DD298055A5

DD298055A5 - Methode und nuetzlicher apparat zur darstellung pharmazeutischer zusammensetzungen

Info

Publication number: DD298055A5
Application number: DD90344026A
Authority: DD
Inventors: R Alan Hardwick; William C Lake; Alan K Smith; Dennis Chenoweth
Original assignee: ��@��@��Kk��
Priority date: 1989-09-14
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1992-02-06
Also published as: IE903354A1; JPH05500512A; CA2067158A1; PL286914A1; WO1991004059A3; US5336760A; WO1991004059A2; EP0491858A1

Abstract

Eine Methode und eine geeignete Apparatur zur Darstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die einen Komplex aus einer Antigenkomponente und der entsprechenden Antikoerperkomponente in einem pharmazeutisch vertraeglichen Traeger umfaszt.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Geräte und Methoden ihrer Anwendung zur Darstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, bestehend aus einem Komplex einer Antigenkomponente und dem entsprechenden Antikörper oder Inhibitorkomponente in einom pharmakologisch verträglichen Träger. Spezioll betrifft die Erfindung ein Gerät und eine Methode ihrer Anwendung zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch selektive Isolierung einer Komponente vom Antikörpertyp aus einer physiologischen Flüssigkeit wie Blut, Plasma oder anderer Körperflüssigkeit in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, zu dem die Verbindung vom Antigentyp gegeben werder kann.

Pharmazeutische Zusammensetzungen mit Antikörper/Antigen-Komplex wurden für zahlreiche medizinische-Anwendungen vorgeschlagen. Zum Beispiel offenbart das US-Pa>ent Nr.4.740.371, erteilt an St. Remy et al. am 26. April 1988, einen zur Allergie-Behandlung geeigneten Komplex. Dieser Komplex umschließt das spezifische Allergen, das die allergische Reaktion verursacht, und den besprechenden Antikörper für dieses Allergen. Während die Antikörper abgeleitet werden können entweder aus physiologischen Flüssigkeiten des Patienten oder eines Spenders, wird der bevorzugte Antikörper aus den Körperflüssigkeiten des Patienten gewonnen. Die Injektion dieses Komplexes reduziert, und eliminiert auch, die allergische Reaktion des Patienten auf ein spezifisches Allergen, wobei es keine Nebenwirkungen besitzt, die die konventionellen Allergie-Behandlungen begleiten.

Ein weiterer Antikörper/Antigen-Kcmplex wird in der entsprechenden US-Patent-Anmeldung 255.360, angemeldet am 11.Oktober 1988, angegeben. Diese Anmeldung offenbart einen Komplex, zusammengesetzt aus Faktor VIII und einem Antikörper, genannt Faktor Vlll-Inhibitor. Dieser Komplex wird verwendet zur Behandlung von Hämophylien, die sich als Folge der Injektion von Faktor VIII gebildet hatten. Die betreffenden Individuen produzieren als Antikörper einen Faktor Vlll-Inhibitor, der sich mit dem Faktor VIII verbindet und ihn inaktiv macht. So wirkt der Faktor VIII als Antigen, während der Anti-Faktor VIII als der Antikörper fungiert. Es wurde gezeigt, daß die Injektion des Faktor Vlll-Antigen/Inhibitor-Komplexes bei manchen Patienter den Widerstand gegen Faktor VW-Injektionen verringert.

Die Antigen/Antikörper-Komplexe, angegeben bei St. Remy et al. und der entsprechenden Anmeldung, benutze ι vorzugsweise die Antikörper aus den patienteneigenen Körperflüssigkeiten. Das ist bemerkenswert, nicht nur, weil sie jede poteUielle Reaktion auf einen Antikörper eliminieren, der von einem nicht-identischen Spender stammt, wichtiger ist, daß autologe A itikörper am effektivsten bei der Einleitung der Therapie selbst sind. Die bisher verfügbaren Methoden, wie sie von St. Remy et al. und der entsprechenden Anmeldung gelehrt werden, zur Extraktion von Antikörpern erfordern eine sorgfältige chemische Isolierung der Antikörper aus der Körperflüssigkeit des Patienten wie Blut. Zum Beispiel offenbaren St. Remy et al. die Isolierung der gewünschten Antikörper IgG, IgM, IgA, IgE und IgD durch eine komplexe Reihe von Schritten wie Fällung, Dialyse, Konzentrierung, Chromatographie und Immunoadsorption.

So können pharmazeutische Zusammensetzungen mit Antigen/Antikörper-Komplexen wirksam bei der Behandlung gewisser Krankheiten und Bedingungen sein, die Methoden der Isolierung der gewünschten Antikörper sind komplex und zeitraubend. Es ist deshalb wünschenswert, einen Mechanismus zu liefern zur leichten Darstellung pharmazeutischer Antikörper/Antigen-Komplexe.

Neuere Fortschritte bei der Separierungstechnologie haben zur Isolierung einer spezifischen Zielpopulation, zum Beispiel Zellen, Proteinen oder Antikörpern geführt ohne die Notwendigkeit langwieriger und teurer chemischer Trenntechniken. Zum Beispiel haben verschiedene Forscher ein Abfangen spezifischer Zielpopulationen durch Verwendung von Filtern, die immunoreaktive Gruppen tragen, vorgeschlagen. Immunoreaktive Gruppen sind jene, an die sich der gewünschte Antikörper selektiv bindet, typischerweise das Antigen. Diese Techniken umfassen Filter, dargestellt aus Fasern, die immunoreaktive Gruppen tragen, US-Patent 3.843.324, erteilt am 22.Oktober 1974; Säulen, die immunoreaktive Gruppen tragen, l'S-Patent 4.252.655, erteilt am 24. Februar 1981; und Filterkerzen, die immunoreaktive Gruppen tragen, US-Patent Nr.4.64R °/ ;, erteilt am 10. März 1987. Eine weitere kürzlich entwickelte Technik zur Isolierung von Zielpopulationen, zum Beispiel An., .orpern, ausgewählten Proteinen und Zellen, aus einer physiologischen Flüssigkeit verwendet paramagnetische Kugeln oder Partikel, überzogen mit einer immunoreaktiven Verbindung oder Agena, die selektiv für die gewünschte Zielpopulation sind. Beispiele solcher Partikel oder Kugeln werden offenbart in den US-Patenten Nr.4.230.685, erteilt am 28. Oktober 1980; 4.554.088, erteilt am 19. November 1985; und 4.628.037, erteilt am 9. Dezember 1986. Die Verwendung solcher Partikel bei der Zelltrennung wirri gezeigt in Veröffentlichungen wie „Entfernung von Neuroplastoma-Zellen aus Knochenmark mit monoclonalei Antikörpern mit magnetischen Mikrokugeln", von J.G.Treleaven, J.Ugelstad, T.Philipa, F. M.Gibson, A.Rembaum, (J.D.Cainea und J.T.Kemshead, The Lancet, 14. Januar 1984, S.70-73 und „Immunomagnetische Entfernung B-Lymphoma-Zellen aus menschlichem Knochenmark: Ein Verfahren zur klinischen Verwendung" von G. Kvalheim, O. Sorensen, O. Fodstad, S. Funderud, S.Kiesel, B. Dorken, K. Nustad, E. Jacobsen, J. Ugelstad und A. Pihl, Bone Marrow Transplantation, (\988), Band 3, S.31-41. Andere Referenzen, die Geräte und Methoden der Isolierung spezifischer Zielpopulation offenbaren, s!nd die US-Patente 3.970.518 und 4.018.886, beide erteilt an Giaever am 20. Juli 1976 bzw. 19. April 1977,4.219.411, erteilt an Yen et al. am 26.August 1980, und 4.710.472, erteilt an Säur et al. am I.Dezember 1987. Sowohl Yen et al. als auch Säur et al. offenbaron komplizierte Geräte zur Mischung einer physiologischen Flüssigkeit mit immunoreaktiven Partikeln. Diese immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel sind mit einem für die Zielpopulation spezifischen Mittel überzogen, das heißt, es bindet selektiv

Zellularvertreter der Zielpopulation oder chemische Verbindungen. Diese paramagnetischen Partikel werden anschließend durch ein Magnetfeld festgehalten, während die Flüssigkeit entfernt wird.

Die Qiaever-Patente offenbaren Geräte und Methoden zur Isolierung der ausgewählten Population der Zellen aus einer physiologischen Flüssigkeit unter Verwendung der immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel. Die immunoreaktiven Partikel und die physiologische Flüssigkeit werden in einem Gefäß gemischt. Wenn das immunoreaktive Mittel, zum Beispiel Antikörperschicht, 'ich mit den Zellen der Zielpopulation oder der chemischen Verbindung verbunden hat, werden die Partikel durch Aktivieren einer Magnetspule von der Flüssigkeit getrennt (Festhalten und Immobilisieren der Partikel und Öffnen eines Ventils zum Ablassen der Flüssigkeit aus dem Gefäß). Die immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel werden dann in ein anderes Gefäß übergeführt, das ein Reinigungsmittel enthält. Dieses Reinigungsmittel begünstigt die Freisetzung der ausgewählten Zielpopulation von den beschichteten, paramagnetischen Partikeln.

Die oben diskutierten Verfahren und Apparate gestatten die Trennung einer Zielpopulation, entweder Zellen, Proteine oder Antikörper, aus einer physiologischen Flüssigkeit. Die Verfahren, in denen diese Methoden verwendet werden, sind normalerweise jene, in doncn es gewünscht wird, dio Zielpopulation vor der Rückkehr der Flüssigkeit zum Patienten zu isolieren. Das obige Verfahren ist zum Beispiel geeignet zur tntfernung infizierter oder Turnorzellen aus einem speziellon Gewebe, zum Beispiel Knochenmark. Der Hauptnachteil der beschriebenen Verfahren und Apparaturen ist die Komplexität des verwendeten Verfahrens oder Apparates odor dio Unfähigkeit der vollständigen Abtrennung der Zielpopulation vom Rückstand der physiologischen Flüssigkeit. Das heißt, die offenbarten Verfahren und Apparate sind nicht auf die vollständige Entfernung des Großteils der physiologischen Flüssigkeit gerichtet, sondern Hauptzweck ist die Entfernung der Zielpopulation. So verbleiben die Risiken einer gewissen Verunreinigung der Zielpopulation mit Fremdzellen oder -verbindungen aus der Flüssigkeit, Weiter haben diese Verfahren und Apparate den Nachteil, daß sie einer Vielzahl von Behältern zur Durchführung der Isolierung bedürfen, wie bei Giaever et al. beschrieben, oder eine genaue Kenntnis der Verfahren erfordern, um eine Vorbeugung der Verunreinigung des Finalproduktes zu sichern. Es bleibt somit wünschenswert. Methode und Apparat zu liefern, die die Handhabung und Isolierung einer Zielpopulation, und speziell eines Antikörpers für Zwecke der leichten und sicheren Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erleichtern.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die obenbeschriebenen Nachteile durch Lieferung einer Methode und eines zweckmäßigen Apparates zur Darstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen mit einem Komplex einer Antigen-Komponente und der entsprechenden Antikörper-Komponente in einem pharmakologisch verträglichen Träger.

Das Verfahren der Erfindung wird ausgeführt durch Isolieren des ausgewählten Antigen-Komponente/Antiköiper-Komponente-Komplexes in einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer Kammer.

Allgemein umfaßt das Verfahren der Erfindung die Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus einer speziellen Zielantikörperkomponenten-Population in einem pharmazeutisch verträglichen Träger aus einer physiologischen Flüssigkeit in einer Kammer mit mindestens je einem Einlaß und Auslaß und besteht

in dem In-Kontakt-Bringen der physiologischen Flüssigkeit mit einem festen Träger, der eine Antigen-Komponente trägt, die selektiv für die Zielantikörperkomponenten-Population ist;

Entfernen der physiologischen Flüssigkeit aus der Kammer;

Waschen der Kammer mit einer verträglichen Waschflüssigkeit;

Ablassen der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

Einbringen einer pharmazeutisch verträglichen Elotionslösung in die Kammer und Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer.

