^^-N^ insulina humana

ArgB3, ProB^, SerA2\ Thr^^-NEb, insulina humana

ArgB3, GlyA2^, Thr^^-NH^ insulina humana

ArgB3, ProB^, GlyÂ2^, ThrB3B-NH2 insulina humana

ArgB2, Ser^'2'1', ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB2, ProB3, SerA2\ ThrB3B-NH2 insulina humana

ArgB2, GlyA2^, ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB2, ProB3, GlyA21, ThrB30-NH2 insulina humana

ArgB2, ArgB3, SerA2^, ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB2, ArgB3, SerA2^ insulina humana

ArgB\ ProB3, SerA2^, ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB\ ArgB3, ProB^, Gly^'2·1’, ThrB3° insulina humana

ArgB3, GlyA2\ ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB3, SerA2''', ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB\ GlyA2^, ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB^, SerA2·*·, ThrB3^-NH2 insulina humana

ArgB\ ProB2, GlyA2\ ThrB3^-NH2 insulina humana.

Os novos análogos de insulina, de acordo com a presen te invenção, podem ser preparados por alteração do gene da

proinsulina mediante a substituição de codio ou codões no sítio apropriado, no gene da proinsulina humana natural, por codao ou codões que codifica(m) o(s) resíduo(s) de aminoácido pretendido(s) como sufcstituinte(s) ou mediante a síntese da sequência completa de ADN que codifica o análogo de insulina pretendido. 0 gene que codifica o análogo de insulina desejado á, depois, inserido em um vector de expressão apropriado que quan do transferido para um organismo hospedeiro apropriado, por exemplo, para Ej. coli, Bacillus ou levedura, produ? o produ to pretendido. 0 produto expresso é âepois isolado das células ou do caldo de cultura, dependendo de o produto expresso ser ou não segregado das células.

Os novos análogos de insulina podem também ser preparados por síntese química por métodos análogos ao método descrito por Márki et al., Hoooe-Sevleís Z. Physiol. Chem.. ^60 (1979) 1619-1632. Podem ainda ser formadas a partir de cadeias A e B, preparadas in vitro separadamente contendo as substituições de resíduos de aminoácidos apropriados, após 0 que as cadeias A e B modificadas são ligadas uma à outra mediante for mação de pontes de dissulfureto de acordo com métodos conhecidos (Cf., por exemplo, Chance et al., In: Rick, DH., Gross, E., (eds.) Peptides; Synthesis - Structure - Function Proceedinas of the seventh American peptide Svmposium, Illinois, pp. 721-728)

Os análogos de insulina podem ainda ser preparados por um método análogo ao método descrito na patente de invenção europeia EP OI63529A, cuja descrição aqui se inclui como refe 9

rência. Através deste método, um precursor de insulina humana no qual Lys^^ se liga a Gly^ por meio de itma ligação peptldica ou de uma cadeia peptídica de comprimento variável com pontes de dissulfureto nas posições correctas, é expresso e segregado pela levedura e em seguida convertido em insulina humana pela chamada reacção de transpeptidação. A reacçao de transpeptidação está descrita na patente de invenção norte-americana NQ 4 343 898, cuja descrição aqui se inclui como referência. Nesta reacção, a ligação peptídica ou a cadeia peptídica que liga Lys®^ a Gly^ é excisada sendo acoplado um grupo éster de treonina ou um grupo amido - B29 de treonina a extremidade C-terminal de Lys .

Assim, os novos análogos de insulina podem ser preparados por um método que consiste em fazer reagir um precursor de biossíntese de insulina de fórmula geral wq~ 'r" j S-S—|

Ál-A(2-6)-Cys-A(8-19)-Cys-Z (II)

S S i i X1-X2-X3-X4-X5-X6-Cys-B(8-18)-Cys-B(20-28)-B29 na qual Q representa uma cadeia peptídica com q resíduos de aminoácidos, representando q zero ou um número inteiro de 1 a 33; T representa Lys ou Arg; r representa zero ou o numero inteiro 1; e Xp X2, Xg, X^, Xg, Xg e Z tem os significados definidos antes, com um composto de fórmula geral HY (III) na qual Y representa um resíduo protegido do aminoácido treonina comportando como protector do grupo carboxilo um grupo éster ou amidoj utilizando tripsina ou enzimas semelhantes à tripsina como catalisadores numa mistura de água e de um dissolvente orgânico. 0 grupo protector éster ou amido pode ser em seguida clivado por hidrólise ácida ou básica.

