PT91828A - Processo para a preparacao de peptideos inibidores de proteases do hiv, uteis para o tratamento da sida - Google Patents

Processo para a preparacao de peptideos inibidores de proteases do hiv, uteis para o tratamento da sida Download PDF

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PT91828A
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Jutta Hansen
Rudolf H Hanko
Heeja Yoo-Warren
Triprayer V Ramabhadran
Paul Perry Tamburini
George A Scangos
Rolf Henning
Dieter Hoppe
Klaus Rabe
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Description

-4-
' . BASE DO INVENTO - , .
Domínio do Invento O presente invento diz respeito a terapêuticas para a SIDA baseadas em inibidores de protease de HIV. 0 invento é também dirigido a novos compostos contendo actividade farmacêutica, à produção de tais compostos, a intermediários, a composições contendo estes novos compostos a ao uso destes compostos em farmacologia. 0 invento diz respeito também a um ensaio rápido, sensível a actividade de pro tease de HIV. (
Informação Base 0 virus de Imunodeficiência humana (HIV), o agente causador do Siódroma de Imuno Deficiência Aquirida (SIDA), é um membro da família de lentivirus de retro virus (M.A, Gonda, F. Wong-Staal e R.C. Gallo, "Sequence Homo-logy and Morphological Similarity of HILV III and Visna Virus, A Pathogenic Lentivirus", Science, 227 173 (1985) e P. Sonigo e N. Alizon e Colab, "Nucleotide Sequence of the Visna Lentivirus: Relationship to the AIDS Virus", Cell, 42, 369, (1985).
A SIDA espalhou-se já em 131 países com o maior número de casos registados nos Estados Unidos da América atingindo mais de 42.000 pessoas. Os grupos de alto risco de adultos/adolescentes incluem homosexuais/bisecuais do sexo masculino (66%), abusadores de droga intravenosa (IV) (16%), homosexuais do sexo masculino e abusadores de droga IV (8%), doentes com doença de hemofilia/coagulação (1%), casos de heterosexuais (4%), transfusão, componentes/sangue (2%) e os casos não determinados (3%); enquanto no grupo de crianças, a maior incidência de 78% era de pais "em risco" de SIDA. A -5-
taxa do número de mortes é de 58%. 0 HIV, em comum com outras retrovisores, abrange um número de enzimas que são necessários para o ciclo de vida virai (R. Weiss, N. Teich, H. Varmus e J. Coffin, eds., (1982), "The Molecular Biology of RNA Tumor Vi-rus" , 2§. edição. Cold Spring Harbor Laboratory, New York e L. Ratner, W. Haseltine e colab. (1985), "Complete Nucleotide Sequence of the AIDS Virús, HTLV III" Nature, 313, 277 (1985). Na ausêncis destes enzimas, a inspecção virai produtiva não ocorre (R. Weiss, N. Teich, H. Varmus e J. Coffin, supra).
Tendo em vista o que atrás se dis^ se, os inibidores dos enzimas atrás referidos têm potencial terapêutico contra a SIDA. 0 unico terapêutico vulgarmente usado, o AZT, é um inibidor da transcriptase inversa virai (H. Mitsuya and S. Broder, "Inhibitoon of the In Vitro Infectivi-ty and Cytopathic Effeets of HTLV III", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, 1911 (1986)).
Outros enzimas virais incluem um ARNse, um integrase e um protease, sendo todos essenciais para o ciclo de vida virai (H. Mitsuya and S. Broder, (1987), "strategies for Antiviral Therapy in AIDS", Nature, 325, 773, (1987)). A protease virai é responsável por clivagem das poliproteínas gag e gag-pol em peptideos maduros (L. Ratner, W. Haseltine, et al supra; R.A. Kramer, M:D. Schaber, et al, "HTLV III Gag Proteín is Processed in yeast Cells by the Virus Pol Protease", Science, 231, 1580 (1986) and W. G. Farmerie, D.D. LOeb et al "Expression and Processing of the AIDS Virus Reverse TRanscriptase in Escherichia coli", Science, 236, 305 (1987)). A sequência de amino ácidos para poliproteina gag é descrita em Ratner et al, Nature, 313, 277-284 (1985). -6-
A partir da posição conhecida na extremidade 51 do gene pol e dos pontos de clivagem da pro -tease inferida (L.H. Pearl and W.R. Taylor, "Sequence Speci-ficity of Retroviral Proteases", Nature, 328, 482 (1987)), o tratamento previsto da protease HIV, juntamente com outras proteases retrovirais, têm homologia em relação a proteases de aspartilo celular (I. Katoh, T. Yasunaga, Y. Xkawa e Y. Yoshinada, "Inhibition of Retroviral Prolease Activity by an Aspartyl Proteinase Inhibitor", Nature, 329, 654 (1987)).
Alguns dos pontos de clivagem da protease HIV têm sido determinados (L.H. Pearl e W.R. Taylor, "Sequence Speeificity of Retroviral Proteases", Nature, 328, 482 (1987)) e são listados abaixo como se segue: (1) Ser-Fe-Asn-Fe-Pro-Gln-Val (2) Tr-Leu-Asn-Ee-Pro-Ile-Ser (3) Ser-Glu-Asn-Tir-Pro-Ile-Val
As sequências anteriores (1) e (2) são as que se aproximam muito da própria protease, enquan to a sequência (3) está situada na poliproteína gag. A capacidade para se obter quanti^ dades da ordem do miligrama de protease-HIV recombinante numa forma altamente pura tem ajudado no desenvolvimento pelos aplicantes de um ensaio específico, sensível, rápido para a actividade de protease-HIV usando substratos de peptídeos dan silados.
As técnicas de separação e purifi cação necessárias para produtos polipeptídeos sintetizados em E. Coli são o assunto de um artigo revista por Marston, Bio-chem. J. , (1986) 240, 1-12. Este artigo descreve a purificação de fusão de proteínas com e sem clivagem. Apesar de des -crever largamente um processo de três fases da lise celular, desnaturação e enrolamento, não parece haver solubilização au mentando as concentrações da ureia tamporizada.
Marston et al descrevem um método para a solubilização de proquimosina (F.A.D. Marston, P.A. Lowe, S.W. Schoemaker e S. Angal, "Purification of Calf Pro -chymosin (prorennin) Syntheslized in E. coli", Bio/Technology, 2, páginas 800 a 804 (1984)). Foi obtido uma solubilização óptima usando ureia 8M ou HC1 guanidina 6M.
Foi alcançada a purificação par -ciai de MS2-HIV-fusão de proteínas pela adição de acetona (-70SC) para listatos bacterianos obtidos por tratamento com prensa francesa e sonificação, e o precipitado seco sob pressão reduzida seguido por um processo de purificação de vários passos (Hansen et al"Partial Purification and Substrate Analy-sis of Bacterially Expressed HIV Protease by Means of Monoclo-nal Antibody", EMBO J., 1785-1791, (1988)).
Gaim e Boros, J. Biol. Chem., 263, 14617-14620, (1988), descreve a purificação de lacz-pro fusão de proteína. Para representar grandes quantidades de protease usaram um E. coli promotor de ASN ribosoma e um operador lac. As proteínas insolúveis lacz-pro foram solubilizadas e desenroladas numa solução aquosa contendo ureia 8M e DTT 50 MM para concentrações de 0,2-0,4 *mg/ml. Para enrolar a proteína, a suspensão foi diluída com 1 ml de um tampão contendo Tris 10 mM a um pH de 6,8, enquanto se deixa a suspensão ficar em repouso durante a noite à temperatura ambiente. O método de purificação de MS2--HIV fusão de protease que se segue providencia quantidades da ordem de miligrama de uma preparação de alta pureza de HlV-migração de protease como uma banda simples em SDS PAGE: (a) corpos de inclusão fraccionada contendo MS2-HIV protease fusão de proteina por extracção sucessiva de proteína em soluções contendo ureia 2M, 4M, 6M e 8M, sendo cada extracção -8- realizada durante 90 minutos, (b) enrolamento e clivagem auto-catalítica de MS2-HIV protease fusão de proteína durante uma diminuição gradual em concentrações de ureia a partir de 8M até 1,5M, sob condições de redução a pH = 8, e (c) precipitação de contaminantes de proteína restante por diálise. Os contaminantes podem ser submetidos a diálise num tampão contendo X-100, ureia 1,5M, glicerol e ditiotreitol. Os passos são conduzidos à temperatura ambiente e a preparação de protease solúvel tem uma pureza total superior a 95%. O uso de substratos de peptídeo dansilado tem sido referido no desenvolvimento de ensaios de enzima não-HIV-protease. Por exemplo, o uso de peptídeos dan-silados tem sido referido para colagenase de vertebrados, enzima Λ-amida e glutamlnil ciclase (Bond et al, "A Convenient Fluorescent Assay for Vertebrate Collagenase", Anal. Biochem, 155, 315-321 (1986); Jones et al, "A Fluorometric Assay for Peptidyl Alpha-amidation Activity Using High-Performance Li-quid Chromatography", Anal. Biochem, 168, 272-279 (1988); e Consalvo et al., "A Rapid Fluorometric Assay for N-terminal glutaminyl Cyclase Activity Using High Performance Liquid Chromatography" , Anal. Biochem., 175 131-138 (1988)).
As desvantagens anteriores são ultrapassadas pelo ensaio do presente invento. Este ensaio^do invento pode detectar e quantificar a actividade proteolítica de proteína de HlV-protease e a potência inibidora dos compostos teste. -9-
RESUMO DO INVENTO
Um objectivo do presente invento é providenciar um composto terapêutico activo tratar a SIDA. Outro objectivo do presente invento é providenciar um ensaio sensível rápido para a actividade de HIV protease. Estes objec tivos e outros objectivos, ajudas e vantagens são providenciadas pelo presente invento. 0 presente invento refere-se a um composto activo contendo a fórmula (I) (A1) _(z) -(Y)-A" κ n m em que 0
1 II A* é R -C ou hidrogénio, 1 7 7 ^ 7 1 â R é OR , NR R ou CR R R , 2 3 4 R , R e R , independentemente um do outro, são hidrogénio, um grupo alifático não substituído ou substituído_com 1 a 20 átomos de carbono ou um grupo aromático não substituído ou substituído com 6 a 18 átomos de carbono, em que K é um (1) ou zero (0), com a condição de quando Z for hidrogénio, k ser zero (0). Z é hidrogénio ou resíduo amino- 0 1 II ! , -acido Ser ou Thr ou R -C, em que R é definido como anterior-mente em que n é um (1) ou zero (0), com a condição de quando y for hidrogénio, n é zero (0),
ο 1 11 1 γ é hidrogénio ou R -C, em que R é definido como anteriormente ou um grupo contendo a fórmula
9 em que R é hidrogénio ou um grupo alifático C^-C-^g substituído ou não substituído ou um grupo aromático substituído ou não substituído com 6 a 18 átomos de carbono, em que 0
II o substituinte é -OH, -C , -SH,
ou um grupo aromático com 6 a 18 átomos de carbono, em que R ,
\ V 2 3 , - ' ; . ·,' R e R são como atrás definidos, em que m é um (1) ou zero (0), com a condição de quando E4 for hidrogénio, m ser zero (0), A" é seleccionado a partir de um grupo consisitindo de -E4 - E2
E1-X- Q - S, NR , oxigénio ou a) 2 3 CR κ , b) -E4 - E3 Q'
Q' = N
CR e
-X- C) -E4 - E2· Q" = N ou CR2, em que o símbolo
representa um sistema de anel saturado substituído ou não substituído, que tem 4 a 5 membros em que apenas Q, Q', Q" podem ser diferentes de carbono, em que o substituinte é um grupo alifático C^-C.^ ou um 9ruP° aromático com seis a doze átomos de carbono, -12-
com a condição de quando E for
-13-
-Ν' 4 2 8 - Ε não ser R - 0 - C -, 4 em que E é hidrogénio ou o resíduo 0 1 II' ]_ aminoácido Asn ou R -C-, em que R é como atrás definido, é sabido que outros resíduos aminoácidos naturais e não natu-rais podem ser substituídos por Asn em que R é um grupo aromático substituído ou não substituído com seis a dezoito átomos de carbono ou um grupo alifático substituído ou não substituído com 1 a 18 átomos de carbono, em que X é hidrogénio ou R1 ou um grupo contendo a fórmula
HN .10 em que R^ é um grupo alifático C^-C.^ substituído ou não substituído ou um grupo aromático substituído ou não substituído com 6 a 12 átomos de carbono, em que o substituinte é
O -14-
ou um grupo alif ático C^-C.^ ou um grupo' aromático com 6 a 12 átomos de carbono, em que R é como atrás definido, „10 %, *2 „1 Λ2 , em que R e hidrogénio ou -C-A ou -C-R , em que A e um grupo contendo a fórmula,
R9 9 _ 2 em que R é como atrás definido, e em que R é como atrás definido , e os seus sais ou ésteres farmacêuticamente aceitáveis.
Os compostos referidos anterior-mente podem existir em diferentes formas estereoquímicas. 0 invento refere-se a ambos às formas de isómeros individuais e às suas misturas.
Os compostos activos atrás referidos inibem as actividades proteolíticas de serotipos HIV-1 na poliproteína gag-pol total ou nas suas regiões. O invento é também dirigido a um método de tratamento de um doente infectado com HIV, compreendendo a administração a umtial doente de uma quantidade efec-tiva do composto activo terapêutico atrás referido, ou de um seu sal, ou de um seu éster, só ou em mistura com um diluente. Λ Ν\ Ο presente iiiVènto refere-se também a um ensaio sensível rápido para a detecção de actividade de HlV-protease. 0 ensaio compreende (a) incubação de HlV-protease com um N-Dansil-peptídeo que pode ser clivado proteolíticamente pelo HlV-protease in vitro, sendo a incubação realizada sob condições em que o HlV-protease é activo catalíticamente, <b) submetendo uma porção da mistura resultante (a) a análise por RP-HPLC analítica, (cl resolução do substrato peptídeo não convertido dos produtos peptídeos (Resolução significativas separação completa do substrato não convertido e do produto de modo a ser facilitada a sua quantificação separada) e (d) determinação da quantidade de produtos de peptídeo formados durante um intervalo de tempo conhecido para calcular a actividade de HlV-protease.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Os três pontos de clivagem de
HlV-protease até aqui referidos têm em comum a sequência Thr (Ser)-X-Asn-Y-Pro-Z, em que X é um aminoácido qualquer, Z é um aminoácido lipofílico e Y é quer Tyr quer Phe. Com base nestes pontos de clivagem, podem ser propostos intermediários análogos de alta energia da reacção com actividade inibidora.
Da experiência com outras protea-ses, sabe-se que os intermediários tetrahédricos de alta ener-
ν"Ν gia como (2) apresentados imediatamente' éríi' seguida são formados na via reaccional apresentada abaixo como se segue:
em que JYJ e um enzima proteolítico com ou sem moléculas de 5 o água ligadas, em que R é como atrás definido, e R é um resíduo alifático ou aromático.
De acordo com a Teoria Análoga do Estado de Transição os análogos estáveis de estruturas te-trahédricas como {2) aqui dadas imediatamente atrás devem ligar-se com firmeza ao protease e mostram forte inibição de actividade de protease.
No composto de acordo com o presente invento contendo a fórmula (A1). —(Z) -(Y) -A" (I), k n m
Ο A' é R^-C- ou H, em que R^ é OR^, NR^R^, ou CR^R^R^, em que 2 3 4 . R f R e R são independentes um do outro, hidrogénio, um grupo alifático com 1 a 20 átomos de carbono ou um grupo aro-mático com 6 a 18 átomos de carbono, de preferência R , R e 4 R são independentes um do outro, hidrogénio alquilo-C^-C2Q substituído ou não substituído, alquenilo-C2-C2Q substituído ou não substituído, alquinilo-Cg-C2Q substituído ou não substituído ou aromáticos Cg-C^g, em que os substituintes para os grupos alquilo-, alquenilo- e alquinilo- são seleccionados a partir de um grupo consistindo de alquilo-C^-C^, aromáticos 9, halogénio (por exemplo, cloro, flúor iodo ou bromo); ® , 8 7 8 7
hidroxi; e um grupo amino da fórmula NR R , em que R e R são independente um do outro, hidrogénio, alquilo-C^-C2Q ou oxigénio. Os substituintes para o grupo aromático são alquilo
Cl-C5' aromatÍcos C6-C12' hal°g©ni° (por exemplo, flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxi, o grupo amino atrás referido 8 7 8 7 NR R , em que R e R são como atrás definido, e alquilo C-^-
C 20*
Na fórmula anterior (I), K é um (1) ou zero (Θ), com a condição de quando Z for hidrogénio, K ser zero (0). 0 Zé hidrogénio ou resíduo amino- 1 II η ácido Ser ou Thr ou R -C, em que R é como atrás definido.
Na fórmula anterior (I) n é um (1) ou zero (0), com a condição de quando Y fór hidrogénio, n ser zero (0). 0 i li Y é hidrogénio ou R -C, em que R·*" é como atrás definido, ou um dos seguintes resíduos amino-ácidos: -18-
.S X'
aspártico Asp ;D asparagina Asn N threonina Thr T serina Ser S glutâmico Glu E glutamina Gin Q prolina Pro P glicina Gly G alanina Ala A cisteina Cys C valina Vai V metionina Met M isoleucina Ile I leucina Leu L tirosina Tyr Y fenilalanina Phe F triptofano Trp W lisina Lys K histidina His H arginina Arg R
No composto anterior, m é um (1) ou zero (0) com a condição de quando E^ for hidrogénio, m ser zero (0). Δ" na fórmula (I) é seleccionado a partir de um grupo consistindo de
c
4 2 -E -E
Q=N ou CR2,
0 2 poder ser R -O-C-, 0
4 _ , ]_ II em que R é hidrogénio ou o resíduo aminoácido Asn ou R -Ciem que R é como atrás definido, -20-
em que o símbolo
representa um sistema de anel saturado não substituído, que tem 4 a 7 membros, em que apenas Q pode ser diferente de carbono, em que R é um grupo aromático substituído ou não substituído com 6 a 18 átomos de carbono ou um grupo alifático substituído ou não substituído com 1 a 18 átomos de carbono e de preferência com 1 a 10 átomos de carbono, em que os substituin-tes são seleccionados a partir de um grupo consistindo de al-quilo-C^-Cj., aromáticos Cg-C]_2' hal°Çf®nio (por exemplo, flúor- cloro, bromo ou iodo), hidroxi e um grupo amino de fórmula 8 7 8 7 -NR R', em que R e R são, cada um independentemente do outro, hiirogénio, alquilo C^~C20' oxigénio, alquenilo C2-C20 ou alquinilo-C2~C2Q. Mais preferencialmente, R^ é fenilo, hi-droxifenilo, naftilo, metilo, etilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, butilo-secundário, ciclopentilo ou ciclohexilo. X é hidrogénio, ou R1 ou um grupo contendo a fórmula
HN
R1 2 3 4 5 6 1 2 em que R é um grupo alifático ^y^2 substituído ou não subs 3 tituído ou um grupo aromático não substituído ou substituído com 6 a 12 átomos de carbono preferencialmente o grupo alifáti co para R tem um a sete átomos de carbono, em que o substi -tuinte é 4 0 5 $_r! ou um grupo alifático C-^-C2 ou um grupo aromático com 6 21-
a 12 átomos de carbono. De preferência, o substituinte é 0 C-R"*· ou fenilo, piridilo, naftilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo-secundário ou isobutilo, em que R1 é como atrás definido. 0 0 10 II 2 li 1
Quando R é hidrogénio ou -C-A ou -C-R , R^- é como atrás definido, A é um dos seguintes resíduos aminoacidos ácido aspartico Asp asparagina Asn treonina Thr serina Ser ácido glutâmico Glu glutamina Gin prolina Pro glicina Gli alanina Ala cisteina Cis valina Vai metionina Met isoleucine Ile leucina Deu tirosina Tir fenilalanina Fe triptofano Trp lisina Lys histidina His arginina Arg ou um seu éster alifático C^-C-^g ou éster aromático com o és^ ter aromático contendo seis a dezoito átomos de carbono, e o éster alifático contendo de preferência um a dez átomos de carbono ou uma sua amida alifática C^-C^g ou aromática com a amida aromática contendo seis a dezoito átomos de carbono e a amida alifática contendo de preferência um a dez átomos de cafbono.
Preferencialmente E e E são colocados adjacentes a cada um,
Os grupos preferidos para A" in- cluem os seguintes
CO-X (A) (B) -Asn- Ν'
CO-X-
OH
-23- I i ' .1 (C) (D) (E) (F)
2 em que R para A' e em que 2 é como atrás definido e R é idêntico ou diferente A", é fenilo, p-hidroxifenilo ou ciclohexilo, -24-
1
em que X é hidrogénio ou R ou um grupo contendo a fórmula
R10 g em que R é seleccionado a partir de um grupo consistindo de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo-secundá -rio, isobutilo, ciclohexilo, fenilo, piridilo e é não substituído ou substituído por um grupo que é seleccionado a partir de um grupo consistindo de hidrogénio, 0 -C-R^ ou fenilo, piridilo, naftilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo secundário ou isobutilo, em que R^ é como atrás definido. 1 ο ο
II R10 é hidrogénio ou
or C
R 2 1 em que A e R são definidos como antes.
Os compostos de acordo com o in -vento podem ser preparados por métodos que são conhecidos geralmente na química de petídeos para compostos análogos. Em particular, é para ser compreendido que os compostos reacti-vos não envolvidos numa dada reacção (por ex. , amino, carbox_i lo, hidroxilo, etc.) podem ser protegidos por métodos gerais em quimica de peptídeos antes de reacções de outros grupos e desprotegidos subsequentemente.
Os intermediários de uso na produ ção dos produtos finais são ou compostos conhecidos ou podem ser preparados por métodos como descrito nos Exemplos. -25-
Dentro do âmbito do invento, os substituintes têm, em geral, o seguinte significado:
Alquilo representa em geral um radical hidrocarboneto ramificado contendo 1 a 20 átomos de carbono. Alquilo inferior contendo 1 até cerca de 6 átomos de carbono é preferido. Como exemplos podem ser incluidos o grupo metilo, etilo propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, hexilo, isohexilo, heptilo, isoheptilo, octilo e isooctilo.
Alquenilo representa em geral um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada contendo 2 a 10 átomos de carbono, e uma ou mais, de preferência uma ou duas, ligações duplas. 0 radical alquenilo inferior contendo 2 até cerca de 6 átomos de carbono e uma ligação dupla é preferido. É particularmente preferido um radical alquenilo contendo 2 a 4 átomos de carbono e uma ligação dupla. São exemplos: alilo, propenilo, iso-propenilo, butenilo, isobutenilo, pentenilo, isopentenilo, he-xenilo, isohexenilo, heptenilo, isoheptenilo, octenilo e iso-octenilo.
Alquinilo representa em geral um radical de hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada contendo 2 a 20 átomos de carbono e um ou mais, de preferência uma ou duas ligações triplas. É preferido o radical alquinilo inferior contendo 2 até cerca de 6 átomos de carbono e uma ligação tripla. São exemplos: propinilo, isopropinilo, butinilo, isobutinilo, pentini-lo, isopentinilo, hexinilo, isohexinilo, heptinilo, isohepti-nilo, octinilo e isooctinilo.
Cicloalquilo representa em geral um radical hidrocarboneto cíclico contendo 3 a 20 átomos de carbonos. É preferido o radical cicloalquilo inferior contendo 3 a 8 átomos de carbono. São particularmente preferidos o anel ciclobutano, ciclopen-tano e ciclohexano. São exemplo: ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo e ciclooctilo. -26-
Arilo representa em geral um radical aromático contendo 6 até cerca de 20 átomos de carbono. É preferido o radical arilo inferior contendo 6 a 10 átomos de carbono. São particularmente preferidos os radicais arilo: fenilo, naftilo e bifenilo.
Aralquilo representa em geral um radical arilo ligado via cadeia alquileno e contendo 7 até cerca de 20 átomos de carbono são preferidos os radicais aralquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono na parte alifática e 6 a 12 átomos de carbono na parte aromática. Exemplos de radicais aralquilo incluem benzilo, naftilmetilo, fenetilo e fenilpropilo.
Alcoxi.representa em geral um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada ligado via um átomo de oxigénio e contendo 1 a 20 átomos de carbono. É preferido um alcoxi inferior contendo 1 até cerca de 6 átomos de carbono. É particularmente preferido um alcoxi contendo 1 a 4 átomos de carbono. São exemplos: metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, isopropoxi, bu-toxi, isobutoxi, pentoxi, isopentoxi, hexoxi, isohexoxi, hep-toxi, isoheptoxi, octoxi e isooctoxi. Ãriloxi representa em geral um radical aromático contendo 6 até cerca de 20 átomos de carbono que são ligados através de um átomo de oxigénio. É preferido o radical ariloxilo inferior contendo 6 a 10 átomos de carbono. São particularmente preferidos os radicais ariloxi: fenoxi ou naftioxi.