Zusätzlich betrifft die Erfindung einen verfügbaren, aseptischen Flüssigkeitsverarbeitungsweg zur Einzelnutzung, der benutzt werden kann, um eine vorbestimmte Menge uines Antigen-spezifischen Antikörpers aus der physiologischen Flüssigkeit eines Patienten, zu erhalten, um Allergie- oder Autoimmunerkrankungen durch Immunisierung mit autologen oder homologen Antigen/Antikörper-Immunkomplexen zu behandeln.

Zusätzlich betrifft diese Erfindung eine Methode zur Erhaltung einer vorbestimmten Menge eines Allergen-spezifischen Antikörpers aus physiologischer Flüssigkeit, um den Verlauf der immunotherapeutischen Behandlung einer allergischen Reaktion auf das spezifische Allergen zu leiten, bestehend aus

Zugabe einer ausreichenden Menge einer physiologischen Flüssigkeit und einer ausreichenden Zahl allergen-beschichteter Partikel, um eine vorbestimmte Menge Allergen-spezifischer Antikörper zu binden, zu einer aseptischen Trennkammer; Inkubation der genannten Flüssigkeit und der Allergen-beschichteten Partikel für einen ausreichenden Zeitraum, um die Allergenspezifischen Antikörper an die Allergen-beschichteten Partikel in der Kammer zu binden; Mittel zur Trennung der Allergen-spezifischen Antikörper, die an die Allergen-beschichteten Partikel gebunden sind, von der nicht gebundenen Flüssigkeit;

Mittel zur Trennung der genannten Allergen-spezifischen Antikörper, die an die Allergen-beschichteten Partikel gebunden sind, von der nicht gebundenen Flüssigkeit;

Entfernung der nicht gebundenen Flüssigkeit aus der Kammer;

Waschen der Allergen-beschichteten Partikel zur Entfernung nichtspezifisch adsorbierten Materials in der Kammer; Zugabe einer Menge einer physiologisch verträglichen Elutionslösung zur Ellison der Allergen-spezifischen Antikörper von den Allergen-beschichteten Partikeln, aber weniger als die Menge der Elutionslösung, um eine Konzentration der zurückgewonnenen Allergen-spezifischen Antikörper zu erfordern;

Inkubation des Allergen-spezifischen Antikörpers, gebunden an die Allergen-beschichteten Partikel, mit der Elutionslösung für einen ausreichenden Zeitraum, um den Allergen-spezifischen Antikörper von dem Allergen-beschichteten Partikel zu eluieren; Mittel zur Trennung des Allergen-spezifischen Antikörpers von den Allergen-beschichteten Partikeln in der Kammer, um eine vorbestimmte Menge des Alle'gen-spezifischen Antikörpers zu erhalten;

Zugabe einer Menge eines physiologisch verträglichen neutralisierenden Puffers zu dem Allergen-spezifischen Antikörper, um eine Lösung zu erhalten, die einen physiologisch verträglichen pH hat, jedoch weniger als eine Menge der neutralisierenden Lösung, die eine Konzentration des Allergen-spezifischen Antikörpers erfordert.

In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Verkörperung der Erfindung bilden paramagnetische Partikol den festen Träge.·, der die Antigen-Komponente trägt, die selektiv für die Antikörperkomponentenzielpopulation ist. Insbesondere umfaßt die Methode der Erfindung die Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung durch Isolierung einer Zielantikörperkomponenten-Population aus einer physiologischen Flüssigkeit in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die Isolierung in einer Kammer ausgeführt wird, die zumindest partiell magnetisch permeabel ist und je einen Ein- und Auslaß hat, bestehend aus Mischen der physiologischen Flüssigkeit und der immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel, die eine Antigen-Komponente tragen, die selektiv für die Zielantikörperkomponenten-Population ist;

Festhalten der Immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel in einem Magnetfeld, um die paramagnetischen Partikel in der Kammer zu halten;

Ablassen der Flüssigkeit aus der Kammer; Zugabe einer Waschflüssigkeit zu der Kammer; Entfernung der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

Zugabe einer pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer und Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer.

Die Erfindung ist auch auf ein Gerät gerichtet zur selektiven Isolierung einer Zielantikörperkomponenten-Population aus einer physiologischen Flüssigkeit gemäß der beschriebenen Methode. Dieses Gerät besteht aus einem Gehäuse, das die Kammer darstellt, die mindestens je einen Ein- und Auslaß hat als Zugang zu der Kammer. Das Gehäuse ist vorzugsweise wenigstens zum Teil aus einem magnetisch permeablen Material gebildet. Das Gerät umfaßt eine Plattform, gegen die sich das Gehäuse lehnt und stützt. Diese Plattform kann entweder in eine im wesentlichen horizontale oder vertikale Position gebracht werden. Die Plattform kann auch einen uder mehrere Magneto umfassen, die neben dem Gehäuse angebracht werden, wenn die Plattform positioniert wird. Gemäß einer bevorzugten Verkörperung wird die Plattform mit einer Auflage gesichert, die es der Plattform und damit dem Gehäuse erlaubt, zwischen der im wesentlichen vertikalen und der im wesentlichen horizontalen Position gedreht zu werden.

Zusätzlich ist die Erfindung auch auf eine Ausrüstung gerichtet, bestehend aus Reagentien und einem disponiblen, aseptischen Trenngerät zur Rückgewinnung des eluierten Antikörpers, wobei die genannte Ausrüstung verwendet wird, autologe oder homologe Antigen/Antikörper-Immunkomplexe zu bilden zur Behandlung von Allergie- oder Autoimmunerkrankungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorstehende Erfindung kann besser verstanden werden und die Vorteile werden den Fachleuten offensichtlicher durch Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, worin sich gleiche Referenznummern auf gleiche Elemente in den verschiedenen Figuren beziehen und worin

Fig. 1: ist eine Illustration einer Containerzusammenstellung gemäß einer Verkörperung der Erfindung, geeignet zur Durchführung der Methode der Erfindung;

Fig. 2 A: ist eine Frontansicht einer Auflagevorrichtung gemäß einer Verkörperung der Erfindung; und Fig.2B: istein Grundriß von Fig.2A

Fig. 3: ist ein schematisches Diagramm der vorliegenden Erfindung im Ausrüstungsformat, zur Bildung antigener Aliergen-Antikörper-Immunkomplexe zur Behandlung von Allergie- oder Autoimmun-Erkrankungen.

Beschreibung der bevorzugten Verkörperungen

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Methode und einen geeigneten Apparat zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung direkt aus einer physiologischen Flüssigkeit, zum Beispiel Blut oder Plasma. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der Methode und ApparaK r der Erfindung dargestellt werden, sind jene Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Störungen dienen, die durch die Reaktion des Körpers auf eine spezifische Antigen-Komponente hervorgerufen werden.

Für den Zweck dieser Erfindung definiert der Begriff „Antigen-Komponente" allgemein eine Verbindung oder ein Molekül mit chemisch aktiven Stellen, die bekannt dafür sind, Antikörper-Komponenten zu binden (wie hier definiert ist). Beispiele für Antigen-Komponenten sind jene Verbindungen oder Moleküle, die mit Immunoglobulin-Molekülen reagieren. Antigen-Komponente umfaßt Antigene im allgemeinen und auch andere, natürlich vorkommende und andere Verbindungen, dio eine immunologische Antwort des Körpers bewirken. Beispiele spezifischer Antigen-Komponenten gemäß der Erfindung sind Proteine, Kohlehydrate, Hormone, Allergene und der Faktor VIII, wenn die Verabreichung des Faktors VIII an Här.iophylie Erkrankte eine Gegenreaktion bewirkt.

Für die Zwecke dieser Erfindung soll „Antikörper-Komponente" allgemein definiert werden als jede Verbindung oder jedes Molekül, die mit einer bekannten chemisch reaktionsfähigen Stelle einer Antigen-Komponente reagiert, insbesondere mit einem Immunoglobulin, das der Körper als Reaktion auf eine Antigen-Komponente produziert. Beispiele für Antikörper-Komponenten sind jene Immunoglobuline, die als Reaktion auf Viren, Allergene und den Faktor Vlll-Inhibitor, Antibiotika, Chemikalien oder eine andere Substanz, die eine Reaktion hervorruft, produziert. Unter diesem Aspekt sollten Antikörper-Komponenten jene Immunoglobuline umfassen, die vom Körper als Reaktion auf die Verbindungen produziert werden. Allgemein umfaßt die Methode der Erfindung die selektive Isolierung einer gewünschten Zielantikörperkomponenten-Population aus einer Körperflüssigkeit eines Patienten unter Verwendung eines festen Trägers, an den ausgewählte Antigen-Komponenten fixiert werden. Diesen festen Träger bilden normalerweise Partikel oder Kugeln, die mit einem Überzug oder einer Schicht einer Antigen-Komponente überzogen werden, die selektiv für die gewünschte Antikörper-Komponente sind, die der physiologischen Flüssigkeit beigemischt sein kann. Dabei kann es möglich sein, die Kammerwände als festen Träger zu verwenden. Es ist im allgemeinen wünschenswert, das Antigen so sehr wie möglich auf den Partikeln oder Kugeln zu immobilisieren, um das Festhalten der größten Antikörper-Menge zu erleichtern. Die Antikörper-Komponenten binden sich an

die Antigen-Ko "nponente unter Bildung eines Antigan-Komponenle/Antikörper-Komponente-Komplexes. Flüssigkeit und Kugeln werden dann getrennt, ungebundene Materialien, zum Beispiel Zellen, Proteine oder andere Verbindungen, werden von den Partikeln abgewaschen. Die Kugeln können durch magnetische Separation abgetrennt werden oder durch Filtrieren, wenn sie nicht magnetisch sind. Die Partikel werden dann mit einer Elutionslösung in Kontakt gebracht, die entweder die Dissoziation der Antikörper-Komponente von der Antigon-Komponente bewirkt oder den Antigen-Komponente/Antikörper-Komponcnte-Komplex von den Partikeln oder Kugeln abspaltet. Diese Elutionslösung wird gesammelt und zur Darstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet.

Bevorzugte Partikel sind immunoreaktive, paramagnetische Partikel oder Kugeln. Diese Typen paramagneti.xhor, für die Praxis der Erfindung geeigneten Partikel sind normalerweise polymere, kugelförmige Partikel mit einem Durchmesser von etwa 3-8 Mikron. Diese Partikel werden mit kleinen Mengen Magnetit hergestellt, was bewirkt, daß die Partikel durch ein magnetisches Feld festgehalten werden. Diese Typen von Partikeln behalten jedoch nach Entfernung des Feldes keinerlei Magnetismus zurück. Im allgemeinen sind paramagnetische Partikel jene, die eine magnetische Suszeptibilität pro Volumeneinheit von etwa 1 χ 10"³ bis etwa 1 χ 10"² cgs-Einheiten haben

Die für die Praktizierung der Erfindung geeigneten paramagnetischen Partikel sollte eine adäquate Oberflächenbindungskapazität für die Antigen-Komponente haben, dagegen eine geringe nichtspezifische Bindungscharakt<"'stik. Das heißt, die Partikel sollten aus einem Material hergestellt werden, das eine adäquate Kapazität zum Zurückhalten r!er Antigen-Komponente sichert, während es auch ein Material ist, das eine begrenzte Reaktionsfähigkeit mit anderen Verbindungen oder Materialien als der gewünschten Antigen-Komponente hat. Beispiele geeigneter paramagnetischer Partikel sind in den oben erwähnten Patenten beschrieben, wobei bevorzugte paramagnetische Partikel die sind, die in US-Patent-Anmeldung Se.ien-Nr. 113.294, eingereicht am 26.Oktober 1987, betitelt „Verfahren zur Herstellung magnetisch reagierender Polymerpartikel und ihre Anwendungen", beschriebenen, oder die von ^:>ynal Company of Great Neck, New York gekauften paramagnetischen Partikel. Darüber hinaus können paramagnetische Sepharose (Pharmacia Inc.!-Kugeln verwendet weiden.

Die genaue Art der in der Praxis verwendeten paramagnetischen Partikel ist nicht kritisch und wird im folgenden nicht weiter beschrieben, solange die paramagnetischen Partikel die gewünschte Kapazität für die spezifische Antigen-Komponente haben und dadurch charakterisiert sind, daC sie ein geringes Bindungsvermögen fur Verbindungen, Zellen oder andere Materialien als der gewünschten Antigen-Komponento haben.

