CN101932333A - 抗c35抗体联合疗法和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杀死癌细胞的方法，该方法包括施用至少一种C35抗体和至少一种HER2或至少一种EGFR抗体中任何一种。在一些实施方案中，将抗体与治疗性试剂一起施用。本发明进一步涉及在这些方法中有用的C35、HER2和EGFR抗体。

Description

抗C35抗体联合疗法和方法
发明背景
技术领域
本发明涉及杀死癌细胞，特别是表达C35的癌细胞的方法。在一个方面，该方法包括施用至少一种C35抗体和至少一种抗HER2抗体。在另一个方面，该方法包括施用至少一种C35抗体和至少一种抗EGFR抗体。在一些实施方案中，治疗性试剂也与抗体联合施用。在另一个方面，本发明涉及设计用于C35阳性癌症的治疗的方法，其包括测试受体分子例如HER2、EGFR和IGFR的表达。
背景技术
细胞生长是响应于机体的特定需要的精确调节过程。有时候，指示关于细胞***规则的复杂且受到高度调节的调控会失效。当发生这种情况时，细胞开始不依赖于其稳态调节而生长并***，从而导致通常被称为癌症的病状。事实上，在25-44岁的美国人中，癌症是导致死亡的第二个主要原因。
目前用于癌症的疗法包括化学疗法和放射疗法。化疗药品主要通过诱导细胞凋亡来杀死癌细胞(Fisher，D.E.，Cell 78：539-542(1994)；Fung，C.Y.和D.E.Fisher，J.Clin.Oncol.13：801-807(1995)；Lowe，S.W.，等人，Cell 74：957-967(1993))。放射疗法通过诱导细胞凋亡并通过其他机制来杀死癌细胞。但是，化学疗法和放射疗法不能杀死给定肿瘤中的所有细胞，并且在经过这种治疗后存活下来的细胞会继续生长。因此，这些治疗通常不足以根除整个肿瘤。因此，需要经改善的治疗癌症的治疗性方法。
已经研发出用于癌症的免疫治疗性策略，这些策略使用抗体靶向在肿瘤细胞中差异性表达的表面膜标记物(例如美国专利号5,770,195，“Monoclonal Antibodies to the HER2 Receptor”，1995年5月23日提交；1998年6月23日授权)。但是，肿瘤中差异性表达的许多抗原并非暴露在肿瘤细胞的表面上。因此，这种细胞内抗原不适合作为用于基于抗体的治疗剂的靶。
发明概述
本发明涉及杀死表达C35和HER2的癌细胞的方法，其包括给所述细胞施用：(a)一定量的特异性结合C35的抗C35抗体或其抗原结合片段；和(b)一定量的特异性结合HER2的抗HER2抗体或其抗原结合片段，其中抗C35抗体的所述量和所述抗HER2抗体的所述量对于杀死所述癌细胞有效。在一个实施方案中，该方法进一步包括施用一定量的治疗性试剂。在一个实施方案中，该方法在体内执行。在一个进一步的实施方案中，该方法在哺乳动物例如人中执行。
在本发明的一个实施方案中，治疗性试剂是化疗剂。化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。在一个实施方案中，化疗剂是紫杉醇。在另一个实施方案中，化疗剂是阿霉素。在另外一个实施方案中，治疗性试剂是放射。
在本发明的一个实施方案中，治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种前施用。在另一个实施方案中，治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种后施用。在一个进一步的实施方案中，治疗性试剂与所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种同时施用。抗C35抗体和抗HER2抗体同时或顺次施用。在一个实施方案中，抗体或其片段各自以约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重的剂量施用。
在本发明的一个实施方案中，抗C35抗体或片段选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗C35抗体或片段是1F2或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。在一个进一步的实施方案中，抗C35抗体或片段是1B3或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
在本发明的一个实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
在本发明的一个实施方案中，癌细胞选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。在另一个实施方案中，癌细胞是乳腺癌细胞。在一个进一步的实施方案中，乳腺癌细胞是导管内癌细胞。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括施用超过一种抗C35抗体或其片段。在另一个实施方案中，该方法包括施用超过一种抗HER2抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗C35抗体是人源化、嵌合或人抗体。在另一个实施方案中，抗HER2抗体是人源化、嵌合或人抗体。
本发明还涉及杀死患者中的C35阳性癌细胞的方法，其包括测试在所述患者的癌细胞样品中EGFR和HER2的表达；和当所述癌细胞对于EGFR表达为阳性时，施用有效杀死所述癌细胞的一定量的抗EGFR抗体和一定量的抗C35抗体；或当所述癌细胞对于HER2表达为阳性时，施用有效杀死所述癌细胞的一定量的抗HER2抗体和一定量的抗C35抗体。在本发明的一个实施方案中，EGFR或HER2表达通过体外测定法进行测定。在另一个实施方案中，体外测定法选自免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在另一个实施方案中，EGFR或HER2表达通过体内测定法进行测定。在一个进一步的实施方案中，EGFR或HER2表达通过细胞成像测定法进行测定。EGFR和HER2表达可以通过不同测定方法或相同测定方法进行测定。
在本发明的一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个进一步的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。在另外一个实施方案中，乳腺癌是乳腺癌转移。
在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在另一个实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
在本发明的一个实施方案中，抗C35抗体是1B3或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗C35抗体是1F2或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。在一个进一步的实施方案中，抗C35抗体是全人的。
在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体和所述抗C35抗体在不同时间施用。在另一个实施方案中，抗EGFR抗体在所述抗C35抗体前施用。在另一个实施方案中，抗HER2抗体和所述抗C35抗体在不同时间施用。在一个进一步的实施方案中，抗HER2抗体在所述抗C35抗体前施用。
本发明还涉及设计用于具有C35阳性癌症的患者的治疗的方法，其包括测试在来自所述癌症患者的生物样品中HER2和EGFR的表达；选择包括抗C35抗体和针对HER2或EGFR的抗体的联合抗体疗法，其中当生物样品对于HER2表达为阳性时，选择抗HER2抗体，并且当生物样品对于EGFR表达为阳性时，选择抗EGFR抗体。在一个实施方案中，生物样品选自肿瘤组织、血浆和血清。
在本发明的一个实施方案中，C35阳性癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌是导管内癌。在一个进一步的实施方案中，乳腺癌是乳腺癌转移。
在本发明的一个实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在另一个实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。在一个进一步的实施方案中，抗C35抗体是1B3或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。在另外一个实施方案中，抗C35抗体是1F2或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗C35抗体是全人的。
本发明还涉及用于鉴定将在治疗上响应于用抗体联合疗法来治疗癌症的方法的患者的方法，所述方法包括测试在所述患者的癌细胞样品中C35、EGFR和HER2的表达；测定在所述癌细胞中表达的C35、EGFR和HER2的组合；和提供针对在所述癌细胞中表达的C35、EGFR和HER2的组合的抗体的组合。在本发明的一个实施方案中，癌症选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在本发明的一个实施方案中，C35、EGFR和HER2表达通过体外测定法进行测定。在另一个实施方案中，体外测定法选自免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
在本发明的一个实施方案中，EGFR或HER2表达通过体内测定法进行测定。在另一个实施方案中，EGFR或HER2表达通过细胞成像测定法进行测定。在一个实施方案中，细胞表达C35和EGFR的组合。在本发明的一个进一步的实施方案中，抗体的组合包括抗C35抗体和抗EGFR抗体。在另一个实施方案中，细胞表达C35和HER2的组合。在另一个实施方案中，抗体的组合包括抗C35抗体和抗HER2抗体。在一个实施方案中，细胞表达C35、EGFR和HER2的组合。在一个进一步的实施方案中，所提供的抗体的组合是抗C35抗体、抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包括测试在所述患者的癌细胞样品中IGFR的表达；测定在所述癌细胞中表达的C35、EGFR、HER2和IGFR的组合；和提供针对在所述癌细胞中表达的C35、EGFR、HER2和IGFR的组合的抗体的组合。在另一个实施方案中，细胞表达C35和IGFR的组合。在一个进一步的实施方案中，抗体的组合包括抗C35抗体和抗IGFR抗体。
本发明还涉及杀死表达C35和EGFR的癌细胞的方法，其包括给所述细胞施用一定量的特异性结合C35的抗C35抗体或其抗原结合片段；和一定量的特异性结合EGFR的抗EGFR抗体或其抗原结合片段，其中抗C35抗体的所述量和所述抗EGFR抗体的所述量对于杀死所述癌细胞有效。在一个实施方案中，该方法进一步包括施用一定量的治疗性试剂。在另一个实施方案中，该方法在体内执行。在另一个实施方案中，该方法在哺乳动物中执行。在另外一个实施方案中，哺乳动物是人。
在本发明的一个实施方案中，治疗性试剂是化疗剂。在另一个实施方案中，化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。在一个实施方案中，化疗剂是紫杉醇。在另一个实施方案中，化疗剂是阿霉素。在一个进一步的实施方案中，治疗性试剂是放射。
在一个实施方案中，治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种前施用。在另一个实施方案中，治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种后施用。在一个进一步的实施方案中，治疗性试剂与所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种同时施用。
在本发明的一个实施方案中，抗C35抗体和所述抗EGFR抗体同时施用。在另一个实施方案中，抗C35抗体和所述抗EGFR抗体顺次施用。在一个进一步的实施方案中，抗体或其片段各自以约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重的剂量施用。
在本发明的一个实施方案中，抗C35抗体或片段选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗C35抗体或片段是1F2及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗C35抗体或片段是1B3及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。在一个进一步的实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
在本发明的一个实施方案中，癌细胞选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。在另一个实施方案中，癌细胞是乳腺癌细胞。在一个进一步的实施方案中，乳腺癌细胞是导管内癌细胞。
在本发明的一个实施方案中，该方法包括施用超过一种抗C35抗体或其片段。在另一个实施方案中，该方法包括施用超过一种抗EGFR抗体。在一个进一步的实施方案中，抗C35抗体是人源化、嵌合或人抗体。在另外一个实施方案中，抗EGFR抗体是人源化、嵌合或人抗体。
下文中进一步详细描述本发明的这些以及其他方面。
附图简述
图1显示了用曲妥珠单抗+对照IgG、曲妥珠单抗+抗C35 1F2抗体、曲妥珠单抗+抗C35 1B3抗体、或盐水处理(处理在移植后12天开始)的BT474-MD移植小鼠的平均肿瘤体积。与单独的曲妥珠单抗相比较，曲妥珠单抗和1F2或1B3抗C35抗体的组合使肿瘤体积明显减少。箭头指示处理时间点。
图2显示了与用曲妥珠单抗+对照IgG或盐水处理的小鼠相比较，在BT474-MD异种移植后的无肿瘤小鼠数目在曲妥珠单抗/抗C35组合处理的小鼠(曲妥珠单抗+抗C35 1F2或曲妥珠单抗+抗C35 1B3)中更大。箭头指示处理时间点。
图3显示了晚期细胞凋亡(A)曲妥珠单抗处理的BT474细胞对于细胞表面抗C35抗体染色为染色阳性，而(B)活细胞不显示细胞表面抗C35抗体染色。
图4显示了在用曲妥珠单抗+对照IgG、曲妥珠单抗+抗C351F2、对照IgG、抗C35 1F2、或盐水处理(处理在移植后15天开始，当平均肿瘤体积为约50mm3时)的BT474-MD移植小鼠中的平均肿瘤体积。与单独的1F2抗C35抗体或单独的曲要珠单抗相比较，曲要珠单抗和抗C35 1F2的组合使肿瘤体积明显减少。箭头指示处理时间点。
图5显示了与曲妥珠单抗+抗C35 1F2相比较，在用曲妥珠单抗+对照IgG处理或无处理(盐水)的BT474-MD移植小鼠中的平均肿瘤体积(处理在移植后22天开始，当平均肿瘤体积为约100mm3时)。与单独的曲妥珠单抗相比较，曲妥珠单抗和1F2抗C35抗体的组合使肿瘤体积明显减少。箭头指示处理时间点。
发明详述
概述
许多研究已经描述了经历细胞凋亡的细胞的表面膜中的改变。在这些变化中主要的是磷脂不对称性的早期丧失，如由表面膜外页上的磷脂酰丝氨酸的暴露反映出来。已经报道，表面膜组成中的这种改变有助于通过巨噬细胞识别和去除细胞凋亡的细胞(Fadok，V.A.，等人，J.Immunol.148：2207-2216(1992))。已经研发出一种普通的方法，其通过使抗凝血剂膜联蛋白V与暴露的磷脂酰丝氨酸分子结合来检测经历细胞凋亡的细胞(Koopman，G.，等人，Blood 84：1415-1420(1994))。
已确定存在细胞内肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的亚类，其在化学疗法或放射性诱导的细胞凋亡的条件下变得暴露于肿瘤细胞膜上，并且可以成为用于使肿瘤内抗体缀合的放射性同位素或毒素浓缩的有效靶。参见2005年7月21日公开的美国申请公开号2005/0158323A1(通过引用整体合并入本文)。特别地，通常与细胞内膜结合的差异性表达的肿瘤特异性C35抗原变得暴露于肿瘤细胞的表面膜上，所述肿瘤细胞已通过放射和/或化学疗法诱导以经历细胞凋亡。参见美国申请公开号2005/0158323 A1，图1-3。使用针对这种抗原(例如C35)的抗体的方法是特别有效的，这是因为所述抗体会增强标准的细胞凋亡诱导化学疗法和放射疗法在治疗癌症中的治疗益处。同样地，其他细胞凋亡诱导试剂例如针对表面表达的细胞信号传导分子(例如生长因子受体例如HER2、EGFR和/或IGFR)的抗体，可以用于改善针对细胞内抗原的抗体例如针对C35的抗体的治疗益处。
在一个方面，在一个实施方案中，本发明涉及与细胞凋亡的诱导结合起作用以增强肿瘤的根除的方法。这基于如下新的观察结果：肿瘤细胞内差异性表达的一类细胞内标记物会变得暴露于细胞凋亡的细胞的表面上，在该细胞的表面上，所述的标记物可以被特异性抗体所靶向。在一个方面，细胞凋亡通过施用针对细胞表面受体例如EGFR、HER2或IGFR的一种或多种抗体来诱导。在一个进一步的方面，施用针对差异性表达的细胞内肿瘤抗原例如C35的一种或多种抗体。这种抗体可以以未与毒性负载物缀合或者与毒性负载物缀合的方式进行施用。这种处理方法的益处是数倍。例如，使用缀合的抗体，该方法允许将毒性负载物递送至肿瘤环境中，所述毒性负载物可以破坏在细胞凋亡靶附近的其他非细胞凋亡的肿瘤细胞。此外，通过施用2种或更多种抗体的组合，抗体可以协同作用，实现更多的细胞杀死且允许更低剂量的化学疗法或放射疗法或者消除化学疗法或放射疗法，并且从而减少相关毒性。此外，该方法可以以其他方式防止活细胞逆转细胞凋亡过程且重新开始生长，所述活细胞已经通过(例如)采用细胞凋亡诱导试剂处理而启动了细胞凋亡过程，如由表面膜组成成分中的改变证实的(Hammill，A.K.，等人，Exp.Cell Res.251：16-21(1999))。
Evans等人报道C35在乳腺癌中过表达，其中32％的1级以及66％的2级和3级浸润乳腺导管癌对于C35表达测试阳性。Evans等人，Mol.Cancer Ther.5：2919-30(2006年11月)(通过引用整体合并入本文)。因为C35表达局限于正常人组织，参见Evans等人，2006，所以它是用于用作特别是乳腺癌中的生物标记物以及诊断和治疗试剂的极佳候选物。
尽管正常细胞通过生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)经由其分别的配体的高度受控激活而进行增殖，癌细胞也通过生长因子受体的激活而进行增殖，但丧失正常增殖的谨慎控制。控制的丧失可以由许多因素引起，例如生长因子和/或受体的过表达，和由生长因子调节的生物化学途径的自发激活。涉及肿瘤发生的RTK的某些例子是关于表皮生长因子(EGFR)、血小板衍生的生长因子(PDGFR)、***(IGFR)、神经生长因子(NGFR)和成纤维细胞生长因子(FGF)的受体。这些生长因子与其细胞表面受体的结合诱导受体激活，这启动且修饰信号转导途径并且导致细胞增殖和分化。
表皮生长因子(EGF)受体家族的成员是与表皮细胞的肿瘤发生相关的特别重要的生长因子受体酪氨酸激酶。发现的EGF受体家族的第一个成员是EGFR，其在许多类型的肿瘤细胞上表达。已发现EGFR涉及肿瘤细胞***和生长的调节、修复和存活、血管发生、侵入和肿瘤转移。
EGFR是170kD的跨膜糖蛋白，具有细胞外配体结合结构域、跨膜区和细胞质蛋白质酪氨酸激酶结构域。特异性配体的结合导致EGFR自磷酸化、受体的细胞质酪氨酸激酶结构域的激活、以及调节肿瘤生长和存活的多重信号转导途径的启动。EGFR途径还影响肿瘤中的多种其他血管发生因子例如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的产生。
已报道许多人肿瘤表达或过表达EGFR。EGFR的表达与预后不良、存活减少和/或转移增加相关。由于在肿瘤发生中的这种牵涉，EGFR已被特异性靶向用于抗癌疗法。这些疗法已主要包括阻断配体与受体的细胞外结构域结合的单克隆抗体，或直接作用于胞内区以阻止信号转导的合成酪氨酸激酶抑制剂。抗EGFR抗体还在EGFR阳性肿瘤细胞中诱导细胞凋亡。
***也称为生长调节素，包括***I(IGF-I)和***II(IGF-II)(Klapper，等人，Endocrinol.112：2215(1983)；Rinderknecht等人，Febs.Lett.89：283(1978))。这些生长因子通过与IGFR1结合(Sepp-Lorenzino Breast CancerResearch and Treatment 47：235(1998))对多种细胞类型包括肿瘤细胞(Macaulay Br.J.Cancer 65：311(1992))发挥促有丝***活性。IGF与IGFR1的相互作用通过触发酪氨酸残基上的受体的自磷酸化来激活受体(Butler，等人，Comparative Biochemistry and Physiology 121：19(1998))。激活后，IGFR1进而使细胞内的靶磷酸化，以激活细胞信号传导途径。这种受体激活对于肿瘤生长和存活的刺激是关键的。因此，IGFR1活性的抑制代表治疗或预防人癌症和其他增殖性疾病生长的有价值的潜在方法。
几个证据线指出IGF-I、IGF-II及其受体IGFR1是恶性表型的重要介导物。已发现IGF-I的血浆水平是***癌风险的最强预测物(Chan，等人，Science 279：563(1998))，并且相似的流行病学研究将血浆IGF-I水平与乳腺、结肠和肺癌危险强烈联系。
用来自以化学方法诱导的大鼠成神经细胞瘤的DNA的转染研究的结果是鉴定了另一种转化基因。最初称为neu的这种基因显示与c-erbB原癌基因相关，但不同于c-erbB原癌基因。借助于v-erbB和人EGFR作为探针以筛选人基因组和互补DNA(cDNA)文库，2个其他团体独立地分离了人erbB相关基因，他们分别命名为HER2和c-erbB-2。后续序列分析和染色体作图研究揭示c-erbB-2和HER2是neu的物种变体。
HER2也是酪氨酸激酶家族成员；并且与EGFR基因紧密相关，但不同于EGFR基因，如由Coussens等人，Science 230：1132(1985)报道的。HER2不同于EGFR之处在于它在染色体17的条带q21上发现，相比于EGFR基因定位在染色体7的条带p11-p13。此外，HER2基因产生4.8kb的信使RNA(mRNA)，这不同于EGFR基因的5.8-和10-kb转录物。最后，由HER2基因编码的蛋白质是185,000道尔顿，相比于由EGFR基因编码的170,000道尔顿蛋白质。相反，基于序列数据，HER2比酪氨酸激酶家族的其他成员与EGFR基因更紧密相关。如同EGFR蛋白质，HER2蛋白质(p185)具有细胞外结构域、包括2个富含半胱氨酸的重复簇的跨膜结构域和细胞内激酶结构域。此外，HER2基因的扩增与疾病的负面预后和复发可能性显著相关。抗HER2抗体如同抗EGFR抗体在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡。
其他人已观察到，使用诸如HER2之类的细胞外表达抗原，施用针对蛋白质的不同表位的2种不同抗HER2抗体在体内和体外产生抗肿瘤活性。Spiridon等人，Clin.Cancer Res.8：1720-30(2002)(通过引用整体合并入本文)。事实上，已证实了关于施用2种不同抗HER2抗体(Spiridon，2002；Friedman等人Proc Natl.Acad.Sci USA 102：1915-1920(2005))；2种不同抗EGFR抗体(Friedman，2005；Perera等人，Clin.Cancer Res.11：6390-6399(2005))；以及1种抗HER2和1种抗EGFR抗体的组合(Larbouret等人，Clin.Cancer Res.13：3356-3362(2007))的协同效应。这些协同效应是通过使针对相同分子上的不同表位的高亲和力抗体相混合而使细胞表面分子过度交联的结果(Spiridon，2002)。因为异二聚体也在HER2和EGFR的链之间形成，所以交联用1种抗HER2和1种抗EGFR抗体也是可能的。超过一个表位的同时衔接引起抗体-受体复合物的大聚集物形成。这些大聚集物比更小的抗体复合物更快速地被胞吞，这导致受体的加速清除(Friedman，2005)。但是，虽然Spiridon等人观察到了细胞外表达的蛋白质HER2，但是如上文所述，C35为细胞内抗原，其与细胞凋亡相关联变得在细胞表面上表达。在一个方面，本发明涉及抗HER2和/或抗EGFR抗体诱导C35的细胞表面表达的用途，以引起抗C35抗体和抗HER2和/或抗EGFR抗体的协同效应。
C35基因位于染色体17q12上，并且位于距离ERBB2(Her2/neu)的3′末端505个核苷酸。(Evans等人，2006)。在一项研究中，显示C35和HER2的表达相关，而所有HER2阳性乳腺肿瘤也对于C35测试阳性。(Evans等人，2006)。尽管多达50％的C35+乳腺肿瘤也表达HER2，并且因此可以用C35和HER2抗体的组合进行治疗，但许多C35+肿瘤表达低HER2或不表达HER2。如本文在下文实施例中证实的，大多数C35阳性肿瘤表达HER2或EGFR，其中C35+肿瘤的小亚类表达HER2和EGFR，并且相似的小亚类既不表达HER2也不表达EGFR。如上文讨论的，HER2和EGFR都与肿瘤转化相关，并且当通过抗体靶向时，各自被报道为诱导细胞凋亡。如本文在下文证实的，在30种分析的肿瘤中，7/30肿瘤是C35+/Her2+/EGFR-，17/30是C35+/Her2-/EGFR+，3/30是C35+/Her2+/EGFR+，并且仅3/30是C35+/Her2-/EGFR-。因此，C35和HER2或C35和EGFR抗体的组合可用于治疗对于这些抗原阳性的肿瘤(例如通过诱导细胞凋亡以在表面上暴露C35，其中它可以用抗C35抗体靶向)。与抗C35抗体联合使用的HER2和EGFR抗体的协同作用至少部分是由于其引起C35的细胞表面暴露。此外，2种抗体的使用可以增加受体清除活性、细胞杀死或2种分子的其他效应子功能，与个别使用任一抗体的治疗形成对比。因此，在一个方面，本发明涉及用于治疗癌症特别是乳腺癌的方法，其包括施用有效杀死癌细胞的一定量的抗C35抗体和一定量的抗HER2抗体和/或一定量的抗EGFR抗体。
I.定义
应该注意，术语“一”或“一个”实体是指一个或多个该实体；例如“C35抗体”应该理解为代表了一个或多个C35抗体。像这样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以交换使用。
如本文所用，术语“多肽”意指包括了单个“多肽”以及多个“多肽”，并指由通过酰胺键(还称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或者用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个来使用，或者可以与这些术语中的任何一个交换使用。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、或者使用非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或者通过重组技术产生，但不一定由指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式包括通过化学合成而产生。
本发明多肽的大小可以为约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个、或2,000个或更多个氨基酸。多肽可以具有所定义的三维结构，但是它们不一定具有这种结构。具有所定义的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有所定义的三维结构、而是采用大量不同构象的多肽被称为非折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分经由氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链与蛋白质附着。
“经分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，经分离的多肽可以是从其本身的或天然的环境中取出的。在宿主细胞中表达的、经重组产生的多肽和蛋白质被认为是用于本发明目的的经分离的，如同通过任何合适的技术分离、分馏或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽。
