JPH05503428A - pharmaceuticals - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 医薬品 本発明は、抗ウィルス活性を有する化合物の製造に宵月な中間体の製造法に関す る。[Detailed description of the invention] pharmaceuticals The present invention relates to a method for producing an intermediate that is useful for producing compounds with antiviral activity. Ru.

εＰ−Ａ−１４１９２７（ビーチャムグループ）は化合物ベンシクロビル（ｐｅ ｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）と抗ウィルス剤としてのその使用を開示しており、ＥＰ− Ａ−１８２０２４（ビーチャムグループ）はそのプロドラッグであるフェンシク ロビル（ｆａａ＋ｃｉｃｌｏｖｉｒ）を開示している。εP-A-141927 (Beacham Group) is the compound benciclovir (pe nciclovir) and its use as an antiviral agent, EP- A-182024 (Beacham Group) is its prodrug Phensic. Lovir (faa+ciclovir) is disclosed.

ベンシクロビルとフェンシクロビルはそれぞれ式（Ａ）および（Ｂ）：ＨＯ−Ｃ Ｈ２−０！　−ＣｌＩ２−　ＯＨで表される。Benciclovir and fenciclovir have formulas (A) and (B), respectively: HO-C H2-0! It is represented by -ClI2-OH.

上記化合物の製造法は、式（Ｃ）： の２−アミノ−６−クロロプリンと式ＣＤ）：［式中、Ｑ　ハヒドロキシやハロ （例えばヨードまたはブロモ）のような離脱基である１の側鎖中間体との反応を 包含する。The method for producing the above compound is represented by formula (C): 2-amino-6-chloropurine and formula CD): [wherein Q is hydroxy or halo reaction with a side chain intermediate of 1 that is a leaving group (such as iodo or bromo) include.

式（Ｄ）の側鎖中間体は簡単には入手できず、多段合成によって製造される。Ｑ をアセテートで置き換えた式（Ｄ）の化合物、すなわち式（１）・の化合物は、 Ｗ、Ｊ、　Ｂａ１ｌｅｙ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、、　１ ９６２に記載の方法の変法を使って、市販のトリエチル１．１．２−エタントリ カルボキシレートから製造することができるが、アセトキシ基の１つを離脱基に 選択的に変換することは不可能である。なぜなら、それらは全て同じような化学 的環境にあり、化学的加水分解がこれらの官能基を識別できるとは思えないから である。Side chain intermediates of formula (D) are not readily available and are produced by multi-step synthesis. Q The compound of formula (D) in which is replaced with acetate, that is, the compound of formula (1), is W, J, Ba1ley at al, J, Org, Chem, 1 Commercially available triethyl 1.1.2-ethanetri It can be prepared from carboxylates, but one of the acetoxy groups is used as a leaving group. It is not possible to convert selectively. Because they all have similar chemistry chemical hydrolysis is unlikely to be able to distinguish between these functional groups. It is.

微生物のヒドロラーゼ（加水分解酵素）を使って式（［）の化合物、すなわちト リアセテートを式（［Ｉ）　： のジアセテートに変換する新規な方法が今回開発された。Using microbial hydrolases, compounds of the formula ([), i.e. Reacetate is expressed by the formula ([I): A new method has now been developed to convert diacetate into diacetate.

かくして、本発明は、先に定義した式（１）の化合物を微生物のヒドロラーゼで 処理することからなる、先に定義した式（Ｉ【）の化合物の製造法を提供する。Thus, the present invention provides that the compound of formula (1) as defined above is treated with a microbial hydrolase. Provided is a method for the preparation of a compound of formula (I) as defined above, comprising the steps of:

適当な微生物ヒドロラーゼはペニシリウム属およびバクテリウム属を含めた微生 物中に見いだされ、特にペニシリウム・フレクエンタンス（Ｐｅｎｉｃｉ　ｌｌ ｉｕｍｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ）　ＩＭＩ　９２２６５に由来するものである。Suitable microbial hydrolases include microorganisms of the genus Penicillium and Bacterium. It is found in many things, especially Penicillium frequentans (Penicillium ium frequency) is derived from IMI 92265.