Wie festgestellt, werden die Partikel mit einer Antigen-Komponente als Überzug dargestellt, die selektiv für die gewünschte Antikörper-Komponente ist. Die resultierenden Partikel werden hier im allgemeinen als immunoreaktive paramagnetische Partikel bezeichnet. Der Antigen-Komponenten-Überzug bewirkt, daß die Antigen-Komponente, an die sich die gewünschte Antikörper-Komponente bindet, einen Komplex bildet. Beispiele geeigneter Antigen-Komponenten für die Praxis der Erfindung sind jene Verbindungen und Substanzen, die allgemein als Allergene bekannt sind. Das sind Verbindungen, die eine allergische Reaktion hervorrufen. Ein weiteres Beispiel einer geeigneten Antigen-Komponente ist der Faktor VIII. Wie in der entsprechenden Anmeldung, Seriennummer 255.350 oben erwähnt beschrieben, fungiert Faktor VIII als Antigen-Komponente für den Faktor VIII-Inhibitor, der eine Antikörper-Komponente ist. Hinsichtlich einer detailierten Beschreibung der Behandlung von Allergien und der Hitzebeständigkeit des Faktors VIII siehe St. Remy et ?l. und die genannte entsprechende Anmeldung, die beide als Referenzen hier allgemein einbezogen sind.

Übereinstimmend mit den Methoden der Erfindung erfolgt die selektive Isolierung der gewünschten Antikörper-Komponente durch In-Kontakt-Bringen einer physiologischen Flüssigkeit, die die spezifische Antikörper-Komponente enthält, mit den immunoreaktiven Partikeln, vorzugsweise mit immunoreaktiven paramagnetischen Partikeln.

Die physiologische Flüssigkeit kann direkt vom Patienten erhalten werden oder von mehrfachen Spendern. Insbesondere kann die physiologische Flüssigkeit Blut, Plasma, Lymphflüssigkeit, cerebrospinale Flüssigkeit oder ein Derivat davon sein. Die physiologische Flüssigkeit sollte eine ausreichende Menge der gewünschten Antikörper-Komponente enthalten. Zum Beispiel sollte eine zum Zwecke der Lieferung einer Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Reaktionen genommene Flüssigkeit von Patienten oder Spendern entnommen werden, die für das spezifische Allergen entweder im Ergebnis einer natürlichen oder aktiven Immunisierung sensibilisiert worden waren. Ähnlich haben Hämophylien, die sich aus den klinischen Konsequenzen ergeben, die mit der Produktion des Faktor VW-Inhibitors verbunden sind, normalerweise ein meßbares Niveau dieses Inhibitors, der im Biut enthalten ist.

Die physiologische Flüssigkeit kann vorher einer Technik unterworfen gewesen sein, die zur groben Trennung der verschiedenen Bestandteile verwendet wurde, zum Beispiel Zentrifugiertechniken zur Trennung größerer Blutzellen von leichterem Plasma und Proteinen, einschließlich der gewünschten Antikorperkomponente. Die Grobtrennung kann die Methode der Erfindung verbessern.

Gemäß der bevorzugten Verkörperung unter Verwendung immunoreakxiver paramagnetischer Partikel werden diese Partikel der physiologischen Flüssigkeit beigemischt, normalerweise in einem Behälter. Wenn der Behälter als Teil einer Einzelverwendungsausrüstung angewendet wird, um eine Allergie oder Autoimmunerkrankung durch Immunisierung mit autologen Antigen/Antikörper-Immunkomplexen zu behandeln, kann das Volumen des Behälters von etwa 0,25ml bis 500ml reichen, vorzugsweise jedoch 60 ml Flüssigkeit. Wenn homologe Antikörper verwendet werden, können mehr als 500 ml der physiologischen Flüssigkeit erforderlich sein. „Homolog" bedeutet abgeleitet von der gleichen Art, zum Beispiel Gamma Guard¹¹ (Baxter Healthcare Corporation, Hyland Division). Der Behälter ist wenigstens zum Teil magnetisch permeabel, das heißt, mindestens ein Teil des Behälters ist nicht aus Metall. Der Behälter wird dann in ein Magnetfeld gebracht, um die immunoreaktiven paramagnetischen Partikel einzufangen und an eine Seite des Behälters zu ziehen. Die Verwendung von Mehrfachmagneten, die rund um den Behälter angeordnet sind, um ein starkes Feld zu erzeugen, kann zu immunoreaktiven paramagnetischen Partikeln führen, die zu mehr als einer Behälterseite gezogen werden.

Mit dem im Magnetfeld gehaltenen Behälter wird die physiologische Flüssigkeit ausgestoßen. Normalerweise erfolgt dies durch Öffnen einer Klemme oder eines Ventils, die die Flüssigkeit durch eine Leitung aus dem Behälter abläßt. Eine Pumpe kann verwondet werden, um die Flüssigkeit aus dem Behälter zu ziehen. Der Behälter kann so positioniert werden, daß die Ableitung so orientiert ist, daß sie der Flüssigkeit ein Abfließen unter dem Einfluß der Schwerkraft gestattet.

Nachdem die physiolo jischo Flüssigkeit ausgestoßen ist, wird eine geeignete Waschlösung in don Behälter gegeben, um jede Verbindung auszuwaschen, die unspezifisch gebunden is' oder durch Adhäsion an den Behälterwänden oder den paramagnetischen Partikeln haftet. Dies erfordert normalerweise die Zugabe von Salzlösung zum Behälter. Das magnetische Feld wird entfernt, und die Pai-tikel und die Salzlösung werden gemischt, um eine geeignete Waschung der Partikeloberflächen zu sichern.

Anschließend wird der Behälter wieder in d&s Magnetfeld gebracht, um die paramagnetischen Partikel gegen eine oder mehrere Seiten zu ziehen und die Salzlösung oder eine andere geeignete Waschlösung auszustoßen, in einer Weise, ähnlich der für das Ausstoßen der physiologischen Flüssigkeit benutzten. Dieser Waschschritt kann, wenn nötig, wiederholt werden. Danach wird eine Elutionslösung in den Behälter gegeben. Die Elutionslösung kann entweder benutzt werden, um die in dam Magnetfeld gehaltenen Partikel zu waschen, oder das Magnetfeld kann entfernt werden, die Partikel werden in der Elutionslös>in^r) suspendiert.

Für die Praxis geeignete Elutionslösungen der Erfindung hängen davon ab, ob der Komplex aus Antigen-Komponente und Antikörper-Komponente dissoziieren soll, ob er ganz gespalten werden soll von der Oberfläche der Partikel. Unter diesem Gesichtspunkt ist das spezifische Elutionsmittel, das verwendet wird, abhängig von der Bindung zwischen der Antigen-Komponente und der Antikörper-Komponente oder von der chemischen Bindung, die die Antigen-Komponente auf der Partikeloberfläche hält. Er- sollte bemerk: werden, daß die Elutionslösung nicht von der Art sein sollte, die das Ziel Antikörper-Komponente angreift oder schädigt. Beispiele für Elutionslösungen, die nützlich sind, eine Dissoziation des Komplexes aus Antigen-Komponente und Antikörper-Komponente zu bewirken, das heißt das Freisetzen der Antikörper-Komponente von der Antigen-Komponente, werden offengelegt in den US-Patenten Nr.4.431.560, erteilt an Lake et al. am 14. Februar 1984, und 4.740.371, erteilt an Remy et al., die beide die Offenlegung von Elutionslösungen enthalten, sind hier durch Referenzen enthalten. Speziell werden Elutionslösungen in dem Patent von Lake et al. in Spalte 2, Zeile 18, bis Spalte 3, Zeile 4, offe'nbart. Andere geeignete Elutionslösungen sind Essigsäure, Citronensäure oder Glycin. Wenn es wünschenswert ist, den Komplex aus Antigen-Komponente und Antikörperkomponente von der Partikeloberi'läche zu spalten, muß die kov.ilente Bindung zwischen der Antigen-Komponente und den paramagnetischen Partikeln durch Anwendung einer geeigneten Technik gebrochen werden. Zum Beispiel kann die Antigen-Komponente über Disulfid-Brücken kovalent an die paramagnetischen Partikel gebunden sein, die leicht mit einem Reduktionsmittel gespalten werden können.

Die Elutionslösung sollte auch von der Art sein, die einem Patienten injiziert werden kann, das heißt eine pharmazeutisch veiträgliche Lösung, oder von der Art, die leicht für eine Injektion bei einem Patienten verändert werden kann. Wonn zum Baispiel Glycin verwendet wird, kann ein Phosphat-Puffer in einer Menge zugesetzt werden, die zu einem Neutralisierungseffekt führt. Die genaue Art der Elutionslösung ist für die Erfindung nicht kritisch, solange sie die gewünschten Eigenschaften besitzt. Weiterhin sollte das Volumen der Elutionslösung, die verwendet wird, im wesentlichen gleich dem Finalvolumen sein, das für die pharmazeutische Zusammensetzung gewünscht wird. Unter diesem Aspekt wäre es wünschenswert, die Elutionslösung mit einem Pulver oder ähnlichen Material zu neutralisieren, das heißt, mit Puffersalzen, um eine Volumenzunahme zu minimieren, andererseits muß das Volumen des Neutralisierungsmittels in Rechnung gestellt werden, wenn über das gewünschte Volumen für die pharmazeutische Zusammensetzung entschieden wird. Das Volumen dar Elutionslösung ist signifikant geringer als die Menge der verwendeten physiologischen und Waschflüssigkeit, typisch ist eine Größenordnung von 10-50mal weniger, aber das Volumen könnte geringer sein.

Die Inkubationszeit der Elutionslösung beträgt zwischen 5 Minuten und 24 Stunden, um den Antikörper oder den Antikörper-Antigen-Komplex zu eluieren.

Im Kontext einer einzelnen Anwendungsausrüstung zur Behandlung einer Allergie oder Autoimmunerkrankung ist das Volumen der Lösungen, die in die Trennkammer oder den Behälter gegeben werden, wichtig. Insbesondere ist einer der Aspekte dieser Erfindung, der die Anwendung einer Ausrüstung gestattet, die Fähigkeit, den gewünschten Antikörper in einem kleinen Volumen zu gewinnen, wodurch die Notwendigkeit entfällt, den Antikörper durch Konzentrieren, Dialysieren usw. weiterzuverarbeiten. In einen Gerät voller Größe liegt das Elutionsvolumen zwischen 0,1 bis GmI, vorzugsweise zwischen 0,1 und 1,0 ml. Der größte Faktor, der bei der Minimierung des Volumens des Elutionspuffers, der verwendet wurde, ist, daß man zu kleine Elutionsvolumina verwendet, ein Teil des Gesamtelutionspuffers und damit der eluierten Antikörper wird von den Kugeln festgehalten und kann nicht zurückgewonnen werden. Mit diesem Zwang im Gedächtnis hat ein anderer Faktor Bedeutung für das benötigte Volumen der Elutionspufferlösung, es ist die Anzahl der zur Bindrng der Antikörper verwendeten Antigen- oder Allergen-Kugeln. Ein weiterer zu betrachtender Faktor ist, wenn ein zu geringus Elutionsvolumen verwendet wird, das die Ausbeute an _uawonnenen Antikörper etwas beeinträchtigt ist. Der Ausbeuteverlust muß mit einer minimalen Menge Erfordernisse für die gewonnene Antikörper ausbalanziert werden. Die optimale Gewinnung des eluierten Anti-Faktors VIII-Antikörpers ist möglich bei Verwendung von 1-2 ml Elutionspuffermit 1-2 x 10⁹ paramagnetischen (Dynal)Kugelninder 50-60-ml-Kammer.

Die Elutionslösung kann mit einer pharmazeutisch verträglichen Neutralisationslösung wie Phosphat- oder Imidazol-Puffer neutralisiert werden. Ähnlich wie bei den Elutionslösungen sind kleine Volumina der Neutralisationslösung erforderlich, um das Verpacken d'eses Prozesses in eine Ausrüstung zu erleichtern. Insbesondere kann ein geringes Volumen eines konzentrierten Neutralisierunfjspuffers verwendet werden, so daß die Neutralisierung nicht zu einer signifikanten Verdünnung der eluierten Antikörper führt.

