PT96900A - PROCESS FOR THE PREPARATION OF DIACETATE COMPOUNDS - Google Patents

Description

0 pfwStef» ι te Ãi ϊ VfcfFl "CQ Γ8 íSre“S a uns Urui_tf= o para preparação de um intermediário que é útil na preparaç S"o de Cl5;>/\*3 CS í,Om' que tem aetividade antivirulenta.The preparation of an intermediate which is useful in the preparation of the compound of the formula ## STR1 ## in which the activity antiviral.

A ZUUljJUi:· í.O pSí 1EXAMPLES:

Ep-A--141 927 ÍBeechasTi Sroup p,l>c> ) iclovir s a sua utilização como agente Θ24 CBeecham Broup p = 1=,0 = ) descreve a descrsvs o an t i v i r u 1 en to •ua pró—droga, o famciclovir» 0 periciclovir e o famei estrutura CA) e CB)= respectivaiientes avir t'ê'ín rnsulas deEp-A-141,927 (Eds.), Sroup p, l > c > ) and its use as agent Θ24 CBeecham Broup p = 1 =, = = describes the prodrug inhibitors, famciclovir pericyclovir and the structure CA) and CB) respectively t'ê'in

(B)(B)

(D) em que Q representa um grupe halo5 por exemplo, iodo ou jeparável„ tal como hidroKi ou estru- ir* a de «. ± m ÍL£?3S? de roúltipi Qv-.. f — “ — * Jtí ts Ainda que o estru tus v"a (D.? mas θίπ que Q é SIA uS t. i tu í d i t õrmu 1 a de estrutu rs (I)« O intermediário de cadeia lateral de fórmula d« tura (D) nSo está prontemente disponível e ώ preparada par ismposto de fórmuls sár acetato, icS.(D) wherein Q represents a group halo, for example iodo or selectable "such as hydroxy or hydrocarbyl. (M, 4H); Although the structure of the compounds of formula (I) and (II) is more preferred than those of formula (I), the compound of formula (I) side chain of formula (D) is not available and is prepared by the method of formula (I).

ODb‘iE-5 SST* «*: J‘5 S l·"· Π Γ! i’i _~1 |_'» cpsi! -n oartir de 1,i,2-etanotri .carbo Kilato de trietilo c orne r c i a 1 men te disponível por uma mod afie: :ação do método tíS V¥ c d lí Ba x 1 ev e t a 1 1= = d a ura» Chem., 19è2, não é possível separável r"T: U X I ! í i í. " diferenças1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 1. -carboxylic acid 1,1-dimethylethyl ester Triethyl ketone is available from a method of the following general formula: ## STR1 ## ., 19è2, it is not separable r " T: UXI! . " differences

ele etiv csfiien' te um Ejnc, r | i =,-V p (_f "UP· SCStDXi par* a um grupo uma . V0Z que e 1 es estão todas numa viz inhanç a química e d i ll otq! i se qi .1 í Sll iCÃ .í Sm iLlit provável que estaoe X 0ÇízK entre as funcional idades»he is a scientist, i =, - V p (_f " UP · SCStDXi to a group a V0Z that e 1 es are all in a chemical viz uction that is likely to occur between the functionalities »

Foi agora c aberto um processo novo que Lonvertfcí um [posto ds fórmula de 0 s t r u t u r a ( I), o tria c e t a fco 3 pa r a o oetato de fórmula i_5 wl estrutura CII \ tt ,· M (II) C on cordantemeu te 5 D presente inv^ ento pf i-J p f -cions ui processo para a preparação de mn cooíDosto ede ; Qf f«ta la de est.ru tu ra (II)? c on t o r me anter1o r men te definido.. pr DCSSBG esso que coiivA novel process has now been opened which provides a compound of the formula (I), the title compound of formula (I), and the structure of the formula (II) further comprising a process for the preparation of a compound of formula (I) What is the meaning of this (II)? as defined above. DCSSBG is the same as that

6 66 6

preende o tratamento de um composto de fórmula de estrutura <I>, conforme anteriormente definidos com uma hidrolase microbiana.comprises treating a compound of the formula " I ", as defined above with a microbial hydrolase.

