PT95153B - Processo de producao de acido nucleico e de vector codificando neurotrofina-3, (nt-3), de obtencao de proteina de nt-3, de preparacao de composicoes farmaceuticas e de promocao da sobrevivencia de neuronicos dopaminergicos - Google Patents

Description

MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE ε REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., pretendem obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se ao processo de produção de neurotrofina-3 (NT-3), um membro da família de genes de factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF), De acordo com o presente invento, as regiões de homologia compartilhadas por BDNF e factor de crescimento de nervo (NGF) podem ser usadas para identificar NT-3. 0 presente invento refere-se ao processo de isolamento dos genes e de produtos de genes dos novos factores neurotroficos relacionados com BDNF/NGF identificados por estes processos. De acordo com o invento, a NT-3 pode ser usada em processos de diagnóstico de desordens neurológicas incluindo, mas não se lhes limitando a doença de Alzheimer e de Parkinson.

71494

6526-040-118

-2MEMÓRIA DESCRITIVA

1. INTRODUÇÃO presente invento refere-se à preparação de neurotrofina-3 (NT-3), um factor neurotrófico recentemente descoberto que é um membro da família de genes BDNF/NGF» 0 gene codificador da NT-3 jã foi clonado e determinada a sua sequência e a NT-3 recombinante já foi expressa em células de mamíferos, A NT-3 recombinante mostrou ter um espectro de actividades biológicas que difere dos do BDNF e NGF. 0 presente invento apresenta as sequências de ácidos nucleicos codificadoras da NT-3, para a proteína substancialrnente pura da NT-3, derivados peptidicos ou seus derivados produzidos em quantidade e anticorpos dirigidos à proteína ou péptidos da NT-3. Os produtos de genes da NT-3 do invento podem ser usados na diagnose e terapia de diversos distúrbios neurológicos incluindo em particular neuropatias periféricas, a doença de Alzheimer s a doença de Parkinson,

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2,1. O PAPEL DOS FACTORES NEUROTRÓFICOS NO SISTEMA NERVOSO desenvolvimento e a conservação do sistema nervoso dependem de pçoteínas conhecidas como factores neurotróficos. A células morte comum das/neuronais acompanha o desenvolvimento normal dos sistemas nervoso central e periférico e aparentemente desempenha um papel crucial na regulação do número de neurónios que se projectam para um determinado campo objectivo (Berg, D.K., 1982,

Neuronal Development 297-331; Cowan et al., 1984, 225:1258-65).

Estudos de ablação e transplante de tecidos objectivos periféricos durante o desenvolvimento, mostraram que a morte das células neuronais resulta da competição, entre neurónios, de quantidades limitadas de factores de sobrevivência (factores neurotróficos) produzidos nos seus campos de projecção. Estas observações conduziram à identificação do factor de crescimento dos nervos (NGF - nerve growth factor) que continua a ser, de longe, a molécula neurotrófica melhor caracterizada (Levi-Montalcini e Angeletti, P,U„, 1968, Physiol. Rev, 4 = 534-69; Thoenen, H. e

Barde, Y.A., 1980. Rev. 60=1284-335), A compreensão do papel e mecanismo de acção do NGF foi muito aumentada pela descoberta

71494

6526-040-118

-3acidental de urna fonte abundante desta proteína nas glândulas submaxilares do ratinho macho, que permitiu a purificação e a clonação (Ullrich et al., 1983, Nature 303=821-5; Scott et al., 1983, Nature 302=538-40) do NGF, bem como a criação de anticorpos neutralizantes. Como o NGF apenas suporta um conjunto limitado de populações neuronais, de há muito foi postulada a existência de factores neurotróficos adicionais (Varon, S. and Adler, R. 1981, Adv, Cellular Neurobiol. 2:115-63; Barde et al., 1987, Prog Brain Res 71=185-9; Snider, W. D. and Johnson, Ε. Μ., 1989, Ann. Neurol. 26:489-506). Ainda que seja hoje claro que esses factores existem, a sua abundância extremamente baixa tem impedido a sua caracterização molecular. Contudo, a purificação de pequenas quantidades de duas dessas proteínas, nomeadamente o factor neurotrõfico derivado do cérebro (BDNF - brain-derived neurotrophic factor) e o factor neurotrõfico ciliar (CNTF - ciliary neurotrophic factor), permitiu recentemente a determinação parcial da sequência de ácidos nucleicos (Leibrock et al., 1989, Nature 341=149-52; Stockli et al», 1989, Nature 342=21-28 and Lin et al., 1989, Science 246=1023-25), Apesar da especificidade das populações neuronais distintas BDNF e NGF (mas não CNTF) apresentam suficiente homologia estrutural para serem considerados como membros de uma família de genes (Leibrock et al., 1989, Nature 341=149-52).

2.2. OUTROS FACTORES NEURQTRÓFICQS

Na década passada houve numerosos relatórios sobre a actividade neurotrófica em extractos de uma grande variedade de tecidos e em meios de cultura condicionados de tipos de células muito diferentes. Em quase todos os casos, contudo, os progressos na purificação e caracterização destas actividades têm esbarrado no facto destas actividades estarem presentes em quantidades extremamente pequenas, da ordem dos picogramas a nanogramas por grama de tecido.

Além disso, ainda que tenham sido estabelecidos ensaios biológicos adequados para os neurónios periféricos, a proposta de ensaios de confiança, reprodutíveis e específicos para o sistema nervoso central tem mostrado ser problemática. Enquanto que os

71494

6526-040-118

-4tipos individuais de neurónios periféricos se mostram como gânglios discretos, facilmente dissecadas os neurónios do sistema nervoso central (SNC) são, invariavelmente, altamente heterogéneos na sua distribuição. São assim necessários marcadores específicos quer para a identificação quer para o melhoramento de determinadas classes de neurónios do SNC» Tem sido muito limitado o progresso na produção destes marcadores, p. ex., de anticorpos dirigidos para a superfície da célula ou componentes cito-esqueléticos ou de estirpes histológicas específicas. Deste modo, a caracterização de factores neurotróficos que sejam (i) não tão abundantes como o NGF, (ii) difíceis na sua avaliação e (iii) não disponíveis em quantidades suficientes para elicitar a produção de anticorpos, provou ser um processo extremamente difícil»

2.2.1. COMPARAÇÃO DO FACTOR DE CRESCIMENTO DERIVADO DO CÉREBRO, COM 0 FACTOR DE CRESCIMENTO DOS NERVOS

A actividade neurotrófica capaz de manter a sobrevivência de neurónios de gânglios da raiz dorsal de embriões de pintos, in vi tro, foi identificada no meio condicionado onde se tinham cultivado células de glioma C-6 do rato (Barde et al., 1978, Nature 274:818). A actividade não foi neutralizada por anticorpos do NGF do rato, o que sugere a presença de um outro factor neurotrófico no meio condicionado. Actividades semelhantes que não podem ser bloqueadas por anticorpos do NGF foram depois reveladas em culturas de células astrogliais do cérebro do rato adulto normal (Lindsay, 1979, Nature, 282=80-82; Lindsay et al., 1982, Brain Res» 243 = 529-345) e nos extractos do cérebro do rato adulto e do rato em crescimento (Barde et al., 1980, Proc» Natl, Acad. Sei. USA, 77=1199-1203) s da medula espinal do pinto maduro ou em desenvolvimento (Lindsay and Peters, 1984, Neurosci., 12=45-51). No entanto, em caso nenhum foi factor activo isolado ou identificado e permanece questionável saber atê que ponto as actividades observadas foram devidas ao mesmo factor ou a factores diferentes,

Usando o cérebro de porco como material inicial. Barde et al. (1982, EMBO J. 1=549-553) mencionaram um factor, agora

71494

6526-040-118

-5— denorninado factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF = brain derived neurotrophic factor) que parece melhorar a sobrevivência dos neurónios dos gânglios da raiz dorsal em embriões de pintos E10/E11. Verificou-se que a actividade neurotrófica residia numa proteína altamente básica (ponto isoeléctrico, pi > 10,1) que migrava, durante a eleetroforese de gel com dodecilsulfato de sódio (SDS), como uma única banda de peso molecular 12,3 kD. 0 factor de purificação foi estimado em 1,4 χ 10⁶ mas o rendimento foi muito baixo, com apenas aproximadamente 1 ng de BDNF purificado a partir de 1,5 kg de cérebro de porco, Além disso, como o último passo do processo de purificação foi a electroforese preparativa em gel, a actividade do BDNF não poderia ser completamente restabelecida devido à presença de SDS residual (Barde e Thoenen, 1985, em Hormones and Cell Regulation, Vol. 9, Dumont et al., eds. Elsevier Science Publishers, pp. 385-390). Fazia-se notar que a natureza altamente básica e o tamanho molecular do BDNF eram muito semelhantes às do monómero NGF. 0 BDNF parecia contudo ter propriedades que diferiam das propriedades já conhecidas do NGF pois que (a) na avaliação dos gânglios da raiz dorsal do pinto, os anticorpos do NGF não tinham efeito aparente sobre a actividade biológica do BDNF; (b) na mesma avaliação, os efeitos do BDNF e NGF pareciam ser aditivos; e (c) ao contrário de NGF, verificou-se que. o BDNF não tinha qualquer efeito sobre a sobrevivência dos neurónios simpáticos do pinto E12. Além disso, durante os primeiros estudos com extractos de cérebro, observou-se que a actividade neurotrófica nestas fontes parecia actuar sobre os neurónios sensitivos em estágios de desenvolvimento mais tardios do que quando associada ao NGF. Usando culturas separadas de neurónios de embriões de pintos cultivados num substrato policatiónico como a polilisina ou a poliornitina, verificou-se que o BDNF suportava a sobrevivência de mais de 30¾ dos neurónios dos gânglios da raiz dorsal de embriões de pintos E10-11 (dia embrionário dez ou onze) mas parecia ter pouco efeito na sobrevivência dos mesmos neurónios em E6 (Barde et al., 1980. Proc. Natl. Acad. USA 77=1199-1203 supra), Em condições semelhantes, o NGF suportou a sobrevivência de 30-40¾ dos neurónios DRG (dorsal root ganglion) em E6. É

71494

6526-040-118

-6intersssante notar que mais tarde se verificou que, quando cultivados num substrato revestido com a matriz extracelular de glicoproteina laminina, tanto o NGF como o BDNF suportaram a de sobrevivência de cerca de 50¾ de neurónios/DRG de embriões de pintos de idades E6-E12 (Lindsay et al., 1985, Develop. Biol, 112:519-328). Em estudos posteriores verificou-se que os efeitos do NGF e BDNF eram aditivos quando ambos estavam presentes em concentrações de saturação.

Estudos anteriores de Levi-Montalcini (1966, The Harvey Lectures 60=217-259) sobre a especificidade neuronal do NGF, sugeriam que o NGF não era um factor neurotrófico ubíquo mesmo para os neurónios sensitivos, pois que o NGF parece não ter efeito sobre neurónios de certos gânglios sensitivos do crânio dos pintos, especialmente o gânglio nodoso do décimo nervo craniano. Estudos posteriores, in vivo (Johnson et al., 1980, Science 210=916-918; Pearson et al., 1983 Develop. Biol. 96=32-3) mostraram que a exclusão de NGF durante a embriogénese não tinha qualquer efeito na sobrevivência dos neurónios da maior parte dos gânglios sensitivos cranianos do rato , enquanto que um tratamento semelhante fazia baixar a contagem neuronal em gânglios sensitivos derivados da cristã neural. Estudos mais detalhados in vitro (Lindsay e Rohrer, 1985, Develop. Biol. 112=50-48; Davies e Lindsay, 1985, Develop. Biol. 111=62-72; Lindsay et al., 1985, J. Cell. Sei. Suppl. 3=115-129) . mostraram elaramente que o NGF suportava a sobrevivência da maior parte dos neurónios sensitivos derivados da cristã neural mas que não tinha efeito aparente na sobrevivência de neurónios sensitivos cranianos derivados de placodos (placodes) neurais.

A primeira demonstração de uma especificidade neuronal do BDNF distinta da do NGF foi a demonstração in vivo de que o BDNF purificado suporta a sobrevivência de 40-50¾ dos neurónios sensitivos separados do gânglio nodoso derivado do placodo neural do embrião de pinto em E6, E9 ou E12 (Lindsay et al,, 1985, J. Cell Sei. Supp. 3=115-129). NGF não tinha efeito aparente sobre estes neurónios quer por si próprio quer em conjunção com BDNF. Mostrou-se mais tarde em estudos de culturas que^o/BroíF parecia

71494

6526-040-118

-7suportar a sobrevivência e o desenvolvimento de neurite de outros gânglios sensitivos derivados de placodos neurais, incluindo os gânglios do rochedo (petroso), geniculado, ventrolateral do trigémeo (Davies et al., 1986, J. Neurosci. 6=1897-1904), nenhum dos quais se tinha mostrado sensível ao NGF. Em todos os estudos acima referidos, a neutralização dos anticorpos do NGF não tinha qualquer efeito sobre a actividade observada do BDNF. Além do seu efeito sobre os neurónios cultivados provenientes de gânglios periféricos, verificou-se que o BDNF estimula a sobrevivência e a diferenciação neuronal de células cultivadas da cristã neural da codorniz (Kalcheim e Gentíreau, 1988, Develop. Brain. Res. 41=79-86).

Antes do presente invento, a incapacidade de produzir quantidades suficientes de BDNF para imunização impediu a produção de anticorpos anti-BDNF para comparação com anticorpos anti-NGF quanto aos seus efeitos sobre as populações neuronais e impossibilitou experiências de neutralização cruzada BDNF/NGF. Dois estudos recentes com BDNF (Kalcheim et al., 1987, EMBO J. 6=2871-2873; Hofer e Barde, 1988, Nature 351=261-262) indicaram contudo um papel fisiológico do BDNF no desenvolvimento do PNS em aves. Se se colocar uma barreira mecânica in ovo entre os DRG em E3/E4 (gânglios da raiz dorsal de embriões de 3 ou 4 dias) e o seu alvo SNC no tubo neural, observa-se que muitos neurónios dos DRG morrem (Kalcheim e Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116=451-466). Postulou-se que esta morte neuronal podia ser devida à perda de um factor neurotrófico derivado do SNC (tubo neural). Observou-se depois que o BDNF, ligado a uma membrana sialástica revestida com laminina, podia evitar esta morte de células (Kalcheim et al., 1987, EMBO J. 6=2871-2873). Verificou-se que injecções de BDNF em ovos em desenvolvimento de codorniz reduziam a morte de células que ocorria naturalmente nos gânglios nodosos, efeito este ainda não observado com o NGF (Hofer e Barde, 1988, Nature, 551=261-262). Além do seu efeito sobre os neurónios sensitivos periféricos tanto da cristã neiiral como nos de origem de placodo neural, o BDNF mostrou suportar a sobrevivência de neurónios do SNC em desenvolvimento. Johnson et al. (1986, J.

71494

6526-040-118

-8Neurosci., 6:3031-3938) apresentaram dados indicando que a BDNF suporta a sobrevivência de células do gânglio retiniano, cultivados, de embriões do rato E17. Isto expandiu os estudos anteriores que mostravam que os meios condicionados e os extractos de cérebro preparados a partir das células do gânglio retinal de certas regiões, pareciam suportar a sobrevivência destes neurónios (McCaffery et al., 1982, Ex. Erain Res. 48:37-386; Sarthy et al., 1983, J. Neurosci. 3=2532-2544; Turner et al., 1983, Dev. Brain Res. 6:77-83).

Além dos efeitos sobre a sobrevivência de neurónios em desenvolvimento, em cultura, o BDNF mostrou ter efeitos sobre neurónios de cultura do sistema nervoso periférico e central dos adultos. Verificou-se que o BDNF, bem como o NGF, estimulam a regeneração axonal de neurónios, em cultura, dos DRG do rato adulto (Lindsay, 1988, J. Neurosci. 8:2394-2405) ainda que os neurónios sensitivos do adulto não pareçam necessitardefactores neurotróficos para manutenção in vitro por 3 ou 4 semanas. Além disso, em culturas da retina do rato adulto, observou-se que o BDNF melhorava tanto a sobrevivência como a elongação axonal das células do gânglio retinal (Thanos et al., 1989, Eur. J. Neurosci. JL: 19-26). No Quadro I apresenta-se a comparação dos efeitos biológicos do NGF e do BDNF.

QUADRO I

COMPARAÇÃO DAS ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DQ BDNF E NGF*

71494

6526-040-118

SISTEMA NERVOSO PERIFÉRICO	SOBREVIVÊNCIA**
BDNF	NGF
(i) DRG de pinto E6	-	++
DRG de pinto E10	+	++
Simpático de pinto E12 (Barde et al.. 1980. supra)		++
(ii) DRG de pinto E6-E12	++	++
Nodoso de pinto E6-E12		-
Simpático de pinto £12	-	++
Ciliar de pinto E12 (Lindsay et al.. 1985. supra) (iii) Pinto E3-E14
Jugular	+ /++	++
DM-trigeminal	+ f++	++
Rochedo	+/++	-
Geniculado	+/++	-
VL-trigeminal	++	-
Vestibular	-	-
Mesencefálico (Davies et al.. 1986. supra) (Barde et al., 1987, Prog. Brain Res., 71:185-189) SISTEMA NERVOSO CENTRAL	++
(i) Células de gânglio retirâano-do rato	E17 ++	-

(Johnson et al., 1986,

J. Neurosci. 63031-3038) por ordem cronológica de acordo com a data de publicação; efeitos verificados in vitro sem sobrevivência: (-); sobrevivência moderada (+); boa sobrevivência (++)

71494

6526-040-118

-102.2.2, ALVOS NEURQNAIS DO FACTOR NEUROTRÓFICO

DERIVADO-, DO CÉREBRO

Verificou-se que os neurónios sensitivos dos gânglios dos nervos periféricos surgem de qualquer de duas estruturas embriológicas transitórias distintas, nomeadamente a cristã neural e os placodos'; neurais, A cristã neural parece dar origem tanto aos neurónios como às células-satélites de gânglios autónomos e de gânglios sensitivos de nervos espinais, isto é, DRG. A contribuição da cristã neural e dos placodos neurais para formarem os gânglios sensitivos dos nervos cranianos, tem sido estudada usando o sistema de transplantação quimérica codorniz/ /pinto, proposto por Le Douarin (Le Douarin, 1973, Develop, Biol, 20:217-222; Nodem, 1978, Develop. -Biol, 67=313-329; Narayanan e Narayanan, 1980, Anat. Rec. 196=71-32; ftyer-Le Lievre e Le Douarin, 1982, Develop, Biol. 94 = 29.1-510; D’fimico-Martel e Noden, 1983, Am. J. Anat. 166=445-468). Segundo a revisão por Lindsay et al., (1985, J. Cell. Sei, Supp. 3=115-129) crê-se agora que, pelo menos para os pássaros, os neurónios dos gânglios distais do 72, 92 e 102 nervos cranianos (gânglios do geniculado, rochedo e nodoso, respectivamente) e os neurónios do complexo vestibulo-acústico do 82 nervo craniano, são exclusivamente de origem de placodo neural, 0 gânglio trigeminal do 52 nervo craniano contém neurónios de origem tanto da cristã como do placodo (predominando, no polo ventrolateral do lobo maxilo-mandibular, os neurónios derivados de placodo) enquanto que as células satélite de todos os gânglios cranianos mostraram ter como origem a cristã neural.

Em experiências in vitro usando culturas de explante e separadas, enriquecidas em neurónios, de neurónios sensitivos de nervos cranianos e espinais, verificou-se que os neurónios sensitivos de origem na cristã neural respondem ao NGF; em contraste, os neurónios derivados de placodos neurais (incluindo os neurónios da porção ventrolateral do gânglio trigeminal e toda a população neuronal dos gânglios vestibular, geniculado, rochedo e nodoso) têm mostrado largamente serem insensíveis ao NGF ao longo do desenvolvimento embrionário. Em contraste com . as suas

71494

6526-040-118

diferenças de necessidade e resposta ao NGF, tanto os neurónios sensitivos derivados da cristã neural como os derivados dos placodos, mostraram (Quadro I) ser sensíveis à sobrevivência e à actividade promotora de neurite do BDNF (Lindsay et al-, 1985, J. Cell. Sei. Supp. 3=115-129; Lindsay et al., 1985, Develop. Biol. 112=519-528 Kalcheim and Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41=79-86). Tebar e Barde (1988, J. Neurosci. 8=3337-3342) estudaram os parâmetros de ligação do BDNF marcado radioactivamente, aos neurónios dos gânglios da raiz dorsal do embrião do pinto; os seus resultados são consistentes com a existência de 2 classes de receptores de BDNF, unacom elevada afinidade para o BDNF, a outra com baixa afinidade. Não se observaram receptores de elevada afinidade nos neurónios simpáticos.

Os alvos neuronais conhecidos do BDNF foram revistos ainda por Barde et al. (1987, Prog. Brain Res, 71=185-189). Antes do presente invento, não era realizável identificar as células que sintetizam o BDNF, devido à falta de sondas de ácidos nucleicos ou de anticorpos, específicas para o BDNF. Houve tentativas mal sucedidas para preparar anticorpos, tanto policlonais como monoclonais, do BDNF. Este fracasso em produzir anticorpos tem impedido a clonação molecular do BDNF, a determinação do efeito fisiológico de privar os neurónios em desenvolvimento de BDNF in vivo, a quantificação de BDNF em tecidos usando imuno-ensaios, e a localização do BDNF usando imunocitoquímica.

71494

6526-040-118

-12QUADRO II

NEURÓNIOS SENSÍVEIS E NÃO SENSÍVEIS AO BDNF*

A. Neuronios sensíveis

I. Neuronios sensitivos do pinto de origem na cristã neural= (a) no gânglio da raiz dorsal (b) no gânglio jugular (c) no gânglio trigeminal dorsomédio (d) no núcleo trigeminal mesencefálico**

II. Neuronios sensitivos do pinto de origem no placodo ectodérmico no = (a) gânglio nodoso (b) gânglio vestibular (c) gânglio do rochedo (d) gânglio geniculado (e) gânglio trigeminal ventrolateral

III. Células do gânglio retiriano: do rato

IV. Células do gânglio retiniaao do pinto***

B. Neuronios não-sensiveis

I. Neuronios simpáticos do pinto e do rato

II. Neuronios ciliares simpáticos do pinto * De Barde et al., 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189 ** Ver Davies et al., 1986, Nature 519=497-499 *** Rodriguez ~ Tebar et al., 1989, Dev. Biol. 156=296-505

2.2.3. CLONAÇÃO DO GENE DQ FACTOR NEUTRQFICO DERIVADO DO CÉREBRO

A clonação do gene do BDNF foi primeiro realizada como se descreve no pedido de patente americana de série N2. 07/400 591, depositado em 30 de Agosto de 1989, aqui incorporado, na íntegra, para referência. Resumidamente, pequenas quantidades de proteína do BDNF do cérebro do porco foram purificadas, permitindo a determinação dos fragmentos da sequência de aminoácidos, a qual pôde, por seu turno, ser usada para planificar os oligonucleótidos correspondentes. Estes oligonucleõtidos sintéticos foram

71494

6526-040-118

então usados como introdutores na reacção em cadeia de polimerase (PCR) com um padrão de ADNc preparado a partir das células produtoras de BDNF. Os produtos da PCR foram utilizados como sondas para permitir a clonação do ADNc completo e/ou de genes de BDNF genómico de diversas espécies, incluindo o homem, o porco, o rato e o ratinho e determinaram-se as sequências destes genes. A expressão do BDNF recombinante foi conseguida em células COS.

3. SUMÁRIO DO INVENTO presente invento descreve o processo de preparação de nsurotrofina-3, (NT-3), um membro da família de genes de BDNF, recentemente descoberto. Baseia-se em parte, na identificação de regiões de hornologia da sequência de ácidos nucleicos, partilhada pelo BDNF e NGF (pedido de patente U.S. N2 07/400 591, depositado em 30 de Agosto, 1989, aqui incorporada para referência). De acordo com o presente invento, estas regiões de hornologia podem ser usadas para identificar novos membros da família de genes de SDNF/NGF; foi esta a metodologia usada para identificar NT-3. 0 presente invento prepara genes e produtos de genes de novos factores neurotróficos relacionados com BDNF/NGF, identifiçados por este processo.

presente invento descreve, em parte, moléculas de ADN recombinante que codificam a NT-3» Em determinados arranjos específicos do invento, o ADN que codifica a NT-3 deriva do ADN humano, do ADN do murino ou do ADN do rato. 0 presente invento prepara também moléculas de ADN recombinante que compreendem pelo menos uma parte das sequências de ácidos nucleicos, como substancialmente se indica na Figura 2 (NT-3 do murino), Figura 7 (NT-3 do rato) ou Figura 11 (NT-3 do Homem). 0 presente invento também prepara vectores de expressão de ADN recombinante que podem ser usados para preparar proteína de NT-3 recombinante e péptidos relacionados.

Em outros arranjos, o presente invento fornece proteínas da NT-3 e péptidos relacionados e apresenta processos para produzir e preparar esses péptidos e proteínas. O presente invento também se refere a anticorpos dirigidos contra as proteínas e péptidos

71494

6526-040-118

-14da NT-3,

De acordo com o invento, pode usar-se NT-3 na diagnose e/ou tratamento de distúrbios neurológicos incluindo (mas sem que a tal se limite) neuropatias periféricas como as neuropatias diabéticas, neuropatias tóxicas e nutricionais, neuropatias hereditárias e neuropatias relacionadas com o SIDA e doenças degenerativas como a doença de Alzheimer. Demonstrou-se que a NT-3 suporta a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos; assim, nos arranjos preferidos do invento, a NT-3 pode ser usada no tratamento da doença de Parkinson. Como se tem observado que a NT-3 apresenta um espectro de actividade diferente das especificidades do BDNF ou NGF, a NT-3 oferece novas e valiosas opções para induzir o re-crescimento e a restauração do sistema nervoso central.

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURA 1. Comparação das sequências de BDNF e NGF de várias espécies. A análise da sequência do gene que codifica BDNF e a dedução da sua sequência de aminoácidos revelou que esta proteina tem muitas semelhanças estruturais com NGF, A sequência principal do BDNF maduro, bem como a estrutura geral e o modo provável de processamento a partir de uma proteina precursora, sugere fortemente que os genes de NGF e de BDNF podem ter evoluído de um gene comum ancestral. Dentro da região dos polipéptidos maduros, se apenas se introduzirem 3 intervalos nas sequências de NGF para optimizar a imitação, um total de 51 identidades de aminoácidos é comum aos NGF anteriormente conhecidos, de muitas espécies, e aos BDNF do porco e do homem. Estas identidades incluem todos cs seis resíduos de cisteína, o que sugere que os NGF e BDNF partilham uma estrutura secundária muito semelhante, Além disso, podem ser vistos quatro segmentos de seis ou mais aminoácidos onde os NGF de todas as espécies acima indicadas e do BDNF do porco são idênticas ou diferem por não mais do que cerca de uma substituição de aminoácidos conservadores, Assim, é razoável concluir que o NGF e o BDNF são membros próximos de uma família de genes.

71494

6526-040-118

FIGURA 2. Sequência genómica e sequência deduzida de aminoácidos da NT-3 do murino. A sequência de aminoácidos começa com o primeiro codão ATG que se encontra após 3 codões de paragem enquadrados. As sequências sublinhadas indicam a localização dos iniciadores usados na primeira volta da PCR. A única sequência de consenso de N-glicosilação está duplamente sublinhada e a seta indica o suposto começo da NT-3 madura, processada.

FIGURA 3. Comparação de sequências de aminoácidos entre NT— -3 do ratinho maduro, NGF (Scott et al., 1983, Nature 302=538-540) e BDNF (Leibrock et al., 1989, Nature 341=149-152). A sequência do BDNF do ratinho maduro aqui indicada é 100% idêntica à do BDNF do porco. Letras a negrito e tectos indicam os aminoácidos encontrados em posições idênticas em todas as 3 proteínas e as setas apontam para todos os resíduos de cisteína. 0s asteriscos indicam os intervalos introduzidos para optimizar a imitação. V1-V4 indicam os 4 domínios variáveis constituídos por mais de 3 aminoácidos contíguos.

FIGURA 4. Distribuição nos tecidos de ARMm da NT-3 no ratinho. Vinte ng do ARN total foram aplicados a cada pista e hibridados com uma sonda de ADN de cadeia dupla marcado com ^P. (A) Em todos os tecidos pode ver-se uma única banda correspondente a cerca de 1,4 kilobases, sendo o sinal mais fraco observado no pulmão e o mais forte no coração. 0 músculo esquelético foi tirado das coxas. (8) No cérebro o sinal mais forte ê obtido no hipocampo e no cerebelo.

FIGURA 5. Sobrevivência de neurónios sensitivos isolados dos gânglios nodosos obtidos no pinto de 8 dias de idade embrionária. 5 000 células foram postas em placa sobre um substrato de poliornitina-laminina e contaram-se os neurónios sobreviventes após 24 horas. A concentração de BDNF aqui usada é de 3x a concentração mínima necessária para obter a sobrevivência máxima. Verificou-se que nenhum neurónio sobrevivia sem adição, ou com meio condicionado usado à diluição 1=50, de células COS não transfectadas controlo.

ou de células transfectada, com ADN de

71494

6526-040-118

-16FIGURA 6. (ft) Produto de PCR derivado do uso de iniciadores degenerados 1B e 2C (designados por R13/2C) detecta um novo gene, NT-3, bem como os genes de NGF e BDNF no ADN genómico do rato. (B) Mapa de restrição de um clone genómico NT-3 do rato. Dois clones bacteriófagos independentes hibridando especificamente a sonda R1B/2C foram isolados a partir de uma biblioteca genómica do rato. Apresenta-se uma representação esquemática do mapa de restrições de um deste clones, contendo urna inserção de 19,5 kb. A linha a cheio indica a estrutura de leitura aberta (ORF = open reading frame) da NT-3 (ver Fig. 7A). A posição da sonda R1B/2C está indicada.