Os compostos preferidos de fórmula geral III são Thr-Ní^, Lys (Boc) -N^, Thr (Bufc) -OB^ e Thr-OBu*".

As preparações de insulina da presente invenção são ob tidas por dissolução de um composto de fórmula geral I em um meio aquoso, sob condições ligeiramente ácidas, por exemplo, numa concentração de 240 ou 600 nmoles/ml. O meio aquoso é tornado isotónico, por exemplo com cloreto de sódio ou glice-rol. Além disso, o meio aquoso pode conter iões zinco numa concentração compreendida entre cerca de 30 jig de Zn por nmole de um composto de fórmula geral I, agentes tampão como, por exemplo, acetato, citrato ou histidina e agentes conservan tes, como, por exemplo, o m-cresol, o nipagin ou o fenol. 0 valor de pH da preparação de insulina final depende do número de cargas que foram modificadas no composto de fórmula geral I, da concentra ção dos iões zinco, da concentração do composto de fórmula geral I e do composto de fórmula geral escolhido. 0 valor do pH é ajustado para um valor conveniente para administração, como, por exemplo, um valor compreendido entre cerca de 2,5 e 5»5> impedindo-se a precipitação. A preparação de insulina e esterilizada por filtração esterilizante.

As preparações de insulina desta invenção podem ser utilizadas de forma semelhante as outras preparações de insulina conhecidas.

Terminologia-

As substâncias utilizadas para os aminoácidos são as estabelecidas em J. Biol. Chem. 2^-3 (1968), 3558. Os aminoácidos apresentam a configuração L . Salvo quando especifi cado de outro modo, as espécies de insulina aqui citadas são humanas. t utilizada no teste que se segue a designação B(l-29) que representa uma cadeia B encurtada da insulina humana des

*D"| -OpQ de Phe até Lys e A(l-21) representa uma cadeia A de insulina humana. A ou as substituições efectuadas na molécula de insulina humana de acordo com a prática desta invenção, são indicadas com um prefixo referenciado h insulina humana. Como um exemplo, Arg insulina humana representa um análogo da insu lina humana em que Vai foi substituído por Arg na posição 2 na cadeia B . Arg®2, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulina humana representa um precursor para um análogo de insulina, citado anteriormente, em que Vai foi substituído por Arg na posição 2 na cadeia B encurtada e em que a cadeia Bíl-29) 12 » e a cadeia A(l-21) estio ligadas por uma sequência peptídi-ca Ala-Ala-Lys. A menos que especificado de outro modo, deve entender -se que a cadeia B(l-29) e a cadeia A(l-21) estão ligadas por pontes de dissulfureto entre Cys^ e CysB^ e entre CysA2° e CysB1^, respectivamente, e que a cadeia A contêm uma ponte de dissulfureto interna entre CysA^ e CysA1, como na insulina humana.

Parte experimental

Exemplo 1

ArgB2, ProB3, SerA21, ThrB3C~NH2 insulina humana, ArgB^, SerA2\ ThrB3B-NH2 insulina humana,

ArgBlf, GlyA21, ThrB3°-NH2 insulina humana, e ArgB2, ProB3, GlyA21, ThrB3^T insulina humana, ArgB3, GlyA21, ThrB3°-NH2 insulina humana

Os compostos citados anteriormente fi*ram sintetizados a partir dos precursores correspondentes seguintes:

ArgB2, ProB3, SerA21, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) insulina humana,

ArgB^, SerA21, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) insulina humana, ArgBl+, GlyA2\ B(l-29)-Ala-Ala-Lys«A(l-21) insulina humana, ArgB2, ProB3, Gly^1, B(l-29)-Als-Ala-Lys-A(l-21) insulina humana, e