微生物は栄養培地または他の適当な培地で１０−５０°Ｃの温度、好ましくは約 ２０−４０°Ｃにて、使用する微生物の性質に応じて増殖させる。反応はこの培 地中で、あるいは細胞の分離および移動後に別の培地または塩溶液中で行うこと ができる。The microorganism is grown in a nutrient medium or other suitable medium at a temperature of 10-50°C, preferably about Grow at 20-40°C, depending on the nature of the microorganism used. The reaction Can be done underground or in a separate medium or salt solution after cell separation and transfer Can be done.

また、細胞の破壊および分画化後に精製したまたは部分Ｗｉ！！！！シた酵素を 使用することもできる。Also, purified or partial Wi! after cell disruption and fractionation! ! ! ! Shit enzyme You can also use

この反応は３−１Ｏのｐｌ範囲、好ましくはＰＨ５，０−８，０で、通常１０− ４０°Ｃの温度、好ましくは２０−４０℃にて実施する。The reaction is carried out at a pl range of 3-10, preferably at a pH of 5,0-8,0, usually 10- It is carried out at a temperature of 40°C, preferably 20-40°C.

酵素変換反応は硫酸アンモニウム（好ましくは１モル）の存在下で収量を改善す ることができる。Enzymatic conversion reactions can be performed in the presence of ammonium sulfate (preferably 1 mol) to improve yields. can be done.

一般的には、細胞に結合したまたは細胞を含まない形の酵素を固定化して、それ を再使用することができる。ペニシリウム・フレクエンタンス［ＭＩ　９２２６ ５の場合には、有意な活性の低下なしに数回実施することができる。基質濃度は １％（Ｗ／Ｖ）またはそれ以上に高めてもよい。かくして、円柱形のループ反応 器または同様の反応器中の固定化酵素に基質を通過させる連続製造法が意図され る。Typically, enzymes are immobilized in cell-bound or cell-free form; can be reused. Penicillium frequentans [MI 9226 In case 5, it can be carried out several times without significant loss of activity. The substrate concentration is It may be increased to 1% (W/V) or more. Thus, the cylindrical loop reaction Continuous manufacturing methods are contemplated in which the substrate is passed through an immobilized enzyme in a reactor or similar reactor. Ru.

生成物は適当な溶媒抽出により精製し、その後場合によりクロマトグラフィーに かけてもよい。The product is purified by extraction with a suitable solvent, followed by optional chromatography. You can put it on.

この製法は最小限の式（ＩＩＩ）の副生物が製造されるという利点を育する。This process offers the advantage that minimal by-products of formula (III) are produced.

以下の実施例は本発明を例示するものである。既知の技法を使って微生物株の改 良を行うことにより、収量を増加し得ることが理解されるであろう。The following examples illustrate the invention. Modification of microbial strains using known techniques It will be appreciated that yields can be increased by doing better.