Aralcoxi representa em geral um radical aralquilo contendo 7 até cerca de 20 átomos de carbono, em que a cadeia de alquileno é ligada através de um átomo de oxigénio. São preferidos os radicais aralcoxi contendo 1 a 6 átomos de carbono na parte alifática e 6 a 12 átomos de carbono na parte aromática. Exemplos de radicais aralcoxi incluem benziloxi, naftilmetilo-xi, fenetiloxi e fenilpropiloxi.
Acilo representa em geral um fenilo ou alquilo inferior de cadeia linear ou ramificada contendo 1 até cerca de 6 átomos -27-
de carbono que são ligados através de,, um grupo carbonilo. São preferidos os radicais fenilo e alquilo contendo até 4 átomos de carbono. São exemplos benzoílo, acetilo, etilcarbonilo, propilcarbonilo, isopropilcarbonilo, butilcarbonilo e isobu-tilcarbonilo.
Alcoxicarbonilo pode ser representado, por exemplo, pela fórmula -C-O-Alquilo
II o onde alquilo representa um radical hidrocarboneto inferior de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 12 átomos de carbono. É preferido o alcoxicarbonilo inferior contendo 1 até cerca de 6 átomos de carbono na parte alquilo. Em particular, são preferidos os radicais alcoxicarbonilo contendo até 4 átomos de carbono. São exemplo: metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, pro-poxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo e isobuto-xicarbonilo.
Ariloxicarbonilo pode ser representado, por exemplo, pela fórmula -GOO- arilo. Aqui arilo representa em geral um radical aromático contendo 6 a 12 átomos de carbono. São exemplos o fenoxicarbonilo e o naftiloxicarbonilo.
Aralcoxicarbonilo pode ser representado, por exemplo, pela fórmula -GGO-aralquilo. Aqui, aralquilo representa em geral um radical arilo contendo 7 a 14 átomos de carbono e ligados através de uma cadeia de alquileno. São preferidos os radicais aralquilo contendo 1 a 6 átomos de carbono na parte alifática e 6 a 12 átomos de carbono na parte aromática. São exemplos o benziloxicarbonilo ou naftilmetiloxicarbonilo.
Heteroarilo no âmbito das definições atrás referidas representa em geraL um anel aromático de 5- a 6-membros que podem conter oxigénio, enxofre, e/ou azoto como o heteroátomo e sobre -28-
o qual pode ser ligado um anel aromático adicional. São preferidos os anéis aromáticos de 5- a 6- membros que contêm um oxigénio, um enxofre, e/ou até 2 átomos de azoto e que são ligados facultativamente ao benzeno. São particularmente preferidos os radicais heteroarilo tienilo, furilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, quinolilo, isoquinoli-lo, quinazolilo, quinoxalilo, tiazolilo, benzotiazolilo, iso-tiazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, pirazolilo e indolilo.
Halogénio representa em geral flúor, cloro, bromo ou iodo, de preferência flúor, cloro ou bromo. O halogénio particularmente preferido representa flúor ou cloro.
Triarilsililo representa em geral um radical sililo que pode ser substituído por três radicais arilo contendo 6 a 12 átomos de carbono e que podem ser iguais ou diferentes. São preferidos o trifenilsililo e o trinaftilsililo.
Trialquilsililo representa em geral um radical sililo que pode ser substituído por três radicais alquilo que podem ser iguais ou diferentes. É preferida a substituição por radicais alquilo inferior contendo 1 atá cerca de 6 átomos de carbono. São particularmente preferidos o metilo, etilo, propilo, isopropi-lo, butilo, butilo secundário, isobutilo, butilo terciário, pentilo, neopentilo, hexilo e t-hexilo. A descrição de intermediários que se segue definida pela fórmula (III) para a produção de compostos terapêuticos de acordo com a fórmula (I) emlque A" representa o grupo preferido (B) como atrás definido. Sabe-se também que os intermediários definidos pela fórmula (III) podem ser utilizados para a produção de compostos terapêuticos definidos pela fórmula (I) em que A" representa (c) e Q=N. 0 presente invento providencia os compostos descritos pela fórmula geral III. -29-
Ν"
e os seus sais 11 , 12 12 13 12 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR - r13j-,14 g^R12^13^14 e z, ^ Zero (0) ou um (1); se z1 é zero 11 11 17 R é hidrogénio e R e R não representam uma ligação simples; se Z1 é um, R^ não é hidroxilo 12 13 14 em que R , R e R representam xndependentemente um do outro hidroxilo ou alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes do referido alquilo, cicloalquilo, arai quilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, he-15 16 teroarilo, NR R , hidroxi, alcoxi ariloxi, aralcoxi em que R1'*, R^ representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo ou cicloalquilo ou arilo ou aralquilo ou heteroarilo 1 c *1 c ou R e R representam juntamente uma cadeia alquilo com dóis a dez átomos de carbono que podem ser substituídos por grupos alquilo 11 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17
em que M1 representa OR em que R^^ representa hidrogénio ou CR^R^R"*"4 ou SiR^2R^3R^4 ou CO-R^3 em que R^2 , R^3, R^"4 são atrás definidos mas podem ser escolhidos independentemente 18 ✓ 12 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou cr12r13r14 em que R , R , R sao atras definidos 17 11 ou R e R representam juntamente uma ligação simples. 17 23 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 em que R , R são atrás definidos ,25 ou M‘ e R representam juntamente uma ligação simples 19 20 21 em que R , R , R representam hidrogénio ou alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo não substituído ou substituído ou arilo não substituído ou substituído ou hete-roarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes são escolhidos a partir de um grupo consistindo de COR^ , NR‘LDRJ' , SR1 , arilo, heteroarilo, alquilo, cicloalquilo, halogénio, hidroxi, alcoxi, ariloxi ou um grupo contendo a fórmula r15r16 NC(=NH)NH-
22 , 12 em que R representa hidrogénio ou OR 12 13 12 13 14
ou NR R ° ou CR R R em que R·*·^, R^^, R^ são atrás definidos
V 3.5 X 6 ν em que R^ e R1, são atr'ã's definidos 23 , 12 13 14 12 13 14 em que R representa hidrogénio ou SiR ^RxoR ou CR k^R·1- 22 ou COR ou arilo ou heteroarilo 12 13 14 22 em que R , R , R , R^ são atras definidos 23 17 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 , 24 em que R e R são atras definidos em que R re- 25
presenta OR 25 em que R representa alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, hetero-3.5 16 arilo, NR R , hidroxi, alcoxi, ariloxi, hete-roariloxi em que R^, R"^ representam independentemente um do outro hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo 24 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 12 13 12 13 em que X1 representa CR R ou R C=CR ou C=C 12 13 em que R e R são atrás definidos em que m' representa um número entre zero (0) e dez (10), e 2^m'+n'+p,<8 em que Y' representa O ou S ou NR^ ou R^R^N+ ou SiR^R^ 12 13 12 13
ou CR R ou R C=CR ou C=C 12 13 em que R , R são atrás definidos em que n' representa um número entre zero (0) e dez (10), 2<m,+n,+p'^8 12 13 12 13 em que Z' representa CR R ou R C=CR ou C=C 12 13 em que R e R são atrás definidos em que p' representa um número entre zero (0) e dez (10), e 2<m1 +n' +p'<_8. 0 presente invento providencia compostos da fórmula geral III e os seus sais 11 , . _ , __ 12 _13_14 12_13 — 14
em que R representa hidrogénio ou CR R R ou SiR R R 11 z1 é zero (0) ou um (1); se z1 é zero, R é hidrogénio 11 17 e R e R não representam uma ligação simples; se z' é um, Rx não é hidroxilo 12 13 14 em que R , R , R representam independentemente um do outro hidrogénio alquilo inferior não substituído ou substituído cicloal-quilo inferior não substituído ou substituído arilo inferior não substituído ou substituído, heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituintes do referido grupo alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de ha- logénio, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, X5 16 arilo inferior, heteroarilo inferior, NR R , hi-droxi, alcoxi inferior, ariloxi inferior, aralqui-loxi inferior, em que R15, R16 representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior ou aralquilo inferior ou heteroarilo inferior ou R3"8 e R16 representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a* seis átomos de carbono que podem ser substituídos por alquilo inferior 11 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17
em que M' representa OR em que R"^ representa hidrogénio ou CR^R^R14 ou SxR12r13r14 ou CO-íR18 12 13 14 em que R , R , R são atrás definidos mas po-
dem ser escolhidos independentemente em que R 18 -33-
18 ' * / 2 em que R representa hidrogénio ou OR 12 13 12 13 14 12 13 14 ou NR R J ou CR^R JRiq em que R , R , R^4 são atrás definidos 17 11 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17 23 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 em que R , R são atrás definidos 25 ou M1 e M representam juntamente uma ligação simples 19 20 em que R e R representam hidrogénio ou alquilo inferior ou 21 arxlo inferior ou heteroarilo inferior em que R representa hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior não substituído ou substituído ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos grupos são es- 22 colhidos a partir de um grupo consistindo de COR , NR R , SR"*· , arilo inferior, heteroarilo inferior, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, halogénio, hidroxi, alcoxi inferior, ariloxi inferior, aralqui-loxi inferior, ou um grupo contendo a fórmula R15R16NC(=NH)NH- 22 , 12 12 13
em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR12R13R14 „12 „13 „14 ~ , , -. . em que R , R , R sao atras definidos 15 16 em que R"*" e R·*" são atrás definidos em que r23 j-gpregen-tam hidrogénio ou SiR-*-2R13R14 ou cr12$13r14
22 ou COR ou arilo inferior ou heteroarilo inferior 12 π 13 π 14 _22 ~ , / -i ~, . - em que R , R , R , R sao atras definidos 23 _ 15 , , 12—13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 , 24 em que R e R são atras definidos em que R repre- 25
senta OR 25 em que R representa alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de alquilo inferior, cicloalquilo inferior, arilo inferior, aralquilo inferior, ou heteroarilo 24 17 ou R e R representam juntamente uma ligaçao simples em que X1 representa CR^2R^ ou R^2C=CR·^ ou C^c 12 13 em que R e R são atrás definidos em que m' representa um número entre zero (Θ) e cinco (5) e 2<m'+n'+p'<8 12 1? 13 + em que Y1 representa 0 ou S ou NR ou R R ΚΓ ou _ .12n13 _,_.12_,13 n12^ ^_13
SiR R ou CR R ou R C=CR ou C=C em que n' representa um número entre zero (0) e cinco (5 ) e 2<m ' +n ' +p'!:£8 12 13 12 13 em que Z' representa CR R ou R C=CR ou C=C 12 13 em que R , R sao atras definidos em que p' representa um número entre zero (0) e cinco (5) e 2<m1+n1+p'£8 0 presente invento providencia compostos da fórmula geral III e os seus sais em que
Rll
representa hidrogénio ou OR 12 ou NR12r13 ou -35- cr12r13r14 ou sír12r13r14 em que z' é zero (0) ou um (1); se z1 e zero, 11 , , 11 17 R é hidrogénio e R e R não representam , 11 uma ligação simples; se z' e um, R não é hi-droxilo 12 13 14 em que R , R , R representa independentemente um do outro hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo ou ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou fenilo, tolilo, naftilo ou piridilo, furilo, tienilo ou benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpropilo 11 17 ou R e R representam juntamente uma ligaçao simples 17
em que M' representa OR 17 12 13 14 em que R representa hidrogénio ou CR R R ou
SiR12R13R14 ou CO-R18 em que R"*"2, R^3, R^4 são atrás definidos mas po- 18
dem ser escolhidos independentemente em que R 12
representa hidrogénio ou OR 1213 1201314
ou NR R ou CR R R em que R12, R^3, R14 são atrás definidos 17 11 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17 23 ou R e R representam juntamente um gru-
12 13 po CR R 12 13 em que R , R são atrás definidos 25 M' e R representam juntamente uma ligaçao simples 19 em que R representa hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo, hexilo, fenilo, naftilo, em que R20 representa hidrogénio 21 em que R representa hidrogénio ou metilo não substituído ou substituído, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo, hexilo, ou ciclopropilo não substituído ou substituído, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexi-lo ou fenilo não substituído ou substituído, tolilo, naftilo ou piridilo não substituído ou substituído, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo ou benzilo não substituído ou substituído, naftilmetilo, fene-tilo, fenilpropilo em que os substituintes dos referidos grupos são esco- 22 lhidos a partir de um grupo consistindo de COR NR^R^ , SR1 , fenilo, naftilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo, imidazolilo, benzimidazoílo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo-secundário, pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, halogénio, hidroxi, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, fenoxi, naftoxi, benziloxi,naf-tilmetoxi ou um grupo contendo a fórmula r15r16 NC(=NH)NH-
22 , 12 em que R representa hidrogénio ou OR M 12„13 _ 12„13„14
ou NR R ou CR R R
12 „13 „14 em que R , R , R são atrás definidos em que R^“* e R^ são independentemente um do outro hidrogénio, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, fenilo, naftilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpropilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo 15 16 ou R e R representam juntamente uma cadeia de alqui- -37-
lo com dois a cinco átomos de carbono 23 , 12 13 14 em que R representa hidrogénio ou SiR RR ou CR^R^R"^ ou COR22 ou fenilo ou naftilo „12 „13 14 „22 > em que R , R , R , R sao atras definidos 23 17 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R „12 „13 „24 em que R e R sao atras definidos em que R representa OR23 25 em que R representa metilo, etilo, propilo, isopro-pilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, ciclopropilo, ci-clobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo, tienilo, furilo, piridilo, fluorenilmetilo, benzilo, naftilmetilo, fe-netilo, fenilpropilo, 24 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples em que X' representa CR^R3"3 ou RC^^CR3 ou C=C 12 13 em que R e R são atrás definidos em que m' representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<m'+n'+p' <6 12 12 13 + em que Y' representa O ou S ou NR ou R R N ou SiR12R13 ou CR12R13 ou RC12=CR13 ou CsC 12 13 em que R , R são atrás definidos em que n' representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<m' +n1 +p"4 5 em que Z' representa CR12R13 ou R12C=CR13 ou C=c 12 13 · , em que R , R são atras definidos em que p' representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<m'+n'+p,2.8.
Exemplo 1 de fórmula III 1-0-(t-butildifenilsilil)oxi-4-butanol
Foi adicionado gota a gota uma solução de 27 gramas (0,300 mol) de 1,4-butanodiol em 200 ml de tetrahidrofurano anidro a uma suspensão agitada vigorosamente de 9 gramas de uma dispersão a 80% de hidreto de sódio em óleo mineral (0,300 mol) em 400 ml de tetrahidrofurano anidro a 20õC sob árgon. A suspensão foi agitada durante 2 horas, depois foi adicionada gota a gota uma solução de 82,4 gramas (0,300 mmol) de terc.-butilclorodifenilsilano em 100 ml de tetra-hidrofurano anidro e agitou-se durante 16 horas. A reac-ção foi arrefecida pela adição de 450 ml de carbonato de sódio (10% p/p) e agitou-se durante 10 minutos. Foram adicionados 300 ml de hexano e as camadas separadas. A camada orgânica foi extraída com 450 ml de carbonato de sódio (10% p/p), seca com sulfato de sódio, filtrado e concentrada ao vácuo para dar 97 gramas (98,3%) de produto impuro sob a forma de um resíduo. Este resíduo foi usado sem purificação adicional.
Rf (1:1 éter de petróleo/éter etílico): 0,55 C20H28°2Si <328,42)
Exemplo 2 de fórmula III 1-0- (t-butildif enilsilil) oxi-4-0-(p-toluenosulf onil) oxi-butano
Foi adicionado gota a gota uma solução de 97 gramas (0,295 mol) do álcool anterior em 200 ml de diclorometano anidro a uma solução agitada vigorosamente de 56,3 gramas (0,295 mol) de cloreto de p-tòlueno sulfonilo, 9 gramas (0,074 mol) de 4-dimetilaminopiridina, 45 ml (0,323 mol) de trietilamina em 500 ml de diclorometano anidro a 02C sob árgon. A reacção foi arrefecida até -202C durante 18 horas, depois aquecida até +202C e foram adicionados 500 ml de água desionizada e agitou-se vigorosamente durante 20 minutos. O pH foi ajustado para 3 com ácido clorídrico concentrado e as camadas foram separadas. A fase orgânica foi seca com sulfato de magnésio, filtrada e concentrada ao vácuo para dar 144 gramas de resíduo amarelo. 0 produto impuro foi cromatografado em 800 gramas de sílica gel (60 um) com tolueno para dar 120,6 gramas (84,7%) do produto.
Rf (tolueno): 0,51 C27H34°4SiS: 482'62
EXEMPLO 3 de fórmula III
Tosilato de /^-0-(t-butildifenilsilil)oxi7butil-trifenil fos-fónio
Foram adicionados 65,5 gramas (0,250 mol) de trifenilfosfina a um vaso reaccional contendo 120,6 gramas (0,250 mol) do composto anterior sob árgon. O vaso foi aquecido até 1002C durante 36 horas e depois arrefecido até 202C. Foram adicionados 35 ml de tolueno anidro e aqueceu-se para se obter o material solidificado em solução. Foram adicionados 250 ml de éter de petróleo e a reacção foi arrefecida até 20SC. A fase líquida foi removida e a fase sólida foi seca ao vácuo para dar 169,9 gramas (91,2%) do produto sob a forma de um sólido branco. C45H49°4PSi: 744'91
Exemplo 4 de fórmula III 2-N-(t-butoxicarbonil)amino-3-fenilpropanol
Foram adicionados 9,33 gramas (0,245 mol) de hidreto de alumínio e lítio em pó durante 15 minutos a uma solução agitada vigorosamente de 5^,0 gramas (0,175 mol) de terc.-butoxicarbonil-L-fenilalanina N-metoxi--N-metilamida em 1,8 litros de éter etílico a 20QC sob árgon. A suspensão foi agitada durante 2 horas, depois foi adicionado 900 ml de hidrogenosulfato de potássio aquoso (0,34 M) a 5QC e agitou-se durante 10 minutos. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi lavada com 6 litros de éter etílico.
As camadas etéreas foram combinadas, concentradas ao vácuo até 2 litros e extraídas com ácido clorídrico 3N (3x650 ml) com hidrogenocarbonato de sódio saturado (2x1 litro) e com cloreto de sódio saturado (1 litro). A camada etérea foi seca com sulfato de magnésio, filtrada e concentrada para dar 39,0 gramas (89,3%) de produto impuro sob a forma de um óleo. De acordo com a análise de RMN-^H o produto impuro continha 65% do composto indicado em título. Este produto foi usado sem purificado em adicional.
Rf (1:1 de acetato de etilo/hexano): 0,71 C14H19N03: 249,31
Exemplo 5 de fórmula III (Z)-2-N-(t-butoxicarbonil)amino-7-0-(t-butildifenilsilil)oxi--1-fenil-3-hepteno
Foi adicionado durante 40 minutos uma solução de 20,27 gramas (0,105 mol) de bis(trimetilsilil)-amida de sódio (95%) em . 100 ml de tetra-hidrofurano a uma solução agitada de 78,2 gramas (0,105 mol) de tosilato de £4-0--(t-butildifenilsilil)oxi/butil-trifenilfosfónio em 700 ml de tetra-hidrofurano anidro a -802C sob árgon. Depois de aquecer até 0°C durante 100 minutos, a mistura foi arrefecida até -80QC. Isto foi adicionado durante 75 minutos a uma solução agitada de 39,0 gramas (0,101 mol) do aldeído anterior em 100 ml de tetra-hidrofurano anidro a -802C. A mistura foi aquecida até 209C e agitada durante 1 hora. Foram adicionados 18 gramas de celite e 200 ml de hexano e depois filtrou-se através de 55 gramas de celite em 800 ml de hexano. O suporte foi lavado com 400 ml de hexano. Os filtrados foram combinados e concentrados ao vácuo para dar 96 gramas de um sólido côr de laranja. O material impuro foi cromatografado em 500 gramas de sílica gel (60 um) com uma mistura 3:1 de éter de petróleo/diclorometano para dar 32,2 gramas (56%) do produto indicado em título.
Rf (tolueno): 0,50 C34H45N03SÍ: 543>82
Exemplo 6 de fórmula III (Z)-2-N-(t-butoxicarbonil)amino-l-fenil-3-hepteno-7-ol
Foi adicionado durante 5 minutos uma solução de 19,88 gramas (0,063 mol) de fluoreto tetra-bu-tilamónio trihidratado em 150 ml de tetra-hidrofurano a uma solução agitada de 30,55 gramas (0,056 mol) do composto anterior em 200 ml de tetra-hidrofurano a 0QC sob árgon. Depois de 5 horas foram adicionados 100 ml de ácido acético 0,063N e 200 ml de hexano. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com 100 ml de hexano. As camadas orgânicas foram combinadas e extraídas com 125 ml de hidrogeno carbonato de sódio saturado, com 75 ml de cloreto de sódio saturado, seco sulfato de magnésio, filtrado e concentrado ao vácuo para se obter 33,22 gramas de um resíduo amarelo. O produto impuro foi cromatografado em 150 gramas de sílica gel 60 (pn) com uma mistura 10:1 de diclorometano/metanol para dar 12,7 gramas (74%) de produto indicado em título sob a forma de um sólido esbranquiçado.
Rf (1:1 de éter de petróleo/éter etílico): 0,32. C18H27N03: 305'56·
Exemplo 7 de fórmula III (Z)-2-N-(t-butoxicarbonll)amino-l-fenil-7-0-(p-toluenosulfonil)--oxi-3-hepteno -43- /
Foram adicionados 7,55 ml (0,054 mol) de trietilamina, 1,27 gramas (0,010 mol) de 4-dimetilami-nopiridina a uma solução agitada de 12,7 gramas (0,042 mol) do álcool anterior em 250 ml de diclorometano anidro a -12C sob árgon. Foram adicionados 8,90 gramas (0,046 mol) de cloreto de p-toluenossulfonilo em 100 ml de diclorometano anidro e agitou -se durante 15 horas. Foram adicionados 25 ml de água desiioni zada e agitou-se vigorosámente durante 20 minutos. Foi adicionado 100 ml de ácido clorídrico 0,24 N. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi extraída com 100 ml de ácido clorídrico 0,12N, com 100 ml de hidrogeno carbonato de sódio saturado, seca com sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até se obter 19,9 gramas de um resíduo amarelo. O material impuro foi cromatografado em 130 gramas de sílica gel (60 um) com uma mistura (10:1) de diclorometano/metanol para dar 17,3 gramas (90%) do produto indicado em título como um sólido esbranquiçado.
Rf (1:1 de éter de petróleo/éter etílico): 0,57 C25H33N05S: 459'67·
Exemplo 8 de fórmula III 2-N-(t-butoxicarbonil)amino-3,4-epoxi-l-fenil-7-0-(p-tolueno-sulfonil)oxi-heptano
Foram adicionados 1,4 litros de ácido 3-cloroperbenzóico (0,12 N em diclorometano) a 17,3 gramas (0,038 mol) do composto anterior e agitou-se a 209C sob árgon. Depois de todo o material inicial ter sido usado (controlo por TLC), foi adicionado 500 ml de tiosulfato de sódio -44- 1Ν e agitou-se durante 15 minutos. As camadas foram separadas e a fase orgânica foi extraída com 250 ml de hidrogeno carbonato de sódio saturado, 400 ml de hidrogenocarbonato de sódio saturado a 50%, 600 ml de cloreto de sódio saturado, seca com sulfato de magnésio, filtrada e concentrada ao vácuo até se obter um resíduo amarelo. O produto impuro foi cromatografado em 700 gramas de sílica gel (60 jim) equilibrado em éter de petróleo. A coluna foi eluída com um gradiente de éter de pe-tróleo/diclorometano/éter etílico para dar 9,76 gramas (55%) do produto indicado em título sob a forma de um sólido amarelo claro.
Rf (1:1 de éter de petróleo/éter etílico): 0,29 C25H33N06S: 475'67·
Exemplo 9 de fórmula III. 7-azido-2-N-(t-butoxicarbonil)amino-3,4-epoxi-l-fenil-heptano
Foram adicionado 1,09 gramas (0,022 mol) de azida de lítio a uma solução agitada de 9,6 gramas (0,020 mol) do composto anterior em 60 ml de dimetil-formamida anidra a 20QC sob árgon. Após 18 horas a reacção foi concentrada ao vácuo até se obter um resíduo preto, dissol vido em 200 ml de diclorometano anidro e extraído com hidroge-carbonato de sódio saturado (4 x 200 ml), com cloreto de sódio saturado (125 ml) seco sobre sulfato de magnésio, filtrado e concentrado ao vácuo para dar 7,35 gramas (105%) do produto impuro sob a forma de um sólido castanho claro. De acordo com a análise de RMN o produto impuro continha 95% do composto indicado em título e foi usado sem purificação adicional.