In der vorliegenden Erfindung sind wir in dar Lage gewesen, die Neutralisierung von 1-2 ml eines 0,2-m-Glycin-Puffers, pH 2,5 mit weniger als 20-50μΐ einer konzentrierten Neutralisationspuffer-Lösung vorzunehmen. Neutralisierungspuffer wie Tris, Glycyl-glycin oder Borat können ebenfalls verwendet werden. Zusätzlich ist es möglich, einen geeigneten Neutralisationspuffer wie Glycin oder Pyrophosphorsäure mit einem höheren pKa-Wert zu wählen, der auch die Verwendung eines kleineren Volumens an Neutralisationspuffer zu verwenden. Zusätzlich kann ein trocken lyophilisierter Neutralisationspuffer verwendet werden.

Kritische Elemente, die einen geeigneten Neutralisationspuffer diktieren, sind solche Betrachtungen wie „Pufferkapazität" des Puffers, die Sicherheits- und Toxikologieeigenschaften des Puffers, die Löslichkeit der Puffersalze und das potentielle Auslaugen von Komponenten der beabsichtigten Glasgefäße, in denen der Puffer in der Ausrüstungsform aufbewahrt wird.

Normalerweiso erfordern die gemäß der Erfindung dargestellten pharmazeutischen Zusammensetzungen wenigstens ein Minimum der Komplex verbindung aus Antigenkon ponente und Antikörperkomponente, um die gewünschten klinischen Ergebnisse zu erreichen. Sie wurde unabhängig bestimmt zur Behandlung jeder besonderen Krankheit oder jedes Syndroms. Nachdem die Minimalmenge des. Komplexes bestimmt wurde, kann das Verfahren standardisiert werden, um die gewünschte Konzentration des Antigenkomponente/Antikörperkomponente-Komplexes zu erreichen (in einer pharmazeutisch verträglichen Lösung). Die Methodo ist besonders anpassungsfähig, um einzelnen Praktikern zu gestatten, die gewünschte pharmazeutische Zusammensetzung mit minimalem Aufwand in kürzester Zeit aus pationteneigener physiologischer Flüssigkeit zu erhalten und darzustellen. Damit ist eine unmittelbare Anwendung der gewünschten pharmazeutischen Zusammensetzung am Patienten gewährleistet.

Der erste Schritt bei der Entwicklung eines Verfahrens für eine spezifische klinische Anforderung umfaßt die Bestimmung der Minimalmenge des gewünschten Antigenkomponente/Antikörper-Komplexes. Einmal ist bekannt, daß die notwendige Menge der Antikörperkomponente gleich oder größer als die molare Menge der Minimalmenge der Antigenkomponenten-Population, die nötig ist, um die gewünschte Menge des Komplexes zu erreichen. Vorzugsweise wird die Antikörperkomponente in molarem Überschuß angewendet, da zusätzliche Antikörperkomponenten die Wirkung der Zusammensetzung nicht stören und auch dem Patienten nicht schaden, dagegen sichern sie eine adäquate Abdeckung der Antigenkomponente. Es sollte bemerkt werden, daß unter gewissen Umständen es wünschenswert sein könnte, einen molaren Überschuß der Antigenkomponente im Vergleich zur Antikörperkomponente zu liefern. Zu diesem Zwecke werden die nachstehend diskutierten Verfahren in ähnlicher Weise befolgt, ausgenommen die Tatsache, daß ein molarer Überschuß der Antigenkomponente zugewiesen wird.

Die Sammlung der gewünschten Menge der Antikörperkomponente ist abhängig von der Konzentration der Antikörperkomponente, die in der besonderen zu verwendeten physiologischen Flüssigkeit vorhanden ist, und von der Zahl der in der Praxis der Erfindung verwendeten inimunoreaktiven paramagnetischen Partikel, dio in der Praxis der Erfindung verwendet werden. Das bedeutet, die Minimalkonzentration des Antigenkomponente/Antikörperkomponente-Komplexes für therapeutische Ergebnisse wird bestimmt, jenes Volumen der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel, das eine adäquate Kapazität zur Bindung einer ausreichenden Menge der Antigenkomponente ist, um entweder eine gewünschte Menge oder einen Überschuß der Antikörperkomponente aus einer gegebenen Menge der physiologischen Flüssigkeit hat, und das in der beschriebenen Methode verwendet wird.

Zwei spezifische Methodologien sind unter Verwendung der Methode der vorliegenden Erfindung zur Darstellung spezifischer Antigenkomponente/Antikörperkomponente-Komplexe bei der Behandlung allergischer Reaktionen und der Behandlung des Faktor Vlll-Inhibitors entwickelt worden. Die erste allgemeine Methodologie wurde vorgelegt in dem hier inkorporierten Patent, das St. Remy et al. am 26. April 1988 erteilt wurde. Dieses Patent lehrt eine Zusammensetzung, die sich zur Behandlung allergischer Reaktionen eignet. Grundsätzlich ist die offenbarte Zusammensetzung ein Komplex des spezifischen Antigens oder Allergens, das die allergische Reaktion verursacht, und des Antikörpers, spezifisch für jenes Allergen. Unter diesem Blickwinkel sind alle Lehren und Diskussionen, die sich mit der Verabreichung des Allergen/Antikörper-Komplexes zum Zwecke der Behandlung der allergischen Reaktion befassen, hier durch Referenz einbezogen, und speziell die Lehren in den Spalten 3-6. Der Hauptunterschied zwischen dem, was in dor Erfindung von St. Remy et al. gedacht wurde, und der vorliegenden Erfindung betrifft die Methode der Isolierung des Antikörpers. Dies wird speziell in den Spalten 7 und 8 unter der Überschrift 2, Antikörperreinigung, diskutiert. Das Reinigungsverfahren von St. Remy et al. umfaßt eine mühsame und zeitraubende Reinigungsmethode unter Verwendung von Konzentrations- und Extraktionstechniken. Die Methode der Erfindung erlaubt die Reinigung der Antikörperkomponenten auf eine einfachere, kürzere Art unter Verwendung der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel.

Die notwendige Konzentration des Allergen-Antikörper-Komplexes zur Erreichung der gewünschten therapeutischen Ergebnisse, diskutiert bei St. Remy et al., ist speziell und besonders yedacht in Spalte 5, Zeile 13 unter der Überschrift „2. Bildung der Zusammensetzung der Erfindung" und in Spalte 6, Zeile 12 unter der Überschrift „Verabreichung der Zusammensetzungen", die ebenfalls durch Referenz hier inkorporiert sind. Eine geeignete Menge der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel sollte gewählt werden, urn die gewünschte Menge des Antikörpers zur Komplexbildung mit dem Allergen zu liefern. Im Gegensatz zur oben beschriebenen Methode ist eine vorbestimmte Menge Antigen- oder Allergen-spezifischer Antikörper zur Anwendung in einer Ausrüstung, eine Menge, die für einen Verlauf der Behandlung erforderlich ist, die keine Konzentration oder Dialyse erfordert.

Eine zweite Methodologie wird in dem hier inkorporierten entsprechenden US-Patent, Anmeldung 255.350, angemeldet am 11. Oktober 1988, offengelegt. Diese Anmeldung lehrt eine zur Behandlung von Gegenreaktionen, bei einigen Patienten durch Faktor VW-Inhibitor verursacht, geeignete Zusammensetzung. Wie diskutiert, entwickeln einige Hämophilien eine allergenartige Reaktion bei Verabreichung von Faktor VIII. Diese Reaktion wird verursacht durch die Anwesenheit überschüssiger Mengen des Faktor Vlll-Inhibitors. Die in dieser Patentanmeldung gelehrte Methodologie umfaß*, die Verabreichung eines Komplexes aus Faktor VW-Inhibitor und Faktor VIII. Unter diesem Aspekt sind alle Lehren und Diskussionen, die sich mit der Verabreichung des Faktor Vlll/Faktor Vlll-Inhibitor-Komplexes zum Zwecke der Behandlung der beschriebenen Bedingungen befassen, hier als Referenz inkorporiert.

Die oben beschriebene Methode kann mit jedem geeigneten Gerät durchgeführt werden, z. B. mit dem Gerät, das in dem hier inkorporierten US-Patent, Anmeldungsserien-Nr. 255.350, Weiterhin kann das Gerät, wenn nicht-paramagnetische immunoreaktive Partikel verwendet werden, ein Filtor zum Abtrennen der Partikel aus den verschiedenen Flüssigkeiten enthalten.

Eine bevorzugte Apparatur zur Durchführung der beschriebenen Methode wird jetzt unter Bezugnahme auf die verschiedenen Figuren diskutiert. Die Apparatur der Erfindung umfaßt zwei Teile, das Container-Ensemble in Figur 1 bis 10, und Halterungsensemble, zu sehen in den Figuren 2 A und 2 B bei 12.

Die Containereinheit 10 umfaßt im allgemeinen eine Trennkammer 14 mit zahlreichen Ein- und Ausgängen. Diese Trennkammer Ksollte verschlossen oder irgendwie abgedeckt werden vor äußerer Verunreinigung. Die Containereinheit 10 ist konstruiert, dem Nutzer die Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens gänzlich innerhalb der Trennkammer iu gestatten. Die Trennkammer 14 bildet im allgemeinen einen länglichen, zylindrischen Körper mit den beiden einander

gegenüberliegenden Enden 11 und 13. Ende 11 wir α mit den verschiedenen Einn"ngen versehen, während das Ende 13 mindestens einen Ausgang hat und sich zu diesem Ausgang zuspitzt, wie allgemein als zugespitzter Teil 15 zu sehen ist. Um die Einbringung der verschiedenen Flüssigkeiten und der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel zu erleichtern, ist die Trennkammer 14 mit den Flüssigkeitsrohron 16 und 18 versehen. Diese Flüssigkeitsrohre 16 und 18 werden verwendet, die physiologische Flüssigkeit, über Rohr 16, und die Salzlösung oder eine ähnliche Waschflüssigkeit, über Rohr 18, in die Trennkammor 14 einzubringen.

Die Flüssigkeitsrohre 16 und 18, die am Ε·κ^:β 11 eintreten, sind entweder mit der Trennkammer 14 integriert oder in solch einer Weise darauf montiert, daß ein geeignete. Abschluß gewährleistet ist. Die Klemmen 20 und 22 sind an den Flüssigkeitsrohrenlschläuchen) 16 bzw. 18 angebracht. Diese Klemmen 20 und 22 werden verwendet, um die Flüssigkeitsschläuche 16 und 18 nach Einführung der speziellen Flüssigkeit zu verschließen, um eine Verunreinigung zu verhüten. Normalerweise können diese Klemmen Roberts-, Gleit- oder Schraubklemmen sein. Ende 11 der Containereinheit 10 umfaßt auch eine Entlüftung 7 und ein Septum 9. Septum 9 wird verwendet, um die immunoreaktiven paramagnotischen Partikel, nicht gezeigt, einzubringen, sowie die Elutionsflüssigkeit in die Trennkammer 14. Die Entlüftung 7 und das Septum 9 sind so geformt, um die Verunreinigung innerhalb der Kammer 14 zu begrenzen. Unter diesem Blickw.nkel sind die Entlüftung 7 und das Septum 9 Einwegventile. Entlüftung 7 kann auch eine durch Filtermaterial abgedeckte Öffnung sein, wobei das Material eine Porosität hat, die Luft durchläßt, aber eine Verunreinigung der Trennkammer 14 verhindert.

Die Trennkammer 14 umfaßt einen einzigen Ausgang, der am Ende 13 austritt. Dieser Ausgang ist als Schlauch 24 zu sehen. Schlauch 24 ist mit dem zugespitzten Ende 15 des Teils 15 verbunden und ist daran montiert oder mit Ende 13 integriert. Die Kombination des zugespitzten Endes 15 und Schlauch 24 bilden eine trichterähnliche Struktur zum direkten Ausfluß aus der Trennkammer 14. Die Verjüngung des Ausgangs in dieser Weise minimiert das Potential, das die Flüssigkeit Γη der Trennkammer 14 zurückhalten will. Dieser Flüssigkeitsschlau'h 24 ist so dimensioniert, daß die Ausflußgeschwindigkeit aus der Trennkammer gesteuert werden kann. Normalerweise hat der Flüssigkeitsschlauch 24 einen Innendurchmesser von etwa 20/1000 eines Zolls bis 60/1000 Zoll.