As hidrolases microbianas adequadas sSo encontradas em microorganismos que incluem Penicxllia s Bactéria,, em particular Penicillium freguentans IMI 92265.Suitable microbial hydrolases are found in microorganisms including Penicillium s Bacteria, in particular Penicillium freguentans IMI 92265.

Os organismos são cultivados num caldo nutriente ou outro meio de cultura adequado a uma temperatura da i0--50 °C, preferivelmente cerca de 20-40 °C, de acordo com a natureza do organismo empregue. As reacções podem ser levadas a cabo neste meio ou num meio alternativo ou solução de sal após a separação s transferência das células. AIternativaroente, podem ser utilizadas enzimas purificadas ou parcialmente purificadas após a disrupçSo celular e o fraccionamento das células. A reacção é levada a cabo a um pH que se situa numa gama desde 3 até Í0, preferivelmente desde 5,0 até 8,#;, usualmen-te a uma temperatura de 10-40 °C ou 2Θ-4Φ *C. A transformação da enzima pode ser melhorada no rendimento na presença de sulfato de amónio, preferivelmente í molar.The organisms are cultured in a nutrient broth or other suitable culture medium at a temperature of 150-50 ° C, preferably about 20-40 ° C, according to the nature of the organism employed. The reactions may be carried out in this medium or in an alternative salt solution or solution after separation and transfer of the cells. Alternatively, purified or partially purified enzymes may be used after cell disruption and cell fractionation. The reaction is carried out at a pH in the range of 3 to 10, preferably from 5.0 to 8, usually at a temperature of 10-40 ° C or 2 4 -4 ° C. The enzyme transformation can be improved in the yield in the presence of ammonium sulfate, preferably in the molar ratio.

Tipicamente, a enzima no limite da célula ou na forma livre pode ser imobilizada e re-utilizada. No caso de Penicxllium freguentans INI 92265 isto pode ser feito várias vezes sem perda significativa de actividade. A concentração do substrato pode ser aumentada até 1 % ou mais Cp/v>. Por isso, pode-se entrever um método de produção contínuo,, passando o substrato sobre a enzima imobilizada numa coluna, reactor em anel ou reac tor sesne 1 han te „Typically, the enzyme at the boundary of the cell or free form can be immobilized and reused. In the case of Penicxllium freguentans INI 92265 this can be done several times without significant loss of activity. The concentration of the substrate may be increased to 1% or more Cp / v>. Thus, a continuous production method can be envisaged by passing the substrate over the enzyme immobilized on a column, ring reactor or reactor 1,

' V- t . 0 produto é purificada por extracçãa para um solvente adequado= podendo a seguir ser facultativaments cromatografado* 0 processo tem a vantagem de serem prcsduzidas quantidades mínimas do produto lateral de fórmula de estrutura. (III).'Vt. The product is purified by extraction into a suitable solvent = hereinafter optionally chromatographed. The process has the advantage that minimal amounts of the side product of the structure formula are given. (III).

Os seguintes Exemplos ilustram o invento» Será apreciado que os rendimentos podem ser melhorados levando a cabc melhoramentos na estirpe do organismo por técnicas conhecidas» EXEMPLO 1The following Examples illustrate the invention. It will be appreciated that yields can be improved by bringing about improvements in the strain of the organism by known techniques. EXAMPLE 1

Cultura de_Penici.ljiym, freguentans Ijlj.„92265Culture de_Penici.ljiym, freguentans Ijlj. "92265

