PT808326E - Derivados basicos oxazolina-amidas de antibioticos afins de ge 2270 e ge 2270 - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "DERIVADOS BÁSICOS OXAZOLINA-AMIDAS DE ANTIBIÓTICOS AFINS DE GE 2270 E GE 2270"
O presente invento refere-se a derivados básicos amida de antibióticos afins de GE 2270 e GE 2270 da fórmula geral I
Ri \
I em que: R1 representa hidrogénio, (C1-C4) alquilo ou di(CrC4) alquilamino(CrC4) alquileno; alq representa (C1-C4) alquileno, (C2-C5) alquileno-carbonilo ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo azoto; R2 representa aminocarbonilo, mono ou di(Ci-C4) alquilaminocarbonilo, ou um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, ou di(Ci-C4) alquilamino-CCi-Ca) alquileno, e R4 representa (C1-C4) alquilo, di(Ci-C4) alquilamino- -2-
(C1-C4) alquileno ou hidroxi(Ci-C4) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um átomo de azoto e facultativamente um heteroátomo seleccionado de entre azoto e oxigénio, facultativamente substituído com um grupo seleccionado de entre (CrC4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, di(C1-C4) alquilamino ou di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno; ou R1 e alq-R2 em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro heteroátomo seleccionado de entre oxigénio e azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (Cj-C4) alquilo, di(Ci-C4) alquilamino, di(CrC4) alquilamino(Ci-C4) alquileno, hidroxi(Ci-C4) alquileno e um grupo alq2-R5 em que Λ alq é (CpC4) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (C1-C4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino(Cr C4) alquileno e R7 representa (CrC4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino(Cr C4) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (Ci-C4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, di(Ci-C4) alquilamino e di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno; e o grupo da fórmula -3- * representa um porção do núcleo antibiótico da fórmula
em que: W1 representa fenilo W representa hidroxi ou ambos W1 e W2 representam metilo, X1 representa hidrogénio ou metilo, X representa hidrogénio, metilo ou metoximetileno, com a condição de que quando ambos W1 e W2 são metilo, então X é metilo e X é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. O presente invento refere-se também aos processos para a preparação de compostos da fórmula I e aos derivados de ácido carboxílico e de ácido carboxílico protegido dos compostos acima referidos, isto é os precursores « -4- « -4-
r/\ í ! . ly5*% /<<> ^ dos compostos da fórmula 1 em que o grupo amidico:
Ri
On /n é substituído pelo grupo -COOY, em que Y representa hidrogénio ou (Ci-C4) alquilo. O antibiótico GE 2270 é preparado cultivando uma amostra de Planobispora rosca ATCC 53773 ou uma sua variante ou mutante produtor e isolando a desejada substancia antibiótica a partir do micélio e/ou caldo de fermentação. Planobispora rósea ATCC 53773 foi isolada a partir de uma amostra de solo e foi depositada em 14 de Junho de 1998 na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 Maryland, U.S.A., obedecendo às directivas do Tratado de Budapeste. A estirpe foi atribuído o número de acesso ATCC 53733. O factor A do antibiótico GE 2270 constitui o principal componente do complexo antibiótico GE 2270. O factor A do Antibiótico GE 2270 e Planobispora rosea ATCC 53773 são descritos na Patente dos E.U.A. No. 5.139.778.
Presentemente, foi isolado um certo número de factores minor do antibiótico GE 2270, nomeadamente factores Bj, B2, Q, C2, D2, E e T apresentados na Publicação do Pedido de Patente Europeia No. 451486 e factor C2a apresentado na Publicação do pedido de Patente Europeia No. 529410. São também conhecidos produtos dc degradação do factor A de GE 2270, -5-
tf ,1 <£) nomeadamente factores AI} A2, A3 e H apresentados na Patente dos E.U.A. No. 5.139.778.
De entre estes compostos, os factores A, B2, Q e C2 podem ser utilizados como materiais de partida apropriados para a preparação dos compostos do presente invento.
Os factores acima mencionados podem ser representados pela fórmula II que se segue:
II em que é um grupo tal como foi aqui acima definido em que W é fenilo e W é hidroxi e quando X1 é CH3 e X2 é CH2OCH3, o factor A é determinado; quando X é CH3 e X é CH3, o factor B2 é determinado; quando X1 é CH3 e X2 é Η, o factor Cj é determinado; e quando X1 é H e X2 é CH2OCH3, o factor C2 é determinado.