Wie in Figur 1 zu sehen ist, hat der Schlauch 24 einen Y-förmigen Abschnitt, allgemein bei 26 zu sehen. Dieser Y-Abschnitt 26 umfaßt die beiden Arme 28 und 30. Der eine Arm 28 wird verwendet, Abflüssigkeit zu entfernen, zum Beispiel die physiologische Flüssigkeit und alle Waschflüssigkeiten. Der andere Arm 30 wird verwendet, um die r isultierende Zusammensetzung der Antikörperkompo:iente oder den Antigenkomponente/Antikörperkomponente-Komplex in der Elutionslösung in einen geeigneten Container, nicht gezeigt, zu leiten.

Um das Ableiten der Flüssigkeit aus der Trennkammer 14 durch die entsprechenden Arme 28 und 30 des Schlauches 24 zu erleichtern, wird im Y-Abschnitt ein Zwei-Wege-Ventil angebracht. Dieses Zwei-Wege-Ventil 32 bildet zwei getrennte Fließwege, 29 und 31, durch die die Flüssigkeit selektiv durch einen der beiden Arme 28 und 30 geleitet wird. Das Zwei-Wege-Ventil 32 arbeitet so, daß es den Fluß nur durch einen dieser Arme leitet, wodurch die Möglichkeit, daß physiologische oder Waschflüssigkeit in den falschen Arm gelangt, eingeschränkt wird.

Anstelle des Zwei-Wege-Ventils 32 können am oberen Ende der Arme 28 und 30 auch (im Bild nicht gezeigte) Klemmen angebracht werden, um einen unerwünschten Fluß zu unterbindon. Die Öffnung einer dieser Klemmen erlaubt dann das Ausfließen der entsprechenden Flüssigkeit durch einen der beiden dafür vorgesehenen Arme 28 und 30. Es kann auch wünschenswert sein, eine Klammer, angedeutet bei 39, oberhalb des Zwei-Wege-Ventils anzubringen. Sie gestattet es, den Schlauch 24 zeitweilig vom Zwei-Wege-Ventil während des Mischens der Flüssigkeiten mit den immunoreaktiven paramagnetischen Partikeln in der Trennkammer abzuschließen.

Ein Filterensemble, nicht gezeigt, kdnn in den Arm 30 eingebaut werden. Dieses Filter könnte dazu dienen, die Massage immunoreaktiver paramagnetischer Partikel oder eventuell vorhandener Bakterien mit der Flüssigkeit zu verhindern. Allgemein müßte das Filter eine I orengröße von etwa 0,22 Millimikron haben. Ensemble 10 ist normalerweise aus flexiblem Material konstruiert. Wie oben festgestellt ist der Container, in den die physiologische Flüssigkeit und die immunoreaktiven paramagnetischen Partikel plaziert werden, innerhalb eines Magnetfeldes angeordnet, das die immunoreaktiven paramagnetischen Partikel zu einer oder mehreren Seiten der Trennkammer 14 zieht. Dies kann geschehan durch Plazieren des Ensembles 10 auf β;-¹¹· Träger, der einen oder mehrere Magnete enthält. Auf diese Weise würden die immunoreaktiven parämagnetischen Partikel in Richtung der Wand der Trennkammer 14, benachbart zu ci3n Magneten, gezogen. Bezugnehmend auf die Figuren 2 A und 2 B wir J jetzt eine bevorzugte Verkörperung einer Trägereinheit 12 im Detail beschrieben. Die Trägereinheit wird aus einer Plattform 32 gebildet, auf der das Containerensemble 10 montiert ist. Diese Plattform 32 umfaßt einen oder mehrere Magnete 34 und einu schräge Federklammer 36. Die Magnete 34 werden in eine Vertiefung in der Plattform gesetzt, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, auf der das Containerensemble 10 ruht. Die Magnete 34 sind vorzugsweise aus einem in hohem Grade magnetischen Material, dargestellt aus Neodymium-Eisen-Bor mit einer Oberflächenfeldstärke, die ausreichend ist, um den Hauptteil der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel einzufangen. Unter diesen Gesichtspunkt sollten die Magnete 34 eine ausreichende Feldstärke erreichen, um im wesentlichen den Querschnitt der Trennkammer 14 zu haben. Die Zahl der Magnete 34 hängt von der Größe des Containerensembles 10 ab.

In einer weiteren Verkörperung sind die Magnete in die Plattform eingelassen. Die Plattform wurde modifiziert, so daß zwischen verfügbarer Kammer und den Magneten ein rostfreier „Stahlhalterng" plaziert werden kann. Der „Haltering" ist so entworfen, daß er unter Verwendung eines Nutensatzes, der in die Plattform gefräst wurde, am Ort gleiten kann. Der Zweck des Halteringes ist es, die Kammer von dem Magnetfeld abzuschirmen, wenn die Kammer und ihr Inhalt fixiert sind Wenn das magnetische Einfangen der paramagnetischen Kugeln gewünscht wird, wird der Haltering entfernt, und die Kammer wird zurückgedreht in eine Position nahe den Magneten unter Verwendung der schrägen Federklammer. Der Haltering kann, wenn es gewünscht wird, leicht wieder zwischen Kammer und die Magneten gebracht v/erden.

Dieser magnetische Separator ist ausgestattet mit variabler Geschwindigkeit, Zahnradelektromotor, Zahnradachse und einem die beiden Zahnräder verbindenden Riemen. Die Einheit ist vorgesehen, das für die Probenverarbeitung notwendige Mischen vorzunehmen und die früher diskutierte Praxis des Mischens durch das Plazieren der Kammer aus einem unabhängigen Flotator zu ersetzen. Mit der verfügbaren Kammer auf dem Separator kann das Kammerensemble Ende-über-Ende auf der Achse gedr.·!-,; werden, wobei die Rotation durch einen Elektromotor bewirkt wird.

Dieser magnetische Separator ist mit einer Achse ausgestattet, die ein Zahnrad enthält, das, wenn es gewünscht wird, ausgerückt werden kann und eine freie Rotation der Plattform und des Kammerensembles gestattet, unabhängig vom Motor und von antreibenden Zahnrädern. Die Achse kann ausgerückt werden, wenn die Plattform in eine gewünschte Position gerückt wurde.

Diese Tatsache gestattet die drehung der Kammer und der Plattform aus der horizontalen in die vertikale Stellung und umgekehrt während der Verarbeitungsschritte ohne die Notwendigkeit, auf dem Motor zu drehen. Das ist besonders hilfreich, wenn die Kugeln in vertikaler Position abgefangen wurden, nachdem die Elutionslösung zugegeben worden war und der Oparator wünscht, die Kammer in ihre alte Position zu bringen, so daß die Elutionslösung, die am Kammerboden abgelassen wurde, zurückgewonnen werden kann, während die magnetischen Kugeln an der Seite der Kammer weiter zurückgehalten werden.

Die Plattform mit Vertiefung ist mit Schlauchhalterungen versehen, die es erlauben, die freien Enden der Kammereinlässe- und -auslasse während der Rotation und des Mischens der Kugeln mit der Probe, der Waschlösung oder der Elutionslösung zu halten.

Die oben beschriebene Apparatur versetzt in die Lage, die gesamte Misch-, Wasch- und Elutionsoperation durchzuführen, ohne die Notwendigkeit, die Trennkammer vom magnetischen Separator zu entfernen. Der früher offenbarte magnetische Separator erforderte die Entfernung der disponiblen Kammer vom magnetischen Separator für jeden Mischschritt und ein Ersetzen der Kammer auf dem Separator für jeden magnetischen Abfangschritt.

Die Containereinheit 10 wird auf der Plattform 32 positioniert, um die Trennkammer 14 an einem in Nachbarschaft zu den Magneten 34 gelegenen Ort zu plazieren. Dies sichert, daß das Magnetfeld im wesentlichen durch die ganze Trennkammer 14 verläuft.

Die Containereinheit 10 wird durch die Federklammer 36 auf der Plattform 32 gehalten. Die Klammer 36 hat zwei Arme 38 und 40, die in Berührung mit der Kammer 14 gebracht werden kann und die Trennkammer 14 an der Plattform hält.

Diese Federklammer 36 ist gedacht zum federnden Halten der Containereinheit 10 an der Trennkammer 14. Dies gestattet es, die Containereinheit 10 wiederholt auf oder von der Trägereinheit 12 zu montieren. Dieses federnde hi :lten wird durch Montieren der Klammer 36 in solch einer Weise auf der Plattform 32 erreicht, daß sie umgekehrt geneigt ist in Richtung auf die Plattform 32.

Zum Beispiel kann die Federklammer 36 montiert werden, daß sie an Bolzen oder Stehbolzen, nicht gezeigt, entlang gleitet, ausgehend von der Plattform 32. Federn, ebenfalls nicht gezeigt, können um diese Stehbolzen positioniert werden und an entgegengesetzten Enden an der Plattform 32 und der Federklammer 36 gesichert werden. Auf diese Weise kann die Klammer 36 nach außen entlang dsn Stehbolzen gezogen werden, be^:m Loslassen kehrt sie zur Plattform 32 zurück.

Plattform 32 hat an einem Ende eine Auflage 42. Die Auflage 42 ist gedacht und positioniert, dem zugespitzten Teil 15 vom Ende 13 zu dienen, wenn die Containereinheit 10 über der Plattform gehalten wird. Weiterhin ist die Auflage mit einem Fortsetz 44 versehen, durch den sich der Schlauch 24 ausdehnt. Die Plattform 32 ist auf der Trägereinheit 12 montiert, um ein leichtes Drehen von der vertikalen zur horizontalen Position zu erlauben.

Wie illustriert ist die Plattform 32 zwischen zwei seitlichen Trägern 46 und 48 auf einer Achse 50 montiert. Achse 50 ist definiert durch die beiden Gewindebolzen 51 und 53, von denen jeder an einem Ende der Plattform 32 und an den einander entgegengesetzten Enden der seitlichen Träger 46 oder 48 gesichert ist. Die Plattform 32 ist durch die Einzelbolzen 51 und 53 gesichert, um freie Rotation zu gestatten. Die Spannung an der Plattform 32 wird gehalten durch Montage der Federn 52 und 54 zwischen der Plattform und den Scheibe/Mutter-Kombinationen 56 und 58. Die Scheibe/Mutter-Kombinationen 56 und 58 sind drehbar entlang den Bolzen 51 und 53 mo.t.i 3rt, um zu sichern, daß die entsprechenden Federn 52 und 54 unter Spannung gehalten werden. Diese Spannung sichert, daß die Plattform 32 in jeder gewünschten Position auf der Rotationsachse stehen bleibt.

Der Apparat 10 wird bedient zuerst durch Einfüllen der spezifischen physiologischen Flüssigkeit in die Trennkammer 14 durch den Flüssigkeitsschlauch 16. Dann wird die gewünschte Menge der immunoreaktiven paramagnetischen Partikel durch das Septum 9 zu der Flüssigkeit gegeben. Die Flüssigkeitsschläuche 16 und 18 und der Schlauch 24 werden durch die Klemmen 20 und 22 bzw. durch das Vontil 32 verschlossen.

Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht nötig, die Containereinheit 10 auf der Trägereinheit zu positionieren, und um den Mischschritt durchzuführen, sollte sie sich nicht in der Nähe der Magnete 34 befinden. Die Containereinheit 10 wurde bewegt, um Flüssigkeit und immunoreaktive paramagnetische Partikel innig zu vermischen. Die Containereinheit 10 wird dann auf die Trägereinheit 12 plaziert mit der Trennkammer 14, die nahe den Magneten 34 plaziert ist. Das magnetische Feld zieht und hält die immunoreaktiven paramagnetischen Partikel zu den Seiten der Trennkammer 14, die den Magneten 34 am nächsten sind.

Ventil 32 wird geöffnet, um die Flüssigkeit in der Trennkammer 14 durch den Schlauch 28 abzulassen.

Eine Waschflüssigkeit, zum Beispiel Salzlösung, wird dann in die Trennkammer 14 durch Leitung 18 gegeben, nachdem das Ventil 32 geschlossen wurde. Wieder wird die Containereinheit 10 von der Trägereinheit 12 entfernt, oder andererseits wird das Magnetfeld entfernt, so daß es die immunoreaktiven paramagnetischen Partikel in de"· Trennkammer nicht beeinflussen kann.