実施例１ ペニシリウム・フレクエンタンスｔＭＩ　９２２６５の培養ペニシリウム・フレ クエンタンスＩＭＩ　９２２６５の斜面からの白金耳２杯分の菌糸体を４ｍｌの ０．０渡Ｔｗｅｅｎ　８０／水中で混合し、その懸濁液２ｍｌを２５０ｍ１エル レンマイヤーフラスコ中の種培地４０　ｍｌに接種した。種培地（％冑／Ｖ）は ｐＨ５，２に調整した脱イオン水中のトウモロコシ浸出液（４％）、糖蜜（２， ６％）　、ＣａＣＯ５（０，５％）およびｄｊｓｔｉｌｌｅｒｓ’　５ｏｌｕｂ ｌｅｓ　（Ｓｃｏｔａｆｅｅｄ）　（２％）から成っていた。２４Ｏｒｐｍ、　 ２８°Ｃで７２時時間上う培養後、種ブロス１，５ｍｌを２５０　ｍｌエルレシ ンマイヤーフラスコ中生産用培地４０ｍ１に接種した。この生産用培地（％Ｗ／ Ｖ）はｐＨ５，６に調整した脱イオン水中のグルコース（瀉）、栄養ブロス（０ ，８％）、酵母エキス（０，２％）および麦芽エキス（０，３％）から成ってい た。これらのフラスコを２４０　ｒｐｍ、　２８°Ｃで振とうしながら７２時間 インキュベートした。Example 1 Culture of Penicillium flexentans tMI 92265 Add 2 cups of mycelium from the slope of Quentance IMI 92265 to 4ml. Mix 0.0% Tween 80/water and add 2ml of the suspension to 250ml 40 ml of seed medium in a Renmeyer flask was inoculated. Seed medium (%cold/V) is Corn infusion (4%), molasses (2,2%) in deionized water adjusted to pH 5,2 6%), CaCO5 (0,5%) and djstillers’5olub les (Scotafeed) (2%). 24Orpm, After incubation for 72 hours at 28°C, add 1.5 ml of seed broth to 250 ml 40 ml of production medium was inoculated in a Mayer flask. This production medium (%W/ V) Glucose in deionized water adjusted to pH 5,6, nutrient broth (0 ,8%), yeast extract (0,2%) and malt extract (0,3%). Ta. These flasks were incubated at 240 rpm and 28°C for 72 hours with shaking. Incubated.

実施例２ ペニシリウム・フレクエンタンス［Ｍ［９２２６５の全細胞による位置選択的エ ステル加水分解 実施例１のように生産したペニシリウム・フレクエンタンスｒＭＩ　９２２６５ の培養振とうフラスコに式（１）のトリアセテートを加えて、最終基質濃度を４ 　ＩＩＩｇ／ｍｌとした。その後、このフラスコを２４０　ｒｐｍ　２８℃で振 とうし、遠心分離および上清のクロロホルム抽出後に生成物について検定した。Example 2 Regioselective activation by whole cells of Penicillium frequentans [M[92265] stell hydrolysis Penicillium frequentans rMI 92265 produced as in Example 1 Triacetate of formula (1) was added to the culture shake flask to bring the final substrate concentration to 4. It was set as IIIg/ml. Afterwards, shake the flask at 240 rpm at 28°C. The product was assayed after milling, centrifugation and chloroform extraction of the supernatant.

有機相はＨＰＬＣで検定した。The organic phase was assayed by HPLC.

基質と微生物を６時間インキュベートした後に、基質のジアセテート生成物（１ １）への１５％転化が見られ、生成物（■１）対その位置異性体（［ｌＤの比は ９１９であった。９時間のインキュベーション後、生成物への６％転化が見られ 、生成物（ＩＩ）対その位置異性体（ＩＩＩ）の比は９７：３であった。After incubating the substrate and microorganism for 6 hours, the diacetate product of the substrate (1 1) was observed, and the ratio of product (■1) to its positional isomer ([lD is It was 919. After 9 hours of incubation, 6% conversion to product was observed. , the ratio of product (II) to its regioisomer (III) was 97:3.