Duas laçadas de micélio de Peniçillium freguentans IMI 92265 foram misturadas em 4 ml de Tween 80 a 0,02 % em água e foram utilizados 2 ml da suspensão para inocular 4Θ ml da meio de cultura semente num bailo Erlenmeyer de 250 ml» 0 meio de cultura semente compreendia \% peso/volume) licor de infusão de milho (4 %>, melaço (2,6 %), CsCCL» (O,5 %> e solúveis de destiladores d·' (Scotafeed) (2 %> em égua desionizada ajustada para pH 5,2= Depois de agitação a 24® rpm a 28 °C durante 72 horas, foi utilizado 1,5 ml do meio de cultura semente para inocular 4® ml de meio de produção em balões Erlenmeyer de 25© ml» Este meio compreendia CA peso/volume) glicose (3 %), caldo nutriente (©,8 %), extracto da desionizada com agitaçãc levedura {Q,2 ajustada para a 24% rpm, a %) e ex tracto * pH UjÕs Estes 28 ULr 9 durante le malte í&,3 balões foram 72 horas» %), em âqua incubados,Two mycelial loops of Penicillium freguentans IMI 92265 were mixed in 4 ml of 0.02% Tween 80 in water and 2 ml of the suspension were used to inoculate 4 ml of the seed culture medium in a 250 ml Erlenmeyer flask. (4%), molasses (2.6%), CsCCL (0.5%) and distillers (Scotafeed) solids (2% w / v) > in deionized water adjusted to pH 5.2 = After stirring at 24Â ° rpm at 28Â ° C for 72 hours, 1.5 ml of the seed culture medium was used to inoculate 4Âμl of production medium into Erlenmeyer flasks This medium comprised CA weight / volume) glucose (3%), nutrient broth (0.8%), deionized extract with yeast shaking (Q2 adjusted for 24% rpm,%) and ex These flasks were incubated for 72 hours at 37 ° C for 3 hours.

EXEMPLOEXAMPLE

Hidrólise de éster estereosselectiva com células—çomgleta= d_ Penicilliu-m freguentans IHI 92265 0 triacetato de fórmula de estrutura <1/ tcâ adi-ionad- a balões em agitação de cultura de PgQJ£iJLlJiM : 92265, produzida como no Exemplo 1» para dar uma concenu-áyâo dc substrato final de 4 «g.tnL"1· Os halSes foram em seguida agitados a 24© rpm © 28 °c final mente-, foram ensaiados os produtos, a extracção do sobrenadante com clorofórmio» apa= s.sn uri í uy®-· - .rn^ira foi ensaiada por HF'LC» η fase urgani5- substrato com o microorganismu conversão de 15 % do substrato iroporção do produto í ϊ Π Γ “vl ^ 9ís9. Após incubação de 9 ho- 6 % para o produto, e a propor· -reoisómero (III) foi de 97 s 3» _ „»{3 de mcubacão do Depp , foi indicada uma durante & hor** · , ,, diacetato < 11 > e a para o produto j sófflerο (III) foi da o seu estsreO·1'' . „sida uma conversão de ras, foi inaí·’"" , ^ (II) para o seu est clo de- produt'- EXEMPLO 3 ..rificacão parcial de uma esterase estereosselectiva Extraccão e 6^ - freguentans IMI 95265 de Penicil--------- .-r-éiio de 1,6 1 de meio de cultura de Penicillium 0 m3· ‘ rwjT 92265, produzido de acordo com o Exemplo 1, foi f reguentans 1’Estereoselective ester hydrolysis with β-mercapto = β-penicillin-freguentans The triacetate of the structure formula # 1 was added to stirred flasks of 2: 1 culture: 92265, produced as in Example 1. to give a final substrate concentration of 4 μl. The halides were then stirred at 24 ± 1 ° C and finally, the products were assayed, extraction of the supernatant with chloroform, The microorganism was assayed by HFLCLC on the substrate phase with the microorganism, 15% conversion of the substrate product iroporide. After incubation of 9-6% for the product, and the pro-isomer (III) was 97% of the Depp incubation, one was indicated during? hor **, diacetate < 11 > and for the product alone (III) was from its ester 1 ''. "It was a conversion of ras, it was inaí '' " (II) for its deodorant stage. EXAMPLE 3 Partial elution of a stereoselective esterase Extraction and 6-fluorine IMI 95265 Penicillin 1.6 1 of Penicillium culture medium 0 93265, produced according to Example 1, was reguentans 1 '