Nach ausreichendem Mischen der Waschflüssigkeit mit den immunoreaktiven paramagnetischen Partikeln wird die Containereinhei: 10 auf die Trägereinheit zurückgebracht. Das Magnetfeld der Magnete 34 zieht und hält wieder die immunoreaktiven paramagnethchen Partikel gegen eine Wand der Trennkammer 14. Das Ventil 32 wird geöffnet, um die Waschflüssigkeit durch den Arm 28 abzulassen.

Während des Ablassens sowohl der physiologischen als auch der Waschflüssigkeit wird die Containereinheit 10 in vertikaler Stellung gehalten, um die Flüssigkeit unter dem Einfluß der Schwerkraft aus der Trennkammer 14 ausfließen zu lassen. Nachdem die Trennkammer von der Waschflüssigkeit geleert ist, wird über das Septum 9 eine geringe Menge Elutionsflüssigkeit in die Trannkammer 14 gebracht. Die genaue Menge der Elutionsflüssigkeit sollte gleich der gewünschten Menge der Finalmenge der erstrebteil pharmazeutischen Zusammensetzung sein. Normalerweise wurden etwa 0,1-5 Milliliter der Elutionsflüssigkeit verwendet.

Da nur eine kleine Menge der Elutionslösung verwendet werden soll, kann die Containereinheit orientiert werden, daß die Flüssigkeit zu allen Partikeln gelangt, normalerweise dadurch, daß man den Container in eine horizontale Stellung bringt.

Alternativ wird die Elutionslösung Ende-über-Ende in die Kammer gegeben und gemischt. Die Elutionslösung und Partikel können auch durch Entfernung der Containereinheit 10 von der Trägereinheit 12 miteinander vermischt werden, wobei das

Magnetfeld entfernt wird. Das erlaubt ein Bad aller immunoreaktiven Partikel in der Elutionslösung und wirkt so auf den Antigenkomponente/Antikörperkomponente-Komplex zur Freisetzung der Antikörperkomponente oder des ganzen Komplexes.

Nach einer ausreichenden Zeitspanne wird die Containereinheit 10 wieder in vertikale Stellung gebracht durch Drehen der Trägereinheit 12, und das Ventil 32 wird geöffnet, um das Finalprodukt durch den Arm 30 abzulassen. Dieses Produkt wird gesammelt und durch Zugabe eines geeigneten Neutralisierungsmittels neutralisiert.

Eine einzelne Anwendungsform zur Ausführung der beschriebenen Methode wird jetzt unter Bezugnahme auf Figur 3 diskutiert. Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der vorliegenden Erfindung im Anwend, gsformat. Schritt 1 dieser Methode umfaßt das Zugeben einer ausreichenden Menge der physiologischen Flüssigkeit dos Patienten und einer ausreichenden Menge der Allerger -überzogenen Partikel, um eine vorbestimmte Menge Allergen-spezifischer Antikörper an die Containereinheit 10 zu binden, die im allgemeinen die Kammer 14 mit ihren vielen Zu- und Ableitungen, Figur 2, umfaßt.

In Schritt 2 der Methode werden die physiologische Flüssigkeit und die Allergen-überzogenen paramagnetischen Partikel für einen ausreichenden Zeitraum in der Trennkammer inkubiert, um die Allergen-spezifischen Antikörper an das Allergen zu binden. In Schritt 2 wird der an die Allergen-überzogenen paramagnetischen Partikel gebundene Allergen-spezifische Antikörper von der nicht-gebundenen Flüssigkeit getrennt. In Schritt 4 wird durch einen Einlaßkanal eine Waschlösung in die Containereinheit gegeben. Die Waschlösung ist eine physiologische Kochsalzlösung. In Schritt 5 wird eine Menge physiologisch verträglicher Elutionslösung zugesetzt, um die Aliergen-spezifischen Antikörper von den Allergen-überzogenen paramagnetischen Partikel zu eluieren, wobei diese Menge jedoch geringer ist als die Menge Elutionslösung, die die Konzentration der zurückgewonnenen Allergen-spezifischen Antikörperlösung erfordert.

Der Allergen-spezifische Antikörper wird von der zurückgehaltenen Menge der Allergen-überzogenen paramagnetischen Partikel abgetrennt und durch ein Filter abgezogen. Die eluierte Antikörperlösung wird mit einer Injektionsspritze abgezogen. Die Spritze ist mit einem Filter ausgestattet, und die eluierte Antikörperlösung wird in eine Ampulle mit Neuiralisationslösung injiziert. In Schritt 7 wird der Allergen-spezifische Antikörper zu einer physiologisch verträglichen Neutralisationslösung gegeben, um eine Lösung mit einem physiologisch verträglichen pH zu erhalten, wobei die Menge der genannten Neutralisationslösung aber geringer ist als sie von der Konzentration des zurückgewonnenen Allergen-spezifischen Antikörper gefordert wird. In Schritt 8 wird der Allergen-spezifische Antikörper mit dem Allergen des Patienten vereinigt, und der Komplex wird zu dem Erkrankten gebracht, um die Allergie durch Immunisation mit autologen Antigen-Antikörper-Immunkomplexen zu behandeln.

Die folgenden Beispiele demonstriere., die Effektivität der beschriebenen Methoden und Apparaturen zur Rückgewinnung des Anti-Faktors Vlll-Antikörpers (Inhibitor) aus einer physiologischen Flüssigkeit. Die in diesen Beispielen verwendeten Kugeln wurden mit kovalent an eine Epoxy-Einheit an der Oberfläche jeder Kugel gebundenem Faktor VIII präpariert durch Behandeln der nichtüberzogenen Kugeln, gekauft unter der Identifikationsnummer M 450 von Dynal Company of Great Neck, New York, mit Epichlorhydrin. Diese Kugeln wurden dann mit 1,6-Diamino-hexan behandelt und ergaben Kugeln mit primären Amino-Gruppen. Faktor Vlll-Kohlenhydrat-Reste wurden mit Natriumperiodat oxydiert, um Aldehyd-Gruppen zu erhalten, die dann mit den Amin-derivatisierten Kugeln unter Bildung reversibler Schiffscher Basen zwischen Amino- und Aldehyd-Gruppe umgesetzt wurden. Diese Schiffschen Basen wurden mit Natriumcyanoborhydrid reduziert unter Bildung permanenter kovalenter Bindungen zwischen den Rosten der Amino- und Aidehyd-Gruppen. Diese Kugeln wurden in den folgenden zwei Experimenten verwendet, um die Fähigkeit der Faktor Vlll-Kugeln zur Bindung des Anti-Faktor Vlll-Antikörpers (Inhibitor) aus der Lösung zu demonstrieren.

Statt der Verwendung von Plasma für die Experimente wurde eine vergleichbare physiologische Lösung hergestellt, die aus 50mg/ml kommerziell erhältlichen Humanserumalbumins (HSA) und 10mg/ml kommerziell erhältlichen Human IgG bestand, beides gekauft von Hyland Division of Baxter Healthcare Corporation of Deerfiels, Illinois, in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, die fast den Gesamtprotein-Gehalt des Plasmas umfaßte. Radioaktiv markierter Anti-Faktor VIII wurde zu der HSA- und IgG-Lösung gegeben in einer Konzentration von 1^g/ml für jedes Experiment. Die Prozeduren für jedes Experiment, denen gefolgt wurde, waren:

1. Gebe eine Lösung mit '"!-markiertem Faktor Vlll-Inhibitor einer Konzentration von 1 pg/ml in die Kammer.

2. Gib eine Suspension von Faktor VIII tragenden K jgeln diirch den Septum-Zugang unter Verwendung einer Injektionsspritze und einer hypodermischen Nadel in die Kammer. Die Zahl der Kugeln pro Experiment ist unten in Tabelle 1 aufgelistet.

3. Inkubiere Kugeln und Plasma durch Ende-über-Ende-Mischen für 1 Stunde. Die Kugeln müssen vorsichtig gemischt werden oder sie setzen sich am Boden der Kammer ab.

4. Sondere die Kugeln nach dem Inkubationsschritt durch Plazieren der Kammer auf einem Magnetseparator ab, zum Beispiel durch Plazieren der Containereinheit auf der Trägereinheit ganz nahe den Magneten, in vertikaler Stellung. Lasse Plasma oder Blut aus der Kammer in einen Abfallbehälter.

5. Fülle die Kammer mit ungefähr40ml normaler Salzwaschlösung und suspendiere die Kugeln kurz durch Mischen.

6. Sondere die Kugeln ab und lasse die Salzwaschlösung aus der Kammer in den Abfall.

7. Wiederhole die obigen Schritte 5 und 6.

8. Gib 2,0ml eines 0,1m Glycin-Elutionspuffers, pH2,5, in die Kammer, suspendiere die Kugeln nochmals und mischu für 10 Minuten.

9. Sondere die Kugeln durch Plazieren derTrägereinheit in horizontale Lage und setze die Kammer wieder in die Klammern des Separators. Die Vollendung der Absonderung der Kugeln in horizontaler Steilung verhindert, daß Kugeln und Elutionspuffer am Boden der Kammer abfließen während des Versuches, die Kammer auf dem Separator in vertikaler Stellung zu plazieren.

10. Drehe Separator und Kammer in vertikale Stellung und lasse den Elutionspuffer zum Boden der Kammer fließen.

11. Wiederhole die Schritte E bis 10.

12. Bestimme die im Elutionspuffer zurückgewonnene Menge Faktor Vlll-Inhibitor.

Die Ergebnisse der beiden im Großmaßstab unter Verwendung von Faktor Vlll-Kugeln durchgeführten Experimente zur Gewinnung von Anti-Faktor VIII sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Zusammenfassung der Experimente 1 und 2 im großen Maßstab

	Experiment 1	Experiment 2
Zahl der Kugeln	(1 χ 10⁹ Kugeln)	(2x10⁹ Kugeln)
FaktorVIII-lnhibitor
insgesamt gebunden an Kugeln	13,25 pg	22,57 pg
insgesamt zurückgewonnen	3,22 pg	11,65pg
% Rückgewinnung	24%	52%
in der ersten Elution	3,02 pg	11,10Mg
	94%	95%
ir. der zweiten Elution	0,20 pg	0,55Mg
	6%	5%

Beide Experimente wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

45ml veraibeitetes Volumen 50mg/mlHSA& 10mg/ml Human IgG 1,03μςι/ιηΙ Maus-'²⁶I-Anti-Fak,or VIII Elution mit 2,0ml 0,1 m Glycinpuffer, pH 2,5

Die Rückgewinnungskonzentration des '²⁵I-Anti-Faktors VIII, das ist der Faktor Vlll-Inhibitor während jedes Schrittes des Experimentes, das ist die '"!-Faktor Vlll-Inhibitor-Rückgew!nnung sowohl au,' den kugeln als auch in der Elutionslösung jedes Schrittes wurde besiimmt unter Verwendung eine* Gammazählers, um die Gammastrahiaktivität an jeder Stelle der Rückgewinnung, dividiert durch die Gesamtgamniaaktivität des ¹⁵⁵-I-Faktor Vlll-Inhibitors in der in jedem Experiment verwendeten Anfangsmenge.

Der Großversuchsmaßstab der Experimente unter Verwendung von Faktor Vlll-Kugeln zu Entfernung des '"!-markierten Hyland-Anti-Faktor Vlll-Inhibitors, das ist der Faktor Vlll-Inhibitor, aus der Lösung demonstrierte die Leistungsfähigkeit des Systems und der Apparatur.