実施例１のように生産したペニシリウム・フレクエンタンス１組９２２６５の培 養ブロス１．６Ｌから、４℃に冷却後遠心（１６，０００Ｘ　ｇ、　１０分、４ ℃）して菌糸体を分離した。このバイオマスを０．１Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７ ，５）中に再懸濁して６５０　ｍｌとなし、細胞スラリーの６０ｍ１バツチでフ レンチプレス（１２５０９Ｓｉ）を用いて細胞を破壊した。遠心（２３，０００ Ｘ　ｇ、　２０分、４℃）後、上滑に１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ７ ，１に調整し、水５ｍｌに溶解したストレプトマイシン硫酸塩３゜６５ｇの溶液 を攪拌しながら加えた。０°Ｃで０．５時間後、細胞抽出物を遠心（３９゜００ ０　Ｘ　ｇ、　２０分、４℃）し、分離した上清に固体の硫酸アンモニウムを撹 拌しながら加えて硫酸アンモニウムの６０％飽和濃度にした。０℃で１５分後、 遠心（２３，０００ｘ　ｇ、　１０分、４°Ｃ）シ、分離した上滑を前のように 硫酸アンモニウムの８０％飽和にした。０℃で１５分後、前のように再遠心し、 上溝を分離して沈殿物を残し、これを２５ＩＩＩ＆Ｉトリス緩衝液（ｐＨ７，５ ）　７．５　ｍｌに溶解した。この溶液を製造者の指示に従ってセファデックス ＰＤＩＯカラムにかけ、２５−トリス緩衝液（ｐＨ７，５）で溶離して脱塩した 。脱塩タンパク質調製物は脱イオン水で最高２０ｍ１の容量となし、２５ＩＩＩ Ｍトリス緩衝液ＣｐＨ７，５）で予め平衡化しておいたアニオン交換樹脂カラム （ＤＥＡε−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、　７．５　Ｘ　１．８　ｃｍ）にかけた。溶 離はこの緩衝液と、８時間にわたり、同じ緩衝液中の０−３００　ａＩ＆ｌ硫酸 アンモニウム溶液の直線勾配を用いて行った。A culture of Penicillium flexentans 92265 produced as in Example 1. From 1.6 L of culture broth, cool to 4°C and centrifuge (16,000 x g, 10 minutes, 4 ℃) to isolate mycelium. This biomass was mixed with 0.1M Tris buffer (pH 7). , 5) to make a total volume of 650 ml, and filter with 60 ml batches of cell slurry. Cells were disrupted using Lentipress (12509Si). Centrifugation (23,000 x g, 20 minutes, 4°C), add 1M sodium hydroxide solution to the top layer to pH 7. , a solution of 3.65 g of streptomycin sulfate dissolved in 5 ml of water. was added while stirring. After 0.5 h at 0°C, the cell extract was centrifuged (39°00 0 × g, 20 min, 4°C), and solid ammonium sulfate was stirred into the separated supernatant. The mixture was added with stirring to reach a 60% saturation concentration of ammonium sulfate. After 15 minutes at 0℃, Centrifuge (23,000 x g, 10 min, 4°C) and remove the separated supernatant as before. 80% saturation of ammonium sulfate was achieved. After 15 min at 0°C, recentrifuge as before. Separate the upper groove to leave the precipitate, which is added to 25III&I Tris buffer (pH 7,5). ) Dissolved in 7.5 ml. Add this solution to Sephadex according to the manufacturer's instructions. It was applied to a PDIO column and desalted by elution with 25-Tris buffer (pH 7.5). . Desalted protein preparations up to a volume of 20ml with deionized water, 25III Anion exchange resin column pre-equilibrated with M Tris buffer (pH 7,5) (DEAε-Trisacryl, 7.5 x 1.8 cm). melt Separation was performed with this buffer and 0-300 al&l sulfate in the same buffer for 8 hours. A linear gradient of ammonium solution was used.

カラム画分は、２５０μｌのカラムタンパク質両分を、０．４Ｍ硫酸アンモニウ ムを含む０．２Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）中のトリアセテート（Ｉ）の４ 　ｖａｇｌｍｌ　Ｇ液２５０μｌとインキュベートすることにより、エステラー ゼ活性について検定した。周囲温度で１８時間後、この溶液を１２５μｌのクロ ロホルムで抽出し、ＨＰＬＣで澗べた。For column fractionation, 250 μl of both column protein fractions were diluted with 0.4 M ammonium sulfate. 4 of triacetate (I) in 0.2 M Tris buffer (pH 7.5) containing By incubating with 250 μl of vaglml G solution, the ester The enzyme activity was assayed. After 18 hours at ambient temperature, this solution was poured into a 125 μl clot. It was extracted with loform and analyzed by HPLC.