作为本发明的多肽还包括的是上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。当用于指本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留了相应天然抗体或多肽的至少一些抗原结合性质的任何多肽。本发明的多肽的片段除了包括本文其他地方讨论的特定抗体片段以外，还包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的C35和/或HER2抗体和抗体多肽的变体包括如上文所述的片段，还包括具有由于氨基酸取代、缺失或***而改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然的或者是非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可以包含保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或***。抗体的变体包括抗体的人源化形式以及经亲和力成熟或优化的抗体。亲和力优化可以通过本领域公知的常规方法来实施。备选地，用于增加本发明的抗体的亲和力的优选方法公开于US 2002/0123057 Al中。本发明的C35抗体和/或HER2抗体和抗体多肽的衍生物为如下多肽，该多肽经过改变从而表现出在天然多肽中未发现的其他特征。实例包括融合蛋白质。如本文所用，C35抗体和/或HER2抗体或抗体多肽的“衍生物”是指如下对象多肽，该多肽具有通过功能性侧基的反应以化学方法衍生出的一个或多个残基。作为“衍生物”还包括的是这样的肽，该肽包含20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”意欲包括单个核酸以及多个核酸，并且指经分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指在多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。“经分离的”核酸或多核苷酸意指已从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。经分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中重组多核苷酸或在溶液中经纯化(部分或基本上)的多核苷酸。经分离的RNA分子包括本发明多核苷酸的体内或体外的RNA转录物。根据本发明的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的那些分子。此外，多核苷酸或核酸可以为或者可以包括诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子之类的调节元件。
如本文所用，“编码区域”为由被翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)没有被翻译成氨基酸，但是该密码子可以被认为是编码区域的一部分，但是任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等，均不是编码区域的一部分。本发明的2个或多个编码区域可以存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或者存在于分别的多核苷酸构建体中(例如在分别(不同)的载体上)。此外，任何载体都可以包含单个编码区域，或者可以包含2个或多个编码区域，例如单个载体可以分别编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区域，该异源编码区域融合到或未融合到编码C35、HER2或EGFR抗体或其片段、变体或衍生物的核酸中。异源编码区域包括，但不限于专用的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在一些实施方案中，所述多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包含核酸(其编码多肽)的多核苷酸通常可以包含与一个或多个编码区域可操作地连接的启动子和/或其他转录或翻译调控元件。可操作地连接是，当基因产物(例如多肽)的编码区域以某种方式与一个或多个调节序列相连接时，从而使基因产物的表达处于调节序列的影响或调控之下。例如，如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA被转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或者干扰待转录的DNA模板的能力，则这两个DNA片段(例如多肽编码区域及与之相连的启动子)是“可操作地连接的”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与编码多肽的核酸可操作地连接。所述启动子可以为只在预定细胞中指导DNA的基本转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，可以使其他转录调控元件(例如增强子、操作子、阻遏子和转录终止信号)与多核苷酸可操作地连接以指导细胞特异性转录。合适的启动子和其他转录调控区域在本文中公开。
各种转录调控区域是本领域的技术人员已知的。这些区域包括但不限于，在脊椎动物细胞中发挥功能的转录调控区域，例如但不限于，来自巨细胞病毒(即刻早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子节段。其他转录调控区域包括由脊椎动物基因(例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β球蛋白、以及能够调控真核细胞中的基因表达的其他序列)衍生的那些。其他合适的转录调控区域包括组织特异性启动子和增强子、以及淋巴因子诱导的启动子(例如可通过干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译调控元件是本领域的技术人员已知的。这些元件包括但不限于，核糖体结合位点、翻译起始密码子和终止密码子、以及由小核糖核酸病毒衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，还称为CITE序列)。
在其他实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区域可以与编码分泌肽或信号肽的其他编码区域相连，其中所述分泌肽或信号肽指导了由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链穿过粗糙内质网的输出被启动，所述的信号肽或分泌前导序列便从成熟蛋白质中切除。本领域的普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽N末端融合的信号肽，该信号肽从完整或“全长”多肽中切除，从而产生被分泌的或“成熟”形式的多肽。在一些实施方案中，使用天然的信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或者使用保持指导与其可操作地连接的多肽分泌的能力的所述序列的功能衍生物。备选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，可以使用人组织型纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β葡萄糖苷酶的前导序列取代野生型前导序列。
本发明涉及使用某种C35、抗HER2和抗EGFR抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法。除非特别指出是全长抗体(例如天然存在的抗体)，术语“C35抗体”、“HER2抗体”或“EGFR抗体”(该术语在本文中可以分别与术语“抗C35抗体”、“抗HER2抗体”或“抗EGFR抗体”交换使用)包括了全长抗体以及此类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或以与抗体分子相同的方式结合抗原的经改造的抗体分子或片段。同样地，本发明涉及使用特定抗IGFR1抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法。除非特别指出是全长抗体(例如天然存在的抗体)，术语“IGFR抗体”(IGFR在本文中可以与术语IGFR1交换使用，并且IGFR抗体可以与术语“抗IGFR抗体”交换使用)包括了全长抗体以及此类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或以与抗体分子相似的方式结合抗原的经改造的抗体分子或片段。
术语“抗体”与“免疫球蛋白”在本文中可以交换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链可变结构域，并且通常至少包含重链可变结构域和轻链可变结构域。脊椎动物***中的基本免疫球蛋白结构是相对公知的。例如参见Harlow等人的Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)。如本文所用，“本发明的抗体”或“本发明的抗体多肽”包括分别针对C35、HER2、EGFR和IGFR或C35、HER2、EGFR和IGFR多肽抗体的抗体。
术语“免疫球蛋白”包括可以通过生物化学方式区分的种类广泛的多肽，如将在下文中进行更详细的讨论。本领域的技术人员知道重链可以分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)是经过充分表征的，并且已知赋予功能特异性。根据本公开内容，这些类别和同种型各自的修饰形式对于技术人员是易于辨别的，并且因此它们都在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别清楚地在本发明的范围内，以下讨论总体上针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量约23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽和分子量53,000-70,000的两条相同的重链多肽。四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链在“Y”的开口处开始括住重链并延续通过可变区。
轻链可以分类为kappa或lambda(κ，λ)。每个重链类别都可以与κ或λ轻链结合。总体而言，当免疫球蛋白是由杂交瘤细胞、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键连接或非共价连接彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉状末端处的N末端到各条链底端处的C末端。
轻链和重链均被分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定的”和“可变的”是就功能而言来使用的。在这一点上，应该理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2或CH3)赋予了重要生物性质，例如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合。根据惯例，随着恒定区结构域与抗体的抗原结合位点或氨基末端的距离越远，该结构域的数量增加。N末端部分为可变区，并且在C末端部分处为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上文所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。换言之，抗体的VL结构域和VH结构域、或者互补决定区(CDR)的亚类相结合，从而形成定义了三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成在Y构型的各个臂的末端处存在的抗原结合位点。更具体而言，抗原结合位点由每个VH和VL链的三个CDR来定义。在一些情况下，例如衍生自骆驼科物种(camelid species)或者基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链组成而不具有轻链。例如参见Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，存在于各抗原结合结构域中的6个“互补决定区”或“CDR”是短的、非邻接的氨基酸序列，当所述抗体在水环境中采取其三维构型时，所述氨基酸序列特异性地定位，从而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸(称为“框架”区域)显示较低的分子内可变性。框架区主要采用β片构象，并且CDR形成与β片结构相连的环，并且在某些情况下形成β片结构的一部分。因此，框架区起到了形成支架的作用，所述支架通过链内非共价作用提供以正确的方向定位的CDR。由定位的CDR形成的抗原结合位点定义了与位于免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链可变区和轻链可变区，本领域的任何普通技术人员都可以容易地分别鉴定含CDR和框架区的氨基酸，因为这些氨基酸已经被精确地定义(参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″Kabat，E.，等人，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其通过引用整体合并入本文)。
在本发明的方法中使用的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类源化或嵌合抗体；单链抗体；表位结合片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达库产生的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体(例如包括针对本文公开的C35抗体的抗Id抗体；还参见例如Hudson，PJ.和Couriau，C，Nature Med.9：129-134(2003)；美国专利公开号20030148409；美国专利号5,837,242)。例如，scFv分子是本领域已知的并且在例如美国专利5,892,019中描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
包括单链抗体的抗体片段可以包含单独的可变区或者与以下的全部或部分组合的可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。本发明还包括的是抗原结合片段，该片段还包含可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任何组合。用于本文所公开的诊断和治疗方法中的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源包括鸟和哺乳动物。优选地，所述抗体为人、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼羊、马或鸡抗体。在另一个实施方案中，所述可变区在来源中可以是condricthoid(例如得自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白库中或由动物中分离得到的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白，如下文和例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所述。
如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下中的至少一种：CH1结构域、铰链(例如上游铰链区、中游铰链区和/或下游铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或者包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，用于本发明的结合多肽可以缺乏CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上文所述，本领域的普通技术人员都应该理解这些结构域(例如重链部分)可以被这样修饰，使得它们在氨基酸序列中不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文中公开的某些C35、HER2和/或EGFR或IGFR抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链上的重链部分相同。备选地，本发明的包含重链部分的单体是不同的。例如，各个单体可以包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。
用于在本文所公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含衍生自IgG1分子的CH1结构域、以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包含衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包含至少一个VL或CL结构域。
可以根据其识别或特异性结合的抗原的表位或部分来描述或详细说明本文所公开的C35、抗HER2、抗EGFR或抗IGFR抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶多肽部分视“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可以包含单一表位，但是通常包含至少两个表位，并且可以包含任何数目的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。此外，应该注意靶多肽上的“表位”可以为或者可以包含非多肽元件，例如表位可以包含碳水化合物侧链。
认为关于抗体的肽或多肽表位的最低限度大小为约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少7个、更优选至少9个、最优选至少约15个至约30个氨基酸。由于CDR可以以三级形式识别抗原性肽或多肽，所以包括表位的氨基酸无需是邻接的，并且在某些情况下，这些氨基酸甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，被本发明的抗体识别的肽或多肽表位包含C35、HER2、EGFR或IGFR的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约15个至约30个邻接或不邻接的氨基酸。
“特异性结合”通常是指抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且这种结合需要抗原结合结构域与表位之间一定的互补性。根据这个定义，当抗体经由其抗原结合结构域比该抗体与随意的、无关的表位结合得更容易与该表位结合时，抗体被说成与表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于定性某种抗体通过其与某种表位结合的相对亲和力。例如，对于给定的表位，可以认为抗体“A”比抗体“B”具有更高的特异性，或抗体“A”可以被说成以比它对于相关表位“D”具有的更高特异性与表位“C”结合。
“优先结合”是指与抗体和相关的、相似的、同源的或类似的表位结合相比较，抗体更容易与表位特异性结合。因此，与相关表位相比较，与给定表位“优先结合”的抗体更可能与所述给定表位结合，尽管这种抗体可以与所述相关表位交叉反应。
通过非限定性实例，如果抗体以一定的解离常数(KD)与第一表位结合，该解离常数小于该抗体对于第二表位的KD，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，该亲和力比该抗体对于第二表位的KD小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一抗原结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，该亲和力比该抗体对于第二表位的KD小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。
在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的离开速率(off rate)(k(off))与第一表位结合，该离开速率小于该抗体对于第二表位的k(off)，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，该亲和力比该抗体对于第二表位的k(off)小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，该亲和力比该抗体对于第二表位的k(off)小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。
本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物可以被说成以一定的离开速率(k(off))结合本文所公开的靶多肽、或其片段或变体，所述离开速率小于或等于5X10-2sec-1、10-2sec-1、5X10-3sec-1或10-3sec-1。更优选地，本发明的抗体可以被说成以一定的离开速率(k(off))结合本文所公开的靶多肽、或其片段或变体，所述离开速率小于或等于5X10-4sec-1、10-4sec-1、5X10-5sec-1、10-5sec-1 5X10-6sec-1、10-6sec-1、5X10-7sec-1或10-7sec-1。
本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物可以被说成以一定的结合速率(k(on))结合本文所公开的靶多肽、或其片段或变体，所述结合速率大于或等于103M-1sec-1、5X103M-1sec-1、104M-1sec-1或5X104M-1sec-1。更优选地，本发明的抗体可以被说成以一定的结合速率(k(on))结合本文所公开的靶多肽、或其片段或变体，所述结合速率大于或等于105M-1 sec-1、5X105M-1sec-1、106M-1sec-1、5X106M-1sec-1或107M-1sec-1。
如果本发明的抗体与给定表位优先结合，其程度使得该抗体在一定程度上阻断了参照抗体与该表位的结合，则该抗体被说成竞争性抑制参照抗体与给定表位的结合。可以通过本领域中已知的任何方法(例如竞争性ELISA测定法)来确定竞争性抑制。抗体可以被说成使参照抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
如本文所用，术语“亲和力”是指个别表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的量度。例如参见Harlow等人，Antibodies：ALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)，第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白与抗原群体之间的复合物的总体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性组合强度。例如参见Harlow，第29-34页。亲合力与所述群体中的个别免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力有关，还与免疫球蛋白和抗原的效价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(例如聚合物)的抗原之间的相互作用是高亲合力中的一种。
用于在本发明中使用的抗体可以是“多特异性的”，例如双特异性的、三特异性的、或者更多的多特异性，这是指其同时识别并结合存在于一种或多种不同的抗原(例如蛋白质)上的两个或更多个不同的表位。因此，不论抗体是“单特异性的”或“多特异性的”(例如双特异性的)，均是指结合多肽与之反应的不同表位的数目。多特异性抗体可以对本文所述的靶多肽的不同表位特异，或者可以对靶多肽以及异源表位(例如异源多肽或固体支持材料)特异。
如本文所用，术语“效价”是指存在于本发明的抗体、结合多肽或抗体中的潜在结合结构域(例如抗原结合结构域)的数目。每个结合结构域都特异性结合一个表位。当结合多肽或抗体包含超过一个结合结构域时，每个结合结构域可以特异性结合相同的表位，对于具有两个结合结构域的抗体，被称为“二价单特异性”；或者每个结合结构域可以特异性结合不同的表位，对于具有两个结合结构域的抗体，被称为“二价双特异性”。抗体还可以是双特异性且就每种特异性而言是二价的(被称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方案中，可以制备四价微型抗体或结构域缺失抗体。
双特异性二价抗体及其制备方法在例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美国申请公开号2003/020734和2002/0155537中描述，所有这些专利的公开内容通过引用整体合并入本文。双特异性四价抗体及其制备方法在例如WO 02/096948和WO00/44788中描述，这两份专利的公开内容通过引用合并入本文。通常参见PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO92/05793；Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
如先前所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分的氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括例如采用常规的编号方案由抗体的约第244个残基延伸至第360个残基(第244个残基至第360个残基，Kabat编号***；以及第231-340个残基，EU编号***；参见Kabat EA等人在引文中列举)的重链分子部分。CH2结构域是独特的，因为它没有与另一结构域紧密配对。相反，两条N联分支糖链***完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。此外，已经清楚证明了CH3结构域由IgG分子的CH2结构域延伸至C末端，并且包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括使CH1结构域与CH2结构域连接的重链分子部分。该铰链区包含大约25个残基，并且是弹性的，由此允许两个N末端抗原结合区域独立地移动。铰链区可以被再分为三个不同的结构域：上游、中部和下游铰链结构域(Roux等人，J.Immunol.161：4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二个巯基形成二硫键或桥的巯基。在大部分天然存在的IgG分子中，CH1和CL区域通过二硫键连接，并且两条重链在相应于采用Kabat编号***的239和242的位置(EU编号***的位置226或229)处通过二硫键连接。
如本文所用，术语“嵌合抗体”被用于指其中免疫反应性区域或位点得自或衍生自第一个物种，并且恒定区(其可以是完整的、部分的或是根据本发明修饰的)得自第二个物种的任何抗体。在优选的实施方案中，靶结合区域或位点来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)，并且恒定区是人的。
如本文所用，术语“改造抗体”是指其中重链和轻链或两者中的可变结构域通过以下方式被改变的抗体：通过来自特异性已知的抗体的一个或多个CDR的至少部分替代，以及需要时，通过部分框架区替代和序列变化。虽然CDR可以衍生自与框架区由其衍生的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，但是应该想到CDR衍生自不同类别的抗体，并且优选地衍生自来自不同物种的抗体。其中来自特异性已知的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植到人重链或轻链框架区内的改造抗体在本文中被称为“人源化抗体”。不一定使用来自供体可变区的完整CDR来替代所有的CDR，以将一个可变结构域的抗原结合能力转移给另一个。相反，可能仅需要转移维持靶结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到在例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中提出的解释，通过进行常规的实验或者通过试误测试以获得功能性改造或人源化抗体完全在本领域技术人员的能力范围内。