FIGURA 7. Sequência da NT-3 do rato e a sua homologia com a do NGF do rato e com a do BDNF do rato. (A) Sequência de nucleótidos e aminoácidos da NT-3. Sequência do ADN, abrangida pela ORF, codificada pelo gene da NT-3, com a tradução de aminoácidos acima indicada na sequência do ADN; os asteriscos marcam o começo e o fim da estrutura de leitura aberta. Os aminoácidos estão numerados com a posição +1 atribuída ao primeiro resíduo da NT-3 madura (119 aminoácidos). 0 local de cisão que é usado para libertar a NT-3 madura está dentro duma esquadria tal como/está o local de glicosilação conservado logo acima deste local de cisão; outro local de cisão potencial, que está analogamente fixo num local_z propostq, de processamento intermédio no NGF (Darling et al., 1987, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1=427-34) (mas que não está conservado no BDNF), está também dentro de uma esquadria e está marcado com um 7CLEAVE (?Cisão). As seis cisteínas da NT-3 madura estão sublinhadas. 0 códão de iniciação da metionina para a forma precursora curta da NT-3 (na posição -139) que marca o local de começo B, como se disse no texto, está também sublinhado. 0 local proposto da junção do receptor/intrão na fronteira acima do local de começo B, está indicado na figura. (B) Alinhamento da sequência da NT-3 do rato com a do NGF do rato e BDNF do rato. Usou-se software de análise de sequências de MacVector (adquiridos na International Biotechnologies, Inc.) para criar um alinhamento da matriz da ORF da NT-3 do rato com as ORF dos genes de NGF e BDNF

71494

6526-040-118

-17(usando um tamanho de janela de 20 e um ajustamento mínimo de 20¾). Os ajustamentos significativos vistos ao longo da diagonal desta matriz estão representadas por debaixo de uma representação esquemática do produto de proteína da NT-3; estão designadas por 1 s II, duas regiões de homologia a montante da NT~3 madura, vistas em comparação tanto com NGF como com EDNF» Como se pode observar na figura, a - região I a montante do local de começo B usado .para criar a forma curta precursora de NT-3, apoiando a alegação de que existe um precursor mais longo. (C) Comparação de sequências entre NT-3, NGF e BDNF nas regiões de homologia I e II. As sequências nestas regiões estão alinhadas para maximizar a homologia, com intervalos inseridos para alinhamento indicados por Identidades quer de BDNF quer de NGF com a sequência NT-3 estão indicadas por enquanto que identidades de NGF com BDNF estão indicadas por na sequência de NGF. Um + no topo da sequência indica resíduos que estão completamente conservados entre'as sequências da NT-3 do rato e do NGF e BDNF de todas as espécies examinadas. Indicam-se os seguintes locais definidos para NGF, anteriormente previstos para BDNF e aqui propostos para a NT-3 = o codão de iniciação metionina do local de começo Β; o local de cisão da sequência de sinal (Edwards et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8=2456-64); um local proposto de cisão intermédia dõ NGF que está ausente no BDNF mas presente na NT-3; um local de aceitador de glicosilação; um local de cisão proteolítica que liberta os factores maduros, (D) Comparação de sequências das formas maduras da NT-3, BDNF e NGF. As cisteínas conservadas estão assinaladas em baixo por Ufa losango a cheio. e são como no painel C. O local de cisão no terminal C, apenas presente na sequência de NGF, está indicado.

FIGURA 8, Comparação das actividades de NGF, BDNF e NT-3, avaliadas sobre- gânglios de pinto embrionário (8 dias) explantadas. Fotomicrografias de gânglios da raiz dorsal (DRG) (painéis A-D), gânglios nodosos (NG) (painéis E-H) e gânglios da cadeia simpática (SG) (painéis I-L) cultivados durante 24 h (DRG e NG) ou 48 h (SG), quer na ausência de qualquer factor neurotrófico (controlo: A, Ε, I) quer na presença de sobrenadantes de células

71494

6526-040-118

-18COS contendo NGF (B, F, J) ou BDNF (C, G, K) ou NT-3 (D, H, L). Quase não há crescimento de neurite nas culturas de controlo (500 wl de sobrenadante de células COS obtido de células falsamente transfectadas). 0 NGF (10 wl de sobrenadante de células COS) produziu intenso desenvolvimento de fibras de DRG e de SG mas não de NG. 0 aumento de sobrenadante de células COS de NGF, de 20 para 500 wl, não produziu qualquer efeito sobre NG. 0 BDNF (10 wl de sobrenadante de células COS) produziu desenvolvimento de fibras de DRG e de NG mas não de SG; quantidades maiores (20 a 500 wl) não tiveram efeito sobre SG. A NT-3 (20 wl de sobrenadante de células COS sobre DRG e NG, 200 wl sobre SG) produziu desenvolvimento de. fibras em todos os três tipos de gânglios, ainda que o começo do crescimento fosse mais lento e menos intenso no SG. Os gânglios foram cultivados como explantes ern colagénio em gel (Lindsay, R.M. e Rohrer, H., 1985 , Dev.

Biol. 112=30-48) em meio F14 suplementado com 5% de soro de cavalo como anteriormente se referiu (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112:319-28. Escala = 200 wm.

FIGURA 9. A NT-3 promove a sobrevivência e o crescimento das neurites em culturas altamente enriquecidas de neurónios de DRG. Fotomicrografias de culturas, enriquecidas em neurónios (>95% neurónios), de DRG de pinto embrionário (8 dias) dissociado, tratado durante 48 h com: (A) sobrenadante (500 wl) de células COS falsamente transfectadas, ou com (B, C) sobrenadante (50 wl) de células transfectadas de NT-3. A e B são micrografias em campo escuro; em A (cultura de controlo) menos de 5% dos neurónios da placa sobreviveram; em Β o número de neurónios segundo o processo foi de aproximadamente 60% dos neurónios da placa. A partir de uma curva de dose-resposta verificou-se que este valor correspondia ao efeito máximo da NT-3 sobre os neurónios do DRG do pinto em E8. (C) Uma micrografia com maior ampliação de contraste de fase, da mesma cultura. observada em B. Note-se o grande número de corpos de células neuronais da fase brilhante e a virtual ausência de quaisquer células não neuronais. As culturas foram preparadas como anteriormente se descreveu (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112:319-28). Escala = 150 wl

71494

6526-040-118

(C).

FIGURA 10. Comparação pela Mancha Northern da expressão de NT-3, NGF e BDNF em tecidos de roedores. Preparou-se ARN (Auffray, C. e Rougeon, F., 1980, Eur. J. Biochem. 107=303-14) a partir dos tecidos indicados do rato (painéis da esquerda) ou do ratinho (painéis da direita). Dez microgramas de ARN das fontes indicadas foram fraccionados sobre geles de 1¾ formaldeído/ /agarose e transferidos para membranas de nylon em 10X SSC; as manchas Northern, em triplicado, foram hibridadas (Mahmoudi, M. e Lin, V. K., 1989, Biotechniques 7=331-3) a 68°C com fragmentos de ADN, marcado com 22p (Feinberg, A. P. e Vogelstein, B., 1984, Anal Bíochem 137=266-7) de NT-3 do rato, BDNF do rato e NGF do rato, e depois lavados a 68°C em 2XSSC, 0,1¾ SDS. 0s fragmentos de ADN da NT-3, NGF e BDNF foram obtidos de construções de expressão contendo estes genes em pCDMS. As inserções de Xhol, de aproximadamente 775 bp, nestas construções, foram purificadas por gel antes de radiomarcadas. Está incluída uma figura do gel com mancha de brometo de etidio, permitindo a comparação da quantidade total de ARN por amostra.

FIGURA 11. Sequências alinhadas de ADN de genes da NT-3 do rato e do homem. 0 local previsto de começo de tradução está indicado por PREPRO— e o começo previsto para a NT-3 madura está indicado por MATURE—. As proteínas da NT-3 maduras do rato e do homem têm sequências idênticas de aminoácidos enquanto que as suas regiões prepro diferem em 11 posições que estão sublinhadas,

FIGURA 12. Expressão do polipéptido NT-3 do homem, detectada por marcação metabólica. Em placas de petri de 60 mm semearam-se 5x10^ células C0S-M5 por placa que cresceram durante a noite a 37° em meio DMEM completo com 10¾ de soro bovino fetal (FBS). As células foram transfectadas (usando o método do CaP04, descrito por Chen e Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7=2745-52) com 20 wg de plasmídeo pC8-hN3 (Pl) contendo o gene da NT-3 do homem sob regulação de um promotor de citomegalovirus, ou foram simuladamente transfectadas (sem ADN do

71494

6526-040-118

plasmídeo). 48 h mais tarde, lavaram-se as células e incubaram-se por 1 h em 1 ml de DMEM isento de metionina e de cisteina, com 1¾ de FBS. Juntou-se, a cada cultura, uma mistura de [^SJmetionina e [35s]cisteína (100 wCi de cada, da New England Nuclear), incubaram-se as células por mais 4 h a 37° e recolheu-se o meio. Misturaram-se amostras de 50 μΐ com 25 μΐ de tampão de amostras de concentração-dupla, contendo dodecilsulfato de Na (SDS), ferveu-se durante 5 min e submeteu-se a electroforese em gel de 15¾ de poliacrilamida na presença de SDS (Laemmli, 1970, Nature 227=680-685). As proteínas foram transferidas por electroforese (3 h, 100 mA) para uma membrana de nylon (immobilon¹^ da Millipore), usando os tampões descritos por Towbin et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76=4350-4354. Os filtros foram secos ao ar e as proteínas marcadas foram detectadas por auto— -radiografia (16 h à temperatura ambiente, usando filme Kodak X-AR com um filtre ’atfmentador Cronex, DuPont).

FIGURA 13. Gráfico de barras que mostra o número de células sobreviventes de tirosina hidroxilase,por cultura, sem sobrenadante de NT-3 (0) ou com sobrenadante contendo MT-3 em diluições de 1=300, 1=100, 1=50 ou 1=25.

FIGURA 14. Gráfico de barras como se descreveu para a figura 13 (supra) excepto em que as células estavam a uma densidade de 900 000 células por placa.

FIGURA 15. Comparação de transcritos sintéticos de NT-3, BDNF e NGF. Por hibridização pingo-mancha, usando um oligonucleótido radiomarcado, homólogo de uma sequência partilhada no extremo 5’ de todos os três transcritos, verifica-se que quantidades iguais (2 ng) de transcritos sintéticos de NT-3, BDNF e NGF, inicialmente quantificadas por espectrofotometria, estão a ser usadas como padrões definidos. B. Determinação dos níveis de ARNm da NT-3, BDNF e NGF, no ARN total preparado a partir do cérebro de rato adulto, por comparação com os padrões sintéticos definidos de ARN. Foram usados, pelo método da mancha Northern, dez microgramas de ARN total, isolado do cérebro de rato adulto, e 4, 10 e 20 pg dos transcritos sintéticos que correspondem a

71494

6526-040-118

-21cada uma das neurotrofinas, e foram hibridados com sondas radiomarcadas específicas de cada neurotrofina.

FIGURA 16. Expressão dos genes de NT-3, BDNF, NGF e NGFR em ARN total (10 ug/pista) preparado de embriões de rato (A), de cérebro de rato em desenvolvimento (8) e em tecidos escolhidos de adultos e perinatais (C). Tecidos= A.Br: amostra de cérebro adulto padronizado na Figura IB; PLAC: placenta; EMB: embrião inteiro; SP.C: espinal medula; THY = timo; LIV= fígado; HRT= coração; BR: cérebro. 0 tamanho dos transcritos é indicado à direita (em quilobases (kb)).

FIGURA 17. Expressão dos genes da NT-3, BDNF, NGF e NGFR em ARN total (10 ug/pista) preparado a partir de regiões discretas do sistema nervoso de recém-nascidos (A) e do adulto (B). Regiões: A.BR: amostra de cérebro de adulto, padronizada na Figura IB; CBL: cerebelo; HBR- (hindbrain) parte posterior do cérebro; MBR: mesencéfalo; DIEN: diencéfalo; STR; striatum; HIP: hipocampo: CTX: neocortex; OLF: bolbo olfactivo; BR = cérebro inteiro sem cerebelo; ADR: glândula supra-renal; RET: retina: SC.N: nervo ciático; SP.C: espinal medula.

FIGURA 18. Quantificação dos níveis transcritos de NT-3, BDNF e NGF em regiões do SNC do recém-nascido e do adulto e em tecidos periféricos. Prospecção densitométrica de exposições múltiplas de manchas Northern incluindo as representadas nas Figuras 16, 17, 19; Maisonpierre et al. (1990, Science 247:1446-1451) foi usado para obtenção de referências. Todos os níveis estão padronizados em relação aos níveis de neurotrofina no cérebro do adulto; os níveis no cérebro do adulto, que são semelhantes para as três neurotrofinas (ver texto), foram consideradas como 1, para cada neurotrofina. Os valores que saem fora da escala são incluídos no topo de barras verticais interrompidas. Estão indicadas na figura amostras neurais e não neurais» Amostras: BRN: cérebro não incluindo o cerebelo; CBL: cerebelo; HBR: parte posterior do cérebro; MBR: mesencéfalo; DIE= diencéfalo; STR; striatum; HIP: hipocampo; CTX: neocortex; OLF: bolbo olfactivo; SP.C.: espinal medula; SC.N.: nervo ciático;

71494

6526-040-118

-22RET = retina; ADR; glândula supra-renal= HRT = coração; LIV: fígado; THY = timo; SKN = (skin) pele; MUS = músculo esquelético; LNG = pulmão; INT = intestino; KID = rim; SPL = baço.

FIGURA 19. Expressão dos genes da NT-3, BDNF, NGF e NGFR durante o desenvolvimento da medula espinal (A,E), cerebelo (B,F) e hipocampo (C,G). 10 ug de ARN total, preparados nos tempos de desenvolvimento indicados, foram comparados quanto à expressão dos vários transcritos. A quantificação densitométrica dos níveis transcritos das neurotrofinas está indicada em E, F e 6.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO presente invento descreve a preparação da neurotrofina-3, um novo membro da família BDNF/NGF de moléculas neurotróficas, bem como a de outros membros da família BDNF/NGF que possam ser identificados usando metodologia semelhante» Para clareza de exposição, e não como sua limitação, a descrição detalhada do invento será dividida nas seguintes sub-secções:

(i) identificação de outros membros da família BDNF/NGF;

(ii) a clonação da neurotrofina-3;

(iii) expressão da neurotrofina-3;

(iv) avaliação da actividade biológica da neurotrofina-3;

(v) genes e proteínas da neurotrofina-3;

(vi) criação de anticorpos anti-neurotrofina-3; e (vii) utilidade do invento.

5.1. IDENTIFICAÇÃO DE OUTROS MEMBROS DA FAMÍLIA BDNF/NGF

NGF e o BDNF são proteínas básicas de aproximadamente 120 aminoácidos, que partilham uma identidade de sequência de aminoácidos de cerca de 50%, incluindo a conservação absoluta de seis resíduos de cisteína que, no NGF activo, mostraram formar três pontes de dissulfureto (Bradshaw, A., 1978, Ann. Rev.

Biochem. 47=191-216; Leibrock et al., 1989, Nature 341=149-52). A comparação das sequências de NGF de espécies de tipo evolutivo divergente revelou que os aminoácidos que ladeiam estes resíduos de cisteína constituem as regiões mais altamente conservadas, da molécula (Meier et al., 1986, EMBO J. 5=1489-93; Selby et al.,

71494

6526-040-118

1987, J. Neurosci. Res, 18:293-8). Notavelmente estas são também as regiões mais semelhantes entre BDNF e NGF (leibrock et al., 1989, Nature 341:149-52).

Pode realizar-se uma pesquisa racional de outros membros da família de genes BDNF/NGF, usando uma abordagem que tire vantagem da existência de segmentos consexvaçbs de forte hornologia entre NGF e BDNF. Por exemplo, podem ser identifiçados outros membros da família de genes BDNF seleccionandó, entre diversas sequências de ácido nucleico, aquelas que sejam homólogas a BDNF e NGF e identificando depois, entre as sequências seleccionadas, aquelas que também contem sequências de ácidos nucleicos que sejam não-homólogas a NGF e a BDNF. Os termos não-homólogo” pretendem significar uma região que contenha pelo menos cerca de 6 nucleótidos contíguos, onde pelo menos cerca de 2 nucleótidos diferem nas sequências de NGF e BDNF.

presente invento também se refere a moléculas de ADN recombinante que sejam homólogas a BDNF e a NT-3 ou, em alternativa, a NGF e a NT-3, mas que também contenham regiões não-homólogas a BDNF e a NT-3, ou a NGF e a NT-3, respectivamente. Estes outros membros da família de genes BDNF/NGF/NT-3, podem ser identifiçados usando sondas moleculares que correspondam às regiões de hornologia, Com base em outras análises verifica-se que estes membros da família de genes BDNF/NGF/NT-3 possuem sequências que diferem das sequências dos membros já conhecidos da família de genes BDNF/NGF/NT-3.

Por exemplo, um dos arranjos específicos preferidos do invento apresenta o seguinte processo. Correspondendo a cada um dos quatro segmentos coTrs.ewa.dos (caixas) estabelecidos no Quadro III, infra, podem sintetizar-se conjuntos de sondas de oligonucleótidos degenerados, de cerca de 10 a 20 nucleótidos, representando todas as sequências possíveis de codificação dos aminoácidos encontrados quer em NGF quer em BDNF, para cerca de 3 a 7 codões contíguos. Numerando, em relação ao terminal amino, os polipéptidos maduros (de modo que His 134 do prepro BDNF seja tratado com His 1 na proteína madura), as quatro caixas podem

71494

6526-040-118

ser caracterizadas do seguinte modo (numeradas em relação às proteínas maduras do homem).

QUADRO III

Caixa 1:	NGF	GlylO	- Ser19
	BDNF	Gly8	- Serl7
Caixa 2'	NGF	LysSO	- Cys58
	BDNF	LysSO	- Cys58
Caixa 3=	NGF	Glyó7	- Asp72
	BDNF	Gly67	- Asp72
Caixa 4:	NGF	Trp99	- CysllO
	BDNF	TrplOO	- Cyslll

Os oligonucleõtidos sintéticos, derivados dos pares de sequências das caixas indicadas no Quadro III, podem ser utilizados como iniciadores para amplificar, por PCR, as sequências de uma fonte (ARN ou ADN) de interesse potencial. Isto poderá incluir ARNm ou ADNc ou ADN genómico de qualquer espécie eucariótica que possa expressar um polipéptido estreitamente ligado a BDNF ou NGF. Realizando apenas seis reacções PCR (nomeadamente: um iniciador da Caixa 1 com um iniciador da Caixa 2; Caixa 1 com Caixa 3; Caixa 1 com Caixa 4; Caixa 2 com Caixa 3; Caixa 2 com Caixa 4; Caixa 3 com Caixa 4) pode ser possível detectar um gene ou produto do gene, partilhando quaisquer 2 dos 4 segmentos acima referidos de sequência conservadosrentre NGF e BDNF. Se alguém decidir sintetizar vários iniciadores degenerados diferentes de cada caixa, pode ser ainda possível realizar uma pesquisa completa com um número razoavelmente pequeno de reacções PCR. É também possível variar o rigor das condições de hibridaçao usadas no inicio das reacções PCR, para permitir maior ou menor grau de semelhança entre as sequências de nucleótidos do gene desconhecido e as de NGF ou BDNF. Se um segmento de um membro, anteriormente desconhecido, da família de genes BDNF/NGF, for amplificado com sucesso, esse segmento pode ser clonado molecularmente e sequenciado, e utilizado como uma sonda para isolar um ADNc completo ou um clone genómico. Este, por sua vez, permitirá a determinação da sequência de nucleótidos completa do

71494

6526-040-118

-25gene desconhecido, a análise da sua expressão e a produção da sua proteína para análise funcional.

Além disto, o presente invento apresenta o uso de homologias sequenciais de BDNF/NGF na preparação de novas moléculas recombinantes que sejam membros da família de genes BDNF/NGF mas que não possam ocorrer na natureza. Por exemplo (e não como limitação), pode construir-se uma molécula recombinante, de acordo com o invento, compreendendo porções de genes NGF e BDNF. Tal molécula poderá mostrar propriedades associadas com ambas, NGF e BDNF, e apresentar um novo perfil de actividades biológicas, incluindo não só agonistas como sequência primária de BDNG e NGF pode também prever a estrutura terciária das moléculas, usando a simulação por computador (Hopper e Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 78:3824-3828); os genes recombinantes quiméricos de BDNF/NGF podem ser preparados à luz das correlações entre a estrutura terciária e a função biológica. Podem igualmente ser construídos genes quiméricos compreendendo porções de um .qualquer ou.máis’ membros da família de genes BDNF/NGF.

antagonistas. A ser usada para

5.2. A CLONAÇÃO DA NEUROTROFINA-5 0 gene NT-3 de qualquer organismo pode ser identificado usando as regiões de homologia partilhadas pelo BDNF e NGF, utilizando os métodos acima referidos. Em dois arranjos específicos preferidos do invento, o gene pode ser identificado e clonado do modo seguinte.

Num arranjo preferido, um iniciador de sentido (ou 5’) com uma sequência de nucleótidos (usando a nomenclatura da IUPAC) GGGGATCCGC 6GI TGI MGI GGI ATH GA (iniciador 1 que inclui sítios de cisão de endonuclease Bam Hl e Sac II) e um iniciador antisentido (ou 3⁷), com a sequência de nucleótidos TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA (iniciador 2 que inclui locais Eco RI e Xba I), podem ser usados numa reacção em cadeia de polimerase (Saiki et al., 1985, Science 250: 1350-1354) com um ciclizador térmico comercial (p. ex. o ciclizador térmico Perkin-Elmer Cetus) e com polimerase de ADN termoestável de thermus aquati71494

6526-040-118

-26cus polimerase (Taq polymerase). Após cerca de 4 ciclos com uma temperatura de têmpera de 45°C, os restantes 36 ciclos podem ser realizados a temperaturas de têmpera de 49°C. Os produtos resultantes, de'ADN, da amplificação podem então ser separados por electroforese em gel de poliacrilamida e o produto que corresponda ao tamanho esperado (cerca de 137 pares de bases) pode ser eluido, reamplifiçado e depois digerido com duas endonucleases de restrição, uma das quais cinde a sequência do gene de NGF do organismo dentro do segmento amplificado, e a outra cinde a sequência do gene de BDNF do organismo dentro do segmento amplificado. 0 ADN não cindido (que presumivelmente não codifica nem o NGF nem o BDNF, por ter escapado à cisão das endonucleases de restrição) pode então ser separado do ADN cindido por electroforese em gel de poliacrilamida, eluido, amplificado assimetricamente (Innis et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85 = 9436-9440) e sequenciado (Sanger et al., 1979, Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72=5918-3921) usando por exemplo os iniciador 1 e 2. Com base na sequência assim obtida, podem preparar-se outros iniciadores de sentido e anti-sentido que reflitam mais precisamente a sequência do novo gene. Por exemplo, podem ser usados iniciadores de sentido adicionais como GGGATTGATGAG AAA (iniciador 3) e ACTCTCAGTGCAAAACTTCGC (iniciador 4) e o iniciador anti-sentido (5^J) CGGATCCGAATTCTGCAG (T)i2^ (iniciador 5), 0 ARN, preparado de um tecido plausivelmente produtor de actividade neurotrófica, tal como o cérebro (usando qualquer método padrão, como os estabelecidos em Okayama et al., 1987, Meth. Enzymol. 154=3-28) pode ser inversamente transcrito, usando, p. ex., o iniciador 5 criado para simular caudas 3’ poli (A) e que contém locais de cisão por endonuclease de restrição para Bam HI, Eco RI e Pst I (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-152). 0 ADNc resultante pode então ser amplificado por PCR usando os iniciadores 3 e 5, e depois reamplifiçado usando os iniciadores 4 e 5. Pode então preparar-se uma mancha Southern usando os produtos da última reacção, e hibridá^-Ia- a uma sonda de oligonucleõtidos marcada no fim com 32p^ correspondente à sequência a.jusante das sequências dos iniciadores 3 e 4. Os fragmentos de ADN assim identificados podem então ser clonados

71494

6526-040-118

num vector adequado e a inserção mais longa obtida pode ser usada para controlar a informação genómica obtida do organismo em causa. Os clones positivos identifiçados deste modo podem então ser analisados por técnicas padronizadas de mapeamento de restrições e de sequênciação de nucleótidos.

Num outro arranjo preferido do invento, podem síntetizar-se oligonucleõtidos degenerados correspondentes a segmentos de 4 sequências de proteína altamente conservadas entre NG.^C e BDNF. Por exemplo, estas sequências de aminoácidos (apresentadas na Figura 7D) podem ser: (1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser; (2)

Lys-Gen-Tyr-Phe-(Tyr/Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys; (3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp; e (4) Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys. Uma série de oligonucleõtidos degenerados de sentido e anti-sentido (contendo uma porção degenerada de 15-26 nucleótidos de comprimento, correspondendo a 5-9 aminoácidos das sequências de proteína acima mencionadas quer na direcção de sentido como de anti-sentido, bem como uma cauda não degenerada codificando os locais de reconhecimento do enzima de restrição) pode ser usada nas reacções PCR. As reacções de amplificação entre pares de iniciadores de sentido, a montante, e de iniciadores anti-sentido, a jusante, podem ser realizadas nas condições clássicas ou, de preferência, podem determínar-se experimentalmente as condições óptimas para cada par de iniciadores. Por exemplo, o iniciador de sentido (correspondente à sequência de aminoácidos (1), supra)

5’GATTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3’ e o iniciador anti-sentido (correspondente à sequência de aminoácidos (2), supra)

5’-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3’ podem ser usados na reacção de amplificação utilizando ADNc ou ADN genómico de uma fonte adequada como padrão. Os produtos das reacções de amplificação usando pares de iniciadores de sentido, a montante e iniciadores anti-sentido, a jusante, podem ser usados como sondas de hibridação sobre manchas Southern de ADN genómico para identificar o produto por PCR que hibrida a sequência de ADN genómico que contém regiões

71494

6526-040-118

-28homólogas às das sondas, como também regiões não homólogas às das sondas (por exemplo sequências não-NGF, não-BDNF). Pode usar-se um produto por PCR que identifique uma nova sequência de ADN genõmico, para controlar a informação genómica ou do ADNc e daí escolher clones que codifiquem novos membros da família de genes BDNF/NGF.

5-3. EXPRESSÃO DA NEURQTROFINA-5

A sequência de nucleótidos que codifica a proteína da NT-3 ou de uma sua porção, pode ser inserida num vector de expressão apropriado, isto é, num vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência inserida que codifica a proteína. Os sinais necessários de transcrição e tradução podem também ser fornecidos pelo gene da NT-3 nativa e/ou das suas regiões de flanco. Podem utilizar-se diversos sistemas de vector-hospedeiro para expressar a sequência codificadora da proteína. Estes incluem, mas a tal não estão limitados, sistemas de células de mamíferos infectadas com virus (p. ex. vaccinia virus, adenovirus, etc.); os sistemas de células de insectos infectados com vírus (p. ex. baculovirus); microrganismos como a levedura contendo vectores de levedura, ou bactérias transformadas por ADN bacteriofágico, ADN plasmidico ou ADN cosmídico.Nos arranjos preferidos do invento, a expressão do vector pode compreender o promotor CMV (Stephens e Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. 17:7110) e a origem da réplica SV40. Os elementos de expressão destes vectores variam é® força e especificidade. Dependendo do sistema de vector-hospedeiro utilizado, pode usar-se um qualquer dos vários elementos de transcrição e tradução adequados.