Einschätzung der Antigen-Bindungsfunktlon von zurückgewonnen Anti-Faktor Vlll-Antikörpern (Inhibitor) Zur Einschätzung der Antigen-Bindungsfunktion des gewonnenen '"-!-Faktor Vlll-Inhibitors wurde eine Reihe von Experimenten durchgsführt. Die Durchführung dieser Experimente erfolgte unter Verwendung der Faktor Vlll-Kugeln und von '"!-markiertem monoclonalem Hyland-Anti-Faktor Vlll-Antikörper. Faktor Vlll-Kugeln wurden mit 1 Mg/ml des oben zurückgev/onnenen ²⁵I-Faktor-Vlll-Inhibitors in einer Lösung aus 50mg/ml Human-Serum-Albumin und 10mg/ml Human-lgG für eine Stunde inkubiert. Die Kugeln wurden dann zweimal mit normaler Salzlösung gewaschen, der ¹²⁵l-Faktor Vlll-Inhibitor wurde anschließend mit 0,1 m Glycin-Lösung, pH 2,5, eluiert. Die Elutionslösung mit dem zurückgewonnenen '²⁶I-Faktor Vlll-Inhibitor wurde dann mit einem geeigneten Puffer neutralisiert und mit einem zweiten, aliquoten Teil der den Faktor VIII tragenden Kugeln für eine Stunde inkubiert. Die Kugeln wurden zweimal mit Salzlösung gewaschen, und die Menge des gebundenen Faktor Vlll-Antikörpers wurde in einer ähnlichen Weise bestimmt wie oben beschrieben unter Veiwendung der Gamma-Aktivität des zurückgewonnenen '²⁶I-Faktor Vlll-Inhibitors im Vergleich mit der Gamma-Aktivität der Anfangsmenge des '²⁶I-Faktor Vlll-Inhibitors. Die Verwendung eines zweiten Aliquots der Faktor Vlll-Kugeln als Ziel für die Bindung des zurückgewonnenen Faktor Vlll-Antikörpers machte die Quantifizierung der gebundenen Faktor Vlll-Antikörper vertrauenswürdiger als den Versuch, den Faktor Vlll-Faktor Vlll-Antikörper-Komplex in Lösung zu messen. Die Verwendung der Faktor Vlll-Kugeln macht das zu einer „schlimmsten Fall"-Mef jng, da die Kinetikder Faktor Vlli-Antikörper-Bindung an eine feste Phase einer Kugel weniger günstig ist als die Bindung der Faktor Vlll-Antikörper an löslichen Faktor Viii.

Die Ergebnisse bestätigen die Beibehaltung einer hervorragenden Antigen-Bintlungskapazität der zurückgewonnenen Antikörper. Diese Eigenschaft ist wichtig für die Bildung des Faktor Vlll-Inhibitor-Faktor Vlll-Immunkomplexes, der anschließend bei der Patientenimmunisierting benutzt wird. Die Bindung des Antifaktors VIII erwies sich auch als abhängig von u^r Zahl der verwendeten Kugeln, was mit den festgestellten kinetischen Grenzen dieses Model's in Übereinstimmung ist. Die Daten dieses Experimentes sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

(4 x 10⁷ Kugeln)	(8 χ 10⁷ Kugeln)
24,0	34,8
83,2	84,8
77,0	88,2

Tabelle 2

Zusammenfassung der Test-Experimente über die Bindung des zurückgewonnenen Faktor VW-Inhibitors¹-²

Experiment Nr. 1 Experiment Nr. 2

Zahl der Kugeln Anti-Faktor VIII insgesamt % gebunden an Kugeln des aliquoten Teils 1 insgesamt%eluiert durch Glycin-Waschungen insgesamt%gebundenandie Kugeln des aliquoten Teils 2 der offerierten Menge

1 O'ese Experimente wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt.

2ml verarbeitetes Volumen 50mg/mlHSA& lOmg/ml Human IgG

1,OMg/mlMäuse-1251-Anti-FaktorVIII Elution mit ΙΟμΙ 0,1 m Glycin, pH 2,5

Kugeln Aliquote Teile 1 und 2, angewendet in beiden Experimenten, hatten die gleiche Größe

2 Durchschnitt von Dreifachproben

Die folgenden Beispiele demonstrieren die Effektivität der beschriebenen Methode und Apparatur zur Rückgewinnung von Antikreuzkraut-Antikörpern aus dem Plasma von Personen, die dafür bekannt sind, daß sie allergisch sind gegen Kreuzkrautallergenextrakte. Die für diese Demonstration verwendeten Kugeln wurden folgendermaßen dargestellt:

1. Überzugsfreie Dynal M-450-Kugeln wurden von Dynal gekauft, (Great Neck, New York) und durch die Anwendung von Epichlorhydrin modifiziert, um kovalent gebundene Epoxy-Reste auf ihrer Oberfläche zu haben.

2. Die Epoxy-derivatisierten Kugeln wurden durch Zugabe von 1,6-Diamino-hexan modifiziert, um Kugeln mit primären Aminoüruppen auf ihrer Oberfläche zu erhalten.

3. Die Amin-Kugeln wurden dann mit Kreuzkraut-Allergen und 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimid gemischt, um ein kovalentes Ankoppeln von Kreuzkraut-Allergen an die Amino-Gruppen auf der Oberfläche der Kugeln zu erleichtern.

Das Verfahren ist im allgemeinen das gleiche wie früher beschrieben, ausgenommen, daß die Kreuzkraut-Allergen-überzogenen Kugeln durch die Faktor VW-Kugeln ersetzt wurden und daß in der Kammer menschliches Plasma anstelle der vergleichbaren Lösung (physiologisch) nus50mg/ml Human-Serum-Albuminund 10mg/ml Human-lgG indem FaktorVlll-Beispiel verwendet wurde. Zusätzlich wurde nur ein einziger Glycin (0,2 m Glycin-Puffer, pH 2,1) Elutionsschritt in diesem Experiment verwendet.

Zwei ml Glycin wurden zugesetzt.

Der Elutionspuffer wurde durch Zugabe von festem Tris-Puffer neutralisiert.

Die Menge der bei der neutralisierten Elution anwesenden IgG-Antikreuzkraut-Antikörper wurde bestimmt unter Verwendung einer enzym-gebundenen Immunsorbent-Analyse (ELISA) zur Entdeckung des Antikreuzkraut-lgG bestimmt. Ungefähr Ο,δμρ IgG Antikreuzkraut wurden unter Verwendung von 2 χ 10⁹ Kreuzkrautallergen-beschichteten Kugeln und 40ml menschlichen Plasmas zurückgewonnen.

Die Kapazität der zurückgewonnenen Antikreuzkraut-Antikörper wird auch demonstriert durch die Tatsache, daß die Antikörper in der Lage sind, sich an die Kreuzkrautallergen-überzogenen Wände zu binden, die in F'J.SA *ur Feststellung der IgG-Antikörper verwendet werden. Die Spezif ität der Antikreuzkraut-Antikörper kann demonstriert werden durch komuirrierende Bindungsinhibitionsuntersuchung, die auch die Fähigkeit der zurückgewonnenen Antikreuzkraut-Antikörper zur Bindung der Kreuzkraut-Allergene demonstriert.

Während die bevorzugten Verkörperungen beschrieben worden sind, können verschiedene Modifikationen und Substitutionen dazu vorgenommen werden ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Demgemäß ist zu verstehen, daß die Erfindung durch Illustration und ohne Einschränkung beschrieben worden ist.

Claims

1. Eine Methode zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einer spezifischen Zielantikörper-Komponente in einem pharmazeutisch verträglichen Träger aus einer physiologischen Flüssigkeit in einer Kammer mit mindestens einem Ein- und Auslaß, bestehend aus

- In-Kontakt-bringen der physiologischen Flüssigkeit mit einer festen Phase als Träger, der eine Antigenkomponente trägt, die selektiv für die Zielantikörper-Population ist;

- Entfernen der physiologischen Flüssigkeit aus der Kammer;

- Waschen der Kammer mit einer verträglichen Waschflüssigkeit;

- Ablassen der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

- Zusetzen einer pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zur Kammer und

- Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer,

2. Die Methode von Anspruch 1, worin der genannte Schritt des In-Kontakt-bringens der genannten physiologischen Flüssigkeit mit der genannten festen Trägerphase das Liefern einer Menge immunoreaktiver Partikel zu der genannten Flüssigkeit umfaßt.

3. Die Methode von Anspruch 2, worin das Volumen der physiologischen Flüssigkeit,der Elutionslösung und der immunoreaktiven Partikel geringer ist als das der genannten Kammer.

4. Die Methode von Anspruch 2, die weiter einen Schritt des Aussonderns der genannten Partikel in der genannten Kammer während des Schrittes der Entfernung der physiologischen Flüssigkeit, des Ablassens der Waschflüssigkeit und des Entfernens der Elutionslösung umfaßt.

5. Die Methode von Anspruch 1, worin der genannte Schritt des In-Kontakt-bringens der genannten physiologischen Flüssigkeit mit dem genannten festphasigen Träger die Lieferung einer Menge immunoreaktiver paramagnetischer Partikel zu der genannten Flüssigkeit umfaßt.

6. Die Methode von Anspruch 5, die weiter einen Schritt des Aussonderns der genannten Partikel in der genannten Kammer in einem magnetischen Feld während der Schritte des Entfernens der physiologischen Flüssigkeit, des Ablassens der Waschflüssigkeit und der Entfernung der Elutionslösung umfaßt.

7. Eine Methode zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einer spezifischen Zielantikörperkomponenten-Population in einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer Kammer, die mindestens teilweise magnetisch permeabel ist und einen Einlaß und Auslaß hat; bestehend aus

- Mischen einer physiologischen Flüssigkeit, die die genannte Zielantikörperkomponenten-Population und immunoreakt've, paramagnetische Partikel, die eine Antigenkomponente, selektiv für die genannto Zielantikörperkomponenten-Population, enthält;

- Aussondern der immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel in der genannten Kammer durch Anlegen eines Magnetfeldes;

- Ablassen der Flüssigkeit aus der Kammer;

- Zugabe einer Waschflüssigkeit zu der Kammer;

- Entfernung der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

- Lieferung einer pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer; und

- Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer.

8. Die Methode von Anspruch 7, worin das Volumen der physiologischen Flüssigkeit, der Elutionslösung und der immunoreaktiven Partikel geringer ist als das Volumen der genannten Kammer.

9. Die Methode von Anspruch 7, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Waschflüssigkeit zu der Kammer resuspendiert wird.

10. Die Methode von Anspruch 7, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Elutionslösung zu der genannten Kammer resuspendiert werden.

11. Die Methode von Anspruch 7, die weiter den Schritt der Orientierung der genannten Kammer in eine Stellung umfaßt, daß jede Flüssigkeit in der genannten Kammer unter dem Rinflußder Schwerkraft ausfließen kann.

12. Die Methode von Anspruch 11, die weiter einen Schritt der Orientierung der genannten Kammer in eine Stellung umfaßt, daß die genannten paramagnetischen Partikel nach dem Schritt der Lieferung einer pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der genannten Kammer in einer im wesentlichen horizontalen Orientierung vorliegen, gefolgt von einem weiteren Schritt der Orientierung des genannten Auslasses in der Weise, daß ein Ausfließen unter dem Einfluß der Schwerkraft möglich ist.

13. Die Methode von Anspruch 7, worin der genannte Schritt des Mischens einen Schritt der Auswahl einer vordefinierten Menge der genannten paramagnetischen Partikel zur Lieferung einer molaren Menge der genannten Antikörperkomponente einschließt.

14. Die Methode von Anspruch 7, die weiterden Schritt der Zugabe einer definierten Menge einer Antigenkomponente umfaßt, die selektiv für die genannte Antikörperkomponente ist, zur genannten Elutionslösung.

15. Die Methode von Anspruch 7, worin der genannte Schritt der Lieferung der genannten, pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer das Auswählen der genannten Elutionslösung umfaßt, um zu bewirken, daß die genannten Antikörperkomponenten von der genannten Antigenkomponente dissoziieren.

16. Die Methode von Anspruch 15, worin der genannte Elutionslösung-Auswahlschritt die Auswahl der genannten Elutionslösung aus der Gruppe, bestehend aus Essigsäure und Glycin, umfaßt.

17. Die Methode von Anspruch 16, die weiter den Schritt der Neutralisierung der genannten Elutionslösung umfaßt.

18. Dio Methode von Anspruch 12, worin der genannte Schritt der Lieferung der genannten, pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer das Auswählen der genannten Elutionslösung umfaßt, um zu erreichen, daß der Komplex aus dergenannten Antigenkomponente und der Antikörperkomponente von den genannten paramagnetischen Partikeln abgespalten wird.

19. Die Methode von Anspruch 13, worin der genannte Schritt der Lieferung r.'er genannten, pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer die Auswahl der genannten Elutionslösung umfaßt, um zu erreichen, den genannten Antigenkomponente/ Antikörperkomponente-Komplex von den genannten paramagnetischen Partikeln zu spalten.