如本文所用，术语“适当折叠的多肽”包括如下多肽(例如C35抗体)，其中包含所述多肽的所有功能性结构域都具有明确的活性。如本文所用，术语“非适当折叠的多肽”包括如下多肽，其中所述多肽的至少一个功能性结构域不具有活性。在一个实施方案中，适当折叠的多肽包括通过至少一个二硫键连接的多肽链，并且相反地，非适当折叠的多肽包括没有通过至少一个二硫键连接的多肽链。
如本文所用，术语“经改造的”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶联或者这些技术的某些组合)对核酸或多肽分子的操作。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方法在内的任何方法使两个或更多个元件或组分连接在一起。“框内融合(in-frame fusion)”是指以维持原始ORF的正确翻译阅读框的方式，使两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)连接，以形成邻接的更长的ORF。因此，重组融合蛋白质是单一蛋白质，其包含与由原始ORF所编码的多肽相对应的两个或更多个节段(所述节段在自然界中通常不会如此连接)。虽然由此制备的阅读框在融合节段自始至终是连续的，但是所述节段可以通过例如框内连接体序列在物理上或空间上分离。例如，可以使编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸框内融合，但是通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或其他的CDR区域的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分进行共翻译。
在多肽的背景中，“线性序列”或“序列”是多肽中以氨基末端至羧基末端方向的氨基酸的次序，其中在所述序列中彼此相邻的残基在所述多肽的一级结构中是邻接的。
如本文所用，术语“表达”是指基因通过其产生生物化学物质例如多肽的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能存在的任何表现，包括但不限于，基因敲减以及瞬时表达和稳定表达。表达包括但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，以及将该mRNA翻译成一种或多种多肽。如果最终需要的产物为生物化学物质，则表达包括该生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生了“基因产物”。如本文所用，基因产物可以为核酸(例如通过基因转录产生的信使RNA)或多肽(其由转录物翻译)。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸或者具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、加入脂质、与其他蛋白质亚单位结合、蛋白水解切割等)的多肽。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理、和预防性或防护性措施，其中目标是待预防或减慢(减轻)不希望有的生理学变化或病症，例如多发性硬化的进展。有益的或所需要的临床结果包括但不限于，缓解症状、减轻疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病的状态、延迟或减慢疾病的进程、改善或减轻疾病状态、以及缓解(部分或全部)，无论这些是可检测的还是不可检测的。与未接受治疗时所期望的存活相比较，“治疗”还可以指延长的存活。需要治疗的对象包括已经具有病状或病症的那些、以及倾向于患有病状或病症的那些或者其中病状或病症有待预防的那些。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指对于其需要诊断、预测或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人，家畜，农业动物，以及动物园、运动竞技或宠物动物，例如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
如本文所用，短语例如“受益于施用C35、HER2和/或EGFR抗体的受试者”和“需要治疗的动物”包括如下受试者，例如哺乳动物受试者，该受试者受益于C35、HER2和/或EGFR抗体的施用。如本文更详细地描述的，本发明的抗体可以以非缀合形式使用或者可以与例如药品、药物前体或同位素缀合。
II.C35、HER2、EGFR和IGFR靶多肽
C35是在乳腺癌和某些其他肿瘤类型(包括黑素瘤、结肠癌、卵巢癌、肝细胞癌、膀胱和胰腺癌)中差异表达的抗原。已经显示，C35蛋白质是异戊二烯化的，并且与细胞内膜结合，但是在活肿瘤细胞的表面膜上不能检测出。存在免疫特异性识别C35表位的许多抗体，包括小鼠单克隆抗体、人源化抗体和人抗体。参见美国申请公开号2005/0158323和美国专利申请号11/812,996(通过引用合并入本文)。本发明人还证明，通过使用化疗剂或辐射诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡，导致C35的表面膜暴露，这允许通过C35特异性抗体识别完整的肿瘤细胞。
C35多核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs：1和2)：
gccgcg atg agc ggg gag ccg ggg cag acg tcc gta gcg ccc cct ccc
       Met Ser Gly Glu Pro Gly Gln Thr Ser Val Ala Pro Pro Pro
         1               5                  10
gag gag gtc gag ccg ggc agt ggg gtc cgc atc gtg gtg gag tac tgt
Glu Glu Val Glu Pro Gly Ser Gly Val Arg Ile Val Val Glu Tyr Cys
 15                  20                  25                  30
gaa ccc tgc ggc ttc gag gcg acc tac ctg gag ctg gcc agt gct gtg
Glu Pro Cys Gly Phe Glu Ala Thr Tyr Leu Glu Leu Ala Ser Ala Val
                 35                  40                  45
aag gag cag tat ccg ggc atc gag atc gag tcg cgc ctc ggg ggc aca
Lys Glu Gln Tyr Pro Gly Ile Glu Ile Glu Ser Arg Leu Gly Gly Thr
             50                  55                  60
ggt gcc ttt gag ata gag ata aat gga cag ctg gtg ttc tcc aag ctg
Gly Ala Phe Glu Ile Glu Ile Asn Gly Gln Leu Val Phe Ser Lys Leu
        65                  70                  75
gag aat ggg ggc ttt ccc tat gag aaa gat ctc att gag gcc atc cga
Glu Asn Gly Gly Phe Pro Tyr Glu Lys Asp Leu Ile Glu Ala Ile Arg
    80                  85                  90
aga gcc agt aat gga gaa acc cta gaa aag atc acc aac agc cgt cct
Arg Ala Ser Asn Gly Glu Thr Leu Glu Lys Ile Thr Asn Ser Arg Pro
 95                 100                 105                 110
ccc tgc gtc atc ctg tga
Pro Cys Val Ile Leu
                115
近期癌症研究已集中于重组人源化单克隆抗体用于治疗癌症的用途，所述癌症的细胞过表达HER2或EGFR。HER2的序列是本领域已知的，并且包括但不限于，Genbank登记号NP_001005862、NP004439、AAA75493或AAA35978。关于EGFR的序列也是本领域已知的，并且包括但不限于，Genbank登记号AAB19486、AAH94761、AAI28420和AAI18666。最后，一般的人IGFR前体的核苷酸和氨基酸序列包括但不限于，Genbank登记号X04434或NM_000875，以及美国专利号7,217,796中列出的那些。前体的切割(例如在氨基酸710和711之间)产生α-亚单位和β-亚单位，其结合以形成成熟IGFR。
HER2基因与编码EGFR的基因紧密相关，但不同于编码EGFR的基因。HER2基因的扩增已与人乳腺癌细胞中的致瘤性转化相联系。HER2的过表达已在20-30％的乳腺癌患者中得到鉴定，其中它与地方性重病、肿瘤复发可能性增加和患者存活减少相关。患有胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腹膜癌、***癌或结肠直肠癌的多达30-40％的患者也可以显示出这种蛋白质的过表达。少量HER2蛋白质以组织特异性方式在正常细胞的质膜上表达。这种蛋白质作为与其他ERBB受体的异二聚体受体复合物的一部分存在，所述其他ERBB受体结合生长因子配体。这种配体的结合激活HER2受体，导致生长信号从细胞外部传递给核。这些生长信号调节正常细胞生长和***方面。HER2基因在正常细胞中的改变导致HER2蛋白质的过表达，导致增加的细胞***、增加的细胞生长率，并且可能与至癌细胞表型的转化相关。当HER2基因中的此类改变在肿瘤细胞中发生时，HER2蛋白质直接过表达，或基因扩增导致该基因的多个拷贝和HER2蛋白质的后续过表达。触发这些改变的一种或多种因素目前是未知的。
已经证实EGFR的过表达也与结肠癌(Resnick，M.B.，等人，ClinCancer Res.10：3069-3075(2004))、直肠癌(Kopp，R.，等人，DisColon Rectum 46：1391-1399(2003))、非小细胞肺癌(Selvaggi，G.，等人，Ann Oncol.15：28-32(2004))和乳腺癌(Witton，C.J.，等人，J Pathol.200：290-297(2003)；Tsutsui，S.等人，Clin Cancer Res.8：3454-3460(2002))中的弱存活和复发相关。还已提出EGFR表达状态可以鉴定在晚期鼻咽癌内的患者亚组，其在诱导化疗和放射疗法后将具有弱结果(Chua，D.T.等人，Int J Radiat Oncol Biol Phys.59：11-20(2004))。存在EGFR的表达与***癌中的疾病复发和进展至雄激素不依赖性相关的证据(Di Lorenzo，G.等人，Clin Cancer Res.8：3438-3444(2002))。因此，在临床实践中EGFR的检测可以影响患者管理，包括EGFR靶向药物使用的相关问题。
IGFR的过表达也已在几种癌细胞系和肿瘤组织中得到证实。IGFR在所有乳腺癌细胞系中的40％(Pandini，等人，Cancer Res.5：1935(1999))和15％的肺癌细胞系中过表达。在乳腺癌肿瘤组织中，IGFR过表达6-14倍，并且与正常组织相比较，IGFR显示出2-4倍高的激酶活性(Webster，等人，Cancer Res.56：2781(1996)；Pekonen，等人，Cancer Res.48：1343(1998))。90％的结肠直肠癌组织活组织检查显示出升高的IGFR水平，其中IGFR表达的程度与疾病的严重度相关。与正常外宫颈细胞相比较，原发性***细胞培养物和***细胞系的分析揭示IGFR分别3和5倍的过表达(Steller，等人，Cancer Res.56：1762(1996))。在滑膜肉瘤细胞中IGFR的表达也与侵略性表型相关(即转移和高增殖率；Xie，等人，Cancer Res.59：3588(1999))。
HER2、EGFR或IGFR受体蛋白质的“过表达”意指相对于来自组织或器官的正常细胞中的表达水平，在患者的特定组织或器官内在来自肿瘤的细胞中HER2、EGFR或IGFR蛋白质分别地异常表达水平。患有特征在于HER2、EGFR或IGFR受体过表达的癌症的患者可以通过本领域已知的标准测定法进行确定。过表达可以使用免疫组织化学(IHC)检测在冷冻的固定细胞或石蜡包埋的组织切片中进行测量。当与组织学染色偶联时，可以确定被靶向蛋白质的定位，并且可以定性和半定量检测它在肿瘤内的表达程度。此类IHC检测测定法是本领域已知的，并且包括常规试验测定法(CTA)、商购可得的LabCorp 4D5测试、和商购可得的DAKO HercepTestTM(DAKO，Carpinteria，Calif.)。后面一种测定法使用0至3+细胞染色的特定范围(0是正常表达，3+指示最强的阳性表达)，以鉴定具有HER2蛋白质的过表达的癌症(参见；曲妥珠单抗完全处方信息；1998年9月；Genentech，Inc.，SanFrancisco，Calif.)。因此，患有特征在于HER2蛋白质的过表达的癌症的患者将受益于本发明的治疗方法，所述HER2蛋白质的过表达通过免疫组织化学(IHC)或荧光原位杂交(FISH)在1+、2+或3+(特别是2+或3+，更特别是3+)范围内。
使用标准检测测定法，几个类型的癌症已表征为具有过表达HER2、EGFR或IGFR受体的细胞。此类癌症包括但不限于乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、腹膜癌、***癌、膀胱癌、结肠直肠癌和成胶质细胞瘤。本发明的方法在任何此类癌症的治疗/管理中有用，所述癌症的细胞过表达C35和HER2、EGFR或IGFR蛋白质。特别有利的是乳腺癌。
Ⅲ.C35、HER2和EGFR抗体
本发明涉及针对C35、HER2和EGFR的抗体(在本文中称为抗C35、抗HER2或抗EGFR抗体；或C35、HER2和EGFR抗体)以及使用C35和HER2或C35和EGFR抗体的组合治疗癌症的方法。关于抗体的上文描述还应用于本文描述的C35、HER2和EGFR抗体。
本发明包括与C35、HER2或EGFR多肽或其片段、变体或融合蛋白质免疫特异性结合的抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子，或备选地由抗体片段或其变体组成的分子)。C35多肽包括但不限于，SEQID NO：2的C35多肽。HER2多肽包括但不限于，Genbank登记号AAA75493或AAA35978的HER2多肽。EGFR多肽包括但不限于，Genbank登记号AAB19486、AAH94761、AAI28420和AAI18666的EGFR多肽。C35、HER2或EGFR多肽可以通过核酸的重组表达来产生。(关于C35的含表位片段，参见WO 01/74859和美国申请号2004/0063907。)
靶向HER2受体功能的最广泛公认的单克隆抗体在商品名
Figure BPA00001188942400321
下销售(通常称为曲妥珠单抗、huMAb4D5-8或rhuMAbHER2；美国专利号5,821,337并且可从Genentech，Inc.，San Francisco，Calif.获得)。这种重组人源化单克隆抗体对于HER2具有高亲和力。用患有广泛转移乳腺癌的患者的早期临床试验证实这种单克隆抗体抑制乳腺癌细胞生长的能力，所述乳腺癌细胞过表达HER2(Baselga等人(1996)J.Clin.Oncol.14(3)：737-744)。在一个此类试验中，在转移乳腺癌患者中用曲妥珠单抗的单一疗法得到14％的总体应答率(2％完全应答者和12％部分应答者)。应答的持续时间中值为9.1个月，存活中值为12.8个月(范围为0.5至24+个月)。24％的患者在5.8个月时无进展(Genentech，Inc.，文件上的数据)。HER2的过表达程度预示治疗效应。
尽管最广泛公认的HER2抗体是曲妥珠单抗，但本发明的方法并不限于这种抗体的使用。鼠类起源的其他HER2抗体及其人源化和嵌合形式也适合于在本发明的方法中使用。其他此类HER2抗体的实例包括但不限于，4D5抗体(在美国专利号5,677,171和5,772,997中描述)；和520C9抗体及其功能等价物，命名为452F2、736G9、741F8、758G5和761B10(在美国专利号6,054,561中描述)；通过引用合并入本文。此外，新HER2抗体可以使用本领域已知的方法产生，或本文描述的其他。
许多研究已集中于针对EGFR的细胞外区域的抗体的产生。所产生的mAb主要通过阻断配体结合以及信号的破坏来介导其抗肿瘤活性。存在最初由Peng等人1996(Peng D等人Cancer Res 1996，56：3666-3669)和Mendelson等人1997.(Mendelsohn J Clin Cancer Res1997，3：2703-2707)研发的特异性识别EGFR的几种mAb。Mab 425、528 IgG2a和225IgG1用于治疗具有头与颈鳞状细胞癌的患者(SturgisE M，等人Otolaryngol.Head Neck Surg 1994，111：633-643)。实验工作包括放射性标记已显示mAb 425是包括神经胶质瘤的肿瘤生长的有效抑制剂(Rodeck U等人J Cell Biochem 1987，35：315-320；BradyL W等人Int J Radiat Oncol Biol Phys 1991，22：225-230；Faillot T等人Neurosurgery 1996，39：478-483)。IMC-C225 mAb特异性识别EGFR，并且在癌症例如头与颈癌、结肠直肠癌、胰腺癌和肺癌的治疗中具有许多潜力。mAb255在***细胞系中上调p27 K1P1，并且诱导G1停滞。IMC-C225也称为西妥昔单抗
Figure BPA00001188942400331
是重组的、人/小鼠嵌合的单克隆抗体，其与人EGFR的细胞外结构域特异性结合。西妥昔单抗是EGFR拮抗剂，其阻断与EGFR的配体结合，阻止受体激活，并且抑制表达EGFR的肿瘤细胞的生长。西妥昔单抗已批准用于与依立替康组合或不组合用于治疗患者，所述患者具有表皮生长因子受体表达的、转移结肠直肠癌，所述患者是难治的或不能耐受基于依立替康的化学疗法。
mAb R3针对EGFR产生，并且最初研发用于在放射免疫疗法中使用(Waterfield M D，等人J.Cell Biochem.1982，20：149-161；Ramos-Suzarte M，等人J.Nucl.Med.1999，40：768-775)。已产生R3的嵌合和人源化形式且在非洲绿猴中测试。R3的人源化形式保留了小鼠抗体的相同结合亲和力，并且发现具有小于嵌合抗体2倍的免疫原性。使用锝标记的小鼠和人源化mAb在小鼠中的异种移植物的临床前研究，显示用人源化形式作为诊断工具比鼠类形式具有更大的潜力。大鼠抗EGFR mAb，ICR62，有效竞争配体结合，并且消除小鼠中的人肿瘤异种移植物(鳞状细胞癌)。I期临床试验报道该抗体安全施用于具有鳞状细胞癌的患者，并且它自那以后已用于研究生长因子受体及其配体在头与颈鳞状细胞癌细胞系中的信号传导途径(O-charoenrat P等人Clin.Exp.Metastasis 2000，18：155-161；O-charoenrat P等人Int.J.Cancer 2000，86：307-317；O-charoenrat P等人Oral Oncol.2002，38：627-640)。
本发明进一步涉及基于抗体的治疗方法，其涉及给受试者(优选为哺乳动物、且最优选为人)施用至少一种C35抗体和至少一种HER2抗体，用于治疗一种或多种癌症。本发明还涉及基于抗体的治疗方法，其涉及给受试者(优选为哺乳动物、且最优选为人)施用至少一种C35抗体和至少一种EGFR抗体，用于治疗一种或多种癌症。本发明的治疗性化合物包括但不限于，本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物和衍生物)。本发明的抗体可以在如本领域已知的或如本文所述的药学上可接受的组合物中提供。
本发明的抗体包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体；单链抗体；scFv；双链抗体；三链抗体；四链抗体；微型抗体；结构域缺失抗体；Fab片段；F(ab’)2片段；由Fab表达库产生的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)；以及上述中任一项的表位结合片段。如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
采用杂交瘤技术先前制备对C35多肽特异的杂交瘤细胞系1F2.4.1和1B3.6.1。采用标准的方法，通过蛋白质G亲和纯化由杂交瘤上清液中分离抗体。在ELISA和蛋白质印迹测定法中，来自两种杂交瘤细胞系1F2和1B3的抗体特异性结合重组C35蛋白质。通过免疫组织化学，来自杂交瘤细胞系1F2的抗体还特异性地染色***固定的、石蜡包埋的C35阳性肿瘤和细胞系。这些抗体各自是独特的，但是两种抗体都对C35蛋白质特异。可以用这些抗体中的任一种对来自细胞裂解物的C35蛋白质进行免疫沉淀，并且用另一种检测。竞争性结合ELISA测定法表明，由杂交瘤细胞系1F2和1B3产生的单克隆抗体结合C35蛋白质的不同表位。
如通过引用合并入本文的Evans等人，美国公开号US20050158323所述，将编码1F2和1B3抗体的VL区域和VH区域的多核苷酸克隆到TOPO载体内，其在表2中所述的日期保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，并给予表2中所列出的ATCC保藏编号。ATCC位于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA。ATCC保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约来进行。
携带1F2重链序列的克隆1F2G于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5639。携带1F2轻链序列的克隆1F2K于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5640。携带1B3重链序列的克隆1B3G于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5637。携带1B3轻链序列的克隆1B3K于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5638。
表1.编码小鼠抗C35可变区的经保藏的多核苷酸克隆
  多核苷酸克隆   ATCC登记号   保藏日期
  1F2G   PTA-5639   2003年11月11日
  1F2K   PTA-5640   2003年11月11日
  1B3G   PTA-5637   2003年11月11日
  1B3K   PTA-5638   2003年11月11日
经保藏的克隆的小鼠可变区基因和载体的部分的序列如下所示。
Figure BPA00001188942400361
＝Topo载体序列(包括在经保藏的克隆中)
Figure BPA00001188942400362
＝Topo载体的EcoR1克隆位点
小写字母＝5’非翻译区，包括generacer启动子
Figure BPA00001188942400363
＝鼠类信号肽开始
粗体字＝框架区(FWR)
Figure BPA00001188942400364
＝CDR1、CDR2或CDR3
下划线＝小鼠IgG1或κ恒定区的5’部分。
1F2鼠类抗C35Vγ1基因多核苷酸序列(来自克隆1F2G)(SEQID NO：3)：
Figure BPA00001188942400365
cgactggagcacgggacactgacatggactgaaggagtagaaaacatctctctcattagaggttgatctttgaggaaaacagggtgttgcctaaagg
Figure BPA00001188942400366
AAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTGTTGACAGCCATTCCTGGTATCCTGTCT
Figure BPA00001188942400368
Figure BPA00001188942400369
GCCAA
Figure BPA000011889424003610
AACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCA
Figure BPA000011889424003611
Figure BPA000011889424003612
信号肽＝18AA
FR1＝30AA
CDR1＝6AA
FR2＝14AA
CDR2＝16AA
FR3＝32AA
CDR3＝7AA
FR4＝11AA
1F2VH氨基酸序列(由克隆1F2G编码)(SEQ ID NO：4)：
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYFWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNSNPSLKNRISFTRDTSKNQFFLKFNSVTTDDSAAYYCTRGTTGFAYWGQGTLVTVSA
1F2鼠类抗C35κV基因多核苷酸序列(来自克隆1F2K)(SEQID NO：5)：
Figure BPA00001188942400371
cgactggagcacgaggacactgacatggactgaaggagtagaaaaattagctagggaccaaaattcaaagacagaGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCAGAATGTCCAGAGGA
Figure BPA00001188942400373
Figure BPA00001188942400374
Figure BPA00001188942400375
CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAA
Figure BPA00001188942400376
信号肽＝22AA
FR1＝23AA
CDR1＝10AA
FR2＝15AA
CDR2＝7AA
FR3＝32AA
CDR3＝9AA
FR4＝10AA
1F2-VK核酸序列(由克隆1F2K编码)(SEQ ID NO：6)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKPWIYHTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHSYPPTFGGGTKLEIK
1B3鼠类抗C35VγV基因(由克隆1B3G编码)(NC1-A7V139-D-J1(VH36-60)M13281)(SEQ ID NO：7)：
Figure BPA00001188942400377
cgactggagcacgaggacactggacatggactgaaggagtagaaaatctctctcactggaggctgatttttgaagaaaggggttgtagcctaaaag
Figure BPA00001188942400378
ATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTGTTGACAGCCCTTCCGGGTATCCTGTCA
Figure BPA000011889424003710
GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCA
Figure BPA000011889424003711
Figure BPA000011889424003712
信号肽＝18AA
FR1＝30AA
CDR1＝5AA
FR2＝14AA
CDR2＝16AA
FR3＝32AA
CDR3＝14AA
FR4＝11AA
