PT90353B - Processo para a producao de polipeptideos - Google Patents
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Description
invento diz também respeito aos métodos para a produção de no vos vectores híbridos compreendendo uma cassete de expressão de hirudina e de estirpes de leveduras contendo tais vectores híbridos .
método para a produção dos refe ridos compostos de dessulfato-hirudina consiste em se cultivar uma estirpe de levedura que não possui o DNA endógeno de dois microns e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo uma cassete de expressão de dessulfato-hirudina e o DNA completo de dois microns, seguindo de isolamento das referidas dessulfato-hirudinas, e, caso se pretenda, de separação de uma mistura de compostos de dessulfato-hirudina obtida nos componen tes individuais.
invento pertence ao campo da tec nologia de DNA recombinante e diz respeito a um método para a preparação de polipeptideos com uma acção anticoagulante, mais especificamente dessulfato-hirudinas, com a ajuda de células de levedura alteradas por engenharia genética, as referidas células de levedura alteradas por engenharia genética, vectores híbridos portadores dos genes das referidas dessulfato-hirudinas e métodos para a preparação das referidas células de levedura e referi dos vectores híbridos.
A hirudina é um agente anticoagulante que ocorre naturalmente nas sanguessugas (Hirudo medicinalijs). A hirudina não é uma espécie polipeptidica única mas antes uma classe de polipeptideos de acção semelhante consistindo pelo menos em quatro representantes designados variante de hirudina 1 (HV1), variante de hirudina 2 (HV2) (cf. Pedido de Patente Europeia N9 158 564), variante de hirudina PA (cf. Pedido PCT N9 86/03493) e des-(Vai)^-hirudina (cf. Pedido de Patente Europeia N9 158 986). As variantes diferem estruturalmente umas das outras numa série de aminoácidos (especialmente, a sequência N-terminal de HV1 é Val-Val-Tir, a de HV2 e de PA é Ile-Tre-Tir e a de des-(Vai)^-hirudina é Tre-Tir) mas têm em comum uma acumulação de aminoácidos hidrofóbicos no extremo N e de amino6 3 ácidos polares no extremo C, um resíduo tirosina (Tir ) presen te como monoéster de sulfato, três pontes dissulfureto e a actividade anticoagulante.
A hirudina é o inibidor mais forte da trombina conhecido e é caracterizado por uma afinidade especí fica para a trombina. Outras enzimas da cascada de coagulação do sangue não são inibidas pela hirudina. Ao contrário da heparina que é o anticoagulante preferido na terapia de anticoagulação convencional, a hirudina exerce a sua acção inibidora directamen te sobre a trombina e ao contrário da primeira, não actua através da antitrombina III. 0 único efeito farmacológicamente detectável da hirudina purificada é a inibição da coagulação do sangue e a profiláxia da trombose. Nenhum efeito sobre o ritmo
cardíaco, respiração, pressão sanguínea, contagem de trombócitos, fibrinogénio e hemoglobina pode ser observado após adminis tração intravenosa de hirudina a cães, mesmo em doses elevadas. Em testes com ratos, porcos e cães, a hirudina mostrou-se eficaz na trombose experimental (induzida por estase ou pela injecção de trombina), no choque com endotoxinas e também em DIC (coagulação intravascular disseminada). Sempre que foram efectuados testes para comparação directa a hirudina mostrou-se su perior à heparina. Ainda, a hirudina tem uma toxicidade extremamente baixa, é não antigénica e mostra uma eliminação quase completa pelos rins numa forma biologicamente activa.
Recentemente, foram clonados cDNA e genes sintéticos codificadores de variantes da hirudina e expressos em hospedeiros microbianos. Se bem que o produto de ex6 3 pressão não possua o grupo sulfato de monoéster em Tir - e fo ram portanto designados dessulfato-hirudinas - mostrou-se como tendo aproximadamente a mesma actividade biológica das hirudinas sulfatadas naturais. A variante de dessulfato-hirudina HV1 foi expressa em Escherichia coii (Pedidos de Patentes Europeias NS 158 564 e 168 342) e em Saccharomyces cerevisiae (Pedq dos de Patentes Europeias N®' 168 342, 200 655, 225 633 e 252 854). De modo semelhante, a dessulfato-hirudina HV2 foi expressa em Escherichia coii (Pedidos de Patentes Europeias Ns 158 564) e em Saccharomyces cerevisiae (Pedido de Patente Europeia Ns 200 655, Pedido PCT NS 86/01224) e des-(Vai)2~dessulfato-hirudina foi expressa em Escherichia coii (Pedido de Patente Europeia Ne 158 986).
De um modo geral, a eficácia de expressão e produção dos compostos de hirudina são mais altos quando se escolhe S. cerevisiae com o microorganismo hospedeiro. No entanto, mesmo com os sistemas de expressão disponíveis desenvolvidos para S_.__cerevisiae os rendimentos são relativamen te fracos. Face a isto, existe a necessidade de métodos melhora dos que tornem possível a produção económica de dessulfato-hiru dinas numa grande escala. E objectivo do presente invento pro-5porcionar tais métodos.
A maior parte das estirpes de
Saccharomyces cerevisiae é portadora de um elemento de DNA extracromossómico, auto-rep1icativo e de elevado número de cópias, designado plasmideo dois microns. As caracteristicas estru turais mais marcantes do plasmideo dois microns são duas repetições invertidas (IRI e IR2) de 599 pb cada dividindo o plasmideo em duas regiões de DNA de comprimento diferente. A recom binação homóloga entre estas duas sequências IR idênticas resulta na formação de dois isómeros moleculares (forma A e forma B). Além das regiões IR, o plasmideo dois microns contem uma origem de replicação (ORI), quatro grelhas de leitura aber tas (REP1, REP2, FLP, D) e um sitio STB (ou REP3). 0 produto do gene FLP é uma recombinase específica de sítio que actua nas estruturas IR e é controlada pelos produtos dos genes REP1, REP2 e D. Os produtos dos genes REP1 e REP2 e o sítio STB são essen ciais para a transmissão estável dos plasmídeos dois microns de célula mãe para célula filha.
Os vectores híbridos destinados à expressão de genes heterologos em levedura mais frequentemente contêm DNA dois mícrons. Em geral este DNA dois-microns inclui a origem de replicação se bem que esta não seja uma condição bá sica para a transformação estável devido aos vectores híbridos contendo DNA de dois microns poderem recombinar-se com os plasmídeos endógenos dois microns através das sequências IR. Os vec tores de expressão da hirudina em levedura divulgados nos Pedidos de Patentes Europeia N® 168 342, 200 655, 225 633 e 252 854 contêm fragmentos de DNA dois microns incluindo a origem de replicação, uma sequência IR e nalguns casos o sítio STB.
Surpreendentemente encontrou-se agora que a estabilidade dos transformantes e o rendimento dos compostos de dessulfato-hirudina pode ser aumentado considerávelmente quando o vector de expressão compreende o DNA de dois-microns completo e a estirpe de levedura hospedeira não possui
plasmideos dois-micron endógenos.
Assim, o invento está relacionado com um método para a produção de compostos de dessulfato-hirudi na compreendendo cultura de uma estirpe de levedura que não pos sui DNA dois-micron endógeno e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessul fato-hirudina consistindo num promotor constitutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação de levedura e (2) o DNA completo de dois-micron incluindo os ge nes REP1, REP2 e FLP intactos, assim como sítios ORI, STB, IR1 e IR2 intactos e facultativamente um gene D intacto e isolamento das referidas dessulfato-hirudinas e, caso se pretenda, sepa ração de uma mistura de compostos de dessulfato-hirudina obtidos nos seus componentes individuais.
termo dessulfato-hirudina pre tende incluir todos os compostos de dessulfato-hirudina na lite ratura ou obtidos a partir de uma estirpe de microorganismo transformado contendo DNA que codifica uma dessulfato-hirudina. Tais dessulfato-hirudinas são, por exemplo, as variantes de des sulf ato-hirudina HV1, HV2, HV2 (modificada), PA e des-(Vai ) -dessulfato-hirudina. Deve-se compreender que os derivados tendo actividade de hirudina (i.e. tendo uma acção inibidora da trombina) são também cobertos pelo termo dessulfato-hirudina. Tais derivados são especialmente dessulfato-hirudina encurtadas no extremo C, i.e. dessulfato-hirudinas um a sete, de preferência um a quatro, aminoácidos no extremo C.
São dessulfato-hirudinas preferidas as que têm as fórmulas
X Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai
-ΊThr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly
Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Leu Gin (I) , onde X representa o resíduo dipeptídico Val-Val-(HV1) ou Tre (Des-(Vai)2~hirudina) e os derivados sem o aminoácido C-terminal Gin, o dipeptídeo C-terminal -Leu-Gln, o tripeptídeo C-ter minai -Tir-Leu-Gln ou o tetrapeptídeo C-terminal -Glu-Tir-Leu-Gln ou y_L Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu | Cys | Glu | Gly | Ser | Asn | Vai | Cys | Gly | Lys | Gly | Asn | Lys |
Cys | Ile | Leu | Gly | Ser | Asn | Gly | Lys | Gly | Asn | Gin | Cys | Vai |
Thr | Gly | Glu | Gly | Thr | Pro | Y2 | Pro | Glu | Ser | His | Asn | Asn |
Gly | Asp | Phe | Glu | Glu | Ile | Pro | Glu | Glu | Tyr | Leu | Gin |
(II) , onde Y representa o resíduo dipeptídico N-terminal Ile-Tre- e Y2 representa Asn (HV2) ou Lis, ou Y^ representa Val-Val e Y2 é Asn ou Lis (HV2 modificada) ou
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu
Cys | Leu | Cys | Glu | Gly | Ser | Asn | Vai | Cys | Gly | Lys | Gly | Asn | Lys |
Cys | Ile | Leu | Gly | Ser | Gin | Gly | Lys | Asp | Asn | Gin | Cys | Vai | Thr |
Gly | Glu | Gly | Thr | Pro | Lys | Pro | Gin | Ser | His | Asn | Gin | Gly | Asp |
Phe | Glu | Pro | Ile | Pro | Glu | Asp | Ala | Tyr | Asp | Glu |
(III) , (PA). 0 composto de dessulfato-hirudina mais preferido é o da fórmula I em que X representa o resíduo dipeptídico Val-Val-.
As estirpes hospedeiras de levedura e os constituintes dos vectores híbridos são os especificados abaixo.
-8As estirpes de levedura transformadas foram cultivadas usando métodos conhecidos.
Assim, as estirpes de levedura transformadas de acordo com o invento são cultivadas num meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos.
Pode-se usar várias fontes de car bono. São exemplos de fontes de carbono preferidas açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol, frutose ou lac tose, ou um acetato, como seja acetato de sódio, as quais podem ser usadas sozinhas ou em misturas adequadas. Fontes de azoto adequadas incluem, por exemplo, aminoácidos, tais como casamino ácidos, peptideos e proteínas e seus produtos de degradação, tais como triptona, peptona ou extractos de carne, ainda extracto de levedura, extracto de malte, melaço, assim como sais de amónio, como seja cloreto sulfato ou nitrato de amónio, os quais podem ser usados sozinhos ou em misturas adequadas. Sais inorgânicos que podem ser usados incluem, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio. Em adição, o meio nutritivo pode também conter substâncias promoto ras do crescimento. Substâncias que promovem o crescimento inclu em, por exemplo, micronutrientes, tais como ferro, zinco, manganês e similares ou aminoácidos individuais.
Os vectores híbridos compreendendo o DNA completo de dois-micron (incluindo uma origem de repli cação funcional) são estávelmente mantidos dentro de estirpes de ^£££Íl£r££Z£££ cerevisiae que não possuem plasmídeos dois-micron endógenos (as chamadas estirpes cir°) de modo a que a cultura possa ser efectuada em condições de crescimento não selectivas, i.e. num meio complexo.
A cultura é efectuada empregando técnicas convencionais. As condições de cultura, tais como temperatura, pH do meio e tempo de fermentação são seleccionadas de modo a que sejam produzidas níveis máximos de dessulfato-hirudina. Uma estirpe de levedura escolhida é de preferência cultivada
-9em condições de aerobiose em cultura submersa com agitação a uma temperatura de cerca de 25°C a 35°C, de preferência a cerca de
28°C a um valor de pH entre 4 e 7, por exemplo a pH de aproximadamente 5 e durante pelo menos 1 a 3 dias, de preferência desde que se obtenham produções satisfatórias de dessulfato-hirudina.