Deverá ser notado que esta fórmula não corresponde à fórmula -6- -6-
. ff .í-w* : - apresentada nos Pedidos de Patente acima citados, cuja fórmula foi atribuída tendo como base os dados físico-químicos alí referidos. Com efeito, estudos posteriores sobre os produtos de degradação dos factores de GE 2270 (P. Tavcechia et al., Jour. of Antib., 47, no. 12 (1994), 1564-1567) levam à conclusão de que a suposta sequência de aminoácidos não era correcta, visto que os aminoácidos portadores das porções X e X se encontravam na realidade numa sequência oposta em comparação com a fórmula previamente referida; assim a presente fórmula II foi proposta para representar de um modo correcto a estrutura do antibiótico GE 2270.
Um antibiótico afim de GE 2270 da fórmula Ha:
em que GE é um grupo tal como foi acima definido em que ambos W1 e W2 são metilo, X é metilo e X é hidrogénio, foi descrita por K. Shimanaka et al., Journal of Antibiotics, vol. 47, pp. 668-674 (isolamento, características físico-químicas, actividade antimicrobiana) e vol. 47, pp. 1153-1159 (elucidação da estrutura); ambos estes artigos são aqui incorporados como referência. *»..;a»a^ícAer.· t -7- 0 referido antibiótico GE 2270, nomeadamente o factor A de amitiamicina, foi isolado a partir do caldo de fermentação de Amvcolatopsis sp. MI481-42F4, cuja estirpe foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, com o acesso No. FERM P-12739. A fermentação de Amvcolatopsis sp, MI481-42F4 é conduzida de acordo com metodologias convencionais em meio nutriente convencional; o factor A da amitiamicina apresenta actividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas. Este composto também pode ser apropriadamente utilizado como material de partida para o processo do presente invento.
No que se segue da presente especificação, a expressão "material de partida de GE 2270" significa qualquer factor apropriado do antibiótico GE 2270, tal como o factor A, B2, Ci e C2, assim como o factor A da amitiamicina.
Além disso, derivados da amida de derivados de GE 2270 da fórmula geral
NRR' em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula II e R e R' têm uma série de significados, são descritos na Publicação do Pedido de Patente Europeia No. 565567 (também neste caso, por razões indicadas anteriormente, a estrutura apresentada da porção nuclear (central) é incorrecta).
Como é evidente, os derivados de amida acima referidos, de GE -8- 2270 diferem dos compostos do presente invento pelo facto dos compostos do invento conterem um anel oxazolina entre a porção nuclear (central) de GE e a porção amídica.
Na presente descrição, os termos acima usados na definição dos significados dos substituintes pretendem ter os significados que lhes são habitualmente atribuídos nesta técnica. Consequentemente: (C1-C4) alquilo representa uma porção hidrocarboneto linear ou ramificada contendo 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono tais como: -CH3, -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3; -CH-(CH3)2; -CH2-CH2-CH3-CH3, -CH(CH3)-CH2-CH3, -CH2-CH(CH3)-CH3, -C(CH3)3; (C1-C4) alquileno representa uma porção hidrocarboneto linear ou ramificada bifuncional contendo 1,2,3 ou 4 átomos de carbono tais como: -ch2-, -ch2-ch2-, -CH(CH3)- -ch2-ch2-ch2-, -CH(CH3)-CH2-, -ch2-ch2-ch2-ch2-, -CH(CH3)-CH2-CH2-, -CH2-CH(CH3)-CH2- -C(CH3)-CH2-; (C1-C4) alquilenocarbonilo representa uma porção carbonílica bifuncional contendo 2 a 5 átomos de carbono, tais como: -CH2-CO-, -CH2-CH2-CO-, -CH(CH3)-CO-, -CH2-CH2-CH2-CO-, -CH(C2Hs)-CO-, -CH(CH3)-CH2-CO-, -CH(C2Hs)-CH2-CO-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CO-, -CH(CH3)-CH2-CH2-CO-, -C(CH3)2-CH2-CO-; hidroxi(CrC4) alquileno representa uma porção alcanoica linear ou ramificada com de 1 a 4 átomos de carbono, tais como: -CH2-OH, -CH2-CH2-OH, -CH(CH3)-OH, -CH2-CH2-CH2-OH, -CH(CH3)-CH2-OH, -CH2-CH(CH3)-OH, -ch2-ch2-ch2-ch2-oh, -CH(CH3)-CH2-CH2-OH, -CH2-CH(CH3)-CH2-OH, -CH2-CH2-CH(CH3)-OH, -C(CH3)2-CH2-OH; di(Ci-C4) alquilamina, é uma porção amino substituída com dois grupos alquilo lineares 011 ramificados contendo 1,2,3 ou 4 átomos de carbono tais como: -N-(CH3)2, -10- τ