1B3 VH氨基酸序列(由克隆1B3G编码)(SEQ JD NO：8)：
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYVGYISYSGGTYYNPSLKSRISITRDTSKNHYYLQLNSVTTEDTATYYCARGAYYGGAFFPYFDVWGAGTTVTVSS
1B3鼠抗C35κV基因(来自克隆1B3K)(SEQ ID NO：9)：
Figure BPA00001188942400381
cccctggagcacgaggacactgacatggactgaaggagtagaaaatcagttcctgccaggacacagtttagatAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATATCAGGTGCCCACTGT
Figure BPA00001188942400383
Figure BPA00001188942400384
Figure BPA00001188942400385
CGGGCT
Figure BPA00001188942400386
GATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAA
Figure BPA00001188942400387
SP＝20AA
FR1＝23aa
CDR1＝11aa
FR2＝15aa
CDR2＝7AA
FR3＝32aa
CDR3＝9AA
FR4＝10AA
1B3 VK氨基酸序列(由克隆1B3K编码)(SEQ ID NO：10)：
DVQITQSPSFLAASPGETITINCRASKYISKHLVWYQEKPGETKKLLIYSGSTLQSGLPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPLTFGAGTKLELK
本发明的C35抗体包括这样的抗体，其免疫特异性结合本发明的SEQ ID NO：2的C35多肽、多肽片段、或变体、和/或表位(如通过用于测定特异性抗体-抗原结合的本领域众所周知的免疫测定法测定的)。
如本文所用，术语“经分离的”意欲描述如下目的化合物(例如C35抗体)，该化合物处于与所述化合物天然出现的环境不同的环境中。“经分离的”意欲包括在样品内的化合物，该样品基本上富集了目的化合物和/或在该样品中目的化合物是部分或基本上纯化的。
如本文所用，术语“基本上富集的”和“基本上纯化的”是指这样的化合物，其从其天然环境中取出，并且至少60％、优选为75％、且最优选为90％不含它与之天然结合的其他成分。如本文所用，与参照抗体具有“相同特异性”的抗体是指该抗体结合与参照抗体相同的表位。抗体是否结合与参照抗体相同的表位的测定可以采用下文所述的测定法来进行。
衍生自本文讨论的小鼠杂交瘤细胞系的抗体(1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171)在共同未决的美国申请号11/812,996中描述。编码这些抗体的VL和VH区域的多核苷酸于2003年11月11日保藏于美国典型培养物中心(“ATCC”)。克隆1F2G于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5639。克隆1F2K于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5640。克隆1B3G于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5637。克隆1B3K于2003年11月11日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏编号PTA-5638。
1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165或MAb 171抗体的使用用于举例说明性目的，并且该方法并不应解释为局限于这些抗体。任何C35抗体，包括但不限于共同未决的美国申请号11/812,996中列出的那些，在本发明的方法中有用。
优选地，示例性抗体的类似物通过保守性的氨基酸取代与示例性抗体不同。为了将氨基酸的取代分类为保守性的或非保守性的，可以将氨基酸分成以下几组：组I(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；组III(酸性侧链)：asp、glu；组IV(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链方向的残基)：gly、pro；以及组VI(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守性的取代包括同一类别中的氨基酸之间的取代。非保守性的取代构成了这些类别之一的成员交换另一类别的成员。
最优选地，所述抗体为本发明的人、嵌合(例如人-小鼠嵌合)或人源化抗体，或者抗原结合抗体片段，其包括，但不限于：Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、细胞内抗体、以及含有VL区域或VH区域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包含单独的可变区或者与以下的全部或部分组合的可变区：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。本发明还包括的是抗原结合片段，该片段还包含可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任何组合。在本发明的治疗方法中的优选抗体为含有CH2结构域缺失的那些抗体。
用于与本发明的方法一起使用的抗体可以根据其识别或特异性结合的本发明多肽的一个或多个表位或部分来进行描述或详细说明。如本文所述，通过例如N末端和C末端的位置或者通过邻接氨基酸残基中的大小，可以详细说明所述一个或多个表位或多肽部分。还排除特异性结合本发明的任何表位或多肽的抗体。因此，本发明包括特异性结合本发明的多肽的抗体，并且允许排除该抗体。
用于与本发明的方法一起使用的抗体还可以根据其与本发明的多肽的结合亲和力来进行描述或详细说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5X10(-7)M、10(-7)M、5X10(-8)M、10(-8)M、5X10(-9)M、10(-9)M、5X10(-10)M、10(-10)M、5X10(-11)M、10(-11)M、5X10(-12)M、10(-12)M、5X10(-13)M、10(-13)M、5X10(-14)M、10(-14)M、5X10(-15)M或10(-15)M的那些。
用于与本发明的方法一起使用的某些抗体对于C35的亲和力和抗体1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165和MAb 171的亲和力相同或相似。优选地，本发明的抗体对于C35的亲和力高于抗体1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165和MAb 171的亲和力。
本发明还包括如下抗体(包括包含抗体片段或其变体的分子，或备选地由抗体片段或其变体组成的分子)的用途，该抗体具有与本文所述的一种或多种抗体相同的一种或多种生物学特征。“生物学特征”是指抗体的体外或体内活性或性质，例如结合C35、HER2、EGFR和/或IGFR多肽的能力；基本上抑制或取消C35、HER2、EGFR和/或IGFR多肽介导的生物学活性的能力；杀死C35、HER2、EGFR和/或IGFR相关癌细胞的能力；或诱导表达HER2、EGFR和/或IGFR的癌细胞的细胞凋亡的能力。任选地，本发明的抗体与本文特别提及的抗体中的至少一种相同的表位结合。可以采用本领域已知和下文描述的测定法常规测定这种表位结合。
本发明的人源化免疫球蛋白和人抗体变体具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变框架区、和基本上来自小鼠C35、HER2、EGFR和/或EGFR VH和VL区域(称为供体免疫球蛋白)的CDR。此外，恒定区如果存在的话也基本上来自人免疫球蛋白。人源化抗体和人抗体变体表现出对C35、HER2、EGFR或IGFR的特异性结合亲和力为至少10(2)、10(3)、10(4)、10(5)、10(6)、10(7)、10(8)、10(9)或10(10)M(-l)。通常，人源化抗体和人抗体变体对于人C35、HER2或EGFR的结合亲和力的上限在小鼠抗体1F2或1B3的结合亲和力的3、4、5或10倍内。通常，对于人C35的结合亲和力的下限同样也在小鼠抗体1F2或1B3的结合亲和力的3、4、5或10倍内。优选的抗C35人源化免疫球蛋白和人抗体变体与小鼠抗体1F2或1B3竞争与C35结合，并阻止C35与分别的小鼠或人抗体结合。
可能的人受体抗体的重链可变区和轻链可变区由Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health，Bethesda，Md.，1987和1991)描述。这样选择人受体抗体，使得其可变区表现出与小鼠C35或HER2抗体的可变区的高度序列同一性。重链可变框架区和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列或者可以是数种人抗体的共有序列。
可以如下进行人源化免疫球蛋白的设计。当氨基酸归入以下范畴时，待使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸被来自用于提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸替代：
(a)受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸在该位置处对于人免疫球蛋白是罕见的，而供体免疫球蛋白的相应氨基酸在该位置处对于人免疫球蛋白是通常的；
(b)氨基酸的位置与CDR之一紧邻；或
(c)氨基酸能够与CDR相互作用(分别参见Queen等人，WO92/11018.和Co等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，2869(1991)，这两份文献均通过引用合并入本文)。关于人源化免疫球蛋白的生产的详细描述，参见Queen等人和Co等人。
通常，人源化抗体和人抗体变体中的CDR区域与该CDR区域衍生自其的小鼠或人抗体中的相应CDR区域基本上相同，并且更通常地是相同的。可以进行CDR残基的一个或多个氨基酸取代，而不明显影响所得到的人源化免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力，并且有时候，CDR区域或CDR区域范围内的取代可以增强结合亲和力。例如参见Iwahashi等人，Mol.Immunol.36：1079-1091(1999)；Glaser等人，J.Immunol.149(8)：2607-2614(1992)；和Tamura等人，J.Immunol.164：1432-1441(2000)。
除了上文所述的特定的氨基酸取代以外，人源化免疫球蛋白和人抗体变体的框架区与该框架区衍生自其的人抗体(受体免疫球蛋白)的框架区通常基本上相同，并且更通常地是相同的。当然，框架区中的许多氨基酸几乎不促成或不直接促成抗体的特异性或亲和力。因此，可以耐受框架残基的许多个别的保守性的取代，而没有所得到的人源化免疫球蛋白或人抗体变体的特异性或亲和力的明显改变。
噬菌体展示技术提供了用于选择类似物的有力技术，所述类似物与亲本序列具有基本的序列同一性，同时保留了结合亲和力和特异性(例如参见Dower等人，WO 91/17271；McCafferty等人，WO92/01047；和Huse，WO 92/06204；US 2002/0123057A1；这些文献各自通过引用合并入本文)。
如上所述产生的人源化抗体或人抗体变体的可变节段通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分连接，通常与人免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。可以根据公知的操作从各种人细胞(例如永生化的B细胞)中分离人恒定区DNA序列(参见上文的Kabat等人和WO 87/02671)。所述抗体可以包含轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区可以包含CH1、铰链、CH2、CH3，有时还包含CH4区域。对于治疗目的而言，CH2区域可以缺失或省略。
人源化抗体或人抗体变体包括具有所有类型恒定区的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任何同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。当希望人源化抗体或人抗体变体表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常为补体结合性恒定结构域，并且其类别通常为IgG1。当不需要这种细胞毒活性时，恒定结构域可以为IgG2类别。人源化抗体或人抗体变体可以包含来自多于一个类别或同种型的序列。
还包括了嵌合抗体用于在本发明中使用。这种抗体可以包含与另一物种(例如人或小鼠或马等)的CH区域和/或CL区域融合的VH区域和/或VL区域。在优选的实施方案中，嵌合抗体包含与人C区域融合的、由鼠抗C35或抗HER2抗体编码的VH和/或VL区域。当抗体用于治疗目的时，人CH2结构域可以缺失。嵌合抗体包括了抗体片段，如上文所述。
如上所述产生的嵌合抗体的可变节段通常与免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分连接，通常与人免疫球蛋白恒定区的至少一部分连接。可以根据公知的操作从各种人细胞(例如永生化的B细胞)中分离人恒定区DNA序列(参见上文的Kabat等人和WO 87/02671)。所述抗体可以包含轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区可以包含CH1、铰链、CH2、CH3，有时还包含CH4区域。对于治疗目的而言，CH2区域可以缺失或省略。
嵌合抗体包括具有所有类型恒定区的抗体，恒定区包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及任何同种型的抗体(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。当希望嵌合抗体表现出细胞毒活性时，恒定结构域通常为补体结合性恒定结构域，并且其类别通常为IgG1。当不需要这种细胞毒活性时，恒定结构域可以为IgG2类别。嵌合抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列。
多种方法可以用于产生此类免疫球蛋白。由于遗传密码简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。可以通过从头固相DNA合成或者通过所需多核苷酸的较早制备的变体的PCR诱变产生所需核酸序列。编码本申请中描述的抗体的所有核酸都明确地包括在本发明内。
本发明的整体抗体、其二聚体、个别轻链和重链或其他免疫球蛋白形式一经表达，便可根据本领域中标准操作(包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法、凝胶电泳等)进行纯化(通常参见Scopes，R.，ProteinPurification，Springer- Verlag，N.Y.(1982)，其通过引用合并入本文)。对于药学用途，至少约90％至95％同质性的基本纯的免疫球蛋白是优选的，并且98％至99％或更高同质性是最优选的。一旦部分纯化或者纯化到所希望的同质性，随后就可以将所述多肽治疗性(包括体外)地用于开发或执行测定法操作、免疫荧光染色等等(一般参见，Immunological Methods，第I和II卷，Lefkovits和Pernis，编辑，Academic Press，New York，N.Y.(1979和1981)，或者检测C35或者诊断C-35相关的癌症。
如下文更详细地讨论的，在本发明的方法中使用的抗体可以单独使用，彼此组合使用，或者与其他组合物组合使用。所述抗体可以进一步在N末端或C末端处与异源多肽重组融合，或者与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)。例如，本发明的抗体可以与在检测测定法中用作标记物的分子和效应分子重组融合或缀合，所述效应分子例如异源多肽、药品、放射性核素或毒素。例如参见PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995和EP 396,387，所述专利通过引用整体合并入本文。
在本发明的方法中使用的抗体包括经修饰的衍生物，所述修饰即通过使任何类型的分子与所述抗体共价附着，从而使得共价附着不会妨碍抗体结合C35、HER2、EGFR或IGFR。例如但不限于，所述抗体衍生物包括已通过下述进行修饰的抗体：例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质相连等等。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何修饰，其中所述化学修饰包括但不限于，特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，所述衍生物可以包含一种或多种非典型氨基酸。
在本发明的方法中使用的抗体可以由通过肽键或经修饰的肽键而彼此连接的氨基酸(即，肽的等排体)组成，并且可以包含除了20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。在本发明的方法中使用的抗体可以通过天然过程(例如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。这些修饰在基础课本和更详细的专论中、以及在大量的研究文献中充分描述。修饰可以在抗体中的任何位置处发生，所述位置包括肽主链、氨基酸侧链、以及氨基或羧基末端。应该理解，相同类型的修饰可以以相同程度或不同程度存在于给定抗体中的数个位点处。此外，给定抗体可以包含许多类型的修饰。抗体可以例如由于泛素化而是分支的，并且它们可以是环状的，具有或不具有分支。环状、分支、以及分支环状的抗体可以起因于翻译后的天然过程，或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价附着、亚铁血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧酸化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(例如精氨酰化)以及泛素化(例如参见PROTEINS- STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，编辑，AcademicPress，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明的一个进一步的实施方案涉及包含抗体序列的氨基酸序列的多肽，所述抗体序列具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列包含至少1个氨基酸取代，但不超过50个氨基酸取代，甚至更优选地不超过40个氨基酸取代，还更优选地不超过30个氨基酸取代，并且甚至还更优选地不超过20个氨基酸取代。当然，按照不断增加的优先次序，高度优选多肽具有包含抗体序列的氨基酸序列，所述抗体序列包含至少1个氨基酸取代，但不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸取代。在具体的实施方案中，抗体序列中的加入、取代和/或缺失的数目为1-5、5-10、5-25、5-50、10-50或50-150。就取代而言，保守性的氨基酸取代是优选的。所述取代可以在框架区或CDRs或两者内。
该部分的说明适用于在本发明的方法中有用的C35、HER2、EGFR和/或IGFR抗体。这种抗体可以如本文所述的与毒素缀合或复合，或者可以是非缀合的或非复合的。
Ⅳ.C35、HER2和EGFR抗体多肽
本发明进一步涉及构成本发明的抗体的经分离的多肽、以及编码这种多肽的多核苷酸。本发明的抗体包括多肽，例如编码衍生自免疫球蛋白分子的C35、HER2或EGFR特异性抗原结合区域的氨基酸序列。“衍生自”指定蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。在某些情况下，衍生自特定的初始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与所述初始序列或其一部分的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或者由于具有其在初始序列中的来源，可以以其他方式被本领域普通技术人员鉴定。
在一个实施方案中，本发明提供了经分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，或者基本上由免疫球蛋白重链可变区组成，或者由免疫球蛋白重链可变区组成，其中所述重链可变区的CDR中的至少一个或者所述重链可变区的CDR中的至少两个与来自上文提及的C35、HER2或EGFR抗体的参照重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同。备选地，所述VH的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自上文提及的抗体的参照重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VH多肽，基本上由上文所述的一种或多种VH多肽组成，或由上文所述的一种或多种VH多肽组成的抗体或其抗原结合片段，与选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165和MAb 171的单克隆抗体的相同表位特异性或优先地结合，或者竞争性地抑制此类单克隆抗体与C35结合。
在一些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VH多肽，基本上由上文所述的一种或多种VH多肽组成，或由上文所述的一种或多种VH多肽组成的抗体或其抗原结合片段，与C35、HER2或EGFR多肽或其片段、或者C35、HER2或EGFR变体多肽特异性或优先地结合，其亲和力可表征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M。
在另一个实施方案中，本发明提供了经分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，基本上由免疫球蛋白轻链可变区组成，或由免疫球蛋白轻链可变区组成，其中所述轻链可变区的CDR中的至少一个或者所述的轻链可变区的CDR中的至少两个与来自上文提及的C35、HER2或EGFR抗体的参照重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同。备选地，所述VL的CDR1、CDR2和CDR3区域与来自上文提及的抗体的参照轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同。
在一些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VL多肽，基本上由上文所述的一种或多种VL多肽组成，或由上文所述的一种或多种VL多肽组成的抗体或其抗原结合片段，与选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165和MAb 171的单克隆抗体的相同表位特异性或优先地结合，或者竞争性地抑制此类单克隆抗体与C35结合。
在一些实施方案中，包含上文所述的一种或多种VL多肽，基本上由上文所述的一种或多种VL多肽组成，或由上文所述的一种或多种VL多肽组成的抗体或其抗原结合片段，与C35、HER2或EGFR多肽或其片段、或者C35、HER2或EGFR变体多肽特异性或优先地结合，其亲和力可表征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M。
上文所述的任何多肽可以进一步包含其他多肽，例如指导所编码的多肽分泌的信号肽、如本文所述的抗体恒定区、或如本文所述的其他异源多肽。此外，本发明的多肽包括在本文其他地方所述的多肽片段。此外，如本文所述，本发明的多肽包括融合多肽、Fab片段和其他衍生物。
此外，本领域普通技术人员应当理解，如本文所公开的C35、HER2或EGFR抗体多肽可以这样进行修饰，使得它们在氨基酸序列中不同于它们所衍生自的天然存在的结合多肽。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以是相似的，例如与初始序列具有一定的同一性百分比，例如它可以与初始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。
此外，可以制备导致在“非必需”氨基酸区域处的保守性取代或变化的核苷酸或氨基酸的取代、缺失或***。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可以与初始序列相同，除了一个或多个个别氨基酸的取代、***或缺失，例如一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多个个别氨基酸的取代、***或缺失。在一些实施方案中，相对于初始序列，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列具有1至5、1至10、1至15、或者1至20个个别氨基酸的取代、***或缺失。
本发明的某些抗体多肽包含衍生自人氨基酸序列的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。但是，某些抗体多肽包含衍生自其他哺乳动物物种的一个或多个邻接氨基酸。例如，本发明的抗体可以包含灵长动物的重链部分、铰链部分或抗原结合区域。在另一个实例中，一个或多个鼠类衍生的氨基酸可以存在于非鼠类的抗体多肽中，例如C35、HER2或EGFR抗体的抗原结合位点中。在某些治疗性应用中，C35、HER2或EGFR特异性抗体或者其抗原结合片段、变体或类似物这样进行设计，以便在所述抗体施用于其的动物中是非免疫原性的。
在一些实施方案中，本发明的抗体多肽包含通常与抗体无关的氨基酸序列或一个或多个部分。下文更详述地描述了示例性的修饰。例如，本发明的单链fv抗体片段可以包含弹性连接体序列，或者可以进行修饰以加入功能性部分(例如PEG、药品、毒素或标记物)。
本发明的抗体多肽可以包含融合蛋白质，基本上由融合蛋白质组成，或由融合蛋白质组成。融合蛋白质为嵌合分子，其包含例如：具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域、和至少一个异源部分，即，它在自然界中与之非天然连接的部分。所述氨基酸序列通常可以存在于分开的蛋白质中，并在融合多肽中被集合在一起；或者所述氨基酸序列通常可以存在于同一蛋白质中，但在融合多肽中以新的排列方式放置。例如可以通过化学合成或通过产生且翻译多核苷酸(其中肽区域以所需关系编码)来产生融合蛋白质。
“保守性的氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基取代的情况。本领域已经对具有相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义，所述氨基酸残基家族包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地由来自相同侧链家族中的另一种氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以由侧链家族成员的次序和/或组成中不同的结构上相似的串替代。
备选地，在另一个实施方案中，可以通过例如饱和诱变，沿着免疫球蛋白编码序列的全部或一部分随机地引入突变，并且可以将所得的突变体掺入到C35或HER2抗体中，在本文所公开的治疗方法中使用。
Ⅴ.融合蛋白质和抗体缀合物
在本发明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以进一步在N末端或C末端与异源多肽重组融合，或与多肽或其他组合物化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)。例如，本发明的抗体与在检测测定法中用作标记物的分子和效应分子重组融合或缀合，所述效应分子例如异源多肽、药品、放射性核素或毒素。例如参见PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995和EP 396,387。