Independentemente da estirpe de le vedura, promotor e peptideo sinal usado, a maior parte da dessul fato-hirudina produzida é secretada para o meio de cultura enquanto que uma parte ínfima permanece dentro da célula. A propor ção exacta (composto secretado/compostos associados à célula) de pende das condições de fermentação e do processo de recuperação aplicado. Em geral ainda à volta de 8:1 ou mais. Assim, a dessul fato-hirudina secretada é sempre fortemente dominante.
A dessulfato-hirudina pode ser iso lada do meio de cultura por meios convencionais. Por exemplo, o primeiro passo consiste geralmente na separação das células do meio de cultura por meio de centrifugação. 0 sobrenadante resultante pode ser enriquecido em dessulfato-hirudina por tratamento com polietileneimina de modo a remover a maior parte do material não proteico e a precipitação das proteínas por saturação da solução com sulfato de amónio. As proteínas hospedeiras quando presentes, podem também ser precipitadas por meio de acidificação com ácido acético (por exemplo 0,1%, pH 4-5). Um posterior enriquecimento da dessulfato-hirudina pode ser conseguido por extracção do sobrenadante do ácido acético com n-butanol. Outros passos de purificação incluem, por exemplo, remoção de sal, processos cromatográficos, tais como cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel, crornatografia de par tição, HPLC, HPLC de fase reversa e similares. A separação dos constituintes da mistura é também efectuada por diálise, de acor do com a carga por meio de electroforese em gel ou electroforese sem veículo, de acordo com o tamanho molecular por meio de uma coluna de Sephadex adequada, por cromatografia de afinidade, por exemplo com anticorpos especialmente anticorpos monoclonais ou com trombina acoplada a um veículo adequado para cromatografia
-10de afinidade ou por outros processos, especialmente os conhecidos da literatura.
Caso se pretenda isolar qualquer dessulfato-hirudina adicional que esteja associado às células, i.e. que se tenha acumulado intracelularmente ou no espaço peri plasmático, são necessários alguns passos de purificação suplementares. Assim, no caso da dessulfato-hirudina se ter acumulado dentro das células, o primeiro passo para a sua recuperação consiste na sua libertação do interior celular. Na maior parte dos processos a parede celular é primeiro removida por digestão enzimática com glucosidases (infra). Subsequentemente, os esperoplastos resultantes são tratados com detergentes, tais como Triton. Como alternativa, forças mecânicas, tais como forças de cisalhamento (por exemplo prensa X, prensa Francesa) ou agitação com esferas de vidro, são adequados para rebentar as células. No caso da dessulfato-hirudina ser secretada pelas células hospedeiras para o espaço periplasmático, pode-se usar um proto colo simplificado: A dessulfato-hirudina é recuperada sem lise das células por remoção enzimática da parede celular ou por tra tamento com agentes químicos, e.g. reagentes de tiol ou EDTA, os quais danificam a parede celular permitindo a libertação do produto.
Uma mistura de dessulfato—hirudina obtida pode ser separada nos seus componentes individuais através da aplicação de meios convencionais, tais como métodos cromatográf icos , por exemplo HPLC em fase reversa cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel e cromatografia de interacção hidrofobica.
Para detectar actividade hirudina podem ser usados o teste com anticorpos anti-hirudina ou anti-dessulfato-hirudina (por exemplo, anticorpos monoclonais obti_ dos de células de hibridoma), o teste da trombina . U . Bergmeyer (ed.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, pág. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (FRG) 1983] ou o teste de coagulação do sangue [f. Markwardt et al . , Thromb. Haemost. 47, 226 (1982)].
As células hospedeiras de levedura transformadas de acordo com o invento podem ser preparadas por técnicas de DNA recombinante compreendendo os passos de
- preparação de um vector híbrido compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina consistindo num promotor constitutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primei, ra sequência de DNA codificador de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura, e (2) o DNA completo de dois-micron incluindo os genes REP1, REP2 e FLP intactos, assim com os sítios ORI, STB, IR1 e IR2 intactos e facultativamente um gene D intacto
- preparação de uma estirpe de levedura não possuidora de DNA de dois-micron endógeno
- transformação da estirpe cir° obtida com o referido vector híbrido,
- e selecção das células de levedura transformadas a partir de células de levedura não transformadas.
Vectores de expressão invento diz respeito a um vector híbrido de levedura compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina consistindo num promotor constitutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal ligado na grelha de leitu ra correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e (2) o DNA completo de dois-micron incluindo os genes REP1, REP2 e FLP intactos, assim como os sítios ORI, STB, IRI e IR2 intactos e um método para a sua produção.
promotor de levedura constituti
-12vo é de preferência derivado de um gene de levedura altamente expresso, como seja um gene codificador de uma enzima glicolítica, como seja o promotor dos genes da enolase, glicera1deído-3-f os f ato-de s i dr ogenase (GAPDH), 3-fosfoglicerato-cinase (PGK) , hexocinase, piruvato-descarboxilato, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-cinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucocinase, ainda o promotor ADHI ou IRPI θ um promotor encurtado de fosfatase ácida PHO5 que foi desprovido dos seus sítios de activação a montante. É especialmente preferido o promotor GAPDH e seus fragmentos funcionais começando nos nucleotídeos entre -550 e -180, em particular no nucleotídeo -540, -263 ou -198 e terminan do no nucleotídeo -5 do gene GAPDH e promotores constitutivos encurtados PHO5 começando nos nucleotídeos entre -200 e -150 em particular em -173 e terminando no nucleotídeo -9 do gene PH05.
A sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal (sequência sinal) deriva preferencialmen te de um gene levedura codificadora de um polipeptídeo que é ge ralmente secretado. A sequência sinal da hirudina obtida a partir de DNA genómico de sanguessuga também pode ser escolhido.
As sequências sinal de levedura são, por exemplo, as sequências sinal e prepro de genes da invertase de levedura, factor , feromona-peptidase (KEX1), toxina assassina e fosfatase ácida reprimível (PH05) e a sequência sinal da glucoamilase de Aspergi1lus awamori. Como alternativa, as sequências sinal fundidas podem ser construídas ligando parte da sequência sinal (se presente) do gene naturalmente ligado ao promotor usado (por exemplo PH05) com parte da sequência sinal da hirudina. São favorecidas aquelas combinações que permitam uma clivagem precisa entre a sequência sinal e a sequência de aminoácidos da dessulfato-hirudina. Sequência adicionais tais como sequências pro ou espaçadoras que podem ou não ser portadoras de sinais de proces sarnento específicos podem também ser incluídas nas construções para facilitar o processamento preciso de moléculas precursoras. Como alternativa, podem ser geradas proteínas fundidas contendo
-13sinais de processamento internos que permitam a maturação correcta in vivo ou in vitro. Por exemplo, os sinais de processamento contem um resíduo Lis-Arg, o qual é reconhecido por uma endopeptidase de levedura nas membranas do Golgi. As sequências sinal preferidas de acordo com o presente invento são as do gene PH05 de levedura codificadoras de um peptideo sinal tendo a fórmula
Met Fen Lis Ser Vai Vai Tir Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala, e do gene da invertase de levedura codificadora de um peptideo sinal tendo a fórmula
Met Leu Leu Gin Ala Fen Leu Fen Leu Leu Ala Gli Fen Ala Ala Lis Ile Ser Ala.
A sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina pode ser isolada a partir de DNA genómico de sanguessuga ou um DNA de cadeia dupla da dessu1fato-hirudina (ds cDNA da dessulfato-hirudina) é produzido complementar do mRNA da dessulfato-hirudina ou um gene codificador da sequên cia de aminoácidos da dessulfato-hirudina é produzido por meio de processos químicos e enzimáticos de modo conhecido per se.
Uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura é de preferência a sequência delimitante 3' de um gene de levedura que contem si^ nais adequados para a terminação da transcrição e poliadenilação. Sequências delimitantes 3' adequadas são por exemplo as do gene de levedura naturalmente ligado ao promotor usado. A sequên cia delimitante preferida é a do gene PH0 5 de levedura.
promotor de levedura, a sequência de DNA codificadora do peptideo sinal, a sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina e a sequência de DNA conten do sinais de terminação da transcrição de levedura são operacio nalmente ligados uns aos outros, i.e. são justapostos de modo a que as suas funções normais sejam mantidas. 0 arranjo é tal que o promotor efectua uma expressão correta do complexo sequência
-14sinal-gene da dessulfato-hirudina, os sinais de terminação da transcrição efectuam uma terminação correcta da transcrição e po 1 iadeni 1 ação e a sequência sinal está ligada na grelha de lei. tura correcta ao gene da dessulfato-hirudina de modo a que o lL· timo codão da sequência sinal esteja directamente ligado ao pri^ meiro codão do gene da dessulfato-hirudina e a secreção da dessulfato-hirudina ocorra. Se o promotor e a sequência sinal forem derivados de genes diferentes, o promotor é de preferência ligado à sequência sinal entre o principal sítio de iniciação do mRNA e o ATG do gene naturalmente ligado ao promotor. A sequência sinal deverá ter o seu próprio ATG para a iniciação da tradução. A junção destas sequências pode ser efectuada por meio de oligodesoxinucleotídeos adaptadores sintéticos portadores da sequência de reconhecimento de uma endonuclease.
Os vectores híbridos de acordo com o invento contêm o DNA completo de dois micron numa forma ininterrompida, i.e. o DNA dois-micron é clivado uma vez com uma en donuclease de restrição, o DNA linearizado é ligado com os outros componentes do vector antes da recircularização. 0 sítio de restrição é escolhido de modo a que a função normal dos genes REP1, REP2 e FLP e dos sítios ORI, STB, IR1 e IR2 seja mantida. Facultativamente o sítio de restrição é escolhido de modo a que o gene D também fique intacto. Os sítios de restrição preferidos são o sítio PstI único situado dentro do gene D e os sítios Hpajt e SnaBI. únicos situados fora dos referidos genes e sítios.
De preferência os vectores híbridos de acordo com o invento incluem um ou mais, especialmente um ou dois, marcas geneticas selectivas para levedura e uma destas marcas e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano, especialmente Escherichia coli.
Como marcas genéticas para levedura, pode ser usado qualquer gene marcador desde que facilite a selecção dos transformantes devido à expressão fenotipica do ge ne marcador. As marcas adequadas para levedura são, por exemplo, as que expressam resistência a antibióticos ou, no caso de mutan
tes de levedura auxotróficos, genes que complementam lesões do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, re sistência aos antibióticos G418, higromicina ou proporcionam prototrofia num mutante de levedura auxotrófico, por exemplo o gene URA3, LEU2, LYS2 ou TRP1.
Uma vez que a amplificação dos vectores híbridos é por conveniência feita em E^_coli, com van tagem são incluídas numa marca genética de E_.__θ uma origem de replicação de E. coli. Estas podem ser obtidas a partir de plasmídeos de ΕΛ__co1q, como seja pBR322 ou um plasmideo pUC, por exemplo pUC18 ou pUC19, os quais contem a origem de replicação, de E^__££li θ uma marca genética de que confere resistên cia a antibióticos, como seja ampicilina.
Os vectores híbridos de acordo com o invento podem ser preparados por métodos conhecidos. 0 proces so compreende clivagem do DNA do plasmideo dois micron com uma endonuclease de restrição de tal modo que a função normal dos ge nes REP1, REP2 e FLP e dos sítios ORI, STB, IRI e IR2, seja man tida, ligando o plasmideo linearizado obtido à cassete de expres são da dessulfato-hirudina e facultativamente a segmentos de DNA contendo numa ou mais marcas selectivas para levedura e uma mar ca genética selectiva e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano e recircularização do vector híbrido obtido.
Preparação de estirpes de levedura sem dois-micron
A estabilidade do plasmideo dois-micron é dada por três funções codificadas pelo plasmideo. Os produtos dos genes REP1 e REP2 são proteínas que actuam em trans que são necessárias à transmissão estável do plasmideo dois-micron. Deste dois REP1 é possivelmente o mais importante por a eficácia de transmissão estar dependente da dosagem de gene do produto do gene RP1. Qa . Cashmore et a 1^. , Mol. Gen. Genet. 20 3, 154 (1986)j. Estas duas proteínas actuam através e no sítio STB (REP3), um elemento importante que actua em cis no plasmideo
-16[m. Jayaram et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 2466; B. Viet et al. Mol. Cell. Biol. (1985) 2190j. 0 processo que se segue baseia-se no pressuposto que a eliminação do plasmideo dois-micron por um segundo plasmideo envolve o aumento da dosegem do sítio STB para regular negativamente as proteínas REP1 e RE2. Esta redução rela tiva das proteínas REP1 e REP2 conduzirá a uma instabilidade do plasmideo dois-micron endógeno.