Qualquer dos processos anteriormente descritos para inserção de fragmentos de ADN num vector, pode ser usado para construir vectores de expressão contendo um gene quimérico constituído por sinais de controlo de transcrição/tradução e por sequências codificadoras de proteína. Estes processos podem incluir ADN recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão da sequência de ácidos nucleicos_? codificadora de uma proteína de NT-3 ou de um fragmento

71494

6526-040-118

-29de péptido, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácidos nucleicos de forma a que a proteína de NT-3 ou do péptido seja expressa num hospedeiro transformado pela molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão da NT-3 pode ser controlada por qualquer elemento promotor/melhorador 'já conhecido na arte, Os promotores que podem ser usados para controlar a expressão da NT-3 incluem, sem que tal constitua limitação, a região promotora inicial SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290=304-310), o promotor contido no motivo de repetição do terminal longo 3’ do virus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al,, 1980, Cell 22=787—797), o promotor da quinase timidina da herpes (Wagner et al., 1981, Proc, Natl, Acad. Sei. U.S.A. 78=144-1445), as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296=39-42); vectores de expressão procariótica como o promotor da β-lactamase (Villa-Kamaroff et al,, 1978, Proc. Natl, Acad, Sei, U.S.A, 75 = 3427-3751) ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80=21-25), ver também Useful proteins from recombinant bactéria na Scientific American, 1980, 242=74-94; vectores de expressão de plantas compreendendo a região promotora da sintetase nopalina (Herrera-Estrella et al., Nature 503=209-213) ou o promotor do ARN do vírus do-mosaico. dacouverflor. „35.S ; ..,/ (Gardner et al», 1981, Nucl. Acids Res. 9=2871) e o promotor do enzima fotossintêtico ribulose bifosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 510=115-120); elementos promotores da levedura ou de outros fungos como o promotor Sal 4, o promotor ADC (álcool des-hidrogenase), promotor PGK (fosfoglicerol quinase), promotor da fosfatase alcalina e as seguintes regiões de controlo de transcrição animal que mostram especificidade de tecidos e que têm sido utilizados em animais transgénicos: região de controlo de gene elastase I que é activa em células acinar pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 58 = 659-646; Ornitz et al,, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50=399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7=425-515); região de controlo de gene insulina que é activa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 515=115-122), região de controlo de gene imunoglobulina que é activa em células linfoides (Grosschedl et al, , 1984, Cell

71494

6526-040-118

= 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318=533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7=1436-1444), região de controlo do virus do tumor mamário do ratinho que é activa em células testiculares, do colo, linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 45 = 485-495), região de controlo de gene albumina que é activa no fígado (Pinkert et al,, 1987, Genes and Devei. 1=268-276), região de controlo de gene alfa-fetoproteina que é activa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell, Biol. 5=1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235 = 55-58); região de controlo de gene alfa-l-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. _1 = 161-171), região de controlo de gene beta-globina que é activa em células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 515 = 558-540; Kollias et al., 1986, Cell 46 = 89-94; região de controlo de gene de proteina básica de mielina que é activa nas células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48=705-712); região de controlo de gene da cadeia leve 2 da miosina que é activa no músculo < esquelético (Sani, 1985, Nature 514 = 285-286) e a região de controlo .de? . gene da .hormona b? de ? libertação \ gonadotrofio.a aetivá ' ^;no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 254 = 1572-1578).

As inserções de vectores de expressão contendo o gene da NT-3 podem ser identificadas por 3 processos gerais= (a) hibridação ADN-ADN, (b) presença ou ausência de funções marcadoras de gene e (c) expressão de sequências inseridas. No primeiro processo, a presença de um gene estranho inserido num vector de expressão pode ser detectada por hibridação ADN-ADN usando sondas que incluam sequências homólogas às do gene inserido NT-3. No segundo processo, o sistema hospedeiro/vector recombinante pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções “marcadoras do gene (p. ex. a actividade da timidina quinase, a resistência a antibióticos, fenotipos de transformação, formação ds corpos de oclusão no baculovirus, etc.) causadas pela inserção de genes estranhos no vector» Por exemplo, se o gene da NT-3 é inserido dentro da sequência do gene marcador do vector, os recombinantes que contêm a inserção de NT-3 podem ser identificados pela ausência da

71494

6526-040-118

-31função do gene marcador. No terceiro processo, os vectores de expressão recombinante podem ser identificados avaliando o produto do gene estranho expresso pelo recombinante. Estas avaliações podem basear-se, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto do gene da NT-3 em sistemas de bio-avaliação.

Uma vez que uma certa molécula de ADN recombinante tenha sido identificada e isolada, podem usar-se diversos métodos já conhecidos na arte para a propagar. Logo que se tenham estabelecido as condições de crescimento e um sistema hospedeiro adequado, os vectores de expressão recombinante podem ser propagados e preparados em quantidades apreciáveis. Como anteriormente se disse, os vectores de expressão que podem ser usados incluem (sem que tal constitua uma limitação) os seguintes vectores ou derivados: virus do homem ou de animais como o vaccinia virus ou adenovirus; virus de insectos como o baculovirus; vectores de levedura; vectores bacteriófagos (p. ex. lambda) e vectores de ADN plasmídico e cosmídico para nomear apenas alguns,

Além disso, pode escolher-se uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou que modifique e processe o produto de gene da maneira especifica pretendida, A expressão de certos promotores pode ser aumentada na presença de certos indutores; assim, a expressão da proteína da NT-3 obtida por engenharia genética pode ser controlada, Acontece também que as diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento da tradução, post-tradução e modificação (p. ex, glicosação, cisão) das proteínas. Podem escolher-se linhas de células ou sistemas hospedeiros apropriados para assegurarem a modificação e processamento pretendidos da proteína estranha expressa. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano pode ser usada para produzir um produto de proteína de núcleo não glicosado. A expressão em levedura produzirá um produto glicosado. A expressão em células de mamíferos pode ser usada para assegurar a glicosação nativa da proteína heteróloga da NT-3. Além disso os diferentes sistemas de expressão vector/hospedeiro podem

71494

6526-040-118

efectuar reacçoes de processamento tais como cisões proteolíticas de diferentes intensidades.

Num arranjo específico do invento, o ADN codificador da prepro NT-3 pode ser clonado em plasmídeo pCMV, amplificado e depois usado para transfectar células COS pelo método do fosfato de cálcio (Chen e Qkayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7=2745-2752); a actividade da NT-3 pode então ser recolhida de um meio de cultura de células (Ver Secções de Exemplo 6 e 7, infra).

Tem sido realçado que o NGF é sintetizado em duas formas precursoras diferentes, uma forma comprida e uma forma curta (Darling et al., 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 48 = 427-485). A forma mais curta é substancialmente análoga âs formas prepro do BDNF e da NT-3. De acordo com o invento, pode ser desejável utilizar sistemas de expressão compreendendo ADN codificando uma forma longa análoga de BDNF ou NT-3. 0 ADN que codifica estas formas longas precursoras pode ser identificado por determinação da sequência das regiões do ADNc ou ADN genómico a raontánte: ' das regiões codif icadoras dos péptidos da NT-3 ou do BDNF maduro, e localizando a estrutura de leitura de tradução aberta. 0 alinhamento da sequência do gene da NT-3 com as sequências de NGF e BDNF tem permitido o prognóstico de precursores longos e curtos da proteína da NT-3 (Figura 7B). A eficácia da expressão do BDNF maduro ou da NT-3 das formas precursoras longas ou curtas pode depender do sistema de expressão usado e pode variar ds tipo para tipo de linhas de células.

5.3.1. IDENTIFICAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DE GENE EXPRESSO

Uma vez identificado o recombinante que expressa o gene da NT-3, pode analisar-se o produto do gene. Isto consegue-se por ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto,incluindo a marcação radioactiva do produto seguindo-se a análise por electroforese em gel.

Identificada a proteína da NT-3, ela pode ser isolada e purificada pelos métodos clássicos como a cromatografia (p. ex.,

71494

6526-040-118

-33de permuta iónica, de afinidade e de classificação em coluna), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica clássica para purificar proteínas. As propriedades funcionais podem ser avaliadas por qualquer ensaio adequado incluindo (mas sem limitação) os gânglios da raiz dorsal do embrião, os neurónios dos gânglios simpáticos ou dos derivados do placodo neural do pinto.

5.4. AVALIAÇÃO DA ACTIVIDADE BIOLÓGICA DA NEUR0TR0FINA-5 Pode usar-se qualquer método que indique qualitativa ou quantitativamente a actividade da NT-3 de acordo com o presente invento. Como a NT-3, em contraste com o BDNF e o NGF, promove o desenvolvimento da neurite para fora tanto dos gânglios simpáticos como do gânglio nodoso derivado do placodo neural, qualquer destes sistemas, além do sistema de cultura do gânglio da raiz dorsal (DRG), podem ser usados na bioavaliação da NT-3. O ensaio do DRG pode realizar-se como foi descrito por Barde st al. (1980, Proc. Natl» Acad. Sei. U.S.A. 77:1199-1205). 0 sistema ds ensaio do gânglio nodoso pode realizar-se como foi descrito por Lindsay et al. (1985, Dev. Biol. 112:519-328). 0 sistema de ensaio do gânglio simpático pode realizar-se como foi descrito por Barde et al. (1982, EMBO J., 1:549-553).

5.5. GENES E PROTEÍNAS DA NEUR0TR0FINA-5 Usando os métodos referidos acima e os das Secções de

Exemplo 6 e 7, abaixo, determinaram-se as seguintes sequências de ácidos nucleicos e deduziram-se as suas sequências de aminoácidos correspondentes. Determinou-se a sequência genómica da NT-3 do ratinho representada na Figura 2. A sequência da NT-3 do rato está representada na Figura 7. Determinou-se a sequência genómica do ADN da NT-3, representada na Figura 11 que também apresenta as sequências do ADN do rato. Cada uma destas sequências ou os seus equivalentes funcionais podem ser usados de acordo com o invento. Além disso, o invento refere-se aos genes e proteínas da NT-3 isolados de porcinos, bovinos, felinos, aves, equinos ou caninos, bem como de primatas ou de quaisquer outras espécies onde exista actividade da NT-3. 0 invento é também dirigido para as subsequências de ácidos nucleicos da NT-3 que compreendam pelo

71494

6526-040-118

rnenos dez nucleótidos, compreendendo estas subsequências porções hibridáveis da sequência da NT-3 que têm aplicação, p. ex., em ensaios de hibridação de ácidos nucleicos, em análises de mancha Southern e Northern, etc.. 0 invento fornece também proteína da NT-3 e seus fragmentos e derivados, de acordo com as sequências de aminoácidos estabelecidas nas Figuras 2, 7 e 11 ou dos seus equivalentes funcionais. 0 invento prepara também fragmentos ou derivados das proteínas da NT-3 que compreendam determinantes antigénicos ou que sejam funcionalmente activos. Os termos funcionalmente activos significam aqui que têm actividade positiva em ensaios de funções conhecidas da NT-3, p. ex. dos DRG do gânglio nodoso e do gânglio simpático do embrião do pinto.

Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos representadas nas Figuras 2, 7 e 11 podem ser alteradas por substituições, adições ou eliminações que forneçam moléculas funcionalmente equivalentes. Devido ã degenerescência das sequências de codificação de nucleótidos podem ser usadas na prática do presente invento outras sequências de ADN que codifiquem substancialmente as mesmas sequências de aminoácidos representadas nas Figuras 2, 7 e 11. Elas incluem (sem que a tal estejam limitadas) sequências de nucleótidos que compreendam todos ou parte dos genes da NT-3 representados nas Figuras 2, 7 e 11 que sejam alterados pela substituição dos diferentes codões que codificam na sequência um resíduo de aminoácido funcionalmente equivalente, produzindo assim uma alteração sem sintomas (silent change). De igual modo, as proteínas da NT-3 ou os seus fragmentos ou derivados, do invento, incluem (sem limitação) aquelas que contêm, como sequência principal de aminoácidos, toda ou apenas parte da sequência de aminoácidos, substancialmente como nas Figuras 2, 7 e 11, incluindo sequências alteradas onde resíduos de aminoácidos funcionalmente equivalentes substituem resíduos dentro da sequência, do que resulta uma alteração sem sintomas. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro da sequência podem estar substituídos por outros aminoácidos de polaridade semelhante que aetuam como equivalentes funcionais, do que resulta uma alteração sem sintomas. Os substitutos de um

71494

6526-040-118

-35aminoácido dentro da sequência podem ser escolhidos entre outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem a alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem a glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem a arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (acídicos) incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico. Também incluídas no âmbito do invento estão as proteínas da NT-3 ou os seus fragmentos ou derivados que sejam modificados diferencialmente durante ou após tradução, p. ex,, por glicosilação, cisão proteolítica, ligação a uma molécula anticorpo ou a outro ligando celular, etc..

Além disso, uma dada NT-3 pode, por mutação in vitro ou in vivo, criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou de terminação, ou criar variações em regiões de codificação e/ou formar novos locais de restrição de endonuclease ou destruir os já pre-existéntes, para facilitar modificações in vitro posteriormente. Pode usar-se qualquer técnica de mutagénese já conhecida na arte, incluindo (sem limitação) a mutagénese in vitro dirigida ao local (Hutchinsori et al. , 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), o uso de elos TAB(^) (Pharmacia), etc..

5.6. CRIAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-NEUR0TR0FINA-5

De acordo com o invento, a proteína da NT-3 ou os seus fragmentos ou derivados, podem ser usados como imunizador para criar anticorpos anti-NT-3.

Para aumentar a probabilidade de produzir uma resposta imune anti-NT-3, pode analisar-se a sequência de aminoácidos da NT-3 a fim de identificar as partes da molécula que podem estar associadas com uma imunogenicidade aumentada. A sequência de aminoácidos pode, p. ex., ser submetida a uma análise por computador para identificar epítopos de superfície, de acordo com o método de Hopp e Woods (1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828) que tem sido aplicado com sucesso para identificar

71494

6526-040-118

péptidos antigénicos do antigénio de superfície da Hepatite B. Em alternativa, as sequências de aminoácidos da NT-3 deduzidas para as diferentes espécies podem ser comparadas e identifiçadas as regiões relativamente não homólogas; estas regiões não homólogas terão maior probabilidade de serem imunogénicas para as várias espécies.

Para preparar anticorpos monoclonais dirigidos à NT-3 pode usar-se qualquer técnica que produza moléculas anticorpo por cultura de linhas contínuas de células; Por exemplo, a técnica do hibridoma, originalmente desenvolvida por Kohler e Hilstein (1975, Nature, 256=495-497), bem como a técnica' do trioma, a técnica do hibridoma de células-B do homem (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) e a técnica do EBV-hibridoma para produzir anticorpos monoclonais no homem (Cole et al., 1985, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) e outras semelhantes estão dentro do âmbito do presente invento.

Os anticorpos monoclonais para uso terapêutico podem ser anticorpos monoclonais do homem ou anticorpos monoclonais quiméricos de homem-ratinho (ou de outras espécies). Os anticorpos monoclonais do homem podem ser preparados por qualquer uma das numerosas técnicas já conhecidas na arte (e,g., Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4=72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92=3-16). As moléculas anticorpo quiméricas podem ser preparadas contendo um domínio de ligação antigénica do ratinho com regiões constantes do homem (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452).

Podem ser usados vários processos já conhecidos na arte para preparar anticorpos policlonais contra epitopos da NT-3. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injecção com proteína da NT-3 ou seus fragmentos ou derivados, incluindo (sem limitação) coelhos, ratinhos, ratos, etc.. Podem usar-se vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo (sem

71494

6526-040-118

-37lirnitação) o reagente de Freund (completo e incompleto), geles minerais como o hidróxido de alumínio, surfactantes como a lisolecitina, poliois plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas de lapa (género EissurêCIa),dinitrof enol e adjuvantes potencialmente úteis para o homem como o BCG (Bacilo Calmette-Guerin) e o Corynebacterium parvum.

Um clone molecular de um anticorpo contra um epítopo da NT-3 pode ser preparado por técnicas já conhecidas. Pode usar-se a metodologia do ADN recombinante (ver p. ex., Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) para construir sequências de ácidos nucleicos que codifiquem uma molécula de anticorpo monoclonal ou uma sua região de ligação de antigénio.

As moléculas dos anticorpos podem ser purificadas por técnicas já conhecidas, p. ex., por cromatografia de imunoabsorção ou de imunoafinidade, por métodos cromatograficos como a HPLC (cromatografia liquida de alta eficiência) ou por uma combinação destes métodos.

Os fragmentos de anticorpos que contenham o idiotipo da molécula podem ser preparados por técnicas já conhecidas. Por exemplo, esses fragmentos incluem (sem que a tal estejam limitados): o fragmento F(ab’)2 que pode ser produzido por digestão, pela pepsina, da molécula anticorpo; os fragmentos Fab’ que podem ser obtidos por redução das pontes de dissulfureto do fragmento F(ab’)2, β os fragmentos 2 Fab ou Fab que podem ser obtidos tratando a molécula do anticorpo com papaína e um agente redutor.

5.7. UTILIDADE DO INVENTO presente invento refere-se ã preparação da sequência de ácidos nucleicos da NT-3 e à de proteína substancialmente pura e fragmentos de péptidos ou derivados obtidos a partir dela. A NT-3 pode ser preparada em quantidades suficientes para diagnóstico e para aplicações terapêuticas. Podem igualmente ser utilizados anticorpos anti-NT-3 e ácidos nucleicos da NT-3 em diagnósticos e em aplicações terapêuticas. Para a maior parte dos fins é

71494

6526-040-118

-38preferível usar genes da NT-3 ou produtos dos genes da mesma espécie para diagnóstico e fins terapêuticos, ainda que a utilização de espécies cruzadas possa ser útil em arranjos específicos do invento.

5-7.1. APLICAÇÕES DE DIAGNÓSTICO presente invento que se refere a ácidos nucleicos que codificam a NT-3 e proteínas, fragmentos de péptidos ou derivados bem como a anticorpos contra a proteína, péptidos ou derivados da NT-3, pode ser utilizado para diagnosticar doenças e distúrbios do sistema nervoso que possam estar associados com alterações do padrão de expressão da NT-3.

Em vários arranjos do invento, os genes da NT-3 e suas sequências e subsequências de ácidos nucleicos incluindo sequências complementares podem ser utilizados em ensaios de hibridação para diagnóstico. As sequências de ácidos nucleicos da NT-3, ou as suas subsequências compreendendo cerca de 15 nucleótidos, podem ser usadas como sondas de hibridação. Os ensaios de hibridação podem ser utilizados para detectar, prognosticar, diagnosticar ou monitorizar estados, distúrbios ou doenças associadas com alterações da expressão da NT-3, incluindo em particular, os estados resultantes de danos nos neurónios sensitivos. Estas doenças e estados incluem (sem que a tal estejam limitados) o trauma no SNC, enfarte, infecção, doenças degenerativas dos nervos, estados malignos ou alterações post-operatórias incluindo (mas sem limitação) a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a coreia de Huntington. Por exemplo, pode avaliar-se o ARN total numa amostra de tecido de um paciente pela presença de ARNm da NT-3, onde uma alteração da quantidade de ARNm da NT-3 é indicadora de degenerescência neuronal.

Em outros arranjos do invento podem utilizar-se os anticorpos dirigidos à proteína, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3 para diagnosticar doenças e distúrbios do sistema nervoso, incluindo, em particular, os distúrbios sensoriais e doenças degenerativas da retina, bem como os distúrbios e doenças acima referidas. Os anticorpos do invento podem ser usados p. ex.

71494

6526-040-118

-39em técnicas de hibridação in situ usando amostras de tecidos obtidas de um paciente necessitado dessa avaliação, Num outro exemplo, os anticorpos do invento podem ser usados em processos ELISA para detectar e/ou medir quantidades de NT-3 presentes em amostras de tecidos ou de fluidos; de modo análogo, os anticorpos do invento podem ser usados em análises de mancha Western para detectar e/ou medir a NT-3 presente em amostras de tecidos ou de fluidos.

Noutros arranjos do invento, a proteína, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3 podem ser utilizados para diagnosticar doenças e distúrbios do sistema nervoso, Num arranjo particular (e sem limitação), pode ser usada proteína ou fragmento de péptidos marcados para identificar tecidos ou células que expressam o receptor da NT-3 com vista a identificar aberrações da expressão do receptor da NT—3 e, consequentemente, anormalidades potenciais nos tecidos ou na resposta celular ã NT-3,

5,7,2. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS presente invento que se refere aos ácidos nucleicos que codificam a NT-3 e à sua proteína, fragmentos de péptidos ou seus derivados, bem como a anticorpos dirigidos contra a proteina, péptidos ou derivados da NT-3, pode ser utilizado para tratar doenças e distúrbios do sistema nervoso que possam estar associados a alterações do padrão de expressão da NT-3 ou que possam beneficiar da exposição à NT-3 ou a anticorpos anti-NT-3.

Em vários arranjos do invento, a proteína, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3, podem ser administrados a pacientes cujo sistema nervoso tenha sido afectado por trauma, cirurgia, isquémia, infecção, doença metabólica, deficiência nutricional, estados malignos ou agentes tóxicos. Em vários arranjos específicos do invento, a NT-3 pode ser administrada localmente a neurónios sensitivos que tenham sido prejudicados incluindo (sem limitação) neurónios nos gânglios da raiz dorsal ou em qualquer dos seguintes tecidos: gânglios geniculado, rochedo e nodoso; o complexo vestíbulo-acústico do 82 nervo

71494

6526-040-118

-40' craniano; o polo ventrolateral do lobo maxilo-mandibular do gânglio do trigémeo, os gânglios do núcleo do trigémeo do mesencéfalo e os simpáticos. Pode pretender-se administrar os péptidos relacionados com a NT-3 ou a proteína da NT-3 por adsorção numa membrana, p. ex., uma membrana silástica que pode estar implantada na proximidade do nervo atingido. 0 presente invento pode também ser utilizado p. ex. para acelerar a recuperação de pacientes que sofram de neuropatias diabéticas, p. ex., neuropatias periféricas diabéticas e mononeuropatias multiplex.

Além das neuropatias diabéticas, a NT—3 ou os péptidos relacionados com a NT-3 podem também ser usados para tratar outras neuropatias periféricas incluindo (mas sem limitação) as seguintes neuropatias associadas com virus, incluindo a neuropatia relacionada com o síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA), a mononucleose infecciosa com polineurite, a hepatite virai com polineurite; o síndroma de Guillian-Barre; a neuropatia relacionada com o botulismo; as polineuropatias tóxicas incluindo as neuropatias relacionadas com o chumbo e o álcool; as neuropatias nutricionais incluindo a subaguda combinada com degenerescência; as neuropatias angiopáticas incluindo as neuropatias associadas com o lupus eritematoso sistémico; a neuropatia associada com sarcoides; a neuropatia carcinomatosa; a neuropatia de compressão (p. ex. o síndroma da aeroembolia carpal) e as neuropatias hereditárias. As neuropatias hereditárias que podem ser tratadas usando a NT-3 ou as proteinas relacionadas com a NT-3 incluem a atrofia muscular do perõneo, a disautomia de família e neuropatia hipertrófica progressiva.

Noutros arranjos do invento, a proteína ou os fragmentos de péptidos ou os derivados da NT-3, podem ser usados para tratar estados congénitos ou distúrbios neurodegenerativos incluindo (mas sem limitação) a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a esclerose múltipla, a esclerose lateral amiotrófica e a coreia de Huntington.

Num arranjo específico do invento, a administração da

71494

6526-040-118

-41proteína da NT-3, ou dos seus fragmentos de péptidos ou derivados, pode ser usada em conjunção com implantações cirúrgicas de tecidos no tratamento da doença de Alzheimer e/ou da doença de Parkinson. Como se mostra na Secção 11, abaixo, a NT-3 melhora a sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos; corno os neurónios dopaminérgicos são destruídos na doença de Parkinson, a NT-3 pode ser usada nos métodos de tratamento da doença de Parkinson, que compreendem a administração de uma quantidade efectiva de NT-3 a um paciente necessitado de tal tratamento. Verificou-se que aproximadamente 35¾ dos pacientes com a doença de Parkinson sofriam da demência de Alzheimer; a NT-3 produzida de acordo com o invento pode provar ser um agente único de terapia útil para este complexo de doenças. De modo análogo, a NT-3 preparada de acordo com o invento pode ser usada para tratar terapeuticamente a doença de Alzheimer conjuntamente com o Síndroma de Down. Além disso, como se mostra na Secção 12, abaixo, a NT-3 está expressa em níveis elevados durante o desenvolvimento e diferenciação do sistema nervoso; a NT-3 pode assim ser usada no tratamento de distúrbios do desenvolvimento do sistema nervoso, como o Síndroma de Down, e também no tratamento de distúrbios relacionados com a des-diferenciação das células, como nos estados malignos ou em distúrbios que possam beneficiar da regeneração do sistema'nervoso. A NT-3 produzida de acordo com o invento pode ser usada no tratamento de diversos tipos de demência bem como nos distúrbios de aprendizagem congénitos.

Noutros arranjos do invento, a proteína, os fragmentos ou os derivados da NT-3 podem ser usados conjuntamente com outras citoquinas para alcançar um desejado efeito neurotrófico. Por exemplo (e não como limitação), a NT-3 preparada pelo invento pode ser usada juntamente com um segundo agente, por exemplo, o NGF -ou o BDNF para se alcançar um efeito estimulador·- sinergíco no crescimento de neurónios e/ou na manutenção da sobrevivência e/ou na restauração ou melhoramento de funções onde o termo sinergícô < significa que o efeito da combinação da proteína, fragmentos peptídicos ou derivados da NT-3, com um segundo agente, alcança um efeito maior do que a substância usada

71494

6526-040-118

-42apenas individualmente. Pretende-se que a NT-3 possa funcionar sinergicamente - - --- com outros factores peptídicos derivados do SNC já completamente caracterizados no crescimento, desenvolvimento, manutenção da função diferenciada e na sobrevivência duma vasta ordem de subpopulações neuronais do sistema nervoso central. Em alternativa os efeitos da NT-3 e de um segundo agente neurotrópico podem ser aditivos.

Prevê-se também que, com base na plena caracterização da molécula da NT-3, possam ser desenvolvidos novos fragmentos de péptidos, derivados ou mutantes da NT-3 que sejam capazes de actuar como antagonistas de algumas ou de todas as funções biológicas da NT-3. Estes antagonistas da NT-3 podem ser úteis na eliminação de neurónios sensitivos, p. ex., no tratamento de síndromas de dor crónica.

Ainda noutros arranjos do invento, os anticorpos dirigidos à proteína da NT-3 ou a,os seus fragmentos peptídicos ou derivados, podem ser administrados a pacientes que sofram de diversos distúrbios e doenças neurológicas e que necessitem de tal tratamento. Por exemplo, os pacientes que sofram de produção excessiva de NT-3 podem necessitar desse tratamento. Os anticorpos anti-NT-3 podem ser usados na prevenção da regeneração anormal de neurónios sensitivos (p. ex. após operação), ou, como acima se discutiu, no tratamento de síndromas de dor crónica.

A distribuição de NT-3 nos tecidos, como se descreve nas Secções 6 e 7 infra, indica que níveis elevados de ARNm da NT-3 estão expressos no cérebro, rins, coração e baço, entre outros tecidos. A NT-3 produzida em tecidos não neurais pode ser ou não idêntica à NT-3 expressa no cérebro. Uma só espécie de NT-3 pode funcionar tanto nos tecidos neurais como nos não neurais; distúrbios na expressão da NT-3 podem ser o fundamento de doenças que afectem o sistema nervoso bem como os sistemas de outros órgãos. Por outro lado uma família muito próxima de moléculas de NT-3 pode servir diferentes funções em tecidos neurais e não neurais. As moléculas de NT-3 do invento podem portanto ser úteis no tratamento de doenças que afectem também a regulação neural de

71494

6526-040-118

-43tecidos não neurais, incluindo em particular o coração, os sistemas hematopoiético, renal e reticuloendotelíal,

Como se exemplifica na Secção 6, abaixo, a expressão da NT-3 está aumentada em animais imaturos quando se compara com animais adultos. De acordo com o invento, a NT-3 pode ser particularmente útil no tratamento de distúrbios do desenvolvimento ou, em alternativa, na indução de renovação do sistema nervoso após danos no SNC.

5.8. C0MP0SIÇ5ES FARMACÊUTICAS

As composições activas do invento, que podem incluir parte ou todo o produto de genes da NT-3, incluindo a proteína, fragmentos de péptidos ou seus derivados ou anticorpos (ou fragmentos de anticorpos) dirigidos contra a proteína, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3 ou uma combinação de NT-3 e pelo menos um outro agente, como o NGF ou o BDNF, podem ser administradas em qualquer veiculo estéril farmaceuticamente biocompativel, incluindo (mas sem a tal estarem limitadas) o soro salino, soro salino tamponado, dextrose e água.

A proteína, os fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3 podem compreender uma sequência de aminoácidos ou uma sua subsequência, substancialmente como se indica nas Figuras 2, 7 ou 11; pode ser preferível usar proteína da NT-3 que compreenda, em particular, parte ou toda a sequência de aminoácidos desde cerca do aminoácido 140 até cerca do aminoácido 258, como se indica na Figura 2, desde cerca do aminoácido 1 até cerca do aminoácido 119 na Figura 7, ou desde o primeiro aminoácido marcado maduro na Figura 11 até ao fim da sequência de péptidos aí representada, ou uma sequência funcionalmente equivalente, pois que se julga que esta subsequência compreenda a parte funcional da molécula de NT-3. A NT-3 pode derivar de sequências que correspondam aos genes da NT-3 de quaisquer espécies adequadas incluindo (mas sem limitação) o homem, o porco, o rato, a galinha, a vaca, o cão, o carneiro, a cabra, o gato, o coelho, etc.,

A quantidade de proteína, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3, ou de anticorpo que seja eficaz no tratamento de um

71494

6526-040-118

-44determinado distúrbio ou estado, depende da natureza do distúrbio ou estado e pode ser determinada pelas técnicas clínicas clássicas. Sempre que possível é desejável determinar a curva de dose-resposta das composições farmacêuticas do invento primeiro in vitro, p. ex. nos sistemas de bioavaliação da NT-3 acima descritos, e depois em sistemas úteis de animais modelo, antes de as ensaiar no homem. Com base nos resultados in vitro, num dos arranjos específicos do invento, uma composição farmacêutica eficaz na promoção de sobrevivência de neurónios sensitivos pode fornecer uma concentração local de proteína da NT-3 entre cerca de 0,1 e 10 ng/ml.