Rf (1:1 de éter de petróleo/éter etílico): 0,50 C18H26N4°3: 346·43·
Exemplo 10 de fórmula III 2-/~2-N- (t-butoxicarbonil)amino-l-hidroxi-3-feniljpropil-pirro-lidina
Foram adicionados 0,339 gramas de 5% de paládio em carbonato de cálcio a uma solução de 0,97 gramas (0,0028 mol) do composto anterior em 50 ml de etanol (graduação 200). O vaso reaccional foi evacuado e cheio 3 vezes com azoto gasoso e agitado vigorosamente. Fez-se borbulhar azoto gasoso através do vaso à pressão de 1 atmosfera durante 1 hora e depois a mistura reaccional foi filtrada através de 5 gramas de celite. O suporte foi lavado com 30 ml de dicloro-metano. Os filtrados foram combinados e concentrados até se obter 1,23 g de um resíduo preto. O produto impuro foi croma-tografado em 89 gramas de sílica gel (60 pn) com um gradiente de diclorometano/metanol/amónia para dar 0,44 gramas (50%) do produto indicado em título sob a forma de um sólido branco.
Rf (5:1 de diclorometano/metanol): 0,15 C18H26N2°3: 320'43 13C-RMN 300MHZ (COCl2)g = 26,69; 28,72; 28,97; 40,12; 46,44; 54,09; 61,77; 73,06; 79,32; 126,73; 128,88; 130,06; 139,49; 156,33. A descrição de intermediários que se segue é definida pela fórmula (IV) para a produção de com- -46-
postos terapêuticos de acordo com a fórmula XI) em que A" representa o grupo preferido (C) como atrás definido. Sabe-se também que os intermediários definidos pela fórmula (IV) podem ser utilizados para a produção de compostos terapêuticos definidos pela fórmula (I) em que a fórmula A" representa (a) e (c) em que se A" é (c), Q=CR e R é atrás definido.
O presente invento providencia compostos descritos pela fórmula geral IV
e os seus sais 11 , 12 12 13 12 13
em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR R R14 ou SiR1 W4 12 13 14 em que R , R , R independentemente um do outro representam hidrogénio ou alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo substituído ou não substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de ha-
logénio, alquilo, cicloalquilo;,* arilo, heteroari-15 16 lo, NR R , hidroxi, alcoxi, ariloxi, aralcoxi em que R3"8, R"*"8 representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo ou cicloalquilo ou arilo ou aralquilo ou hete-roalquilo ou R3"8 e R3"8 representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a dez átomos de carbono que podem ser substituídos por grupos alquilo 11 17 ... ou R e R representam juntamente uma ligaçao simples 17
em que M1 representa OR 17 12 13 14
em que R representa hidrogénio ou CR R R ou SiR12R13R14 ou CO-R18 em que R , R , R sao atras definidos mas podem ser escolhidos independentemente 18 12 em que R representa hidrogénio ou OR ou M„12„13 „121314 „12 „13 „14
NR R ou CR R R em que R , R , R são atrás definidos 17 11 ou R e R representam juntamente uma ligação 17 23 simples ou R e R representam juntamente um 12,, 13
grupo CR R 12 13 em que R , R são atrás definidos 25 ou M' e R representam juntamente uma ligação simples em que 19 20 21 R , R , R representa hidrogénio ou alquilo não substituído ou cicloalquilo não substituído ou substituído ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes são escolhidos a partir de um grupo consistindo de COR22, NR^R3"8, SR3-8, arilo, heteroarilo, alquilo, cicloalquilo, halogénio, hidroxi, alcoxi, ariloxi ou um grupo contendo a fórmula -48-
r15r16nc(=nh)nh- em ou 22 , 12 que R representa hidrogénio ou OR CR12R13R14
ou NR 12r13 em que R^2, R13, R3-4 são atrás definidos 15 16 em que R e R são atrás definidos 23 „ 12 13 14 em que R representa hidrogénio ou SiR RR ou CR^2R^3R^4 ou COR22 ou arilo ou heteroarilo em que R , R , R , R sao uteis e atras definidos 23 17 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 em que R e R são atrás definidos· 24 25
em que R representa OR 25 em que R representa alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, 15 16 heteroarilo, NR R , hidroxi, alcoxi, arilo-xi, heteroariloxi em que R3-3, R^ representam independentemente um do outro hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo 24 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples
em que X- representa CR12R13 ou R12C=CR13 ou C=C 12 13 em que R e R são atrás definidos em que m' representa um número entre zero (0) e dez (10), e -49-
2^m'+n'+p'<8 em que Y' representa 0 ou S ou NR12 ou R12R13N+ ou SiR12R13 12 13 ou R CsCR ou C=C 12 13 em que R , R são atrás definidos em que n' representa um número entre zero (0) e dez (10), e 2<.m ' +n 1 +p"<8 em que Z' representa CR12R13 ou R12C=CR13 ou C=C 12 13 em que R , R são atrás definidos em que p' representa (0) e dez (10), e 2<m 1+n 1+p' <8 .
Este invento providencia os compostos descritos pela fórmula geral IV e os seus sais 11 12 12 13 12 13
em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR R R14 ou SiR12R13R14 12 13 14 em que R , R , R representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior substituído ou não substituído ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes de tais grupos alquilo cicloalquilo, aralquilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, arilo inferior, heteroarilo infe-rior, NRX3R'l , hidroxi, alcoxi inferior, arilo-xi inferior, aralquiloxi inferior _15 _16 , . , em que R , R representam mdepen- dentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior ou aralquilo inferior ou heteroarilo inferior -50-
„15 „16: . , · . ou R e R representam junta- mente uma cadeia de alquilo com dois a 6 átomos de carbono que podem ser substituídos por alquilo inferior 11 17 ou R e R representam juntamente uma ligaçao simples 17
em que M' representa OR em que R1^ representa hidrogénio ou CR1^R13R'*'^ _ . -.12-,13-14 „18
ou SiR RR ou CO-R
„12 „13 „14 em que R , R R~" são átrás definidos mas podem ser escolhidos independentemente
18 , 12 èm que R representa hidrogénio ou OR m_12_13 „„12„13„14
ou NR R OU CR R R são atrás definidos „12 „13 „14
em que R , R , R
ou R 17 11 . . e R representam juntamente uma lxgaçao simples. 17 23 . 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R ,12 em que R sentam juntamente uma ligação simples 13 , 25 R são atrás definidos ou M' e R repre- 19 20 / em que R e R representam hidrogénio ou alquilo inferior 21 em que R representa hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou cicloalquilo inferior não substituído ou substituído ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituintes dos referidos grupos escolhi- 22 dos a partir de um grupo consistindo de COR , 1516 15 NR R , SR , alquilo inferior, heteroarilo inferior, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, halogénio, hidroxi, alcoxi inferior, ariloxi inferior, aralqui-loxi inferior, ou um grupo com a fórmula r15r16nc(=nh)nh-
22 12 em que R representa hidrogénio ou OR .τπ12 13 12„13„14
OU NR R ou CR R R em que R , R , R sao atras definidos 1S 16 em que R e R são atrás definidos 23 , . 12 13 14 12 13 14
em que R representa hidrogénio ou SiR R R ou CR RR 22 ou COR ou anlo inferior ou heteroarilo inferior em que , R^, são atrás definidos 23 15 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR‘LZRX 12 13 * em que R e R são atrás definidos
24 25 em que R representa OR 25 em que R representa alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituíntes dos referidos grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de alquilo inferior cicloalquilo inferior, arilo inferior, aralquilo inferior, ou heteroarilo inferior 24 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 12 13 12 13 em que X' representa CR R ou R C=CR ou C=C 12 13 / em que R e R são atrás definidos em que m1 representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 12 -52- 2<_m1 +n 1 +p' <8
em que Y1 representa 0 ou S ou NR π12π13.τ+ _.„12_13 _,π12π13 _12„ „„12 ou R R N ou SiR R ou CR R ou R C=CR ou
CsC 12 13 em que R , R são atrás definidos em que n1 representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<m,+n,+p"£8 12 13 12 13 em que Z1 representa CR R ou R C=CR ou Csc 12 13 em que R , R são atrás definidos em que p1 representa um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<_m 1 +n 1 +p1 < 8
Este invento providencia os compostos descritos pela fórmula geral IV e os seus sais 11 , ' 12 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR1 W4 ou Si^W4 12 13 14 em que R , R , R representam mdependentemente um do outro hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopro-pilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo ou ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou fenilo, tolilo, naftilo ou piridilo, furilo, tienilo ou benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpropilo 11 17 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17
em que M' representa OR em que R representa hidrogénio ou CR R R ou SiR12R13R14 ou CO-R18 12 13 14 em que R , R , R sao atras definidos mas 18 12 em que R representa hidrogénio ou OR ou podem ser escolhidos independentemente 18 em que R representa Nr12r13 ou CR12R13R14 -53-
„12 „13 „14 'JJ , ,-. ., em que R , R , R sao atras definidos 17 11 ou R e R representam juntamente uma ligação simples 17 23 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 em que R , R são atrás definidos 25 ou M1 e R representam juntamente uma ligação simples 19 , em que R representa hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo secundário, isobutilo, pentilo,he-xilo, fenilo, naftilo, em que R^ representa hidrogénio 21 am que R representa hidrogénio ou metilo não substituído ou substituído, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário pentilo, hexilo, ou ciclopropilo não substituído ou substituído, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ou fenilo não substituído ou substituído, tolilo, naftilo, ou piridilo não substituído e substituído, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo ou benzilo não substituído ou substituído, naftilmetilo, fene-tilo, fenilpropilo em que os substituintes dos referidos grupos são es- 22 colhidos a partir de ura grupo consistindo de COR , NR^R·*·®, SR"^, fenilo, naftilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo, imidazolilo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, halogénio, hidro-xi, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, fenoxi, naftoxi, benziloxi, naftilmetoxi ou um grupo com a fórmula R15R16NC(=NH)NH- 12 -54- em ou
„22 que R 12 13 NR R em que dos
representa hidrogénio ou OR ou CR12R13R14
R 12
R 13
R 14 são atrás defini- em que R^3 e R"*"3 são independentemente um do outro hidrogénio, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, pentilo, ciclopropilo, ciclo-butilo, ciclopentilo, fenilo, naftilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpro-pilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furi-lo, tiazolilo, X5 16 ou R e Rx representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a cinco átomos de carbono 23 . , ., , ._12_13_14 12„13_14
em que R representa hidrogénio ou SiR RR ou CR R R 22 ou COR ou fenilo ou naftilo „12 _,13 „14 „22 ~ em que R , R , R , R sao atras definidos 23 17 12 13
ou R e R representam juntamente um grupo CR R 12 13 em que R e R são atrás definidos „24 . „„25
em que R representa OR 25 em que R representa metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo secundário, ci-clopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo, tienilo, furilo, piridilo, fluo-renilmetilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fe-nilpropilo, 24 27
ou R e R representam juntamente uma ligação simples em que X' representa CR^R3-3 ou R^2C=CR^3 ou C=C 12 i3 em que R e R são atrás definidos em que m' representa um número entre zero (0) e dois (2), e 2<m 1 +n1 +p '<6 -55-
ν
_,d12d13 ou SiR R
em que Y' representa 0 ou S ou NR 12 13 2 13
ou CR R ou R C=CR ou CsC 12 13 em que R , R são atrás definidos em que n' representa um número entre zero (0) e dois (2), e 2<m'+n'+p"<6 12 13 12 13 em que Z' representa CR R ou R C=CR ou C=c 12 13 em que R , R são atrás definidos em que p' representa um número entre zero (0) e dois (2), e 2^m1+n1+p1<6 O presente invento providencia
um processo para a preparação de compostos descritos pela fórmula IV caracterizado por se fazerem reagir os compostos da fórmula geral V
em que X', Y', Z', são atrás definidos em que m', n' , p' são atrás definidos 12 13 em que R , R são atras definidos em que L , L , L , L , L , L representam mdependente- 12 12 13 mente um do outro hidrogénio ou halogénio ou OR ou NR R ou CR12R13R14 ou PR12R13R14 ou NR12R13R14 -56-
ou ciclopentadienilo substituído ou não substituído ou arilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído
em que R 12 „13
R 14 são atrás definidos ou dois (2) 08 dos substituintes referidos representam juntamente L,10 a09). em que , L"^ representam independentemente um do 12 12 13 12 13 12 outro OR , NR R , PR R , NR em que R^^, R^ são atrás definidos 09 12 13 em que L representa CR R 12 13 em que R R são atrás definidos e se j >1 os substituintes dos diferentes átomos de carbono podem ser escolhidos independentemente em que j representa um número entre um (1) e cinco (5) em que a, b, c, d, e, f, representam independentemente um do outro um número entre zero (0) e seis (6), e a +b+c +d+e+f +h =?n em que n representa um número entre dois (2) e dez (10), e n não deve exceder à número máximo de ligandos para um dado núcleo metálico, em que M representa lítio, sódio, potássio, boro, magnésio, alumínio, silício, titânio, vanádio, crómio, manganês, germâ-nio, zircónio, nióbio, molibdénio, estanho, antimónio, lantanídeos, háfnio, tântalo, tungsténio, rénio em que g representa um número entre um (1) e cinco (5), e se g>l M pode representar mais do que um metal
em que h representa um número entre um (1) e cinco (5) com aldeídos ou cetonas de fórmula VI
-5 7-
_19 η20 „21 _23 „4 ~ em que R , R , R , R , R sao atras defxnidos em solventes inertes, seguido por oxidação sob condições ací- dicas.
Os compostos de acordo com a fórmula V utilizados como materiais iniciais são conhecidos ou podem ser preparados por métodos conhecidos, por exemplo pela reacção de ésteres da fórmula VII ou VIII com uma base que pode ser seguida pelo tratamento com um composto de fórmula IX contendo metal
(z')p'"(y \ 1 \ 1 (x)m í (x')m /NRI2R13 °-C t /N RI2r13 0_\ 0 0 vTF ML -58-
(L01) (L02) (L03) (L04) (L05) (L06) M (L°7) a b c d e f g 1
IX 12 13 em que R , R são atras definidos em que X', Y', Z' são atrás definidos em que m,,n', p' são atrás definidos om t01 r02 r03 t04 r05 r06 ~ 4- ^ , .. .. em que L , L , L , L , L , L sao atras definidos em que M é atrás definido 07 12 · 12 13 em que L representa halogénio ou OR ou NR R ou cr12r13r14 ou pr12r13r14 ou nr12r13r14
em que R 12
R 13 R14 são atrás definidos, em que a, b, c, d, e, f, g são atrás definidos em que i representa um número entre zero (0) e cinco (5). e a+b+c+d+e+f+i=u em que n representa um número entre dois (2) e dez (10) eu não deve exceder o número máximo de ligandos para um dado núcleo de metal
Sabe-se, em particular, que o grupo alquilo em compostos de fórmula V pode ser ligado ao nú- 3 cleo de metal não apenas, de uma forma trihapto (h ) mas também monohapto.
Os compostos de carbonilo de fórmula VII utilizados como materiais iniciais são conhecidos ou podem ser preparados por métodos conhecidos, por exemplo pela reacção de álcoois de fórmula X com halogenetos de ácido car-bâmico de fórmula XI em que X', Y1, Z1, m1, n', p', R12, R13 são atrás definidos.
Os compostos de carbonilo de fórmula VIII utilizados como materiais iniciais são conhecidos -59-
ou podem ser preparados por métodos conhecidos por exemplo pela reacção de enolatos de fórmula XII com halogenetos de ácido carbâmico de fórmula XI
(ζ)ρ'— (/)ri )m (ζ')ρ'— (/)rf >y3x)rrí 0 Hal^^N R12 R13 ΌΗ \ n0M X XE xT em que X', Y'f Z' são atrás definidos em que m', n', p' são atrás definidos 12 13 em que R , R são atrás definidos em que Hal representa halogénio em que M é atrás definido
Os aldeídos ou cetonas de fórmula VI são conhecidos ou podem ser preparados por métodos conhecidos ^ãynthesis 676 (1983)7
As oxidações sob condições ací-dicas que são aqui adequadas são os processos que utilizam agentes de oxidação conhecidos para um pH<7.
Os solventes inertes que são aqui adequados são conhecidos os solventes orgânicos que não são alterados sob as condições de reacção. Estes incluem de prefee rência éteres tal como éter dietílico, éter metil butílico, dioxano, tetra-hidrofurano, éter glicol-dimetílico, ou hidro-carbonetos tal como o benzeno, tolueno, xileno ou fracções de óleo mineral, ou ureias tal como DMEU (N,Ν-dimetil-etileno--ureia) ou DMPU (Ν,Ν-dimetil-propileno-ureia) ou aminas tal como a trimetilamina, 'trietilamina, tetrametiletilenodiamina. Em adição é possível usar misturas dos solventes referidos.
Os alcóxidos de metal alcalino ou alquilos de metal alcalino ou amidas de metal alcalino são em geral usados como bases, de preferência os alquilos de lítio e as amidas de lítio. A reacção é efectuada em geral à pressão atmosférica, elevada ou reduzida (por exemplo na gama de pressão de 0,1 até 10 bar). Em geral, a reacção é efectuada à pressão atmosférica. A reacção é efectuada em geral numa gama de temperatura de -1252C até +502C, de preferência de -1002C até +20QC.
Exemplo 1 de fórmula IV 1-Ciclopentenilmetanol (1)
Foi dissolvido em 150 ml de n-he-xano 9,61 g (0,1 mol) de 1-ciclopentenocarboxaldeído (L.F. Tietze, T. Eicher; "Reacktionen und Synthesen im organisch--chemischen Praktikum", S. 231, Thieme Verlag, Stuttgart, New York 1981) e arrefeceu-se até 02C. Em seguida foi adicionado -61-
120 ml de uma solução de hidreto de diisobutilalumínio em hexano a uma velocidade tal que a temperatura não se eleve acima de 53C . Depois da adição, a solução foi agitada durante 30 minutos a 02C. Depois foi adicionado 20 ml de MeOH seguido por 20 ml de solução saturada de NH^Cl e 100 ml de NHC1 2N à mistura reaccional e à temperatura ambiente. A fase aquosa foi separada e extraída 3 vezes com 150 ml de éter, as fases orgânicas combinadas misturadas 2 vezes com 150 ml de solução saturada de NaHCOg e secas sobre MgSO^. Depois da remoção do solven te ao vácuo e fraccionação do líquido residual foi obtido 9,32 g (95%) p. ebulição = 582C/10 Torr) do composto (1) indicado em título.
Exemplo 2 de fórmula IV 1-Ciclopentenilmetil-N,N-diisopropilcarbamato (2)
Este composto foi preparado a partir de 1 e cloreto de Ν,Ν-diisopropilcarbamoílo de acordo com a literatura, (D. Hoppe, R. Hanko, A. Broenneke, F. Lich-tenberg, Angew Chem. 93 (1981) 1106: Angew. Chem., Int. Engl. 20 (1981) 1024; D. Hoppe, R. Hanko, A. Broenneke: Angew. Chem. 92 (1980) 637, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 19 (1980) 625. -62-
Exemplo 3 de fórmula^IV
Foi preparado (S)-2-(t-butoxicar-bonil)amino-3-fenilpropanol (4) a partir de (S)-2-terc.-butoxi-carbonilamino-N-metoxi-N-metil-3-fenil-propanamida de acordo com a literatura (J. -A. Fehrents, B. Castro, Synthesis (1983) 6 76.
Exemplo 4 de fórmula IV /ls, 1(1S,2Z),2S7 e ZlR,l(lR>2Z),2S7-2-terc-butoxicarbonil--amino-l-(N,N-diisopropilcarbamoíloximetileno),Jciclopentilo-3--fenilo-l-propanol (3a) e (3b)
Foi dissolvido em 120 ml de éter 9,02 g (40 mmol) de composto 2 e 5,1 g (44 mmol) de Ν,Ν,Ν',Ν'--tetrametiletilenodiamina e arrefeceu-se até -78QC. Depois foi adicionado lentamente 26,2 ml (44 mmol) de uma solução de n--Buli 1,68M em n-hexano de modo a que a temperatura não se eleve acima de -702C. Depois de cristalização do composto 2 desprotonado, a mistura reaccional foi deixada em repouso durante 20 minutos, depois foi adicionado 47,6 ml (160 mmol) de tetraisopropoxititânio (a temperatura de reacção durante a adição foi mantida abaixo de -602C), pelo que o precipitado se dissolveu outra vez. Após agitação durante 30 minutos a -78°C, foi adicionado gota a gota 4,98 g (20 mmol) do composto 4 suspenso em 30 ml de éter e a mistura foi agitada durante mais 30 minutos. Para completar a reacção a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, depois foi diluída com 100 ml de éter e adicionada a 800 ml de HC1 2N. Depois da separação -63-
das fases límpidas e extracção por 2x com 150 ml de éter, a fase orgânica foi misturada com solução saturada de NaHCO^ para remover o ácido e depois seco sobre MgSO^. A remoção do solvente ao vácuo e a cromatografia em sílica com acetato de etilo/n-hexano deu 3,949 g (41,6%) do composto 3a e 4,699 g (49,5%) do composto 3b.3a: : 3a: ÓLeo, Rf = 0,38 (1:3 de acetato de etilo/n-hexano) IV (Filme): 3600-3300 (OH, NH), 1700 cm"1 (N-C=0). 90 = +16,82 (c=2, CH2C12). C27H42°5N2 <474.64).
Valores Calculados: C = 68,33; H = 8,92.
Valores Encontrados: C = 68,28; H, 9,03. 3b: Sólido branco, p.f. = 1072C (Hexano),
Rf = 0,23 (1:3 de EtoAc/n-Hexano) IV (KBR): 3600-3300 (OH, NH), 1700 cm"1 (N-C=0). ΟΛ = +94,22 (c=2, CH2C12). C27H42°5N2 <474,64).
Valores Calculados: C = 68,33; H = 8,92 Valores Encontrados: C = 68,45; H = 8,97.
Exemplo 5 de fórmula IV ZT4St4S,5(lS.2Z)7- e £4S , 5R , 5 (IR, 2Z )7-4-benzil-5-Z'2-(N ,N-diiso-propil-carbamoíloximetileno)ciclopentil7-1,3-oxazoldin-2-ona (5a) e (5b)
Foi aquecido durante 15 horas sob refluxo 237 mg (0,5 mmol) do composto 3a e 71 mg (0,25 mmol) de tetraisopropoxititânio em 5 ml de tetra-hidrofurano. à mistura reaccional foi adicionado 10 ml de HC1 2N e a fase aquosa foi extraída 3 vezes com 10 ml de éter. A fase orgânica foi agitada 2 vezes com 10 ml de solução saturada de NaHCO^ para remover o ácido e.depois de secagem sobre MgSO^ o solvente foi removido ao vácuo. A cromatografia do resíduo em sílica com EtOAc/n-hexano deu 168 mg (84%) do composto 5a. 5a Composto: Oleo Rf = 0,24 (EtOAc/n-hexano 1:1) -1 IV (Filme): 3300 (NH), 1755 (Oxazolidina C=0), 1710 cm (Carbamoilo C=0). Γ-7ρ° = +69,82 (c=2, CH2C12). C23H32°4N2
Valores Calculados: C=68,97; H= 8,06.
Valores Encontrados: C=69,21; H=8,28.
Da mesma forma que descrita para 5a, foi obtido a. partir de 237 mg (0,5 mmol) do composto 3b 172 mg (86%) do composto 5b. 5a: Sólido branco p. fusão = 149QC (Hexano), Rf=0,20 (1:1 de EtOAc/n-hexano) IV (KBr): 3360 (NH), 1755 (Oxazolidin C=0) , 1685 cm-·*· -65-
(Carbamoilo C=0). ZT7p°= -222,OQ (c=2, CH2C12).
(400,52)
Valores calculados: C=68,97; H=8,05
Valores Encontrados: C=69,22; H=7,87.
Exemplo 6 de fórmula IV ^S,5S, 5(1S,2Z)J7- e Z'4S,5R,5(lR,2Zl7r-4-benzil-3-terc-butoxicar-bonil-5-/2-(N,N-dlisopropilcarbamoiloximetileno)ciclopenti3Í7--2,2-dimetil-l,3-oxazoldina (6a) e (6b) A 237 mg (0,5 mmol) do composto 3a em 3 ml de N,N-dimetilformamida a OQC foi adicionado 120 ul (1,25 mmol) de 2-metoxipropeno e uma gota de POCl^. A mistura reaccional foi agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. Em seguida foi adicionado 10 ml de H20, a fase aquosa foi extraída 3 vezes com 10 ml de éter e as fases orgânicas foram secas sobre MgSC>4. A solução foi concentrada ao vácuo e croma-tografia em sílica cora EtOAc/hexano. Foi obtido 218 mg (85%) do composto 6a. 6a: Óleo, Rf=0,56 (EtOAc/n-Hexano 1:4). IV (Filme): 1700 cm-1 (C=0) ?n ÍJv = +164Q (c=2/5' CH2Cl2) ·
(514,71)
Valores Calculados: C=70,01; H=9,01 Valores Encontrados: C=69,90; H=8,94. -66
Da mesma forma como descrito para o composto 3a foi obtido 232 mg do composto 6b (92%) a partir de 237 mg do composto 3b. 6b: Sólido branco, p. fusão de 582C (hexano), Rf = 0,44 (1:4 de EtOAc/n-hexano) IV (KBr); 1700 cm-1 (C=0) on £Jp = -97,62 (o=2, CH2C12) C30H46°5N2 (514'71)
Valores Calculados: C=70,01; H=9,01.