De preferência o segundo plasmideo usado tem um defeito no gene REP1 ou não possui o gene REP1. Um exemplo de tal plasmideo é pDP38 que além de não possuir REP1 também não têm uma repetição invertida (IR2). Isto faz com que a expressão do seu número de cópias elevado esteja dependente da complementaçâo da proteína REP1 pelo plasmideo dois-micron endó geno. Ele contem duas marcas selectivas para levedura: URA3, usa da em situações de alto e baixo número de cópias e dLEU2, aplica vel apenas em situações de elevado número de cópias £e . Erhart et aA., J. Bacteriol. (1968) 625j .
Uma estirpe de levedura Ura e Leu foi transformada com o plasmideo pDP38 e seleccionada quanto a colónias Ura+. A selecção em placas sem uracilo (selecção Ura) ;dá uma melhor frequência de transformação do que a selecção em placas sem leucina (selecção Leu), uma vez que o gene URA3 é melhor expresso do que o gene defectivo dLEU2. Seleccionou-se uma única colónia que foi semeada numa placa de selecção Leu que dá colónias de tamanho e forma variáveis. Algumas das cólonias mais
I pequenas foram repicadas para placas de selecção Ura e transferi
Idas para placas de selecção Leu. Seleccionaram-se as colónias jque podem crescer sob selecção Ura mas apenas muito lentamente com selecção Leu. 0 crescimento em placas de selecção Ura mostra que o plasmideo pDP38 ainda está presente e que o crescimento lento sob selecção Leu não é devido à perda deste plasmideo e que a ausência de crescimento sob selecção Leu implica que pDP38 não é capaz de complementar esta marca. Este último facto pode ser explicado de duas maneiras: A. 0 gene LEU2 no pDP38 esta mutagenizado, ou B: 0 plasmideo não pode complementar leu2 porque
não pode aumentar o seu número de cópias implicando que não esteja disponível (i.e. perdido) o plasmideo dois-micron para com plementar o produto do gene REP1.
Estas duas possibilidades podem ser fácilmente distinguidas. Em primeiro lugar, o crescimento mínimo observado com as referidas colónias (contra o crescimento de zero absoluto das células sem pDP38) mostra que está presente alguma expressão LEU2. 0 segundo ponto pode ser directamente testado, uma vez que na ausência do plasmideo dois-micron pDP38 actuará apenas como plasmideo tipo ARS, i.e. será muito instável de tal forma que a maior parte das colónias o vão perder passadas algumas gerações. Assim, quando uma colónia isolada é riscada numa placa de agar YPD e colónias isoladas transfe ridas para placas sem uracilo, apenas algumas crescerão sob selecção Ura. As colónias que não crescem são testadas por hibridação relativamente às sequências de pUC e de dois-micron. As colónias que não apresentam sinais de hibridação não possuem o plasmideo pDP38 e os plasmídeos endógenos dois-micron (estirpes • ° \ c ι r ) .
As estirpes cir° de acordo com o invento podem ser também preparadas por outros métodos menos vantajosos bem conhecidos fver, por exemplo, C. P. Hollenberg, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96, 119 (1982)].
Estirpes de levedura transformadas invento diz respeito ainda a uma estirpe de levedura que não possui o DNA dois-micron endóge no e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina consistindo num promotor constitutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e
-18(2) o DNA completo de dois-micron incluindo os genes REP1, REP2 e FLP intactos, assim como sítios ORI, STB, IR1 e IR2 intactos, e a um método para a sua produção.
Estirpes hospedeiras de levedura adequadas incluem estirpes de Saccharomyces cerevisiae que forarr desprovidas dos plasmídeos dois-micron endógenos (ver atrás).
método para a produção da referida estirpe de levedura transformada caracteriza-se pela trans formação de uma estirpe de levedura que não possui plasmídeos dois-micron endógenos com o referido vector híbrido.
A transformação de levedura com os vectores híbridos de acordo com o invento pode ser conseguida de acordo com o método descrito por Hinnen et a_l . fproc .
Natl. Acad. Sei. USA 7 5, 1929 (1978)3· Este método pode ser dividido em três passos:
(1) Remoção da parede celular de levedura ou partes dela usando várias preparações de glucosidases, como seja suco intestinais R R de cobra (e.g. Glusulase ou Helicase ) ou misturas de enzimas p
obtidas a partir de microorganismos (e.g. Zymolyase ) em soluções osmóticamente estabilizadas (e.g. 1 M sorbitol).
(2) Tratamento das células de levedura nuas (esferoplastos) com o DNA vector na presença de PEG (ρo1ieti1enoglico1) e iões Ca2+ .
(3) Regeneração da parede celular e selecção das células transformadas numa camada sólida de agar. Esta regeneração é por con veniência feita por embebição dos esferoplastos em agar. Por exemplo, agar fundido (cerca de 50°C) é misturado com os esfero plastos. Quando do arrefecimento da solução para temperaturas de crescimento das leveduras (cerca de 30°C), obtem-se uma cama da sólida. Esta camada de agar é para evitar a rápida difusão e perda de macromoléculas essenciais do esferoplasto e portanto facilita a regeneração da parede celular. No entanto, a regeneração da parede celular pode também ser conseguida (se bem que com uma eficácia mais baixa) semeando os esferoplastos na super
-19fície de camada de agar pré-formadas.
De preferência, o agar de regeneração é preparado de modo a permitir a regeneração e selecção de células transformadas ao mesmo tempo. Uma vez que os genes de levedura codificadora de enzimas das vias de biossintese de aminoácidos ou nucleotídeos são geralmente usadas como marcas selectivas (supra), a regeneração é de preferência efectuada num meio mínimo para levedura com agar. Se forem necessárias eficácias de regeneração muito elevadas é vantajoso seguir o seguinte processo de dois passos: (1) regeneração da parede celular num meio complexo rico (2) selecção das células transformadas por transferência da camada de células para placas de agar selectivo .
invento diz ainda respeito a no vos compostos de dessulfato-hirudina obtidos pelo processo de acordo com o invento.
Os compostos de dessu 1 fato-hirudi. na obtidos pelo processo de acordo com o invento podem ser usados, de modo análogo à hirudina natural, na terapia e profiláxia de tromboses, para terapia de choque agudo, para a terapia de coagulopatias destruidoras e similares conforme descrito no Pedido de Patente Europeia N9 168 342.
invento diz respeito especialmente a vectores híbridos, estirpes de levedura transformadas, aos métodos para a produção dos referidos vectores híbridos e referidas estirpes de levedura transformadas e ao método para a produção de compostos de dessulfato-hirudina, como descrito nos Exemplos.
Breve descrição dos desenhos
Na parte experimental que se segue estão descritas várias realizações do presente invento com referência aos desenhos juntos em que:
-20Fig. 1 é um diagrama esquemático mostrando a síntese in vitro do gene da hirudina HV1 incluindo a sequência sinal de PH05 com os codões de levedura preferidos. Os 21 oligodesoxinucleotídeos usados estão indicados por linhas numeradas e linhas a tracejado, respectivamente.
Fig. 2 | ilustra esquemáticamente | a construção do plasmideo | pDP33. |
Fig. 3 | ilustra esquemáticamente | a construção dos plasmideos | |
pDP34 e | de pDP38. | ||
Fig. 4 | ilustra esquemáticamente | a construção do plasmideo | de ex |
pressão | PDP34/GAPFL-YHIR. | ||
Fig. 5 | ilustra esquemáticamente | a construção do plasmideo | de ex |
pressão | PDP34/PH05(-173)-YHIR. | ||
Fig. 6 | ilustra esquematicamente | a construção do plasmideo | pDP92. |
Fig. 7 | é uma ilustração esquemática do plasmideo pDP96. |
Parte experimental
Exemplo 1: Síntese in vitro do gene da hirudina HV1 com codões preferidos pelas leveduras
A sequência codificadora da casse te de expressão da hirudina foi projectada com os codões pelas leveduras Qb. Hall J. Biol. Chem. 257 (1982) 3026J para garantir uma tradução óptima do mRNA da hirudina. A sequência codify cadora contem a sequência sinal PH05 fundida na mesma grelha de leitura à sequência codificadora da dessulfato-hirudina HV1. 0 extremo 5' do DNA sintético contem os extremos coesivos do sítio de restrição EcoRI. No extremo 3' o codão de paragem TAG é imediatamente seguido dos extremos coesivos do sítio BamHI. A sequência do fragmento de DNA EcoRI-BamHI de 257 pb está apresentado na Figura 1.
A Fig. 1 também indica a estratégia para a síntese in vitro do fragmento de DNA de cadeia dupla. Sintetizaram-se 21 oligonucleotídeos usando o método fos
-21foramideto £m.H. Caruthers, em: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments (H.G. Gassen e A. Lang, Eds.), Verlag Chernie, Weinheim, FRGj num sintetizador Applied Biosystems Modelo 380B . Na Figura 1 está apresentada a sequência dos oligonucleotídeos individuais. As sobreposições são únicas. Os oligonucleotídeos liofilizados foram redissolvidos em 50 mM Tris-HCl pH 8,0 numa concentração de 10 pmoles/μΐ. Os 21 oligonucleotídeos foram dis tribuidos por dois grupos; [a] Na 1-11 representando a metade 5' do fragmento de DNA, [b’J Na 12-21 para a metade 3' . Os dois grupos foram tratados separadamente. Misturaram-se 10 pmoles de cada um dos oligonucleotídeos de um grupo. Os oligonucleotídeos foram fosforilados em 20 μΐ de 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgClg, 10 mM NaCl, 3 mM DTT, 0,4 mM ATP e 8 unidades de polinuc1eotídeo-cinase (Boehringer) durante 1 hora a 37°C. Após 30 min à temperatura ambiente ambas as misturas (A e B) foram aque cidas individualmente durante 5 min. a 95°C num banho-maria. As amostras ficaram a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente num banho-maria durante a noite. As misturas de oligonucleotídeos emparelhados A e B foram então guardadas em gelo.
plasmideo pBR322 foi totalmente cortado com EcoRI e B am H I_. 0 fragmento grande de 4 kb foi isola do num gel preparativo de 0,6% de agarose. 0 DNA foi recuperado por electroeluição, purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitação com etanol como descrito no Exemplo
2. 0 DNA foi redissolvido em H^O numa concentração de 0,4 pmole s /μ 1 .
μΐ da mistura A de oligonucleotídeos emparelhados (5 pmoles de cada um dos oligos 1-11), 9,5 μΐ da mistura B (5 pmoles de cada um dos oligos 12-21), 0,4 pmoles do fragmento EcoRI^-BanHI de 4 kb do pBR322 e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) foram incubados durante 16 horas a 15°C.
Amostras de 10 μΐ foram usadas pa ra transformar células competentes E. coli HB 101 Ca++ 12 colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas in dividualmente em meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina. 0
-22DNA de plasmideo foi preparado pelo método de Holmes et al_. [Anal. Biochem. /14 (1981) 193j e analisado por digestão de res trição com EcoRI e BamHI. Os DNAs dos plasmideos com a inserção EcoRI-BamHI de 257 pb foram ainda analisados por sequenciação de DNA em ambas as cadeias. Os oligonucleotideos 3, 11, 12, 14 e 20 (ver Fig. 1) foram usados como iniciadores de sequenciação Um clone com uma sequência correcta em ambas as cadeias de DNA foi seleccionado e referido como pBR322/YHIR.
Exernplo 2: Construção do plasmideo pJDB207/GAPFL-YHIR pJDB207/GAPFL-YHIR é um plasmideo de levedura para a expressão da variante HV1 de dessulfato-hirudina sob o controle de um pro motor curto constitutivo do gene da gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) de levedura. A sequência codificadora da dessulfato-hirudina consiste em codões preferidos pelas leveduras.