本发明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物包括经修饰的衍生物，所述修饰即通过使任何类型的分子与所述抗体共价附着，从而使得共价附着不会妨碍抗体分别结合C35、HER2、EGFR或IGFR。例如但不限于，所述抗体衍生物包括已通过下述进行修饰的抗体：例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、phosphylation、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何修饰，所述化学修饰包括但不限于，特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，所述衍生物可以包含一种或多种非典型氨基酸。
本发明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或经修饰的肽键而彼此连接的氨基酸(即，肽的等排体)组成，并且可以包含除了20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。本发明的抗体可以通过天然过程(例如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。这些修饰在基础课本和更详细的专论中、以及在大量的研究文献中充分描述。修饰可以在抗体中的任何位置处发生，所述位置包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端、或在诸如糖碳水化合物的部分上。应该理解，相同类型的修饰可以以相同程度或不同程度存在于给定抗体中的数个位点处。此外，给定抗体可以包含许多类型的修饰。抗体可以例如由于泛素化而是分支的，并且它们可以是环状的，具有或不具有分支。环状、分支、以及分支环状的抗体可以起因于翻译后的天然过程，或者可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价附着、亚铁血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧酸化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(例如精氨酰化)以及泛素化(例如参见Proteins Structure And Molecular Pproperties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann NY Acad Sci663：48-62(1992))。
本发明还提供了融合蛋白质，其包含C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽。抗体与之融合的异源多肽可用于发挥功能或用于靶向表达C35、HER2、EGFR或IGFR的细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白质包含多肽和异源多肽序列，基本上由多肽和异源多肽序列组成，或由多肽和异源多肽序列组成，所述多肽具有本发明抗体的任何一个或多个VH区域的氨基酸序列、或者本发明抗体或其片段或变体的任何一个或多个VL区域的氨基酸序列。在另一个实施方案中，在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白质包含多肽和异源多肽序列，基本上由多肽和异源多肽序列组成，或由多肽和异源多肽序列组成，所述多肽具有C35、HER2、EGFR或IGFR特异性抗体或者其片段、或变体或衍生物的VH CDR中的任何一个、两个、三个的氨基酸序列，或者C35、HER2、EGFR或IGFR特异性抗体或者其片段、或变体或衍生物的VL CDR中的任何一个、两个、三个的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白质包含多肽和异源多肽序列，所述多肽具有本发明C35特异性抗体或其片段、衍生物或变体的VH CDR3的氨基酸序列，所述融合蛋白质特异性结合C35的至少一个表位。在另一个实施方案中，融合蛋白质包含多肽和异源多肽序列，所述多肽具有本发明C35特异性抗体的至少一个VH区域的氨基酸序列，和本发明C35特异性抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区域的氨基酸序列。优选地，所述融合蛋白质的VH和VL区域相应于特异性结合C35的至少一个表位的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。在另外一个实施方案中，用于在本文公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白质包含多肽和异源多肽序列，所述多肽具有C35特异性抗体的VH CDR中的任何一个、两个、三个或更多个的氨基酸序列，和C35特异性抗体或其片段或变体的VL CDR中的任何一个、两个、三个或更多个的氨基酸序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或更多个VH CDR(s)或VL CDR(s)相应于本发明的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。本发明还包括编码这些融合蛋白质的核酸分子。
文献中报道的示例性融合蛋白质包括以下物质的融合物：T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon等人，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等人，Nature 344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等人，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等人，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；以及IgE受体(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.第115卷，Abstract No.1448(1991))。
如本文中其他地方所述，可以使在本发明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与异源多肽融合，以增加所述多肽的体内半衰期。例如，在一个实施方案中，PEG可以与本发明的抗体缀合，以增加其体内半衰期(Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002))。
在本发明的方法中使用的抗体可以以非缀合的形式使用，或者可以与多种分子中的至少一种缀合，从而例如改善所述分子的治疗性质，以促进靶检测，或者用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，可以在纯化之前或纯化之后使在本发明的方法中使用的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物标记或缀合。
特别地，可以使本发明的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与治疗性试剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG缀合。
本发明进一步包括了与诊断试剂或治疗性试剂缀合的在本发明的方法中使用的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。所述抗体可以在诊断中使用，例如，作为临床检验操作的一部分来监控疾病的发展或进程，以例如确定给定治疗和/或预防方案的效果。可以通过使抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与可检测物质偶联来促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用了各种正电子发射断层显像的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁金属离子。关于金属离子参见例如美国专利号4,741,900，该金属离子可以与抗体缀合用于作为根据本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括：链霉亲核素/生物素、以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括：伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括：萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白质；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
Ⅵ.抗体多肽的表达
如所公知的，可以通过标准技术(例如异硫氰胍提取和沉淀，随后为离心或色谱法)从原始的杂交瘤细胞中或从其他经转化的细胞中分离RNA。需要时，可以通过标准技术(例如在寡dT纤维素上的色谱法)从总RNA中分离mRNA。合适的技术是本领域熟悉的。
可以采用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常为质粒DNA，根据详细阐明(例如在关于重组DNA技术的现有文献中)的标准的公知的技术来制作限制性图谱并测序。当然，可以在分离过程或随后的分析过程中的任何时间点，根据本发明合成DNA。
在处理经分离的基因材料以提供C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物后，通常将编码抗体的多核苷酸***表达载体内用于引入宿主细胞内，所述宿主细胞可以用于产生所需量的本发明的抗体。
与本文所述的靶分子结合的本发明的抗体或者其片段、衍生物或类似物(例如抗体的重链或轻链)的重组表达需要构建包含编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。编码本发明的抗体分子或者抗体的重链或轻链、或者其部分(优选包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸一经获得，便可以采用本领域公知的技术通过重组DNA技术生产用于产生所述抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达包含编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域的技术人员公知的方法来构建表达载体，所述表达载体包含抗体编码序列、以及合适的转录和翻译调控信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供了可复制的载体，其包含与启动子可操作地连接的、编码本发明的抗体分子或者其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这种载体可以包含编码所述抗体分子的恒定区的核苷酸序列(例如参见PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且所述抗体的可变结构域可以被克隆到这种载体中，用于表达完整的重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明使用的载体，作为用于引入到宿主细胞内并在宿主细胞中表达所需基因的媒介物。如本领域的技术人员所已知的，这种载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择标记物、有助于克隆所需基因的合适的限制性位点、以及进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
更通常的是，一旦制备出编码C35、HER2、EGFR或IGFR抗体的单体亚单位的载体或DNA序列，便可以将表达载体引入到合适的宿主细胞内。可以通过本领域的技术人员公知的多种技术来完成质粒向宿主细胞内的引入。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用有包膜DNA的细胞融合、显微注射以及使用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors″Vectors，Rodriguez和Denhardt，编辑，Butterworths，Boston，Mass.，第24.2章，第470-472页(1988)。通常，向宿主内引入质粒经由电穿孔。使包含表达构建体的宿主细胞在适合于产生轻链和重链的条件下生长，并就重链和/或轻链蛋白质的合成进行测定。示例性的测定法技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)、或荧光激活细胞分拣仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养经转染的细胞，以产生在本文所述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括宿主细胞，其包含编码与异源启动子可操作地连接的、本发明抗体或其片段或者其重链或轻链的多核苷酸。在用于表达双链抗体的优选实施方案中，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体，用于表达完整的免疫球蛋白分子，如下文所述。
如本文所用，“宿主细胞”是指如下细胞，其包含采用重组DNA技术构建并编码至少一个异源基因的载体。在从重组宿主中分离抗体的过程的描述中，除非另有明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可交换使用，以表示抗体的来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可以指从向下旋转的完整细胞中，或从包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中。
可以使用多种宿主表达载体***来表达在本文所述的方法中使用的抗体分子。这种宿主表达***代表了通过其可以产生并随后纯化的目的编码序列的媒介物，还代表了这样的细胞，当使用合适的核苷酸编码序列进行转化或转染时，其可以原位表达本发明的抗体分子。这些宿主表达***包括但不限于，微生物例如使用包含抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；使用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；使用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；使用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV))感染的、或者使用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞***；或者包含重组表达构建体(其包含衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒基因组的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子))的哺乳动物细胞***(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，使用专门用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞例如大肠埃希杆菌(Escherichiacoli)，更优选地真核细胞，来表达重组抗体分子。例如，与载体例如来自人巨细胞病毒的主要即刻早期基因启动子结合的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，是用于抗体的有效的表达***(Foecking等人，Gene 45：101(1986)；Cockett等人，Bio/Technology8：2(1990))。
用于蛋白质表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；相信本领域的技术人员具有优先地确定具体的宿主细胞系的能力，所述宿主细胞系最适合于待在其中表达的所需基因产物。示例性的宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR缺陷)、HELA(人***)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可从商业机构、美国组织培养物保藏中心或公开的文献中获得。
此外，可以选择调节***序列的表达、或者以所需的特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于所述蛋白质的功能是重要的。对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰，不同的宿主细胞具有特征性和特异性的机制。可以选择合适的细胞系或宿主***，以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用如下真核宿主细胞，其具有用于初始转录物的适当加工，以及基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制。
为了长期、高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，稳定地表达抗体分子的细胞系可以是经改造的。不使用包含病毒复制起点的表达载体，可以使用由合适的表达调控元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和可选择标记物调控的DNA来转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，可以允许经改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记物赋予针对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体内，并生长以形成转化灶(foci)，该转化灶依次可以被克隆并扩展到细胞系内。可以有利地使用该方法来改造稳定表达抗体分子的细胞系。
可以通过载体的扩增来提高抗体分子的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning，Academic Press，New York，第3卷.(1987))。当表达抗体的载体***中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平提高会增加标记物基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因结合，所述抗体的生产也增高(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
在体外生产允许按规模扩大，以得到大量所需的多肽。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，并且包括在例如气升式反应器或连续搅拌反应器中的均匀悬浮培养，或者在例如中空纤维、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷筒上的固定化或截留的细胞培养。必需和/或需要时，在例如合成铰链区多肽的优先生物合成之后、或在本文所述的HIC色谱法步骤之前或之后，可以通过常规的色谱方法(例如凝胶过滤、离子交换色谱法、经过DEAE纤维素的色谱法或(免疫)亲和色谱法)来纯化多肽溶液。
编码在本发明的方法中使用的C35、HER2、EGFR或IGFR抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可以在非哺乳动物细胞例如细菌或酵母或植物细胞中表达。容易摄取核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，例如大肠埃希杆菌或沙门氏菌属的菌株；芽孢杆菌科的成员，例如枯草杆菌；肺炎球菌属(Pneumococcus)的成员；链球菌属(Streptococcus)的成员以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应该进一步理解，当在细菌中表达时，该异源多肽通常成为包涵体的一部分。必须将异源多肽分离、纯化，然后组合成功能分子。当需要抗体的四价形式时，随后将亚单位自组合成四价抗体(WO02/096948A2)。
在细菌***中，可以根据对于所表达的抗体分子预期的用途来有利地选择多种表达载体。例如，当准备产生大量此类蛋白质用于产生抗体分子的药物组合物时，指导融合蛋白质产物(其易于纯化)的高水平表达的载体是理想的。这种表达载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中可以将抗体编码序列个别地连接到所述载体的lacZ编码区域的框架中，从而产生融合蛋白质；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109(1985)；Van Heeke & Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等。还可以使用pGEX载体表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质的外源多肽。通常，这种融合蛋白质是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠子上、然后通过在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，从裂解细胞中容易地纯化。pGEX载体经设计以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得可以从GST部分中释放经克隆的靶基因产物。
除了原核生物外，还可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常使用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母，但是许多其他菌株(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))通常也可以利用。
对于在酵母菌属中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature 282：39(1979)；Kingsman等人，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene 10：157(1980))。这种质粒已经包含了TRP1基因，该基因提供了关于缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株(例如ATCC编号44076或PEP4-1)的选择标记物(Jones，Genetics 85：12(1977))。那么，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供了通过在不存在色氨酸的情况下生长用于检测转化的有效环境。
在昆虫***中，通常使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列个别地克隆到所述病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)内，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。
一旦在本发明的方法中使用的抗体分子已被重组表达，它便可以通过本领域已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法(例如色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是在蛋白质A后通过对于特异性抗原的亲和力)以及分子筛柱色谱法)、离心、差异溶解或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准的技术)进行纯化。备选地，用于增加本发明抗体的亲和力的优选方法在US 2002/0123057 Al中公开。
Ⅶ.使用包括抗C35抗体的联合疗法的治疗方法
本发明涉及使用本发明的抗体的组合治疗过度增殖性疾病例如治疗癌症的方法。在一些实施方案中，施用至少一种抗C35抗体和至少一种抗HER2抗体。在一个具体实施方案中，施用一种抗C35抗体和一种抗HER2抗体。在一个更具体的实施方案中，抗C35抗体是1B3或1F2或其变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。在其他实施方案中，可以施用至少一种抗C35抗体和至少一种抗EGFR抗体。在一个具体实施方案中，施用一种抗C35抗体一种抗EGFR抗体。在一个更具体的实施方案中，抗C35抗体是1B3或1F2或其变体或衍生物。在另一个实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在其他实施方案中，施用2种或更多种抗C35抗体和/或2种或更多种抗HER2和/或2种或更多种抗EGFR抗体。在其他实施方案中，一种或多种抗IGFR抗体与一种或多种抗C35抗体相组合进行施用。此外，在另外的实施方案中，任何前述抗体组合与治疗性试剂一起施用。在一个特别的实施方案中，治疗性试剂是化疗剂。在一个更特别的实施方案中，化疗剂是紫杉醇。在另一个更特别的实施方案中，化疗剂是阿霉素。在另一特别实施方案中，化疗剂是顺铂。在一个进一步的实施方案中，治疗性试剂是放射。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在其中施用针对特定多肽的至少2种抗体的实施方案中(例如2种抗C35、2种抗HER2、2种抗EGFR和/或2种抗IGFR抗体)，抗体可以各自与多肽内的不同表位结合。例如，对于C35，一种抗体可以与位于C35(SEQ ID NO：2)的第105-115残基内的表位结合，而另一种可以结合位于C35(SEQ ID NO：2)的第48-104残基内的表位。在一个特别的实施方案中，结合在C35的这些区域内的表位的C35抗体是1B3和1F2、或其变体或衍生物(例如人源化1B3和/或人源化1F2)。
本发明还包括施用与相同表位结合的两种抗体。例如，可以施用与位于C35(SEQ ID NO：2)的第105-115残基内的表位结合的两种不同的C35抗体。类似地，可以施用与位于C35(SEQ ID NO：2)的第48-104残基内的表位结合的两种不同的C35抗体。
在一些实施方案中，基于其与C35、HER2或EGFR多肽或其片段，或C35、HER2或EGFR变体多肽结合的能力，可以选择在本发明的方法中使用的抗体，其具有特征在于小于参照单克隆抗体的KD的解离常数(KD)的亲和力。本发明包括本文所公开的所有C35、HER2或EGFR抗体作为用于这些实施方案中的参照单克隆抗体。在具体的实施方案中，如本文以及美国申请公开号2005/0158323A1和20040063907A1(通过引用整体合并入本文)中所公开的单克隆抗体1B3和1F2为参照抗体。在另一个实施方案中，所述参照单克隆抗体为MAb163，如共同未决的美国申请号11/812,996(通过引用整体合并入本文)中公开的。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种C35抗体与C35多肽或其片段、或者C35变体多肽结合，具有特征在于小于MAb 1B3、MAb 1F2或MAb 163的KD的解离常数(KD)的亲和力。此外，在一些实施方案中，在本发明中使用的抗C35抗体结合与参照抗体相同的表位，特别是公开于美国申请公开号2005/0158323A1和20040063907A1以及美国申请号中11/812,996中的那些抗C35抗体(例如MAb 1B3、MAb 1F2或MAb 163)。