Valores Encontrados: C=69,92; H=9,03.
Exemplo 7 de fórmula IV /lR, 2S , 2 (4S , 5S )_7 e Q.S ,2S ,2 (4S , 5S )J-2-(4-Benzil-3-terc-butoxi-carbonilo-2,2-dimetil-l,3-oxazoldina-5-il)ciclopentano-metanol (7a) e (7b) A uma solução de 514 mg (1 mmol) do composto 6a em 5 ml de tetra-hidrofurano a OQC foi adicionado gota a gota 190 pl (2 mmol) de complexo de borano-dime-tilsulfureto durante um período de 5 minutos. Após 30 minutos a mistura reaecional foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e depois foi agitada durante 15 horas. Depois foi adicionado 8 ml de EtOH seguido por 1 ml de a 30% e 2,2 ml de NaOH a 30%. A solução foi aquecida durante 1 hora a 502C. λ mistura reaecional arrefecida foi depois adicionado 20 ml de e 20 ml de éter. As fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída 3 vezes com 10 ml de éter. Depois da secagem so- -67-
bre MgSO^ o solvente foi removido no evaporador rotativo enquanto sob observação como uma medida de precaução. Foi obtido 421 mg de um óleo incolor que foi usado sem purificação adicional em reacções subsequentes. Para caracterização por cro-matografia em sílica foi obtido 217 mg (56%) de uma mistura inseparável de epímeros C-l 7a e 7b. 7a e 7b: dleo, Rf = 0,42 (1:1 de EtOAc/n-hexano) IV (KBr): 3460 (OH), 1670 cm-1 (C=0). C23H35°4N (389,54).
Valores Calculados: C=70,92, H=9,06.
Valores Encontrados: C=71,08, H=8,94
Exemplo 8 de fórmula IV /lRt2R,2 (4S>5R)J- e jls ,2R,2 (4S ,5R)J-2-(4-benzil-3-terc-butoxi-carbonil-2,2-dimetil-l,3-oxazolidina-5-il)-ciclopentanometanol (8a) e (8b). A partir de 514 mg do composto 6b foi obtido pelo mesmo processo descrito para o composto 7, 418 mg dos compostos. 8a e 8b sob a forma de um produto impuro (óleo incolor), que foi usado na reacção seguinte sem purificação adicional. Para caracterização por cromatografia em sílica foi obtido 260 mg (67%) de uma mistura inseparável dos epímeros C-l 8a e 8b.
Compostos 8a e 8b: Mistura sólida branca, gama de p. fusão de 90 - 100°C (hexano), Rf = 0,55 (1:1 de EtOAc/n-hexano). -68- IV (KBr): 3480 (OH), 1715 cm-1 (C=0)
C23H35°4N
Valores calculados: C= 70,92, H = 9,06 Valores encontrados: C=70,89, H = 9,00
Exemplo 9 de fórmula IV /ÍR,2R,2(4S,5R)J- e /lS , 2R , 2 (4S , 5R )J-2-(4-Benzil-3-terc-buto-xicarbonil-2,2-dimetil-l,3-oxazolidina-5-il)ciclopentano-car-baldeído (9a) e (9b) A 418 mg de uma mistura de 8a e 8b (produto impuro de 7) em 10 ml de foi adicionado 752 mg (2 mmol) de dicromato de piridínio. Depois de agitação durante 15 horas à temperatura ambiente a mistura foi aquecida durante 1 hora a 40QC para completar a reacção. O solvente foi removido ao vácuo, o resíduo dissolvido em 40 ml de éter e filtrado através de uma camada de 5 cm de sílica gel. O filtrado foi lavado consecutivamente com 10 ml de HC1 2N e 10 ml de solução saturada de NaHCC>3 e seco sobre MgSO^. Depois da remoção do solvente ao vácuo ficaram 385 mg de composto 9a e 9b sob a forma de produto impuro (óleo amarelo) que foi usado sem purificação na reacção seguinte.
Composto 9a e 9b: óleo, Rf = 0,55 (mistura 1:1 de EtOAc/n-he-xano).
Exemplo 10 de fórmula IV
Epimerização de 9b a 9a
Foi dissolvido 385 mg dos compostos 9a e 9b (produto impuro de 9) em 5 ml de MeOH, foi adicionado 108 mg (2 mmol) de metóxido de sódio e a solução foi agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado 10 ml de HC1 2N e 10 ml de éter à mistura reaccio-nal. A fase orgânica foi desacifiçada por agitação com 10 ml de solução saturada de NaHCO^ e seca sobre MgSC>4. A remoção do solvente ao vácuo deu 355 mg do composto 9a sob a forma de um óleo amarelo, que foi usado sem purificação nas reacções posteriores.
Composto 9a: óleo, Rf = 0,55 (mistura 1:3 de EtOAc/n-hexano)
Exemplo 11 de fórmula IV Ácido /IR,2R,2(4S,5R)/-2-(4-benzil-ã-terc-butoxicarbonil-2,2--dimetil-1,3-oxazolidina-5-il)/ciclopentanocarboxílico (10) (B.S. Bal, W.E. ChildeES, H.W. Pinnick, Tetrahedron, 37 (1981) 2091. A 355 mg de composto 9a (produto impuro de 10) e 3 ml de 2-metil-2-buteno em 12 ml de MeOH foi adicionado gota a gota uma solução de 630 mg (7 mmol) de NaC102 e 660 mg (5 mmol) de NaH2PO^ em 7 rol óe ^urante um período -70- de 10 minutos. Depois de agitação durante-30 minutos à temperatura ambiente, o solvente foi removido pela maior parte e or resíduo foi dissolvido em 20 ml de éter e 10 ml de HC1 2N. Δ fase aquosa foi extraída 3 vezes com 10 ml de éter e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO^. O solvente foi removido ao vácuo e o produto impuro foi cromatografado em sílica com EtOAc/n-hexano. Foi obtido 185 mg (46%, com base em 6b) do composto 10.
Composto 10: Sólido branco, p. fusão de 48 a 50SC, Rf = 0,29 (mistura 1:3 de EtoAc/n-hexano). IV (KBr): 1700 cm-1 (C=0). 70 C'Jd = -64,59 (C=2 , CH2C12) C23H3305N (403,52)
Valores calculados: C=68,46, H=8,24.
Valores encontrados: C=68,38, H=8,35
Exemplo 12 de fórmula V Éster metílico do ácido £LR,2R,2(4S,5R )J-2-(4-benzil-3-terc--butoxicarbonil-2,2-dimetil-l,3-oxazoldina-5-il)ciclopentano-carboxílico (11). (D.R..Williams, F.D. Klingler, E.E. Allen, F.W. Lichtenthaler, Tetrahedron Letters (1988) 5087. A uma solução de 355 mg do composto 9a (produto impuro de 10) em 2 ml de Me0H/H20 (9:1) foi adicionado 1,68 g (20 mmol) de NaHCOj. Em seguida, foi adicionado gota a gota 0,2. ml (4 mmol) de Br2 em 1 ml de Me0H/H20 (9:1) durante um período de tempo de 5 minutos a uma tempera- -71-
tura reaccional de 09C. A mistura reaccional foi agitada durante mais 5 horas à temperatura ambiente. Depois da remoção do excesso de Br2 com Na2S203, foi adicionado 30 ml de H20 e 20 ml de éter, as fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída 3 vezes com 15 ml de éter. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO^, o solvente foi removido ao vácuo e o resíduo cromatografado em sílica com EtOAc/hexano. Foi obtido 209 mg do composto 11 (50% com base em 6b).
Composto 11: Sólido branco, p. fusão de 909C (hexano), Rf = 0,55 (mistura 1:3 de EtOAc/n-hexano) IV (KBr): 1730 (COOMe), 1700 cm-1 (N~C=0). Z"7p0 = -65q (c=i, ch2ci2) C24H35°5N (418'56)
Valores Calculados: C=68,87, H=8,43.
Valores Encontrados: C=69,28, H=8,51.
Exemplo 13 de fórmula IV /T.R, 4S , 4 (IS) , 5£è7-4- (l-terc-butoxicarbonilamino-2-f eniletil) --3-oxabiciclo/3,3,Qj-octan-2-ona (12)
A uma solução de 237 mg (0,5 mmol do composto 3a em 2,5 ml de THF for adicionado gota a gota a 09C 192 μΐ (2‘mmol) de complexo de borano-dimetilsulfureto durante um período de 5 minutos. Depois de 30 minutos a mistura reaccional foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, e depois agitada durante 15 horas. Depois foi adicionado consecutivamente 4 ml de EtOH, 4 ml de H202 a 30% e 2,2 ml de NaOH -72- a 30% e a solução foi aquecida durante 1 hora a 502C. A solução arrefecida foi adicionada a 10 ml de E^O e 10 ml de éter, as fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída 3 vezes com 10 ml de éter. Depois de secagem sobre MgSO^, o solvente foi removido no evaporador rotativo enquanto observação como uma medida de precaução. 0 produto impuro foi depois dissolvido em 2 ml de CH^C^, foi adicionado 376 mg (1 mmol) de dicro-mato de piridínio e a seguir foi agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. O solvente foi removido ao vácuo, o resíduo foi dissolvido em 40 ml de éter e filtrado através de uma camada de 5 cm de sílica gel. O filtrado foi lavado consecutivamente com 10 ml de HC1 2N e 10 ml de solução saturada de NaHCC>3 e seca sobre MgS04· A remoção do solvente ao vácuo e a cromatografia em SiC^ com EtOAc/n-hexano deu 83 mg (48%) do composto 12.
Composto 12: Sólido branco, p. fusão de 1409C (hexano),
Rf = 0,6 (mistura 1:1 de EtOAc/n-hexano) IV (KBr): 3400-3340 (NH), 1750 (Lacton C=0), 1700 cm"1 (t.-Butoxicarbonil C=0). = -4,8° (0=1,5? CH2C12) C20H2?V <345,44)
Valores Calculados: C=69,54, H,=7,88 Valores Encontrados: C=69,43, H=8,09.
Exemplo 14 de fórmula IV
Foi sintetizado (S)-2-benziloxi-carbonilamino-3-fenilpropanol (13) a partir de (S)-benziloxi-carbonilamino-N-metoxi-N-metil-3-fenilpropanamida de acordo com a literatura.
Exemplo 15 de fórmula IV £LS,1(1S,2Z) ,2S_7- e /ÍR,l(lR,2Z),2S7-benziloxicarbonilamino--1-/Í2- (N,N-diisopropilcarbamoiloximetileno)ciclopentil7-3-f e-nil-l-propanol (14 a) e (14 b) A partir de 9,020 g (40 mmol) do composto 2 e 5,660 g (20 mmol) do composto 13 foi obtido pelo mesmo processo descrito para o composto 4 2,400 g (23%) do composto 14a e 5,030 g (49,5%) do composto 14b que foram separados por cromatografia em Si02 com EtOAc/hexano.
Composto 14a: óleo; Rf = 0,4 EtOAc/n-hehano 1:3) IV (KBr): 3600-3300 (NH, OH), 1710 cm-1 (N-C=0). fjl° = 63,2° (c=2, CH2C12). C30H40N2°5 (508,66)
Valores Calculados: C=70,84, H=7,96.
Valores Encontrados: C=70,87, H=7,84.
Composto 14b: Óleo, Rf = 0,21 (1:3 de EtOAc/n-hexano) IV (Filme): 3600-3300 (NH, OH), 1710 cm-1 (N-C=0). -74-
Valores Calculados: C=70,87, H=7,96. Valores Encontrados: C=70,86, H=8,03.
Exemplo 16 de fórmula IV
Conversão de 15a em 5b
Pelo mesmo processo descrito em 5 foi obtido 95 mg (95%) do composto 5a a partir de 127 mg (0,25 mmole) do composto 14a.
Exemplo 17 de fórmula IV
Conversão de 14b em 5b
Pelo mesmo processo foram convertidos 125 mg (0,25 mmole) do composto 14b em 59 mg (59%) do composto 5b. -75-
Exemplo 18 de fórmula IV /1S,2S,2(1S) ,4S,5R7- e AS ,2S ,2 (IS) ,4R,5R7-2-(l-benziloxicar-bonilamino-2-feniletil) -4-metoxi-3-oxabiciclo-/'3,3,07octano (15a) e (15b). A 508 mg (1 mmol) do composto 14a e 32 mg (0,1 mmol) de acetato de mercúrio (II) em 5 ml de MeOH foi adicionado gota a oota a OQC 128 jil (2 mmol) de ácido meta-nosulfónico durante um período de 5 minutos. No final da adição a mistura reaccional foi agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi neutralizada com NaHCOg, o solvente foi removido ao vácuo e o resíduo foi dissolvido em 30 ml de éter. A solução foi lavada com 10 ml de H20, seca sobre MgSO^ e o solvente foi removido ao vácuo para dar 408 mg de um óleo incolor. Este óleo foi usado sem purificação na reacção seguinte.
Alternadamente, a cromatografia do produto impuro em Si02 com EtOAc/hexano deu 185 mg (46,8%) do composto 15a e 60 mg (15,2%) do composto 15b.
Composto 15a: Óleo, Rf = 0,77 (1:1 de EtOAc/n-hexano). IV (Filme): 3450-3250 (NH), 1715 cm"1 (C=0) CT" = +59,93 (c=l, 5 , CH2C12).
(395,48).
Valores Calculados: C=72,89, H=7,39
Valores Encontrados: C=72,79, H=7,41.
Composto 15b: Óleo, Rf=0,72 (1:1 de EtOAc/n-hexano). IV (Filme): 3400-3250 (NH), 1715 em-1 (C=0) = -55,84 -76- C24H29N04 (395,48)
Valores calculados: C=72,89, H=7,39 Valores Encontrados: C=72,79, H=7,35
Exemplo 19 de fórmula IV £Lr , 4S ,.4 (IS ) , 4S_7-4- (l-benziloxicarbonilamino-2-feniletil)-3--oxabiciclo-/^ , 3,07-octano-2-ona (16 ) A 408 mg do composto 15a e 15b (produto impuro de 18) e 237 mg (1,1 mmol) de ácido m-cloro-nerbenzóico a 80% em 15 ml de CH^Cl^ foi adicionado gota a çjota a 02C 280 μΐ (1 mmol) de complexo de trifluoreto de boro--éter dietílico e a mistura reaccional foi agitada durante 15 horas à temperatura ambiente. O excesso de perácido foi depois reduzido com 50 pl de dimetilsulfureto e 30 minutos depois a mistura reaccional foi adicionada a 30 ml de éter e 10 ml de F^O. A fase orgânica foi desacifiçada com 10 ml de solução saturada de NaHCO^ e seca sobre MgSO^. A remoção do solvente ao vácuo e a cromatografia do resíduo em SiC>2 com EtOAc/hexano deu origem a 201 mg (53% com base em 14a) do composto 16.
Composto 16: Sólido branco, p. fusão = 129QC éter. Rf=0,64 (1:1 de EtOAc/n-hexano). IV (KBr): 3320 (NH), 1770 (Lacton C=0), 1690 cm"1 (N-C=0). íjl0 = -162 (c=i, ch2ci2). C23H25N04 (379,44).
Valores Calculados: C=72,81, H=6,64 Valores Encontrados: C=73,02, H=6,72 -77-
Os compostos do presente invento podem existir como isómeros ópticos e como misturas racémicas e diastereoisoméricas destes isómeros que podem existir para certos compostos, assim como os isómeros ópticos individuais estão todos dentro do âmbito do presente invento. Enquanto as misturas racémicas podem ser separadas nos seus isómeros individuais através de técnicas bem conhecidas tal como, por exemplo, a separação desais diastereoisoméricos formados com adjuntos opticamente activos, por exemplo, ácidos ou bases seguidos por conversão para os substratos opticamente activos; em muitos casos, para os compostos do presente invento, o isómero óptico preferido pode ser sintetizado por meio de reacções es-tereoespecíficas, começando com o estereoisómero apropriado do material inicial desejado. 0 presente invento também se refere a sais não tóxicos farmacêuticamente aceitáveis destes
X ^ !· X XX XX compostos contendo, por exemplo, Na , Li , K , Ca e Mg Estes sais podem incluir os derivados por combinação de catião apropriados tal como iões de metal alcalino e alcalino-terrosos ou iões de amónio e amino quaternário com um composto deste invento. Exemplos de sais de metal que podem ser preparados desta forma são os sais contendo Li+, Na+ e K+. Um sal de metal menos solúvel pode ser precipitado a partir da solução de um sal mais solúvel por adição do composto de metal adequado.
Em adição, os sais podem ser formados a partir da adição de ácido de certos ácidos orgânicos e inorgânicos, por exemplo HC1, HBr, ou ácidos sulfónicos orgânicos. Finalmente, é de compreender que os compostos do presente invento na sua forma não-ionizada, assim como na sua forma Zwitteriónica, e/ou na forma de solvatos são também considerados parte do presente invento. O presente invento abrange também os ésteres farmacêuticamente aceitáveis dos compostos do invento contendo os grupos ΘΗ. Estes ésteres são os produtos de es-terificação de um grupo OH de um composto do invento com um >78- ácido tal como por exemplo, um ácido carboxílico, um ácido sulfónico ou um ácido fosfórico. Exemplos não limitativos de ácidos específicos para preparar ésteres de acordo com o invento incluem o ácido alquil carboxílico, o ácido benHÓico não substituído ou substituído ou o ácido alquil(C^-Cg)sulfónico.
Os compostos activos do presente invento podem ser usados como se segue: (a) para o tratamento ou profilaxia de doenças causadas por HIV (Vírus de imunodeficiência humana) por exemplo, HIV I, HIV II e HIV III e os estados de SIDA associados tais como ARC (complexo relaccionado com SIDA) e LAS (Sindroma de adenopatia da linfa) e a fraca imunidade e encefalopatia causadas por este vírus. (b) para o tratamento ou profilaxia de uma infecção provocada por HTLV I ou HTLV II. (c) para o tratamento ou profilaxia do estado veículo da SIDA (estado transmissor de SIDA); e (d) para o tratamento ou profilaxia de doenças causadas pelo vírus da hepatite B. 0 presente invento inclui formulações farmacêuticas que, em adição aos excipientes farmacêuticamente adequados, não-tóxicos, contêm um ou mais compostos do invento. 0 presente invento inclui também formulações farmacêuticas em unidades de dosagem. Isto significa que as formulações estão presentes na forma de partes individuais, por exemplo, comprimidos, drageias, cápsulas, peque-
nas cápsulas, pilulas, supositórios e ampolas, cujo conteúdo de composto activo corresponde a uma fracção ou a um múltiplo de uma dose individual. As unidades de dosagem podem conter por exemplo, 1,2,3 ou 4 doses individuais ou 1/2, 1/3 ou 1/4 de uma dose individual. Uma dose individual contém, de preferência, a quantidade de composto activo que é dada numa administração e que corresponde em geral a um total, um meio, um terço ou um quarto de uma dose diária.
Por excipientes não-tóxicos, farmacêuticamente adequados inertes é de compreender diluentes sólidos, semi-sólidos ou líquidos agentes de enchimento e auxiliares de formulação de todos os tipos.
As formulação farmacêuticas preferidas que podem ser referidas são os comprimidos, drageias, cápsulas, pequenas cápsulas, pílulas, grânulos, supositórios, soluções, suspensões e emulsões, pastas, pomadas, geles, cremes, loções, pós e sprays. Os comprimidos, drageias, cápsulas, pequenas cápsulas, pílulas e grânulos podem conter o composto activo ou compostos em adição aos excipientes vulgares, tais como (a) agentes de enchimento e de extensão, por exemplo, amidas, lactose, sucrose, glucose, manitol e ácido silício, (b) agentes ligantes, por exemplo, carboximetilcelulose, algi-natos gelatina e polivinilpirrolidona, (c) humidificantes, por exemplo, glicerol (d) agentes desintegrantes, por exemplo, agar-agar, carbonato de cálcio e carbonato de sódio, (e) retardadores de solução, por exemplo, parafina e (f) aceleradores de absorção, por exemplo, compostos de amónio quaternário, (g) agentes molhantes, por exemplo, álcool cetílico e monoesteara-to de glicerol, (h) absorventes, por exemplo, caulino, e ben-tonite e (i) lubrificantes, por exemplo, talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, e polietileno glicóis sólidos, ou misturas das/substâncias listadas de (a) e (i) imediatamente atrás.
Os comprimidos, drageias, cápsulas, pequenas cápsulas, pílulas, e grânulos podem ser providenciados com os revestimentos e cápsulas vulgares, contendo facultativamente agentes de opacidade e também podem ser de uma tal composição que liberta o composto activo ou compostos apenas ou de preferência numa certa parte do tracto intestinal, facultativamente de uma forma retardada. Exemplos de composições de encaixar que podem ser usados são as substâncias poli-méricas e as ceras. 0 composto activo ou compostos também pode(m) estar presente(s) na forma micro-encapsulada, se apropriado com um ou mais dos excipientes atrás referidos.
Os supositórios podem conter, em adição ao composto ou composto(s) activo(s), os excipientes vulgares solúveis em água ou insolúveis em água, por exemplo, polietilenoglicóis, gorduras, por exemplo, gordura de cacau e ésteres superiores (por exemplo álcool-C^ com ácido gordo--Ci6) ou misturas destas substâncias.
As pomadas, pastas, cremes e geles podem conter, em adição ao composto activo ou compostos, os excipientes vulgares como por exemplo gorduras animal e vegetal, ceras, parafinas amido, tragacanth, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonites ácido silíci-co, talco e ácido de zinco, ou misturas destas substâncias.
Os pós e sprays podem conter, em adição ao composto ou composto(s) áctivo(s), o excipientes vulgares, por exemplo, lactose, talco, ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicato de cálcio e pó de poliamida, ou mistura destas substâncias. Os sprays podem conter adicionalmente propulsores vulgares, como por exemplo, clorofluorohidrocarbone-tos. 81-
As soluções e emulsões podem conter, em adição -ao composto activo os excipientes vulgares, tal como solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, por exemplo água, álooiàl atílico, álcool isopropílico carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de ben-zilo, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimemetilformami-da, óleos, em particular, óleo de semente de algodão, óleo de noz moída, óleo de germe de milho, óleo de azeitona, óleo de castor e óleo de sésamo, glicerol, glicerol formal, álcool te-trahidrofurfurilo polietileno glicóis e ésteres de ácido gordo de sorbitam ou misturas destas substâncias.
Para administração parenteral, as soluções e emulsões também podem estar numa forma estéril que é isotónica com o sangue.
As suspensões podem conter, em adição ao composto activo, excipientes, tais como diluentes líquidos, por exemplo água, álcool etílico ou propileno glicol e agentes de suspensão, por exemplo álcoois de isoestearilo etoxilado, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitan, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonite, agar-agar e tragacanth, ou misturas destas substâncias.
As formas de formulação referidas também podem conter agentes corantes, preservativos e aditivos de melhoramento de - cheiro e - gosto, por exemplo óleo de hortelã-pimenta e óleo de eucalipto e adoçantes como, por exemplo, sacarina e aspartam.
Os compostos activos do invento devem estar presentes de preferência nas formulações farmacêuticas atrás referidas numa concentração de cerca de 0,1 até 99,5, de preferência de cerca de 0,5 até 95%> em peso da mistura total. -82-
As formulações farmacêuticas = atrás referidas também podem conter outros compostos activos farmacêuticos em adição aos compostos do invento.
As formulações farmacêuticas atrás referidas são preparadas da forma vulgar por métodos conhecidos, por exemplo, por mistura do composto ou compostos activos com o excipiente ou excipientes.
As formulações referidas podem ser usadas em seres humanos ou animais quer oralmente, rectal-mente, bucalmente, parenteralmente (intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente), intracisternamente, intra-vaginalmente, intraperitonealmente ou localmente (pó, pomada ou gotas) e para a terapia de infecções em espaços ou cavidades bocais. As formulações adequadas são as soluções injectá-veis soluções e suspensões para terapia oral geles, formulações , emulsões, pomadas ou gotas. As formulações oftalmológicas e desmatológicas, sais de prata e outros sais, gotas de ouvidos pomadas para a vista, pós ou soluções podem ser usados para terapia local. Além disso é possivel usar os geles, pós, pós para polvilhar, comprimidos, comprimidos de libertação prolongada, pré-misturas, concentrados, grânulos, cápsulas, pequenas cápsulas, acrosóis, sprays e inalatos em seres humanos e animais. Os compostos de acordo com o invento também podem ser incorporados noutros veículos materiais tais como, por exemplo, plásticos (por exemplo cadeias de plástico para a terapia local), colagénio ou cimento dos ossos.
Em geral, vantajoso quer em seres humanos quer em medicina veterinária administrar o composto activo ou compostos do invento em quantidades totais de cerca de 0,5 até 500, de preferênia 5 até 100 mg/kg de peso de corpo todas as 24 horas, se apropriado na forma de várias doses individuais, para se atingir os resultados desejados. Uma dose individual contém de preferência o composto activo ou compostos em quantidades de cerca de 1 até cerca de 80, em particu- -83-
lar de 3aa 30 mg/kg de peso do corpo. Contudo, pode ser necessário alterar as dosagens referidas e em particular fazê-lo de acordo com a natureza e peso do corpo do indivíduo a ser tratado, a natureza e gravidade da doença, a natureza da formulação e da administração do medicamento e do período ou intervalo de tempo dentro do qual tem lugar a administração.