20. Die Methode von Anspruch 17, die weiter einen oder mehrere zusätzliche Schritte durch Zugabe einer Waschflüssigkeit zu der genannten Kammer umfaßt.

21. Die Methode von Anspruch 19, die weiter einen oder mehrere zusätzliche Schritte durch Zugabe einer Waschflüssigkeit zu der genannten Kammer umfaßt.

22. Ein Gerät zur selektiven Isolierung einer Zielantikörperkomponenten-Population aus einer physiologischen Flüssigkeit in einer pharmazeutisch verträglichen Trägerlösung, bestehend aus

- einem die Kammer definierenden Gehäuse, das Ein- und Ausgang hat als Zugang zur Kammer umfaßt, und vorzugsweise aus einem wenigstens teilweise magnetisch durchlässigen Material besteht;

- einer Arretierung, gegen die das Gehäuse lehnt und von der es lösbar gehalten wird, wobei die Arretierung in einer im wesentlichen horizontalen oder vertikalen Stellung positionierbar ist und einen oder mehrere, in Nachbarstellung zu Gehäuse gelegene Magnete umfaßt.

23. Das Gerät von Anspruch 22, worin die genannte Arretierung auf einem Träger gesichert ist, der es gestattet, daß die Arretierungsvot richtung zwischen einer im wesentlichen vertikalen und einer im wesentlichen ho^ri7r>ntalen Stellung gedreht werden kann.

24. Das Gerät von Anspruch 22, das weiter eine definierte Menge immunoreaktiver Partikel, in der genannten Gehäusekammer positioniert, einschließt.

25. Das Gerät von Anspruch 22, das weiter eine definierte Menge immunoreaktiver, paramagmetischer Partikel, in der genannten Kammer positioniert, einschließt.

26. Das Gerät von Anspruch 24, worin die genannte definierte Menge der genannten Partikel ausgewählt wird, eine definierte Menge Antikörperkomponenten zu liefern.

27. Das Gerät von Anspruch 25, worin die genannte definierte Menge der genannten Partikel ausgewählt wird, ein bestimmtes molares Verhältnis der Antikörperkomponenten zu liefern.

28. Eine Methode zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung einer spezifischen Zielantikörper-Population in einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer Kammer, die mindestens teilweise magnetisch permeabel ist und Ein- und Auslaß umfaßt, bestehend aus

- dem Mischen einer physiologischen Flüssigkeit mit der genannten spezifischen Zielantikörper-Population und immunoreaktiven, paramagnetischen Partikeln, die ein für die genannte Zielantikörper-Population selektives Allergen tragen;

- dem Aussondern der immunoreaktiven, paramagnetischen Partikel in der genannten Kammer durch Lieferung eines Magnetfeldes;

- Abiassen der Flüssigkeit aus der Kammer;

- Zugabe von Waschflüssigkeit zu der Kammer;

- Entfernung der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

- Lieferung einer pharmazeutisch verträglichen Elutionslösung zu der Kammer und

- Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer.

29. Die Methode von Anspruch 28, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Waschflüssigkeit zu der Kammer resuspendiert werden.

30. Die Methode von Anspruch 28, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Elutionslösung zu der genannten Kammer resuspendiert werden.

31. Eine Methode zur Darstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung des Faktor VIII-Inhibitors in einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer Kammer, die wenigstens teilweise magnetisch permeabei ist und einen Ein- und Auslaß umfaßt, bestehend aus

- Mischen einer physiologischen Flüssigkeit mit derr genannten Faktor Vlll-Inhibitor und immunoreaktiven, paramagnetischen Partikeln, die den Faktor VIII tragen;

- Aussondern derimmunoreaktiven, paramagnetischen Partikel in der genannten Kammerdurch Anlegen eines Magnetfeldes;

- Ablassen der Flüssigkeit aus der Kammer;

- Zugabe einer Waschflüssigkeit zu der Kammer;

- Entfernung der Waschflüssigkeit aus der Kammer;

- Entfernung der Elutionslösung aus der Kammer.

32. Die Methode von Anspruch 31, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Waschflüssigkeit zur Kammer resuspendiert wi 11 χίπη.

33. Die Methode von Anspruch 31, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Elutionslösung zu der genannten Kammer resispundiert wurden.

34. Eine Methode zum Erhalten einer vorbestimmten Menge eines allergen-spezifischen Antikörpers aus einer physiologischen Flüssigkeit, um eine immunotherapeutische Behandlung einer allergischen Reaktion auf dieses spezifische Allergen durchzuführen, bestehend aus

- der Zugabe einer ausreichenden Menge der genannten Flüssigkeit und einer ausreichenden Zahl allergen-überzogener Partikel zur Bindung der genannten vorbestimmten Menge allergenspezifischer Antikörper;

- dem Inkubieren der genannten Flüssigkeit und der genannten allergen-überzogenen Partikel für einen ausreichenden Zeitraum, um die genannten allergen-spezifischen Antikörper an die genannten allergen-überzogenene Partikel in der genannten Kammer zu binden;

- einem Mittel zur Trennung der genannten, allergen-spezifischen Antikörper, gebunden an die genannten allergen-überzooenen Partikel, von ungebundener Flüssigkeit;

- Entfernung der ungebunaenen Flüssigkeit aus der genanntenKammer;

- Waschen der genannten allergen-überzogenen Partikel zur Entfernung nicht-spezifisch adsorbierten Materials in der genannten Kammer;

- Zugabe einer Menge einer physiologisch verträglichen Elutionslösung zum Eluieren der genannten allergen-spezifischen Antikörper von den genannten allergen-überzogenen, paramagnetischen Partikeln, aber weniger als die Menge der genannten Elutionslösung als zur geforderten Konzentration der genannten allergen-spezifischen Antikörper nötig ist;

- Inkubieren der genannten allergen-spezifischen Antikörper, gebunden an allergen-überzogene Partikel, mit der genannten Elutionslösung für einen ausreichend langen Zeitraum, um die genannten allergen-spezifischen Antikörper von den genannten, allergen-überzogenen Partikeln zu eluieren;

- Mittel zur Trennung der genannten allergen-spezifischen Antikörper von den genannten allergen-überzogenen Partikeln in der genannten Kammer;

- Zugabe einer Menge einer physiologisch verträglichen neutralisierenden Pufferlösung zu den genannten allergen-spezifischen Antikörper, um eine Lösung mit einem physiologisch verträglichen pH zu erhalten, aber weniger als die Menge des genannten neutralisierenden Puffers als zur geforderten Konzentration der genannten aller&en-spezifischen Antikörper nötig ist.

35. Die Methode von Anspruch 34, worin das Volumen der physiologischen Flüssigkeit, der Elutionslösung und der immunoreaktiven Partikel geringer ist als das Volumen der Kammer.

36. Die Methode von Anspruch 34, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Waschflüssigkeit zur Kammer resuspendiert werden.

37. Die Methode von Anspruch 34, worin die genannten Partikel nach Zugabe der genannten Elutionslösung zur genannten Kammer resuspendiert werden.

38. Die Methode von Anspruch 34, worin die genannten Partikel paramagnetisch sind.

39. Die Methode von Anspruch 34, worin die physiologische Flüssigkeit autolog ist.

40. Die Methode von Anspruch 39, worin eine ausreichende Menge der genannten Flüssigkeit im Bereich von etwa 0,25ml bis 500ml liegt.

41. Die Methode von Anspruch 34, worin die genannte Inkubationszeit im Bereich von etwa 5 Minuten bis 24 Stunden reicht.

42. Die Methode von Anspruch 34, worin die physiologische Flüssigkeit homolog ist.

43. Die Methode von Anspruch 34, worin die genannte Elutionslösung Glycin ist.

44. Die Methode von Anspruch 34, worin der genannte Neutralisierungspuffer ein Salz oder eine Lösung ist.

45. Die Methode von Anspruch 34, worin der genannte Neutralisierungspuffer festes Tris(hydroxymethylamino)methan ist.

46. Die Methode von Anspruch 34, worin der genannte Neutralisierungspuffer ein Phosphat-Puffer ist.

47. Eine Methode zur Gewinnung einer vorbestimmten Menge eines allergen-spezifischen Antikörpers aus physiologischer Flüssigkeit zur Durchführung einer Behandlung einer allergischen Reaktion auf diese spezifische Reaktion, bestehend aus

- Rückgewinnung des genannten allergen-spezifischen Antikörpers in einem hinreichend kleinen Volumen, um zusätzliche Konzentrationsschritte zu vermeiden.

48. Eine Methode zur Gewinnung einer vorbestimmten Menge eines antigen-spezifischen Antikörpers aus physiologischer Flüssigkeit, um eine Behandlung einer autoimmunen Krankheit durchzuführen, bestehend aus

- Rückgewinnung der genannten antigen-spezifischen Antikörper in einem hinreichend kleinen Volumen, um zusätzliche Konzentrationsschritte zu vermeiden.

49. Eine Ausrüstung einschließlich Reagentien und Trenngerät zur Rückgewinnung einer ausreichenden Menge antigen-spezifischen Antikörpers, der zur Bildung eines Antikörper/ Antigen-Komplexes verwendet wird, bestehend aus

- einem Gefäß mit einer ausreichenden Zahl antigen-überzogener Partikel zur Bindung einer vorbestimmten Menge des genannten antigen-spezifischen Antikörpers;

- einem Behälter mit einer ausreichenden Menge Waschlösung;

- einem Behälter mit einer Menge einer physiologisch verträglicher. Elutionslösung zur Eluierung der genannten allergen-überzogenen Partikel, die aber geringer ist als die Menge der genannten Elutionslösung, die zur erforderlichen Konzentration der genannten antigen-spezifischen Antikörper nötig ist;

- einem Behälter mit einer Menge einer physiologisch verträglichen neutralisierenden Pufferlösung, um eine Lösung zu erhalten mit einem physiologisch verträglichen pH, die aber geringer ist als die Menge der genannten Neutralisationslösung, die zur geforderten Konzentration des genannten antigen-spezifischen Antikörpers nötig ist;

- Mitteln zur Trennung des genannten antigen-spezifischen Antikörpers.

50. Die Methode von Anspruch 49, worin die genannten Partikel paramagnetisch sind.

51. Die Ausrüstung von Anspruch 49, worin das genannte Antigen ein Allergen ist.

52. Die Ausrüstung von Anspruch 49, die weiter ein Mitte! enthält, um die genannten antigen spezifischen Antikörper und das Antigen zu einem physiologisch verträglichen Komplex zu vereinigen.

53. Eine Ausrüstung einschließlich Reagentien und Trenngerät zur Rückgewinnung einer ausreichenden Menge antigen-spezifischen Antikörpers, der zur Bildung eines Antigen-Antigen-Komplexes verwendet wird, bestehend aus

- einem Trenngerät, bestehend aus

i. einer aseptischen Trennkammer aus wenigstens teilweise magnetisch permeablem Material und

ii. Mitteln zur Zugabe und Entfernung von Lösungen aus der genannten Kammer;

- einem Gefäß mit einer ausreichenden Zahl antigen-überzogener paramagnetischer Partikel zur Bindung einer vorbestimmten Menge der genannten antigen-spezifischen Antikörper;

- einem Container mit einer ausreichenden Men je einer Waschlösung;

- einem Container mit einer ausreichenden Menge einer physiologisch verträglichen Elutionslösung zum Eluieren der genannten antigen-überzogenen paramagnetischen Partikel, die aber geringer ist als die Menge der genannten Elutionslösung, die für die geforderte Konzentration des genannten antigen-spezifischen Antikörpers nötig ist;

- einem Behälter mit einer Menge eines physiologisch verträglichen Neutralisierungspuffers zur Erhaltung einer Lösung mit einem physiologisch verträglichen pH, die aber geringer ist als die Menge der genannten Neutralisierungslösung der genannten Antigen-spezifischen Antikörper.

54. Die Ausrüstung von Anspruch 53, worin der genannte Antikörper ein Allergen ist.

55. Die Ausrüstung von Anspruch 53, die weiter Mittel umfaßt zur Kombinierung der genannten antigen-spezifischen Antikörper und des Antigens zu einem physiologisch verträglichen Komplex.