Os métodos de introdução incluem (sem limitação) o intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, endovenoso, subcutâneo, oral e intranasal. Além disso pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas do invento no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo a injecção intraventricular e intratecal; a injecção intraventricular pode ser facilitada por um catetsr intraventricular, p. ex,, ligado a um reservatório, p. ex. um reservatório Ommaya.

Além disso pode ser desejável administrar as composições do invento, localmente, na área necessitada de tratamento; isto pode conseguis—se, p, ex, e não como limitação, por infusão local durante a operação cirúrgica, por injecção, por meio de um catéter ou por meio de um implante, sendo o referido implante de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, p, ex. membramas sialásticas ou fibras.

invento também fornece composições farmacêuticas que compreendem .proteínas, fragmentos de péptidos ou derivados da NT-3, administradas via liposomas, micropartículas ou microcápsulas. Em vários arranjos do invento pode ser útil usar essas composições para alcançar uma libertação retardada de NT-3 ou de produtos relacionados com a NT-3.

Pretende-se que seja possível introduzir células produzindo activamente a NT-3, substâncias relacionadas com a NT-3, antagonistas da NT-3 ou anticorpos anti-NT-3, em áreas necessitadas de

71494

6526-040-118

-45concentrações de NT-3 aumentadas ou reduzidas.

6. EXEMPLO: A CLONAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA

NEUR0TR0FINA-3 DO RATINHO

6-1. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. REACÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE Foram sintetizados dois iniciadores de oligonucleótidos, com base em 2 sequências de aminoácidos conservadas em BDNF e em todos os NGF conhecidos (Leibrock et al., 1989, Nature 341=149-152). A sequência do iniciador do sentido (ou 5’) foi GGGGATCCGC GGI TGY MGI G6I ATH GA (iniciador 1, nomemclatura da IUPAC, I=inosina) e incluia locais BamHI e SacII, e a sequência do iniciador antisentido (ou 3’) foi TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA e incluia locais EcoRI e Xbal (iniciador 2). A PCR (Saiki et al,, 1985, Science 250=1350-1554) foi realizada com 1 ug de ADN genómico de ratinho usando um ciclizador térmico Cetus da Perkin-Elmer e Taq polimerase (Gene Amp^). Após 4 ciclos a uma temperatura de têmpera (annealing) de 45°C, os restantes 36 ciclos foram realizados com temperaturas de 49°C. Os produtos resultantes de ADN amplificado correspondentes ao tamanho

esperado (137 pares de base) foram eluidos de ura/de acrilamida, reamplifiçados e digeridos com HindII e Apal, o primeiro para cindir NGF do ratinho, o último para o BDNF do ratinho. 0 ADN não cindido foi eluído, amplificado assirnetricamente (Innis et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85 = 9456-9440) e sequenciado (Sanger et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72=5918-5921) usando os iniciadores 1 e 2. Com base na sequência assin obtida, sintetizaram-se mais 2 iniciadores de sentido correspondentes ao nucleótido 802-822 (iniciador 3) e 824-844 (iniciador 4) aos quais se juntaram os locais Sall e PstI. Extraíu-se ARN do cérebro, do fígado e do músculo do ratinho adulto (Okayama et al., 1987, Meth. Enzymology 154=5-28) e transcreveu-se inversamente usando iniciador antisentido (5’) CGGATCCGAATTCTGCAG(T)i2^v (iniciador 5) para simular caudas 3’ poli (A), contendo locais de clonação de BamHI, EcoRI e PstI (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-152). Estes ADNc foram primeiro amplificados por PCR usando iniciadores 3 e 5 e re-amplifiçados usando iniciadores 4 e

71494

6526-040-118

-465. Realizou-se uma análise de mancha Southern com os produtos resultantes desta última reacção e hibridáranr-se- com um oligonucleótido marcado no fim com ³²P, correspondente aos nucleótidos 879-893. Os fragmentos de ADN assim identifiçados foram clonados num vector BluescriptC^) SK+ (Stratagene) e a inserção mais comprida obtida (460 pares de base) foi usada para pesquisar uma biblioteca (Clontech) genómica de ratinho EM8L3. Encontraram-se 2 clones positivos e digeriu-se o ADN de um clone com diversos enzimas de restrição. Os fragmentos de restrição foram sondados com a inserção de 460 pares de base: um fragmento HindIII de 770 pares de base e um fragmento PstI de 4000 pares de bases-· foram subclonados no Bluescript(^) SK+, Mostra-se a sequência completa de HindIII-.na extensão 3’ a 5’ usando o fragmento PstI.

6.1.2. ANÁLISE DE MANCHA NORTHERN

Extraiu-se ARN total de tecidos da fêmea adulta (Okayama et al., 1987, Meth. Enzym. 154:5-28) e submeteu-se a electroforese sobre geles de agarose contendo 1,3¾ de formaldeído (Hehrach et al., 1977, Biochem 16:4745-4751). 0 ARN foi transferido para membramas de nylon (Hybond-N, Amersham) e hibridado durante a noite, a 42°C, em 1 ml de fosfato de sódio 200 mM (pH 7,2) contendo 40¾ de formamida, solução de SxDenhardt e 200 ug ml^-^ de ADN desnaturado de esperma de salmão. A sonda usada estava marcada com ^2p _{s era uma} sonda de dupla espira com iniciadores ao acaso (Feiberg et al., 1979, Anal. Biochem. 157:266-267), correspondente aos nucleótidos 319-1093 (Fig. 2). A actividade específica era de l,3xl0⁸ cpm x w.g^-1, e juntaram-se 10? ao tampão de hibridação. A lavagem durou 60 min, a 60°C, em 0,lxSSC contendo 0,5¾ SDS. 0s filtros foram expostos durante 5 dias a -70°C com filtros intensificadores.

6.1.3. EXPRESSÃO DA NEURQTROFINA-5 Foram sintetizados iniciadores de oligonucleótidos, correspondentes aos primeiros 19 nucleótidos (mais um local EcoRI) e aos 19 últimos nucleótidos (mais um local BamHI) da estrutura ds leitura aberta representada na Fig. 2. Após amplificação por PCR usando como padrão o fragmento genómico PstI (Fig. 2), o produto

71494

6526-040-118 resultante foi clonado no local EcoRI-BamHI do vector de expressão pCMV (Anderson et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:8222-8229). Determinou-se a sequência de nucleótidos da inserção de NT-3 no pCMV. As células COS—1 foram transfectadas usando o processo do fosfato de cálcio (Chen e Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7=2745-2752) e o meio foi recolhido como anteriormente se descreveu (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-152K Os meios de controlo foram obtidos após tratamento das células COS-1 com fosfato ds cálcio ou com uma 'construção ^: pCMV/NT-3 onde o codão de paragem da NT-3 tinha sido rejeitado. Ambos os meios estavam destituídos de actividade biológica, na diluição de 1=50. Os gânglios nodosos foram dissociados, os neurónios cultivados em placas de 24 poços (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112=319-328), e o BDNF foi purificado a partir de cérebro de porco (Hofer e Barde, 1988, Nature 551=261-262).

6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um problema importante na caracterização de factores neurotróficos é a sua abundância extremamente baixa. Ambos o NGF e BDNF foram caracterizados usando técnicas de purificação de proteínas baseadas em ensaios biológicos para controlar a sua actividade (Cohen et al., 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46=302-311; Barde et al., 1982, EMBO J. 1=549-553). Esta abordagem foi possível com o NGF devido à extraordinária abundância desta proteína na glândula submandibular do ratinho macho adulto e ultimamente com o BDNF devido à disponibilidade virtualmente ilimitada de tecido de cérebro porcino. A identidade de sequências detectada no NGF e BDNF sugeriu que se poderia usar uma estratégia diferente para caracterizar outros membros daquilo que se determinou ser uma família de genes (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-152). Uma comparação detalhada das sequências de aminoácidos (a.a.) do NGF e BDNF do ratinho revelou 2 trechos de a.a. (sublinhados na Fig. 2) que parecem particularmente adequados para uma abordagem que use iniciadores de oligonucleótidos numa reacção em cadeia de polimerase (PCR) (Saiki et al., 1985, Science 250 = 1550-1554). Foi usado padrão genómico de ratinho porque nos genes de NGF e BDNF nenhum intrão interrompe a

71494

6526-040-118

codificação, pelo exão, das proteínas biologicamente activas. Esta abordagem tem como resultado a esperada amplificação das sequências do NGF e BDNF que foram depois digeridas usando enzimas de restrição apropriados. Um fragmento de ADN deixado intacto foi sequenciado e verificou-se que a sequência não correspondia ao BDNF nem ao NGF, Sinterizaram-se dois iniciadores de sentido (ou 5’) específicos para novas PCRs usando como padrões ADN complementar preparado por transcrição inversa de ARN extraído de cérebro, músculo e fígado de ratinho, e um iniciador 3¹ para simular sequências poli A (Fig. 2). Estes três tecidos deram produtos amplificados de tamanhos semelhantes, que foram clonados e usados para pesquisar uma biblioteca” genómica de ratinho, Sequenciou-se um dos clones genómicos assim obtido (Fig. 2). Uma estrutura de leitura aberta indica uma proteína de 258 a.a. (começando na primeira metionina encontrada depois de 3 códões de paragem, na estrutura), Em todos os aspectos, a estrutura geral da proteína indicada assemelha-se às estabelecidas para o NGF e BDNF = uma suposta sequência de sinal de 18 a.a. (mostrando 5 e 9 identidades de a.a. com BDNF e NGF respectivamente) é seguida de uma pro-sequência de 121 a.a.. Estas pro-sequências, presumivelmente implicadas no estabelecimento e formação correcta das pontes de dissulfureto destas proteínas (Edwards et al,, J» Biol. Chem. 263:6810-6815), têm sido encontradas no NGE (103 a.a.) do ratinho e no BDNF (112 a.a.) do ratinho. Um só local de N-glicosilação potencial está situado 9 a.a. (em comparação com 8 no BDNF e NGF) antes daquilo que nós propomos que seja o local de cisão, caracterizado por um grupo de resíduos básicos, dando origem à NT-3 madura (Fig. 2, seta), Prevê-se que a NT-3 madura consista em 119 a.a. (massa molecular relativa 13 625 e pl 9,3). A comparação entre NGF, BDNF e NT-3 maduros, do ratinho, revela 54 identidades de a.a. (Fig. 2), Todos os 6 resíduos de cisteina, que se sabe estarem implicados na formação das pontes de dissulfureto no NGF e BDNF (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-152); Angeletti, 1973, Biochemistry 12=100-115) estão entre os resíduos cconservados (Fig, 3, setas). É notável que a adição da sequência da NT-3 às dos NGF

e BDNF revele que apenas 7 a.a. idênticos se tenham perdido (encontram-se 61 a.a. idênticos quando se comparam NGF e BDNF do ratinho). Assim conserva-se quasé 50¾ da estrutura primária e é provavelmente o necessário para a formação de uma forma básica

3-dimensional comum a todas as 3 proteínas. Além disso, a comparação das 3 sequências revela 4 domínios variáveis, cada um de 7 a 11 a.a. de comprimento (numerados VI a V4 na Fig. 3), presumivelmente implicados na especificidade neuronal exercida por estas proteínas.

Para estudar a expressão do gene da NT-3, extraíu-se ARN de diversos tecidos do ratinho e analisou-se com uma sonda específica de NT-3 (Fig. 4). Encontrou-se uma única banda de cerca de 1,4 quilobases em todos os tecidos examinados (Fig. 4A). Contudo o nível de expressão deste ARNm varia consideravelmente. No cérebro (Fig. 4B) encontraram-se acentuadas diferenças regionais sendo os níveis mais elevados de ARNm observados no cerebelo e no hipocampo (Fig. 4B). Estes resultados demonstram que a distribuição de ARNm da NT—3 no tecido do ratinho adulto é muito diferente da do ARNm do BDNF e NGF. De facto, encontra-se ARNm do BDNF predominantemente no cérebro e o ARNm do NGF é dificilmente detectável em tecidos como o fígado ou o músculo · : esquelético (Heumann st al., 1984,. EMBO 3. 3=3138-3189), É contudo intrigante notar que o hipocampo, conhecido por expressar ARNm do NGF (Korsching et al., 1985, EMBO 3. 4=1389=1393), também expresse ARNm do BDNF e da NT-3 e em quantidades muito maiores do que na maior parte das outras regiões do cérebro (Fig. 4B).

Com o fim de pesquisar se a NT-3 é uma proteína segregada e biologicamente activa, toda a sequência de codificação da proteina foi cionada num vector de expressão (pCMV) usado para transfectar células COS (do rim de macaco) (Fig. 5). Dado o facto de se encontrar ARNm da NT-3 em tecidos periféricos, cultivámos diversos neurónios de pinto embrionário conhecidos por projectarem estes tecidos e por necessitarem de factores trópicos para sobreviverem. Na presença de NT-3 observou-se que não sobreviviam os neurónios motores, purificàdos a partir da espinal medula de embriões com 6 dias de idade (E6) (Dohrmann et al=, 1986, Dev,

71494

6526-040-118

-50Biol. 118=209-221), os neurónios ciliares (E8) e os neurónios simpáticos dissociados (Eli). Contudo, verificou-se que os neurónios sensitií vos isolados de gânglios sensitivos primários de E8 respondiam. Como aqui se mostra (Fig, 5), a NT-3 apoia a sobrevivência de cerca de 30¾ dos neurónios isolados do gânglio nodoso. Além disso, este efeito é aditivo ao do BDNF, sintetizado nos campos de projecção central, e sabe-se que actua sobre uma subpopulação dos neurónios nodosos (Lindsay et al,, 1985, Dev, Biol, 112=319-328), e ambos os factores combinados salvam a maior parte dos neurónios (90¾) (Fig, 5), É importante notar que o ARNm da NT-3 é encontrado nos alvos viscerais deste gânglio, incluindo o coração, intestinos, fígado e pulmões (Fig, 4A). Também se encontram populações de neurónios sensitivos, sensíveis à NT-3, nos gânglios da raiz dorsal dissociada e do trigémeo E8 e em explantes de gânglios simpáticos de E8. Parece assim que a NT-3 tem uma actividade biológica, até agora não caracterizada, presente em diversos tecidos periféricos incluindo o fígado (Lindsay e Tarbit, 1979, Neuro Sei, Lett. 12=195-200) e o músculo esquêlêtico (Davies, 1986, Dev. Biol. 115=56-67), e que se sabe apoiar a sobrevivência de neurónios sensitivos viscerais e proprioceptivos que não respondem ao NGF (para uma revisão sobre o assunto, ver Davies, 1987, Development 101=185-208).

Tomadas em conjunto, estas descobertas indicam que a NT-3 é um factor neurotrófico ligado, tanto em estrutura como em funções, ao NGF e BDNF, as duas primeiras neurotrofinas. Propomos que o nome neurotrofina (NT) se aplique a esta classe de proteína e, em analogia com as interleucinas, se numere pela ordem da sua descoberta.

7. EXEMPLO: A CLONAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO D0 GENE

DA NEUROTROFINA-3 P0 RATO

A homologia entre NGF e BDNF foi utilizada para estabelecer uma estratégia de clonação para pesquisar novos membros desta família de genes.' Descrevemos a clonação de um gene que codifica um terceiro membro da família BDNF/NGF, o qual designámos por neurotrofina-3 (NT-3), Este novo factor revela uma actividade biológica e uma expressão espacio-temporal distintas quando se

71494

6526-040-118

-51compara com ο NGF e o BDNF.

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS

7.1.1. REACÇÕES EM CAPEIA DE POLIMERASE

Sintetizaram-se oligonucleótidos degenerados correspondentes a segmentos de quatro sequências ds proteína altamente conservadas entre NGF e BDNF; as sequências de proteína (que podem ser encontradas dentro das sequências NGF/8DNF na Fig. 7D) foram (1) Gly-Glu-(Tyr/Phe)-Ser-Val-Cys-Asp-Ser, (2) Lys-Gln-Tyr-Phe-(Tyr/ /Phe)-Glu-Thr-Lys-Cys, (3) Gly-Cys-Arg-Ile-Asp, e (4) Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-(Ser/Ala)-Cys-Val-Cys. Nas reacções PCR usou-se uma série de oligonucleótidos degenerados de sentido e anti-sentido (contendo uma porção degenerada de 15-26 nucleótidos de comprimento, correspondendo a 5-9 aminoácidos das sequências de proteína indicadas nas direcções sentido e anti-sentido, bem como uma cauda não degenerada codificando locais de reconhecimento do enzima de restrição). As reacções de amplificação entre pares de iniciadores de sentido,a montante,e de anti-sentido_z a jusante, foram realizadas de acordo com as condições recomendadas por Perkin-Elmer/Cetus, excepto em que a temperatura - de têmpera, a concentração de Mg⁺⁺ e o tempo de extensão variaram para se determinar as condições óptimas para cada par de iniciadores. A sequência exacta do iniciador de sentido 1B (codificando uma porção da sequência 1 de proteína acima) foi 5’-GACTCGAGTCGACATCG-GTN—TGY-GAY-WSN-RTN-WS—3’ e a do iniciador anti-sentido 2C (correspondendo aos codões anti-sentido de uma porção da sequência 2 da-proteína, acima) foi 5’-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3’ (abreviaturas dos nucleótidos segundo o código da IUPAC). A análise posterior das sequências mostrou que o oligonucleótido 1B tinha um desasjustamento de 2 nucleótidos com a sequência da NT-3 enquanto que o oligonucleótido 2C tinha um desasjustamento de 1 -nucleõtido com a sequência de NT-3, Fez-se a radio-marcação por PCR, de acordo com a reacção recomendada de amplificação de gene, por Perkin-Elmer/Cetus, com as seguintes modificações: 1 a 10 ng do padrão de ADN em agarose de baixo ponto de fusão foi adicionado a uma mistura de reacção contendo dATP, dGTP e DTTP não marcados, numa concentração final de 50wM; juntaram-se 50 wCi «32p_^çyp (3000 Ci/mmole) por 50 pl da mistura

71494

6526-040-118

-52reagente s submeteu-se a reacção a sete ciclos de amplificação. Os iniciadores de amplificação foram idênticos aos iniciadores degenerados usados na PCR original.

7.1.2. MANCHA SOUTHERN DO ADN GENÕMICO DO RATO USANDO SONDA DE NT-3

Obteve o produto PCR R1B/2C por amplificação do padrão de ADN genõmico do rato usando iniciadores degenerados 1B e 2C como acima se descreveu na Secção 7.1,1.. 0 produto PCR_z derivado usando iniciadores degenerados 1B e 2C (designado por R1B/2C), detecta um novo gene, NT-3, bem como os genes de NGF e BDNF no ADN genõmico do rato. Preparou-se ADN a partir do fígado de ratos Fischer (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)), digeriu-se com EcoRI e fraccionaram-se 10 ug sobre gel a 1% de agarose. Transferiu—se o ADN para nitrocelulose usando 10X SSC (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual· (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)), hibritíõu-se (Mahmoudi e Lin, 1989, Biotechniques 7:331-3) com o produto PCR R1B/2C marcado com ³²P, a 60°C, e lavou-se em 2X SSC/0,1% SDS a 65°C. Indicam-se as bandas da NT—3, NGF e BDNF; a posição das bandas de NGF e BDNF foram previamente determinadas usando sondas específicas. Os tamanhos estão indicados, à esquerda, em quilobases ( kb ).

7.1.3. EXPRESSÃO DA NEURQTROFINA-3

A construção de expressão da NT-3 foi obtida- usando PCR para amplificar a região de codificação do suposto precursor curto da NT-3 a partir de um plasmideo contendo o fragmento genõmico do rato, Sstl, de 3,2 kb (Fig. 6B) que abarca o gene da NT-3; os oligonucleõtidos usados na reacção PCR continham locais de reconhecimento Xhol de síntese, nos seus extremos, para permitir a inserção da região amplificada de codificação no local Xhol no ligador múltiplo (polylinker) do vector de expressão pCDMS (Seed, 1987, Nature 329:840-42). Os oligonucleõtidos exactos, usados para amplificar a região de codificação do gene da NT-3 do rafo, foram o iniciador de sentido a- montante'- - de - 5’- CGG TAC CCTCGAGCC ACC ATG TCC ATC TTG TTT TATGTG - 3’ (o ATG

71494

6526-040-118

-53sublinhado corresponde ao codão de iniciação do local de partida B, com a sequência a jusante do ATG simulando exactamente a sequência da NT-3; a montante do ATG o iniciador contém um local de síntese Xhol) e o iniciador anti-sentido a jusante 5” - CGG TAC CCT CGA GAT GCC AAT TCA TGT TCT TCC 6-3’ (o tripleto sublinhado é complementar do codão de terminação do gene da NT-3; este tripleto é flanqueado pela sequência sxacta anti-sentido da NT-3, e há um local Xhol no extremo 5’ deste iniciador). 0 resultante plasmídeo de expressão da NT-3 do rato foi designado por pC8-rN3(Pl). Foram usadas anteriormente estratégias semelhantes para inserir regiões de codificação do NGF e BDNF do rato no local Xhol do mesmo vector pCDMS. As construções de expressão da NT-3, NGF e BDNF foram transfectadas, como se descreve em Okayama s Berg (1982, Mol. Cell, Biol. 5=1136-42) em células COS-M5 semeadas a 5x10^ células por placa de 60 mm e cultivadas em 2,5 ml de Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium contendo elevada glucose (4500 mg/ml) e 10% de soro bovino fetal; os sobrenadantes foram colhidos 72 h após transfecção,

7.2, RESULTADOS

7.2.1, CLONAÇÃQ D0 GENE DE NEUR0TR0FINA-5 Os produtos de amplificação dos tamanhos pretendidos (previstos a partir de sequências de NGF e BDNF) foram obtidos usando pares diferentes de oligonucleõtidos degenerados, Estes produtos foram primeiro submetidos à análise por enzimas de restrição para determinar o conteúdo relativo de NGF, BDNF ou de novas sequências. Em todos os casos eram detectáveis, pela mancha com brometo de etídio, fragmentos de restrição correspondendo apenas a sequências do NGF e BDNF. Contudo, o uso dos mesmos produtos PCR como sondas de hibridação sobre manchas Southern de ADN genómico do rato, revelou que um produto (designado por R1B/2C, ver Fig. 6A) identificou uma nova sequência de ADN genómico, além de NGF e BDNF (Fig. 6A); assim a pesquisa nos produtos PCR pela mancha Southern permitiu a identificação de sequências amplificadas raras que eram indetectáveis por outros meios, A sonda R1B/2C também detectou novas sequências no ADN

71494

6526-040-118

genómico tíe espécies tíe evolução divergentes (incluindo o homem, o ratinho, a galinha, e Xenopus) o que sugere que esta sonda identifica um gene funcional.

A fim de isolar este gene usaram-se a sonda R1B/2C bem como sondas específicas para o NGF e BDNF para pesquisar (Maniatis et al., 1932, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor)) uma biblioteca de ADN genómico do rato (adquirida nos Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, CA) preparada a partir de ADN de ratos Sprague-Dawley (parcialmente digerido com endonuclease de restrição Sau3A e clonado no vector bacteriófago EMBL3/SP6/T7. Encontraram-se dois clones bacteriófagos independentes que hibridavam a sonda R1B/2C mas não nenhuma das outras duas sondas. A análise do mapa ds restrições das inserções genómicas do rafo nestes clones demonstrou que elas correspondiam ao mesmo gene (Fig. 6B). 0 clone bacteriófago com a inserção mais comprida foi designado por (J>rN3(Gl). A análise de sequências provou que o gene identificado por R1B/2C codifica um novo membro da família NGF/BDNF (ver Fig. 7) que nós chamámos neurotrofina-3.

7.2.2. ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DA NEURQTROFINA-3 MADURA sequenciamento do ADN foi realizado pelo método da terminação da cadeia de didesoxi nucleótidos (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74=5463-7) usando o kit SEQUENASE Versão 2.0 fornecido pela United States Biochemical Corporation, usando os protocolos recomendados pelo fabricante.

NGF tem duas formas precursoras distintas, denominadas longa (que começa no local de partida A) e curta (que começa no local de partida B) que diferem pelo comprimento das suas sequências do terminal N (Darling et al., 1987, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1=427-34; Selby st al., 1987, Mol. Cell Biol. 7=3057-64; Edwards et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8=2456-64). Tanto o precursor longo como o curto podem ser cindidos proteoliticamente, produzindo a forma madura de NGF que constitui essencialmente os 120 aminoácidos do terminal carboxilo de cada precursor. 0 BDNF pode também ter formas precursores longa e

71494

6526-040-1IS

curta.

sequenciamento do gene do NGF a partir de diferentes espécies revelou que a maior parte desta sequência adicional do terminal N se encontra em exões separados excepto para 4 codões (Val-His-Ser-Val) que estão incluídos no extremo 5’ do exão que codifica todo o precursor curto (ponto de partida B). Anteriormente já demonstrámos que 2 destes 4 codões (Val-X-X-Val) bem como o local do receptor de junção de ARN que os precede, estão conservados justamente a montante do local de partida “B conservado em genes de BDNF isolados das diferentes espécies; esta descoberta leva-nos a propor a existência de ambas as formas precursoras, longa e curta, do BDNF. Há conservação .dos codões Val-X-X-Val bem como do local receptor de junção, no gene da NT-3 do rato; este local receptor de junção e a fronteira intrão proposta estão indicados na Figura 7A. Estas considerações sobre as sequências levam-nos a prever a existência de exões de codificação a montante para o gene da NT-3, que codificaria uma forma precursora longa. A descoberta das sequências conservadas a montante do suposto local de inicio A da NT-3 reforça ainda mais a nossa previsão da existência de um precursor longo de BDNF e sugere um papel importante, conservado sob o ponto de vista de evolução, deste precursor longo para todos os membros da família NGF. 0 terminal N previsto da NT-3 madura segue uma sequência canónica de cisão da protease (Arg-Arg-Lys-Arg), muito semelhante às verificadas no NGF e BDNF (Fig. 7A,C). Nalgumas espécies, os dois aminoácidos do terminal C do NGF são também removidos proteoliticamente. Ao contrário do NGF, a NT-3 do rato não possui um local óbvio de cisão potencial no seu terminal C (Figura 7A,C) e inferimos que, tal como no BDNF em todas as espécies examinadas até agora, não há modificações proteolíticas no terminal C da NT-3.

Com base nestas considerações, o tamanho previsto do polipéptido da NT-3 madura é de 119 aminoácidos com um pi estimado em cerca de 9,5. Assim, em tamanho e em carga, a NT-3 assemelha-se muito ao NGF e BDNF. Os sete aminoácidos do terminal

N da NT-3 madura diferem completamente do NGF e do BDNF, Partindo

71494

6526-040-118

do oitavo aminoácido da NT-3 madura, o alinhamento óptimo requeria uma simples falha de 2 aminoácidos em relação ao BDNF e uma só inserção de um aminoácido em relação ao NGF (Fig, 7D). A NT-3 madura do rato mostra uma homologia de 57¾ de aminoácidos com o NGF do rato e uma homologia de 58¾ de aminoácidos em BDNF do rato; 57 dos 120 resíduos (48¾) são por todas as três proteínas (Fig, 2D). Os seis resíduos de cistéína encontrados no NGF e no BDNF estão absolutamente conservado na NT-3 e as regiões de maior homologia entre as três proteínas estão agrupadas principalmente à volta destes resíduos de cisteína.

relação ao partilhados

7.2,3. ANÁLISE DE PRECURSORES DA NEURQTRQFINA-3

Logo a montante do pressuposto local de cisão que liberta a NT-3 madura, está um local receptor universal de glicosilação (Asn-X-Thr/Ser, ver Fig. 7A,C) que também foi encontrado na mesma posição no NGF e BDNF (Ullrich et al., 1983, Nature 303:821-5; Leibrock et al., 1989, Nature 341:149-52), Permanece desconhecido ss este local de glicosilação desempenha um papel no processamento dos precursores da NT-3, NGF ou BDNF.

Nova comparação da sequência da NT-3 com os precursores de NGF e BDNF revela duas regiões de homologia de aminoácidos a montante da sequência da NT-3 madura (regiões I e II na Fig, 7B,C). A região de homologia I leva-nos a prever a existência para a NT-3 do rato de um local de começo B (definido para o NGF acima) que produziria um precursor curto de 258 aminoácidos, de tamanho semelhante ao dos precursores curtos do NGF (241 aminoácidos) e do SDNF (249 aminoácidos). 0 códão de iniciação aparente metionina, a sequência de sinal secretor e o local de cisão da sequência de sinal dos precursores curtos de todos os 3 factores estão conservados (Fig, 7C). Como a região de homologia I se estende a montante do local de começo 8, previmos também a existência de um precursor longo da NT-3 que se iniciaria a partir do local de começo A (ver Fig. 7A,B,C). Como ss tem visto para o NGF (Ullrich et al., 1983, Nature 303:821-5; Selby et al., 1987, Nol. Cell Biol, 7=3057-64) e proposto para o BDNF, tal local de começo estará presumivelmente codificado sobre

71494

6526-040-118

-57exoes adicionais a montante do único exão que codifica todo o precursor curto.

Além das regiões I e II de hornologia de aminoácidos, a comparação de gráficos de hidrofilicidade da NT-3, NGF e BDNF revela uma semelhança de estrutura dos precursores, a montante dos produtos maduros.