Assim, em alguns casos pode ser suficiente tratar com menos do que a quantidade de composto activo atrás referida, enquanto noutros casos, a quantidade de compostos activos podem ser determinada facilmente por qualquer pessoa experiente com base no seu conhecimento sabedor. O presente invento também é dirigido a cromatografia líquida de Alta Resolução de Fase Reversa (PP-HPLC) em ensaio de enzima in. vitro baseado na actividade proteolítica catalizada pelo HlV-protease. A cromatografia de camada fina podia ser usada em vez de RP-HPLC, mas esta resulta em quantificação mais precisa. O enzima é incubado com um N-Dansil-peptídeo que podem ser s-clivado pela protease in vitro. As sequências de aminoácidos presentes em tais substratos de N-dansil-peptídeo incluem mas não são limitadas às presentes no ponto de clivagem proteolítica das poliproteínas gag e pol. A incubação da proteína com tais peptídeos é realizada sob condições em que a protease é catalicamente activa. Depois do período de incubação, é removida uma parte aliquota da mistura reaccional e analizada por RP-HPLC analítica. Qualquer substrato de peptídeo não coberto é removido a partir de produto(s) peptídeo(s) e depois detectado por um monitor de fluorescência em linha. A quantidade de produto formado durante um intervalo de tempo conhecido podendepois ser usado para calcular a actividade do enzima sob as condições de ensaio específicas. A quantidade de fluorescentes detectada no pico eluído a partir de HPLC pode estar relacionada com a quantidade de peptídeo no pico por análise de HPLC anterior da fluorescência obtida a partir de análise de HPLC de amostras padronizadas. A quantidade de peptídeo nas amostras padronizadas pu- -84-
ras é determinada com segurança por análise de aminoácido.
Nos exemplos aqui citados, é descrito um ensaio com base na clivagem de N-densil SQNYPIV para dar N-dansil-SQNY. Os peptídeos seguintes podem também ser utilizados no ensaio atrás referido:
Produto
N-dansil-ARVL N-dansil-ATIM N-dansil-PGNF N-dansil-SFNF N-dansil-TLNF N-dansil-RKIL
Substrato
N-dansil-ARVLAEA
N-dansil-ATIMMQR
N-dansil-PGNFLQS
N-dansil-SFNFPQI
N-dansil-TLNFPIS
N-dansil-RKILFLD O tempo de análise rápido permite a análise de grande número de amostras, tais como encontrados no controlo de cromatografia em coluna durante a purificação do enzima. A natureza isocrática da separação HPLC permite um sistema de entrega de solvente barato e simples comparativamente. Em adição, a seleetividade na detecção torna fácil o desenvolvimento do ensaio de competição dando importância a outros ligandos não fluorescentes tais como poliproteínas gag autênticas. Providencia-se um método directo de determinação do efeito inibidor dos compostos.
Um ensaio de captura p24 (ver
Exemplo 50 aqui representado em seguida) providencia um método -85-
"in vivo" para a determinação da actividade de HlV-protease. 0 inibidor é adicionado às células infectadas com HIV, e um dos efeitos em síntese de proteína virai é examinada. A inibição de propagação de HlV-protease em células é medida pela ausência ou presença de p24, que é gerada por HIV protease. 0 invento será agora descrito com referência aos seguintes exemplos nãoelimitativos. 86-
EXEMPLO 1 2-/11,l-dimetiletoxicarbonil7amino-l-fenil-but-3-eno
Ph
80C-N' 'r H
Uma suspensão de 87,5 g (0,21 mol) de brometo de metiltrifenilfosfórico + amida de sódio (PLUKA "ileto instantâneo") em 500 ml de THF seco foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, foi adicionado sob arrefecimento com gelo uma solução de 52,6 g (0,21 mol) de Boc-L-fenilalaninal em 250 ml de THF seco, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A suspensão foi vertida em gelo esmagado e extraída quatro vezes com salmoura, seca (Na2SO^) e, concentrada. O resíduo foi cro-matografado em sílica gel com tolueno/éter de petróleo (gradiente 1:2 —>5:1) para dar 26,6 g (51,3%) do produto.
Rf (20:1 de diclorometano/metanol): 0,68:
EXEMPLO 2 A-£(l,l-Dimetiletoxi)carbonil7amino-2-feniletil7oxirano
BOC-N
H
Foi adicionado a 0°C uma solução de 42,6 g (0,21 mol) de ácido m-cloroperbenzóico a 85% numa mistura de 200 ml de clorofórmio e 50 ml de diclorometano a uma solução de 26,6 g (0,1 mol) do composto do Exemplo 1 em 250 ml de clorofórmio. Depois da agitação à temperatura ambiente durante a noite, a solução foi lavada duas vezes com Na2S20 aquoso a 5% e três vezes com ^200^ aquoso a 5%, seca (NaSO^f e concentrada. O resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 3:1 de n-hexano/acetato de etilo para dar 18,3 g 69,5%)’ do produto, principalmente sob a forma do dias-tereómero 2R,3S (RMN 1H). FAB-MS: m/z 264 (M+H)
Rf (3:1 de n-hexano/acetato de etilo): 0,34 -88-
EXEMPLO 3 2-[{ 1,1-Dimetiletoxi )carbonil7amino-l-ciclohexil-but-3-eno
boc-n
H
Uma suspensão de 82,9 g (0,2 mol) de brometo de metiltrifenil fosfónio + amida de sódio (FLUKA "ileto instantâneo") em 500 ml de THF seco foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, foi adicionado sob arrefecimento com gelo, uma solução de 46,8 g (0,2 mol) de Boc-L-ciclohexilalaninal em 250 ml de THF seco e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A suspensão foi vertida sobre gelo esmagado e extraída três vezes com n-hexano. Os extractos combinados foram lavados duas vezes com salmoura, secos (Na2S04) e concentrados. O resíduo foi cromatografado em sílica gel com tolueno/éter de petróleo (gradiente 1:1 —^10:1) para dar 24,4 g (50,7%) do produto. DCI-MS: m/z 254 (M+H). F„ (10:1 de tolueno/acetato de etilo): 0,37. Γ
EXEMPLO 4 /1-/( 1.1-Dimetiletoxi)carbonilj amino-2-ciclohexil-etilj oxirano
Foi adicionado a OQC uma solução de 24,2 g (0,12 mol) de ácido m-cloroperbenzóico a 85% numa mistura de 200 ml de diclorometano e 50 ml de clorofórmio a uma solução de 14,4 g (0,06 mol) do composto do Exemplo 3 em 200 ml de diclorometano. Depois de agitação à temperatura ambiente durante a noite, a solução foi lavada duas vezes com Ν32$2θ,- aquoso a 5% e três vezes com Na2CC>2 aquoso a 5%, seca (Na2SO^) e concentrada. O resíduo foi cromatografado em sílica gel com tolueno/acetato de etilo (gradiente 50:1 —^10:1) para dar 12,7 g (78,6%) do produto, principalmente sob a forma 2R, 3S diastereómero. (RMN ^H). DCI-MS: m/z 270 (M+H)
Rf (10:1 tolueno/acetato de etilo): 0,28. -90-
EXEMPLO 5 N-2-/*( 1,1-Dimetiletoxi) carbonilJ-N-Z2- (2-piridinil) etil7~L-pro-linaamida
H A uma solução agitada de 15,06 g (70 mmol) de Boc-L-prolina em 100 ml de diclorometano a 0°C foram adicionados 9,2 ml (77 mmol) de 2-(2-aminoetil)-piridina, 13,4 gramas (87,5 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 16,61 g (80,5 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. A mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite, depois foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura, seco (Na2SO^) e concentrado. O resíduo foi croma-tografado em sílica gel com uma mistura 10:1 de diclorometano/ /metanol para dar 20,6 g (92¾) do produto.
Espectro de Massa: m/z 319 (M+).
Rp (10:1 de diclorometano/metanol): 0,50. -91-
EXEMPLO 6 N-/2-(2-piridiniletil )J-L-prolinaamida
Uma solução de 20,6 g (65 mmol) do compostos do Exemplo 5 em 150 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano, contendo 30 ml de metanol seco, foi agitada a Oec durante 8 horas. A solução foi concentrada, e o óleo residual foi seco ao vácuo. Foi depois dissolvido em aquoso a 10% (pH=10), a solução foi concentrada, e^o resíduo foi triturado vigorosamente com diclorometano quente. A fase orgânica foi seca (Na2S0^) e concentrada para dar 12,4 g (87%)' do produto.
Rp (9:1:0,1) de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,34 EXEMPLO 7 N-2-/3-/1,1-Dimetiletoxi)carbonil/amino-2-hidroxi--4-fenil-bu-til/-N-/2-(2-piridinil)etil)-L-prolinamida
Uma solução de 4,13 g (15,7 mmol) do composto do Exemplo 2 e 3, 79 g (17,3 mmol) do composto do Exemplo 6 em 50 ml de isopropanol foi agitada a 70QC durante 7 horas. A solução foi depois concentrada e o resíduo foi cro-matografado em sílica gel com uma mistura 12:1:0,1 de dicloro-metano para dar 4,82 g (63,6%) do produto. FAB-MS: (espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos) m/z 483 (M+H) (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,64 -93-
EXEMPLO 8 N-2-/3-A ,l-Dimetiletoxi)-carbonil7amino-2-hidroxi-4-ciclohe-xil-butil7-N-2-(2-pirídinil)-etil7-L-prolinamida
H
Uma solução de 4,16 g (15,4 mmol) do composto do Exemplo 4 e 3,73 g (17 mmol) do composto do Exemplo 6 em 50 ml de isopropanol foi agitado a 70QC durante 7 horas. Δ solução foi depois concentrada, e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 12:1:0,1 de diclo rometano/metanol/NH^ aquoso concentrado para dar 6,17 g (81,9%) do produto. FAB-MS (Espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos): m/z 489 (M+H)
Rp (9:1:01 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado: 0,65 -94-
EXEMPLO 9
Sal hidrocloreto de N-2-/3-amino-2-hidroxi-4-fenil-butil7-N-/"2-piridinil) -L-prolinamida (1:3)
Foi agitada a OQC durante 2 horas uma solução de 4,32 g (8,95 mmol) do composto do Exemplo 7 em 50 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano, contendo 3 ml de metanol seco. A solução foi depois concentrada o res_í duo foi triturado repetidamente com éter seco e concentrado outra vez e finalmente foi seco ao vácuo para dar 4,5 g (100%) do produto.
Rp (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,29 -95-
EXEMPLO 10 N-2-Z~3-amino-2-hidroxi-4-ciclohexil-butil )-N-/2- (2-piridinil) etil7-L-prolinamida
Foi agitada a 0SC durante 2 horas uma solução de 5,67 g (11,6 mmol) do composto do Exemplo 8 em 60 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano, contendo 1 ml de metanol seco. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado repetidamente com éter seco e concentrado outra vez. Finalmente foi seco ao vácuo para dar 5,9 g (100%) do produto indidcado em título.
Rp (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,26.
EXEMPLO 11 N—2—/3—/TSf—2 — Z~3- ,1-Dimetiletoxi) carbonilT-L-asparagil/amino^-hidroxi-i-f enil-butil/-N-2- ((2-piridinil)etil7-L-prolinamida A uma solução agitada de 4,5 g(9 mmol) do composto do Exemplo 9 em 30 ml de DMF a OQC foram adi^ cionados 4,1 ml (32,17 mmol) de N-etilmorfolina, 2,35 g (10,1 mmol) de Boc-L-asparagina, 1;76 g (11,49 mmol) de 1-hidroxi -benzotriazole e 2,27 g (11 mmol) de dicilohexilcarbodiimida. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, de pois foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, filtrado outra vez e o filtrado foi lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO^) e concentrada. O re -síduo foi dissolvido em mistura 9:1:0,1 de diclorometano/meta-ηοΙ/ΝΗ^ aquoso concentrado e o produto precipitou por âdição de éter. Depois de filtração, foi lavado com éter e seco ao vácuo para dar 2,27 g (41,4%). FAB-MS (espectrometria de massa por bombardeamento com átomos rápidos) : M/Z 597 (M+H) R„ (10:1 de diclorometano/metanol): 0,34 Γ EXEMPLO 12 N-2-/3-/'N-2-/'(l,l-dimetiletoxi)carbonil)-L-asparagil/amino-2--hidroxi-4-ciclohexil-butiiy-N-/2-(2-piridinil)etil7-L-proli-namida 9 7- A uma solução agitada de 5,69 g (11 mmol) do composto do Exemplo 10 em 30 ml de DMF a OQC foram adicionados 5,1 ml (40 mmol) de N-etilmorfolina, 2,92 g (12,5 mmol) de Boc-L-asparagina, 2,18 g (14,27 mmol) de 2-hi-droxibenzotriazole e 2,83 g (13,7 mmol) de diciclohexilcarbo-diimida. A mistura foi agitada à temperatura ambiente, depois filtráda e o filtrado foi concentrado. 0 resíduo foi dissolvido em diclorometano, lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura, seco (Na2SO^) e concentrado. O resíduo foi cromatografado em sílica gel com diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado (gradiente 15:1:0,1 -£-9:1:0,1) para dar 2,01 g (29,2%) do produto indicado em título. FAB-MS: m/z 603 (M+H)
Rp (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,43 EXEMPLO 13 N-2-/'3-/L-asparagil/'-amino-2-hidroxi-4-fenil-butil7-N-^2-(2--piridinil)etil7-L-prolinamida, sal do ácido clorídrico (1:3)
Foi agitada a OQC durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 1 hora uma solução de 1,95 g (3,27 mmol) do composto do Exemplo 11 em 35 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano, contendo 10 ml de metanol seco. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado re-petidamente com éter seco e concentrado outra vez. Finalmente foi seco ao vácuo para dar 1,93 g (97,5%) do produto indicado em título. -98-
Rp (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso saturado):0,15 EXEMPLO 14
Sal do ácido clorídrico N-2-£3-/L-asparagll7amlno-2-hidroxi--4-ciclohexil-butil7-N-/^- (2-piridinil)etil7-L-prolinainida (1:3)
Foi agitada a 0°C durante 1 hora e á temperatura ambiente durante 1 hora uma solução de 1,71 g (2,83 mmol) do composto do Exemplo 12 em 30 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano, contendo 3 ml de metanol seco. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado repi-tadamente com éter seco e concentrado outra vez. Finalmente foi seco ao vácuo para dar 1,75 g (100%) do produto indicado em título.
Rp (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,17. EXEMPLO 15 N-2£3-/N-2-/N-/*( 1,1-Dimetiletoxi )carbonil7-L-f enilalanil7-L--asparagil·7amino-2-hidroxi-4-ciclohexil-butil7-N-/2-(2-piridi-nil)etil7-L-prolinamida -99-
A uma solução:de 925 mg (3,49 mmol) de Boc-L-fenilalanina em 15 ml de diclorometano a OSC foram adicionado 588 mg (3,84 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 756 mg (3,67 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. Depois de agitação a OQC durante 2 horas, foi adicionado uma solução de 1,75 g (2,82 mmol) do composto do Exemplo 14 e 1,3 ml (10,1 mmol) de N-etilmorfolina em 20 ml de DMFAe a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi filtrada e o resíduo foi triturado repetidamente com 9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado.,Os filtrados combinados foram concentrados, o resíduo foi dissolvido em diclorometano (mais uns ml de metanol), e lavados duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. EXEMPLO 15a N-2-Z3-ZN-2-Z'N-/1i ,1-Dimefiletoxi )carbonil7-L-f enilalanil7-L--histidil7amino-2-hidroxi-4-ciclohexil-butil7-N-/'2- (2-piridi-nil )eti37-L-prolinamida
-100-
Este composto' :foi preparado por processos vulgares semelhantes em principio aos passos sequenciais envolvendo a síntese do composto no Exemplo 15 a partir do composto do Exemplo 10. EXEMPLO 16 N-2-£3-/N-2-/N-/~(l, l-Dimetiletoxi)carbonil7-L-fenilalanil7-L--asparagil7amino-2-hidroxi-4-fenilbutilJ-N-^Z-(2-piridinil)-etilJ-L-prolinamida, sal de ácido acético (1:2)
A uma solução de 929 mg (3,5 mmol) de Boc-L-fenilalanina em 15 ml de diclorometano a 0°C foram adicionados 590 mg (3,85 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 758 mg (3,68 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. Depois de agitação a 09C durante 2 horas, foi adicionado uma solução de 1,93 g (3,18 mmol) do composto do Exemplo 13 e 1,3 ml (10,1 mmol) de N-metilmorfolina em 30 ml de KMF, e a mistura foi
X \\ agitada à temperatura ambiente durante a 'noite. A mistura foi filtrada, o filtrado foi concentrado, o resíduo foi dissolvido em diclorometano e lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2S0^) e concentrada. O resíduo foi combinado com o primeiro resíduo a partir de uma mistura reaccional de diclorometano/DMF - contendo deciclohexil ureia assim como algum produto) e foi agitado vigorosamente com éter. A suspensão foi filtrada e o resíduo foi agitado vigorosamente outra vez com ácido acético a 10%. A mistura foi filtrada e o filtrado foi liofilizado para dar 1,80 g (65,5%) do produto indicado em título. FAB-MS: m/z 744 (M+H)
Rp (9:1:0+1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado): 0,45. EXEMPLO 17 Éster N-/N-1,1-Dimetiletoxi)carbonil7-L-fenilalanil7-L-pro-linametílico
Foi agitada a 02C uma solução de 26,5 g (0,1 mol) de Boc-L-fenilalanina e 16,5 g (0,1 mol) de éster prolinametílico em 150 ml de dimetilformamida seca e foi adicionado 60 ml de N-etilmorfolina. Depois de agitação durante 6 horas todos os solventes foram evaporados e o resíduo foi dissolvido em 100 ml de acetato de etilo e lavado três vezes com bicarbonato de sódio saturado, com água e com uma solução IN de ácido cítrico, seco sobre MgSC>4 e concentrado. O resíduo foi cromatografado em sílica gel (10:1 de diclorometa-no/metanol) para dar 35,0 g (93%) do composto indicado em tí- tulo.
Rf: 0,9 (10:1,5 de diclorometano/metanol). EXEMPLO 18 Éster N-/^-/T(l ,1-Dimetiletoxi )carbonil7amino-3-fenil-tiopro-pionil7-L-prolinametílico
Foram dissolvidos em 100 ml de tolueno 26,6 g (79 mmol) de éster N-/N-(ll-dimetiletoxi)carbo-nirj-L-fenilalanilj7-L-prolinametílico e adicioneu-se a uma solução de 15,9 g (38 mmol) de 2,4-bis(4-metoxifenil)~1,3-di-tio-2,4-difosfetano-2,4-disulfureto (Reagente de Lawesson) em 600 ml de tolueno a 80QC. Depois de agitação durante 8 horas foram adicionados mais 1,6 g (4 mmol) do reagente de Lawesson. Depois da agitação durante mais 12 horas, a mistura reaccional foi arrefecida e extraída três vezes com í^©, seca sobre MgSO^ e concentrada. O resíduo foi cromatografado em sílica gel (10: 10:0,3 de diclorometano/éter de petróleo/acetona) para dar 23,5 g (76,3%) do composto indicado em título. R : 0,8 (10:1 de diclorometano/acetona). -103- EXEMPLO 19
Sal hidrocloreto do éster N-£2-/~(l, 1-Dimetiletoxi )carbonil7-amino-3-fenil-propil7-L-prolina metílico (1:1)
Foram suspensos em 500 ml de E^O sob árgon 56 g de uma liga de níquel/alumínio 50/50 e foram adicionados lentamente 80 g de hidróxido de sódio. A mistura foi aquecida até 30 minutos, arrefecida, decantada e lavada três vezes com água. O resíduo foi lavado três vezes com metanol e finalmente foram adicionados 25,5 g (70 mmol) de éster N1,1-dimetiletoxi ) carbonil/amino-3-f eniltiopropionil/--L-prolinametílico em 300 ml de metanol. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante três horas, filtrada e concentrada. Foram adicionados 70 ml de ácido clorídrico e a solução foi concentrada para dar 14?? (53%) do composto indicado em título.
Rf: 0,23 (20:1 de diclorometano/acetona). EXEMPLO 20 N-/2-/*( 1,1-dimetiletoxi) carbonil.7 amino-3-fenil-propil7-L-pro-lina
Foram dissolvidos 14,8 g (37 mmol) de éster U-£2-£(1,1-dimetiletoxi )carbonil_7amino-3-fenil-propil7 -L-prolina metílico em 100 ml de metanol e foram adicionados 50 ml de tetra-hidrofurano e 3,1 g (74 mmol) de hidróxido de -104- lítio monohidratado em 40 ml de t^O. A mistura resultante foi agitada durante 4 horas a 0°c. Depois da adição de 1,55 g (37 mmol) de hidróxido de lítio em 20 ml de í^O, a solução foi mantida a 09C durante 16 horas, extraída com 150 ml de hexano e acidificada para pH de 2,5. Os cristais resultantes foram recolhidos e secos para dar 11,3 g (88%) do composto indicado em título. R : 0,67 (65:25:4:3 de clorofórmio/metanol/H»0/ácido acético). Γ L· EXEMPLO 21
Sal ácido cítrico do éster N-/ffl-/í'2-Z'(l,l-dimetiletoxi)carbo-nil7amino-3-fenil-propilJ-L-prolilJ-L-isoleucina benzílico (1:1)
Foram dissolvidos em 65 ml de dimetilf ormamida 10,1 g (29 mmol) de N-2-/’(l ,1-dimetiletoxi)-carbonil7amino-3-fenil-propilJ-L-prolina e 13,1 g (33 mmol) de éster isoleucinabenzílico, sal do ácido toluenossulfónico (1:1) e foi mantida a temperatura de Osc. Foram adicionados a esta temperatura 15,8 g (137 mmol) de N-etilmorfolina e 25,5 g (40 mmol) de anidrido cíclico do ácido 1-propanofosfónico (solução a 50% em diclorometano e a mistura resultante foi agitada a 0°C durante cinco horas. A mistura reaccional foi concentrada ao vácuo e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e água, lavado três vezes com bicarbonato de sódio saturado, depois com água, depois três vezes com ácido cítrico 1-molar seco sobre MgSO^ e concentrado ao vácuo. O resíduo foi croma-tografado em sílica gel (20:1 de diclorometano/metanol) para dar 12,9 g (82%) do composto indicado entítulo. R„: 0,73 (10:1 de diclorometano/metanol). F ' EXEMPLO 22
Sal do ácido clorídrico do éster N-/N-/~2-amino-3-fenil-propil7--L-prolil7-L-isoleucinabenzílico (1:2)
Foram misturados com 5 ml de acetato de etilo 8,7 g (15,8 mmol) de éster N-/fl-/’(l,l-dimetil-etoxi )carbonil7amino-3-f enil-propil_7-L-propil7-L-isoleucina-benzílico seguido pela adição de 20 ml de uma solução 4M de ácido clorídrico em acetato de etilo. A mistura é agitada a^ OQC e foi obtido o composto com rendimento quantitativo.
Rp: 0,26 (10:1 de diclorometano/metanol). EXEMPLO 23 Éster N-£M-/2-/N-2-/T(1 ,l-dimetiletoxi)carbonil7-L-aspaEagijL/-amino-3-fenil-propilJ-L-prolilJ-L-isoleucinabenzílico
Foram dissolvidos em 15 ml de di-metilformamida 2,8 g (6,2 mmol) de éster N-/jN-/2-amino-3-fenil--propil7-L-prolil-L-isoleucinabenzílico e 1,45 g (6,3 mmol) de Boc-L-asparaginá seguido pela adição de 0,72 g (6,3 mmol) de N-etilmorfolina, 0,83 g (6,1 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole -106-
-\ hidratado e 1,42 g de diciclohexilcarbodiimida. A mistura resultante é agitada a OQC durante uma hora e depois à temperatura ambiente durante 15 horas. A solução é concentrada ao vácuo e o resíduo é cromatografado em sílica gel (19:1 de diclorometano/metanol) para dar 3,16 g (77%) do composto indicado em título.