-N(CH3) (CH2-CH3), -N(CH2-CH3)2, -N(CH3) (CH2-CH2-CH3), -N(CH2-CH3) (CH2-CH2-CH3), -N(CH2-CH2-CH3)2, -N(CH3) [CH-(CH3)2], -N(CH2-CH3) [CH-(CH3)2], -N(CH3) (CII2-CH2-CH2-CH3), ♦ -N(CH2-CH3) (CH2-CHrCH2-CH3), -N(CH2-CH2-CH3) (CH2-CH2-CH2-CH3), -N(CH2-CH2-CH2-CH3)2 -N(CH2-CH2-CH2-CH3) [CH-(CH3)2]; um anel heterociclico com cinco ou seis membros de acordo com os significados de R2 ou R5 é um anel heterociclico tal como:
em que A representa hidrogénio ou hidroxi(Ci-C4) alquileno quando em referência ao substituinte "R2" ou A representa apenas hidrogénio quando em referência ao substituinte "R5"; um anel com cinco ou seis membros formado pelas porções R1 e alq-R2 em conjunto, é um anel heterocíclico tal como:
em que A1 representa hidrogénio ou os substituintes facultativos do anel heterocíclico tal como foi acima indicado.
Ao comparar as fórmulas acima referidas I e II, parece que os factores de GE 2270 ocorrem naturalmente com uma determinada quiralidade da molécula; de acordo com o presente invento, os compostos da fórmula I podem ser obtidos com ambas as quiralidades, no que se refere à ligação entre os aneis oxazolina e prolina. Embora em muitos casos, a actividade antimicrobiana dos dois epímeros (quer dos materiais de partida quer dos compostos do invento) seja quase igual, nalguns casos, contra estirpes particulares (por exemplo estreptococos), foi observada uma actividade antimicrobiana ligeiramente mais elevada correspondendo à actividade natural.
Assim, um grupo de compostos preferidos do invento são os compostos da fórmula geral Ia -12-
'*
em que o grupo GE, R1, alq e R2 são tal como foram definidos na fórmula I.
Outro grupo de compostos preferidos é constituído pelos compostos da fórmula I ou Ia em que o grupo GE é tal que W1 é fenilo, W2 é hidroxi, X1 é 2 12 metilo, X é metoximetileno e R, alq e R são tal como foram definidos na fórmula I.
Um outro grupo de compostos preferidos são os compostos da fórmula I ou Ia em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I e R1 representa hidrogénio ou (C1-C4) alquilo, alq representa (C1-C4) alquileno, (C2-C5) alquilenocarbonilo ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo azoto; R2 representa aminocarbonilo ou um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C4) alquilo e R4 representa (C1-C4) alquilo ou di(CrC4) alquilamino(Ci-C4) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado dc entre (CrC4) alquilo e hidroxi(C]-C4) alquileno; ou R1 c alq-R2 cm conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel hetcroeielico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro átomo de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C|-C4) alquilo, di(CrC4) alquilamino, di(Ci-C4) alquilamino-(C|-C4) alquileno e um grupo alq2-R5 em que alq» é (C1-C2) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (Ci-C4) alquilo e R7 representa (CrC4) alquilo ou di(Ci-C4) alquil-amino(Ci-C4) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio.
Um outro grupo de compostos preferidos são os compostos da fórmula I ou Ia em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I e R1 representa hidrogénio ou (Ci-C2)alquilo; alq representa (CrC3) alquileno, (C2-C3) alquilenocarbonilo ou um anel heterocíclico com cinco membros contendo azoto; - 14- It-v % '
R2 representa aminocarbonilo ou um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C3) alquilo e R4 representa (C1-C3) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino-(CrC2) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C1-C2) alquilo e hidroxi(Ci-C2) alquileno; ou R1 e alq-R2 em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro átomo de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (Ci-C2) alquilo, di(Ci-C2) alquilamino, di(Ci-C2) alquUamino(Ci-C2) alquileno e um grupo alq-R5 em que alq2 é (C1-C2) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (Ci-C2) alquilo e R7 representa (Ci-C2) alquilo ou di(Ci-C2) alquil-amino(Ci-C2) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio.