7.2=4. A NEUR0TR0FINA-3 POSSUI ACTIVIDADE NEUROTRÓFICA

A chocante hornologia entre a NT-3, NGF e BDNF sugere fortemente que a NT-3 deve possuir actividade neurotrófica. Cada um dos NGF e BDNF promove a sobrevivência de populações escolhidas de neurónios.in vivo e in vitro ,do sistema nervoso central e periférico (revisto por Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res, Rev. 12=439-64; Lindsay, 1988, em The Making of the Nervous System pp 149-65; Davies, 1988, Trends Genet. 4=139-43). Por exemplo, a administração de qualquer dos factores a embriões de aves em desenvolvimento evita a morte neuronal que ocorre naturalmente em gânglios periféricos específicos (Hoffer e Barde, 1988, Nature 331:261—2). Quando adicionados a gânglios de explantes, o NGF e o BDNF induzem o desenvolvimento da neurite (Davies et al., 1986, J. Neurosci. 6=1897-904); quando adicionados a culturas de neurónios ganglionares dissociados, estes factores apoiam a sobrevivência e a diferenciaçao neuronais (Lindsay et al,, 1985, Dev. Biol, 112=319-28). Estes ensaios in vitro, utilizando vários tipos de gânglios periféricos do pinto, têm sido usados para a distinção entre as actividades neurotróficas do NGF e as do BDNF, Embora ambos os factores actuem sobre as populações de neurónios sensitivos encontrados nos gânglios da raiz dorsal (DRG) da cristã neural, apenas o BDNF ajuda os neurónios sensitivos o gânglio nodoso (NG) derivado do placado neural (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112=319-28). Em contraste, o NGF, mas não o BDNF, -pode apoiar a sobrevivência e crescimento dos neurónios dos gânglios simpáticos (SG) da cadeia paravertebral (Barde et al., 1982, EMBO J. 1=549-53).

A fim de determinar a actividade biológica potencial da NT-3, inserimos o gene da NT-3 do rato num vector, pCDMS (Seed,

71494

6526-040-118

1987, Nature 529:840-42), anteriormente usado para expressar transitoriamente o BDNF e o NGF em células de mamíferos. Este, construção foi planeada para expressar a forma do precursor curto da NT-3; a expressão das formas dos precursores curtos do NGF e do BDNF produziu materiais biologicamente activos (Edwards et al., 1989, Mol. Cell Biol. 8=2456-64; Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-52). As construções da NT-3, NGF. e BDNF foram transfectadas para células COS; recolheram-se os sobrenadantes das culturas e ensaiaram-se primeiro a várias concentrações quanto à sua capacidade de induzir o crescimento da neurite a partir de explantes de DRG. Tal como se esperava, o NGF e o BDNF promoveram o crescimento de -neurite neste ensaio (Fig, 8). Na primeira demonstração ds que o gene da NT-3 codifica realmente uma actividade neurotrõfica, o produto deste gene induziu um intenso crescimento de neurite, a partir dos explantes de DRG (Figura S).

Para demonstrar que a NT-3 actua directamente sobre os neurónios, ensaiámos este factor em culturas altamente enriquecidas em neurónios de DRG dissociados (Fig. 9). Na ausência virtual de células 7Schwann e de fibroblastos, a NT-3 aumentou a sobrevivência e o crescimento de neurite em aproximadamente 60¾ destes neurónios de DRG. Dado que o NGF e o BDNF, em conjunto, apoiam virtualmente 100¾ dos neurónios de DRG nas culturas (Lindsay et al., 1985, Dsv. Biol. 112=519-28) deve aceitar-se que a NT-3 apoia a sobrevivência de células que também respondem a pelo menos um dos outros dois factores,

7,2.5. A ACTIVIDADE NEUROTRÚFICA DA NT-5 É

DISTINTA DA DG NGF E BDNF

Para melhor explorar a especificidade neuronal da NT-3, ensaiámos o factor sobre explantes de NG e SG, Como se esperava, nas experiências de controlo verificou-se que o NGF induziu o crescimento de neurite a partir de explantes de SG, mas não de NG, de embriões de pinto E8, enquanto que o BDNF induziu o crescimento da neurite a partir de explantes de NG mas não de SG. É interessante notar que a NT-3 induziu o crescimento de neurite tanto dos explantes de NG como dos de SG (Fig. 8) sugerindo uma

71494

6526-040-118

-59especificidade mais ampla quer do NGF quer do BDNF. A NT-3, contudo, tal como o NGF e o BDNF, falhou na promoção da sobrevivência ou na promoção do crescimento ds neurite, de culturas do gânglio ciliar do pinto, enriquecidas com neurónios de explantes ou dissociados. Como anteriormente se indicou, os neurónios parassimpáticos que incluem o gânglio respondem ao CNTF do rato, um factor neurotrófico não relacionado com a família NGF/BDNF/NT-3 ((Manthorpe et al., 1986, Brain Res. 367=282-6); Stockli et al., 1989, Nature 342=21-28). Não se verificou qualquer resposta em nenhum destes ensaios em que se usaram sobrenadantes de células COS transfectadas com vectores de controlo (Fig, 8).

No Quadro IV mostram-se os resultados de uma experiência representativa que mede as respostas dos gânglios da raiz dorsal (DRG) dos gânglios nodosos (NG) e gânglios simpáticos paravertebrais (SG), explantados, de pinto embrionário:- de 8 dias (E8), a doses crescentes de NT-3. Os gânglios foram cultivados durante os tempos indicados como explantes em 1 ml de gel de colagénio,(como foi descrito por Lindsay e Rohrer, 1985, Dev. Biol. 112=50-48). 0 crescimento de fibras foi cotado numa escala de 0 a 5, onde 5 é o crescimento máximo de fibras observado em gânglios da raiz dorsal em resposta a uma dose saturadora do factor tíe crescimento do nervo (NGF) (1-10 ng/ml). A NT-3 do rato foi obtida, como meio condicionado, a partir de células CQS-M5 transfectadas com plasmideo pC8-rN3(Pl), como acima se descreveu como controlo usou-se meio condicionado a partir de células C0S-M5 transfectadas por simulação. Em todas as doses ensaiadas, numa zona de amplificação acima de 50 vezes, a NT-3 promoveu um crescimento de fibras detectável em todos os três tipos de gânglios explantados, ainda que a doses ^baixas as respostas tivessem sido mais fracas nos gânglios simpáticos. A resposta máxima de crescimento de fibras de gânglios da raiz dorsal, à NT-3, foi comparável às observadas com NGF ou BDNF. A resposta máxima dos gânglios nodosos à NT-3 foi maior do que a resposta máxima observada com o BDNF. (Os gânglios nodosos não mostram uma resposta de crescimento de fibras ao NGF). A resposta máxima dos gânglios simpáticos à

71494

6526-040-118

-60NT-3 foi inferior à resposta máxima destes gânglios ao NGF e foi observada a concentrações mais elevadas do que as necessárias para obter respostas máximas à NT-3 em culturas de gânglios da raiz dorsal ou dos nodosos,

QUADRO IV

A NT-3 recombinante do rato promove o crescimento de fibras de explantes de=

DRG = gânglios da raiz dorsal do embrião de pinto E8

NG = gânglios nodosos do embrião de pinto E8

SC = gânglios da cadeia simpática paravertebral do embrião do pinto E8

Sobrenadantes de células COS transfectadas por simulação, 500 u.1, de controlo

NT-3, sobrenadante de células
	COS, 10 Wl
NT-3,	sobrenadante de células COS, 50 ul
NT-3,	sobrenadante de células COS, 200 wl
NT-3,	sobrenadante de células COS, 500 wl

Pontuação do Crescimento de fibras
DRG (24h)	NG Í24h)	SC (24h)
0-0,5	0	0
2-3	2-3	0-0,5
3-4	4-5	0-0,5
5* *	2-3*	0-1
5*	0-2*	1-2

Os resultados representam a zona de pontuação do crescimento de fibras de 4 a 6 gânglios em cada caso.

* Aos níveis de supersaturação da NT-3, o crescimento de fibras é reduzido, quando determinado pelo comprimento das fibras em explantes de DRG e pelo número de fibras em explantes de NG.

7.2.6. A NEUR0TR0FINA-3 D0 RATO É ACTIVA SOBRE QS NEURÓNIOS DOS MAMÍFEROS

A fim de determinar se a NT-3 do rato apresenta actividade

494

6526-040-118

-61sobre os neurónios dos mamíferos, o ensaio de explantes foi repetido usando gânglios da raiz dorsal dissectados de embriões do rato com 14 dias (Quadro V). Usou-se como controlo o NGF purificado. Os explantes de gânglios da raiz dorsal do rato E14 (4 gânglios por 1 ml de cultura) foram cultivados durante 24 h, essencialmente como se descreveu para os gânglios do pinto (Fig. 8, Quadro IV), sem factor neurotrófico adicionado (controlo), com factor de crescimento de nervo (NGF) da glândula submaxilar do ratinho ou com NT-3 recombinante do rafo (mexo condicionado a partir de células COS-M5 transfectadas com plasmídeo pC8-rN3(Pl), como acima se descreveu). Cada gânglio teve o crescimento de fibra pontuado como se descreveu (ver Quadro IV). Os resultados mostram que, cone o NGF, a NT-3 é altamente activa na promoção do crescimento de fibras ds explantes de gânglios da raiz dorsal do rato.

QUADRO V

A NT-3 PROMOVE 0 CRESCIMENTO DE FIBRAS DE EXPLANTES DE GÂNGLIOS

DA RAIZ DORSAL DO EMBRIÃO DO RATO

Pontuação do Crescimento de Fibras

DRG do Rato E14

Controlo 0,0,0,0 NGF (ratinho, 5 ng/ml) 4,4,4,3 NT-3= 20 u„l de sobrenan- 3,3,3,4 dante de células COS da NT-3 do rato

A pontuação do crescimento de fibra (escala de 0 a 5) é dada para 4 gânglios individuais por cultura.

Embora cada um dos explantes de DRG, NG e SG, respondesse a pelo menos 2 dos 3 factores neurotróficos em causa, a resposta máxima exibida por um dado gânglio dependia do factor usado. No caso dos DRG, a resposta aos níveis safurantes de NGF, BDNF e

494

6526-040-118

NT-3 era relativarnente equivalente. Com o NG, contudo, a resposta máxima à NT-3 era superior à do.BDNF, enquanto que com SG a resposta máxima à NT-3 era substancialmente mais baixa e um tanto atrasada em relação ao NGF.

7,2.7. EXPLORANDO OS LOCAIS DE SÍNTESE DA NEUROTRQFINA-5

Tem-se verificado que, durante o desenvolvimento, a sobrevivência neuronal depende das moléculas neurotroficas do alvo. A sobrevivência contínua, mesmo no adulto, pode exigir a persistência ds uma influência neurotrófica (Thoenen et al,, 1987, Ciba Found, Symp, 126=82-95), Em outros casos a sobrevivência dos neurónios maduros pode já não depender mais de um factor neurotrófico; estes factores têm contudo mostrado afectar profundamente os fenotipos diferenciados dos neurónios (Lindsay e Harmar, 1989, Nature 557 = 362-4). A determinação dos locais de síntese de uma molécula neurotrófica pode portanto ajudar a elucidar os seus papéis fisiológicos,

Para explorar os locais de síntese da NT-3 e para comparar a expressão da NT-3 com a do NGF e BDNF, manchas Northern, em triplicado, de amostras de ARN preparadas de vários tecidos do rato adulto, foram hidridadas com sondas específicas para cada um destes genes (Figura 10). Como anteriormente se demonstrou (Heumann et al,, 1984, EMBQ 3. 3=3183-9; Shelton e Reichardt, 1984, Proc. Natl, Acad, Sei. U.S.A. 81=7951-5), a expressão do ARNm do NGF foi mais elevada no cérebro, no coração e no baço; foram detectados pelo menos níveis de vestígios em todos os outros tecidos examinados, 0 BDNF mostrou um padrão de expressão mais restrito; foram encontrados níveis mais altos no cérebro (Leibrock et al., 1989, Nature 541=149-52) e observaram-se níveis significativos no coração, pulmão ε músculos. Tal como o NGF, o transcrito da NT-3 (1,4 kb) era detectável em todos os tecidos estudados. Contudo, em todos os tecidos·periféricos examinados o nível de expressão do ARNm da NT-3 era pelo menos comparável ao observado no cérebro adulto e, nalguns casos (p, ex. rim, baço), era substancialmente mais elevado.

494

6526-040-118

-63Também comparámos a abundância relativa dos transcritos de NGF, BDNF e NT-3 nos cérebros de ratinhos recém-nascidos e adultos. Em contraste com ambos, NGF e BDNF, o nível do ARNm da NT-3 no cérebro do recém-nascido era mais elevado do que no cérebro do adulto (Fig. 8). Uma análise mais detalhada revelou que os níveis de ARNm da NT-3 no sistema nervoso central eram dramaticamente mais elevados durante o desenvolvimento fetal e que depois decresciam até aos níveis do adulto.

7.3. DISCUSSÃO

Comparações estruturais entre NGF, BDNF e o mais recente membro desta família de genes, a NT-3, fizeram realçar várias regiões conservadas e levam a sugerir que as diferenças funcionais entre estas proteínas são determinadas por sequências situadas fora destas regiões conservadas. A existência prevista de formas precursoras longas e curtas de todas estas três proteínas levanta questões intrigantes acerca da relevância de ambas as formas precursoras in vivo. As formas compridas podem processadas mais eficientemente do que as formas curtas. No entanto, os vectores que expressam as formas precursoras curtas destes factores produzem material biologicamente activo em células COS.

A nossa descoberta de que estes três factores neurotróficos apresentam padrões de expressão específicos de fase e específicos dos tecidos confirma a noção de que o desenvolvimento neural depende da expressão, distinta, temporal e espacialmente, de actividades neurotróficas discretas. 0 perfil de desenvolvimento da expressão da NT-3 sugere que este factor pode desempenhar um papel particularmente importante no início do desenvolvimento do sistema nervoso. A nossa caracterização.inicial da actividade neurotrófica in vitro, associada à prevalência generalizada do ARNm da NT-3 tanto no cérebro do adulto como nos tecidos periféricos do adulto, sugere ainda que a NT-3 pode ter uma vasta influência sobre a função e/ou sobrevivência neuronais no adulto. A expressão mais global da NT-3 também levanta a possibilidade de que este factor actue sobre células fora do sistema nervoso, tal como foi proposto para o NGF (Otten et al., 1989, Proc. Natl.

494

6526-040-118

-64Acad. Sei. U.S.A. 86:10059-10063).

Ainda que não tenha sido claramente demonstrado - que os neurónios possam responder simultaneamente a mais de um factor neurotrófico, a evidência sugere que o NGF e o BDNF podem actuar sobre populações neuronais comuns. Por exemplo, a administração quer do NGF quer do BDNF pode salvar a grande maioria de neurónios dos DRG que de outro modo morreriam durante o desenvolvimento normal das aves (Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-2). As nossas observações sobre os efeitos da NT-3 sobre os gânglios periféricos do pinto confirmam fortemente a intrigante possibilidade de que os neurónios individuais possam responder a estímulos múltiplos, afins. Se for este o caso, tanto a mediação como a relevância fisiológica da capacidade de respostas simultâneas, levantariam problemas fascinantes, Por exemplo, os componentes dos receptores e/ou os mecanismos de transdução de sinal para os três factores neurotróficos estruturalmente relacionados, poderiam ser partilhados. Em princípio, os neurónios de respostas simultâneas poderiam ter receptores múltiplos, sendo cada um específico para um determinado factor neutrófico, ou um receptor simples que pudesse mediar uma resposta a factores neurotróficos múltiplos. Estes vários factores poderiam, in vivo, ser simultaneamente apresentados a todos os neurónios responsivos. Com maior probabilidade haverá diferenças espasio-temporais na disponibilidade relativa dos factores individuais (ver p. ex. Davies et al., 1987, Nature 526:353-8). Pode mesmo ser possível que estejam disponíveis diferentes factores para os diferentes locais do mesmo neurónio (p, ex., um neurónio sensitivo pode receber factores distintos pelos seus terminais periféricos e centrais) (Kalcheim et al., 1987, Le Douarin, EMBO J. 6:2871-3). Se houver múltiplos factores disponíveis simultaneamente para alguns neurónios, as suas acções poderiam ser redundantes ou complementares.

A elucidação dos papéis individuais e potencialmente complementares do NGF, BDNF e NT-3, fornecerá informação crucial para a compreensão do desenvolvimento normal e manutenção do sistema nervoso. Estudos em animais sugeriam que o NGF pode ser

494

6526-040-118

65valioso no tratamento de estados neurológicos degenerativos (Snider e Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26=489-506; Fischer et al., 1987, Nature 329 = 65-8; Phelps et al. 1989, Neurobiol. Aging 10=205-7). A clonação de um novo membro da família de genes de NGF/BDNF e a sua interacçao potencial com outros membros da família levantam novas hipóteses sobre as aplicações terapêuticas potenciais destas proteínas nas doenças neurodegenerativas.

8- EXEMPLO= A CLONAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENE DA

NEURQTRQFINA-3 DQ HOMEM

8.1. RESULTADOS

A preparação ds uma sonda (R1B/2C) para identificar o gene da NT-3 do rato foi realizada segundo se descreveu na Secção do Exemplo 7, acima. Como ai se descreveu, a sonda foi preparada por reacção em cadeia de polimerase (PCR) a partir do ADN genõmico do rato, usando iniciadores de oligonucleotidos degenerados correspondentes a 2 das “caixas da homologia da sequência de aminoácidos partilhada pelos NGF e BDNF. A presença, no interior da sonda R1B/2C, de uma população de moléculas de ADN representando um novo gene foi assinalada inicialmente por hibridação por mancha Southern em ADN genõmico do rato, digerido com endonuclease de restrição EcoRI; a sonda detectou um novo fragmento de ADN, além dos fragmentos já esperados que se sabe corresponderem aos genes do NGF e BDNF.

Quando se usa como sonda R1B/2C, marcada com 32p₅ para analisar manchas Southern de ADN genõmico do homem digerido com várias endonucleases de restrição, como é o caso do ADN do rato, observaram-se não só zonas de hidridação correspondentes aos genes do NGF e BDNF mas também zonas novas. Por exemplo, com endonuclease de restrição HindIII, observou-se uma nova (isto é, não-NGF, não-BDNF) zona de aproximadamente 1,8 kb; com BamHI observou-se uma nova zona de 15 kb; e com EcoRI observaram-se novas zonas de 8 e 12 kb (a presença de 2 zonas poda ter resultado de um polimorfismo em locais de restrição EcoRI no ADN genõmico do homem). Estes resultados indicam que o ADN humano contém um gene da NT-3 que se encontra bem conservado entre ratos e homens,

494

6526-040-118

-660 gene da NT-3 humana foi isolado por selecção numa biblioteca genómica, como se descreveu para isolar o gene da NT-3 do rato (ver Secção de Exemplo 7). Resumidamente, uma biblioteca constituída por produtos de digestão parcial com Sau3A de ADN genómico de placenta humana, clonada no vector bacteriófago 2eM8L3/SP6/T7 (adquirido nos Clontech Laboratories, Inc.), foi seleccionada pela sonda R1B/2C e com sondas de NGF do rato e BDNF do rato» Era de esperar que o clone da NT-3 humana hidridasse com R1S/2C, mas não com NGF nem com BDNF. Foi identificado um destes clones fãgicos entre aproximadamente 8xl0⁵ placas examinadas. Estes clone, designado por <?>hN3(Gl) continha uma inserção de ADN humano de aproximadamente 16 kb. Usando métodos convencionais estabeleceu-se o mapa de restrição do clone e subclonaram-se fragmentos de restrição seleccionados, no plasmideo pBluescriptII (Stratagene) para análise de sequência do ADN. Na Figura 11 mostra-se a sequência do gene da NT-3 do homem e a sequência deduzida de aminoácidos da sua proteína, alinhada com as sequências da NT-3 do rato.

8.2. DISCUSSÃO

Os resultados da análise da sequência mostram um elevado e chocante grau de conservação nos ácidos nucleicos e na sequência de aminoácidos entre a NT-3 do rato e do homem. Na região que codifica o polipéptido maduro (119 aminoácidos), aproximadamente 92¾ dos genes do homem e do rato são homólogos na sequência do ADN. Contudo, nenhuma das diferenças da sequência de nucleótidos entre homem e rato, nesta região, conduz a substituições de aminoácidos; as sequências, deduzidas, de aminoácidos da NT-3 do homem e do rato, maduros (e da NT-3 madura do ratinho, ver Secção 6, supra) são absolutamente idênticas. Isto é reminiscente do elfevado grau de conservação do BDNF que mostra uma identidade completa na sequência de aminoácidos do polipéptido maduro entre ratos, ratinhos, homens e porcos. Em contraste, as sequências de aminoácidos dos NGF maduros do homem e dos : roedores (ratinho s rato) diferem em aproximadamente 10¾. Além disso, as sequências de aminoácidos dos supostos precursores da NT-3 do homem e do rato mostram também algumas diferenças notáveis (sublinhadas na

494

6526-040-118

-67Figura 11). t-Logo · a- · · HKmtrante.'- .·. do ponto de cisão previsto da protease, que criaria o polipéptido (Arg-Arg-Lys-Arg) da NT-3 madura, na sequência do homem falta um codão (de Pro) que está presente na sequência do rato. Um bloco de 4 aminoácidos difere entre as prepro NT-3 do rato e do homem, e seis substituições de mais aminoácidos simples estão espalhadas entre esse bloco e o local previsto de cisão da protease.

9. ACTIVIDADE BIOLÓGICA DA NT-3 HUMANA

Como a sequência deduzida de aminoácidos da NT-3 madura do homem é idêntica à da NT-3 madura do rato, é altamente provável que as proteínas da NT-3 do homem e tío rato indiquem actividades biológicas indestinguiveis. A actividade neurotrófica da NT-3 do homem foi confirmada pela inserção do gene clonado do homem no vector de expressão de plasmídeo pCDMS, transfecção do plasmídeo resultante pC8-hN3(Pl) para células C0S-M5 (descrito por Chen e Okayama, 1987, Mol. Cell, Biol. 7=2745-52) e avaliação da actividade neurotrófica em meio condicionado a partir das células transfectadas. O gene da NT3 humana foi amplificado por PCR a partir do bacteriófago óhN3(Gl) e inserindo no vector de expressão de plasmídeo pCDMS, como se descreveu para o gene da NT-3 do rato (Exemplo 7); o plasmídeo resultante foi designado por pC8-hN3(Pl). A sequência de nucleótidos de toda a inserção de NT-3 foi determinada e comparada com a sequência genómica determinada como acima se descreveu, a fim de confirmar que não ss tinham introduzido mutações durante a amplificação por PCR e durante os processos de clonação. Os processos de transfecção e avaliação foram essencialmente idênticos aos usados na avaliação da actividade biológica da NT-3 do rato,

Conforme foi previsto, verificou-se que a NT-3 do homem possui actividade neurotrófica quando avaliada em explantes de gânglios da raiz dorsal e dos gânglios nodosos do pinto embrionário de 9 dias (E9) (Quadro VI), Os gânglios foram cultivados (ver Figura 8, Quadro IV) durante 24h na presença de meio condicionado (sobrenadantes) de células C0S-M5 transfectadas por simulação ou de células C0S-M5 transfectadas com plasmídeos (todos derivados do vector de expressão pCDMS) codificadores do

494

6526-040-118

escolhido para tem actividade

BDNF recombinante humano, ou da NT-3 recombinante do rato [rNT-3; plasmideo pC8-rN3(Pl)] ou de NT-3 recombinante humano [hNT-3; plasmideo -pC8-hN3(Pl)]. 0 plasmidso do BDNF foi controlo positivo porque se sabe que o BDNF neurotrófica tanto sobre os gânglios da raiz dorsal como sobre os gânglios nodosos.' Como se mostra no Quadro VI, tanto a NT-3 recombinante do rato como, a do homem, em dose modesta (compare-se com o Quadro IV) mostram aproximadamente o mesmo nível de actividade do que o BDNF sobre gânglios da raiz dorsal e uma actividade significativamente maior do que a do BDNF sobre gânglios nodosos. Não se observaram diferenças na actividade da NT-3 do homem versus a do rato.

QUADRO VI fi NT-3 recombinante humana produzida em células COS é tão activa como a NT-3 recombinante do rato quando avaliadas em culturas de explantes de gânglios da raiz dorsal ou dos gânglios nodosos do embrião do pinto.

Pontuação do Crescimento de Fibras

Controlo

BDNF ϊ 20 wl COS sobrenadante Mock: 20 wl COS sobrenadante NT-3 humana: 20 wl COS sobrenandante

NT-3 do rato: 20 wl COS sobrenadante

DRG NG

0,0,0,0,0.5 0,0

3.3.3.3.3 1,3

0,0.5,0,0,0 0

3.2.4.3 3,3

3,4,4,3,4 3,4

A pontuação é a medida do crescimento das fibras (escala de 0 a 5) observada em 1 a 5 gânglios individuais, após 24h em cultura. Mostra-se a pontuação de cada gânglio individualmente,

10- IDENTIFICAÇÃO PO PRODUTO DE GENES DA NT-3

HUMANA POR MARCAÇÃO METABÓLICA tamanho previsto do polipéptido da NT-3 madura (do rato ou do homem) é de 119 aminoácidos, com um peso molecular de 13,6

494

6526-040-118

-69pCS-hN3(Pl) mistura de dalton, Para determinar experimentalmente o tamanho aproximado do polipéptido da NT-3 madura humana, marcaram—se metabolicamente células transfectadas com um plasmideo de expressão da NT-3 humana e o meio condicionado foi analisado quanto à presença de um novo polipéptido. Na experiência indicada na Figura 12, células COS-M5 foram transfectadas com o plasmideo (acima descrito), as células foram marcadas com uma [³^S]metionina e [³⁵S]cisteina, recolheu-se o meio de crescimento e fraccionou-se por electroforese em condições desnaturantes sobre um gel a 15% de poliacrilamida, as proteínas foram transferidas para um filtro de membrana (essencialmente como se descreveu em Towbin et al., 1979, Proc, Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:4350-4354) e os polipéptidos marcados foram detectados por auto-radiografia. Usaram-se como controlo células transfectadas por simulação (pista marcada simulação“). Como se mostra na Figura 12, o plasmideo de expressão pC8-hN3(Pl) orientou a síntese de um só polipéptido de aproximadamente 14 kDa (marcada NT-3 na figura) que não foi observado no controlo. Dentro dos limites de resolução da técnica, isto concorda bem com o tamanho previsto da NT-3 madura.

11. EXEMPLO: A NEUROTROFINA-3 APOIA A SOBREVIVÊNCIA

PE NEURÓNIOS DOPAMINÉRGICQS DE CULTURA, DO

MESENCÉFALO VENTRAL DO RATO EMBRIOiWIQ Estabeleceram-se culturas de mesencéfalo ventral de embrião de rato E14 como se descreveu no pedido de patente U.S. de série N2. 07/400 591, depositado' em 30 de Agosto de 1989 aqui incorporado na totalidade apenas para referência. Foram semeadas culturas a uma densidade de 50 000 células/cm² (Fig. .13) ou 100 000 células/cm² (Fig. 14) e desenvolveram-se na ausência de controlo por factor neurotrófico ou na presença de quantidades crescentes de sobrenadante de células COS contendo neurotrofina-3 (NT-3) recombinante humana. Após 8 dias em cultura, as células foram fixadas e manchadas com um anticorpo monoclonal contra a hidroxilase da tirosina (TH), um marcador de neurónios dopaminérgicos. Como se mostra nas Figuras 13 e 14, verificou-se que quantidades crescentes de NT-3 aumentavam o número de células

494

6526-040-118

positivas à TH que sobreviviam após 8 dias, com um aumento máximo de 2,5 vezes sobre os valores de controlo com uma diluição de 1=25 de sobrenadante de células COS da NT-3. 0 factor, purificado, de crescimento de nervos pareceu não ter qualquer efeito mas os efeitos da NT-3 foram semelhantes aos observados com o BDNF.

12. EXEMPLO= NT-5, BDNF E NGF NQ DESENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO DO RATO = PADRÕES DE EXPRESSÃO PARALELOS E

TAMBÉM RECÍPROCOS

12.1. PROCESSOS

12.1.1. MATERIAIS E DISSECÇÕES Em todas as dissecções foram usados ratos Sprague-Dawley, obtidos de Harlan Sprague Dawley... Inc.. As dissecções do cérebro adulto foram orientadas pelas referências convencionais gerais anatómicas. Amostras do córtex incluiam porções de neocortex e dorsais do córtex olfactivo. As amostras do’ diencéfalo foram tomadas usando a stria medullarís e o quiasma óptico como limites dorsal e ventral, respectivamente. As amostras do mesencéfalo foram tomadas ao nível dos colliculi superior e inferior, dorsalmente e estendidas até à superfície ventral do cérebro até ao extremo mais à face da ponte. As amostras da parte posterior do cérebro (hindbrain) não tinham cerebelo mas incluiam ponte e medula. Note-se que apenas foram amostradas as porções do rostro do striatum para evitar contaminação com tecido talâmico. As amostras do hipocampo foram colhidas desde o nível da fímbria/fornix até aproximadamente ao polo caudal. As dissecções de cérebros de recém-nascidos utilizaram os mesmos limites com excepção da stria medullarís. Ratos de gravidez regulada foram usados para obter tecidos embrionários., com o dia de esperma positivo designado por dia El; o dia de nascimento era designado por PO. Os ratos adultos pesavam em média 150-275 g (6 a 8 semanas de idade).