Rp: 0,60 (20:3 de diclorometano/metanol). EXEMPLO 24
Sal do ácido clorídrico do éster N-ZN-/2-/L-asparagil7-amino--3-fenil-propil7-L-prolil-L-isoleucina benzílico (1:2)
Foram dissolvidos em 6 ml de uma solução 4M de ácido clorídrico em acetato de etilo 4 g (6,0 mmol) de éster N-/>J-/2-/N-2-/'(l,l-dimetiletoxi)carbonilJ7-L--asparagil7amino-3-fenil-propil7-L-prolíl7-L-isoleucinabenzí-lico e agitou-se a 0°C durante 4 horas. A solução foi concentrada ao vácuo e seca para dar 3,75 g (98%) do composto indicado em título. R„: 0,55 (50:4 de diclorometano/metanol). r
EXEMPLO 25 Éster N-/}$-Ç2-CÇ\i-2-fM-Ç(1, 1-dimetiletoxi)carbonil7-L-fenil-alanil7-L-asparagil7amino_7-3-f enil-propilJ-L-prolil^-L-isoleu-cina benzílico
Foram dissolvidos em 13 ml de di-metilformamida 3,6 g (5,6 mmol) de éster -/L-asparagil/- amino-3-fenil-propil7-prolil-L-isoleucinabenzílico e 1,85 g (7 mmol) de Boc-L-fenilalanina seguido pela adição de 3,7 ml (29 mmol) de n-etilmorfolina e 4,9 g (8 mmol) de anidrido cíclico do -acido 1-propanofosfónico (50% em diclorometano). A mistura resultante foi agitada a 5°C durante 2 horas e meia e concentrada ao vácuo, O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e água e lavado três vezes com ácido cítrico 1M, com água, três vezes com bicarbonato de sódio saturado, seco sobre MgSO^ e concentrado ao vácuo. O resíduo foi cromatografa-do em sílica gel (4:1 de diclorometano/acetona) para dar 3,88 g (85%) do composto indicado em título.
Rp! 0,71 (50:4 de diclorometano/metanol) EXEMPLO 26
Sal do ácido clorídrico do éster N-j3l-/^-/XN-2-/l-fenilalanil7--L-asparagil^amino7-3-f enil-propilj7-L-prolil7-L-isoleucinaben-zílico (1:1) -108-
Foram dissolvidos 2,5 g (3,1 mmol) de éster N-/Jl-/2-Z2N-/ll,l-dimetiletoxi)carbonil7-L-fenilala-nil7-L-asparagir7aininq7-3-f enilpropil7-L-prolil7-L-isoleucina benzílico em 7 ml de uma solução 4M de ácido clorídrico em acetato de etilo e agiteu-se durante 3 horas a 0°C, O solvente foi retirado para dar 2,4 g (99%) do composto indicado em título. R„: 0,36.(20:3 de diclorometano/metanol). Γ EXEMPLO 27 Éster N-/fo-/3-ZffiJ-2-/N-/N-Z~( 1,l-dimetiletoxi)carbonil7-L-se-ril2-L-fenilalanil7-L-asparagil7-amino7-3-fenil-propilJ-L--prolilJ-L-isoleucina benzílico
Foram dissolvidos em 12 ml de di-metilformamida 2 g (2,5 mmol) do composto indicado em título no exemplo 26 e 0,65 g (3,2 mmol) de Boc-serina seguido pela adição de 1,9 ml (14,9 mmol) de N-etilmorfolina e 2,2 g (3,6 mmol) de anidrido cíclico do ácido 1-propano fosfónico (50% em diclorometano). A mistura resultante foi agitada a 5SC durante 18 horas e concentrada ao vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e água e lavado com ácido cítrico 1M por três vezes, com água, 3 vezes com bicarbonato de sódio saturado, seco com sulfato de magnésio e concentrado ao vácuo. 0 resíduo foi cromatografado em sílica gel (10:1 de diclorometano/metanol) para dar 1,8 g (80%) do composto indicado em título.
Rp,: 0,39 (10:1:0,1 de diclorometano/metanol/amónia). -109-
EXEMPLO 28
Sal do ácido clorídrico do éster N-/N-/!2-/XN-2-/N-/N-L-seril7--L-fenilalanil7-L-asparagina7amino7-3-fenil-propir7-L-prolil7--L-isoleucina benzílico (1:2)
Foram dissolvidos 1,5 g (1,7 mmol) do composto indicado em título no Exemplo 27 em 2,5 ml de uma solução 4M de ácido clorídrico em acetato de etilo e agitou-se a 0°C durante 2 horas. A solução foi concentrada ao vácuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, concentrado e seco ao vácuo para dar 1,43 g (96%) do composto indicado em título.
Rp: 0,21 (10:1:0,1 de diclorometano/metanol/amónia). -110-
EXEMPLO 29 ' : ' físter N-/N-/2-^XN~2-/lJ-Z'N-ZN-Z~(l,l-(Íimetiletoxi)carbonil7-L·--valil7-L-eerir7-L-fenilalanil7-L-asparagil7-amino7-3-£enil--propil7-L-prolil7-L-isoleucinabenzilico
Foram dissolvidos 1,4 g (1,6 mmol) do composto indicado em título no exemplo 28 e 0,44 g (2 mmol) de BOC-valina em 8 ml de dimetilformamida e arrefeceu-se até OQC. Foram adicionados 1,1 ml (8,6 mmol) de N-etilmorfolina e 1,6 g (2,6 mmol) de anidrido cíclico do ácido 1-propano fosfcínico (50% em diclorometano) e a mistura foi agitada durante 18 horas e concentrada ao vácuo. O resíduo foi dissolvido em 100 ml de diclorometano e extraído 3 vezes com ácido cítrico 1M, com água, 2 vezes com bicarbonato de sódio saturado, seco com sulfato de magnésio e concentrado ao vácuo. O resíduo foi cromatografado em sílica gel (10:7:1 de diclorometano/acetona/ /etanol) para dar 0,45 g (28%) do composto indicado em título. R_: 0,38 (10:7:1 de diclorometano/acetona/etanol). Γ EXEMPLO 30
Acido l-/r(benziloxicarbonil )amino7-2-feniletilfosfínico -111-
ν '
Foi arrefecida até 0°C uma solução de 30 g (0,162 mol) de ácido l-amino-2-feniletilfosfínico (J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 2845 (1984)) em 460 ml de dio-xano e 175 ml de NaOH IN e agitou-se vigorosamente enquanto foram adicionados simultaneamente 47,7 ml (0,32 mol) de cloro-formato de benzilo e 345 ml de NaOH IN. A mistura reaccional foi agitada vigorosamente à temperatura ambiente durante 20 horas. A maioria do dioxano foi depois removida ao vácuo e a solução aquosa foi extraída duas vezes com éter. A camada etérea foi desprezada e a camada aquosa foi acidificada com KHSO^ aquoso para pH 1-2. A suspensão resultante foi extraída cinco vezes com acetato de etilo, os extractos combinados foram secos (Na2SO^) e concentrados. O resíduo foi agitado vigorosamente com éter, filtrado e seco ao vácuo para dar 49,3 g (95,3 %) do produto indicado em título sob a forma de um sólido branco .
Espectro de massa: m/z 342 (M+Na) R : 0,53 (140:80:20:1 de clorofórmio/metanol/água/ácido acéti- Γ co glacial). V-'- - -112-
Metil-1-Z*(benziloxicarbonil )amino7-2-f eniletilf osf inato
Foi adicionado a OQC uma solução de 9 g (28,2 mmol) do ácido fosfínico em 300 ml de acetato de etilo e 25 ml de metanol a uma solução (em excesso) de diazo-metano etéreo preparada recentemente. A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e depois destruída o excesso de diazometano por adição de alguns ml de ácido acético glacial. A solução foi concentrada e o resíduo foi cromatogra-fada em sílica gel com uma mistura 30:1 de diclorometano/meta-nol para dar 4,84 g (51,5%) do produto indicado em título.
Rp (20:1 de diclorometano/metanol): 0,52. -113-
EXEMPLO 32 Éster 2-/71-/( benziloxicarbonil) amino7-2-f eniletilj(metoxi) -fosfinil/ciclopentanocarbonilmetílico
Foi arrefecido até OQC uma solução de 4,83 g (14,49 mmol) do fosfinato em 40 ml de metanol seco e foram adicionados 978 mg (18,11 mmol) de metilato de sódio. A mistura foi agitada a OQC durante 10 minutos, altura em que foram adicionados de uma só vez 2,28 g (18,11 mmol) de ciclopenteno-l-carboxilato de metilo. A mistura foi agitada a OQC durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante a noite. Foram adicionados mais 98 mg (1,81 mmol) de metilato de sódio e a agitação foi continuada à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi tratado com HC1 0,1N, a solução aquosa foi extraída três vezes com acetato de etilo. Os extractos combinados foram secos (Na2S04), concentrados, e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 30:1 de diclorometano/metanol para dar 3,68 g (55,3%) do produto indicado em título.
Espector de massa: m/z 460 (M+H) R„: 0,51 (20:1 de diclorometano/metanol) V ' EXEMPLO 33
Acido 2-/‘Zl-/“(benziloxicarbonil )amino7-2-f eniletilj (metoxi)-fosfonil7ciclopentanocarboxílico
Foram dissolvidos 2,82 g (6,14 mmol) do éster em 12 ml de dioxano e 6,4 ml de NaOH IN e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi extraída duas vezes com acetato de etilo, os ex-tractos combinados foram secos (Na2S04), e concentrados para dar 2,66 g (97,3%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 446 (MH)
Rp: 0,39 (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/ácido fórmico). -115-
\ EXEMPLO 34 Híster N-Z~2-ZIA-benziloxicarbonil)amino7-2-feniletiJj(metoxi)- fosfinilTciclopentanocarbonilJ-L-isoleucina-metílico
Uma solução agitada de 2,64 g (5,93 mmol) do ácido fosfínico e 1,238 g (6,82 mmol) de hidro-cloreto do éster L-isoleucina metílico em 50 ml de diclorome-tano foram adicionados a 0°C 1,74 ml (13,63 mmol) de N-etil-morfolina, 0,962 g (7,12 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole, e 1,346 g (6,52 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. A mistura foi agitada a OQC durante 30 minutos, e depois à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada e o filtrado foi lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A camada orgânica foi seca (Na2SO^), concentrada e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 30:1 de diclorometano/metanol para dar 2,6455g (77,9%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 573 (M+H)
Rp: 0,53 (20:1 de diclorometano/metanol). -116-
EXEMPLO 35 ' ·' : . --..-- N-ZS-Z^l-Ztbenziloxicarbonil)amino7-2-feniletil7(metoxi)- -fosfinil/ciclopentanocarbonil7-L-isoleucina-(2-piridil)metil- amida
A uma solução agitada de 2,93 g (6,58 mmol) do ácido fosfínico e 2,226 g (7,56 mmol) de hidro-cloreto de L-isoleucina 2-aminometil-piridil amida em 55 ml de diclorometano foram adicionados a OSC 2,9 ml (22,7 mmol) de N-etilmorfolina, 1,07 g (7,89 mmol) de 1-hidroxibenzotriazo-le e 1,493 g (7,42 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. A mistura foi agitada a OSC durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada, e o filtrado foi lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A camada orgânica foi seca (Na2SO^), concentrada e 0 resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 30: 1 de diclorometano/metanol para dar 2,56 g (60%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 649 (M+H).
Rpj 0,35 (20:1 de diclorometano/metanol). -117-
EXEMPLO 36
Nl-amino-2-f eniletil) (metoxi )f osf inil7ciclopentanocar-bonil7-L-isoleucina-(2-piridil)metilamida
A uma solução de 2,54 g (3,92 mmol) de uretano em 60 ml de metanol foram adicionados 2,46 g (39,2 mmol) de formato de amónio e 0,65 g de paládio em carvão a 10%. A mistura foi aquecida sob refluxo numa atmosfera de árgon durante 1 hora, depois foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada. 0 filtrado foi concentrado, o resíduo foi dissolvido em diclorometano, filtrado outra vez, e o filtrado concentrado de novo para dar 1,98 g (98,2%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 515 (M+H).
Rf: 0,50 (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado ).
-118-
EXEMPLO 37 Éster N-^-Z^l-amino^-feniletil) (metoxi)fosfiniljciclopenta-nocarbonil7-L-isoleucina metílico
A uma solução de 2,45 g (4,28 mmol) de uretano em 55 ml de metanol foram adicionados 2,7 g (42,8 mmol) de formato de amónio e 0,60 g de paládio em carvão a 10%. A mistura foi aquecida sob refluxo numa atmosfera de argon durante 1 hora, depois foi arrefecida à temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi concentrado, o resíduo dissolvido em diclorometano, filtrado outra vez, e o filtrado concentrado novamente para dar 1,87 g (99,6%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 439 (M+H)
Rpi 0,32 e 0,25 (20:1 de diclorometano/metanol).
EXEMPLO 38 N-^-/,/l-/TN-2-(terc-butoxicarbonil)-L-asparagil7amino7-2-fe-niletiljmetoxiyfosf ini3i7ciclopentanocarbonilJ7-L-isoleucina--(2-piridil)metilamida
A uma solução agitada de 1,97 g (3,83 mmol) da amina e 0,98 g (4,21 mmol) de Boc-L-asparagina em 12 ml de DMF foram adicionados a 02C, 0,65 g (4,79 mmol) de 1-hidroxibenzo—triazole e 0,908 g (4,4 mmol) de diciclohe-xilcarbodiimida. A mistura foi agitada a 0°C durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada e a DMF foi removida ao vácuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (N^-SO^), concentrada e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com 15:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado para dar 1,29 g (46,2%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 729 (M+H).
Rp: 0,48 (9:1:0,1 de diclorometano/etanol/NH^ aquoso concentrado ). -120-
EXEMPLO 39 Éster N-/2-^/1-/7^1-2- (terc-butexicarbonil )-L-asparagiljamino--2-feniletilj (metoxi)fosfinilJciclopentano-carbonilJ-L—isoleu-cinametílico
A uma solução agitada de 1,86 g (4,24 mmol) da amina e 1,09 g (4,7 mmol) de Boc-L-asparagina em 13 ml de DMP foram adicionados a OQC 0,72 g (5,3 mmol) de 1-hidroxibenzo-triazole e 1,0 g (4,88 mmol) de diciclohesilcar bodiimida. A mistura foi agitada a 0°C durante 30 minutos, e depois à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada, e a DMF foi removida ao vácuo. O resíduo fòi disso^L vido em acetato de etilo e lavado:.duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2S0^) concentrada, e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com uma mistura 15:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado para dar 1,94 g (70,1%) do produto indicado em título .
Espectro de massa: m/z 653 (M+H) R„ : 0,52 (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NEL· aquoso concen Γ O "" trado) -121-
EXEMPLO 40 N-/12-//1-7(L-Asparagil )amino_7-2-f eniletil/ (metoxi )f osf inil_7ci-clopentano-carbonilT-L-isoleucina-(2-piridil)-metilamida
Uma solução de 1,11 g (1,52 mmol) de uretano em 16 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxa-no e 3 ml de metanol::seco foi agitada a 02C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado repetidamente com éter seco e concentrado outra vez, e finalmente foi seco ao vácuo para dar 1,07 g (100%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 629 (M+H) R : 0,20 (9:1:01 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concen-F *3 trado) -122-
EXEMPLO 41 Éster N-/~2-/7~l-/~N-/ÍSl-asparagil )-amino_7-2-f eniletilj (metoxi) fosfinilJ-ciclopentanocarbonil7-L-isoleucina metílico
H C 3
I A CO— HN CO 2CH 3
Uma solução de 1,67 g (2,56ommol) de uretano em 27 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxa-no e 5 ml de metanol seco foi agitada a OQC durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado repetidamente com éter seco e concentrado outra vez, e finalmente seco ao vácuo para dar 1,51 g (100%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 553 (M+H) R_ : 0,29 (9:1:0,1 de dielorometano/metanol/NH- aquoso concen
Γ J trado) -123- EXEMPLO 42 N-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil7-L-aspa-ragilXâmino7-2-feniletll7(metoxi)fosfinil7ciclopentanocarbo-nil^-L-isoleucina-(2-pirldil)metilamlda
A uma solução de 445 mg (168 mmol) de Boc-L-fenilalanina em 7 ml de diclorometano a 0°C foram adicionados 247 mg (1,83 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 361 mg (1,75 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. Depois da agitação a 09C durante 2 horas, foi adicionado uma solução de 1,07 g (1,52 mmol) da amina e 0,58 ml (4,57 mmol) de N-etilmorfolina em 10 ml de DMF e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada, e a DMF foi removida ao vácuo. O resíduo foi dissolvido em diclorometano e lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO^), concentrada, e o resíduo cromato-grafado em sílica gel com uma mistura 15:1:0,1 de diclorometa-no/metanol/NHg aquoso concentrado para dar 0,90 g (67,5%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 876 (M+H).
Rp: 0,42 (9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NHg aquoso concentrado) . -124- EXEMPLO 43
Ester N-r2-ZZl-£Z"N-2-ZN-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanll7--L-asparagil7amino7-2-feniletilj(metoxi)fosfinil7ciclopentano-carbonil7-L-isoleucinametílico
A uma solução de 747 mg (2,82 mmol) de Boc-L-fenilalanina em 12 ml de diclorometano a OQC foram adicionados 415 mg (3,07 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 607 mg (2,94 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. Depois de agitação a OQC durante 2 horas, foi adicionado uma solução de 1,51 g (2,56 mmol) da amina e 0,65 ml (5,12 mmol) de N-etil-morfolina em 16 ml de DMF, e a mistura foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. A solução foi filtrada e a DMF foi removida ao vácuo. Θ resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado duas vezes com NaHCO^ aquoso saturado e com salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO^), concentrada e o resíduo foi cromatografado em sílica gel com (15:1:0,1) de di-clorometano/metanol/NHg aquoso concentrado para dar 1,51 g (73,7%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 800 (M+H).
Rp: 0,56 (mistura 9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado). -125-
EXEMPLO 44 éster V\-Çl-[ÇL-βϋ- (terc-butoxicarbonil )-L-fenilalanil7--L-asparagil7,amino7-2-f eniletil^f osf inil^ciclopentanocarbonilj--L-isoleucinametílico
OH o CO-HN CO 2CHj A uma solução de 350 mg (0,44 mmol) de fosfinato de metilo em 3 ml de THF seco foram adicionado 118 mg (0,88 mmol) de iodeto de lítio. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 36 horas, depois foram adicionados mais 59 mg (0,44 mmol) de iodeto de lítio, e a agitação foi continuada à temperatura ambiente durante 24 horas. A solução foi concentrada e o resíduo foi repartido entre éter e NaHCOg aquoso a 5%. A camada de éter (contendo algum material inicial) foi desprezado e a camada aquosa foi acidificada com HC1 IN para pH 1-2. A mistura foi extraída três vezes com acetato de etilo, os extractos combinados foram secos (Na^SO^) e concentrados. O resíduo foi agitado com éter, filtrado e seco ao vácuo para dar 173 mg (50%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 786 (M+H). R„: 0,69 (mistura 140:80:20:1 de clorofórmio/metanol/água/áci- Γ do acético glacial). -126-
EXEMPLO 45 Ν-/2-ΖΆ-/Ζ^-2-ΖΜ-(terc-butoxicarbonil)-L-fenilalanil7-L-aspa-ragil7amino7-2-f eniletil/f osf inilJ7ciclopentanocarbonil7-L-iso-leucina-6-piridil)metilamida
A uma solução de 400 mg (0,46 mmol) do fosfinato de metilo em 3 ml de THF seco foram adicionado -123 mg (0,92 mmol) de iodeto de lítio. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, depois foram adicionados mais 123 mg (0,92 mmol) de iodeto de lítio, e a agitação foi continuada à temperatura ambiente durante dois dias. A solução foi concentrada, e o resíduo foi repartido entre éter e NaHCOg aquoso a 5%. A camada etérea foi desprezada e a camada aquosa foi acidificada com HC1 IN para Ph=4-5. A mistura foi extraída duas vezes com diclorometano, os extractos combinados foram secos (Na2SO^), e concentrados. O resíduo foi agitado com éter, filtrado e seco a<D vácuo para dar 90 mg {22,1%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 862 (M+H). R_: 0,70 (mistura 140:80:20:1 de clorofórmio/metanol/água/áci- Γ do acético glacial). -127-
EXEMPLO 46
Ester N-Z2-Z7l-ZZN-2-(L-fenilalanil)-L-asparagil7amino7-2-fe-niletil7(metoxi)fosfinil7ciclopentanocarbonil7-L-isoleucina-metílico
Uma solução de 0,8 g (1 mmol) do uretano em 11 ml de uma solução 4N de HC1 gasoso em dioxano e 5 ml de metanol seco foi agitada a OQC durante 1 hora. A solução foi depois concentrada, o resíduo foi triturado repetida-mente com éter seco e evaporado outra vez, e finalmente foi seco ao vácuo para dar 0,75 g (100%) do produto indicado em título.
Espectro de massa: m/z 700 (M+H) R„: 0,40 (mistura 9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH0 aquoso
Γ J concentrado). -128-
Ν*Χ
EXEMPLO 47
Ester N—/21—2—ZN—/lJ— (terc—butoxicarbonil )-L-serinil7--L-fenilalanil7-L-asparagil7amino7-2-£eniletil7(metoxi)fosfi-nilfciclopentanocarbonil2-L-isoleucina metílico
A uma solução de 226 mg (1,1 mmol) de Boc-L-serina em 5 ml de diclorometano a Osc foram adicionados 162 mg (1,2 mmol) de 1-hidroxibenzotriazole e 237 mg (1,15 mmol) de diciclohexilcarbodiimida. Depois de agitação a 0°C durante 2 horas, foi adicionado uma solução de 0,75 g (1 mmol) da amina e 0,25 ml (2 mmol) de N-etilmorfolina em 6 ml de DMF e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante dois dias. A mistura foi filtrada, o filtrado foi concentrado, o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, e lavado duas vezes com NaHCO^, aquoso saturado e com salmoura. A camada orgânica foi seca (Na2S04) concentrada, e o resíduo foi cromatogra-fado em sílica gel com uma mistura 15:1:0,1 de diclorometano/ metanol/NH^ aquoso concentrado.
Espectro de massa: m/z 887 (M+H) R^: 0,46 (mistura 9:1:0,1 de diclorometano/metanol/NH^ aquoso concentrado). -129-
Éster /lR,2R,2(4S ,5R ).7-/2-(4-benzil-3-terc-butoxicarbonil--2,2-dimetil-l,3-oxazolidin-5-il)ciclopentanocarbonil7-L-iso-leucina-O-benzílico
Foram dissolvidos 241 mg (90,53 mmol) do composto do exemplo 11 de fórmula IV e 239 mg (0,61 mmol) de sal do éster isoleucinabenzílico-ácido toluenossulfó-nico em 3 ml de Ν,Ν-dimetilformamida. Depois da adição de 369 mg (3,21 mmol) de N-etilmorfolina a solução foi arrefecida até OQC e foram adicionados 530 mg de uma solução a 50% de ácido propanofosfónico-anidrido (0,83 mmol) em diclorometano. A mistura resultante foi agitada a OQC durante 4 horas e a 20QC durante 24 horas. Todos os solventes foram retirados e o resíduo foi dissolvido em diclorometano e acetato de etilo (9:1: 15 ml) extraído com ácido cítrico (1 M: 10 ml) hidr§enocarbo-nato de sódio saturado (10 ml) cloreto de sódio saturado (5 ml) e seco sobre MgSO^. Os solventes foram retirados e o resíduo foi cromatografado em sílica gel (20 um) com acetato de etilo/ hexano (1:1) para dar 246 mg do composto indicado em título (76%). C36H51N2°6 (607,79) R„: 0,20 (mistura 5:1 de hexano/acetato de etilo). Γ -130
EXEMPLO 49
Sal clorídrico do éster N-/2-(2-amino-l-hidroxi-3-fenil-pro-pil)ciclopentanocarbonil7-L-isoleucina-0-benzílico
Foram dissolvidos 190 mg (313 umol) do composto anterior em 1 ml de acetato de etilo. A solução resultante foi evaporada até à secura e o resíduo foi tratado com 3 ml de HC1 em acetato de etilo (4N). A mistura resultante foi agitada a 59C até a reacção estar completa (controlo por TLC). Todos os solventes foram removidos ao vácuo. O resíduo foi usado sem purificação adicional para o passo seguinte. C28H39C1N2°4 (503,06).