Compostos particularmente preferidos são os compostos da fórmula I ou Ia em que o grupo GE é tal que W1 é fenilo, W2 é hidroxi, X1 é metilo, X2 é metoximetileno e R1 representa hidrogénio ou (Ci-C2) alquilo, alq representa (CrC3) alquileno, R2 representa um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C3) alquilo e R4 representa (C1-C3) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino (C1-C2) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (CrC2) alquilo e hidroxi(Ci-C2) alquileno ou R1 e alq-R2 em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro átomo de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (CrC2) alquilo, di(CrC2) alquilamino, di(Ci-C2) alquilamino-(Ci-C2) alquileno e um grupo alq-R5 em que alq2 é (CpC2) alquileno e R é um grupo NR R em que R6 representa (Ci-C2) alquilo e R7 representa (CpC2) alquilo ou di(CpC2) alquil-amino(Ci-C2) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio. 1 9
Exemplos de grupos -N(R )alqR , tal como é definido na fórmula I, são os que se seguem: - 16-
- 16- —NH—CH- I -NH-(CH2)m-N(CH2)t(CH3) (CH2)PCH3 -Ν—(CH2)m-N(CH2)t(CH3) (CH2)qCH3 (CH2)PCH3 -Ν —(CH2)m“N-CH(CH3HCH2)^H3 (CH2)qCH3 CH(CH3HCH2)sCH3 -N(CH2)t{CH3) (CH2),CH3 (CH2)pCH3 -NH-(CH2)m-N-CH(CH3HCH2)rCH3 CH(CH3HCH2)SCH3 —NH-íCH^m—CO-N(CH2)t(CH3) {CH2)pCH3 ~NH“(CH2)m”N(CH2)n—N(CH2)t(CH3) (CH2)pCH3 (CH2)qCH3 -N-(CH2)m“N(CH2)—N(CH2)q-CH3 II! ~NH—(CH2)m— (CH2)t-CH3 <CH2)PCH3 (CH2)qCH3 -NH—(CH2)m i J \-(CH2)„-N(CH2}t(CH3)
Ny-/ (CH2)pCH3 (CH2)PCH3
—NH—(CH2)m N
"NH—(CH^m N
(CH2)n—N(CH2)t(CH3) (CH2)qCH3 -NH— (CH2)m n
(CH2)n-N(CH2)t(CH3) (CH^pCHs 17- í'-\i n .Λ«=3»ϊ=*<»»β —NH—(CHa),
jCH2)pCH3-O / \ -N ~(CH2)m--N N—(CHa)n-N(CH2)t<CH3) (CH2)pCH3 ^^ (CH2)qCH3 /“\ -NH-(CH2)m—N N—(CH^nOH \_/ (CH2)m~N(CHa)n N(CH2}t(CH3) / \ -NH-(CH2)m Nv N—(CH2)tCH3
-N
(CH2)pCH3 (CH2)qCH3 (CH2)pCH3
-N
/ \ -N-(CH2)m-Nv N— (CH2)pCH3
N I (CH2)qCH3 (CH2>qCH3 -j \ —(CH2)m-N(CH2)t{CH3) / / \ ^-/ (CH2)qCH3 -N N (CH2)m~N p em que: m e n = 1, 2, 3, ou 4; p, qet = 0, 1,2 ou 3; r e s = 0 ou 1.