12.1.2» PREPARAÇÃO DE ARN E MANCHAS NORTHERN

Tecidos escolhidos foram dissectados de ratos Sprague-Dawley e imediatamente congelados em azoto liquido. Os ARNs foram isolados por homogeneização de tecidos em LiCl 3M/Ureia 6M como

494

6526-040-118

-71está descrita (Bothwell et al., 1990, em Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Jones and Bartlett, Boston, MA), Os ARNs (10 p.g) foram fraccionados por electroforese por geles a 1¾ agaros©/formaldeído, em quadruplicado (Bothwell et al., supra) seguida de transferência capilar para membranas de nylon (MagnaGraph, Micron Separations, Inc.) com 10X Standard saline citrate (SSC), pH 7. Os ARNs foram reticulados por UV nas membranas por exposição à luz ultra-violeta (STRATALINKER(R), Stratagene, Inc.) e hidridados a 68°C com sondas radio-marcadas na presença de NaP04 0,5 M (pH 7), albumina de soro bovino a 1¾ (fracção V, Sigma, Inc.), 1% SDS, EDTA 1 mM (Mahmoudi e LIn, 1989, Biotechniques 7=31-33) e 100 ug/ml de ADN de esperma de salmão, desnaturado, tratado por ultra-sons. Lavaram-se os filtros a 68°C com 2X SSC, 0,1¾ SDS e submeteram-se a auto-radiografia durante 1 dia a 2 semanas com 1 a 2 filtros intensificadores (CRGNEX(^), DuPont) e filme de raios X (XAR-5, Kodak) a -70°C. A mancha pelo brometo de etídio dos geles em quadruplicado demonstrou que foram avaliados para as diferentes amostras níveis equivalentes de ARN total (como em Maisonpierre et al., 1990, Science 247=1446-1451); isto foi confirmado sondando várias manchas usando uma sonda específica para o ARNr 28S,

12.1.3. PREPARAÇÃO DE SONDAS DA NT-3, BDNF, NGF E NGFR A clonação molecular das regiões codificadoras da NT-3, BDNF e NGF, do rato, no vector de expressão pCDMS (Aruffo e Seed, 1987, Proc. Natl, Acad. Sei, USA 84=8573-8577) já foi descrita anteriormente (Maisonpierre et al., supra), As inserções Xhol de 800 pares de base (bp) destes plasmídeos foram separadas em geles de acrilamida e recuperadas por electro-eluição (Bothwell et al., 1990) e depois marcadas com ³²P por marcação aleatória de hexâmeros (Bothwell et al., supra); a hibridação de cada uma destas sondas com transcritos de síntese de NGF, NT-3 e BDNF (ver abaixo) demonstrou que a sonda específica para uma neurotrofina não hibridava com transcritos das neurotrofinas aparentadas. A sonda do NGFR do rato era um fragmento de ADNcNcol de 1,6 kb que abarca a região codificadora da proteína do NGFR do rato (Radeke

494

6526-040-118

et al., 1987, Nature 325=593-597).

12.1.4. PRODUÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE TRANSCRITOS DE SÍNTESE 0 promotor fágico T7 presente nas construções de expressão pCDMS/neurotrofina acima descritas foi usado para produzir transcritos de ARN de síntese, correspondentes âs orientações do sentido das regiões codificadoras da NT-3, BDNF e NGF. A quantidade destes transcritos de síntese foi primeiro determinada por espectrofotometria. Os transcritos foram depois avaliados usando uma sonda de oligonucleótido 30-mero de extremidade marcada (Bothwell et al., supra) que hibridava com o extremo 5’ comum (έ jusante'· ; do promotor T7) aos três transcritos, A pesquisa densitométrica (Séries 300 Computing Densitometer, Molecular Dynamics, Inc.) de transcritos de síntese, por mancha de pingo e Northern, hibridados cora a sonda de oligonucleõtidos (hibridaçao e lavagem realizada a 55°C; no resto, como acima se descreveu) confirmou que estavam a ser usados níveis equivalentes de transcritos de síntese como os padrões definidos (resultados representativos indicados na Figura ISA).

12.1.5. QUANTIFICAÇÃO DENSITOMÉTRICA DOS NÍVEIS

TRANSCRITOS DE NEUROTROFINA

Os níveis de transcrição nas várias amostras foram normalizados em relação à amostra de cérebro de rato adulto (ver acima) do modo seguinte. Alíquotas equivalentes de amostra de ARN do cérebro adulto foram incluídas em todas as- manchas Northern. Usou-se uma pesquisa densitométrica das várias exposições auto-radiográfiças de· cada mancha Northern para determinar as intensidades de sinal de cada amostra ensaiada. Para cada exposição pesquisada avaliaram-se as intensidades de sinal de cada amostra. Para cada exposição pesquisada, as intensidades de sinal de cada amostra foram divididas pelo valor obtido para a intensidade de sinal na amostra do cérebro adulto nessa exposição, o que normalizou todos os valores em relação às amostras padronizadas do -cérebro- adulto.. Na Figura 18, os níveis de transcritos em diferentes amostras foram dispostos em relação aos níveis na amostra do cérebro adulto, estando o nível do cérebro adulto arbitrariamente estabelecido como 1,0, Tendo determinado

494

6526-040-118

os femtogramas de transcritos de neurotrofina por micrograma de ARN total na amostra do cérebro adulto, pudémos determinar os níveis reais de transcritos (em fg/pg) em amostras normalizadas em relação à amostra de cérebro adulto.

12.2. RESULTADOS

12.2.1. QUANTIFICAÇÃO E COMPARAÇÃO DOS NÍVEIS PE ARNm DA NT-3, BDNF E NGF NO CÉREBRO DO RATO ADULTO

Utilizámos o sistema de avaliação por mancha Northern para quantificar e comparar a expressão de transcrito da NT-3, BDNF e NGF em várias amostras derivadas de tecidos. A quantidade de cada transcrito de neurotrofina nas diferentes amostras foi quantificada em relação a padrões de síntese definidos. Transcritos de síntese de ARN da NT-3, BDNF e NGF, cujas quantidades foram determinadas precisamente (ver Figura 15A e legenda), foram incluídos em manchas Northern contendo também 10 pg de ARN total isolado de cérebros de ratos adultos. As manchas foram hibridadas com sondas radio-marcadas específicas para cada neurotrofina e depois submetidas a auto-radiografia (Fig. 15B). Usou-se então a pesquisa densitométrica para comparar as intensidades de sinal de hibridaçâo obtidas da amostra de cérebro adulto e dos padrões de síntese. Esta quantificação revelou que existiam níveis de ARNm aproximadamente iguais (estimados em 40 fg de transcritos de NT-3, 45 fg de transcritos de BDNF e 30 fg de transcritos de NGF, por pg de ARN total) para todas as três neurotrofinas do cérebro do rato adulto. Uma alíquota desta amostra padronizada de cérebro adulto foi incluída em todas as manchas Northern seguintes, permitindo assim a quantificação dos níveis de expressão da neurotrofina em novas amostras de ARN por comparação (ver abaixo), Para ajudar a comparação visual dos três transcritos de neurotrofina entre diferentes amostras, escolheram-se as exposições indicadas nas figuras seguintes, de modo a que as intensidades de sinal na amostra padronizada do cérebro do adulto fossem semelhantes em todas as três neurotrofinas, normalizando portanto os sinais de outras amostras de tecido em relação ao padrão definido.

494

6526-040-118

12.2.2 A EXPRESSÃO DOS GENES DA NT-3, BDNF E NGF REVELAM CARACTERÍSTICAS DE DESENVOLVIMENTO NÃO SÓ COMUNS COMO ÚNICAS exame da expressão dos genes das neurotrofinas em embriões de ratos revelou que todas as três neurotrofinas revelam um aumento dramático nos seus níveis de expressão entre os dias embrionários H ® 12 (E11-E12) (Fig, 16A); todos os transcritos das três neurotrofinas encontram-se largamente distribuídos por todo o embrião E12 e E13. A altura dessa ajustada subida na expressão dos genes da neurotrofina coincide com o período em que a neurogénese (tanto periférica como central) começa resolutamente e com a elaboração inicial de axonios .'por estes neuronios recentemente formados (p. ex. ftltman e Bayer, 1982, Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. Vol. 74; Altmán e Bayer, 1984, ibid, Vol. 85).

Apesar deste estabelecimento coordenado da expressão dos genes da neurotrofina durante a embriogénese, a comparação com a amostra padronizada de cérebro de adulto revela que o ARNm da NT-3 é de longe a mais abundante nos embriões mais novos (180 fg/ug de ARN total), enquanto que o ARNm do BDNF é pelo menos abundante (5-10 fg/ug de ARN total) e o ARNm do NGF está presente em níveis intermédios (30 fg/wg de ARN total) (Fig. 6A). A NT-3 e o BDNF continuam a mostrar uma relação recíproca quando se acompanham os níveis de expressão no cérebro em desenvolvimento (Fig. 16B) ou no coração densamente inervado (Fig. 16C) inicialmente a expressão elevada da NT-3 decresce enquanto que inicialmente a baixa expressão do BDNF aumenta até finalmente se atingirem níveis semelhantes no adulto; em contraste, a expressão do NGF mantém-se bastante constante, é interessante notar que a expressão da NT-3 aumenta durante o desenvolvimento do fígado e do timo, órgãos que não são densamente inervados e que não expressam ARNm de BDNF detectável (Fig. 16C).

A expressão emòrionaria do transcrito de NGFR aparentemente precede o aumento de expressão dos'genes da neurotrofina, ê surpreendentemente elevada na medula espinal quando está no começo, e decresce durante o desenvolvimento pré-natal do cérebro e no desenvolvimento post-natal do coração (Fig. 16A,B,C).

494

6526-040-118

12.2.3. COMPARAÇÃO DA EXPRESSÃO DA NT-3. BDNF, NFG E

NGFR NO SISTEMA NERVOSO DO RECÉM-NASCIDO E DO ADULTO

-75Para definir a distribuição espacial da expressão dos genes da nsurotrofina no sistema nervoso do rato e para compreender como é que os perfis distintos de desenvolvimento no cérebro inteiro se relacionam com as alterações de desenvolvimento 'em regiões discretas do cérebro, examinámos a expressão dos genes da neurotrofina nos cérebros dos recém-nascidos e dos adultos. Todos os três factores mostraram diferenças discretas espaciais e temporais nos seus padrões de expressão (Fig. 17). A quantificação dos níveis transcritos, incluindo os dos tecidos periféricos, está indicada ém forma gráfica na Figura 4. A maior semelhança partilhada por todos os três factores é o seu nivel uniformemente elevado de expressão no hipocampo do adulto. Em contraste com a situação nos tecidos periféricos do adulto onde as expressões da NT-3 e do NGF são mais semelhantes nas suas vastas distribuições (Maisonpierre et al., supra), a NT-3 e o BDNF mostram paralelismo óbvio nos seus padrões de expressão global no cérebro do adulto (Figura 17B,18B); é interessante notar que ambos os factores estejam chocantemente ausentes do striatum. Contudo, a NT-3 e o BDNF mostram também as mais interessantes e aparentemente recíprocas, diferenças quando a expressão é comparada entre cérebros de recém-nascidos e de adultos (Fig. 17A,8 e Fig. 18A,B). A expressão da NT-3 no recém-nascido é a mais alta e bastante mais alta do que no adulto, em regiões mais imaturas do cérebro (isto é, cerebelo, hipocampo e neocortex). A expressão do BDNF é a mais baixa nestas regiões e a mais alta, e semelhante à dos níveis dos adultos, em regiões mais caudais do cérebro que amadurecem mais cedo (isto é, a parte posterior do cérebro, o mesencéfalo e o diencéfalo), Como no cérebro do adulto, os transcritos da NT-3 e do BDNF não são detectáveis no striatum do recém-nascido.

Comparados com os da NT-3 e BDNF, os níveis de ARNm do NGF mostram diferenças menos dramáticas na comparação do cérebro do recém-nascido versus adulto (Fig. 17,18); os níveis de NGF do bolbo olfactivo são mais elevados no recém-nascido enquanto que

494

6526-040-118

-76os níveis de NGF no hipocampo e neocortex são mais elevados no adulto. Os níveis de ARNm da NGFR foram geralmente mais elevados no cérebro do recém-nascido em oposição aos do adulto, com níveis excepcionalmente elevados no cerebelo e na parte posterior do cérebro do recém-nascido (Figura 17A,B),

12.2,4. EXAME DA EXPRESSÃO DA NT-5, NGF E BDNF DURANTE 0 DESENVOLVIMENTO DE REGIÕES DISCRETAS DO SNC

Para melhor estudar a noção de que a NT-3 é expressa notavelmente mais cedo no desenvolvimento de regiões particulares do SNC, enquanto que o BDNF se expressa predominantemente mais tarde no desenvolvimento das mesmas regiões, analisámos a expressão dos genes da neurotrofina durante o desenvolvimento de três regiões do SNC cujas maturações seguem precursos muito diferentes no tempo, ft neurogénese, seguida rapidamente por um período de morte natural de células, começa muito cedo na espinal medula (E12-E13) e completa-se alguns dias antes do nascimento (Altman e Bayer, 1984, supra), Em contraste, a maioria dos neurónios no cerebelo s no hipocampo (responsáveis pelas suas populações de células granulares)· aparecem após o nascimento (p. ex. Altman, 1966, J. Comp. Neur. 128=431-474; Schlessinger et al., 1975, J. Comp. Neurol. 159=149-176). No cerebelo em fase última de desenvolvimento hã intensa neurogénese, migração de neuroblastos e diferenciação neuronal durante as primeiras três semanas de vida (ρ. ex, Altman, 1966, supra). Tem sido afirmado que os níveis de ARNm do NGF no hipocampo não se fornam facilmente detectáveis até cerca de 2 semanas após nascimento (Large et al., 1986, Science 234=352-355); este aumento ocorre muito depois do estabelecimento peri-natal de intensa proliferação de células granulares (p. ex. Altman, 1966, supra) e de invasão de fibras dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal (Koh e Loy, 1989, J. Neurosci. 9=2999-3018) mas coincide com posterior diferenciação colinérgica destes neurónios (Large et al., supra).

nosso exame ã medula espinal em desenvolvimento (Fig. 5A,E) revela níveis elevados de expressão da NT-3 em E12-E13 (150-280 fg/ng ARN total) que decresce no nascimento e que são

494

6526-040-118

-77quase indetectáveis no adulto. 0 ARNm -do BDNF que mal é detectado em E12-E13, tem um pico no nascimento (10-20 fg/ng ARN total) e depois decresce no adulto. 0 ARNm'do NGF está expresso nos mais altos níveis na medula espinal E12-E13 (15-25 fg/pg ARN total) mas a níveis 10X menores do que os níveis de ARNm na NT-3 na mesma fase. É interessante notar que o NGFR está expresso nos mais altos níveis na medula espinal em desenvolvimento; esta expressão foi já correlacionada com o período de morte natural de células de neurónios motores recentemente formados na medula espinal em desenvolvimento (Ernfors et al., 1989, Neuron 2=1605-1613).

No cerebelo em desenvolvimento avançado (Fig. 19B,F) persistem níveis notavelmente elevados de ARNm da NT-3 (500-820 fg/wg ARN total) ao longo das primeiras três semanas após nascimento, enquanto que a expressão do BDNF começa a aumentar apenas mais tarde neste período; níveis muito baixos de expressão do NGF são detectáveis apenas nas primeiras fases do desenvolvimento do cerebelo. 0 JNG.ER está expresso em níveis elevados no começo do desenvolvimento do cerebelo e depois decresce, antes do observado decréscimo de expressão da NT-3.

No hipocampo (Fig. 19C,G) os níveis de ARNm tanto do BDNF como do NGF aumentam desde níveis baixos em E17 até níveis intermédios na altura do nascimento e alcançam os níveis mais elevados no adulto. Ainda que os transcritos de todas as três neurotrofinas estejam expressos em níveis semelhantes no hipocampo adulto, a expressão da NT-3 é notavelmente mais elevada do que do a do BDNF e NGF no E17 e no hipocampo/recém-nascido; os níveis de expressão da NT-3 no hipocampo do recém-nascido são tão elevados como os observados no cerebelo peri-natal (820 fg/wg ARN total). Em contraste com as neurotrofinas, a expressão do NGFR decresce durante o desenvolvimento do hipocampo.

Em todas as três regiões do SNC acima examinadas, a expressão da NT-3 é notavelmente elevada durante o seu desenvolvimento e depois decresce até aos níveis do adulto, enquanto que do os níveis /ARNm do BDNF são inicialmente baixos, aumentam até

494

6526-040-118

alcançar níveis no adulto semelhantes aos da NT-3. Em contraste com os perfis recíprocos da NT-3 e BDNF, a expressão do NGF não apresenta nenhum padrão consistente; é de preferência expresso (ainda que a baixos níveis) no começo do desenvolvimento da medula espinal e do cerebelo, mas só mais tarde no desenvolvimento do hipocampo.

12,3. DISCUSSÃO

A nossa análise revelou tanto semelhanças como diferenças entre as distribuições espsçio-temporais dos transcritos das três neurotrofinas. Todos òs transcritos da NT-3, BDNF e NGF apresentam um aumento simultâneo na sua expressão entre o décimo primeiro e o décimo segundo dia de embriogénese do rato, e estão largamente distribuídos .nos embriões de 12 e 13 dias. .A altura deste irrompimento comum da expressão coincide aproximadamente com o estabelecimento do desenvolvimento da neurogénese (p. ex. ver Altman e Bayer, 1982, supra; Altman e Bayer, 1984, supra). Esta associação apoia a noção de que as três neurotrofinas desempenham, no desenvolvimento, papéis de particular importância para o sistema nervoso, e pode marcar o período em que todas as neurotrofinas primeiro se tornam geralmente necessárias para manter a sobrevivência de neurónios post-mitóticos. Contudo, o aparecimento da sua expressão poderá também ser indicadora de outros papéis das neurotrofinas no desenvolvimento do sistema nervoso (ver abaixo).

Ainda que o estabelecimento da expressão dos genes ocorra simultaneamente para as três neurotrofinas, os níveis que elas alcançam no primeiro desenvolvimento dos embriões diferem muito, 0 ARNm da NT-3 é de longe o mais abundante nos embriões, enquanto que o ARNm do BDNF se expressa nos mais baixos níveis, Este contraste entre as expressões da NT-3 e do BDNF permanece em quasé todos os casos examinados, Durante o desenvolvimento, a expressão da NT-3 é muito acentuada em regiões do SNC onde prossegue a proliferação, migração e diferenciação de neurónios e dos seus precursores e, geralmente, decresce subitamente em regiões do SNC quando estas amadurecem. Em contraste, a expressão do BDNF no recém-nascido é mais acentuada em regiões do SNC onde

494

6526-040-118

-79a neurogénese já tenha ocorrido e geralmente aumenta em regiões do SNC quando estas amadurecem. É interessante notar que os níveis que os transcritos da NT-3 e do BDNF por fim atingem em várias regiões do SNC adulto são bastante semelhantes. A relação recíproca entre -a expressão da NT-3 e a do BDNF durante o desenvolvimento, associada aos seus perfis relativamente semelhantes no SNC adulto, indica que a NT-3 e o BDNF podem, nalguns casos, actuar sobre as mesmas populações neuronais no SNC. Se assim for, os nossos resultados sugerem que a NT-3 desempenharia um papel importante no- desenvolvimento destes neurónios (talvez durante o estabelecimento da inervação dos alvos), enquanto o BDNF poderia predominantemente actuar mais tarde na vida dos mesmos neurónios (isto é, como um factor de maturação ou de manutenção). A expressão do NGF varia localmente durante o desenvolvimento mas estas variações não seguem um padrão consistente como o da NT-3 e o do BDNF. Os níveis de ARNm do NGFR não espelham especificamente a expressão de qualquer dos genes das três neurotrofinas, o que é consistente com a possibilidade de servirem como componente comum dos receptores individuais da neurotrofinas (Rodriguez-Tebar et al., 1990, Neuron 4:487-492). A expressão do NGFR tem tendência a ser muito elevada no começo do desenvolvimento das regiões do SNC e os nossos estudos revelam interessantes alterações da expressão do NGFR, reguladas pelo desenvolvimento, que são objecto de futuras investigações.

Em contraste com as suas distribuições semelhantes no SNC adulto, a NT-3 e o BDNF apresentam padrões de expressão muito diferentes nos tecidos periféricos dos adultos; a distribuição periférica mais vasta dos transcritos da NT-3 pode reflectir actividade numa zona mais larga (e diferente) da células (tanto neurais como não neurais) na periferia do que no BDNF (Maisonpierre et al., supra).

Ainda que haja considerável evidência sugerindo que tanto o NGF como o BDNF desempenham cedo um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso, a nossa análise revela uma correlação muito mais consistente e impressionante entre a expressão notavelmente alta da NT-3 e o começo do desenvolvimen71 494

6526-040-118

-80to neural. Os níveis de ARNm da NT-3 no cerebelo em desenvolvimento e no hipocampo do recém-nascido, são várias vezes mais elevados do que os níveis de qualquer das neurotrofinas em qualquer outro tecido ou região do cérebro e mais do que vinte vezes os níveis de qualquer das neurotrofinas no cérebro adulto. A descoberta da NT-3 como uma nova proteína relacionada com o NGF que pode apoiar pelo menos alguns neurónios dependentes do BDNF e do NGF (Maisonpierre et al., supra) e cuja expressão temporal muito claramente acompanha paralelamente os períodos críticos do desenvolvimento neural, levanta a possibilidade de que a NT-3 seja o agente fisiológico normalmente responsável por algumas das importantes funções no desenvolvimento anteriormente atribuídas ao BDNF ou- NGF. A re-exploração dos verdadeiros papéis no desenvolvimento, de todos os membros desta família é ainda realçada pela possibilidade de que os anticorpos destes factores aparentados possam reagir entre si (Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12=439-464),

Ainda que tenhamos anteriormente demonstrado·que a NT-3 pode actuar como uma molécula clássica de sobrevivência neuronal (Maisonpierre et al., supra). permitindo a acção da NT-3 como um factor derivado do alvo cuja limitada expressão resulta em selecção e reajustamento neuronal, isto de modo algum exclui outros papéis importantes no desenvolvimento para a, NT-3 (bem como para as outras neurotrofinas), 0 padrão de expressão da NT-3 dentro do sistema nervoso em desenvolvimento partilha semelhanças notáveis com o da nestina (uma nova proteína intermédia de filamento cuja sxpressãos característica de regiões do SNC em fase de neurogéne - Lendahl et al., 1990) e com SNAP (um marcador antigénico do início do desenvolvimento da neurite - Yamamoto et al., 1986, J, Neurosci. 6=3576-3594). Ao contrário do caso com ç, NGF (Clegg et al., 1989, Devi. Biol. 134=30-37), altos níveis de expressão da NT-3 precedem a chegada das fibras simpáticas ao coração. Assim, a NT-3 pode estar particularmente ligada a processos de desenvolvimento diferentes dos da sobrevivência neuronal, incluindo a proliferação/diferenciação de precursores neuronais e/ou a orientação de células migradoras ou dos seus

494

6526-040-118

-81axortiõs; outra sugestão de tais papéis fisiológicos potenciais da NT-3 vem da descoberta recente de que uma das neurotrofinas (isto é, NGF) pode desempenhar um papel na proliferação de precursores neuronais in vitro. De modo oposto, o BDNF ainda que presente no inicio do desenvolvimento, pode ter um papel geralmente mais importante muito depois do período inicial da morte e selecção neuronais.

Os perfis de expressão de todas as três neurotrofinas no adulto partilham uma notável semelhança= todas as três neurotrofinas estão expressas em níveis comparavelmente elevados no hipocampo adulto. A ruptura dos prolongamentos dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal até ao hipocampo tem como resultado uma atrofia e uma redução da síntese de transmissores por estes neurónios (revisto em Snider e Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26=489-506). Uma atrofia semelhante está associada a uma fraca eficácia nas tarefas específicas da memória nos ratos idosos e no homem com a doença de Alzheimer. A atrofia dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal pode ser invertida em modelos de ratos pela administração de NGF. Os resultados aqui representados são consistentes com a possibilidade do hipocampo adulto fornecer normalmente todas as três neurotrofinas ao prosencéfalo basal, sugerindo que a recente evidência das acções complementares do NGF e BDNF sobre neurónios colinérgicos de cultura, reflecte o verdadeiro papel fisiológico destas moléculas. Contudo, a expressão da NT-3 é notavelmente elevada muito cedo no desenvolvimento do hipocampo, e depois decresce até aos níveis do adulto que são semelhantes aos do NGF e BDNF. Esta expressão tão precoce sugere ainda que a NT-3 pode desempenhar um papel único na orientação ou no estabelecimento, muito cedo, de ligações a partir de aferentes do prosencéfalo basal ou outros aferentes do hipocampo, ou na proliferação dos precursores de células granulares dentadas ; níveis relativamente baixos do NGF durante o desenvolvimento do hipocampo têm atestado contra o desempenho deste papel pelo NGF (Large et al., supra),

494

6526-040-118

-8213. DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS

Em 28 de Fevereiro de 1990 foram feitos os seguintes depósitos na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn

Drive, Rockville, Maryland 20852:

NQ. de Acesso

	Estirpe	na ATCC
ADN bacteriófago	$hN3(61)	40763
ADN bacteriófago	ΦγN3(G1)	40764
plasmideo	pC8-rN3(Pl)	40766
plasmideo	pC8-hN3(Pl)	40765
0 presente invento	não tem o seu âmbito	limitado pelos

arranjos específicos aqui descritos. De facto, para os peritos na arte, tornam-se evidentes várias modificações do invento, além daquelas aqui descritas, a partir da descrição antecedente e das figuras que a acompanham. Pretende-se que tais modificações caiam dentro do âmbito das reivindicações. Várias publicações são aqui citadas, sendo o seu conteúdo aqui incorporado apenas para referência.