Rp: 0,05 (1:1 de hexano/acetato de etilo). EXEMPLO 50 Éster N-i/2-/2-Z'N-2-^D.,l-dimetiletoxi)carbonilJ-L-asparagilJ7-amino-l-hidroxi-3-fenil-propil7ciclopentanocarbonil7-L-isoleu-cina-0-benzílico -131-
Foram dissolvidos 79 mg (341 pmol) de Boc-Asn-OH em 300 pl de Ν,Ν-dimetilformamida e adicionados a 170 mg (338 prnol) do composto anterior seguido pela adição de uma solução de 70 mg (340 pmol) de N,Ν-J-diciclohexilcarbodi-imida e 39 mg (340 pmol) de N-etilmorfolina e 47 mg (340 umol) de hidroxibenzotriazol em 700 pl de Ν,Ν-dimetilformamida. A mistura resultante foi agitada durante 2 horas a OQC depois 20 horas a 202C. Os solventes foram retirados e o resíduo foi dissolvido em 120 ml de CH2C12 e 30 ml de acetato de etilo. A camada orgânica foi extraída com ácido cítrico (25 ml, 1M), hidrogenocarbonato de sódio saturado (25 ml) e NaCl saturado (25 ml), seco sobre MgSO^ e evaporado para dar 235 mg de um produto impuro, que foi purificado por cromatografia em sílica gel (20 p) (1:2 acetato de etilo/CH2Cl2=>CH2C12=>1:20 MeOH/CH2Cl2) para dar 129 mg (56%) do composto indicado em título. C37H52N4°8 (680,82). R„: 0,57 (diclorometano/metanol 10:1). Γ -132-
EXEMPLO 51
Sal clorídrico do éster N-Z2-72-(L-asparagil)amino-l-hidroxi--3-fenil-propil7ciclopentanocarbonil7-L-isoleucina-0-benzilico
Foram suspensos 66 mg (96 umol) do composto anterior em 0,5 ml de acetato de etilo seguido pela adição de 2,5 ml de HC1 em acetato de etilo (4N). A solução transparente foi mantida a 49C durante 11 horas. Todos os solventes foram retirados para dar 59 mg de um produto, que foi usado sem purificação adicional. C32H45C1M4°6 (617'16) R_: 0,13 (10:1 de diclorometano)metanol). Γ EXEMPLO 52 Éster Ν-/^-/2-/Ν-2-Ζΐΐ-ΖΓ(1 , 1-dimetiletoxi )carbonil7-L-fenilala-nilJ-D-asparagilJamino-l-hidroxi-S-f enilpropil7ciclopentano-carbonilJr-isol·eucina-0 -benzi lico
Foram dissolvidos 54 mg (87 #umol) do composto anterior em 0,8 ml de N,N-dimetilformamida, seguido pela adição de 30,5 mg (115 pmol) de Boc-Fe-OH e 69 mg (0,6 mmol) de N-etilmorfolina. A mistura resultante foi arrefecida até 42C seguido pela adição de 78 jil (157 jimol) de uma solução a 50% de anidrido ácido propanofosfónico em diclorometano. Depois da agitação a 42C durante 11 horas todos os solventes foram removidos ao vácuo e o resíduo foi dissolvido em 10 ml de
CHg.C^ e 1 ml de acetato de etilo extraído com ácido cítrico (1M, 10 ml), NaHCO^ saturado (10 ml), NaCl saturado (10 ml), seco sobre MgS04 e evaporado para dar 77 mg de produto impuro. A cromatografia em sílica gel deu 61 mg (85%) do composto indicado em título. C46H61N5°9 (827,99) R : 0,68 (10:1 de diclorometano/metanol). Γ EXEMPLO 53
ENSAIO IN VIVO DA ACTIVIDADE DE HIV PROTEASE
Foram incubados linfócitos H9 7 (1 x 10 células/ml) na presença ou ausência de HIV-I durante 1 hora a 372C. As células foram lavadas completamente para re-mover ou viriões não adsorvidos e re-suspensos em 4 x 10 células/ml em meio de cultura. Foram colocadas partes alíquotas (um mililitro) em depósitos de 24 pratos de cultura por depósito contendo um volume igual de composto teste (diluído em meio de cultura). Depois de incubação durante três dias a 372C foi determinada a densidade da célula de culturas não infectadas para avaliar a toxicidade do composto teste. Foi usado um ensaio de captura de antigene p24 para determinar o nível de infecção por HIV em culturas tratadas de HIV. A capacidade dos compostos teste para inibir a resposta a HIV foi medida em diferentes concentrações de composto teste relativamente às culturas infectadas, não tratadas. EXEMPLO 54 50% de uM num 0 composto do Exemplo 25 mostrou inibição de formação de p24 a uma concentração de 200 sistema teste de acordo com o Exemplo 53. EXEMPLO 55 O processo de purificação de HIV protease é descrito em seguida. Todas as operações foram realizadas à temperatura ambiente, a não ser que indicado de outro modo. A) Lise Celular
Foram desenvolvidos a 282C o re-combinante E. coli contendo o plasmídeo de expressão MS2 num meio líquido contendo ampicilina (100 tig/ml) para uma densidade correspondente a uma obsorvância entre 0,55 e 0,6 a 600 nm. A temperatura desenvolvida foi então aumentada para 422C durante cerca de 10 minutos e a cultura foi mantida a esta temperatura durante 5 horas com agitação vigorosa. As células foram colhidas por centrifugação (8000 rpm num Rotor 6 x 400 ml Sor-· vall GS-3) e congelados sob a forma de uma pasta húmida a -802 até ser usada. Foi utilizada para a purificação uma quantidade de pasta (3,1 g) equivalente a 700 ml de cultura original. As células foram adicionadas a 15 ml de tris-HCl 50 mM de pH=8,0 contendo cloreto de sódio 50 mM, EDTA 1 mM e 0,1 mM PMSF (aqui posteriormente designado por "tampão A") à temperatura ambien- 135-
te. Foi depois adicionado lisozima de ovo de galinha (E.C.3.2. 1.17, Sigma (St. Louis, MO., USA grau L-6876) para 1 mg/ml final. Depois de 30 minutos, a amostra foi tomada para -80QC, congelada e depois derretido para 4QC. Trinta minutos depois de derretida foi adicionado Nonidet NP-40 (0,25% v/v final). Logo depois da adição do detergente, a solução tornou-se viscosa devido à lise celular e libertação de ácidos nucleicos. Depois de mais 30 minutos à temperatura ambiente, foram adicionados DNase I (Sigma (St. Louis, MO., U.S.A.), D-0 876, 0,1 mg/ml final) e cloreto de magnésio (10 mM final). Dentro de 5 minutos a mistura transformou-se de um estado viscoso para um estado. B) Extracção de Proteína do Corpo de Inclusão a partir de Li-sado Celular Total A proteína insolúvel na mistura de lise-celular foi recolhida por centrifugação (11.000 rpm x 10 minutos.num rotor Sorvall HB-4), suspensos outra vez em 30 ml de tampão A contendo 0,5% (v/v) de Triton X-100. A mistura foi mergulhada suavemente, depois foi passada rapidamente em redemoinho durante 20 minutos à temperatura ambiente, e em seguida centrifugada (11.000 rpm x 10 minutos). A pastilha foi outra vez suspensa em tampão A contendo Triton x-100 e o processo anterior foi repetido. A extracção em tampão A contendo triton foi realizado num total de três vezes de uma forma idêntica. A pastilha recolhida ter cerca da terceira centrifugação da mistura tratada com triton foi suspensa outra vez em água purificada de pacote (30 ml) por mergulhamento suave, passado rapidamente em redemoinho durante 20 minutos e depois centri-fugado (11.000 rpm x 20 minutos num rotor Sorvall HB-4). Este processo foi realizado um total deiquatro vezes de uma forma idêntica.
-136- C) Extracção em Concentrações A pastilha final de inclusão de proteína atrás obtida foi suspensa outra vez em 30 ml de tris 50 mM com pH = 8,0 contendo cloreto de sódio 50 mM e ureia 2M. A pastilha proteica foi suspensa de novo por suave mergulhamen-to, agitada à temperatura ambiente durante 90 minutos e depois centrifugada (11.000 rpm x 20 minutos). Este processo foi rea- y lizado num total de três vezes excepto em cada ocasião sucessiva a concentração final de ureia no tampão foi aumentada em 2 Μ. A proteína foi então resuspensa consecutivamente em tampão (30 ml) contendo ureia 2M, 4M e 6M. Pouco ou nenhuma proteína recombinante enriquecida contendo material relativo a HlV-protease foi solubilizada para ureia 2 a 6 M. Cerca de 50% da MS2-protease foi dissolvida subsequentemente em 10 ml do tampão anterior contendo ureia 8M. A restante fusão de MS2--protease não-solubilizada (recolhida sob a forma de uma pastilha por centrifugação a 11.000 rpm x 25 minutos) podia ser dissolvida em 10 ml de tampão contendo ureia 8M e 1% de mercap-toetanol.
D. Enrolamento e Concomitante Clivagem da Fusão de MS2-HIV Protease para dar uma Molécula de HlV-Protease 10KD
Foi desenvolvido q processo de diálise lenta, à temperatura ambiente: A substância proteica de inclusão purificada (0,22 mg proteína/ml foi determinada pelo ensaio BCA (Pierce, RocKford, II., USA) em tampão tris 5 mM de pH= 8,0 contendo cloreto de sódio 50 mM e ureia 8M, foi ajustado para ditiotreitol 20 mM (aqui posteriormente designado por "DTTS) em seguida foi dializado em relação a tampão tris 50 mM de pH = 6,8 contendo cloreto de sódio 50 mM, DTT 20 mM e ureia 6M (foi usado completamente um volume de razão de tampão de diálise/proteína=5.·Depois do período de -137- tempo não inferior a 2 horas, a partir a proteína foi dializa-da em relação a um volume recente do mesmo tampão em que a concentração final de ureia tivesse sido deminuída para 4M.
Pelo menos duas horas mais tarde a proteína sofreu diálise com um volume de tampão recentemente preparado contendo ureia 2M e 25% (v/v) de glicerol. Depois de pelo menos 2 horas a proteína foi transferida para diálise com um volume de tampão recentemente preparado contendo ureia 1,5 M e 20% (v/v) de glicerol. Durante esta fase a maioria de HlV-protease enrolava-se dando uma protease activa capaz de clivagem proteolíti-ca do associado de fusão MS2. Depois de 2 horas e meia a proteína foi dializada versus dois excessos de volume de cinco vezes consecutivos de acetato de sódio 50 mM de pH=5,2, contendo cloreto de sódio 50 Mm, DTT 20 mM, 20% (v/v) de glicerol 0,1% (v/v) de triton X-100 e ureia 1,5M. Isto causou o associado de fusão MS2 clivado, fusão de MS2 não clivado residual--HIV protease e traço contaminando a proteína a precipitar a partir da solução. Estas proteínas podiam ser removidas por centrifugação (28.000 rpm X 25 minutos num rotor Beckman S.W. 41 Ti) resultando numa camada sobrenadante contendo protease solúvel altamente puro de valor aprocimado de Mr= 10 KDa. O ensaio de proteína realizado nesta fase (Pierce (Rockford, IL., USA)BCA) indicou que uma célula de cultura 2L (cerca de 8,8 g de pasta de célula húmida) pode dar aprocimadamente 1 miligrama de proteína purificada. A ureia podia ser depois removida desta preparação de protease por diálise completa versus acetato de sódio 50 mM com pH=5,2 contendo cloreto de sódio 50 mM, DTT 20 mM, glicerol a 20% (v/v) e 0,1% (v/v)· de triton x-100. Na verdade, verificou-se que a protease ficava em solução se dializada subsequentemente a completar com o acetato de sódio 10 mM de pH= 5,2. -138-
EXEMPLO 56
Ensaio In vitro para a actividade de HIV protease O exemplo descreve o uso de N- -Dansil-SQNYPIV eomo um substrato para HlV-protease. A sequência de aminoácido deste substrato corresponde ao que alcança o ponto de clivagem entre pl7 e p24 na HIV gag poli-proteína. 0 ensaio é baseado em medidas da taxa de clivagem enzimática de N-dansilSQNYPIV para dar N-dansil-SQNY e PIV. A) Síntese de substrato peptídeo (N-dansil-SQNYPIV) e produto peptídeo autêntico (N-dansil-SQNY). Os peptídeos SQNYPIV e SQNY foram sintetizados num sintetiza-dor de modelo de peptídeo 430A ^Applied Biosystems, Inc.) usando química t-boc padrão de acordo com Merrifield (Merrifield R.B (1963) J. Amer, Chem. Soc. 85, 2149-2154), e utilizando resina de fenilacetamidometilo. A N-dansilação dos peptídeos foi realizada antes de serem clivados da resina como se segue; A resina-peptídeo (0,6 g peso seco) foi aumentada em 5 ml de uma mistura (95:5) de dimetilformamida/diisopropiletilamina depois foi misturada com um volume igual do mesmo solvente contendo 0,56 g de cloreto de dansilo (Pierce Chemical Co). Depois de um período de incubação de 2 horas à temperatura ambiente, as resinas foram lavadas consecutivamente com um excesso de cada um dos solventes seguintes num funil de vidro sinterizado (95:1) de dimetilformamida/diisopropiletilamina, dimetilformamida, diclorometano, isopropanol, dimetilformami-da. Depois de secagem das resinas ao vácuo a clivagem HF da resina ligada aos peptídeos de N-dansilo foi realizada de acordo com Merrifield. Finalmente, os peptídeos foram purificados por sucessiva HPLC (C18) utilizando primeiramente um protocolo gradiente linear de acetato de amónio 50 mM/aceto-nitrilo, e depois com um sistema gradiente de 0,1% de TFA/0,1% -139-
de TFA-acetonitrilo. A composição correcta- dè aminoácido de ambos os peptídeos foi confirmada.
B) Incubação de HlV-protease com Sintético N-dansil-SQNYPIV
As reacções são iniciadas a 37QC por adição de preparação de enzima armazenado (77 pg/ml) para alcançar as seguintes concentrações de componente t=0; protea-se lOKDa, (2,4-5,0 jig/ml); N-dansil-SQNY-PIV, (100-170 pM); cloreto de sódio, (2M); Tween 20, (0,017%$; Mes pH = 6,0 tampão, (50 mM). Em vários pontos seguintes à iniciação das reacções, são removidas partes alíquotas (5 a 10 ^il), acidificadas com 10 pl de TFA a 2% (v/v) e depois injectadas no sistema HPLC. A a-cidificação foi apresentada para terminar efecti-vamente as reacções, podem ser acumuladas grande número de amostras e depois postas de parte para subsequente análise au-tomátizada.
C) Análise HPLC da mistura Reaccional em B A RP-HPLC é realizada usando um Hewlett Packard HP1090 completo com solvente binário, compartimento de coluna aquecido e capacidade de auto-injecção. A detecção de fluorescência é realizada com um fluorímetro Gilson Model 121 filtro em linha (emissão entre 480-520 nm) em conjugação com um integrador Hewllet Packard Model HP 3396A. Partes alíquotas (1 a 25 jil) da mistura reaccional enzimática acidificada contendo substrato não convertido (N-dansil-SQNY--PIV) e os produtos da proteólise enzimica (N-dansil-SQNY e PIV) são depois injeetados sobre um Hypersil ODS, coluna de 5 um (4,6 x 100 mm). A cromatografia é realizada a 1,2 ml/mi-nuto e 50°C. 0 substrato e os produtos são separados isocrati-camente em acetato de sódio 100 mM de pH=6,5 contendo 29% (v/v) -140-
de acetonitrilo. São observados os seguintes tempos de retenção aproximados: N-dansil-SQNY-PIV (1,9 minutos), N-dansil--SQNY (1,35 minutos). A duração de tempo de formação do pro-5 duto pode ser usada para calcular as velocidades iniciais se estas são necessárias para estudos enzimológicos mais rigorosos. Alternativamente, as actividades relativas podem ser calculados a partir de medidas de tempo pontuais simples. A incubação da protease altamente pura com o substrato peptídeo (170 uM) na gama de pH de 4 a 8,5 resultou numa interconversão dependente do tempo do substrato para o produto dansilado. Não são observados outros me-tabolitos. O produto fluorescente gerado enzimaticamente foi confirmado como N-dansil-SQNY por espectroscopia com bombardeamento por átomos rápidos. 0 perfil de pH para a reacção é "em forma de sino" exibindo um ponto óptimo entre pH igual a 5,5 e pH igual a 6,0. A actividade da protease neste ensaio é fortemente dependente da concentração iónica. A concentração iónica óptica usando como sal o cloreto de sódio em tampão Mes 25 mM com pH igual a 6,0 foi de 2M. Concentrações mais ele vadas de sal produzem uma estimulação mais pequena de activida de enzimática. A actividade enzimática não é perdida em diluição extensiva do enzima. A Tabela I aqui apresentada em seguida descreve os resultados do uso do anterior ensaio de protease 10 K Da descrito assim como o ensaio de infecção da célula na avaliação da potência inibidora dos compostos dos Exemplos atrás descritos. -141-
Composto do Ensaio do Exemplo 53 Ensaio do Ex 57
Exemplo % de Inibição (uM) IC50 07 0 (100) >1000* 08 0 (100) >1000* 15 0 (100) 75 15a 0 (20) 8 16 50 (100) 21 19 0 (100) >1000* 20 0 (100) >1000* 21 0 (10) 50 23 0 (10) 29 24 0 (10) >1000* 25 40 (100) 60 27 0 (10) 20 28 0 (10) 11 29 0 (100) 20 42 44 44 7 45 4 48 140 50 70 # < 10% de inibição observada para concentração de inibi-dor de 100 uM. -142-
De notar que' *a presente especif 1 cação e reivindicações são apresentadas como ilustração e não limitação e que podem ser feitas várias modificações e altera ções sem desvio do espírito e âmbito do presente invento.

Claims (4)

  1. -143-
    REIVINDICAÇÕES: lã. - Processo para a preparação de ura composto da fórmula (A1) - (Z) - (Y) - A" K n m em que 0 II A' é R -C, ou hidrogénio; 1 , 2 3 2 2 3 4 R é OR , NR°R^ ou CR^R^R*, 2 3 4 R , R , R sao, independentemente um do outro, hidrogénio, um grupo alifático substituído ou não substituído contendo 1 a 20 átomos de carbono ou um grupo aromático substituído ou não substituído contendo 6 a 18 átomos de carbono, em que K é um ou zero, com a condição de quando Z for hidrogénio, K ser zero, Z é hidrogénio ou resíduo aminoácido Ser ou Thr ou 0 1 u 2. R -C, em que R é como atrás definido, em que n é um ou zero desde que quando Y foi hidrogénio, n seja zero, 0 1 II 1 Y é hidrogénio ou R -C, em que R é como atrás definido ou um grupo tendo a fórmula: 144-
    9 em que R é hidrogénio ou um grupo alifático C^-C^g, substituído ou não substituído ou um grupo aromático não substituído ou substituído com 6 a 18 átomos de carbono, em que o subs-tituinte é 0 II -OH, -C , SH
    / H N
    NH NH. ou um grupo aromático com 6 a 18 átomos de carbono, em que R , R e R são como atrás definido, em que m é um ou zero, desde que quando for hidrogénio, m seja zero, A" é seleccionado a partir de um grupo consistindo de -145-(b) -
    .o \' <a) - (c)
    0 em que „1 ' que R e 4 λ r r 1 " é hidrogénio ou resíduo aminoácido Asn ou R -C, em como atrás definido, em que o símbolo J Q, Q > Q" representa um sistema de anel substituído ou não substituído, que é de 4 a 7 membros, em que apenas Q, Q’, Q" pode ser dife- -146-
    rente de carbono em que o substituinte;é um grupo alifático C,-C,„ ou um grupo aromático com 6 a 12 átomos de carbono,em 1 χι 3 que E é C; em que E é, II 0
    for desde que quando E 2 -147-
    \
    ΝΗ ΟΗ, Ο 4 2 " Ε nao seja R -O-C-, , 5 em que o anel e com 4 a 7 membros, em que R é um grupo aromático não substituído ou substituído com 6 a 18 átomos de carbono, ou um grupo alifático não substituído ou substituído com 1 a 18 átomos de carbono, em que X é hidrogénio ou R^ ou um grupo com a fórmula H I N
    R1 2 3 4 5 1 ✓ 2 em que R é um grupo alifático substituído ou não substituído 3 com um a dez átomos de carbono ou um grupo aromático substi 4 tuído ou não substituído com 6 a 12 átomos de carbono, em que 5 o substituinte é, A R 1 ou um grupo alifático C,-C,0 ou um grupo aromático com 6 a 12 /· **" τ 1 n átomos de carbono, em que R é como atrás definido, em que R é hidrogénio ou
    t 0 1 C ou em que A 2 é um grupo tendo a fórmula H
    R
    em que R^ e R^ são como atrás definidos e os referidos compos- -149-
    tos activos terapêuticos existirem também em formas estereo-químicas diferentes e misturas das referidas formas, e sais farmacêuticamente aceitáveis ou ésteres do referido composto; caracterizado por se fazer reagir compostos de fórmula geral V
    em que X1 , Y' , Z' são tal como atrás foi definido em que m', n', p1 são tal como atrás foi definido em que 12 13 R , R são tal como atrás foi definido em que L01 02 T 03 T 04 r 05 06 independentemente ums dos ,12 outros representam hidrogénio ou halogéneo ou OR ou 1213 121314 nn12n13n14 MD12D13n14 NR R ou CR R R ou PR R R ou NR R R ou ciclopentadienilo substituído ou insubstituído ou arilo inferior insubstituído ou substituído ou heteroarilo inferior insubstituído ou substituído em que 12 13 14 R , R , R são tal como atrás foi definido ou dois sentam em que (2) L08 dos substituíntes mencionados, (L09), L10 em conjunto, repre-
    L10 NR independentemente um do outro representam 12 13 12 13 12 -^R , PR±ZR , NR^ em que em que 12 13 R , R são tal eomo atras foi definido r 09 . _„12_13 L representa CR R em que 12 13 R , R são tal como atrás foi definido e se j >1 os substituintes dos diferentes átomos de carbono podem ser escolhidos independentemente, em que j representa um número compreendido entre um (1) e cinco (5) em que a, b, c, d, e, f, representam independentemente uns dos outros um número compreendido entre zero (0) e seis (6), e a+b+c+d+e+f+h = n em que n representa um número compreendido entre dois (2) e dez (10), e n não pode exceder o número máximo de ligandos para um dado núcleo metálico, em que M representa lítio, sódio, potássio, boro, magnésio, alumínio, silício, titânio, vanâdio, crómio, mangané-sio, germânia, zircónio, nióbio, molibdénio, estanho, antimónio, lantanídeos, háfnio, tântalo, tungsténio, rénio, em que g representa um número compreendido entre um (1) e cinco (5), e se g> 1 M pode representar mais do que um metal, em que h representa um número compreendido entre um (1) e cinco (5), com aldeídos ou cetonas de fórmula VI -151
    2' R20
    em que „19 „20 „21 „23 „24 „ . . R , R , R , R , R sao tal como atras foi defini do , em solvente inertes, seguido de oxidação em condições ácidas, e por se acoplarem os restantes amino-ácidos ao composto obtido utilizando processos convencionais da química dos peptídeos. 2ã. - Processo para a preparação de um composto terapêutico activo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Z ser Ser ou Thr. 3ã. - Processo para a preparação de um composto terapêutico activo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado por Z ser Ser ou Tre. 4ã. - Processo para a preparação de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 3 4 1 a 3, caracterizado por R , R e R serem, mdependentemente um do outro, alquilo C-^-C^q substituído ou não substituído al- quenilo C2-C20 n^° sut3st;'-i:;u^do ou substituído, alquinilo, al-quinilo Cg-C-^Q não substituído ou substituído ou aromático
    40C3-C10 não substituído ou substituído'èmguè os substituin- tes para os referidos alquilo, alquenilo e alquinilo são se- leccionados a partir de um grupo consistindo de alquilo C^-C^., aromático C-.-C19, halogénio; hidroxi, e um amino de fórmula 87 ^ xz8 7 -NR R , em que R e R são, independentemente um do outro, halogénio, alquilo C-^-C2q ou oxigénio; e os substituintes para o referido aromático são seleccionados a partir de um grupo consistindo de alquilo C^-Cg, aromáticos cg~c^2' haí°9aní° '1 hidroxi; e amino da fórmula -NR^-R^, em que R e R são, independentemente um do outro, halogénio, alquilo C]_“C^0' ox^-<3®“ nio, alquenilo C2-C20 OU alc3u:*-n^l0 C'3-C20‘ 5ã. - Processo para a preparação de um composto terapêutico activo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o halogénio ser seleccionado a partir de um grupo consistindo de cloro, flúor, bromo e iodo. 6§. - Processo para a preparação de um composto terapêutico activo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 e 5, caracterizado por o aromático ter 6 a 10 átomos de carbono. 7^. _ Processo para a preparação de um composto terapêutico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por A" ser seleccionado a partir de um grupo consistindo de -153-
    CO-X-
    -154-
    2 em que R é como definido de acordo com'a reivindicação 1, em 5 que R é fenilo, p-hidroxifenilo ou ciêiohexilo, em que X é hidrogénio ou R"*" ou um grupo contendo a fórmula / H I N R10 6 ✓ em que R é seleccionado a partir de um grupo consistindo de metilo, etilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, ci-clohexilo, fenilo, piridilo sendo todos não substituídos ou substituídos por
    0
    ou 1 R fenilo, piridilo, naftilo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec-butilo ou isobutilo, em que R"*- é como atrás definido em que é hidrogénio ou -155-
    e em que e A são como atrás definidos.
  2. 89. - Processo para a preparação de um medicamento para o tratamento do HIV, caracterizado por se incluir no referido medicamento uma quantidade farmacêuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em mistura com um veículo farmacêuticamente aceitável.