separada par centrifugação <Ιό&ΘΘ 15 10 fliin: arrefecimento até 4 C'U, A biomassa foi ressuspsnsa até &5Θ ml em tampão Tris ® 51 M a pH 7,5 e as * IJ 1 f o ram f rac c i on ad as utilizando uma p rensa Francesa Cí: JU pSi — Õ&Xtí KqNm ) sás cozeduras d? ξ 1amas ds células» Aoós- c sn t. r i fuqaçao í23'®®® κ π = 'JM mm 5 4 '•'C -} , O SQDf "Sílíl d ante f a j listado para pB = /, í pala adição de hidróxido de sódio 1 M e foi~ lhe adicionado, com agi taç áo, uma soAUção de 3«65 q de sul fato de estreptofliic ina em 5 mt de á guas depois de 0,5 ho Γά5 a Θ C, o i extracto de células TQi rentrifugado <·$ψΘ&Θ k q? 2® mirss 4 °C) jbrenadante separado foi trazido até um nível de saturação de êS % de sulfato de amónio, pela adição de sulfato de amónio sólido sob agitação»separated by centrifugation for 15 minutes: cooling to 4 ° C. The biomass was resuspended to &5; ml in Tris® 51 M buffer at pH 7.5 and the fractions were dried adducts using a French ply C: JU p p p p p s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s ξ cells cells. The slurry was added to pH 5 by adding 1M sodium hydroxide and added to it. , with stirring, a solution of 3.56 g of streptofloxacin sulphide in 5 ml of water after 0.5 hr to 5 ° C, the exchanger of TQi cells, ? 2 m.s at 4 ° C.). The separated supernatant was brought to a saturation level of 80% ammonium sulfate by the addition of solid ammonium sulfate under stirring.

Após 15 minutos a & °C;i a que se seguiu uma centrífuga- ção (230ΘΘ xg? 10 m i n 5 4 °C)5 o sol irenadante traz ido até um nível de s- aturscão di e 8Θ % de sulf como an teriormen te» Após 15 mx nutos a Θ °C, uma r reparado foi sulfato de amónio» como anteriormente, s a separação do sobrenadante deixaram um precipitado, que foi dissolvido em 7,5 cr.L de tampão Tris 25 m!i a pH - 7,5» Esta solução foi dessalgada em colunas Sepftadex PDi®, de acorda com as instruções do fabricante, eluindo com tampão Tris 25' íTíM a dH = 7,5'» um de que vo1ume de 2® mL com água dc~s.i.on resina psi r"iTii.?ÍlíSiZlor* cl iónic :& (DEi A preparação de proteína dessalgada, foi feita, até as dssionizada e aplicada, a uma coluna -Tr isac ry1« 7,5 κ 1»8 cm) do pré-equi1ibrada com tampão Tris 25 li dM a pH = 7,5» A foi f si >_a com es-"ce tampão a, durante 8 horas, com um e 1 insar de solução de sulfate i de amór lio 0 - 30® mM no mesmo tampão.After 15 minutes the & After centrifugation (230 æg / 10 min 54øC) the precipitate was added to a sieve concentration of 8% sulfur as above. After 15 minutes, at? C, a repaired ammonium sulfate was prepared as above, and the separation of the supernatant left a precipitate which was dissolved in 7.5 cc of 25 mM Tris buffer pH 7.5. desalted on Sepftadex PDi® columns, in accordance with the manufacturer's instructions, eluting with Tris buffer 25 ÂμM to dH = 7.5 °, one volume of 2 ml of water with psi resin. ≪ / RTI > (DEI). The desalted protein preparation was made, to the desionated and applied, to a Tris-β1 7.5 Âμ-1.8 cm column) of the pre-equilibrated 25 ÂμM Tris buffer at pH = 7.5 The A solution was buffered for 8 hours with a solution of 0.30 mM mM sulfate solution in the same buffer.

As fracções da coluna foram ensaiadas para a actividade da esterase, por incubação de 256 μΐ de fracção de proteína da coluna com 25© μΐ de uma solução a 4 mg «ml A de triacetato (Ϊ) em tampão Tris ©,Ξ M a pH = 7,5 com sulfata de amónio ©,4 M, Após 18 horas â\ temperatura ambiente, a solução foi extraída com 125 μΙ_ de clorofórmio, que foi ensaiado por HPLC« Foram isoladas duas fracções de proteína que mostraram 8© % de conversão de (I) para o produto <II), e nunca mostraram mais do que 11 % do estereoisómero (111) na mistura de diacetato (II) ε (III). As fracções de proteína da coluna foram faculfcativamente concentradas por ultrafiltração e foram determinadas as concentrações- de proteína (ffethod of M« íi» Bradford, Anal, Biochem,, 1974, 72, 248-254). EXEMPLO 4Column fractions were assayed for esterase activity by incubation of 256 μl of protein fraction of the column with 25 μg of a solution of 4 mg of triacetate (Ϊ) in Tris ®, pH Ξ M buffer at pH = 7.5 with 4 M ammonium sulfate. After 18 hours at room temperature, the solution was extracted with 125 μl of chloroform which was assayed by HPLC. Two protein fractions were isolated which showed 80% conversion (I) for the product < II), and never showed more than 11% of the stereoisomer (111) in the diacetate (II) ε (III) mixture. The protein fractions of the column were facullatively concentrated by ultrafiltration and the protein concentrations (Method of Methyl, Bradford, Anal, Biochem., 1974, 72, 248-254) were determined. EXAMPLE 4