Bg do plasmideo pBR322/YHIR foram digeridos com as endonucleases de restrição BamHI e EcoRI. 0 fragmento EcoRI-BamHI de 257 pb foi separado dos outros fragmentos de DNA num gel preparativo de 1,2% de agarose. As banhas de DNA foram coradas com brometo de etidio e visualizadas sob luz UV a 360 nm. A banda de DNA de 257 pb foi cortada do gel e electrocluida em tampão TBE 0,2 χ (TBE: 90 mM base Tris, 90 mM ácido bórico, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) durante 45 min a 100 mA. Após alteração da polari dade durante 45 seg. a solução de DNA foi colhida e ajustada a 0,15 M NaCl. 0 DNA foi adsorvido a 100 μΐ de permutador iónico DE52 (Whatman) e eluido em 400 μΐ de tampão de alto teor salino (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1,5 M NaCl). 0 DNA foi preci pitado com etanol e ressuspenso em H^O numa concentração de 0,1 pmoles/μΐ.
plasmideo pJDB207/GAPFL-HIR (Pedido de Patente Europeia N? 225 633) contem o gene sintético da dessulfato-hirudina (baseada na frequência de utilização de codões de E. coli) fundido na mesma grelha de leitura com a se-
quência sinal da fosfatase ácida de levedura (PH05). 0 gene é expresso sob o controle de um promotor curto constitutivo da gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPFL) de levedura no vector vai-vem pJDB2O7. 10 pg do plasmideo pJDB207/GAPFL-HIR foram digeridos com Sall e EcoRl. 0 fragmento SalI-EcoRI de 478 pb contem a parte Sal-Bam do pBR322 e o promotor GAPFL. 0 fragmento de DNA foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose electroeluido e purificado por cromatografia em DE52 e precipitação com etanol. 0 DNA foi ressuspenso em H20 numa concentração de 0,1 pmoles/μΐ. 5 μg de pJDB207/GAPFL-HIR foram digeridos com Sall e BamH. 0 fragmento vector grande de 6,7 kb foi isolado como descrito atrás.
0,2 pmoles do fragmento promotor SalI-EcoRI de 478 pb, 0,2 pmoles do fragmento EcoRI-BamHI de 257 pb contendo a sequência sinal de PH05 e o gene sintético da hirudina (codões de levedura) e 0,1 pmoles do fragmento vector de 6,7 kb foram ligados em 10 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 5 mM DTT, 1 mM ATP e 200 unidades de DNA ligase de T4 (Biolabs) durante 6 h a 15°C. Uma amostra de um μΐ da mistura de ligação foi usada para trans formar células competentes coli HB 101.
colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas individualmente em meio LB contendo 100 pg/ml de ampicili na. 0 DNA de plasmideo foi preparado pelo método de Holmes et al (supra) e analisado por duplas digestões SalI/HindIII. Um clone isolado com o pedrão de restrição esperado foi referido como pJDB207/GAPFL-YHIR.
De modo análogo a construção pode ser efectuada com um fragmento promotor SalI-EcoRI de 543 pb do plasmideo pJDB207/GAPEL-HIR (Pedido de Patente Europeia Ns 225 633). 0 novo plasmideo resultante foi designado pJDB207/ /GAPEL-YHIR
Exemplo 3: Construção do plasmideo pJD3207/PHO5(-173)-HIR pJDB207/PH05(-173)-HIR é um plasmideo de levedura para a expres são da variante HV1 de dessulfato-hirudina sob o controlo de um promotor curto PH05. 0 elemento promotor PH05(-173) compreende a sequência de nucleotídeos do promotor PH05 de levedura da po sição -9 a -173 (sítio de restrição BstEII), mas não tem sequên cias reguladoras a montante (UAS). 0 promotor PH05(-173) compor ta-se portanto como um promotor constitutivo.
plasmideo pJDB207/PH05(Eco)-HIR (EP 225 633) contem o promotor PHO 5 de tamanho completo regulado com um sítio EcoRI introduzido na posição -8 relativamente ao ATG da sequência sinal PHO5 e a sequência codificadora da dessulfato-hirudina que é seguida do fragmento de terminação da PHO5. Este exemplo descreve a substituição do promotor PHO5 regulado pelo elemento promotor curto PH05(-173).
μg do plasmideo pJDB207/PH05(Eco)-HIR foram digeridos com BstEII. Os extremos coesivos dos fragmentos de restrição foram preenchidos numa reacção com DNA polimerase Klenow (1 unidade/ ^g de DNA) em 200 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5 10 mM MgCl^, dATP, dCTP, dGTP, TTP 0,1 mM cada durante 30 min. à temperatura ambiente. Após extracção com fenol o DNA foi precipitado com etanol.
4,16 μg do adaptador BamHI (5'-CGGATCCG-3', Biolabs) foram fosforilados em 100 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 5 mM
DTT, 0,5 mM ATP e 18 unidades de po1inuc1eotídeo-cinase de T4 (Boehringer) durante 45 min a 37°C. Após 10 min 75°C a mistura de reacção foi arrefecida lentamente até à temperatura ambiente Os adaptadores oligonucleotídicos emparelhados foram guardados a -20°C.
pmoles dos fragmentos {^BstEIlJ/extremo cerse do plasmideo pJDB207/PH05(Eco)-HIR foram incubados durante 16 h a 15°C com um excesso de 100 vezes de adaptador BamHI fosforilado e empare lhado em 208 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, mM
-25DTT, 3,5 mM ATP e 800 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs).
Após inactivação da ligase durante 10 min. a 85°C o excesso de adaptadores foi removido por precipitação do DNA na presença de 10 mM EDTA, 300 mM acetato de sódio pH 6,0 e 0,54 volumes de isopropanol. 0 DNA foi digerido com BamHI e EcoRI. Os fragmentos de DNA foram separados num gel preparativo de 0,8% de agaro se. 0 fragmento promotor BamHI-EcoRI de 172 pb foi recuperado do gel por electroeluição e precipitação com etanol. 0 DNA foi ressuspenso numa concentração, de 0,1 pmoles/μΐ.
plasmideo pJDB207/PH05(Eco)-HIR foi digerido com EcoRI e HindIII. 0 fragmento EcoRI-HindlII de 643 pb foi isolado com descrito atrás. 0 fragmento de DNA contem a sequência sinal PH0 5 fundida na mesma grelha de leitura com a sequência codificadora da dessulfato-hirudina e o fragmen to de terminação da transcrição de PH05. 0 plasmideo foi também cortado com HindIII e BamHI. 0 fragmento vector de 6,6 kb foi isolado.
0,2 pmoles de cada um dos fragmentos BamH-I-EcoRI de 172 pb e EcoRI-HindIII de 643 pb e 0,1 pmoles do fragmento vector de 6,6 kb foram ligados em 10 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, mM DTT, 1 mM ATP e 400 unidades de DNA-ligase de T4 (Biolabs) durante 6 h a 15°C. Uma amostra de um μΐ da mistura de ligação foi adicionado a 100 μΐ de células E. coli HB101 tornadas competentes para a transformação por tratamento com cálcio.
colónias transformadas resistentes à ampicilina foram cultivadas em meio LB contendo 100 μg/ml de ampicilina. 0 DNA do pias mídeo foi preparado e analisado por digestão com BamHI e Sall/ /HindIII. Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e referido pJDB207/PH05(-173)-HIR.
Exemplo 4: Construção do plasmideo pDP34
DNA circular covalentamente fecha do de 2 micron de levedura foi isolado a partir de Saccharomyces £Ê£ÊZ.isi㣠estirpe S288C. As células foram incubadas com 5 μg/ /ml de Zymolyase (100 000 unidades^g) durante 20 min a 37°C para digerir as paredes celulares. Os esferoplastos foram lisados em 2% SDS. Adicionou-se então EDTA para 25 mM, brometo de etídio para 1 mg/ml e cloreto de césio para uma densidade final de 1,55 g/ml. 0 DNA de plasmideo foi separado do DNA cromossómico por ultracentrifugação durante 49 horas a 15°C. 0 DNA do plasmideo 2 micron foi retirado do gradiente com uma seringa. 0 brometo de etídio foi removido por extracçâo com isopropanol sa turado com NaCl e o DNA de plasmideo foi finalmente precipitado com etanol. 0 DNA do plasmideo dois-micron purificado foi então linearizado com PstI e clonado no sítio PstI do pUC19 [\j. Norran der et al., Gene 26 (1983), 101] para dar o plasmideo pDP31.
plasmídio pJDB207 foi digerido com as enzimas de restrição Kpnl e Hpal. 0 fragmento Hpal-Kpnl de 0,55 kb resultante contem a junção entre a sequência de 2 mi cron e o promotor defectivo do gene dLEU2.
plasmideo pUC7/LEU2 contem o fragmento genómico Xhol-Sall de 2,2 kb de levedura do gene LEU2 CA. Andreadis et al., Cell 31^ (1982), 319] clonado no sítio Sali do plasmideo pUC7 [j . Vieira et al. , Gene 19 (1982) , 259] .
plasmideo pUC7/LEU2 foi cortado com Kpnl e Hpal. 0 fragmento Kpnl-Hpal de 4,25 kb foi ligado ao fragmento Hpal-Kpnl de o,55 kb do pJDB207. Isto resulta no plasmideo pDP30 onde a fusão ori ginal dois micron/dLEU2 tal como no plasmideo pJD207 está colocado em frente do gene LEU2 com o seu terminador completo. pDP30 foi digerido com Hpal e Sali e o fragmento de 1,85 kb con tendo o gene completo LEU2 foi purificado e clonado no fragmento Sall-Hpal de 8,7 kb do plasmideo pDP31 . 0 plasmideo resultan te, pDP33 (ver Fig. 2), foi linearizado por digestão parcial com HindIII na presença de 50 pg/ml de brometo de etídio 04. Oesterlund et al., Gene 20 (1982) 12l] e ligado com o fragmento HindIII de 1,17 kb contendo o gene URA3 04 · Rose et al. , Gene 29 (1984), 113]. A inserção do gene URA3 foi seleccionada por transformação de células E. coli estirpe pyrF 04. Rose et al.,
-27supra]. Um clone positivo foi referido como plasmideo p D P 3 4 (ver Fig. 3).
pDP34 é um vector vai-vem para levedura-Eh ££ii com a marca da resistência à ampicilina para E_^ coli e as marcas selectivas de levedura URA3 e dLEU2. Ele possui a sequência completa de 2 micron na forma A e é proficiente para REP1 , REP2 e FLP.
Exemplo 5: Clonagem de cassetes de expressão da hirudina no pDP34 plasmideo pDP34 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos do sítio de restrição foram preenchi dos numa reacção com DNA-polimerase Klenow (T. Maniatis et al., em Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). 0 DNA foi ainda cortado com Sall e o fragmento vector de 11,8 kb foi isolado num gel preparativo de 0,6% de agarose. 0 DNA foi recuperado por electroeluição e precipitação com etanol. Diferentes cassetes de expressão foram clonados no fragmento vector pDP34 entre os sítios Sall e [BamHl]/extremo cerse .
plasmideo pJDB207/GAPFL-YHIR foi digerido com HindIII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremo cerses pela DNA-polimerase Klenow. 0 DNA foi precipitado com etanol e ainda digerido com Sall. 0 fragmento Sall- [HindIII]/extremo cerse de 1,1 kb contem a cassete de expressão completa com sequências do pBR322, o promotor GAPFL, a sequência sinal PH05 fundida na mesma grelha de leitura à sequência codifi cadora (codões preferidos das leveduras) da dessulfato-hirudina e o fragmento de terminação da transcrição de PH05. 0 fragmento de 1,1 kb foi isolado num gel preparativo de 0,8% de agarose, re cuperado do gel por electroeluição e purificado por cromatografia de permuta iónica em DE52 e precipitação com etanol. 0,2 pmoles do fragmento de 1,1 kb e 0,1 pmoles do fragmento vector de 11,8 kb foram ligados em 10 μΐ de 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2> 5 mM DTT, 3,5 mM ATP e 400 unidades de DNA -ligase de _ 28de T4 (Biolabs) durante 16 h a 15°C. usou-de uma amostra de um 2 + μΐ para transformar células de E. coli HB1O1 Ca . Analisaram-se 5 colónias transformadas resistentes à ampicilina. 0 DNA de plasmídeo foi digerido com BamHI e SalI/BamHI. Um clone com os fragmentos de restrição correctos foi seleccionado e referido como pDP34/GAPFL-YHIR (ver Fig. 4).