  3. 99. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto que compreende a fórmula III
    -156-
    e os seus sais 11 12'‘ 12 13 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR.: ou NR R ou CR R - R^"4 ou SiR^R^R^"4 e Z' é zero (0) ou um (1); e se Z1 é zero, 11 17 R" é hidrogénio, e R e R não representam uma ligação sim- , li , 12 13 14 pies; se z' e um, R nao e hidroxilo, em que R , R , R independentemente um do outro representam hidroxilo ou alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído ou arilo substituído ou não substituído ou heteroarilo substituído ou não substituído ou aralquilo substituído ou não substituído em que os substituintes do referido alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, al- 15 16 quilo cicloalquilo, arilo, heteroarilo, NR R , hidroxi, al- 15 16 coxi, ariloxi, aralcoxi, em que Rx , R-1 representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo ou cicloalquilo 15 16 ou arilo ou aralquilo ou heteroarilo, ou R e R representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a dez átomos de car- ✓ 11 17 bono que pode ser substituído por grupos alquilo ou R e R representam juntos uma ligação simples.em que M' representa OR·^, em que R"^ representa hidrogénio ou CR^2R^3R^4ou CO-R^, 12 13 4 em que R , R , R são como atrás definidos mas podem ser es- 18 colhidos independentemente, em que R representa hidrogénio ou OR12 ou NR12R13 ou CR12R13R14, em que R12, R13, R14 são 17 11 como atrás definidos, ou R e R representam juntos uma li- 17 23 12 13 gação simples ou R e R representam um grupo CR R em 1213 25 que R , R são como atrás definidos ou W e R representam 19 20 21 juntos uma ligação simples em que R , R , R representa hidrogénio ou alquilo não-substituído ou substittiido ou cicloalquilo substituído ou não-substituído ou arilo substituído ou não-substituído ou heteroarilo substituído ou não-substituído ou aralquilo substituído ou não substituído, em que os substituintes são escolhidos a partir de um grupo consistindo de COR22, NR·*"3, rÍ® , SR”^, arilo, heteroarilo, alquilo, cicloalquilo, halogénio, hidroxi, alcoxi, ariloxi, ou um grupo contendo a fórmula -157-
    V 1 c ΐί R R NC(=NH)NH- , . . - 4 22 , 12 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou 121314 _12 „13 „14 . , . .. CR R R , em que R , R , R sao como atras definidos, em 15 16 2 3 que R e R-*" são como atrás definidos, em que R^ representa , 12 13 14 12 13 14 22 hidrogénio ou SiR R R ou CR RR ou COR ou arilo ou 12 13 14 22 heteroarilo, em que R , R , R , R são como atrás defini- 23 17 12 13 dos ou R e R representam juntamente um grupo CR R em 12 13 . 24 que R e R sao como atras definidos, em que R representa 25 25 OR , em que R representa alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que o substituintes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de ha- ' 15 16 logénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo NR R , 15 16 hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, em que R , R representam independentemente um do outro hidrogénio, alquilo 24 17 cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, ou R e R re- 12 13 presentam uma ligaçao simples em que X1 representa CR R ou 12 13 12 13 R C=CR ou C=c, em que R e R são como atrás definidos, em que m1 representa um número entre zero (0) e dez (10), e 12 12 13 + 2<m'+n'+p<8, em que Y' representa 0,>ou S ou NR ou R R N c.ra12„l3 „12 _ „13 _ _ „12 „13 ~ ou SiR R ou R C=CR ou C=C, em que R , R sao como atrás definidos em que n' representa um número entre zero (0) 12 13 e dez (10), e 2<m'+n'+p"<8, em que Z1 representa CR R ou 12 13 12 13 R C=CR ou CC, em que R , R são como atrás definidos, em que p' representa um número entre zero (0) e dez (10), e 2<m' +n' +p '<8. lOi. - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por R" representar hidrogénio ou OR12 ou NR12R13 ou CR12R13R14 12 13 14 ou SiR RR , z' ser zero (0) ou um (1); se z' for zero,R" é hidrogénio e R não representa uma ligação simples; se z' for um, R" não é hidroxilo, em que R"*"2, R13, R^"4 representam -158-
    :ndependentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior substituído ou não substituído ou arilo inferior não substituído ou substituído, ou heteroarilo inferior não substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituintes destes grupos alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo inferior, cicloalquilo inferior 15 16 arilo inferior, heteroarilo inferior, NR R , hidroxi, alco-xi inferior, ariloxi inferior, aralquiloxi inferior, em que R , R são independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior ou aralquilo inferior ou heteroarilo inferior ou R e Rx reprè-sentam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a 6 átomos de carbono que podem ser substituídos por alquilo inferior ou 17 R" e R representam juntamente uma ligação simples, por M1 17 17 , 12 13 representar OR , em que R representa hidrogénio ou CR R „14 _. 12„13„14 „18 „12 „13„14 ~ ^ , R ou SiR R R ou CO-R , em que R , R R sao como atras definidos mas podem ser escolhidos independentemente em que 18 1? 1918 191814. R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR RR , em „12 „13 „14 ~ „17 „11 que R , R , R sao como atras definidos ou R e R repre- 17 23 sentam juntamente uma.ligação simples ou R e R represen- 12 13 12 13 tam juntamente um grupo CR R , em que R , R sao como 25 atrás definidos ou por M1 e R representarem juntamente uma 19 20 ligação simples por R e R representarem hidrogénio ou alquilo inferior ou arilo inferior ou heteroarilo inferior, por R representar hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior não substituído ou substituído ou a rilo inferior não substituído ou substituído ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído, em que os substituintes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo con-sistindo de COR^ , NRX'>RJ" , SRX , arilo inferior, heteroarilo inferior, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, halogénio, hidroxi, alcoxiiinferior, ariloxi inferior, aralquiloxi inferior, ou um grupo contendo a fórmula -159-
    R15R16NC(=NH)NH- 22 12 12 13 em que R representa hidrogénio oú OR ou NR-.-.oR ou ^,„12 13-14 m _12 -13 „14 - CR R R , em que R , R , R sao como atras definidos em X5 16 23 que R e R são como atrás definidos por Rz representar hi- ✓ 12 13 14 121314 22 drogenio ou SiR R1JRi4 ou CR RR ou COR ou arilo infe- 12 13 14 22 rior ou heteroanlo inferior em que R , R , R , R são 23 15 como atrás definidos ou R e R representarem juntamente um 12 13 12 13 grupo CR R , em que R e R são como atrás definidos por 24 25 25 R representar OR em que R representa alquilo não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior ou arilo infer-rior ou arilo inferior não substituído ou substituído ou hete-roarilo inferior não substituído ou substituído ou aralquilo inferior não substituído ou substituído em que os substituin-tes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de alquilo inferior, cicloalquilo inferior, arilo infe- 24 rior, aralquilo inferior ou heteroanlo inferior ou por R e 17 R representarem juntamente uma ligaçao simples por X' repre- 12 13 12 13 sentar CR R ou R C=C ou C=C 12 13 em que R e R são como atrás definidos por m' representar um numero entre zero (O) e cinco (5) e 12 12 13 + 2<m'+p<8 por Y' representar 0 ou S ou NR ou R R N ou „ .012π13 12 13 12^, „„13 _ „ „12 „13 ~ SiR R ou CR R ou R C=CR ou C=C em que R e R sao como atrás definidos por n' representar um número entre zero 12 13 (0) e cinco (5), e 2<m1+n1+p'+<8, por Z' representar CR R 12 13 12 13 ou R C=CR ou C=C, em que R e R são como atrás definidos por p' representar um número entre zero (Θ) e cinco (5), e 2<4m'+n'+p'4 8.
  4. 111. - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por R^ representar hidrogénio ou OR"*"^ ou NR^R"^ ou CR^R^R^"4 ou SiR^R^R^4 por z' ser zero (0) ou um (1); se z' for zero, é hidrogénio e R·^ e R17 não representam uma ligação sim- 160- 11 , ' ·'; - ' 12 13 14 pies; se z1 for um R não é hidroxilo em que R , R e R representam independentemente um do outro hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-buti-lo, pentilo ou ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou fe- nilo, tolilo, naftilo ou piridilo, furilo, tienilo ou benzilo, 11 17 naftilmetilo, fenetilo, femlpropilo, ou R e R representa- 17 rem juntamente uma lxgaçao simples por M' representar OR , „17 _d12„13d14 c.d12d13d14 em que R representa hidrogénio ou CR R R ou SiR R R __ „18 _ 12 „13 „14 „ , , c. . , ou CO-R em que R , R e R sao como atras definidos mas 18 podem ser escolhidos independentemente em que R representa ... , . „d12 .12 3.3 12 13 14 _12 _13 hidrogénio ou OR ou NR R ou CR R R em que R , R e 14 17 11 R são como atrás definidos ou R e R representam junta- 17 23 mente uma ligação simples ou R e R representam juntamente 1213 12 13 um grupo CR em que R e R são como atrás definidos por 25 19 M1 e R representarem juntamente uma ligaçao simples por R representar hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo, pentilo, hexilo, fenilo, naf-tilo, por R representar hidrogénio, por R representar hidrogénio ou metilo não substituído ou substituído, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo, pentilo, hexilo ou ciclopropilo não substituído ou substituído, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo ou fenilo não substituído ou substituído, tolilo, naftilo ou piridilo não substituído ou substituído, tienilo, quinolilo, furilo tiazolilo ou benzilo não substituído ou substituído, naftilmetilo, fenetilo, fenil-propilo em que os substituintes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de COR^ , NR^^R"1· , SR"1, , fenilo, naftilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo, imidazolilo, benzimidazoílo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo, pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, halogénio, hidroxi, me-toxi, etoxi, propoxi, butoxi, fenoxi, naftoxi, benziloxi, naf-tilmetoxi ou um grupo contendo a fórmula -161-
    22 12 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR ; . ou NR R ou _π12π13η14 12 _13 n14 „ CR R R , em que R , R e R sao como atras definidos, 15 16 em que R e R são independentemente um do outro hidrogénio, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.- -butilo, pentilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, fenilo, naftilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpropi- 15 lo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo ou R e 16 R representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a 23 cinco átomos de carbono por R representar hidrogénio ou 12 13 14 12 13 14 22 SiR V R ou CR RR ou COR ou fenilo ou naftilo ou n12 _13 14 „22 ~ , , . . , emcque R , R , R e R sao como atras definidos ou por 23 17 12 13 R e R representarem 3untamente um grupo CR R , em que R·^ e R1^ são como atrás definidos por R^ representar OR^, 25 em que R representa metilo, etilo, propilo, isopropilo, bu-tilo, isobutilo, sec.-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo, tienilo, furilo, piridilo, fluorenilmetilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, 24 17 fenilpropilo, ou por R e R representarem juntamente uma 12 13 12 13 ligaçao simples, por X1 representar CR R ou R C=CR ou 12 13 C=C, em que R e R são como atrás definidos por m' representar um número entre zero ($) e cinco (5), e 2<m1+n1+p'<6, por Y' representar 0 ou S ou NR^ ou R^R^N+ ou SiR^R^ ou „12 13 12 _13 12 13 ~ , CR R ou R C=CR ou C=C, em que R e R sao como atras definidos, por n' representar um número entre zero (0) e cinco (5) e 2<£m1 +n1 +p"^6, por Z1 representar CR^R"^ ou R"^C=CR^ 12 13 ou C=C em que R e R são como atrás definidos por p' representar um número entre zero (0) e cinco (5), e 2<m'+n'+p'^8. 12ã. - Processo para a preparação de um composto que compreende a fórmula IV -162-
    e os seus sais, 11 12 12 13 12 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR - -13.,14 „.012013d14 d12 _13 JL4 RR ou SiR RR , em que R , R e R representam m- dependentemente um do outro hidrogénio ou alquilo não substituído ou substituído por cicloalquilo substituído ou não substituído ou arilo não substituído ou substituído ou heteroari-lo substituído ou não substituído ou aralquilo não substituído ou substituído, em que os substituintes destes grupos alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo, ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alqui- 15 16 lo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, NR R , hidroxi, alco- 15 16 xi, ariloxi, alalcoxi, em que R e R representem independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo ou cicloalquilo ou aralquilo ou heteroarilo ou R e Rx representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a dez átomos de carbono que 11 17 podem ser substituídos por grupos alquilo ou R e R repre- 17 sentam uma ligaçao simples, em que M1 representa OR , em que R representa hidrogénio ou GR R R ou CO-R em que R , 13 14 R e R são como atrás definidos mas podem ser escolhidos 18 12 independentemente, em que R representa hidrogénio ou OR MD12 13 ^,^12-13-14 -12 -13 _14 „ . , ou NR R ou CR R R em que R , R e R sao como atras . . 17 11 definidos ou R e R representam juntamente uma liqação sim- 17 23 12 13 pies ou R e R representam juntamente um grupo CR R , em -163-
    12 13 25 que R e R são como atrás definidos ou M' e R represen- 19 20 21 tam juntamente uma ligação simples, em que R , R e R representam hidrogénio ou alquilo não substituído ou cicloal-quilo não substituído ou substituído ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substi-tuintes são escolhidos a partir de um grupo consistindo de COR , NRX R , SR , arilo, heteroarilo, alquilo, cicloalqui-lo, halogénio, hidroxi, alxosi, ariloxi, ou um grupo contendo a fórmula r15r16 NC(=NH)NH- em que „22 , , . _„12 1213 „„12„13„14 R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR R R , „12 „13 „14 ~ „15 em que R , R e R sao como atras definidos em que R e 16 2 3 R são como atrás definidos, em que R representa hidrogé- e .„12„13 14 _„12„13„14 __„22 „12 „13 mo ou SiR R R ou CR R R ou COR em que R , R 14 22 , 23 17 R e R são como atras definidos ou R e R representam 12 13 12 13 juntamente um grupo CR R em que R e R são como atrás definidos, em que 24 25 25 R representa OR , em que R representa alquilo não subbs-tituído ou substituído ou cicloalquilo ou arilo não substituído ou substituído ou heteroarilo não substituído ou substituído ou aralquilo não substituído ou substituído em que os substituintes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, 15 16 heteroarilo, N R , hidroxi, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, 15 16 em que R e R representam independentemente um do outro hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroari-24 17 lo ou R e R representam juntamente uma ligação simples, 12 13 12 13 123 13 em que X' representa CR R ou R C=CR ou C=C que Rx e Rx são como atrás definidos, em que m' representa um número entre -164-
    zero (0) e dez (10) e 2<m'+n1+p'+<8 em que Y1 representa 0 ou 12 12 13 + 12 13 12 13 12 13 S ou NR ou R RXJN+ ou SiR R ou CR R OU R C=CR ou 12 13 C=C, em que R e R sao como atras definidos, em que n' representa um número entre zero (0) e dez (10) e 2θι'+n'+p'<8, 12 13 1213 i? em que Z' representa CR R ou R C=CR ou C=C, em que R 13 e R são como atrás definidos, em que p’ representa um número entre zero (0) e dez (10), e 2<m1+n'+p'<8; caracterizado por se fazer reagir compostos de fórmula geral V 01 02 03 t d") a <L“‘> b <L“J> c a04) d (LU=) . (1“-, fM 1 05, 06,
    nrbr'3 em que X', Y' e Z‘ são como atrás foi definido em que m', n1 e p' são tal como atrás foi definido em que 12 13 R e R são tal como atrás foi definido em que T01 T02 r03 T04 r05 r06 . . , L , L , L , L , L , L mdependentemente uns dos 12 outros representam hidrogénio ou halogénio ou OR ou 12 13 12 13 14 nD12D13D14 ^12^13,,14 NR R ou CR R R ou PR R R ou NR R R ou ciclopentadienilo substituído ou insubstituído ou arilo inferior insubstituído ou substituído ou heteroarilo inferior insubstituído ou substituído em que r12 ^ r13 e r14 s~q como atrás foi definido -165-
    ou dois (2) dos substituintes mencionados;.,; em conjunto, repre- . . 08 ,r09. .10 sentam L (L ), L em que l08 ^ L10 in(jepen(jen^emente um do outro representam 12 12 13 12 13 12 OR . NR R . PR R . NR em que 12 13 R , R são tal como atrás foi definido em que r 09 . „π12π13 L representa CR R em que 12 13 R e R são tal como atrás definido e se j > 1 os substituintes dos diferentes átomos de carbono podem ser escolhidos independentemente, em que j representa um número compreendido entre um (1) epcin-co (5) em que a, b, c, d, e, f representam independentemente uns dos outros um número compreendido entre zero (0) e seis (6), a a+b+c+d+e+f+h = n em que n representa um número compreendido entre dois (2) e dez (10), e n não pode exceder o número máximo de ligandos para um dado núcleo metálico, em que M representa lítio, sódio, potássio, boro, magnésio, alumínio, silicío, titânio, vanádio, crómio, mangané-sio, germânio, zircónio, nióbio, molibdénio, estanho, antimónio, lantanídeos, háfnio, tântalo, tungsténio, rénio, em que g representa um número compreendido entre um (1) e se -166-
    cinco (5), e se g 1 M pode representar mais do que um metal, em que h representa um número compreendido entre um (1) e cinco (5), com aldeídos ou cetonas de fórmula VI R21 R20
    em que „19 „20 „21 „23 „24 R , R , R , R , R sao tal como atras foi definido, em qolventes inertes, seguido de oxidação em condições ácidas, 13ã. - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- 11 / 12 12 13 do por R representar hidrogénio ou OR ou NR R ou _„12„13„14 „.„12„13„14 „12 „13 „14 . . CR R R ou SiR RR em que R , R e R representa m- dependentemente um do outro hidrogénio, ou alquilo inferior não substituído ou substituído, ou cicloalquilo inferior substituído ou não substituído ou arilo inferior não substituído -167-
    ou substituído, ou heteroarilo não substituído ou substituído, ou aralquilo não substituído ou substituído, em que os substi-tuintes destes grupos alquilo, cicloalquilo, aralquilo, arilo ou heteroarilo são escolhidos a partir de um grupo consistindo de halogénio, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, ari- 15 16 lo inferior, heteroarilo inferior, NR R , hidroxi, alcoxi 15 inferior, anloxi inferior, aralquiloxi inferior, em que R 16 e R representam independentemente um do outro hidrogénio ou alquilo inferior ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior, 15 16 ou aralquilo inferior ou heteroarilo inferior ou R e R representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a seis átomos de carbono que podem ser substituídos por alquilo in-11 17 ferior ou R e R representarem uma ligação simples por m' 17 17 12 13 representar OR , em que R representa hidrogénio ou CR R „14 „18 „12 13 „14 ~ . >· , _. . , R ou CO-R em que R , R e R sao como atras definidos 18 mas podem ser escolhidos independentemente, em que R repre- 1? 1213 121314 12 senta hidrogénio ou OR ou NR R ou CR RR em que R , „13 „14 ~ „17 „11 R e R sao como atras definidos ou R e R representarem ~ . 17 11 juntamente uma ligaçao simples, ou R e R representarem 17 23 12 13 uma ligaçao simples ou R e R representarem um grupo CR R 12 13 , 25 em que R e R são como atrás definidos, ou M' e R repre- 19 20 sentarem juntamente uma ligação simples, por R e R repre-sentarem hidrogénio ou alquilo inferior por R representar hidrogénio ou alquilo inferior não substituído ou substituído, ou arilo inferior não substituído ou substituído, ou heteroarilo inferior não substituído ou substituído, ou aralquilo inferior não substituído ou substituído, em que os substituin-tes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consis- λλ 1 r η / TC tindo de COR , NR R , SR , arilo inferior, heteroarilo inferior, alquilo inferior, cicloalquilo inferior, halogénio, hidroxi, alcoxi inferior, ariloxi inferior, aralquiloxi inferior, ou um grupo contendo a fórmula
    I J
    22 , 12 12 13 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou --12-13,,14 _15 _16 „23 CR R R em que R erR sao como atras definidos, por R 12 13 14 22 representar hidrogénio ou SiR RR ou COR ou arilo infe- 12 13 14 22 rior ou heteroxilo inferior em que R , R , R e R são 23 15 como atrás definidos, ou R e R representarem juntamente 12 13 12 13 um grupo CR R , em que R e R são como atrás definidos, 24 25 25 por R representar OR , em que R representa alquilo inferior não substituído ou substituído ou cicloalquilo inferior ou arilo inferior não substituído ou substituído, ou hetero-arilo inferior não substituído ou substituído, ou aralquilo inferior não substituído ou substituído, em que os substituin-tes dos referidos grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de alquilo inferior, cicloalquilo inferior, arilo inferior, aralquilo inferior ou heteroarilo inferior, ou por 24 17 R e R representarem juntamente uma ligação simples por X' 12,,13 12 _ __ 13 _ _ 12 13 ~ representar CR R ou R C=CR ou C=C, em que R e R sao como atrás definidos por m1 representar um número entre zero 12 (0) e cinco (5) e 2<m' +n' +p1 <_8 por Y* representar O ou SR „12„13 _„12 13 „12- -„13 __ „12 „13 - ou R R ou CR R ou R C=CR ou CC, em que R , R sao como atrás definidos, por n' representar um número entre zero 12 13 (0) e cinco (5) e 2<m'+n1+p'<8 por Z' representar CR R ou 12 13 12 13 R C=CR ou C=C, em que R e R são como atrás definidos por p' representar um número entre zero (0) e cinco (5) e 2<m' +n' +p' £8. 14ã. - Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- 11 12 12 13 12 do por R representar hidrogénio ou OR ou NR R ou CR - „13-14 „. „12„13„14 „12 „13 „14 . , RR ou SiR RR em que R , R e R representam cada um independentemente hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec.-butilo, pentilo ou ciclo- propilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou fenilo, tolilo, naftilo ou piridilo, furilo, tienilo ou benzilo, naftilmetilo, feneti- 11 17 lo, fenilpropilo ou por R e R representarem juntamente uma 17 17 ligação simples por M' representar OR , em que R represen- ίο 1 λ i9 ίο 14 *| o ta hidrogénio ou CR RR ou SiR RR ou CO-R em que 169-
    R^, R^ e R·^ são como atrás definidos mas podem ser escolhi- 18 dos independentemente, em que R representa hidrogénio ou „„12 , 12 13 121314 „12 „13 „14 „ OR ou NR R ou CR R R em que R , R e R sao como 17 11 atrás definidos ou por R e R representarem juntamente uma 17 23 ligação simples, ou R e R representarem juntamente um gru-12 13 12 13 po CR R , em que R e R são como atrás definidos ou por 25 19 M' e M representarem juntamente uma ligação simples por R representar hidrogénio ou metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, sec.-butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, fenilo, naf-tilo, por R representar hidrogénio por R representar hidrogénio ou metilo não substituído ou substituído, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo sec.-butilo, pentilo, hexilo, ou ciclopropilo não substituído ou substituído, ciclo-butilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ou fenilo não substituído ou substituído tolilo, naftilo ou piridilo não substituído ou substituído, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo ou foenzilo não substituído ou substituído, naftilmetilo, fenetilo, fenil-propilo, em que os substituintes destes grupos são escolhidos a partir de um grupo consistindo de CORz , NRXDRJ' , SRX , fenilo, naftilo, piridilo, tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo, imidazoílo, metilo, etilo, propilo, isopropilo butilo, isobutilo, sec.-butilo, pentilo, ciclopeopilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, halogénio, hidroxi, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, fenoxi, naftoxi, benziloxi, naftilmetoxi ou um grupo contendo a fórmula r15r16nc(=nh)nh- 22 12 12 13 12 em que R representa hidrogénio ou OR ou NR R ou CR - „13„14 „12 „13 „14 ~ RR em que R , R e R sao como atras definidos em que R e R"^ são independentemente um do outro hidrogénio, meti-lò;- etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo pentilo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, fenilo, naf- -170- tilo, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, fenilpropilo, piridilo, 15 16 tienilo, quinolilo, furilo, tiazolilo ou R e R representam juntamente uma cadeia de alquilo com dois a cinco átomos de carbono, por R representar hidrogénio ou SiR RR ou 12 13 14 22 12 13 14 CR-1· k^R-1· ou COR:; ou fenilo ou naftilo em que R"2, , RA , R 22 , 23 17 e R são como atrás definidos, ou R e R representam jun- 12 13 12 13 tamente um grupo CR R em que R e R são como atrás de- 24 25 25 fmidos por R representar OR , em que R representa meti- lo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, fenilo, naftilo, tienilo, furilo, piridilo, fluorenilmetilo, benzilo, 24 17 naftilmetilo, fenetilo, fenilpropilo, ou por R e R repre- 12 13 sentarem uma ligaçao simples por X' representar CR R ou 12 13 12 13 R C+CR ou C=C em que R e R são como atrás definidos, por m' representar um número entre zero (0) e dois (2) e :i 12 12 13 2<m'+n'+p'<6 por Y' representar 0 ou S ou NR ou R R N+ ou SiR^R^ ou R^C=CR^ ou C=C em que R"^ e R^ são como atrás definidos por n' representar um número entre zero (0) e dois (2) e 2<m'+n'+p'<6 por Z' representar CR^R^ ou R^C=CR"^ ou C=C, em que R e R são como atrás definidos e por p' representar um número entre zero (0) e dois (2), e 2θτΓ+η' + p'<6. 15§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar Ν2-£3-£ΪΊ2-£Ν-—ΖΓ( 1,1-dimetiletòxi ) -carbonil7-L-f enilalanil7-L-histidil7ami-no-2-hidroxi-4-ciclo-hexil-butil7-N-i^’2- (2-piridinil )-etil_7--L-prolinamida tendo a fórmula -171-
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