在另一特别实施方案中，抗EGFR抗体西妥昔单抗是参照抗体。因此，在一些实施方案中，一种或多种抗EGFR抗体与EGFR多肽或其片段、或者EGFR变体多肽结合，具有特征在于小于西妥昔单抗的KD的解离常数(KD)的亲和力。在另一特别实施方案中，抗HER2抗体曲妥珠单抗是参照抗体。因此，在一些实施方案中，一种或多种抗HER2抗体与HER2多肽或其片段、或者HER2变体多肽结合，具有特征在于小于曲妥珠单抗的KD的解离常数(KD)的亲和力。
在其他实施方案中，基于其与IGFR多肽或其片段，或者IGFR变体多肽结合的能力，可以选择在本发明的方法中使用的抗体，其具有特征在于小于参照单克隆抗体的KD的解离常数(KD)的亲和力，所述参照单克隆抗体与IGFR特异性结合。IGFR抗体的实例包括如美国专利号7,217,796中描述的1H3、15H12、19D12、15H12/19D12 LCA、15H12/19D12 LCB、15H12/19D12 LCC、15H12/19D12 LCD、15H12/19D12 LCE、15H12/19D12 LCF、15H12/19D12 HCA或15H12/19D12 HCB；α-IR3(Kull等人，J.Biol Chem.258：6561(1983))；1H7(Li等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.196：92-98(1993)，SantaCruz biotechnology，Inc.Santa Cruz，Calif.)和MAB391(R&D Systems；Minneapolis，Minn.)。
在一些实施方案中，本发明包括将一种抗C35抗体和一种抗HER2抗体连同或不连同另外的治疗性试剂一起施用，所述另外的治疗性试剂用于治疗过度增殖性疾病例如癌症。与C35或HER2特异性结合的任何抗体包括但不限于本文公开的那些，可以在这种方法中使用。在一些实施方案中，抗体在治疗性试剂的施用之前、之后或同时施用。在一个实施方案中，MAb 1F2或1B3与曲妥珠单抗和治疗性制剂一起施用。在一个实施方案中，治疗性试剂是选自紫杉醇、阿霉素和顺铂的化疗剂。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在一些实施方案中，本发明包括将一种抗C35抗体和一种抗EGFR抗体连同或不连同另外的治疗性试剂一起施用，所述另外的治疗性试剂用于治疗过度增殖性疾病例如癌症。与C35或EGFR特异性结合的任何抗体包括但不限于本文公开的那些，可以在这种方法中使用。在一些实施方案中，抗体在治疗性试剂的施用之前、之后或同时施用。在一个实施方案中，MAb 1F2或1B3与西妥昔单抗和治疗性制剂一起施用。在一个实施方案中，治疗性试剂是选自紫杉醇、阿霉素和顺铂的化疗剂。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在一些实施方案中，本发明包括将一种抗C35抗体和一种抗IGFR抗体连同或不连同另外的治疗性试剂一起施用，所述另外的治疗性试剂用于治疗过度增殖性疾病例如癌症。与C35或IGFR特异性结合的任何抗体包括但不限于本文公开的那些，可以在这种方法中使用。在一些实施方案中，抗体在治疗性试剂的施用之前、之后或同时施用。在一个实施方案中，MAb 1F2或1B3与西妥昔单抗和治疗性制剂一起施用。在一个实施方案中，治疗性试剂是选自紫杉醇、阿霉素和顺铂的化疗剂。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。
在一些实施方案中，上述C35/HER2或C35/EGFR联合疗法与IGFR抗体一起施用。C35/HER2/IGFR或C35/EGFR/IGFR抗体组合物可以连同或不连同治疗性试剂的施用一起施用。
在一些实施方案中，本发明包括将至少2种C35抗体和1种HER2抗体与治疗性试剂一起施用。在其他实施方案中，至少2种C35抗体和至少2种HER2抗体与治疗性试剂一起施用。可以施用C35和HER2抗体的任何组合，并且所有组合都包括在本发明中。在一些优选实施方案中，本发明包括将至少2种C35抗体和1种EGFR抗体与治疗性试剂一起施用。在其他实施方案中，至少2种C35抗体和至少2种EGFR抗体与治疗性试剂一起施用。可以施用C35和EGFR抗体的任何组合，并且所有组合都包括在本发明中。本发明中还包括的是与彼此和治疗性试剂(例如化疗剂)相组合的这些抗体中任何一种的变体(例如人源化形式、亲和力优化的形式)或衍生物的施用。本发明中还包括的是包含连同或不连同治疗性试剂的抗体组合的组合物。
在其中患有癌症的受试者为人的实施方案中，施用的抗体优选为全人的或完全人源化的。这些人源化抗体可以包括本文所公开的任何抗体的人源化形式，例如1F2和/或1B3的人源化形式。此外，包括但不限于1B3和1F2的抗体的亲和力优化形式也包括在本发明内。
本发明的方法和组合物可以用于治疗过度增殖性疾病、病症和/或病状，包括赘生物。可以通过本发明的方法治疗的过度增殖性疾病、病症和/或病状的实例包括但不限于位于以下器官中的赘生物：***、结肠、腹、骨、乳腺、消化***、肝、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头与颈、神经(中枢神经和外周神经)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸和泌尿生殖器。
此类增殖性病症的其他实例包括，但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人霍奇金病、成人霍奇金淋巴瘤、成人淋巴细胞性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、AIDS相关恶性肿瘤、***癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经***(原发性)淋巴瘤、中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、***、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞瘤、儿童霍奇金病、儿童霍奇金淋巴瘤、儿童下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成髓细胞瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、内分泌胰腺胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤及相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳腺癌、高歇病(Gaucher’s Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道肿瘤、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、多毛细胞白血病、头与颈癌、肝细胞癌、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成髓细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性隐性原发性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、骨髓发育不良综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、骨髓增生紊乱、鼻腔及鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、怀孕期非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐性原发性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、副蛋白血症、紫癜、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、原发性肝癌、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、结节病肉瘤(Sarcoidosis Sarcomas)、塞扎里(Sezary)综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚瘤和松果体瘤、T-细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、***癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom′s)巨球蛋白血症、韦氏(Wilms)肿瘤、以及位于上述器官***中除了瘤形成以外的任何其它过度增殖性疾病。
在一些具体的实施方案中，所述过度增殖性病症为选自乳腺、膀胱、肝、结肠、卵巢和皮肤的组织或器官的癌症。在一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个更具体的实施方案中，乳腺癌是导管内癌。在一些实施方案中，过度增殖性病症是上述癌症之一的转移。
可以使用本发明的方法和组合物来治疗恶化前的病状并预防发展到肿瘤或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些病症。在已知或者怀疑向赘生物或癌症发展之前的情况下，特别是在其中由增生、化生或最特别地发育不良组成的非赘生性细胞生长已经发生的情况下，适用此类用途(关于这种异常生长情况的综述，参见Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页)。
增生是受控的细胞增殖形式，涉及组织或器官中细胞数目的增加，而无结构或功能中的明显改变。可以通过本发明的方法治疗的增生病症包括但不限于，血管滤泡性纵隔***增生、血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多、非典型黑素细胞增生、基底细胞增生、良性巨***增生、牙骨质增生、先天性肾上腺增生、先天性皮脂增生、囊性增生、乳腺囊性增生、义齿性增生、导管增生、子宫内膜增生、纤维肌性增生、局灶性上皮增生、牙龈增生、炎性纤维增生、炎性***状增生、血管内***状内皮增生、***结节性增生、结节性再生性增生、假性上皮瘤样增生、老年皮脂腺增生和疣状增生。
化生是受控的细胞生长形式，其中一种类型的成体或完全分化的细胞取代了另一种类型的成体细胞。可以通过本发明的方法治疗的化生病症包括但不限于：原因不明性髓样化生、顶浆分泌腺化生、非典型化生、自体实质化生(autoparenchymatous metaplasia)、***化生、上皮化生、肠化生、化生性贫血、化生性骨化、化生性息肉、髓样化生、原发性髓样化生、继发性髓样化生、鳞状化生、羊膜的鳞状化生以及症状性髓样化生。
发育不良通常为一种癌症前兆，并且主要在上皮中发现；其为一种最混乱形式的非赘生性细胞生长，涉及个别细胞均一性和细胞组构方向的丧失。发育不良的细胞通常具有异常大的、染色深的核，并且表现出多形性。发育不良特征性地出现在其中存在慢性刺激或炎症的地方。可以通过本发明的方法治疗的发育不良病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、异侧(anterofacial)发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨骨干(craniodiaphysial)发育不良、颅腕跖骨发育不良、颅骨干骺端(craniometaphysial)发育不良、牙本质发育不良、骨干发育不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不良、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮发育不良、面-指-生殖器(faciodigitogenital)发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱褶性发育不良、纤维肌性发育不良、骨纤维性发育不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾-视网膜性发育不良(hereditary renal-retinal dysplasia)、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、***发育不良、下颌面骨发育不良、干骺端发育不良、Mondini发育不良、单骨性纤维性发育不良、粘液上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼-齿-指发育不良、眼椎骨发育不良、牙源性发育不良、眼下颌支发育不良、根尖周牙骨质发育不良、多骨纤维性发育不良、假性软骨发育不全性脊椎骺发育不良(pseudoachondroplastic spondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良、中隔-视神经发育不良、脊椎骺(spondyloepiphysial)发育不良以及ventriculoradial)发育不良。
可以通过本发明的方法和组合物治疗的其他肿瘤发生前病症包括但不限于，良性增殖障碍(dysproliferative)病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉、结肠息肉和食道发育不良)、黏膜白斑病、角化病、鲍恩氏(Bowen’s)病、慢性光化性皮炎(Farmer’s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物用于抑制癌症(特别是上文所列出的那些癌症)的生长、进展和/或转移。
在优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗、抑制癌症的生长、进展和/或转移，所述癌症特别是选自乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤的癌症。
治疗过度增殖性疾病而施用的一种或多种抗体可以任选与能够诱导细胞凋亡的试剂一起施用。细胞凋亡诱导疗法包括化疗剂(也称为抗肿瘤试剂)、放射疗法、以及放射疗法与化学疗法的组合。
在一些优选的实施方案中，治疗过度增殖性疾病(例如癌症)而施用的本发明的抗体与化疗剂一起施用。例如，本发明包括治疗癌症的方法，其包括将至少一种C35抗体和至少一种HER2抗体与治疗性试剂一起施用，以及将至少一种C35抗体和至少一种EGFR抗体与治疗性试剂一起施用。
示例性的治疗性试剂为长春花生物碱、表鬼臼毒素、蒽环类抗生素、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素、短杆菌肽D、紫杉醇(TaxolTM.，Bristol Myers Squibb)、秋水仙碱、细胞松弛素B、依米丁、美坦辛和安吖啶(或者″mAMSA″)。长春花生物碱类别在Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1277-1280页中描述。长春花生物碱的实例为长春新碱、长春碱和长春地辛。表鬼臼毒素类别在Goodman和Gilman的ThePharmacological Basis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1280-1281页中描述。表鬼臼毒素的实例为依托泊苷、依托泊苷邻醌和替尼泊苷。蒽环类抗生素类别在Goodman和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1283-1285页中描述。蒽环类抗生素的实例为柔红霉素、多柔比星、米托蒽醌和比生群(bisanthrene)。放线菌素D，还称为更生霉素，在Goodmand和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1281-1283页中描述。普卡霉素，还称为光神霉素，在Goodmand和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(第7版)，(1985)，第1287-1288页中描述。其他化疗剂包括顺铂(PlatinolTM.，Bristol Myers Squibb)、卡铂(ParaplatinTM.，BristolMyers Squibb)、丝裂霉素(MutamycinTM.，Bristol Myers Squibb)、六甲蜜胺(HexalenTM，U.S.Bioscience，Inc.)、环磷酰胺(CytoxanTM，Bristol Myers Squibb)、洛莫司汀(CCNU)(CeeNUTM Bristol MyersSquibb)、卡莫司汀(BCNU)(BiCNUTM，Bristol Myers Squibb)。
示例性的化疗剂还包括阿克拉霉素A、阿柔比星、阿克罗宁、山油柑碱、亚德里亚霉素(adriamycin)、阿地白介素(白细胞介素-2)、六甲蜜胺(hexamiethylmelamine)、氨鲁米特、氨鲁米特(cytadren)、氨基咪唑甲酰胺、安吖啶(m-AMSA；胺苯吖啶)、阿那曲唑(anastrazole)(瑞宁得)、环胞苷、anthracyline、安曲霉素、天冬酰胺酶(优适宝)、阿扎胞苷、阿扎胞苷(拉达卡霉素)、氮鸟嘌呤、重氮丝氨酸、阿扎尿苷、1，1′，1″-噻替派(phosphinothioylidynetrisaziridine)、azirino(2′，3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、BCG(theracys)、BCNU、BCNU氯乙基亚硝基脲、苯甲酰胺、4-(双(2-氯乙基)氨基)苯丁酸、比卡鲁胺、二氯乙基亚硝基脲、博来霉素、博来霉素(blenozane)、博来霉素类、溴脱氧尿苷、溴尿苷、白消安(马利兰)、氨基甲酸乙酯、卡铂、卡铂(伯尔定)、卡莫司汀、卡莫司汀(BCNU；BiCNU)、苯丁酸氮芥(瘤可宁)、氯乙基亚硝基脲、氯脲菌素(chorozotocin)(DCNU)、色霉素A3、顺式视黄酸、顺铂(cis-ddpl；顺氯氨铂)、克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷；2cda；克拉立平)、助间型霉素、环亮氨酸、环磷酰胺、无水环磷酰胺、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、阿糖胞苷、阿糖胞苷HCl(cytosar-u)、2-脱氧-2-(((甲基亚硝胺)羰基)氨基)-D-葡萄糖、达卡巴嗪、放线菌素D(cosmegen)、柔红霉素、柔红霉素HCl(红比霉素)、氮烯咪胺、氮烯咪胺(DTIC-dome)、秋水仙胺、***、二去水卫矛醇、重氮亮氨酸、己烯雌酚、多西他赛(泰索帝)、亚德利亚霉素HCl(阿霉素)、盐酸多柔比星、依洛尼塞、雌莫司汀、雌莫司汀磷酸钠(emcyt)、乙碘油、依托格鲁、氨基甲酸乙酯、甲基磺酸乙酯、依托泊苷(VP16-213)、味甲酰酚胺、氟尿苷、氟尿苷(fudr)、氟他拉滨(福达华)、氟尿嘧啶(5-FU)、氟***(halotestin)、氟他胺、氟他米特(氟他胺)、氟尿苷(fluxuridine)、硝酸镓(花岗岩)、吉西他滨(健择)、染料木黄酮、2-脱氧-2-(3-甲基-3-nitrosoureido)-D-吡喃葡萄糖、戈舍瑞林(诺雷德)、己烷雌酚、羟基脲(hydra)、伊达比星(idamycin)、ifosfagemcitabine、异环磷酰胺(丁福明)、异环磷酰胺和美司钠(MAID)、干扰素、干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n3、白细胞介素-2、碘苄胍、碘苄胍碘苄胍、依立替康(camptosar)、异维甲酸(accutane)、酮康唑、4-(二(2-氯乙基)氨基)-L-苯丙氨酸、L-丝氨酸重氮基乙酸酯、香菇多糖、甲酰四氢叶酸、乙酸亮丙瑞林(LHRH-类似物)、左旋咪唑(ergamisol)、洛莫司汀(CCNU；cee-NU)、甘露莫司汀、美坦辛、氮芥、氮芥HCl(氮芥)、乙酸甲羟孕酮(普维拉、狄波普维拉)、乙酸甲地孕酮(menace)、乙酸美仑孕酮、美法仑(爱克兰)、美诺立尔、巯嘌呤、巯嘌呤(巯基嘌呤)、无水巯嘌呤、MESNA、美司钠(mesne)、甲磺酸乙酯、氨甲喋呤(mtx；氨甲喋呤)、赛氮芥、含羞草碱、米索硝唑、光辉霉素、米托蒽醌、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素(突变霉素)、丝裂霉素C、米托坦(o，p′-DDD；lysodren)、米托蒽醌、米托蒽醌HCl(诺消灵)、莫哌达醇、N，N-双(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-氧氮杂膦-2-胺-2-氧化物、N-(1-甲基乙基)-4-((2-甲基肼基)甲基)苯甲酰胺、N-甲基-双(2-氯乙基)胺、尼卡地平、尼鲁米特(nilandron)、尼莫司汀、硝氨丙吖啶、氮芥、诺考达唑、诺拉霉素、奥曲肽(善得宁)、紫杉醇(泰素)、紫杉醇、密旋霉素、培门冬酶(PEGx-1)、喷司他丁(2′-脱氧助间型霉素)、培洛霉素、苯丙氨酸芥肽、光泳(photophoresis)、普卡霉素(mithracin)、溶链菌制剂、哌泊溴烷、普卡霉素、普达非洛、鬼臼毒素、泊非霉素、***、丙卡巴肼、丙卡巴肼HCl(甲苯肼)、螺丙醇、嘌呤霉素、氨基核苷嘌呤霉素、PUVA(补骨脂素+紫外线a)、吡喃共聚物、雷帕霉素、s-氮胞苷、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-三嗪、司莫司汀、焦土霉素、西罗莫司、链脲霉素(链佐星)、舒拉明、柠檬酸他莫昔芬(诺瓦得士)、taxon、喃氟啶、替尼泊苷(VM-26；威猛)、替奴佐酸、TEPA、睾内酯、噻替哌、硫鸟嘌呤、噻替哌(thioplex)、替洛隆、拓扑替康、维甲酸(vesanoid)、三亚胺醌、木霉素、环氧甘醚、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、曲美沙特(三甲曲沙)、三(1-氮丙啶基)氧化膦、三(1-氮丙啶基)硫化膦、三(氮丙啶基)-对-苯醌、三(氮丙啶基)硫化膦、尿嘧啶氮芥、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、长春碱、硫酸长春碱(velban)、硫酸长春新碱(安可平)、长春地辛、长春瑞滨、酒石酸长春瑞滨(诺维本)、(1)-含羞草碱、1-(2-氯乙基)-3-(4-甲基环己基)-1-亚硝基脲、(8S-顺式)-10-((3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-己吡喃基)氧)-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘并萘二酮、131-间碘苄胍(I-131 MIBG)、5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-1H-咪唑-4-甲酰胺、5-(二(2-氯乙基)氨基)-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮、2，4，6-三(1-氮丙啶基)-s-噻嗪、2，3，5-三(1-氮丙啶基)-2，5-环己二烯-1，4-二酮、2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺、N，N-二(2-氯乙基)四氢-2H-1，3，2-氧氮杂膦-2-胺-2-氧化物、3-去氮杂尿苷、3-碘代苄基胍、5，12-萘并萘二酮、5-氮胞苷、5-氟尿嘧啶、(1aS，8S，8aR，8bS)-6-氨基-8-(((氨基羰基)氧)甲基)-1，1a，2，8，8a，8b-六氢-8a-甲氧基-5-甲基azirino(2′，3′：3，4)吡咯并(1，2-a)吲哚-4，7-二酮、6-阿扎尿苷、6-巯嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤及其组合。
在具体的实施方案中，在本发明的方法中使用的化疗剂为紫杉醇。在另一具体的实施方案中，在本发明的方法中使用的化疗剂为阿霉素。
优选的治疗性试剂及其组合可以作为细胞凋亡的诱导疗法进行施用，所述细胞凋亡的诱导疗法包括多柔比星和多西他赛、拓扑替康、紫杉醇(泰素)、卡铂和泰素、顺铂和放射、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-FU和放射、泰素帝(Toxotere)、氟达拉滨、Ara C、依托泊苷、长春新碱和长春碱。在一个实施方案中，治疗性试剂是顺铂。
可以在本发明的方法中施用的化学剂包括但不限于，抗生素衍生物(例如，多柔比星、博来霉素、柔红霉素和更生霉素)；抗***药(例如，他莫昔芬)；抗代谢药(例如，氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、普卡霉素、巯嘌呤和6-硫鸟嘌呤)；细胞毒素剂(例如，卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、胞嘧啶阿糖核苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如，甲羟孕酮、磷雌氮芥、乙炔基***、***、乙酸甲地孕酮、***、二乙基己烯雌酚双磷酸酯、氯烯雌醚和睾内酯)；氮芥衍生物(例如，美法仑、苯丁酸氮芥(氮芥)和噻替哌)；类固醇和组合(例如，倍他米松磷酸钠)；和其它(例如，达卡巴嗪、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱和依托泊苷)。
在具体的实施方案中，本发明的抗体与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***)或者与CHOP组分的任何组合相组合施用。
表2：用于主要癌症适应症的通常使用的化疗药品
在一些实施方案中，本发明的方法涉及施用至少一种C35抗体和至少一种HER2抗体及治疗性放射。在其他实施方案中，该方法涉及施用至少一种C35抗体和至少一种EGFR抗体及治疗性放射。任选地，这些方法还可以包括施用化疗剂。例如，在一些实施方案中，本发明可以包括将至少一种C35抗体和至少一种HER2抗体与化疗剂或治疗性放射一起施用。在其他实施方案中，本发明可以包括将至少一种C35抗体和至少一种EGFR抗体与化疗剂或治疗性放射一起施用。
治疗性放射包括例如分割放射疗法、非分割放射疗法、超分割放射疗法、以及组合放射和化学疗法。放射的类型还包括电离(γ)放射、粒子放射、低能透射(LET)、高能透射(HET)、紫外线放射、红外线放射、可见光放射以及光敏放射。如本文所用，化学疗法包括使用单一化疗剂、或者试剂的组合的治疗。在需要治疗的受试者中，化学治疗可以与手术治疗或放射疗法，或者与其他抗肿瘤治疗形式相组合。
在进一步的实施方案中，将本发明的抗体或其组合与抗病毒试剂组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的抗病毒试剂包括但不限于，阿昔洛韦、病毒唑、金刚烷胺和金刚烷乙胺(remantidine)。
本发明的抗体或其组合还可以与止吐剂及其组合一起施用，所述止吐剂例如2-(乙基硫代)-10-(3-(4-甲基-1-哌嗪基)丙基)-10H-吩噻嗪(乙基硫代培拉嗪)、1-(对-氯-α-苯基苄基)-4-(间-甲基苄基)-哌嗪(美克洛嗪，氯苯甲嗪)等等。本发明的多核苷酸和多肽还可以与本文公开或者本领域已知的其他治疗剂及其组合一起施用。
可以与本发明的抗体或其组合相组合施用的常规的非特异性免疫抑制剂包括但不限于，类固醇、环孢霉素、环孢霉素类似物、环磷酰胺、甲***、***、硫唑嘌呤、FK-506、15-去氧精胍啉(15-deoxyspergualin)和通过抑制响应T细胞的功能来起作用的其他免疫抑制试剂。
在具体的实施方案中，本发明的抗体或其组合与免疫抑制剂相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的免疫抑制剂制剂包括但不限于，ORTHOCLONETM(OKT3)、SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYATM(环胞菌素)、PROGRAFTM(他克莫司)、CELLCEPTTM(麦考酚酯)、硫唑嘌呤、糖皮质激素和RAPAMUNETM(西罗莫司)。在具体的实施方案中，免疫抑制剂可以用于预防器官或者骨髓移植的排斥。
在其他的实施方案中，本发明的抗体可以单独施用，或者与一种或多种静脉内免疫球蛋白制剂相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的静脉内免疫球蛋白剂包括但不限于，GAMMARTM、IVEEGAMTM、SANDOGLOBULINTM、GAMMAGARD S/DTM和GAMIMUNETM。在具体的实施方案中，在移植疗法(例如骨髓移植)中，本发明的抗体与静脉内免疫球蛋白制剂相组合施用。