De modo análogo o fragmento Sall- (HindIII^/extremo cerse de 1,2 kb do pJDB207/GAPEL-YHIR (ver Exemplo 2) foi clonado no vector pDP34 que resulta no plasmídeo PDP34/GAPEL-YHIR.
plasmídeo pJDB207/PH05(-173)-HIR foi digerido com Sall e EcoRI. 0 fragmento SalI-EcoRI de 448 pb foi isolado como descrito. 0 fragmento de DNA contem a parte SalI-BamHI do pBR322 e o promotor constitutivo curto PH05(-173) (ver Exemplo 3). 0 plasmídeo pJDB207/GAPFL-YHIR foi digerido com HindIII. Os extremos coesivos foram convertidos em extremos cerses pela DNA polimerase Klenow. 0 DNA foi ainda digerido com EcoRI. Isolou-se o fragmento EcoRI-£HindiIij/extremo cerse de 642 pb. Ele contem a sequência sinal PHO5, a sequência codificadora da dessulfato-hirudina (com codões preferidos da levedura) e o fragmento de terminação da transcrição de ΡHO5. Ligaram-se 0,2 pmoles de cada um dos fragmentos SalI-EcoRI de 448 pb e EcoRI-extremo cerse de 642 pb e 0,1 pmoles do fragmento vector Sall-[BamHl]/extremo cerse de 11,8 kb. Amostras da mistura de li gação foram usadas para transformar células E^ ££ΐϊ_ HB 101 Ca + +. 0 DNA do plasmídeo de 12 transformantes foi analisado por dige£ tão com BamHI e SalI/BamHI. Um clone com o plasmídeo correcto foi seleccionado e designado pDP34/PH05(-173)-YHIR (ver Fig. 5).
E2S£££i£_Ê: Plasmídeo de expresso para o gene da hirudina com codões de E. coli
Plasmideos de expressão contendo o gene sintético da variante HV1 da dessulfato-hirudina baseado na frequência de utilização de codões de E. coli foram construi
-29dos de modo análogo à descrição no Exemplo 5. 0 fragmento Sall-[HindIII]/extremo cerse de 1,1 kb do pJDB207/GAPFL-HIR (Pedido de Patente Europeia 225 633) foi isolado e clonado no vector pDP34. 0 plasmideo de expressão resultante é pDP34/GAPFL-HIR compreendendo o gene sintético da dessulfato-hirudina baseado nos codões preferidos de E. coli expressos sob o controlo do pro motor constitutivo GAPFL.
Para uma construção semelhante o fragmento Sall-[HindIII]/extremo cerse de 1,1 kb do pJDB207/PH05 (-173)-HIR (ver Exemplo 3) foi clonado em pDP34. 0 plasmideo resultante pDP34/PH05(-173)-HIR contem o gene sintético da dessulfato-hirudina (codões de ΕΛ_£θ1Λ) sob o controlo do promotor constitutivo curto PH05(-173).
Exemplo 7: A cassete de expressão da hirudina no plasmideo pDP92
Vectores contendo a sequência com pleta de dois-micron não expressam necessáriamente todas as fun ções do circulo genuíno de dois-micron de levedura. Através da clonagem podem ser destruídas grelhas de leitura. Uma vez que não se conhece ainda nenhuma função para o produto da grelha de leitura D o sítio único PstI dentro deste gene foi usado para clonagem do gene dLEU2 CBeggs, J.D., Nature 275 (1978) 104-109] ou inserção de parte do vector pUC19 como no plasmideo pDP31 (ver Exemplo 4). Apenas recentemente foi sugerido que o produto do gene D regule a expressão do produto do gene FLP Çj.A.H. Murray £t a1., EMBO J. 6, 4205 (1987)]. Para tirar total vantagem do círculo de dois-micron construiu—se um vector que é proficien te para todas as funções conhecidas de dois-micron incluindo o produto do gene D.
a ) Çã£_do_p/a^mí.de o_pDP92 (ver Fig 6_)_ plasmideo pDP31 (Exemplo 4) foi digerido com PstI e Hpal resultando em três fragmentos. 0 pias-
-30mídeo pkl9 [que confere resistência à canamicina; Pridmore,
R.D., Gene 56 (1987) 309-312] foi linearizado com Smal. Os frag mentos de DNA de ambas as digestões foram extraídos com fenol e precipitados com etanol. Os fragmentos de DNA foram misturados e ligados. A mistura de ligação foi usada para transformar [Hanahan, D. J., Mol. Biol. 166 (1983) 557-580] células competentes de E. coli JM109 [Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33 (1985) 103-119], expressa durante 2 h a 37°C em meio LB e depois semea dos em placas de agar LB suplementado com 50 gg/ml de canamicina, 30 gg/ml de XGal e 7 pg/ml de IPTG.
colónias brancas resistentes à canamicina foram cultivadas.
DNA de plasmideo foi analisado por digestões com Xbal e BamHI/ /Kpnl. Um clone isolado que perdeu parte do vector pUC19 do pDP31, restaurou a grelha de leitura D de dois-micron por religa ção do sítio Pst7 e que tem o extremo cerse do plasmideo p k 19 in serido no sítio Hpal foi referido como pDP91 . 0 plasmideo contem os fragmentos grande Hpal-PstI e pequeno PstI-Hpal do plasmideo dois-micron clonados no sítio Smal de pkl9. Por religação dos sítios PstI a grelha de leitura D foi reconstituída.
gene URA3 foi isolado num fragmento HindIII de 1,17 kb do plasmideo pDP34 (ver Exemplo 4) e clonado no sítio único HindIII do plasmideo pUC12. Um clone com o gene URA3 inserido na mesma orientação do gene de resistência à ampicilina foi designado pUC12/URA3. Os plasmideos pDP91 e pUC12/URA3 foram ambos digeridos com Saci e BamHI resultando em dois fragmentos de cada. Os fragmentos de DNA foram misturados e ligados e usados para transformar células competentes E. coli JM109. As células foram semeadas em placas de agar LB suplementado com 100 μg/ml de ampicilina, 30 pg/ml de XGal e 7 gg/ml de IPTG .
Foram cultivadas 12 colónias bran cas resistentes à ampicilina. 0 DNA de plasmideo foi analisado por digestão com HindIII e PvuII. Um único clone referido como pDP92, compreendendo a sequência completa de dois-micron profici
-31ente para todas as suas funções conhecidas e o gene URA3 clona do no vector pUC.
b} dlonagem de cassetes de expressão da hirudina em pDP92
Por analogia com o Exemplo 5 pDP92 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos foram preenchidos numa reacção com DNA polimerase Klanow. 0 DNA foi ainda cortado com Sall. 0 fragmento vector de 10,2 kb foi isolado. 0 fragmento Sall-^Hindlll}/extremo cego de 1,1 kb do plasmideo pJDB207/ /GAPFL-YHIR foi isolado e ligado ao fragmento vector.
colónias transformadas resistentes à ampicilina foram analisa das. 0 DNA de plasmideo foi digerido com BamHI, PstI e Sall/ /BamHI. Um clone com os fragmentos de restrição esperados foi seleccionado e referido como pDP92/GAPFL-YHIR. De modo semelhan te o plasmideo pDP92/GAPEL-YHIR foi obtido usando o fragmento SalI-[hindiIi)/extremo cerse de 1,2 kb do pJDB207/GAPEL-YHIR (ver Exemplo 2) plasmideo pDP92/PH05(-173)-YHIR foi construído como descrito no Exemplo 5 usando o fragmento Sall-[BamHl]/extremo cerse de 10,2 kb do vector pDP92. (ver atrás).
Exemplo 8: Construção de estripes hospedeiras de Saccharomyces cerevisiae sem DNA de dois-micron
Para remover o plasmideo endógeno dois-micron, num primeiro passo introduziu-se uma deleção no ge ne URA3 da estirpe HT246 (DSM 4084; , /eu 2-3, leu 2-112, prb) para tornar a estirpe auxotrófica para o uracilo. HT246 foi transformada com 1 μ g do plasmideo YEpl3 03r o a c h, J.R., S t r athern, J.N., Hicks, J.B. (1979) Gene 8, 121-12 3} usando o proto colo de transformação descrito por Hinnen et a1. [Proc. Natl . Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)}. 10 μ g do plasmideo pUC12ura3 contando uma deleção no gene URA3 [Sengstag, Ch., Hinnen, A.,
Nucleic Acids Research 15, 233-246 (1987)J foram adicionados juntamente com o plasmideo YEpl3. Sensivelmente 3000 transformantes prototróficos para leucina foram ressuspensos em 5 ml de meio mínimo (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos a que se adicionou 2% de glucose, 0,1% de leucina, 0,1% de uracilo e 0,25% de ácido fluoroorótico) num pequeno frasco de agitação e incubou-se durante 60 horas a 30°C e 180 rpm. Os transformantes que cresceram são resistentes ao análogo tóxico ácido fluorooró tico e possuem portanto uma substituição no gene URA3 cromossómico por ura3 . As células crescidas foram semeadas em meio completo composto por (g/1): Petona 20, extracto de levedura 10 glucose 20 e após crescimento durante 48 horas a 30°C foram transferidas para meio mínimo de base azotada de leveduras (Difco) sem aminoácidos; suplementado com 2% de glucose e 0,1% de leucina) para detectar auxotróficos para uracilo. Vários auxotróficos foram repicados e testados quanto à perda do plasmídeo YEpl3 conferindo auxotrofia para leucina. Uma colónia individual (designada Tr889) requerendo leucina e uracilo foi repicada e usada em experiências subsequentes.
Tr889 foi transformada com o plasmideo pDP38 [^obtido a partir do plasmideo pDP34 por digestão com Sphl e religação do fragmen to resultante de 8,4 kb; ver Fig. 3], que é portador de ambos os genes marcadores LEU2 e URA3 (protocolo de transformação, su pra). As células de levedura transformadas foram primeiro selec cionadas em placas de meio mínimo para leveduras deficiente em uracilo, suplementado com leucina e depois transferidas para meio mínimo deficiente em leucina e suplementado com uracilo.
colónias de crescimento semanal· foram repicadas e cultivadas individualmente em meio líquido completo (supra) durante cerca de cem gerações. Ao fazer-se isto as células perdem o plasmideo pDP38 e, até uma certa percentagem, simultaneamente também o plasmideo endógeno dois-micron. 10 colónias requerendo uracilo leucina foram repicadas, o DNA foi preparado, o DNA foi digerido totalmente com PstI e despistado com DNA de dois-micron de levedura marcado com P em transferências Southern. Um isolado
-33sem qualquer sinal de hibridação foi designado H449 (a, leu2-112, ura3 , prb, cir°), um derivado isogénico da estirpe de levedura HT246 sem dois-micron (cir ).
Exemplo 9: A cassete de expressão da hirudina no plasmideo pDP96 pDP96 foi construido como alternativa a pDP92. A diferença essen ciai na construção de pDP96 é a utilização do sítio único SnaBI no círculo de dois-micron para clonagem em comparação com o sítio Hpal em pDP92. Em pDP96 todas as grelhas de leitura abertas do círculo de dois-micron, incluindo a grelha de leitura D, estão intactas. Assim, o vector deverá ser proficiente para todas as funções conhecidas de dois-micron.
a) Construção do plasmideo pDP96 plasmideo pDP31 (Exemplo 4) foi digerido com PstI e SnaBI resultando em três fragmentos. 0 pias mídeo pK19 ^conferindo resistência à canamicina; Pridmore, R.D., Gene 56 (1987) 309-312] foi linearizado com Smal. Os fragmentos de DNA de ambas as digestões foram extraídos com fenol e precipitados com etanol. Os fragmentos de DNA foram misturados e ligados. A mistura de ligação foi usada para transformar [Hanahan, D. J., Mol. Biol. 166 (1983) 557-580J células competentes ΕΛ coii JM109 CYanisch-Perron, C. et al., Gene 33 (1985) 103-119^, expressas durante 2 h a 37°C em meio LB e depois semeada em pia cas de agar LB suplementado com 50 μg/ml de canamicina, 30 pg/ml de XGal e 7 gg/ml de IPTG.