Hidrólise do éster estereosselestivo com preparação de enzima a partir de Penicillium frequentans IMI 922&5 A 125 μΐ de uma solução a 4<ng»ml de triacetato (I) em tampão Tris 1,2 M a pH - 7,5, foi adicionado 25© μΐ de uma preparação de enzima descrita no Exemplo 3 com uma concentração de proteína de 2,67 mg,ml Λ e 125 μΐ de solução de sulfato de amónio 4 M em tampão Tris 12 M a pH = 7,5» Após mistura suave, as reacções foram incubadas a 2© °C durante 4 horas e, em seguida, os produtos foram extraídos para 125 μΐ de clorofórmio e ensaiados por HPLC. Verificou—se uma conversão de 97 % de substrato (X) para diacetato (II) e a proporção de produto (II) para o seu estereoisómero (III) foi de 95s5. EXEMPLO 5Hydrolysis of stereoselective ester with enzyme preparation from Penicillium frequentans IMI 922 & 5 To 125 μl of a solution of 4 μg of triacetate (I) in 1.2 M Tris buffer at pH 7.5 was added 25 μg of an enzyme preparation described in Example 3 with a protein concentration of 2.67 mg, ml Λ and 125 μl of 4 M ammonium sulfate solution in 12 M Tris buffer at pH = 7.5. After mixing The reactions were incubated at 20 ° C for 4 hours and then the products were extracted into 125 μl of chloroform and assayed by HPLC. There was a conversion of 97% of substrate (X) to diacetate (II) and the ratio of product (II) to its stereoisomer (III) was 95%. EXAMPLE 5

Efeito, dp sulfato de amónio sobre a hidrólise do ...éster ...catalisada gor enzimaEffect, dp ammonium sulfate on the hydrolysis of the ... ester ... catalyzed gor enzyme

Foi obtida uma preparação de esterease, pelo processo descrito no Exemplo 3, cosi uma concentração de 'proteína ds 3»5ò sq.ffil Um alíquota de 25Φ ul desta preparação foi adicío— nado a cada uma ds duas misturas ds 5 mg de triacetato íI) em 125 μΐ de solução de sulfato de amónio 4 M em tampão Tris 12 M a pH = 75-5 e à outra reacção foi adicionado 125 μΐ tíe tampão Tris 12 M a pH = 7,,5nA stereose preparation was obtained by the procedure described in Example 3, using a protein concentration of 3.55 g. An aliquot of 25 Âμl of this preparation was added to each of the two 5 mg triacetate mixtures ) in 125 μl of 4 M ammonium sulfate solution in 12 M Tris buffer at pH = 75-5 and to the other reaction was added 125 μl of 12 M Tris buffer at pH = 7.5 n

Após mistura suave durante 19 horas a 2Θ °CS as rsac--ções foram extraídas para 125 μΐ de clorofórmio e ensaiadas por HPLC* A reacção na presença do sulfato ds amónio mostrou 71 % de conversão de triacetato (I) para diacetato (II), enquanto na ausãncia ds sulfato de amónio a conversão foi de 28 7.= Ma presença do sulfata de amónio a proporção do diacetato (II) para o seu estsreoisómsro (III) foi de 94só5 enquanto na susfncia de sulfato de amónio a proporção foi de 82s 18 * EXEMPLO.,„6After gentle mixing for 19 hours at 2 ° C, the reactions were extracted into 125 μl of chloroform and assayed by HPLC. Reaction in the presence of ammonium sulfate showed 71% conversion of triacetate (I) to diacetate (II) , while in the absence of ammonium sulphate the conversion was 28.7. In the presence of ammonium sulphate the ratio of diacetate (II) to its esterase (III) was 94%, while in ammonium sulphate the proportion was EXAMPLES: 6

Mobilizaca.Q da esterase com Sepharose activada com brometo de çianpgénioActivation Sepharose esterase Mobilizaca.