在其他的实施方案中，本发明的抗体单独施用或者与消炎剂相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的消炎剂包括但不限于，糖皮质激素和非类固醇消炎剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪甲酰胺、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。
在其他的实施方案中，本发明的抗体与细胞因子相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的细胞因子包括但不限于，IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12、IL13、IL15、抗CD40、CD40L、IFN-γ和TNF-α。在另一个实施方案中，本发明的抗体可以与任何白细胞介素一起施用，所述白细胞介素包括但不限于，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。
在其他的实施方案中，本发明的抗体与血管生成蛋白质相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的血管生成蛋白质包括但不限于，神经胶质瘤衍生的生长因子(GDGF)，如欧洲专利号EP-399816中所公开的；血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)，如欧洲专利号EP-6821 10中所公开的；血小板衍生的生长因子-B(PDGF-B)，如欧洲专利号EP-282317中所公开的；胎盘生长因子(PIGF)，如国际公开号WO 92/06194中所公开的；胎盘生长因子-2(PIGF-2)，如Hauser等人Growth Factors，4：259-268(1993)中所公开的；血管内皮生长因子(VEGF)，如国际公开号WO 90/13649中所公开的；血管内皮生长因子-A(VEGF-A)，如欧洲专利号EP-506477中所公开的；血管内皮生长因子-2(VEGF-2)，如国际公开号WO 96/39515中所公开的；血管内皮生长因子B(VEGF-3)；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)，如国际公开号WO 96/26736中所公开的；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际公开号WO 98/02543中所公开的；血管内皮生长因子-D(VEGF-D)，如国际公开号WO 98/07832中所公开的；以及血管内皮生长因子-E(VEGF-E)，如德国专利号DE19639601中所公开的。上述提及的文献通过引用合并入本文。
在其他的实施方案中，本发明的抗体与造血生长因子相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的造血生长因子包括但不限于，LEUKINETM(SARGRAMOSTIMTM)和NEUPOGENTM(FILGRASTIMTM)。
在其他的实施方案中，本发明的抗体与成纤维细胞生长因子相组合施用。可以与本发明的抗体一起施用的成纤维细胞生长因子包括但不限于，FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14和FGF-15。
施用时间
本文所述的任何细胞凋亡诱导疗法都可以在本发明的一种或多种抗C35抗体之前、同时或之后施用。在一个具体实施方案中，细胞凋亡诱导试剂是选自抗HER2抗体、抗EGFR抗体和抗IGFR抗体的抗体。在一些实施方案中，抗C35抗体和一种或多种细胞凋亡诱导抗体同时施用。例如，抗C35抗体与抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体同时施用。在其他的实施方案中，抗体分开施用。例如，抗HER2抗体可以在某一时间施用，然后抗C35抗体可以在同一天稍后施用或者在第一种抗体施用当天之后一天或多天施用。同样地，抗EGFR抗体可以在某一时间施用，然后抗C35抗体可以在同一天稍后施用或者在第一种抗体施用当天之后一天或多天施用。同样地，抗IGFR抗体可以在某一时间施用，然后抗C35抗体可以在同一天稍后施用或者在第一种抗体施用当天之后一天或多天施用。抗C35抗体可以在不施用其他抗体(例如，抗HER2、抗EGFR或抗IGFR)的那一天施用，例如在施用抗HER2抗体、抗EGR抗体或抗IGFR抗体中的至少一种或其组合之前的某一天，或者在施用抗HER2抗体、抗EGR抗体或抗IGFR抗体中的至少一种或其组合之后的某一天。
在其他实施方案中，多种抗体(例如，抗C35抗体和抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)的施用可以在化疗剂的施用之前、之后或同时发生，所述化疗剂例如紫杉醇(TaxolTM)、阿霉素、顺铂、本文描述的任何其他试剂。例如，一种或两种或多种抗体可以与紫杉醇、阿霉素、顺铂或其他试剂在同一时间施用或在同一天施用。备选地，紫杉醇、阿霉素、顺铂或其他试剂可以在不施用抗体的那一天施用，例如在施用至少一种抗体之前的某一天或者在施用至少一种抗体之后的某一天。
在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在施用至少一种抗C35抗体之前施用。例如，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在给需要治疗的受试者施用至少一种抗体之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时施用。在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在施用本发明的至少一种抗C35抗体之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。在特别的实施方案中，细胞凋亡诱导疗法是抗体，特别是抗HER2抗体、抗EGFR抗体或抗IGFR抗体。在一个具体实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。在另一具体实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在其他实施方案中，细胞凋亡诱导试剂是化疗剂，例如紫杉醇或阿霉素或顺铂。
在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在施用至少一种抗C35抗体之后施用。例如，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在给需要治疗的受试者施用至少一种抗C35抗体之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时施用。在一些实施方案中，细胞凋亡诱导试剂(例如，抗HER2抗体和/或抗EGFR抗体和/或抗IGFR抗体)可以在施用本发明的至少一种抗C35抗体之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用。在特别的实施方案中，细胞凋亡诱导疗法是抗体，特别是抗HER2抗体、抗EGFR抗体或抗IGFR抗体。在一个具体实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗。在另一具体实施方案中，抗EGFR抗体是西妥昔单抗。在其他实施方案中，细胞凋亡诱导试剂是化疗剂，例如紫杉醇或阿霉素或顺铂。
在一个实施方案中，在治疗过程中，抗体以一周的时间间隔进行施用。在具体的实施方案中，在治疗过程中，抗体每周施用一次，共两周。在更具体的实施方案中，在治疗过程的前两周过程中，抗体每周施用一次。在一些实施方案中，在治疗过程中，抗体每周施用一次、两次或三次。在具体的实施方案中，在治疗过程中，抗体每周施用两次。
在一个实施方案中，抗体每周施用两次。在另一个实施方案中，治疗性试剂(例如化疗剂，例如紫杉醇、阿霉素或顺铂)每周施用一次。在一个实施方案中，治疗性试剂在治疗的第一天时施用，并且治疗性试剂的第二个剂量在一周后施用，而抗体的组合每周施用两次。
在具体的实施方案中，治疗过程可以持续一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月或一年。治疗过程的持续时间将取决于癌症的类型、所使用的抗体、化疗剂、患者的年龄等。这些参数可以由本领域的技术人员确定。
治疗活性的证明
在人中使用前，本发明的方法和抗体可以在体外进行测试，然后在体内针对所需治疗性或预防性活性进行测试。例如，用于证明化合物或药物组合物的治疗性或预防性效用的体外测定法包括化合物对细胞系或患者组织样品的作用。可以采用本领域技术人员已知的技术(包括但不限于细胞增殖测定法和细胞裂解测定法)来测定化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的作用。根据本发明，可以用于确定施用特定的化合物是否适用的体外测定法包括体外细胞培养测定法，其中使患者组织样品在培养基中生长，并且暴露于化合物或以其他方式施用化合物，并观察这种化合物对组织样品的作用。
试剂盒
本发明提供了可以在上述方法中使用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含至少一种C35和至少一种HER2抗体或至少一种EGFR抗体或至少一种IGFR抗体，优选地一种或多种经纯化的抗体。
Ⅷ.药物组合物和施用方法
制备本发明的一种或多种抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，并且将其施用于有此需要的受试者的方法是本领域技术人员所公知的，或可以容易地确定的。抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的施用途径可以为例如经口、肠胃外、通过吸入或局部。如本文所用，术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或***施用。虽然所有这些施用形式都被清楚地包括在本发明的范围内，但是用于施用的形式将是用于注射，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。但是，在与本文的教导相容的其他方法中，可以将本发明的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物直接递送至有害细胞群体的部位，从而增加患病组织对治疗性试剂的暴露。
如上文所讨论的，至少一种C35抗体和至少一种抗HER2抗体或至少一种抗EGFR抗体或至少一种抗IGFR抗体，或者其抗原结合片段、变体或衍生物，可以以药学有效量施用，用于过度增殖性疾病例如癌症且特别地乳腺癌的体内治疗。
就这一点而言，应该理解的是所公开的抗体将这样进行配制，从而使得有助于施用且促进活性剂的稳定。优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的、无毒、无菌载体，例如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等。就本申请的目的而言，缀合的或非缀合的抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量是指这样的量，其足以达到与靶的有效结合且获得益处(例如缓解疾病或病症的症状)或检测物质或细胞。
在一个实施方案中，完整抗体剂量在单次推注中提供。备选地，所述剂量可以通过多次施用例如延长输注方法来提供，或者通过经过数小时或数天的跨度(例如约2至约4天的跨度)施用的反复注射来提供。
在一些实施方案中，至少一种抗C35抗体和至少一种抗HER2抗体或抗EGFR抗体或抗IGFR抗体在同一个的药物制剂中一起施用。在其他的实施方案中，所述抗体作为分开的药物制剂同时或顺次施用。
当化合物包括核酸或免疫球蛋白时，可以采用的制剂和施用方法在上文描述；另外的合适的制剂和施用途径可以选自本文在下文描述的那些。
多种递送***是已知的并且可以用于施用本发明的化合物，例如，封装在脂质体中、微粒、微囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，和作为逆转录病毒或其他载体的部分构建核酸等等。引入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。可以通过常规途径施用化合物或组合物，例如，通过输注或者推注注射，通过经过上皮或皮肤粘膜衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，可能希望通过任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物引入中枢神经***内，所述途径包括心室内和鞘内注射；通过例如与储库例如Ommaya贮库附着的心室内导管可以促进心室内注射。例如，通过使用吸入器或者喷雾器和具有雾化剂的制剂，也可以采用经肺施用。
在特定实施方案中，希望对需要治疗的部位局部施用本发明的药物化合物或组合物；这可以通过例如但不限于，在手术期间的局部输注、例如与手术后伤口敷料结合的局部应用、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或胶状材料，包括膜，例如sialastic膜或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质包括抗体时，必须小心使用蛋白质与之不吸附的材料。
在另一实施方案中，化合物或组合物可以在囊泡特别是脂质体中递送(参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等人，in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同前，第317-327页；一般参见前文)。
在另外一个实施方案中，所述化合物或组合物可以在控释***中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery88：507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRCPres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；还参见Levy等人，Science 228：190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71：105(1989))。在另外一个实施方案中，可以将控释***放置于治疗靶(即，大脑)的附近，因而仅需要***剂量的一部分(例如参见Goodson，in Medical Applications of ControlledRelease，同上，第2卷，第115-138页(1984))。其他控释***在由Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))中讨论。
本发明还提供了药物组合物。这种药物组合物包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准或者是在美国药典或其他普遍公认的药典中列出用于在动物更特别地人中使用。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以为无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。特别就可注射的溶液而言，还可以使用生理盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作为液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。需要时，所述组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂、或者pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。所述组合物可以与常规的粘合剂和载体例如甘油三酯一起配制成栓剂。经口制剂可以包括标准的载体，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中描述。这种组合物包含治疗有效量的所述化合物(优选为纯化形式)连同合适量的载体，以便提供用于适当施用于患者的形式。所述制剂应适合施用方式。
在优选的实施方案中，根据常规操作将组合物配制成适合于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物为无菌等渗水性缓冲液中的溶液。需要时，所述组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)，以减轻注射部位处的疼痛。通常，所述成分分开提供或以单位剂型混合在一起，例如作为在指示活性剂的量的紧密密封容器(例如安瓿或药囊)中的冻干粉剂或无水浓缩物。当通过输注来施用组合物时，可以将该组合物分散于包含无菌药物等级的水或盐水的输注瓶中。当通过注射来施用组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，从而使得所述成分可以在施用前相混合。
本发明的化合物可以被配制成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的那些(例如由盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生而来的那些)、以及由阳离子形成的那些(例如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生而来的那些)。
可以通过标准的临床技术来确定本发明化合物的量，其有效治疗、抑制和预防与本发明多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症。此外，可以任选采用体外测定法，以帮助鉴定最佳的剂量范围。制剂中待使用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和各个患者的情况来决定。可以根据由体外或动物模型测试***衍生的剂量-应答曲线来推断有效剂量。在一个实例中，化疗剂的最高耐受剂量和分别的化疗方案的确定在美国专利申请号2005/0158323A1(通过引用合并入本文)中描述。
就抗体而言，给患者施用的剂量通常为约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重。优选地，给患者施用的剂量为约0.1mg/kg至约20mg/kg患者体重，更优选约1mg/kg至约10mg/kg患者体重。在一些实施方案中，以约10mg/kg至约50mg/kg患者体重的总剂量来施用抗体。在另一个实施方案中，以约20mg/kg至约40mg/kg患者体重的总剂量来施用抗体。通常，由于对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内具有比来自其他物种的抗体更长的半衰期。因此，较低剂量的人抗体和较不频繁的施用通常是可能的。此外，通过修饰(例如脂化)来增强抗体的摄取和组织渗透，可以减少本发明抗体的施用剂量和频率。
如上文所讨论的，本发明还提供了包含一个或多个容器的药物包装或试剂盒，所述容器填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分。例如，所述药物包装或试剂盒可以包含抗体制剂，该抗体制剂包含两种或更多种抗体(例如，至少一种抗C35抗体和至少一种抗HER2抗体、或至少一种抗EGFR抗体、或至少一种抗IGFR抗体)、以及化疗剂例如紫杉醇或阿霉素。在一些实施方案中，抗体在相同的容器中。在其他的实施方案中，抗体在分开的容器中。在一些实施方案中，化疗剂与抗体制剂在相同的容器中。在其他的实施方案中，化疗剂在分开的容器中。与此类一个或多个容器任选结合的可以是由管理药物或生物产品的制造、使用或出售的政府机构所规定的形式的注意事项，所述注意事项反映由制造、使用或出售机构批准用于人施用。
采用本领域技术人员已知的常规的免疫组织学方法，抗体可以用于测定生物样品中由本发明的多核苷酸编码的多肽的水平(例如参见Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.101：976-985(1985)；Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.105：3087-3096(1987))。用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA)。合适的抗体测试法标记是本领域已知的，并且包括酶标记，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113In、112In、111In)、和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、88Re、142Pr、105Rh、97Ru；发光标记，例如鲁米诺；以及荧光标记，例如荧光素和罗丹明和生物素。
除了测定生物样品中本发明多肽的水平以外，蛋白质还可以通过成像在体内进行检测。用于蛋白质体内成像的抗体标记或标记物包括可通过X-放射显影法、NMR或ESR检测的那些。对于X-放射显影法，合适的标记包括放射性同位素例如钡或铯，所述放射性同位素发射可检测的放射，但是不会对受试者造成明显的伤害。对于NMR和ESR合适的标记物包括具有可检测的特征性自旋的那些(例如氘)，可以通过标记用于相关杂交瘤的营养物来将所述合适的标记物掺入所述抗体内。
将已经用合适的可检测成像部分标记的蛋白质特异性抗体或抗体片段引入(例如肠胃外、皮下或腹膜内)到待检查免疫***病症的哺乳动物内，所述合适的可检测的成像部分例如放射性同位素(例如131I、112In、99mTc、(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F、153Sm、177Lu、59Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru))、不透射线的物质或可通过核磁共振检测的物质。本领域应该理解的是，受试者的身体大小和所采用的成像***决定了产生诊断图像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情况，对于人受试者，所注入的放射性的量通常为约5至20毫居里的99mTc。然后，经标记的抗体或抗体片段在表达由本发明的多核苷酸编码的多肽的细胞位置处优先积累。体内肿瘤成像在S.W.Burchiel等人的″Immunopharmacokinetics of RadiolabeledAntibodies and Their Fragments″(Tumor Imaging中的第13章：TheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，编辑，Masson Publishing Inc.(1982))中描述。
本领域已知的技术可以应用于标记本发明的多肽(包括抗体)。此类技术包括但不限于，双功能缀合剂的使用(例如参见美国专利序号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560和5,808,003，所述专利各自的内容在此通过引用整体合并入本文)。
除非另有说明，否则本发明的实践使用了细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中都有充分的说明。例如参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook等人，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，编辑，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning，D.N.Glover编辑，第I和II卷(1985)；OligonucleotideSynthesis，M.J.Gait编辑，(1984)；Mullis等人美国专利号：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription And Translation，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene TransferVectors For Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos编辑，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology，Mayer和Walker，编辑，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，(1986)；Manipulating the MouseEmbryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；以及Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
抗体工程的主要原理在Antibody Engineering，第2版，C.A.K.Borrebaeck，编辑，Oxford Univ.Press(1995)中阐述。蛋白质工程的主要原理在Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，等人，编辑，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)中阐述。抗体以及抗体-半抗原的结合的主要原理在Nisonoff，A.，Molecular Immunology，第2版，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；以及Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure andFunction，Chapman and Hall，New York，NY(1984)中阐述。此外，本领域已知的并且未特别描述的标准的免疫学方法通常可以根据Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Stites等人(编辑)，Basic and Clinical- Immunology(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(编辑)，Selected Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman andCo.，New York(1980)。
阐述免疫学的主要原理的标准的文献著作包括Current Protocolsin Immunology，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley& Sons，New York(1982)；Kennett，R.，等人，编辑，MonoclonalAntibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，″Monoclonal AntibodyTechnology″in Burden，R.，等人，编辑，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第13卷，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunnology第4版编辑Richard A.Goldsby，ThomasJ.Kindt和Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，I.，Brostoff，J.和Male D.，Immunology第6版London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和Lichtman，A.，Cellular and MolecularImmunology第5版，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer ColdSpring Harbor Press(2003)。