Cultivaram-se 12 colónias brancas resistentes à canamicina. 0 DNA de plasmideo foi analisado por digestão com Xbal e BamHI/Kpnl. Um clone isolado gene tinha per dido parte do vector pUC19 do pDP31, restaurou a grelha de leitura D do dois-micron por religação do sítio PstI e que tinha o extremo cerse do plasmideo pK19 inserido no sítio SnaBI foi designado pDP95. 0 plasmideo contem o fragmentos grande SnaBI-PstI
-34e pequeno PstI-SnaBI do plasmideo dois-micron clonados no sítio Smal de pK19. Por religação dos sítios PstI a grelha de leitura D é reconstituída.
plasmideo pUC18/URA3 consiste no gene URA3 de 1,17 kb de levedura (fragmento HindIII) clonado no sítio HindIII do vector pUC18 de coli com o gene URA3 inserido na orientação oposta ao gene de resistência à ampicilina. pUC18/URA3 foi parcialmente digerido com a enzima de restrição HindIII na presença de 50 μg/ml de brometo de etídio durante 1 h a 37°C. A adição de brometo de etídio à digestão permite que um primeiro sítio seja digerido com HindIII, mas a subsequente intercalação do brometo de etídio no DNA linearizado interfere com a digestão do segundo sítio originando assim um enriquecimen to em DNA de plasmideo linearizado. A enzima de restrição e o brometo de etídio foram removidos por duas extracções consecutivas com fenol e o DNA foi precipitado com etanol. Este DNA foi então tratado com o fragmento grande da DNA-polimerase (enzima Klenow) para preencher os extremos protuberantes 5' dos sítios HindIII. Este DNA com os extremos reparados migron num gel de agarose para separar os vários fragmentos incluindo o DNA linear com extremos reparados. 0 DNA linear pUC18/URA3 de 3,35 kb foi removido do gel e electroeluído. Este DNA foi então auto-lq gado com DNA-ligase de T4, usado para transformar células competentes de Ecoli JM109 e semeado em placas YT suplementadas com 50 μg/ml de ampicilina. As colónias foram despistadas como atrás para identificar o plasmideo D onde o sítio HindIII no lado do arranjo de pUC com adaptador do gene URA3 foi reparado no extremo criando um novo sítio de restrição único N h e 1^. 0 pias mídeo D foi digerido totalmente com a enzima de restrição HindIII e os extremos protuberantes 5' foram preenchidos numa reacção com DNA-polimerase Klenow. Este DNA foi então misturado com um grande excesso de adaptadores Notl (GCGGCCGC), ligado com DNA-ligase de T4, usando para transformar células competentes JM109 e semeando em placas YT suplementadas com 50 μg/ml· de ampicilina. As colónias foram despistadas como atrás e identifica
-35do o plasmideo E, onde o sítio HindIII foi reparado no extremo e um adaptador Notl adicionado. 0 plasmideo E foi digerido com a enzima de restrição Saci e os extremos protuberantes 3' foram reparados com DNA polimerase de T4. 0 DNA foi então mistu rado com um grande excesso de adaptadores Notl e ligado com DNA-ligase de T4. Esta mistura de ligação foi usada para transformar células competentes E. coli JM109 e semeada em placas YT suplementadas com 50 μδ/ιηΐ de ampicilina. As colónias foram des pistadas como atrás e identificado o plasmideo pUC18/URA3-N, onde as sequências pUC18 estão agora delimitadas por sítios de restrição Notl (os plasmideos D e E são apenas intermediári os na construção de pUC18/URA3-N).
Os plasmideos pDP95 e pUC18/URA3-N foram ambos digeridos com Kpnl e BamHI resultando em dois fragmentos cada um. Os fragmentos de DNA foram misturados e ligados e usados para transformar células competentes E^ coli JM109. As células foram semeadas em placas de agar LB suplementado com 100 μg/ml de ampicilina, 30 μg/ml de XGal e 7 μg/ml de IPTG.
Cultivaram-se 12 colónias brancas resistentes à ampicilina. 0 DNA de plasmideo foi analisado por digestões com HindIII e PvuII. Um clone isolado foi referido co mo pDP96, compreendendo a sequência completa de dois-micron pro ficiente para todas as suas funções conhecidas e o gene URA3 clonado no vector pUC (ver Fig. 7).
b) Çlonagen_das cassetes de expressão da hirudina em pDP96
Por analogia com o Exemplo 5 pDP96 foi digerido com BamHI. Os extremos coesivos foram preenchidos numa reacção com DNA-polimerase Klenow. 0 DNA foi ainda cortado com Sall. 0 fragmento vector de 10,2 kb foi isolado. 0 fragmento Sall-QlindIIlj/extremo cego de 1,1 kb do plasmideo pJDB207/ /GAPFL-YHIR foi isolado e ligado ao fragmento vector.
-36Analisaram-se 6 colónias transfor nadas resistentes à ampicilina. 0 DNA do plasmideo foi digerido com BamHI, PstI e SalI/BamHI. Um clone com os fragmentos de res trição esperados foi seleccionado e referido como pDP96/GAPFL-YHIR. De modo semelhante o plasmideo pDP96/GAPEL-YHIR foi obt_i do usando o fragmento Sall-[(HindIIlj/extremo cerse de 1,2 kb do pJDB207/GAPEL-YHIR (ver Exemplo 2).
plasmideo pDP96/PH05(-173)-YHIR foi construído como descrito no Exemplo 5 usando o fragmento Sall-[BamHlJ/extremo cerse de 10,2 kb do vector pDP96 (ver atrás)
Exemplo 10: Transformação de S. cerevisiae estirpe H449
Saccharomyces cerevisiae estirpe H449 foi transformada com os plasmídeos
PDP34/PH05(-173)-HIR pDP34/GAPFL-HIR pDP34/GAPEL-HIR pDP34/PHO5(-173)-YHIR
PDP34/GAPFL-YHIR
PDP34/GAPEL-YHIR pDP92/PHO5(-173)-YHIR
PDP92/GAPFL-YHIR pDP92/GAPEL-YHIR pDP96/GAPFL-YHIR pDP96/GAPEL-YHIR pDP96/PHO5(-173)—YHIR usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et a_l (supra). As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas de meio mínimo para levedura suplementados com leucina e deficientes em uracilo. Células de levedura transformadas singulares foram isoladas e referidas como
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevi s i ae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
Saccharomyces | cerevisiae |
H449/pDP34/PH05(-173)-HIR H449/pDP34/GAPFL-HIR H449/pDP34/GAPEL-HIR H449/pDP34/PHO5(-173)—YHIR H449/pDP34/GAPFL-YHIR H449/pDP34/GAPEL-YHIR H449/pDP92/PH05(—173)-YHIR H449/pDP92/GAPFL-YHIR H449/pDP92/GAPEL-YHIR H449/pDP96/GAPFL-YHIR H449/pDP96/GAPEL-YHIR H449/pDP96/PH05(-173)-YHIR
Exemplo 11: Fermentação de estirpes de levedura transformadas numa escala laboratorial
Células de Saccharomyces_cerevsiae H449/pDP34/ΡH05(—173)—YHIR e de Saccharomyces cerevisiae H449/pDP34/GAPFL-YHIR foram cultivadas individualmente em duas preculturas subsequentes de 10 ml de meio mínimo composto por (g/1):
Difco Yeast Nitrogen Base 6,7 asparagina 10 leucina 1 glucose 20
A primeira precultura foi cultiva da durante 60 horas a 28°C e 180 r.p.m, A segunda precultura foi inoculada com 2% da primeira precultura e incubada durante 24 h a 28°C e 180 r.p.m.
meio de cultura principal é composto por (g/1):
extracto de levedura 49
glucose | 5 |
f rutose | 57 |
nh4no3 | 0,5 |
MgS04 x 7 H20 | 1,0 |
CaCO3 | 5,0 |
Wz | 2,0 |
A cultura principal foi inoculada com cerca de 2 χ 10θ células/ml e incubada até 72 h a 28°C e 9
180 r.p.m. No fim da fermentação obteve-se cerca de 1 x 10 células/ml. A vários tempos durante a fermentação retiraram-se amostras das culturas, as células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante da cultura analisado relativamente à des sulfato-hirudina por HPLC (infra).
Exemplo 12: Produção da variante HV1 de dessulfato-hirudina numa escala de 50 1
Um banco de células da estirpe de Saccharomyces cerevisiae H449/pDP34/GAPFL-YHIR sem 2 μ foi usado como fonte de inoculo para a produção de dessulfato-hirudina numa escala de 50 1.
As ampolas do banco de células fo ram preservadas na fase de vapor de um contentor de azoto liqui do. 0 contendo de uma ampola foi usado para inocular uma cultura em frasco de agitação compreendendo um meio selectivo consis tindo em (g/1)
base azotada | de | leveduras | 8,4 |
mono-hidrato | de | L-asparagina | 11,4 |
L-histidina | 1,0 | ||
L-leucina | 0, 1 | ||
mono-hidrato | de | D-glucose | 20,0 |
-390 frasco de 500 ml continha 100 ml de meio e foi incubado durante 48 horas a 28°C num agitador orbi tal a uma velocidade de agitação de 180 rev/min.
A segunda precultura em frasco de agitação foi feita no mesmo meio do qual 600 ml estavam num fras co de 2 1 com quatro anti-vortexes. 0 nível do inoculo da primei ra precultura foi de 5% (30 ml) e os frascos foram incubados durante 48 horas a 28°C num agitador orbital a uma velocidade de 120 rev/min.
Uma terceira precultura foi fermen tada num bio-reactor de 50 1 em aço inoxidável equipado com 4 anti-vortexes e um agitador de turbina de disco único com um diâ metro de 115 mm. 0 meio acima foi também usado para esta cultura, o volume de partida sendo de 30 1. Um único frasco de 2 1 contendo 600 ml de cultura foi usado para inocular o reactor de 50 1 (2%). A fermentação dura cerca de 42 h a uma temperatura de 28°C. A velocidade de agitação foi de 600 rev/min, a velocida de de arejamento 1 vvm e o reactor funcionou com uma sobrepressão de 0,3 bar.
Um bio-reactor semelhante de 50 1, adicionalmente equipado para processos de alimentação foi usado na fase de produção de dessulfato-hirudina. Um meio consistindo em (g/1) peptona de carne (Merck) 5,0 extracto de levedura 30,0 sulfato de amónio 6,0 hepta-hidrato de sulfato de magnésio 1,0 cloreto de sódio 0,1 di-hidrogenofosfato de potássio 1,0 mono-hidrato de D-glucose 10,0 foi usado nesta fase (30 1). 0 volume de inoculo da terceira fa se de precultura é facultativamente 2%. A fermentação dura 48 h
-40a uma temperatura de 28°C e a velocidade do agitador é regulada para 750 rev/min. A sobrepressão é inicialmente regulada para 0,3 bar, mas isto pode ser aumentado para 1,0 bar no decurso da fermentação para manter a tensão do oxigénio dissolvido acima de 20% de saturação. 0 fluxo de ar inicial foi de 0,25 vvm mas este foi aumentado para 1 vvm após nove horas para assegurar um fornecimento de oxigénio adequado.
valor do pH decai durante a par te inicial da fermentação para um valor de 5,0 o qual é mantido através do fornecimento automático de hidróxido de amónio.
Na cultura simples em batch o nível da biomassa atingido e, consequentemente o título de dessulf ato-hi rud i na , está dependente da quantidade da fonte de car bono que é lançada para o fermentador no começo. Isto por sua vez ê ditado pela capacidade de transferência de oxigénio do bio-reactor e pela necessidade de evitar a produção excessiva de etanol pela levedura em crescimento. Estas limitações podem ser ultrapassadas usando tecnologia de alimentação em batch. As sim muito pouca glucose é incluida no meio inicial mas faz-se uma alimentação com glucose para suportar uma concentração de biomassa final considerávelmente mais alta e um título de dessulf ato-hi rudi na de aproximadamente três vezes o atingido na cultura em batch. Na prática a alimentação é aumentada em intervalos de modo gradual para uma velocidade final de alimentação de 175 g/h de mono-hidrato de glucose.
Quando necessário, para controlar a espuma fizeram-se pequenas adições de um anti-espumante basea do em silicone. Uma porção do gás que sai do fermentador é analisada para dar informação acerca da tomada de oxigénio e velocidade de libertação de dióxido de carbono. A tensão do oxigénio dissolvido foi medida usando um eléctrodo esterilizável.
Retiraram-se amostras com interva los de 6 horas ao longo do processo para permitir o controle das concentrações de glucose e de etanol, o título de dessulfa-41\
to-hirudina por bio-ensaio e HPLC e também para testar a esteri lidade. No final do processo de fermentação a dessulf ato-hirudi. na pode ser recuperada do sobrenadante de cultura.
Exemplo 13: Análise de compostos de hirudina da fermentação de
S. cerevisiae estirpe H449/pDP34/GAPFL-YHIR sobrenadante do caldo de fermen tação (ver Exemplos 11 e 12) foi de rotina sujeito a análise de HPLC (condições experimentais N2 1, ver abaixo). Os produtos pu rificados foram analisados por meios adicionais, e.g. cromatografia de permuta iónica (IEC) ou coluna Mono-Q (condições expe rimentais N22) e cromatografia de alta resolução de filtração em gel (HPGFC), condições experimentais N23).