ArgB3, Glu^1, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) insulina humana, ia

mediante transpeptidação tríptica, em solução orgânica /aquo 9&nte P^resança d© Thr-NEb,, tal como se descreve na patente de invenção europeia EP 019^8#+Α, Exemplos ^ e 6, No Quadro 1 apresentam-se os rendimentos, cargas relativas à insulina humana, velocidades de migração relativamente I insulina em elec troforese em BISC PAGE , a pH 8,9 e desvios nas composições de aminoácidos relativamente a insulina humana.

Os precursores de insulina foram produzidos por um método análogo ao método descrito na patente de invenção europeia EP 0163529A.

Os precursores da insulina foram recolhidos dos caldos de fermentação por adsorção de LiChroprep RP-18, do modo des crito no Exemplo 7 da patente de invenção europeia EP OI63529A. Eluiram-se os precursores da coluna com cloreto de potássio 0,2M, ácido clorídrico Ο,ΟΟΙΜ em etanol a 33 % (v/v). Cristalizam-se os precursores da insulina a partir da mistura por adições sucessivas de água (1 volume por volume da mistura), citrato de trissodio solido, para se obter a molaridade 0,0$>M e finalmente acetato de zinco para obtenção da molaridade Ο,ΟΟβΜ . Ajustou-se o valor de pH para 6,8 e deixou-se a mis tura durante a noite à temperatura de k C. Isolaram-se os cris tais por centrifugação, lavaram-se com água e secaram-se sob vazio.

Prepararam-se os aminoácidos protegidos e os péptidos protegidos para semi-síntese enzimática de acordo com métodos convencionais ou adquiriram-se (síntese habitual) a Nova Biochem ou Bachem, Suíça.

Qua-

I

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As soluções estéreis injectáveis dos compostos citados anteriormente, para a verificação do grau de acção prolongada foram preparadas utilizando como agente isotdnico glicerol a 1,6 % (p/v), e como agente conservante fenol a 0,26 % (p/v). A concentração do ião zinco foi 8, 80 ou 160jxg/ml. Os valores de pH das soluções foram.ajustados de forma suficientemente afastada do ponto isoeléctrico dos análogos, para man ter as soluções límpidas apds conservação à temperatura de ^C. As soluções continham 2^0 nmoles/ml dos compostos testa dos. A concentração de 2*+0 nmole /ml foi verificada por HPLC.

Prepararam-se em seguida soluções injectáveis contendo 2*f0 nmoles/ml dos compostos indicados no Quadro 2.,, «xibin do um pH de 3 e um teor de zinco estabelecido. 0 prolongamento do efeito hipoglicémico foi verificado de acordo com a British Pharmacopeia. 19Ô0, A l*+2 em coelhos alimentados. Cada solução teste foi administrada por via sub cutânea numa dose de 1^,3 nmoles por coelho em 12 animais com pesos compreendidos entre 3 e k kg, e seguiu-se durante 6 horas o comportamento da hipoglicémia. Para comparação da preparação com acção rápida, incluiu-se nos testes insulina huma na Actrapid . Os resultados dos testes estão indicados no Quadro 2 em percentagem de glucose apds 1, 2, !+ e 6 horas.

Os resultados da determinação da potência biológica, pelo Ensaio de Doseamento da. Glucose no Sangue de Murganho (MBG) e Teste na Célula Gorda Livre (FFC) estão apresentados no Quadro 3 ,

Quadro 2 »|·»|·

Composto Zn Glucose em pereenta - gem do valor inicial

Substituições na insulina humana Jjg/ml Ih 2h >+h 6h ArgB5, SerA21, ThrB3°-NH2 8 59 6½ 96 9*+ ArgB^, SerA2B, ThrB3°-NH2 80 85 92 97 95 ArgB^, SerA21, ThrB3°-NH2 l6o 76 89 96 9*+ ArgB2, ProB3, Se/21, ThrB3°-NH2 8 58 67 73 72 ArgB2, ProB3, SerA21 ,ThrB3°-NH2 80 73 66 6i* 61 TM Actrapid , insulina humana 7 53 53 92 97.