生成物（ＩＩ）への（Ｈの８０％転化を示した２つのタンパク質画分を単離し、 両方ともジアセテート（１■）および（［［Ｄの混合物中の位置異性体（［［Ｄ か１１％以下であった。場合により、カラムタンパク質画分を限外濾過で濃縮し 、タンパク質の濃度を測定した（Ｍ、Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ、　 ＢｉｏｃｈｅＩＬ、　１９７４．７２．２４８−２５４に記載の方法）。Two protein fractions that showed 80% conversion of (H) to product (II) were isolated; Both regioisomers ([[D It was less than 11%. Optionally, concentrate the column protein fraction by ultrafiltration. , measured the protein concentration (M, M, Bradford, Anal, BiocheIL, 1974.72.248-254 method).

酵素調製物による位置選択的エステル加水分解１．２Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７ ，５）中のトリアセテート（■）の４　ｍｇ／ｍｌ溶液１２５μ＋に、２．６７ 　ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する実施例３に記載した酵素調製物２５０μ ｌと、１２ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中の４Ｍ硫酸アンモニウム溶液１２ ５μｌを加えた。穏やかに混合した後、反応混合物を２０℃で４時間インキュベ ートし、生成物を１２５μｌのクロロホルムで抽出し、）ｆＰＬｃで検定した。Regioselective ester hydrolysis with enzyme preparation 1.2M Tris buffer (pH 7) , 5) to a 4 mg/ml solution of triacetate (■) in 125μ+, 2.67 250μ of the enzyme preparation described in Example 3 with a protein concentration of mg/ml l and a 4M ammonium sulfate solution in 12mM Tris buffer (pH 7,5) 12 5 μl was added. After gentle mixing, the reaction mixture was incubated at 20°C for 4 hours. The product was extracted with 125 μl of chloroform and assayed by fPLc.

ジアセテート（［Ｄへの基質（［）の９７％転化が見られ、生成物（ＩＩ）対そ の位置異性体（Ｉ［Ｄの比は９５５で酵素触媒によるエステル加水分解に対する 硫酸アンモニウムの影響実施例３に記載の方法により、３．５６　ｍｇ／ｍｌの タンパク質濃度を育するエステラーゼ調製物を得た。この２５０μｌアリコート を１２ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）中の４Ｍ硫硫酸アンモニウム液液１２５ ｍに溶解したトリアセテート（ｆ）　５　ｍｇの２つの混合物に加え、他の反応 には１２ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，５）　１２５μｌを加えた。A 97% conversion of the substrate ([) to diacetate ([D] was observed, and the product (II) versus its positional isomer (I [D ratio is 955 for enzyme-catalyzed ester hydrolysis) Effect of ammonium sulfate By the method described in Example 3, 3.56 mg/ml of Esterase preparations were obtained that increased protein concentration. A 250 μl aliquot of this (12mM) 4M ammonium sulfate solution in Lys buffer (pH 7,5) 125 In addition to the two mixtures of 5 mg of triacetate (f) dissolved in 125 μl of 12 mM) Lys buffer (pH 7.5) was added.

２０°Ｃで１９時時間中かに混合した後、この反応混合物を２５０μｌのクロロ ホルムで抽出し、有機相をＨＰＬＣで検定した。硫酸アンモニウムの存在下での 反応はトリアセテート（Ｉ）のジアセテート（ＩＩ）への７１％転化を示したが 、硫酸アンモニウムの不在下では転化率か２８％であった。硫酸アンモニウムの 存在下で、ジアセテー１−　（ｒ　ｒ）対その位置異性体（Ｉｆｆ）の比は９４ ，６であり、一方硫酸アンモニウムの不在下ではその比が８２：１８であった。After mixing for 19 h at 20°C, the reaction mixture was diluted with 250 μl of chloride. It was extracted with form and the organic phase was analyzed by HPLC. in the presence of ammonium sulfate The reaction showed 71% conversion of triacetate (I) to diacetate (II); In the absence of ammonium sulfate, the conversion was 28%. ammonium sulfate In the presence of diacetate, the ratio of diacetate 1-(r , 6, while in the absence of ammonium sulfate the ratio was 82:18.