Condições experimentais Ν2 1:
Método Cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC) com gradiente
Tipo de coluna:
Nucleosil 100-5 C
-L o (Macherey-Nagel, Duren, FRG)
Tamanho da partícula: 5 μη
Dimensões:
4,0 x 120 mm
Volume da amostra:
μΐ
Proteína aplicada/injecção 2,5-10 pg (50-200 μg/ml)
Fluxo:
Contrapressão Detecção: Eluente A:
1,5 ml/min
- 120-150 bar a 215 nm (atenuação: 6) água (Analyzed HPLC Reagent, BAKER Chemicals, Deventer, Holland) com 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA )
Eluente B:
acetonitrilo (grau de pureza HPLC,
-42Condições de eluição t(min)
30/0
Condições experimentais Ng 2:
Método:
Tipo de coluna:
Dimensões:
Volume de amostra:
Proteína aplicada/injecção: Fluxo:
Contrapressão:
Detecção
Eluente A:
Eluente B:
Condições de eluição:
Fluka) com 0,07% (v/v) de ácido trifluoroacitico (TFA).
%B (v/v)
Cromatografia de permuta iónica (IEC) numa fase estacionária com permutador iónico forte (eluição com gradiente de pH)
Mono-Q (Pharmacia, (Jppsala, Sweden)
5,0 x 50,0 mm 100 μΐ
- 100 μg (250 - 1000 μg/ml) 2,0 ml/min
- 30 - a 280 | 3 5 bar nm (atn. | 5) | |
50 mM | HCOONH , 4 ’ | PH | 4,5 |
50 mM | HCOONH,, 4 | pH | 3,5 |
t(mi n) | %B | (v/v) |
0 | 20 |
5 | 20 |
15 | 75 |
15,1 | 100 |
17,5 | 100 |
17,6 | 20 |
20/0 | 20 |
Condições exper^imentaLs^N.^
Método
Tipo de coluna:
Dimensões:
Volume de amostra:
Proteína aplicada/injecção: Fluxo:
Contrapressão:
Detecção:
Eluente:
Condições do eluente:
Cromatografia de alta resolução de filtração em gel (HPGFC)
Superose 12 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)
10,0 x 300 nm μΐ
- 10 μg (500 - 2000 μg/ml)
0,5 ml/min - 9 bar a 280 nm (atn. 5)
0,1 M NH4COOCH3, pH 5,0 t ( min ) %B ( v/v )
40,1 50/0
100
100
Picos de dessulfato-hirudina recombinante Q= pico 1] , de dessulfato-hirudina (1-64) £= pico 2] , de dessulfato-hirudina (1-63) £= pico 3], das variantes de dessulfato-hirudina B6a |5= pico 4j, B6b 5= pico 5j e B7 [5= pico 6j , da hirudina autêntica derivada da sanguessuga Hirudo medicinalis 5= pico 7] e de dessulfato-hirudina autêntica 5= pico 8; obtida por reacção de hirudina natural Q= pico 7j com a enzima arilsulfatase^ foram colhidos e sujeitos ao teste de inibição da trombina (Chromozym TH como substrato cromogénico) e a um ou mais métodos analíticos (ver condições experimentais atrás). Os resul tados estão resumidos na Tabela 1 que se segue:
Tabela
Pico 8 | 17.4 | Ό £ | 27.2 | LO σ> ι | |||
ο | ΙΩ | ||||||
ο | cn | ♦ | Ο | ||||
ϋ | • | Ό | • | ||||
•Ρ | to | • | ι> | ||||
IX. | ι-H | C | Cd | I | |||
to | |||||||
ο | Ρ | ο | |||||
ο | • | • | « | σι | |||
•Η | to | t> | |||||
α. | Ρ | Ρ | X | ϊ | |||
ΙΟ | |||||||
Ο | to | co | Cd | ο | |||
Ο | • | • | • | ο | |||
•Η | c» | ο | |||||
Λ | γ-Η | Ρ | Cd | ϊ | |||
ο | CO | CM | CM | ο | |||
ο | • | • | • | cn | |||
«Η | ο | ο | 1> | ||||
X | rp | Ρ | Cd | ί | |||
CQ | |||||||
C | |||||||
•Η | ο | lo | C- | cn | ΙΩ | ||
ε | ο | • | • | • | Ρ | ||
•Η | Cd | ιΩ | l> | ||||
X | Ρ | Ρ | Cd | ί | |||
Ο | |||||||
ίΦ | |||||||
σ> | |||||||
β | Cd | ||||||
φ | |||||||
-Ρ | ο | C0 | CJ | ο | |||
φ | α | • | • | • | ΙΩ | ||
£ | •Ρ | ΐΩ | c^» | ||||
φ TJ | CL | Ρ | Ρ | cd | ϊ | ||
ω | ρ—1 | ||||||
ο | C | ο | |||||
ο. | ο | cn | C\) | CM | ο | ||
ε | ο | • | • | • | Ρ | ||
Φ | «Ρ | ω | o | ||||
Ε-ι | X | Ρ | Ρ | Cd | ϊ | ||
φ | |||||||
+> | |||||||
£ | |||||||
φ | Φ | ||||||
•Ρ | ω | ||||||
Ό | o | ||||||
οι | Φ | β | |||||
2 | X | Cr | Φ | ||||
ύθ | 1 | α | φ | ||||
ω | Ο | □ | Ό | ||||
♦Η | * | β | ω | ||||
Φ | ο | Ο | ο | ||||
-Ρ | S | ·. | ίφ | ||||
ω | £ | X | ο | θ’ | φ | ||
φ | α) | X | Ll | •Ρ | £ | ||
ÍO | ε | 1 | ο | Ο | -Q | •Ρ | |
ο | •Η | X | ω | CU | •Ρ | Ο) | |
•Η | β | αζ | ρ | X | β | ε | |
Ό | ω | >s_-x | Χ_χ- | Ρ | ο | ||
£ | α | β | |||||
ο | X | γΡ | CX1 | cn | Η | ||
ο | φ |
Ο
Ό ¢0 £
•Η
Ε
Li
Φ
-Ρ
Φ
Ό
Ο
2CT3 £
Τ3 £
-45Exemp/ο_/4: Caracterização de dessulfato-hirudina recombinante e de outros compostos de hirudina da fermentação de S .__eerevisiae estirpe H449/pDP34/GAPFL-YHIR
Dessulfato-hirudina recombinante de levedura [= pico l] (ver Exemplo 13) da fermentação de S. eerevisiae estirpe H449/pDP34/GAPFL-YHIR foi caracterizada e comparada com os derivados de hirudina dessulfato-hirudina (1-64) [)= pico 2] , dessulfato-hirudina (1-63) [j= pico 3] , varian tes de dessulfato-hirudina B6a [= pico 4] , B6b £= pico 5] e B7 £= pico 6], hirudina autêntica derivada da sanguessuga Hirudo medicinalis []= pico 7] e com dessulfato-hirudina autêntica £= pico 8] .
A) Determinação do peso molecular
a) Peso molecular aparente
Os compostos de hirudina analisados por SDS-PAGE convencional (10 μg de proteína, gel 10 x 15 cm, 15% de polímero) ou num sistema comercial PhastSystem (Phar macia, Uppsala, Sweden) de acordo com as instruções do fabrican te (1 μg de proteína, SDS-PAGE 20% homogéneo). Antes da coloração com azul de Coomassie fez-se fixação com 3% (v/v) de B-mercaptoetanol durante 40 minutos.
Resultados
Observou-se uma única banda para todos os compostos, correspondendo a um peso molecular aparente de cerca de 7000 Daltons. As mobilidades relativas (valores de Rf) estão resumidos na Tabela 2 que se segue:
-46Tabela 2:
r 1 1 1 1 | Mobil idade | 1 1 1 1 1 1 | relativa (valor | Rf) í | |
Pico N9 | i 1 1 1 | SDS-PAGE | 1 1 1 1 | PhastSystem | |
r | 1 ----1-- 1 | 1 X 1 | -----i | ||
J 1 | 1 1 | 1.0 | 1 1 | 1.0 | |
1 2 | 1 1 1 | 1.0 | 1 1 1 | não testado | |
! 3 | 1 1 | 1.0 | 1 1 | não testado | |
I 4 | 1 1 1 | 0.99 | 1 1 | 0.91 | |
! 5 | 1 1 | 0.99 | 1 1 1 | 0.91 | |
1 6 | 1 1 | 1.03 | 1 1 | 1.06 | |
1 7 | 1 1 1 | 1.0 | 1 1 | | não testado | |
J 8 L | 1 1 _ L | 1.0 | 1 1 1 X | 1.0 |
b) Determinação do peso molecular químico por FAB-MS
Os compostos de hirudina foram su jeitos a espectrometria de massa de iões positivos por bombardeamento com átomos rápidos (FAB-MS). Instrumento: Espectómetro de massa ZAB-HF da VG-Analytical Ltd., Manchester; matrix: tioglicerol; bombardeamento com Xenon; energia dos iões 10 KeV; ca libração externa: Cs„rJ_,. (peso molecular: 6887,9) e CsooH„„
6 2 b 2 8 2/ (7147,76).
Resultados
Os resultados estão resumidos e comparados com os valores calculados na Tabela 3 que se segue:
— Δ,Ί —
Tabela 3:
Pico | F ormula | Peso molecular | |
N° | empírica | calculado | encontrado |
1 | H287H440N80°110S6 | 6963.518 | 6963.44 |
2 | H282H432N78°108S6 | 6835.39 | 6832.9 |
3 | H276H421N77°107S6 | 6722.23 | 6719.3 |
4 | não testado | ||
5 | não testado | ||
6 | não testado | 6941 |
Β) Determinação da composição em aminoácidos
0,1-2,0 μg de compostos de hirudina puros foram hidrolisados du rante 24 horas com 6N HC1 a 110°C e depois analisados (método DABS-C1) como descrito por Chang et al ÍMethodo Enzymol. 91 (1983) 41-48; J. Chromatogr. 295 (1984) 193-200].
Resultados
Os resultados resumidos na Tabela 4 foram comparados com os valores calculados e são conforme se esperava:
-48Tabela 4
Aminoácido | Pico 1 | Pico 2 | Pico 3 | |||
calc. | encontrado | calc. | encontrado | calc. | encontrado | |
ALA | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
ARG | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
ASN | 9 | 7.2 | 9 | 10.0 | 9 | 9.2 |
CYS | 6 | 6.0 | 6 | 4.8 | 6 | 5.0 |
GLN | 13 | 13.1 | 12 | 12.5 | 12 | 12.4 |
GLY | 9 | 8.5 | 9 | 8.7 | 9 | 9.0 |
HIS | 3 | 0.9 | 3 | 1.0 | 3 | 1.0 |
ILE | 2 | 2.3 | 2 | 1.9 | 2 | 2.1 |
LEU | 4 | 4.7 | 4 | 3.3 | 3 | 3.3 |
LYS | 3 | 3.3 | 3 | 2.8 | 3 | 3.1 |
MET | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
FHE | 1 | 1.1 | 1 | 1.1 | 1 | 1.2 |
PRO | 3 | 2.8 | 3 | 3.1 | 3 | 3.1 |
SER | 4 | 4.0 | 4 | 4.1 | 4 | 4.0 |
THR | 4 | 3.9 | 4 | 3.9 | 4 | 4.1 |
TRP | 0 | n.d. | 0 | n.d. | 0 | n.d. |
TYR | 2 | 1.9 | 2 | 1.8 | 2 | 1.9 |
VAL | 4 | 3.7 | 4 | 3.1 | 4 | 3.4 |
Total AA | 65 | 64 | 63 |
C ) Análise de sequências
Para a análise da sequência de aminoácidos N-terminal 18 μg (2-3 nMol) dos compostos de hirudi na puros/ou dos fragmentos tripticos) foram sujeitos a uma aná-
lise de sequências convencional de acordo com Edman e Begg [Europ. J. Biochem. 80 (1967)] num sequenciador de proteínas de fa se gasosa (Mod. 470A, Applied Biosystems) e os feni1tio-hidantoina (PTH)-aminoácidos N-terminais foram determinados por meio de RP-HPLC. Para a análise C-terminal os compostos de hirudina foram digeridos com carboxipeptidase Y e os aminoácidos liberta dos foram determinados com analisador de aminoácidos (método DABS-C1, ver atrás).