494

Claims (11)

1. -83REIVINDICACÕES

   1 - Processo de produção de um ácido nucleico recombinante codificando neurotrofina-3, caracterizado por compreender: a propagação de uma célula compreendendo um ácido nucleico recombinante codificando a proteína neurotrofina-3 tendo a sequência:

   Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr,

   de tal modo que o ácido nucleico é replicado.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido nucleico recombinante compreender uma sequência de ADNc.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência de ADNc ser seleccionada de entre o grupo consistindo na sequência de ADNc da neurotrof ina-3 de murino que se segue:

   (segue sequência)

   71 494

   6526-040-118

   -84*** Pro Arg Leu Phe Gin Ser Asp Ile Asn Thr Cys Vai Ser Phe Phe Gin

   AGGTGGCTGA TTCCATAA TGA CCC AGA CTC TTC CAG TCA GAT ATT AAC ACT TGT GTT TCC TTC TTT CAG (B) /L

   -139

   130

   Ile ATC Leu TTA Gin CAG Vai GTG Asn AAC Lys AAG Vai GTG Met ATG Ser TCC Ile ATC Leu TTG Phe TTT Tyr TAT Vai GTG Ile ATA Phe TTT Leu CTT Ala GCT Tyr TAT Leu CTC Arg CGT 120 110 Gly Ile Gin Gly Asn Asn Het Asp Gin Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile 133 GGC ATC CAA GGC AAC AAC ATG GAT CAA AGG AGT TTG CCA GAA GAC TCT CTC AAT TCC CTC ATT ATC -100 -90 Lys Leu Ile Gin Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gin Met Vai Asp Vai Lys Glu AAG TTG ATC CAG GCG CAT ATC TTG AAA AAC AAG CTC TCC AAG CAG ATG GTA GAT GTT AAG GAA -80 -70 -60 Asn Tyr Gin Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Gin Gly Glu Ala Thr Arg 262 AAT TAC CAG AGC ACC CTG CCC AAA GCA GAG GCA CCC AGA GAA CCA GAG CAG GGA GAG GCC ACC AGG -50 7 -40 Ser Glu Phe Gin Pro Het Ile Ala Thr Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin Arg Arg Tyr Asn TCA GAA TTC CAG CCG ATG ATT GCA ACA GAC ACA GAA CTA CTA CGG CAA CAG AGA CGC TAC AAT -30 -20 Ser Pro Arq Vai Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Het Glu Asp 391 TCA CCC CGG GTC CTG CTG AGT GAC AGC ACC CCT TTG GAG CCC CCT CCC TTA TAT CTA ATG GAA GAT -10 -1 Fl Tyr Vai Gly Asn Pro Vai Vai Thr Asn Arg Thr Ser Pro Arq Arq Lys Arq Tyr Ala Glu Hi s TAT GTG GGC AAC CCG GTG GTA ACC AAT AGA ACA TCA CCA CGG AGG AAA CGC TAT GCA GAG CAT

   Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai CYS Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser 526 AAG AGT CAC CGA GGA GAG TAC TCA GTG TGT GAC AGT GAG AGC CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCC TCA 30 40 Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro GCC ATT GAC ATT CGG GGA CAC CAG GTT ACA GTG TTG GGA GAG ATC AAA ACC GGC AAC TCT CCT 50 60 Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg CYS Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly CYS Arg Gly 649 GTG AAA CAA TAT TTT TAT GAA ACG AGG TGT AAA GAA GCC AGG CCA GTC AAA AAC GGT TCC AGG GGG 70 80 90 Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin CYS Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr ATT GAT GAC AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACG TCG CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT 100 110 Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser CYS Vai CYS Ala Leu 778 TCA GAA AAC AAC AAA CTC GTA GGC TGG CGC TGG ATA CGA ATA GAC ACT TCC TGT GTG TGT GCC TTG

   119

   Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr ***

   TCA AGA AAA ATC GGA AGA ACA TGA ATT GGCATCTGTC CCCACATATA AATTATTACT TTAAATTATA

   911 TGATATGCAT GTAGCATATA AATGTTTATA TTGTTTTTAT ATATTATAAG TTGACCTTTA TTTATTAAAC TTCAGCAACC CTTACAGTAT ATAAGCTTTT TTTTCTCAAT AAAATTCGTG TGCTTGCCTT CGCTCAGGCC TCTCCCATCT

   1061 GTTAACCTTG TTTTGTGATT GGGCTCTCGG GAACCTTCTG TAAAACCTGT GTACACCAGT ATTTGGCATT CAGTATTGTC

   AA

   71 494

   6526-040-118 na sequência de ADNc da neurotrofina-3 de ratazana que se segue:

   GGAAACCCCG CCCGCTATAA ATAACAGGGA GGAGTTTACC 40 TCATTTGTTA GACTGGTGGT ACCCTCTCCT CACTCTCAGA TTGTCAGCCT CGGTGGCTGA TGCCAGAATG 110 ACAGGGGCTC TTCCGGCCAG CTGTTAACAC CTGTGTTTCC TTTTTTCAGA TCTTACAGGT GAACAAGGTG 180 1 10 20

   Het Ser Ile Leu Phe Tyr Vai Ile Phe Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Ile Gin Gly Asn Ser ATG TCC ATC TTG TTT TAT GTG ATA TTT CTT GCT TAT CTC CGT GGC ATC CAA GGC AAC AGC 240 Het Asp Gin Arq Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Lys Leu Ile Gin ATG GAT CAA AGG AGT TTG CCG GAA GAC TCT CTC AAT TCC CTC ATC ATC AAG CTG ATC CAG 300 50 60 Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gin Het Vai Asp Vai Lys Glu Asn Tyr Gin GCG GAT ATC TTG AAA AAC AAG CTT TCC AAA CAG ATG GTG GAT GTT AAG GAA AAT TAC CAG 360 70 80 Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro Arg Glu Pro Glu Gin Gly Glu Ala Thr Arg Ser AGC ACC CTG CCC AAA GCA GAG GCA CCC AGG GAA CCA GAG CAG GGA GAG GCC ACC AGG TCA 420 90 100 Glu Phe Gin Pro Het Ile Ala Thr Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin Arg Arg Tyr Asn GAG TTC CAG CCA ATG ATT GCA ACG GAC ACA GAG CTA CTA CGG CAA CAG AGA CGC TAC AAT 480 110 120 Ser Pro Arq Vai Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu Tyr Leu Het TCG CCC CGG GTC CTG CTG AGT GAC AGC ACC CCT TTG GAG CCC CCT CCC TTA TAC CTA ATG 540 130 140 Glu Asp Tyr Vai Gly Asn Pro Vai Vai Ala Asn Arq Thr Ser Pro Arg Arg Lys Arg Tyr GAG GAT TAT GTG GGC AAC CCG GTG GTA GCC AAT AGA ACC TCA CCA CGG AGG AAA CGC TAT 600 150 160 Ala Glu His Lys Ser His Arq Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai GCA GAA CAT AAG AGT CAC CGA GGA GAG TAC TCA GTG TGT GAC AGT GAG AGC CTG TGG GTG 660 170 180 Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile ACC GAC AAG TCC TCA GCC ATT GAC ATT CGG GGA CAC CAG GTC ACA GTG CTG GGG GAG ATC 720 190 200 Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg AAA ACC GGT AAC TCT CCT GTG AAA CAA TAT TTT TAT GAA ACG AGA TGT AAA GAA GCC AGG 780 210 220 Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arq Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr CCG GTC AAA AAC GGT TGC AGG GGG ATT GAT GAC AAA CAC TGG AAC TCT CAG TGC AAA ACT 840 230 240 Ser Gin Thr Tyr Vai Arq Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arq Tm TCG CAA ACC TAT GTC CGA GCA CTG ACT TCA GAA AAC AAC AAA CTC GTA GGC TGG CGC TGG 900 Ile Arq Ile Asp Thr Ser cys Vai cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr End ATA CGA ATA GAC ACT TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCG AGA AAA ATT GGA AGA ACA TGA ATT 960

   GGCATCTGTC CCCACATATA AATTATTACT TTAAATTATA TGATATGCAT GTAGCATATA AATGTTTATA 1030 TTGTTTTTAT ATATTATAAG TTGACCTTTA TTTATTAAAC TTCAGCAACC CTTACAGTAT ATAAGCTTTT 1100 TTCTCAATAA AATTCGTGTG CTTGCCTCCC CTCAGGCCTT TCCCATCTGT TAACCTTGTT TTGTGATTGG 1170 GCTCTCGGGA ACCCTTCTGT AAAACCTGTG TACACCAGTA TTTGGCATTC AGTATTGTCA AGGCCATGAC 1240 TGTGGTTTCA GTAAACTTTC TTAAAATCGG ATGAGTCAGA GTTG 1284

   71 494

   6526-040-118 e na sequência de ADNc da neurotrofina-3 de ser humano que se segue:

   9 1142 I r/HT-3 I R 33 1057 I h/NT-3 | H

   10 * GA CT TTCCATAA AAGGTATT 20 * TGA ACT End CCC GGG Pro AGA TCT Arg 30 ★ CTC GAG Leu TTC AAG Phe CAG GTC Gin 40 ★ TCA GAT AGT CTA Ser Asp ATT AAC TAA TTG Ile Asn 50 * ACT TGA Thr TGT ACA Cys GTT CAA Val> 40 50 60 70 80 * ft ★ A * TGCCAGAA TAA CAC AGA CTC AGC TGC CAG AGC CTG CTC TTA ACA CCT GTG ACGGTCTT ATT GTG TCT GAG TCG ACG GTC TCG GAC GAG AAT TGT GGA CAC End His Arg Leu Ser Cys Gin Ser Leu Leu Leu Thr Pro Val>

   60 ★ TCC AGG Ser TTC AAG Phe TTT AAA Phe 70 ★ CAG ATC GTC TAG Gin Ile TTA AAT Leu 80 ★ CAG GTG GTC CAC Gin Vai AAC TTG Asn AAG TTC Lys 90 * GTG CAC Vai ATG TCC TAC AGG Het Ser PREPRO_ 100 ft ATC TTG TAG AAC lie Leu » TTT AAA Phe> R 90 100 110 120 130 * * * ★ * TTT CCT TTT CAG ATC TTA CAG GTG AAC AAG GTG ATG TCC ATC TTG TTT H AAA GGA AAA GTC TAG AAT GTC CAC TTG TTC CAC TAC AGG TAG AAC AAA Phe Pro Phe Gin Ile Leu Gin Vai Asn Lys Vai Het Ser Ile Leu Phe>

   PREPRO »

   110 120 130 140 150 fr ★ ★ * ★ TAT GTG ATA TTT CTT GCT TAT CTC CGT GGC ATC CAA GGC AAC AAC ATG ATA CAC TAT AAA GAA CGA ATA GAG GCA CCG TAG GTT CCG TTG TTG TAC Tyr Vai Ile Phe Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Ile Gin Gly Asn Asn Het> 140 150 160 170 * ★ * ★ TAT GTG ATA TTT CTC GCT TAT CTC CGT GGC ATC CAA GGT AAC AAC ATG ATA CAC TAT AAA GAG CGA ATA GAG GCA CCG TAG GTT CCA TTG TTG TAC Tyr Vai Ile Phe Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Ile Gin Gly Asn Asn Het>

   160 170 180 190 200 * * * * * GAT CAA AGG AGT TTG CCA GAA GAC TCT CTC AAT TCC CTC ATT ATC AAG CTA GTT TCC TCA AAC GGT CTT CTG AGA GAG TTA AGG GAG TAA TAG TTC Asp Gin Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Lys>

   180 *

   190 *

   200 *

   210 *

   220 *

   GAT CAA AGG AGT TTG CCA GAA GAC TCG CTC AAT TCC CTC ATT ATT AAG CTA GTT TCC TCA AAC GGT CTT CTG AGC GAG TTA AGG GAG TAA TAA TTC

   Asp Gin Arg Ser Leu Pro Glu Asp Ser Leu Asn Ser Leu Ile Ile Lys>

   71 494

   6526-040-118

   210 220 230 240

   ★ ★ ★ ★ TTG ATC CAG GCG GAT ATC TTG AAA AAC AAG CTC TCC AAG CAG ATG GTA AAC TAG GTC CGC CTA TAG AAC TTT TTG TTC GAG AGG TTC GTC TAC CAT Leu Ile Gin Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gin Met Val> 230 240 250 260 270 ★ ★ * ★ ★ CTG ATC CAG GCA GAT ATT TTG AAA AAC AAG CTC TCC AAG CAG ATG GTG GAC TAG GTC CGT CTA TAA AAC TTT TTG TTC GAG AGG TTC GTC TAC CAC Leu Ile Gin Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Leu Ser Lys Gin Met Val> 250 260 270 280 290 ★ ★ ★ ★ ★ GAT GTT AAG GAA AAT TAC CAG AGC ACC CTG CCC AAA GCA GAG GCA CCC CTA CAA TTC CTT TTA ATG GTC TCG TGG GAC GGG TTT CGT CTC CGT GGG Asp Vai Lys Glu Asn Tyr Gin Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro 280 290 300 310 320 ★ ir ★ ★ * GAC GTT AAG GAA AAT TAC CAG AGC ACC CTG CCC AAA GCT GAG GCT CCC CTG CAA TTC CTT TTA ATG GTC TCG TGG GAC GGG TTT CGA CTC CGA GGG Asp Vai Lys Glu Asn Tyr Gin Ser Thr Leu Pro Lys Ala Glu Ala Pro> 300 310 320 330 340 ★ ★ * ★ ★ AGA GAA CCA GAG CAG GGA GAG GCC ACC AGG TCA GAA TTC CAG CCG ATG TCT GTT GGT CTC GTC CCT CTC CGG TGG TCC AGT CTT AAG GTC GGC TAC Arg Glu Pro Glu Gin Gly Gly Ala Thr Arq Ser Gly Phe Gin Pro Met 330 340 350 360 370 ★ ★ ★ * ★ CGA GAG CCG GAG CAG GGA GGG CCC CGC AAG TCA GCA TTC CAG CCA GTG GCT CTC GGC CTC GTC CCT CCC GGG GCG TTC AGT CGT AAG GTC GGT CAC Arg Glu Pro G1 u Gin Gly G1 v Pro Arq Lys Ser Ala Phe Gin Pro Val>

   350 360 370 380 390 * ★ ★ ★ *·

   ATT GCA ACA GAC ACA GAA CTA CTA CGG CAA CAG AGA CGC TAC AAT TCA R

   TAA CGT TGT CTG TGT CTT GAT GAT GCC GTT GTC TCT GCG ATG TTA AGT

   Ile Ala Thr Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin Arg Arg Tyr Asn Ser>

   380 390 400 410 ir -k ir +

   ATT GCA ATG GAC ACC GAA CTG CTG CGA CAA CAG AGA CGC TAC AAC TCA H

   TAA CGT TAC CTG TGG CTT GAC GAC GCT GTT GTC TCT GCG ATG TTG AGT

   Ile Ala Met Asp Thr Glu Leu Leu Arg Gin Gin Arg Arg Tyr Asn Ser>

   71 494

   6526-040-118

   400

   410

   420

   430

   440

   * ★ ★ it ★ ccc CGG GTC CTG CTG AGT GAC AGC ACC CCT TTG GAG ccc CCT CCC TTA GGG GCC CAG GAC GAC TCA CTG TCG TGG GGA AAC CTC GGG GGA GGG AAT Pro Arg Vai Leu Leu Ser Asp Ser Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu> 420 430 440 450 460 ★ ★ ★ ★ ★ CCG CGG GTC CTG CTG AGC GAC ACG ACC CCC TTG GAG CCC CCG CCC TTG GGC GCC CAG GAC GAC TCG CTG TGC TGG GGG AAC CTC GGG GGC GGG AAC Pro Arg Vai Leu Leu Ser Asp Thr Thr Pro Leu Glu Pro Pro Pro Leu>

   450 460 470 480 ★ ★ ★ ★ TAT CTA ATG GAA GAT TAT GTG GGC AAC CCG GTG GTA ACC AAT AGA ACA ATA GAT TAC CTT CTA ATA CAC CCG TTG GGC CAC CAT TGG TTA TCT TGT Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Vai Gly Asn Pro Vai Vai Thr Asn Arg Thr> 470 480 490 500 510 ★ * A ★ * TAT CTC ATG GAG GAT TAC GTG GGC AGC CCC GTG GTG GCG AAC AGA ACA ATA GAG TAC CTC CTA ATG CAC CCG TCG GGG CAC CAC CGC TTG TCT TGT Tyr Leu Met Glu Asp Tyr Vai Gly Ser Pro Vai Vai Aja Asn Arg Thr>

   520

   490

   500

   510

   530

   k ★ ★ * ★ TCA CCA CGG AGG AAA CGC TAT GCA GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGA GAG AGT GGT GCC TCC TTT GCG ATA CGT CTC GTA TTC TCA GTG GCT CCT CTC Ser Pro Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu> » 520 530 540 550 * ★ * * TCA _ _ _ CGG CGG AAA CGG TAC GCG GAG CAT AAG AGT CAC CGA GGG GAG AGT ... GCC GCC TTT GCC ATG CGC CTC GTA TTC TCA GTG GCT CCC CTC Ser Arg Arg Lys Arg Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu> » — 540 550 560 570 580 ★ * ★ * ★ TAC TCA GTG TGT GAC AGT GAG AGC CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCC TCA ATG AGT CAC ACA CTG TCA CTC TCG GAC ACC CAC TGG CTG TTC AGG AGT Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser> 60 570 580 590 600 ★ ★ * * it TAC TCG GTA TGT GAC AGT GAG AGT CTG TGG GTG ACC GAC AAG TCA TCG ATG AGC CAT ACA CTG TCA CTC TCA GAC ACC CAC TGG CTG TTC AGT AGC

   Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser>

   71 494

   6526-040-118

   590 ★

   600 ★

   610 ★

   620 *

   630 ★

   GCC ATT GAC ATT CGG GGA CAC CAG GTT ACA GTG TTG GGA GAG ATC AAA

   CGG TAA CTG TAA GCC CCT GTG GTC CAA TGT CAC AAC CCT CTC TAG TTT

   Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys> 610 620 630 640 650 * * ★ * ★ GCC ATC GAC ATT CGG GGA CAC CAG GTC ACG GTG CTG GGG GAG ATC AAA CGG TAG CTG TAA GCC CCT GTG GTC CAG TGC CAC GAC CCC CTC TAG TTT

   Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys>

   640 650 660 670 680 * * ★ ★ *

   ACC GGC AAC TCT CCT GTG AAA CAA TAT TTT TAT GAA ACG AGG TGT AAA R

   TGG CCG TTG AGA GGA CAC TTT GTT ATA AAA ATA CTT TGC TCC ACA TTT

   Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys>

   660 670 680 690 700 ★ ★ ★ ★ ★

   ACG GGC AAC TCT CCC GTC AAA CAA TAT TTT TAT GAA ACG CGA TGT AAG TGC CCG TTG AGA GGG CAG TTT GTT ATA AAA ATA CTT TGC GCT ACA TTC Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys> 50 690 700 710 720 ★ ★ ★ ★ GAA GCC AGG CCA GTC AAA AAC GGT TGC AGG GGG ATT GAT GAC AAA CAC CTT CGG TCC GGT CAG TTT TTG CCA ACG TCC CCC TAA CTA CTG TTT GTG Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His> 710 720 730 740 750 * * ★ ★ ★ GAA GCC AGG CCG GTC AAA AAC GGT TGC AGG GGT ATT GAT GAT AAA CAC CTT CGG TCC GGC CAG TTT TTG CCA ACG TCC CCA TAA CTA CTA TTT GTG Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His>

   730 ★

   TGG

   ACC

   Trp

   TGG

   ACC

   Trp

   740 750 760 770 * * * *

   AAC TCT CAG TGC AAA ACG TCG CAA ACC TAC GTC CCA GCA CTG ACT TTG AGA GTC ACG TTT TGC AGC GTT TGG ATG CAG GCT CGT GAC TGA Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr>

   760 770 780 790 * * * *

   AAC TCT CAG TGC AAA ACA TCC CAA ACC TAC GTC CGA GCA CTG ACT TTG AGA GTC ACG TTT TGT AGG GTT TGG ATG CAG GCT CGT CAC TGA Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr>

   71 494

   6526-040-118

   -90tf

   780 790 800 810 820 ★ ★ ★ ★ ir TCA GAA AAC AAC AAA CTC GTA GGC TGG CGC TGG ATA CGA ATA GAC ACT AGT CTT TTG TTG TTT GAG CAT CCG ACC GCG ACC TAT GCT TAT CTG TGA Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr> 800 810 820 830 840 ★ * * * ★ TCA GAG AAC AAT AAA CTC GTG GGC TGG CGG TGG ATA CGG ATA GAC ACG AGT CTC TTG TTA TTT GAG CAC CCG ACC GCC ACC TAT GCC TAT CTG TGC Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile 100 Arg Ile Asp Thr> 830 840 850 860 * ★ ★ * TCC TGT GTG TGT GCC TTG TCA AGA AAA ATC GGA AGA ACA TGA R AGG ACA CAC ACA CGG AAC AGT TCT TTT TAG CCT TCT TGT ACT Ser Cys Yal cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr > 850 860 870 880 ★ ★ * * TCC TGT GTG TCT GCC TTG TCG AGA AAA ATC GGA AGA ACA TGA H AGG ACA CAC ACA CGG AAC AGC TCT TTT TAG CCT TCT TGT ACT Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr >

   119

   870 880 890 900 910 920 ******

   ATTGGCATCT GTCCCCACAT ATAAATTATT ACTTTAAATT ATATGATATG CAT R

   TAACCGTAGA CAGGGGTGTA TATTTAATAA TGAAATTTAA TATACTATAC GTA

   890 900 910 920 930 940 * * * * * *

   ATTGGCATCT CTCCCCATAT ATAAATTATT ACTTTAAATT ATATGATATG CAT H

   TAACCGTAGA GAGGGGTATA TATTTAATAA TGAAATTTAA TATACTATAC GTA

   930 940 950 960 970 980 ***** *

   GTAGCATATA AATGTTTATA TTGTTTTTAT ATATTATAAG TTGACCTTTA TTTATTAAAC R CATCGTATAT TTACAAATAT AACAAAAATA TATAATATTC AACTGGAAAT AAATAATTTG

   950 960 970 980 990 1000 ***** *

   GTAGCATATA AATGTTTATA TTGTTTTTAT ATAT-ATAAG TTGACCTTTA TTTATTAAAC H CATCGTATAT TTACAAATAT AACAAAAATA TATA-TATTC AACTGGAAAT AAATAATTTG

   990 1000 1010 * * *

   TTCAGCAACC CTTACAGTAT ATAAGCTTTT AAGTCGTTGG GAATGTCATA TATTCGAAAA

   1020 1030 1040 * * *

   TTTTCTCAAT AAAATTCGTG TGCTTGCCTT AAAAGAGTTA TTTTAAGCAC ACGAACGGAA

   1010 1020 1030 1040 1050 *****

   TTCAGCAACC CT-ACAGTAT ATAAGCTTAT CGATACCGTC GACCTCGAGG GGGGGCC/ AAGTCGTTGG GA-TGTCATA TATTCGAATA GCTATGGCAG CTGGAGCTCC CCCCCGG/

   71 494

   6526-040-118

   -911050 1060 1070 1080 1090 1100 * * ★ * * ★

   CGCTCAGGCC TCTCCCATCT GTTAACCTTG TTTTGTGÂTT GGGCTCTCGG GAACCTTCTG

   GCGAGTCCGG AGAGGGTAGA CAATTGGAAC AAAACACTAA CCCGAGAGCC CTTGGAAGAC

   1110 1120 1130 1140 * * * *

   TAAAACCTGT GTACACCAGT ATTTGGCATT CAGTATTGTC AA/ ATTTTGGACA CATGTGGTCA TAAACCGTAA GTCATAACAG TT/
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ácido nucleico recombinante estar contido no plasmídeo pC8-rN3(Pl) depositado no ATCC e com o número de acesso 40765 ou num seu equivalente funcional.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o ácido nucleico recombinante estar contido no bacteriófago 0rN3(Gl) depositado no ATCC e com o número de acesso 40763 ou num seu equivalente funcional.
6. 6 - Processo de obtenção de um vector de ácido nucleico codificando neurotrofina-3, caracterizado por compreender os passos de:

   (a) introduzir numa célula um vector de ácido nucleico compreendendo um ácido nucleico codificando uma proteína neurotrofina-3 tendo a sequência:

   Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr,

   sendo o vector de ácido nucleico capaz de se propagar na referida célula; e (b) propagação do vector de ácido nucleico por propagação da célula.

   ......

   71 494

   6526-040-118

   -927 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a célula ser uma bactéria.

   8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a célula ser uma levedura.

   9 - Processo de obtenção de uma proteína de neurotrofina-3 purificada, caracterizado por compreender os passos de:

   (a) expressar numa célula hospedeira compatível um ácido nucleico codificando uma proteína de neurotrofina-3 tendo uma sequência :

   Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Vai Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Vai Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gin Vai Thr Vai Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Vai Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Vai Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gin Cys Lys Thr Ser Gin Thr Tyr Vai Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr; e

   (b) isolar a proteína de neurotrofina-3 expressa.

   10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ácido nucleico codificando a proteína de neurotrofina-3 ser seleccionado de entre o grupo consistindo na sequência de ADN da neurotrofina-3 de murino, na sequência de ADN da neurotrofina-3 de ratazana e na sequência de ADN da neurotrofina-3 de ser humano apresentadas na reivindicação 3.

   11 - Processo de obtenção de uma proteína de neurotrof ina-3 purificada, caracterizado por compreender os passos de:

   (a) sintetizar uma proteína de neurotrofina-3 tendo a sequência: Tyr Ala Glu Ser His Gin Lys Gin Asn Gly Thr Ser

   Glu His Leu Trp Vai Thr Tyr Phe Cys Arg Gin Thr

   Lys Ser Vai Thr Vai Leu Tyr Glu Gly Ile Tyr Vai

   His Arg Asp Lys Gly Glu Thr Arg Asp Asp Arg Ala

   Gly Glu Ser Ser Ile Lys Cys Lys Lys His Leu Thr

   Tyr Ser Ala Ile Thr Gly Glu Ala Trp Asn Ser Glu

   Vai Cys Asp Ile Asn Ser Arg Pro Ser Gin Asn Asn

   Asp Ser Arg Gly Pro Vai Vai Lys Cys Lys Lys Leu ç?· . ... .

   71 494

   6526-040-118

   Vai Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Vai Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr; e (b) isolar a referida proteína de neurotrofina-3.

   12 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o produto ser obtido no estado não glicosilado.

   13 - Processo de produção de um anticorpo monoclonal, que é imunologicamente reactivo com a neurotrofina-3 caracterizado por compreender os passos de:

   (a) imortalizar linfócitos, obtidos de um animal previamente imunizado com neurotrofina-3 ou com um péptido compreendendo uma determinante antigénica de neurotrofina-3 para que os linfócitos produzam anticorpos, de modo a produzir células produtoras de anticorpos capazes de propagação;

   (b) pesquisar as células produtoras de anticorpos de modo a seleccionar uma célula que produza um anticorpo monoclonal específico da neurotrofina-3;

   (c) propagar a(s) célula(s) produtora(s) do anticorpo seleccionada (s); e (d) obter um anticorpo monoclonal a partir da(s) célula(s) produtora(s) de anticorpos propagada(s).

   14 - Processo de isolamento de uma molécula de ADN recombinante que codifica uma proteína ou péptido que compreende (i) uma primeira sequência de aminoácidos, homóloga de dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF, e (ii) uma segunda sequência de aminoácidos que não é homóloga dos dois membros diferentes da família de genes BDNF/NGF de (i), caracterizado por compreender:

   (a) seleccionar, de entre uma diversidade de sequências de ácidos nucleicos, as sequências que são homólogas de dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF; e (b) identificar, de entre as sequências de ácidos nucleicos seleccionadas em (a), as sequências que contêm, aproximadamente, pelo menos, 6 nucleótidos contíguos que não são homólogos dos dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF.

   71 494

   6526-040-118

   -9415 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o passo (a) compreender usar a técnica de reacção em cadeia com polimerase, usando-se um par de iniciadores de oligonucleótidos que são capazes de se hibridar a regiões homólogas dos ADN de dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF, de tal modo que o iniciador da cadeia com sentido seja capaz de se hibridar a uma primeira sequência de ADN homóloga de dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF e que o iniciador oligonucleotídico da cadeia anti-sentido seja capaz de se hibridar a uma segunda sequência de ADN homóloga dos dois, diferentes, membros conhecidos da família de genes BDNF/NGF.

   16 - Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por um membro conhecido ser BDNF.

   17 - Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por um membro conhecido ser NGF.

   18 - Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado por um membro conhecido ser neurotrofina-3.

   19 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de uma proteína neurotrofina-3 essencialmente pura com um portador farmaceuticamente adequado.

   20 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de um fragmento ou derivado peptídico de neurotrofina-3 funcionalmente activo, essencialmente puro, com um portador farmaceuticamente adequado .

   21 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz de um fragmento ou derivado peptídico de neurotrofina-3, essencialmente puro, transportando um determinante antigénico com um portador farmaceuticamente adequado.

   TL 494

   6526-040-118

   -9522 - Processo de acordo com a reivindicação 19, 20 ou 21, caracterizado por o fragmento ou derivado peptídico de neurotrofina-3 compreender pelo menos uma porção da primeira sequência de aminoácidos apresentada na reivindicação 3.

   23 - Processo de acordo com a reivindicação 19, 20 ou 21, caracterizado por o fragmento ou derivado peptídico de neurotrofina-3 compreender pelo menos uma porção da segunda sequência de aminoácidos apresentada na reivindicação 3.

   24 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, 20 ou 21, capaz de aumentar a sobrevivência ou o crescimento de neurónios ou de suportar funções celulares diferenciadas, caracterizado por o fragmento ou derivado peptídico de neurotrofina-3 compreender pelo menos uma porção da terceira sequência de aminoácidos apresentada na reivindicação 3.

   25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado estarem glicosilados.

   26 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado estaren não glicosilados.

   27 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a associação de uma quantidade eficaz de um anticorpo que reconhece a proteína neurotrofina-3 ou um seu fragmento ou derivado peptídico com um veículo farmaceuticamente aceitável.

   28 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a associação de uma quantidade eficaz de uma combinação de uma proteína neurotrofina-3 substancialmente pura ou de um seu fragmento ou derivado peptídico e de um segundo agente, e de um veículo farmaceuticamente aceitável.

   29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o segundo agente ser factor de crescimento de nervo.

   TL 494

   6526-040-118

   30 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o segundo agente ser factor neurotrófico derivado de cérebro.

   31 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o segundo agente ser outro membro da família BDNF/NGF.

   32 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender a associação de uma quantidade eficaz de uma proteína ou de um seu péptido ou derivado codificados pela molécula de ADN recombinante obtida de acordo com a reivindicação 14.

   33 - Processo para diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, nomeadamente um tumor, uma doença degenerativa ou uma doença dos neurónios sensoriais, caracterizado por compreender:

   (a) fazer contactar um tecido com uma molécula de ácido nucleico, marcada de maneira a ser detectável, a qual contém, pelo menos, dez nucleótidos essencialmente como se apresenta na terceira sequência da reivindicação 3, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.

   34 - Processo para diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, nomeadamente um tumor, uma doença degenerativa ou uma doença dos neurónios sensoriais, caracterizado por compreender:

   (a) fazer contactar ARN recolhido de um tecido com uma molécula de ácido nucleico, marcada de maneira a ser detectável, a qual contém, pelo menos, dez nucleótidos esencialmente como se apresenta na terceira sequência da reivindicação 3, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.

   35 - Processo para diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, nomeadamente um tumor, uma doença degenerativa ou uma doença dos neurónios sensoriais, caracterizado por

   71 494 compreender:

   (a) fazer contactar ADNc produzido a partir de ARN recolhido de um tecido com uma molécula de ácido nucleico, marcada de maneira a ser detectável, a qual contém, pelo menos, dez nucleõtidos esencialmente como se apresenta na terceira sequência da reivindicação 3, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.

   36 - Processo para diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, nomeadamente um tumor, uma doença degenerativa ou uma doença dos neurónios sensoriais, caracterizado por compreender:

   (a) expor um tecido a uma molécula de anticorpo, marcada de maneira a ser detectável, capaz de se ligar a proteína de neurotrofina-3 ou a um seu fragento ou derivado peptídico sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.

   37 - Processo para isolar um gene membro da família de genes do factor neurotrófico derivado de cérebro/factor de crescimento de nervo (NGF), mas que não codifica nem o factor de crescimento de nervo nem o factor neurotrófico derivado de cérebro, caracterizado por compreender:

   (a) seleccionar, de entre uma diversidade de sequências de ácidos nucleicos, as sequências que são homólogas tanto de BDNF como de NGF;

   (b) identificar, de entre as sequências de ácidos nucleicos seleccionadas em (a), as sequências que contêm sequências de cerca de, pelo menos, 6 nucleõtidos contíguos que não são homólogos aos de NGF e BDNF; e (c) isolar as sequências identificadas em (b).