上文所引用的所有文献、以及现在和下文中所引用的所有文献均通过引用整体合并入本文。
实施例
实施例1
EGFR和HER2在C35阳性乳腺肿瘤中的表达
分析了在C35阳性乳腺肿瘤中的EGFR和HER2表达谱。通常，所有HER2阳性肿瘤也是C35阳性的。然而，并非所有C35阳性肿瘤都是HER2阳性的。为了更好地理解C35阳性肿瘤的临床谱，表3中显示了通过免疫组织学得分的C35hi表达与HER2过表达(HER2hi肿瘤)和EGFR表达之间的关系。C35hi肿瘤定义为得分2+或3+。
肿瘤样品
肿瘤样品衍生自诊断有乳腺癌的患者，所述患者具有腋窝手术且无辅助疗法，并且在病理学上是***阴性的。从代表性肿瘤区域中取出乳腺癌组织的三个0.6mm2核心。这些核心用于构建一式三份地组织微阵列。
免疫组织化学
用亲和纯化的兔多克隆抗体78.2以0.42μg/ml检测C35。使用柠檬酸钠缓冲液(18μM柠檬酸、82μM柠檬酸钠，pH 6.0)执行抗原修复。用兔多克隆抗体(Dako，Carpinteria，CA)以1∶50稀释度检测细胞角蛋白5/6(CK5/6)。使用Tris/EDTA缓冲液(1mM EDTA、10mMTris-HCl Base，pH 8.0)执行抗原修复。
使用小鼠抗体(31G7克隆，Invitrogen，Carlsbad，CA)由在37℃下10分钟的抗原修复(0.1％胰蛋白酶、0.1％氯化钙)检测EGFR。根据制造商的说明书，使用REAL EnVision小鼠/兔试剂盒(Dako)执行关于C35和EGFR的标准免疫组织化学方案。
根据制造商的说明书，使用HercepTest(Dako)执行HER2免疫组织化学；其中抗原修复在96℃下40分钟。染色在Autostainer(Dako)上执行。
通过费氏(Fisher)精确双尾检验的统计分析显示在C35hi组内，EGFR表达在HER2hi亚组和HER2-/low亚组之间明显不同：p＝0.0048。
三十(30)种C35阳性肿瘤就Her2/neu和EGFR的表达进行评分。30种肿瘤中的七(7)种是C35+/Her2+/EGFR-，17/30是C35+/Her2-/EGFR+，3/30是C35+/Her2+/EGFR+，并且3/30是C35+/Her2-/EGFR-。90％的C35阳性肿瘤对于HER2或EGFR是阳性的。
表3.在HER2hi和HER2-/low肿瘤组织样品中的EGFR表达
                       EGFR-              EGFR+
HER2-/low              3                  17
HER2hi                 7                  3
上表3中显示的结果举例说明，当与第二种转化基因相结合时，C35转化活性是最大的。
实施例2
用于治疗癌症的C35和HER2抗体的组合
如图1和2中举例说明以及这个实施例中描述的，测试了涉及施用抗C35抗体和抗HER2抗体的治疗癌症的方法。这个实施例显示与曲妥珠单抗相组合的抗C35小鼠单克隆抗体1F2和1B3在天然地Her2+/C35+人乳腺癌异种移植物模型BT474-MD中的效应。
1F2和1B3抗体的产生
使用72小时原种培养，以2.0x105细胞/ml接种总共3.5L CD杂交瘤。培养物在3L烧瓶中以700ml/烧瓶分开。将烧瓶置于37℃下以90-120rpm振荡的7％CO2温箱中7天，而不添加任何补料培养基。在第7天时，从每个烧瓶中取出样品用于在收获前的细胞计数。计数通过台盼蓝排除来进行。所有3.5L细胞培养物通过在3200rpm(2100xg)下离心得到澄清。经澄清的条件培养基使用0.22μm过滤装置进行过滤灭菌。在纯化期间，将经澄清/经过滤的上清液贮存于4℃过夜。
对于抗体1B3，每周收获上清液，约10-12ml/收获/实验室。抗体批次由前6次连续收获组成。
抗体纯化
上清液中的抗体与Gammabind G(GE Healthcare)柱结合。所结合的抗体在包含1M NaCl的PBS，pH 7.2中洗涤，以减少内毒素。经洗涤的抗体用0.1M甘氨酸，pH 2.7洗脱到包含1∶5体积1M Tris，pH8.0的馏分内。包含经洗脱的抗体的馏分使用G25 PD10柱(GEHealthcare)进行缓冲液更换。将经缓冲液更换的抗体合并，并且使用Centricon Plus-70超滤(Millipore，30kDA MWCO)浓缩至7.5mg/mL。使经浓缩的抗体流过阴离子交换Mustang Q(Pall)膜。收集包含抗体的流出物。这种最终配制的抗体使用0.2um注射器式滤器(Pall)在生物安全橱中进行无菌过滤。蛋白质浓度通过A280使用Nanodrop分光光度计进行测定。
细胞培养
天然地C35+/HER2+人乳腺肿瘤BT474-MD细胞系是经来自JoseBaselga的许可转让的，在MD Anderson的Ronald Bast的友情赠予。细胞系的历史：BT474得自ATCC Jose Baselga的实验室中，在其中它在小鼠中传代，并且进行先体外后体内培养，以产生能够在体内一致地形成肿瘤的系。细胞系通过有限稀释进行亚克隆，并且鉴定在体内具有有利的生长动力学和成活率的克隆。将细胞系命名为BT474-MD，并且在达尔贝科改良伊格尔培养基(Invitrogen)中进行培养，并且进行调整以包含10％胎牛血清。在用于移植的制剂中，细胞用胰蛋白酶-EDTA解离，在PBS中洗涤并且重悬浮于108/ml的体积中。
动物
4周大的Swiss裸鼠购自Taconic Farms。动物在无特定病原体、隔离设施条件下饲养。所有实验在University Committee on AnimalResources批准的方案下执行。
诱导细胞凋亡的药品
在所提供的媒介物中将抗HER2抗体曲妥珠单抗(
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Genentech)稀释至21mg/ml。曲妥珠单抗的最终剂量是10或100μg/剂量(～0.5或5mg/kg)，经由静脉内注射每周施用两次，共3周的持续时间，在移植后第12天时开始。
移植和处理
将10,000,000 C35阳性BT474-MD肿瘤细胞皮下植入4周大的Swiss裸鼠的***脂肪垫中。在移植前24小时，将90天释放***丸植入每个动物中。6至9只小鼠的组各自接受下述处理之一：
1.无处理(对照组)。
2.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射在第12天时开始，并且持续每周两次，共3周。
3.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射连同800μg/i.v.注射(40mg/kg)的1F2鼠类单克隆抗体在第12天时开始，并且持续每周两次，共3周。
4.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射连同800μg/i.v.注射(40mg/kg)的1B3鼠类单克隆抗体在第12天时开始，并且持续每周两次，共3周。
在移植后的各个时间点测量平均小鼠肿瘤体积(图1)。在每个肿瘤上用游标卡尺获得2个尺寸；肿瘤体积使用式(长度x宽度2)/2进行计算。对于每个肿瘤，肿瘤体积中的改变百分比计算为(第X天的肿瘤体积/第11天的肿瘤体积)x100。如图1中所示，不含1F2或1B3抗C35抗体以所示剂量单独施用的曲妥珠单抗(IgG)在抑制小鼠中的肿瘤生长方面不如与抗C35抗体相组合施用的曲妥珠单抗有效。与曲妥珠单抗相组合的、测试的2种鼠类抗C35抗体1F2和1B3各自使C35阳性肿瘤在体内的生长抑制约5倍。此外，这些经组合处理的小鼠也显示出肿瘤消退中的延迟(图2)。因此，抗C35抗体与抗HER2抗体的组合在减少肿瘤生长中具有显著效应。
实施例3
在抗HER2抗体处理后C35易位的诱导和评分
如图3中举例说明和这个实施例中描述的，显示抗HER2抗体曲妥珠单抗使C35蛋白质易位至细胞外膜，在其中它可以通过抗体染色进行检测。BT474细胞以2.5x105细胞/烧瓶种植在完全培养基(达尔贝科改良伊格尔培养基+10％胎牛血清)中。将曲妥珠单抗加入完全培养基中至4ug/ml(37.5μM)的终浓度。使细胞在37℃下温育5天，随后用胰蛋白酶-EDTA收获，包括漂浮细胞。
抗体染色：
使1,000,000细胞在PAB(磷酸盐缓冲盐水、0.01％Azide、1％BSA)中洗涤，并且与0.5μg兔抗C35多克隆抗体78-2或兔IgG对照，随后与和Cy5缀合的驴抗兔抗体一起温育30分钟。细胞在1X膜联蛋白结合缓冲液中洗涤，并且与4μl膜联蛋白-PE(BD Pharmingen，结合在细胞凋亡的细胞上的磷脂酰丝氨酸)和0.1μM Sytox Green(DNA染料，由活细胞排除)一起在室温下温育15分钟。
FACS分析：
细胞群体在FSC/SSC上进行门控(gated)，以排除碎片。样品随后在2D中通过膜联蛋白V/Sytox green染色进行显示，并且门控成下述群体：
a.活的：膜联蛋白V-/Sytox Green DNA染料-
b.早期细胞凋亡的：膜联蛋白V+/Sytox Green DNA染料-
c.晚期细胞凋亡的：膜联蛋白V+/Sytox Green DNA染料low
d.死的：膜联蛋白V+/Sytox Green DNA染料hi
下表4显示经历细胞凋亡和/或死亡的经曲妥珠单抗处理的BT474细胞百分比高于未经处理的细胞的那些。
表4.经历细胞凋亡的经曲妥珠单抗处理的BT474细胞百分比
                        未经处理的               曲妥珠单抗
         活的           96.80％                  91.45％
         早期细胞凋亡的 0.24                     0.65
         晚期细胞凋亡的 0.91                     2.91
         死的           1.73                     4.28
如图3中所示，活BT474细胞的群体对于抗C35抗体染色是阴性的(小图A)，而晚期细胞凋亡的细胞对于抗C35抗体染色是阳性的(小图B)。如本文上文讨论的，通常与细胞内膜结合的C35抗原变得暴露在肿瘤细胞的表面膜上，所述肿瘤细胞通过放射和/或化疗进行诱导以经历细胞凋亡。参见美国申请公开号2005/0158323A1，图1-3。如表4中所示，曲妥珠单抗处理增加晚期细胞凋亡的细胞群体，并且晚期细胞凋亡的细胞对于C35染色阳性。因此，曲妥珠单抗可以诱导细胞凋亡，并且使C35蛋白质易位至细胞膜的外表面，使得它成为抗C35抗体易接近的靶。因此，用抗HER2抗体和C35抗体的联合治疗的一个优点是抗HER2抗体也诱导细胞凋亡，并且使C35易位至肿瘤细胞外膜。
实施例4
与HER2抗体相组合的C35抗体用于处理相对大的肿瘤
如图4和5中举例说明以及这个实施例中描述的，与抗HER2抗体相组合的抗C35抗体施用于移植BT474-MD的小鼠延迟或抑制相对大的肿瘤的肿瘤生长。图4中显示了当肿瘤大小约50mm3时开始处理时，单独和与曲妥珠单抗相组合的1F2抗C35抗体的使用延迟或减少肿瘤生长。图5显示甚至在处理开始时肿瘤体积更大约100mm3时，与曲妥珠单抗相组合的抗C35小鼠单克隆抗体1F2也抑制肿瘤的生长。
测试了用单独的曲妥珠单抗、单独的1F2、或与1F2相组合的曲妥珠单抗处理的小鼠中的平均肿瘤体积。用于测定平均肿瘤体积的方法类似于实施例2中描述的方法，除了在这个实施例中处理在第15或22天时开始以外，这时平均肿瘤体积分别为约50mm3或100mm3。
对于在第15天时开始的处理，9至12只小鼠的每个组各自接受下述处理之一：
1.无处理(盐水对照组)。
2.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射在第15天时开始，并且持续每周两次，共约2周。
3.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射连同800μg/i.v.注射(40mg/kg)的1F2鼠类单克隆抗体在第15天时开始，并且持续每周两次，共约2周。
4.单独的对照IgG。
5.800μg/i.v.注射(40mg/kg)的1F2鼠类单克隆抗体在第15天时开始，并且持续每周两次，共约2周。
对于在第22天时开始的处理，7至12只小鼠的每个组各自接受下述处理之一：
1.无处理(盐水对照组)。
2.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射在第22天时开始，并且持续每周两次，共约2周。
3.10μg/剂量(约0.5mg/kg)曲妥珠单抗/i.v.注射连同800μg/i.v.注射(40mg/kg)的1F2鼠类单克隆抗体在第22天时开始，并且持续每周两次，共约2周。
在移植后的各个时间点测量平均小鼠肿瘤体积(图4)。在第15天时开始处理时，肿瘤体积为约50mm3。测量平均肿瘤体积直至移植后至少45天。如图4中所示，与曲妥珠单抗、单独的1F2抗C35抗体、单独的IgG和未经处理的相比较，曲妥珠单抗和1F2抗C35抗体的组合减少肿瘤体积中的生长。
在处理开始时肿瘤体积约100mm3时，与曲妥珠单抗相组合的1F2抗C35抗体减少肿瘤生长的使用对于延迟或减少肿瘤生长也是有效的。在移植后的各个时间点测量平均小鼠肿瘤体积(图5)。与单独的曲妥珠单抗或未经处理的相比较，曲妥珠单抗和1F2抗C35抗体的组合延迟或减少肿瘤生长。
下表5显示与单独的抗HER2抗体相比较，抗C35抗体和抗HER2抗体的组合在预防肿瘤生长方面也是更有效的。如表5中所示，与单独的抗C35 1F2或曲妥珠单抗相比较，具有静态(static)肿瘤(即，从处理开始直到研究结束时，未能生长或保持相对恒定的肿瘤)的小鼠百分比对于1F2抗C35抗体和曲妥珠单抗处理的组合增加。无论处理在第15天时开始(肿瘤体积约50mm3)还是处理在第22天时开始(肿瘤体积约100mm3)都显示了增加。
表5：在处理后肿瘤大小的比较
Figure BPA00001188942400941
因此，这个实施例显示与单独的抗HER2抗体或单独的抗C35抗体相比较，抗C35抗体和抗HER2抗体的组合在抑制平均肿瘤生长方面更有效，与处理在第15天时开始(肿瘤体积约50mm3)还是处理在第22天时(肿瘤体积约100mm3)开始无关。因此，这个实施例和上文实施例显示经组合的抗C35和抗HER2处理在抑制或延迟相对小和大的肿瘤的肿瘤生长方面比单独的任一处理更有效。
本文引用的所有出版物(包括专利、专利申请、期刊论文、实验室手册、书或其他文件)的完整公开内容在此通过引用合并。
Figure IPA00001188941700011
Figure IPA00001188941700031
Figure IPA00001188941700061

Claims (100)

1.杀死表达C35和HER2的癌细胞的方法，所述方法包括给所述细胞施用：(a)一定量的特异性结合C35的抗C35抗体或其抗原结合片段；和(b)一定量的特异性结合HER2的抗HER2抗体或其抗原结合片段，其中抗C35抗体的所述量和所述抗HER2抗体的所述量对于杀死所述癌细胞有效。
2.权利要求1的方法，其进一步包括(c)施用一定量的治疗性试剂。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法在体内执行。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法在哺乳动物中执行。
5.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物是人。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述治疗性试剂是化疗剂。
7.权利要求6的方法，其中所述化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。
8.权利要求7的方法，其中所述化疗剂是紫杉醇。
9.权利要求7的方法，其中所述化疗剂是阿霉素。
10.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述治疗性试剂是放射。
11.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种前施用。
12.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种后施用。
13.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述治疗性试剂与施用所述抗C35抗体或所述抗HER2抗体中的至少一种同时施用。
14.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述抗C35抗体和所述抗HER2抗体同时施用。
15.权利要求2-10中任一项的方法，其中所述抗C35抗体和所述抗HER2抗体顺次施用。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述抗体或其片段各自以约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重的剂量施用。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述抗C35抗体或片段选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
18.权利要求17的方法，其中所述抗C35抗体或片段是1F2或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
19.权利要求17的方法，其中所述抗C35抗体或片段是1B3或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述癌细胞选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。
22.权利要求21的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述乳腺癌细胞是导管内癌细胞。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述方法包括施用超过一种抗C35抗体或其片段。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述方法包括施用超过一种抗HER2抗体。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述抗C35抗体是人源化、嵌合或人抗体。
27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述抗HER2抗体是人源化、嵌合或人抗体。
28.杀死患者中的C35阳性癌细胞的方法，所述方法包括：
a)测试在所述患者的癌细胞样品中EGFR和HER2的表达；和
b)当所述癌细胞对于EGFR表达为阳性时，施用有效杀死所述癌细胞的一定量的抗EGFR抗体和一定量的抗C35抗体；或
c)当所述癌细胞对于HER2表达为阳性时，施用有效杀死所述癌细胞的一定量的抗HER2抗体和一定量的抗C35抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述EGFR或HER2表达通过体外测定法进行测定。
30.权利要求29的方法，其中所述体外测定法选自免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
31.权利要求28的方法，其中所述EGFR或HER2表达通过体内测定法进行测定。
32.权利要求31的方法，其中所述EGFR或HER2表达通过细胞成像测定法进行测定。
33.权利要求28的方法，其中所述EGFR和HER2表达通过不同测定方法进行测定。
34.权利要求28的方法，其中所述EGFR和HER2表达通过相同测定方法进行测定。
35.权利要求28的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
36.权利要求35的方法，其中所述乳腺癌是导管内癌。
37.权利要求35的方法，其中所述乳腺癌是乳腺癌转移。
38.权利要求28的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
39.权利要求28的方法，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
40.权利要求28的方法，其中所述抗C35抗体是1B3或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。
41.权利要求28的方法，其中所述抗C35抗体是1F2或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。
42.权利要求28的方法，其中所述抗C35抗体是全人的。
43.权利要求28的方法，其中所述抗EGFR抗体和所述抗C35抗体在不同时间施用。
44.权利要求43的方法，其中所述抗EGFR抗体在所述抗C35抗体前施用。
45.权利要求28的方法，其中所述抗HER2抗体和所述抗C35抗体在不同时间施用。
46.权利要求45的方法，其中所述抗HER2抗体在所述抗C35抗体前施用。
47.设计用于具有C35阳性癌症的患者的治疗的方法，所述方法包括：
a)测试在来自所述癌症患者的生物样品中HER2和EGFR的表达；
b)选择包括抗C35抗体和针对HER2或EGFR的抗体的联合抗体疗法，
其中当所述生物样品对于HER2表达为阳性时，选择抗HER2抗体，并且当所述生物样品对于EGFR表达为阳性时，选择抗EGFR抗体。
48.权利要求47的方法，其中所述生物样品选自肿瘤组织、血浆和血清。
49.权利要求47的方法，其中所述C35阳性癌症是乳腺癌。
50.权利要求49的方法，其中所述乳腺癌是导管内癌。
51.权利要求49的方法，其中所述乳腺癌是乳腺癌转移。
52.权利要求47的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
53.权利要求47的方法，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
54.权利要求47的方法，其中所述抗C35抗体是1B3或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。
55.权利要求47的方法，其中所述抗C35抗体是1F2或其保留对于C35的结合特异性的人源化变体或衍生物。
56.权利要求47的方法，其中所述抗C35抗体是全人的。
57.用于鉴定将在治疗上响应于用抗体联合疗法来治疗癌症的方法的患者的方法，所述方法包括：
a)测试在所述患者的癌细胞样品中C35、EGFR和HER2的表达；
b)测定在所述癌细胞中表达的C35、EGFR和HER2的组合；和
c)提供针对在所述癌细胞中表达的C35、EGFR和HER2的组合的抗体的组合。
58.权利要求57的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。
59.权利要求58的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
60.权利要求59的方法，其中所述乳腺癌是导管内癌。
61.权利要求57的方法，其中所述C35、EGFR和HER2表达通过体外测定法进行测定。
62.权利要求61的方法，其中所述体外测定法选自免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
63.权利要求57的方法，其中所述EGFR或HER2表达通过体内测定法进行测定。
64.权利要求63的方法，其中所述EGFR或HER2表达通过细胞成像测定法进行测定。
65.权利要求57的方法，其中所述细胞表达C35和EGFR的组合。
66.权利要求65的方法，其中抗体的所述组合包括抗C35抗体和抗EGFR抗体。
67.权利要求57的方法，其中所述细胞表达C35和HER2的组合。
68.权利要求65的方法，其中抗体的所述组合包括抗C35抗体和抗HER2抗体。
69.权利要求57的方法，其中所述细胞表达C35、EGFR和HER2的组合。
70.权利要求69的方法，其中所提供的抗体的所述组合是抗C35抗体、抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
71.权利要求57的方法，其进一步包括：
d)测试在所述患者的癌细胞样品中IGFR的表达；
e)测定在所述癌细胞中表达的C35、EGFR、HER2和IGFR的组合；和
f)提供针对在所述癌细胞中表达的C35、EGFR、HER2和IGFR的组合的抗体的组合。
72.权利要求71的方法，其中所述细胞表达C35和IGFR的组合。
73.权利要求72的方法，其中抗体的所述组合包括抗C35抗体和抗IGFR抗体。
74.杀死表达C35和EGFR的癌细胞的方法，所述方法包括给所述细胞施用：(a)一定量的特异性结合C35的抗C35抗体或其抗原结合片段；和(b)一定量的特异性结合EGFR的抗EGFR抗体或其抗原结合片段，其中抗C35抗体的所述量和所述抗EGFR抗体的所述量对于杀死所述癌细胞有效。
75.权利要求74的方法，其进一步包括(c)施用一定量的治疗性试剂。
76.权利要求74或75的方法，其中所述方法在体内执行。
77.权利要求73-75中任一项的方法，其中所述方法在哺乳动物中执行。
78.权利要求77的方法，其中所述哺乳动物是人。
79.权利要求75-78中任一项的方法，其中所述治疗性试剂是化疗剂。
80.权利要求79的方法，其中所述化疗剂选自顺铂、卡铂、紫杉醇、阿霉素、多西他赛、泰素帝、吉西他滨和长春瑞滨。
81.权利要求80的方法，其中所述化疗剂是紫杉醇。
82.权利要求80的方法，其中所述化疗剂是阿霉素。
83.权利要求75-78中任一项的方法，其中所述化疗剂是放射。
84.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种前施用。
85.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述治疗性试剂在施用所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种后施用。
86.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述治疗性试剂与施用所述抗C35抗体或所述抗EGFR抗体中的至少一种同时施用。
87.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述抗C35抗体和所述抗EGFR抗体同时施用。
88.权利要求75-83中任一项的方法，其中所述抗C35抗体和所述抗EGFR抗体顺次施用。
89.权利要求75-88中任一项的方法，其中所述抗体或其片段各自以约0.1mg/kg至约100mg/kg患者体重的剂量施用。
90.权利要求75-88中任一项的方法，其中所述抗C35抗体或片段选自1F2、1B3、MAbc0009、MAb 163、MAb 165、MAb 171及其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
91.权利要求90的方法，其中所述抗C35抗体或片段是1F2或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
92.权利要求90的方法，其中所述抗C35抗体或片段是1B3或其保留对于C35的结合特异性的变体或衍生物。
93.权利要求75-92中任一项的方法，其中所述抗EGFR抗体是西妥昔单抗。
94.权利要求75-93中任一项的方法，其中所述癌细胞选自乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、***癌、胰腺癌、结肠癌和黑素瘤。
95.权利要求94的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
96.权利要求95的方法，其中所述乳腺癌细胞是导管内癌细胞。
97.权利要求75-96中任一项的方法，其中所述方法包括施用超过一种抗C35抗体或其片段。
98.权利要求75-97中任一项的方法，其中所述方法包括施用超过一种抗EGFR抗体。
99.权利要求75-98中任一项的方法，其中所述抗C35抗体是人源化、嵌合或人抗体。
100.权利要求75-99中任一项的方法，其中所述抗EGFR抗体是人源化、嵌合或人抗体。
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