Uma preparação de enzima com uma concentração de proteína de 1 ;i74 sng»ml“^ foi preparada de acordo com o processo descrito na Exemplo 3 e i f25 ml desta preparação foi misturada com 1,25 ml. de "tampão de acoplamento" (solução de bicarbonato de sódio ©, 1 M e cloreto de sódio >355 M a pH = 8 = 3) r A cromatograf ia esta soluçS to deu . i 5 3 m 1 d T r i s t i n ha sido removido«An enzyme preparation having a protein concentration of 1.74 ml ml -1 was prepared according to the procedure described in Example 3 and 25 ml of this preparation was mixed with 1.25 ml. " coupling buffer " (1 M sodium bicarbonate solution and sodium chloride> 355 M at pH = 8 = 3). Chromatography of this solution gave the title compound as a white solid. i 5 3 m 1 d T r i s t i n has been removed «

Esta solução foi adicionada a © 5õ ml de Sepharose 4)3 activada por brometo de cianogênio que tinha sido preparada de acordo com as instruções do fabricante. Após mistura durante 2 horas, deixou~se assentar o gel e regeitou·—se o sobrenadante. Ao gel foi adicionado 4 ml de glicina β, 1 11 em ‘'tampão de acoplamento" e a suspensão foi misturada durante mais 1,5 hora à temperatura ambiente. 0 gel foi em seguida lavada sequencialmente com "tampão de acoplamento", tampão acetato ®,4 M a pH 4,0 em solução de cloreto de sódio ©,5 M e "tampão de acoplamento”. 0 gel foi armazenado em suspensão a 4 °C= EXEMPLO 7This solution was added to 50 ml of cyanogen bromide activated Sepharose 4) 3 which had been prepared according to the manufacturer's instructions. After mixing for 2 hours, the gel was allowed to settle and the supernatant was regeared. To the gel was added 4 ml of β-glycine, 11 in a " coupling buffer " and the suspension was stirred for an additional 1.5 hours at room temperature. The gel was then washed sequentially with " coupling buffer ", acetate buffer, 4 M at pH 4.0 in 5 M sodium chloride solution and " coupling buffer ". The gel was stored in suspension at 4 ° C. EXAMPLE 7

Utilização repetida da esterase estereosselsctiva imobilizadaRepeated use of immobilized stereoselective esterase

Qiii de de to ae amãnxo ire* Ao ato de amónio 4 II e 72 mL de tampão Tris A enzima imobilizada, em gel foi preparada de acordo o descrito no Exemplo 6, imobilizando 5 mq de proteína por mL gel, e 144 mL desta preparação foi lavada com um volume igual tampão T ris Φ,1 M a nH ^ r“ / 3 3 jt conten© gel toi adicionada ~yfv __: / jC. iifs— de solução uma solu çã.o de 6ΘΘ mg de triacetato ?'.-i ,-fX *v| .t\ v íj » t 3 Vu-i pH = 7,5. A mistura de i r θ ac c St o f o i jitada a Í4 °C durante 5 díti usn tf xTugaçáo e remc*çao dos sobrenadantes. A preparação de enzima imobilizada foi ainda lavada com tampão Tris 0,1 M a pH = 7,5, contendo sulfato de amónio 1 M, e os sobrena-dantes combinados foram extraídos para clorofórmio para se obter, após secagem e evaporação? 4Θ3 mg de um óleo límpido= Este óleo revelou compreender os- compostos (II) e (III) numa proporção de 94s &, resoec tivamen te„ zada foi Γ855usP&n sulfato da afnónio 1 Bifi !, e anssienada aThe immobilized enzyme, gel was prepared as described in Example 6, immobilizing 5 m 2 of protein per ml of gel, and 144 ml of this preparation was washed with a volume equal to 1M Tris buffer, and the combined extracts were washed with water. A solution of 60 mg of triacetate is added dropwise to the solution. and pH = 7.5. The reaction mixture was stirred at 14 ° C for 5 days and the supernatants were discarded and refluxed. The immobilized enzyme preparation was further washed with 0.1M Tris buffer pH = 7.5 containing 1M ammonium sulfate, and the combined supernatants were extracted into chloroform to give, after drying and evaporation - This oil showed to comprise the compounds (II) and (III) in a ratio of 94%, resoecylated was δ 855usP < " < / RTI >