   38 - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por o passo (a) compreender usar a técnica de reacção em cadeia com polimerase, usando-se um par de iniciadores de oligonucleótidos que são capazes de se hibridar a regiões homólogas dos ADN de BDNF e de NGF, de tal modo que o iniciador

   71 494

   6526-040-118 oligonucleotídico da cadeia com sentido seja capaz de se hibridar a uma primeira sequência de ADN homóloga de BDNF e de NGF e que o iniciador oligonucleotídico da cadeia anti-sentido seja capaz de se hibridar a uma segunda sequência de ADN homóloga de BDNF e de NGF.

   39 - Processo para isolar um gene membro da família de genes do factor neurotrófico derivado de cérebro/factor de crescimento de nervorvo, mas que não codifica nem o factor de crescimento de nervo nem o factor neurotrófico derivado de cérebro, caracterizado por compreender:

   (a) seleccionar, de entretre uma diversidade de sequências de ácidos nucleicos, as sequências que são homólogas tanto de BDNF como de neurotrofina-3;

   (b) identificar, de entre as sequências de ácidos nucleicos seleccionadas em (a), as sequências que contêm sequências de cerca de, pelo menos, 6 nucleótidos contíguos que não são homólogos aos de BDNF e neurotrofina-3; e (c) isolar as sequências identificadas em (b).

   40 - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o passo (a) compreender usar a técnica de reacção em cadeia com polimerase, usando-se um par de iniciadores de oligonucleotidos que são capazes de se hibridar a regiões homólogas dos ADN de BDNF e de neurotrof ina-3, de tal modo que o iniciador oligonucleotídico da cadeia com sentido seja capaz de se hibridar a uma primeira sequência de ADN homóloga de BDNF e de neurotrofina-3 e que o iniciador oligonucleotídico da cadeia anti-sentido seja capaz de se hibridar a uma segunda sequência de ADN homóloga de BDNF e de neurotrofina-3.

   41 - Processo para isolar um gene membro da família de genes do factor neurotrófico derivado de cérebro/factor de crescimento de nervo, mas que não codifica nem o factor de crescimento de nervo nem o factor neurotrófico derivado de cérebro, caracterizado por compreender:

   (a) seleccionar, de entre uma diversidade de sequências de ácidos nucleicos, as sequências que são homólogas tanto de NGF

   71 494 «Z

   6526-040-118

   -99como de neurotrofina-3;

   (b) identificar, de entre as sequências de ácidos nucleicos seleecionadas em (a), as sequências que contêm sequências de cerca de, pelo menos, 6 nucleótidos contíguos que não são homólogos aos de NGF e neurotrofina-3; e (c) isolar as sequências identificadas em (b).

   42 - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o passo (a) compreender usar a técnica de reacção em cadeia com polimerase, usando-se um par de iniciadores de oligonucleotidos que são capazes de se hibridar a regiões homólogas dos ADN de NGF e de neurotrofina-3, de tal modo que o iniciador oligonucleotídico da cadeia com sentido seja capaz de se hibridar a uma primeira sequência de ADN homóloga de NGF e de neurotrofina-3 e que o iniciador oligonucleotídico da cadeia anti-sentido seja capaz de se hibridar a uma segunda sequência de ADN homóloga de NGF e de neurotrofina-3.

   43 - Processo para promover a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos, caracterizado por compreender expor os neurónios dopaminérgicos a uma concentração eficaz de neurotrofina-3.

   Lisboa,

   Por MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e

   REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

   - 0 AGENTE OFICIAL -

   o β •rl o o o 33 Λ 0 > L o M u O 0 O •H Ul 33 ui β 33 IX 4-> β O 0 d ti •rl CJ cx β tu tu CX β nd t) tu tu rC <D <U τι τι lu Lu Tl Lu CS CS u. Lu lu Lu CS z z CS CS CS

   ζ ζ ζ ζ ζ ο

   CQ bO ο

   β O o *r4 o β 0 tí 0 > M β Ul u o o o O •rl β 33 Μ β 3= cx Ul -rl O o rt d tx υ cu β tu tu β nd Tl tu ω tu 33 <11 Tl Tl τι Lu Lu T)

   U. CJ Ο U. Lu U. U.CJZZU0CJ

   z z O CQ zzz

   CL Ο Ο Ο «ί Ο Ζ ζ χ χ χ χ x 2 cj cj <j cj cj cj cj SZ Ίέ 5Ζ SZ aZ az az Η'Η’Η-Η'Η—Η-Η uj ui ui uj ω ui ui >** Lu Lu Lu Lu Lu Lu Lu Lu Lu lu Lu lu Lu ororarorcroror X X aZ X aZ Z _ILl LU Lu lu Lu >o*> > > > > :> cs <z) to z tz) z 2 az z z z z z z to ζ ζ ζ ζ z a

   J

   o. z z z z z z >>>>>>> v uj uj ω ω ω z Ul CS CS <f «f CS Ul

   J J J2 >>>>>>> l-SSI-hHfc· >>>>>>> |— Ul UI Ul Ul Ul hUXXXXXZ cs cs cs co cs cs cs CO hZ aZ aZ aZ SZ SZ

   S á X X X o*x cs > cs <

   SSfcS

   W X X X h- to to z _l _l _l _l w > > > CJ o o o > > > > CJ CJ O CJ tz>< < < hh-hh QQQQ

   CJ CJ CJ < < < ht-1ca ca ui x x x x x

   L—I 1—1 >—I I—< U< I—« I—I Lu U Lu Lu Lu Lu lu X X X X X X X ãOOO

   X * * * * * * s S’S’S’S'S^,g’

   CO CS CS Z Ul cs cs ca q ca o ca cs ui ΣΣΣΗΙ-ΣΣ h h h H H H h

   J ·Μ Μ ·Μ BmJ

   2333232 £

   FIG. 1 ca o ca cs co <

   * * * * * * > > >

   C 3:

   * >

   to to to to CO CO to M > H > > > > LO LO LO tO LO 10 10 Ωοααααο o o o o o o o >>>>>> io to to to to to -J Lu lu lu Lu Lu > > >- lu tO ICXX tt

   X íCJ CJ cx>to to z z z z X “ X > > Lu Lu h“ h— X X h- l·I- L— I- I— CJ CJ >· >CZJ to z z z z >· l-l Lu Lu Η H bX X O I— l· I— ί— I— Ul cz x x az s x α mu < U. lu Lu Ll J Ϊ CL. M > >- > > > Q CL IX O. O. CL ΟΙ/) X X X X X X X to tO l·— I— < Q tO CO CO CO h- Ul (Z) CO LO tO l·— CJ CJ >- íleo LO to z z z z z z

   X cz» < CZ) Q ca

   CJ >-

   CZ) az to < to cz) X ca o o o ca Ul M W M W M cs CS CS CS CS CS _1 X X X X X z CJ CJ CJ O CJ

   O- X CJ CJ CJ CD CD CS CS CS CD ω to to to to to to az ca ca ui ui cz) cl l- > > > >>,> UJ >- Q_ CL O. OL Ol cl CS Ζ Z LZ) Ζ X Z Σ CL CU Q. (/) Ο. X

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC

   2/35

   GGAAACCCCG CCCGCTATAA ATAACAGGGA GGAGTTTACC 40

   TCATTTGTTA GACTGGTGGT ACCCTCTCCT CACTCTCAGA TTGTCAGCCT CGGTGGCTGA TGCCAGAATG 110

   O o O o co *3* o 10 tH CM <*) (*)

   k ω E OJ B 03 ο φ uj o >— < O r- < CM (Z> < rj- 03 O 10 03 CJ 03 1— c ω Φ O kO 03 V) < r— F— >»< OJ < < ·-< < F— F— < >icj 3 03 E b O r- O Φ b (Zl «í < 03 03 —I O < 2 < OJ C 5 V) 03 3 *5 r~ 2 >»< r- 2 F— 03 O -J 2 03 UJ CJ OJ Φ O Φ c_) (Zl 03 (_) W < r— F— w < ís H >»o Φ O r— F— F- i— 03 r- 1— <0 F- o |__ OJ OJ ►H < >· OJ 1“ CDF— 3 O CUF- 2 i~ 03 Φ F— IZI < OJ < O —1 O < OJ < O 3 O X- CJ r— 03 h- Φ F— φ ω «0 b F- Ua -1 O cn ι- >03 p— í— x-1- έ H >P 03 F— >»< (Zl < Φ b Ι- F— h < 2 s< Ο <0 |— 3 CJ B 03 O r— CJ Φ F- ·— < b < 03. -1 CJ 03 CJ H F— 3 Ι- kb (Zl < 03 Ο ω F— O Φ CJ O >4 2 F— rH —1 O (*) tn»— m 03 F— Φ F- 0.0 kO O J= ί- V) < Φ o o < ο- F— < 03 (Z) F— φ < 3 F— o f— F- Φ F— 3 J— M < 03 03 —1 CJ r— 03 O OJ (Zl U3 F— »tí F— k O íS OJ > 03 CU CJ r™ C_> X- b 3 03 B CJ >»< Φ F— (Zl < < 2 03 1- F— -J F— O Φ F— k F— (Zl < O -E Ι- Φ 03 >>2 03 Ο. F- (Z) < _j 2 03 O 3 03 3>UJ 3 03 <_) Φ F— X- 03 Φ »- F— -J F- < < -J H F- Φ O íS Φ CJ O r- b r- F- H— < OJ o M «C t_> 03 k O Q.F- O.F- 03 Φ O V) < (Z> «£ 03 03 < tn h < OJ < 03 P 03 p ta >0 03 O Φ F- φ ι- i— CJ < H£< έ < < 03

   O o o o o «0 CM 00 «fr rr «a· tn X. < o e F— ο η·» o» o X- H ο φ o o (Zl < CM Φ F— < 2 rH SE < rH >»< CO tn F— rH F— F— CDUJ X-CJ 3 «C 0)0 X. 03 >»< Φ F- X- 03 < < k CJ F- F- -1 CJ OICJ LCJ < O (Z) < JC CJ b < X- OJ >,< < CJ b b í « o Ol< 3 < 0)0) r- CJ X. 03 φ b x- α < 03 < < -J b < < 3 03 E OJ O CJ O)OJ r— < ·— < l. CJ I- 03 03 03 03 CJ CU CJ < o >»< E < O Fr- 2 X-CJ O < i— 03 X. o OJ OJ OJ O CU CJ OL· o E OJ 0)03 O CJ X- < 1- < X- OJ U CJ Φ o OJ CJ < CJ 0. CJ (Λ 1- 3 03 3 < s α X- o r— < Φ 1- 1— *£ JZ o 03 03 —lo 03 03 Ι- < O < 3 < 3 03 Ο <t X- CJ Φ 1- Φ 1— X. 03 O. CJ -J O -1 b < < 5S OJ OJ 301 OF- r- < U O 03 03 CU O c (Zl < AAT 0)03 X-<O UOO « o O UUO£UHj:U(nr-U

   IS<<WH<rtH<írH<U

   CM

   O

   Ll.

   o o 0.0 k O P- < X- o (Z> < Φ U3 (0 F- ou o < 03 CZ) «C > 03 10 < k OJ 0.0 r— 03 r- O x: o (Zl < *0 F- < 03 F- < < OJ > UJ 3 OJ « < k 1- O OJ r- < i— O Φ OJ k O 03 OJ < OJ (Z) < CU O «< Φ I- 3 O C O r- O r— F— Φ F— (Zl < < OJ ►H < -1 O < 2 (Z) < +1 CJ 3 OJ >»o Φ b Φ F— r- OJ —I < X < —1 O OJ UJ o o O < ι— O i— UJ x-o k o <0 F— (0 h- cu o CU o > 03 > 03 3 03 Φ F— E OJ r— «C O)UJ k 03 —I O UI O «í O F- F- k o Φ O o o O.F- JC o J= F- k o (Zl < F— < O- F- eu o < 03 X- O 3 OJ kU3 303 Φ 03 »- «t Φ O r- < (Z) < 03 OJ CZ) b 03 U3

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC

   3/35 vo o

   in

   o o o o o o o o o rr VO CW 00 rr o vo η o rr oo vo h» r-s 00 o cn OHHCWCSJ cn rt rt rt rt rt r— tS ο φ cj o oica o t- F— O BI ta F— «0 F— co i— i— o t- ca cw -c cj rr t- ta Η· > ta ι-f Μ < cw < < CW H- < CW F- F— < < f- ca cj o. ca 3 ca co cj w < σ CJ T3 < F- F- ca < t- ca r— r— CJ >»< t- ca c ca < i— i— ca F— F— ca ta < ta -J «c < CJ Ul F- μ. H CJ < < 3 ta >>ca 3 < ΙΛ O B ta t- < f- ca ca cj Φ F- p— ca p^- <c >»ta i. ca JZ CJ ca «t i- cj —J CJ ca ca ca ta CJ F- F— F— F- < h < ca ta í- CJ 3 ca ia < c ta >»CJ O)< <x i— f— ta *t F— < φ ta Φ F— >»< p—· < y» ca í- ts <n < -1 CJ —1 <C ca cj ca ca < < F- F- < F- «X F— CJ 3 ca i— ca <λ f— J- »- r-· < >»< < F— ca F- r— «t io f— >»ca Φ CJ <0 »- r- ca f- ca f- ca ca ca > ca cj f— tn F- > ca ca ca < < F— Ι- Ο CJ O F— t- F— i- < O)< c CJ 3 CJ Φ F- ca < cj < φ ca jc cj s_ ta VJ < Φ 1- r— F— < F— < 1— cn < F- < < < < < —1 o W < Η H- < ts ta cj f— < 0-0 — <j t- ca o. ca (A IA < vi «c «0 F— JC CJ t. ca >1 >»< I— O F— O < ca > ca F— < F— F— -J < < cj ta F- CJ < F- 1- v» 1— c ca 3 < «Λ O C CJ O)< ta < cj < >»ca r— <C ι— «Ϊ •F «c IA < u ca F— CJ F— O <J F- ca cj ta ta =E CJ < < < < < ta < ca H- c o ca ca ·— ca IA CJ t- H V) < C CJ í- ca <CJOI-h- <0 F- •p < >»*C IA < Φ CJ cai—cj|-i— > ta 3= CJ F— H- -1 < < < to F- 1— 1— F— f— ta í- «c >>< Φ F— CLCJ ' 3 3 ca < CJ F— < «t Φ CJ i— ca j= f- <Λ < r* < Φ F- F- «í F- F- ca CO F— ca ca «a.»— < ta ca ta -J Ι- < < cj ca < F— < O < CJ J- CJ o oca o s- f— o BJ F- O $- < ΙΟ CJ F-F—cacJH- >»< t- ca cn >»<c «-< M < Γ0 Φ CJ r— CJ < f— ca cj ca F- 1- HcIUH(-F-N< ta cw CZ) 1- < ta < < < < < < f— cj cj ta 3 ca Φ F- C < Φ F- í- F- IA F- F—F—F—<F— 1— < r— 1— r— < I^- H· J= o >ita H F— CJ F- < ta ta n < ca O 1—( < F- < CJ t— f- < cj ca ca >>< 0.0 V) «c > ca a ca <r- ta cj f- cj η- ca »— ta «Λ < >»«? ff ca Φ F- (0 F— < i— cj ca cj ca ca < ta -i < ca ca -JCJ > ca F—F—F—l—F— 1- CJ o O < cr»< φ i- «- ta σ ca n> < v» i— < CJ CJ O < j- ta ·— F^- OH i. ta r— CJ >»ca f_ < ta < <

   ι-t < > O «C CD UH

   FIG.2(cont.)

   V) o •r- <

   □Ε O

   I- F— <u ca (Z) <

   (Λ ta >ΐ< -l <

   V) F•i“ <c ec cj □ < r— <

   ca o «a <c r— O < ta

   Π3 o p_ O < ca f- < <u o cn f—

   5- O Φ O to F—

   V) C3

   -J <

   Q.CJ v> <

   < tS t- O x: o I- <

   o »— 1~ cj

   Q. CJ t- F— Φ o V) F— c o

   V) «t *C <

   >»F— r- ca ts ts u o JC o F— < V) C

   3S

   ΙΛ > ts cj > F— i— ca ca ca c o

   ΙΛ < < <

   vi <C >»«c -J <

   i— CJ *0 F— > ca o ca t- cj Q- O cn< s- ca < o ·— CJ fO F— > ca t» I— >»< I- F—

   J- CJ J= CJ I- <

   c <c ·- < ca cj t- ca (U CJ <Z> H {- CJ Φ O tO Ft- F— JC CJ F- <

   CUCJ ia < < ta cu t<

   φ ca

   CJ <

   F<

   i— ca f- c < l- F- <

   < H- cj <

   < ca i- c < < F— < < CJ H< F— CJ < Ο Ιο <

   ta F- cj f— ca i— ta i- fl-UH ca f- cj o f- c H- cj < F— CJ <

   < CJ F— < < ca

   CJ F— < I- < < ca f- f— F— H· <

   ,X-> F— < F— h— CJ < F— ΙΟ ta cj ta F- fta f- F< < ca cj ca F— ca Fcj FO O ί—Ή cj ca ta F—

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

   4/35

   k.....

   Lu

   PO0 2 I Ο Ο h- 2 CQ m u_ i u. z l—OO 22CQ >

   >

   ouu CJ l- as as as as CHO 2 Sí h<í α Sí Sí Sí 1— 1— h— UJ UJ UJ as as w > IA. > CZ) CZ) H- Lu Lu Ia. —J _l _J >->->- O 1— o o o Sí 2 Sí > >- > > lu _l 2 >. Cf CZ) < CZ) CZ) CZ) CJ h- t— H Z 2 Sí O O O CJ 2 CZ) ΜΙ-HW l·- M 5* Sí 2 2 as as as Μ Μ l-H *< > ?* UJ UJ 52 Z LU LU as cc as CJ < UJ X X 2 _1 __J __J CJ < CJ > > > > < 1—< h- l·— f— -H ce > > > > Sí O-SÍ O*UJ H 2 Sí Sí 2 iz CJ 2 lAl CZ) CJ CJ CJ LU O O 2 Sí CZ) Wt-X Η H S 1—1—1— O O O -J __1 _l 1—I h— > < «c < as 2 as < < < wt-(unuy sí sí sí > > > >- u. >- i—»— tz> α o o θ'2 θ' * CJ < LZ) 1— Ι- •fc * <c »-* h- Η H l·Sí Η- 2 > > > O CJ O X X 2 —1 > lAl czs- cr cz) cz) cz> CZ) CZ) CZ) 2 2 2 lAl > 1—< XXX CZ) CZ) CZ) O O O £££ O O O o cz) sí > 5> > o o o CZ) CZ) CZ) l—ι ι—i n >- U--1 CJ CJ CJ UJ UJ UJ 2 2 2 CJ CJ CJ CJ O O as S 2 CJ (9 CJ 2 2 as 2 CZ) LU S2 uj sí Sí 5> 2 2 0-0 ΓΌ > > {2 2 > LU Z CZ) > 2 2 0 «C 1— 2 < CZ) S > CZ) LU < 2 <z> Sí 2 2

   ro o

   u.

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC

   I.

   lí

   FIG. 4A

   28 S 18 S

   FIG. 48

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC

   6/35 a®»* ο

   γΗ

   Ο

   Μ co ΰ Ο ο ο ^u

   ΙΟ

   Ο

   5000-1

   Ί O 1 o 1 o 1 o ó O o o o O o o o st ro CM

   saquaAjAajqos sofuojnau ap ojauinu

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC
7. 7/35

   23./—·

   9.4 —< 6.6—·\

   4.4—1

   NGFde rato BDNF de rato NT-3 de rato

   2.3—

   FIG. 6A

   EcoRI Hindu SstI Eco RI Hindu SstI

   | -r j- 7 k AT6 α TGA

   I KB /2C

   F/G.6B

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
8. 8/35 c tg ·- tf <9 O

   01 h'X tcu μ. v <_> X hβ.1k O

   01 O (Z1 l·4J μ~ > (J «rt l·>»u> U H k μX O μ- «t

   E <4 V) tf tf 5

   5t »-< tf w tf < tg k tf 0) (J «Λ H

   E (9 i- tf (9 O ω o 4= μα μ3 O 01 t—I O o>< k <9 < tf

   O o k (4 Ol. <4

   3»tk <9 tf <4

   3 14 o» P—I <4 k H >»tf P- l·— *0 l·— »— <4

   O tf C9 m r4 3 p0) H—I «4 ω μX μα μ« tf H tf r— <9 <0 H > (9 k P>»tf P- PV I— JZ μco cr o

   o

   3 (9 01 I— tf (9 tf tf ttf <4 <4

   01 (4 ·— ΡΜ tf k U <U (4 «Λ hOt 44 (91 « Φ(«-< x tf| i

   -«- 19 « μ> (9 VI (9 -J <

   C (4 V» tf tf tf

   I— (9 •0 b— >· <9 tf (9 t— u

   o

   ΙΟ tf

   E <91 r— tf I O <4

   3 tf

   01 I—

   01 (_) ·£ l-· tf

   3 U

   01 I— —I U k U <U U

   V) H ch

   V) tf tf 3

   3 U οι μ-I <4 k μο, u v» μO 0.(4 r-l VI tf «4 tf t9 I (9 19 p < k <4 O. <4 3 <9

   51= k ΙΟΙ 19.

   Vi tf m <9 k 19 tf tf

   E tf r— tf <9 <4 αινι tf tf <9

   44 (9 01 Px<

   C <4 Vt tf tf < oco

   CM VI tf t-l tf tf

   I >i<4 r— <9 19 19

   E tf i— tf <9 <4 V <4 ·— μ>-> tf >»<4 i— <9 <9 t9 ³ tf r— tf «9 <9 ΙΛ <9 *3 •ο μ> u αμ «λ < tf <9

   1“ tf « μ> <9 44 <JJ έϋ e <9 ·— tf <9 <4

   M tg X

   Oku σ» φ u i <z> μ—

   3 u οι p—I <4 VI 19

   5*3

   E <4 VI tf tf tf

   O 0119 U3 kl9 « tf tf kU JC u μ- tf

   C t33 o

   IX

   I

   «B U O ·— u tf Stf tf u 1 ρ-μ- 3(9 mu »— tf Cd !> k tg t9t9 tf u 5*3 w mtf k (9 <g o μ5 O tf tf E 19 rx e <9 «- tf (9 U (9 U s ta t9 5 53 «9 U p tf mtn k <4 k t9 au tf u 3 tf 3 tf 0» p- <9t3 JU pltf 3 tf k tg « μ- tf tf -JU ou kU 53 O. <4 19 C9 k tf 1— U xu tf «a P- tf 3 <9 o au «9 5 m 1 M < tf tg

   αμVI tf tf 19 <9 <9

   44 (9 οι μO 3 tf <m οι μι —ι u k μ•Λ t •γ- <

   Ζ <4 § 3S

   5 <9 19

   Ό tf ι~ U tf <9

   Η k μΙ >»tf μ- μ3 tf

   5{=

   Síá

   o. u ο μk <4 α u o u k u o. u

   3 <9 t— tf <9 (9

   3 C9 οι μCd «ί

   W ►J υ

   mu k tg tf u

   VI tf >»tf mtg k (9 tf tf mtg k tg tf u
9. 9 < k u a. u k tf 01 <4 Vi μ.

   M tf S3 55 tf <9 3 t9 οι μ-1 p- <A tf 2?3 V u ou kU O.U S-!« < u 3 <9 01 P—1 u «tg i— U tf <9 kU xu μ- < e tg r- tf <9 U k <4 01 <9 Vt tf φ <4 μ· »-« tf e ta <9 U 3 <9 51= ι ι- μ- V) t9 5*3 ^c h: 33 <M ta CM

   k tf X <4 I-tf «tf tf <9

   5t ►4 tf 44 <9 xí£

   2u a. <4

   E<9 tf (9 U

   V U st

   33 ο α k tf 01 <4

   VI μ9 *k u O- 14 k u j: o *-tf

   O kU <*> 0» C9 I <Z) tf au VI tf tf (9 k μ01 <9 <Z) tf 3 (9 . οι μ-j u

   3 C9 o> μ-4 u u « μ> (9

   O» <9 k <9 tf u o u k <4 CU U k tf 01 u vt μω ο

   ο ο

   k < c u

   H tf çn<

   tf tf

   E μ. vt «C tf tf

   O kU r4 X U I H tf

   J? *> <9 i- t9 J³ P> t9

   O (9 k U a. u c u >»u —- <9 19 <9 r- <9 •ο μ> tg >»•5 σ» η

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC

   J

   9/35

   F^L ' ^«nríSSÍ x- < Φ O <Z1 H >»o r— O O O

   X- o O H 0)0 <u O I- O X- o «Z) H (X O < < V) O X- H tf) Ol >>< OJ <_> > o —J <£ tf) H o hI 0.0 C O >»H VI < V) < ι— O < o < C ca o I- o >>o c o JZ o r- ca vi «£ H < o o < < r— O x- o M < «J H jc o >>< > O H < _J < 0.0 v> «t ι— O X- o >?< •Β H Η H -1 «I > O 3 O Φ O O < Φ H ·“ H X. O —I O H-t < cu o t- o 0 3 0 0)0 Φ o >çf < X. o <Z1 < O o < < 3 O >»< o «o

   o u x- h Φ o <z) <

   o. o V) < < O <Z) Hl >- O O Hl i- O Ό H > o x- < <u o <Z> H

   X- o .>»<

   r— O ca o

   3 O Φ H «J Η— r— O •B H => O

   X- < JC o H <

   0 3 0 Ht- «í ca o >»<£ ·— o ca o oi< j- o < o (Λ O •r- C ac <_>

   X- H

   Φ O <z> <

   VI O >»<C

   -1 «C •Β H > O c o i— <

   ca o v» o — < X o >»<

   ·— o o o

   0)0

   X- O < o

   O Φ H <*) r- H »-· <

   0.0 vi «t C cs φ h r— H W <

   •fl O ι— O < O

   XO csi tf)

   Ο X- H Oi£U

   H <

   3 O Φ H -J o

   3 < ι— O «t O

   O)< X- o < o r- O <0 H > O I. o

   ÍJS

   X- o JC o H <

   O tn

   << O o x-o X. H JCO Φ O H < tf) H ³ 3 C O r— *t O O M «t < < UH 0.0 ,>»< X- o Η H Η H Φ H V) o J= H ·»- < cu h X o X- H VI <C >»< >»< Η H —· < ^C3 0.0 i— <! VI < ca o < o >2 XXH V) < —1 < < o ι— O Ο Φ H «Β H Γ> r H > O W <

   O)

   Ό* to

   3 O O O Φ H O H -1 H < O (0 O H O H ι— O o < < O < H o O Ο (Λ Hl < H < H > Ol H H O τ—1 O Hl < ι— O H O H H H < O H • <0 H < «c H > O < < < O c «C H O o o (Z) Hl H H O o >- O H < O H o O Hl H H H H O H (- O Φ o o < H H «C σ tZ) H H < O H S- X- H H H O O < H O «C • JC o H < H H H o o < O o S2 0.0 V) «t 5 o < o o H o < o < ú_ < O < H o H Φ < H H o O < r— H H O H H M < < < H O O)< O «c O H <c H O O X- o o < O o < o o o H H H H Φ < < O < r- H o H O < W < H O H < H H 0.0 H O O X- O O < H H Η H H H O O O 0)0 < H O H O H H O X- O O H H O i-l < O O H < O 0.0 O < < H H < < X- o H H < O Η H < >tO < H o * C H < o — O + O < < o O O * H H O H Ol U< H H O r- < H O H •Β H r-l JC O O H O > O rl H < H H o 3 O O)< < H O < H O Φ H X- O —1 O < < -< H H V» < >»< H H H < H <t 1— O H H O —1 < o o < O H c o O O O Φ o O < H w < H < < H c < M < H H H c o O < H VI < V) «£ >»< H H O < «C -l < <t < H O H H 3 <£ O)< O O O r— < X- o H < O O O c < < O s X- «< H < «C H H Φ o Φ o O H H < <Z) H IZI H H O O < CO i—l r-l to Γχ tH O H O) rH

   MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

   J
10. 10/35

    FIG.7b

    MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC «*·
11. 11/35 en ο r-l CM «*) <-xr-s OU3N r-l CT> CO I I I o—< x o. to ui ft. «t

    XZCC o * * X iZ .· »- * * UI * * £S > ♦ ©*♦

    3Z * > _J *

    * *

    * l

    σι—ι- χ »η χ *—ι—

    M

    O

    CO

    U

    CJ

    CU

    PM

    O

    X bO O r-l O 0 O 43 (U

    X

    H ice bO

    0)

    Pi l-< O. < _J >- UI

    235:

    -j z tn </i to o o cru UI o * o. CE * aJ P* ·· l/l Z op < t/i cr ui o o2H x * >

    XO.·· z < ui_a <a «f — crS2 * H2> O <_> * aJ U_ * >- * u.

    3 Vi * t—I I— U. > hH h-l X —¹ > h- ·· >- -J * Ll- * * aJ * * h-l * X Vi h- * X * * — > + * ΪΖ OC l/l zas > * * cr* * einio «t m cm

    ft ft B ft E-t ft O B M w O o o μ μ μ cd cd cd μ μ μ y (U y X X X

    o icd co •rl y

    cu xi r-l cd

    PI

    -rl “ co co