実施例６ 臭化シアン活性化セファロースによるエステラーゼの固定化１、７４　ｍｇ／ｍ ｌのタンパク質濃度を有する酵素調製物を実施例３に記載したように調製し、こ の１．２５ｍ１を１．２５ｍ１の“カップリング緩衝液“　（０，１Ｍ炭酸水素 ナトリウムおよび０．５Ｍ塩化ナトリウムの溶液、ｐｉ（８，３）と混合した。Example 6 Immobilization of esterase with cyanogen bromide activated Sepharose 1,74 mg/m An enzyme preparation with a protein concentration of 1 was prepared as described in Example 3 and 1.25 ml of “coupling buffer” (0.1M hydrogen carbonate) Mixed with a solution of sodium and 0.5M sodium chloride, pi(8,3).

この溶液でのセファデックスＰＤＩＯカラムによるクロマトグラフィーは酵素の 溶液（トリス緩衝液を除いた）３．５ｍｌをもたらした。Chromatography on a Sephadex PDIO column in this solution was performed to detect the enzyme. Provided 3.5 ml of solution (minus Tris buffer).

この溶液を製造者の指示に従って調製した０、６ｍｌの臭化シアン活性化セファ ロース４Ｂに加えた。２時間混合した後、ゲルを沈降させ、上澄みを捨てた。こ のゲルに“カップリング緩衝液”中の０．１Ｍグリシン４ｍｌを加え、この懸濁 液を周囲温度でさらに１．５時間混合した。その後、ゲルを順次“カップリング 緩衝液″、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液中のｐＨ４，０の０．４Ｍ酢酸緩衝液、 および“カップリング緩衝液″で洗った。ゲルは懸濁状態で４℃にて貯蔵した。This solution was added to 0.6 ml of cyanogen bromide-activated separate prepared according to the manufacturer's instructions. Added to loin 4B. After mixing for 2 hours, the gel was allowed to settle and the supernatant was discarded. child Add 4 ml of 0.1 M glycine in “coupling buffer” to the gel and suspend this suspension. The solution was mixed for an additional 1.5 hours at ambient temperature. Then, the gels are sequentially “coupled” buffer", 0.4 M acetate buffer at pH 4.0 in 0.5 M sodium chloride solution, and “coupling buffer”. Gels were stored in suspension at 4°C.

実施例７ 固定化した位置選択的エステラーゼの反復使用ゲル固定化酵素は実施例６に記載 したようにゲル１ｍｌ当たり５ｍｇのタンパク質を固定化させて調製し、この１ ４４　ｍｌを等量の１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７ ，５）で洗った。このゲルに４Ｍ硫酸アンモニウム溶液７２ｍ１および０．４Ｍ 　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）　７２　ｍｌ中のトリアセテート（［）　６００ 　ｍｇの溶液を加えた。Example 7 Repetitive use of immobilized regioselective esterases Gel-immobilized enzymes are described in Example 6. Prepare the gel by immobilizing 5 mg of protein per ml as described above. 44 ml of 0.1M Tris buffer (pH 7) containing an equal volume of 1M ammonium sulfate , 5). Add 72 ml of 4M ammonium sulfate solution and 0.4M ammonium sulfate solution to this gel. Triacetate ([) in 72 ml of Tris buffer (pH 7,5) 600 mg of solution was added.

この反応混合物を１４°Ｃで５時間振とうし、その後遠心して上溝を分離した。The reaction mixture was shaken at 14°C for 5 hours and then centrifuged to separate the upper groove.