0 s í M a. pH A mesma cozedura foi reutilizada como se descreveu ante-riormente noutras nove ocasiões, dando resultados semelhantes em0 pH The same cooking was reused as described above on other nine occasions, giving similar results in

Um alíquota de enzima imobilizada em gel foi utilizado, soo ss cono içc-es ante riormente dsscritssj sm oezas-seis ocssiHss. sem nenhuma, redução detectável na actividad© ou estereosselecti— vidadSr, conforme ensaido oor HPLC.An aliquot of gel-immobilized enzyme was used, except for the above six-eighth times. without any detectable reduction in activity or stereoselectivity, as tested by HPLC.

EXEMPLO SEXAMPLE S

Imobilização d-a esterase com Phenil Sepharose sólido r · T 03. e 625 t 1 de A 0ΘΦ μ1 de qel de Phenil Seoharose CL—4B sólido adicionado 625 μΐ de solução de sulfato de amónio 4 tampão Tris 0S4 M a pH 1,25 ml de uma prepara* proteína de 3. , / 4 mg * m í Exemplo 3* A s uspensão aflioien te ou? ~an te 3® minu duas vezes com 4 ml de sul 7,5* A esta mistura foi adicionado ífão ds enzima com uma concentração de que foi preparada de acordo com o foi suavemente agitada ã temperatura —tf! Τ 4* ,-tImmobilization of the esterase with solid Phenyl Sepharose r · T 03. and 625 t 1 of A 0 · 1 μl of Phenyl Seoharose CL-4B qel qel added 625 μl ammonium sulfate solution 4 Tris 0S4 M buffer at pH 1.25 ml of a protein preparation of 3. 4 mg / ml. Example 3 The afliogenic suspension or? was added dropwise with 4 ml of 7.5% Na. To this mixture was added the enzyme to a concentration which was prepared according to which it was gently stirred at room temperature. Τ 4 *, -t

o de amónio 1 M em tampão Tris θ,1 M a phthe 1 M ammonium in 1 M Tris θ buffer at pH

Claims (1)

lã. Processo para cl preparação de um composto de fórmula de estrutura <II)s (II) car acterizado por compreender d tratamento de um composto de fórmula de estrutura (I)sover there. A process for the preparation of a compound of the formula (II): (II), which comprises treating a compound of formula (I) OAc (I) com uma hidrolase microbiana. r 1C 8.d O DO Γ Prui_tefl=-'=íQ de acardu com a re {?. hidrolase micrdblana ter or LcaçSo 1» caracte·-em Per* i c i 1 lia ouOAc (I) with a microbial hydrolase. r 1C 8.d The DO Γ Prui_tefl = - '= de de ac ac ac ac ac ac ac. A hydrolase derivative of Formula 1 is disclosed in US 3ã» Processo de acorda com a reivindicação 2r< caracte--rizsdo por a hidrolsse microbiana ter origem no Penici 11 ium f reementans IΜ ϊ 922ώ5 = 4â. Processo de acordo cosa qualquer uma das reivindicações 1 a ôcsrsctsrissQo por a rsscção ter 1 uosr na presença de sulfato de amónio» Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4s caracterizado por a -enzima ser imobilizada e reutilizada num método de produção continua,, Lisboa,, de Fevereiro de 19913. A process according to claim 2, characterized in that the microbial hydrolysis originates from the Penicillium ium fereementans IΜ ϊ 922ώ5 = 4â. Process according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the enzyme is immobilized and reused in a continuous production method, , Lisbon, February 1991 RUA VK/TOR CORDON, 10-A 3,e 1200 USBOARUA VK / TOR CORDON, 10-A 3, and 1200 USBOA