Resultados
Ciclo
esperado | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp - Cys - | ||
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 1 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys)- |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 2 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys)- |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 3 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys ) - |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 4 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys ) - |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 5 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys)- |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly | ||||
encontrado | pico | 6 | Vai - | Vai - | Tyr - | Thr - | Asp -(Cys)- |
- Thr | - Glu | - Ser | - Gly |
Ciclo | ||||||
esperado | Gin - | Asn - | Leu - Cys — | Leu | - Cys - | |
- Glu | - Gly | - Ser - Asn | ||||
encontrado | pico 1 | Gin - | Asn - | Leu -(Cys ) - | Leu | -(Cys ) - |
- Glu | - Gly | - Ser - Asn | ||||
encontrado | pico 2 | Gin - | Asn - | Leu -(Cys ) - | Leu | -(Cys)- |
- Glu | - Gly | - Ser - Asn |
encontrado pico 3 | Gin - - Asn | Asn - Leu -(Cys)- Glu - Gly - Ser |
encontrado pico 4 | Gin - | Asn - |
encontrado pico 5 | Gin - | Asn - |
encontrado pico 6 | Gin - | Asn - |
Ciclo | ||||||||
esperado | Vai - Cys - | Gly - | Gin - | Gly - | Asn - | Lys | ||
- Cys - Ile | - Leu | |||||||
encontrado | pico | 1 | Vai -(Cys)- | Gly - | Gin - | Gly - | Asn - | Lys |
-(Cys)- Ile | - Leu | |||||||
encontrado | pico | 2 | Vai -(Cys)- | Gly - | Gin - | Gly - | Asn - | Lys |
encontrado | pico | 3 | Val -(Cys)- | Gly - | Gin - | Gly - | Asn - | Lys |
-(Cys)- Ile | - ... | |||||||
Ciclo | ||||||||
esperado | Gly - Ser - | Asp - | Gly - | Glu - | Lys - | Asn | ||
- Gin - Cys | - Vai | |||||||
encontrado | pico | 1 | Gly - Ser - | Asp - | Gly - | Glu - | Lys - | Asn |
Gln -(Cys)- Vai
Ciclo
esperado | Thr - | Gly - | Glu - | Gly | - Thr - | Pro - | Lys | |
- Pro | - Gin | - Ser | ||||||
encontrado | pico 1 | Thr - | Gly - | Glu - | Gly | - Thr - | Pro - | Lys |
- Pro | - Gin | - Ser | ||||||
Ciclo | ||||||||
esperado | His - | Asn - | Asp - | Gly | - Asp - | Phe - | Glu | |
- Glu | - Ile | - Pro | ||||||
encontrado | pico 1 | His - | Asn - | Asp - | Gly | - Asp - | Phe - | Glu |
- Ile | - Pro |
Ciclo
esperado | Glu - Glu | - Tyr - | Leu - Gin | ||
encontrado | pico | 1 | Glu - Glu | - Tyr - | Leu - Gin |
encontrado | pico | 2 | Glu - Glu | - Tyr - | Leu |
encontrado | pico | 3 | Glu - Glu | - Tyr | |
encontrado | pico | 4 | Glu - Glu | - Tyr - | (Leu/Gln) |
encontrado | pico | 5 | Glu - Glu | - Tyr - | (Leu/Gln) |
encontrado | pico | 6 | Glu - Glu | - Tyr - | (Leu/Gln) |
D) Determinação | do | ponto isoeléctrico | (IEP) |
Os compostos de hirudina foram su jeitos ao processo de isoelectrofocagem (IEF) convencional (250 -500 μg, gel Servalyte, pH 3 - 10), à análise por curva de titu lação (3,0 mg/9,3 cm, gel Servalyte, pH 3 - 10) e a cromatofoca gem (ver condições experimentais Ne 4).
Condições experimentais Ng 4:
Método
Tipo de coluna:
Dimensões :
Volume de amostra:
Proteína ap1icada/injecção:
Fluxo :
Contrapressão:
Detecção:
Eluente A:
Eluente B:
Cromatografia de permuta iónica (IEC) numa fase estacionária com permutador catiónico forte (eluição com gradiente de pH)
Mono-P (Pharmacia, Uppsala, Sweden )
5,0 x 200 mm μΐ
250 - 500 4g (5Ό00 - 10Ό00 μg/ /ml )
1,0 ml/min
-15-20 bar a 280 nm (atn. 6)
0,025 M Bis-Tris, pH 6,3
H20/Pharmalyte 2,5-5 (Pharmacia) 50:1, pH 2,48
-52Condições de eluição: t(min) %B (v/v)
0
0
6,1 100
100
36,1 0
0
Determinação do ponto isoeléctrico (IEP): colheram-se picos e o valor de pH das fracções foi determinado com pH metro convencional .
Resultados
Os IEP's resultantes estão resumidos na Tabela 5 e comparados com os valores teoricamente esperados, calculados por um programa de computador.
Pico N° | ponto isoeléctrico (pH) | |||
calculado | detectado por | |||
IEF | Curva de Titulação | Cromato focagem | ||
1 | 3.9 | 3.8-3.9 | 3.9 | 3.8 |
2 | 3.9 | 3.8-3.9 | n. a. | n.a. |
3 | 3.9 | 3.8-3.9 | n. a. | n.a. |
4 | - | 3.9-4.1 | n.a. | n.a. |
5 | - | 3.9-4.1 | n. a. | n.a. |
6 | - | 3.6 | n.a. | n.a. |
7 | 3.9 | 3.7 | n.a. | n.a. |
8 | 3.9 | 3.8 | n.a. | 3.8 |
n.a. : não testado
Conclusões:
Com base aos presentes resultados
- o composto do pico 1, representando o principal produto da biossíntese, é dessulfato-hirudina. É idêntico à dessulfato-hirudina autêntica [= pico 8] preparada a partir da hirudina da sanguessuga H/rudo medicinalis [= pico 7].
- os compostos dos picos 2,3,4, 5 e 6 são compostos de hirudina modificada encontrados durante a biossíntese (picos 2 e 3) e purificação (picos 2 - 6) da dessulfato-hirudina recom binante.
-54- o composto do pico 2 é dessulfato-hirudina (1-64), sem 1 amq noácido no extremo C.
- o composto do pico 3 é dessulfato-hirudina (1-63), sem 2 ami noácidos no extremo C.
- os compostos dos picos 4,5 e 6 são análogos da dessulfato-hirudina biologicamente activos com idêntica composição em aminoácidos, a sequência N-terminal (aminoácidos 1-12) e extre mo C (aminoácidos 61-65).
Exemplo 15: Recuperação da dessulfato-hirudina a partir de S. cerevisiae cultivada numa escala de 50 1.
caldo de cultura foi misturado com Amberlite XAD-7 e sujeito a adsorção durante cerca de 4 horas a 25°C. As células foram separadas da resina numa coluna. Após lavagem com IM NaCl a resina foi eluida com tampão Tris (50 mM, pH 7,0 - 8,5). A fracçâo principal (30 1) foi ajustada a pH 2,9 e foi aplicada numa coluna de Sepharose S (Amicon PA, equilibrada com tampão formiato de amónio 25 mM, pH 2,9) tendo um leito de 2 1. Após lavagem com tampão formiato de amónio (40 mM, pH 3,6) fez-se eluição com tampão for miato de amónio (50 mM, pH 3,8). A principal fracçao eluida (10 1) foi concentrada por meio de um sistema de ultrafiltração Filtron Minisette equipado com uma membrana 3k . Uma amostra de 0,5 1 da solução límpida de proteína resultante foi aplicada numa coluna de Bio-Gel P-6 fine (Amicon GF equilibra do com 0,5% de ácido acético) tendo um leito de 1,5 1. A elui ção foi feita com 0,5% de ácido acético. A principal fracçâo eluida (1 1) foi concentrada por meio de u1trafi1tração e sub sequentemente aplicada a uma coluna de fluxo rápido Q-Sepharo se (Amicon PA, equilibrada com tampão formiato de amónio 25 mM, pH 2,9) tendo um leito de 2 1. A eluição foi feita com tam pão formiato de amónio (50 mM, pH 4,2). A principal fracçâo eluida foi concentrada por meio de ultrafiltração e foi subse quentemente diafiltrada contra água. A solução aquosa límpida
-55resultante foi liofilizada. 0 sólido consiste em dessulfato-hirudina pura.
Depósito de microorganismos
As estirpes de microorganismos que se seguem foram depositadas na Deutsche Sammlung von Mikro organismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D—3300 Braunschweig (datas de depósito e números de acesso dados):
Saccharomyces cerevisiae H449: 18 de Fevereiro, 1988, DSM 4413 Escherichia coli JM109/pDP38: 19 de Fevereiro, 1988, DSM 4414; Escherichia coli JM109/pDP34: 14 de Março, 1988, DSM 4473
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES1®. - Método para a produção de um vector híbrido de levedura compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina consistindo num promotor cons titutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primeira se quência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na gre lha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora da dessulfato-hirudina e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação de transcrição de levedura e (2) o DNA com pleto de dois microns incluindo os genes intactos REP1 , REP2 e FLP, assim como sitios intactos ORI, STB, IR1 e IR2, caracterí. zado por compreender clivagem do DNA do plasmideo de dois microns com uma endonuclease de restrição de modo a que seja man tida a função normal dos genes REP1, REP2 e FLP e dos sítios ORI, STB, IR1 e IR2, a ligação do plasmideo linearizado obtido à cassete de expressão da dessulfato-hirudina e facultativamen te a segmentos de DNA contendo uma ou mais marcas genéticas se lectivas e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteri ano e a recircularização do vector híbrido obtido.
- 2®. - Método de acordo com a rei vindicação 1 caracterizado por o DNA de dois microns incluir adicionalmente um gene D intacto.
- 3®. - Método de acordo com a rei vindicação 1 caracterizado por o promotor constitutivo de leve dura ser seleccionado do grupo constituído por um promotor de um gene codificador de uma enzima glicolitica, promotor ADHI , promotor TRPI e o promotor PHDS que foi desprovido dos seus si tios de activação a montante.-574-. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a primeira sequência de DNA ser seleccionada do grupo constituido por sequência sinal da hirudi_ na, as sequências sinal e prepro dos genes da invertase de leve dura, factor , feromona-peptidase (KEX1), toxina assassina e fosfatase ácida reprimível (PH05) e a sequência sinal da glicoa mi 1 ase de Aspergi_ 1_J-u s awamori .
- 5a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a segunda sequência de DNA codificar um composto de dessulfato-hirudina seleccionado do grupo constituido por variantes da dessulfato-hirudina HV1, HV2, HV2 (modificada), PA e des(Val^)-dessulfato-hirudina.
- 6a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura com preender uma ou mais marcas genéticas selectivas para levedura.
- 7a. - Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o vector híbrido de levedura com preender uma marca genética selectiva e uma origem de replicação para um hospedeiro bacteriano.
- 8a. - Método para a produção de uma estirpe de levedura que é desprovida do DNA endógeno de doi microns e foi transformada com um vector híbrido compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hirudina consistindo num promotor constitutivo de levedura operacionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudina e uma sequência de-58DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e (2) o DNA completo de dois microns incluindo os genes intactos REP1, REP2 e FLP, assim como sítios intactos ORI, STB, IR1 e IR2, caracterizado por compreender a transformação de uma esir pe de levedura que não possui os plasmideos endógenos de dois microns com o referido vector.
- 9a. - Método de acordo com a rey vindicação 8 caracterizado por a estirpe de levedura ser uma estirpe de Sacc haromyces_cerevisiae.
- 10a. - Método de acordo com a rey vindicação 8 caracterizado por compreender a transformação da referida estirpe de levedura com um vector hibrido obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
- 11a. - Método para a produção de compostos de dessulfato-hirudina caracterizado por compreender cultura de uma estirpe de levedura que não possui o DNA endóge no de dois microns e que foi transformada com um vector híbrido compreendendo (1) uma cassete de expressão da dessulfato-hy rudina consistindo num promotor constitutivo de levedura opera cionalmente ligado a uma primeira sequência de DNA codificadora de um peptideo sinal ligado na grelha de leitura correcta a uma segunda sequência de DNA codificadora de uma dessulfato-hirudy na e uma sequência de DNA contendo sinais de terminação da transcrição de levedura e (2) o DNA completo de dois microns incluindo os genes intactos REP1, REP2 e FLP, assim como sítios intactos ORI, STB, IR1 e IR2, e o isolamento das referidas dessulf ato-hirudinas e, caso se pretenda a separação de uma mistura de compostos de dessulfato-hirudina obtida nos componentes-59individuais.
- 125. - Método de acordo com a rei vindicação 11 caracterizado por se preparar um composto de dessulfato-hirudina seleccionado do grupo constituído por variantes da dessulfato-hirudina HV1, HV2, HV2(modificado), PA e des(Val^)-dessulfato-hirudina.
- 135. - Método de acordo com a rei vindicação 11 caracterizado por se preparar a variante de dessulf ato-hirudina HV1.
- 145. - Método de acordo com a rei vindicação 11 caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe de levedura obtida de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10.-6015 ã . - Método de acordo com a rei vindicação 11 caracterizado por a estirpe de levedura ter sido transformada com um vector híbrido obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
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FG3A | Patent granted, date of granting |
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