Qua-

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O 00 Ov I—I Λ CM s I Potência biológica relativa CC o «s r\ •H OO i—1 i— (D PQ cg cg Q< d < <1 Ô Λ d í>» υ CD H 0) H $ CD d CD ca O ri ã d *N cd d co <d H **» #\ s cd Φ 8 cg oo CO P X 10 P <4 pq pq X cu o*X d O cg 0 og •H Φ d W d td cd rd P cd co CU Pu & d w p d 1 •H •H •Η ·Η o #x o rH P P H UA cg cg rn P •H W p pq pq pq. pq pq w d P Ui fafl w> d bfl d C pq p d d d X d xi •H v—' ca -η <4 <4 EH <4 H

ArgB , GlyA21, ThrB3°-NHp 66 60-72 kO 38-ifl

Claims

18

REIVINDICAÇÕES 1,- Processo para a preparação de análogos de insu lina humana de fórmula.geral A (1-6)-Cvs-A(3-19)-Cys-z ? 1 (I) ^-X2-X3-X4-X5-X6-Cys-B(3-l8)-J£.3(20.29)_Y na qual Z representa Asn ou outro aminoãcido natural; representa Phe, Lys ou Arg;

X2 representa Vai, Pro, Lys ou Arg; X3 representa Asn, Lys, Arg ou Pro; X4 representa Gin, Lys, Arg ou Pro? X5 representa His, Lys, Arg ou Pro; X6 representa Lys, Arg, Leu ou Pro; Y representa um resto de treonina em que o grupo carboxilo se encontra, eventualmente, blo queado por um grupo éster ou amido? com a condição de pelo menos um dos símbolos X^, X2, X^, X^, Χ^ e Xg representar Lys ou Arg, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um precursor da insu lina de fórmula geral

Al-A(2-6)-CVS-A(8-19)-CVS-Z 1 1 s s (II) s s xl-X2-X3-X4-X5-X6-cys-3(8-18)-Cys-3(20-28)-329 na qual Qg representa uma cadeia de péptidos com 9 restos de aminoácidos representando 9 zero ou um número inteiro de 1 a 33; T representa Lys ou Arg; r representa zero ou o número inteiro 1; e

Χ^, Χ£, Χ3, Χ4, Xg, Xg e Ζ têm os significados definidos antes, com um composto de fórmula geral HY (III) na qual Y representa um resto protegido do aminoácido treonina comportando como protector do grupo car-boxilo um grupo éster ou amido, utilizando como catalisador tripsina ou outros enzimas similares, no seio de uma mistura de água e de um dissolvente orgânico, e de se cindir depois, eventualmente, o grupo protector por hidró lise· ácida ou alcalina.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de análogos de insulina humana de fórmula geral I na qual representa Phe, caracterizado pelo facto de se utiliza rem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de análogos de insulina humana de fórmula geral I na qual Z representa Gly, Ala ou Ser, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para 21

a preparação de análogos de insulina humana de fórmula geral I na qual X^ representa Phe, X2 representa Arg ou Lys, X3 representa Pro, X4 representa Gin, X^ representa His, Xg representa Leu, Z representa Gly, Ala ou Ser e Y representa Thr-NH^ ou Thr, caracte rizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de análogos de insulina humana de fórmula geral I na qual X^ representa Phe, X2 representa Vai, X3 representa Asn, x4 representa Gin, X5 representa His, Xg representa Arg ou Lys, Z representa Gly, Ala ou Ser. e Y representa Thr-NH2 ou Thr, ca-racterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corres pondentemente substituídos.

6. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas com acção insulínica prolongada, caracterizado pelo facto de se converter em uma solução injectável uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um composto de fórmula geral I preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 1, em associação com agentes auxiliares como, por exemplo, tampões, agentes conservantes e agentes que permitem isotonizar a solução. Q Agente Oficial da Propriedade Induslrial 1