固定化酵素調製物は１Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍｌリス緩衝液（ｐＨ７ ，５）でさらに洗い、合わせた上滑をクロロホルムで抽出して、乾燥および蒸発 後に透明な油４０３１１１ｇを得た。この油は９４：６の比で（１ｒ）と（Ｉ［ ｌ）を含んでいることが判明した。The immobilized enzyme preparation was prepared in 0.1 Ml Lys buffer (pH 7) containing 1 M ammonium sulfate. , 5), the combined supernatant was extracted with chloroform, dried and evaporated. Afterwards 403,111 g of clear oil were obtained. This oil was prepared in a ratio of 94:6 (1r) and (I[ It was found that it contained l).

この固定化酵素は１Ｍ硫酸アンモニウムを含むｏ、ｉＭ＋−リス緩衝液（ｐＨ７ ，５）に再懸濁し、４°Ｃで貯蔵した。同じバッチを上記のようにさらに９回使 用し、それぞれの場合に類似の結果を得た。The immobilized enzyme was prepared in o, iM+-Lys buffer (pH 7) containing 1M ammonium sulfate. , 5) and stored at 4°C. Use the same batch 9 more times as above. similar results were obtained in each case.

ゲル固定化酵素のアリコートは、ＨＰＬＣで検定して活性および位置選択性の低 下なしに、上記条件下で１６回使用できた。Aliquots of gel-immobilized enzyme were assayed by HPLC for low activity and regioselectivity. It could be used 16 times under the above conditions without any additional cleaning.

６００μｍの固体のフェニルセファロースＣＩ、−４Ｂゲルに４Ｍ硫酸アンモニ ウム溶液６２５μＩおよび０．４Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）　６２５μｍ を加えた。これに、実施例３のように調製した１、　７４　ｍｇ／ｍｌのタンパ ク質濃度を育する酵素調製物１．２５ｍ１を加えた。この懸濁液を穏やかに周囲 温度で３０分間混合し、遠心し、０．１Ｍｈリスｔｌｌ［（ｐＨ７，５）中の１ Ｍ硫酸アンモニウム４＋１でゲルを２回洗った。600 μm solid Phenyl Sepharose CI, -4B gel with 4M ammonium sulfate. um solution 625 μl and 0.4 M Tris buffer (pH 7,5) 625 μm added. This was supplemented with 1,74 mg/ml protein prepared as in Example 3. 1.25 ml of enzyme preparation to increase protein concentration was added. Gently swirl this suspension around Mix for 30 min at The gel was washed twice with M ammonium sulfate 4+1.

要約 抗ウィルス活性を育する化合物の製造に宵月な中間体の製造法を開示する。summary Disclosed is a method for producing intermediates useful for producing compounds that exhibit antiviral activity.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] １．式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）の化合物を微生物のヒドロラーゼで処 理することから成る、式（ＩＩ）：▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ） の化合物の製造方法。1. Formula (I): ▲ Contains mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. ▼ Compound (I) is treated with microbial hydrolase. Formula (II): ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼(II) A method for producing a compound. ２．微生物のヒドロラーゼがペニシリウム属およびバクテリウム属由来のもので ある、請求項１記載の方法。2. Microbial hydrolases are derived from Penicillium and Bacterium spp. 2. The method of claim 1, wherein: ３．微生物のヒドロラーゼがペニシリウム・フレクエンタンス（Ｐｅｎｉｃｉｌ ｌｉｕｍｆｒｅｑｕｅｎｔａｎｓ）ＩＭＩ　９２２６５由来のものである、請求 項２記載の方法。3. Microbial hydrolase is produced by Penicillium lum frequency) IMI 92265. The method described in Section 2. ４．硫酸アンモニウムの存在下で反応を行う、請求項１−３のいずれか１つに記 載の方法。4. According to any one of claims 1 to 3, the reaction is carried out in the presence of ammonium sulfate. How to put it on. ５．酸素を固定化し、連続製造法で再使用する、請求項１−４のいずれか１つに 記載の方法。5. According to any one of claims 1 to 4, wherein the oxygen is fixed and reused in a continuous manufacturing process. Method described.