Exemplos preferidos de grupos -N(R!)alqR2 são os que se seguem. —NH-(CH2)2—N(CH3)2
—N(CH3)—(CH2)2 N —NH-(CH2)3—N(CH3)2 f ^M -(CH2>2 0h - 18-
N N-CH3 V-/
—NH-(CH2)2—N(C2H5)2 —NH-(CH2)2”N(CH(CH3))2 —N{CH3)-(CH2)2—N(CH3)2 —N{C2H5)-(CH2)2—N(CH3)2 —NÍCaHsi-íCHzh—NiCaHsk N(CH3)2 CH2~“N(CH3)—(CH2)2—N(CH3)2
N —N(CH3)-CH2-CO—N(CH2)2—N(CH3)2 ch3 —NH—CH—CO—N(CH2)2—N(CH3)2 I I ch3 ch3 —N(CH3)—(CH2)2-N(CH2)2—N(CH3)2 ch3
r~{ N NH —NH—(CH2)2— /~Y -_^N—(CHs>)3-N(CH3)2 (CH2)2CH3 ,N,
NH — CH2—^ J / \ / \ -N N—(CH2)2-N O \_v \_// \ —N(CH3)—(CH2)2—H —CH3
Os compostos do invento podem formar sais de acordo com processos convencionais.
Em particular, os compostos da fórmula I em que o grupo -N(R')alqR2 contem ainda funções amina podem formar sais de adição de ácido.
Sais de adição preferidos dos compostos deste invento são sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis" significa os sais com ácidos os quais de um ponto de vista biológico, de fabrico e dc formulação são compatíveis com a prática farmacêutica assim como com a utilização na promoção do crescimento animal.
Sais de adição de ácido representativos e apropriados dos compostos da fórmula I incluem os sais formados por reacção padrão com ácidos tanto orgânicos como inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico, bromídrico, sulfurico, fosfórico, acético, trifluoroacético, tricloroacético, succí-nico, cítrico, ascórbico, láctico, maleico, fumárico, palmítico, eólico, pamóico, múcico, glutâmico, canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, laurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, dodecilsulfónico (estólico), benzenossulfó-nico, sórbico, pícrico, benzoico, cinâmico, etc. A transformação dos compostos do invento sem amino ou que não são sais nos sais de adição de ácido correspondentes, e o inverso, isto é a transformação de um sal de adição de um composto do invento na forma sem amino e que não é sal, situa-se no âmbito das capacidades técnicas habituais e é abrangida pelo presente invento. A única precaução consiste em evitar soluções com pH inferior a 4-5 ao preparar o sal de adição (para evitar a abertura do anel oxazolínico) e soluções com um pH superior a 8-9 qunando se liberta a base (para evitar epimerização no centro quiral).
Por exemplo, um composto da fórmula I pode ser transformado no correspondente sal de adição de ácido dissolvendo a forma não salina num solvente aquoso e adicionando um ligeiro excesso molar do ácido seleccionado. A solução ou suspensão resultante é então liofilizada a fim de recuperar o sal desejado. Em vez de liofilizar, nalguns casos, é possível recuperar o sal final por -20-
extracção com um solvente orgânico, concentração até um pequeno volume da fase orgânica separada e precipitação por adição de um não solvente.
No caso do sal final ser insolúvel num solvente orgânico em que a forma não salina é solúvel, ele poderá ser recuperado por filtração a partir da solução orgânica da forma não salina após adição da quantidade estoiquiométrica ou de um ligeiro excesso molar do ácido seleccionado. A forma não salina pode ser preparada a partir de um sal de adição de ácido correspondente dissolvido num solvente aquoso o qual é então neutralizado a fim de libertar a forma não salina. Esta é então recuperada por exemplo por extracção com um solvente orgânico ou é transformado num outro sal de adição de ácido adicionando o ácido seleccionado e manipulando tal como foi feito acima.
Um processo comum de dessalinização poderá ser utilizado quando, a seguir a neutralização, seja necessária uma dessalinização.
Por exemplo, cromatografia de coluna sobre resinas de polidextrano com poros controlados (tais como Sephadex LH 20) ou gel de sílica silanizado pode ser usada convenientemente. Após eluição dos sais não desejados com uma solução aquosa, o produto desejado é eluido por meio de gradiente linear ou gradiente passo a passo de uma mistura de água e de um solvente polar ou apoiar, tal como acetonitrilo/água de 50:50 a cerca de 100% de acetonitrilo.
Tal como é sabido nesta técnica, a formação de sal quer com ácidos farmaceuticamente aceitáveis quer com ácidos não farmaceuticamente aceitáveis poderá ser usada como uma técnica de purificação conveniente. Após formação e isolamento, a forma salina de um composto da fórmula I pode ser transformada -21 - no correspondente não sal ou num sal farmaceuticamente aceitável.
Nalguns casos o sal de adição de ácido de um composto da fórmula I é mais solúvel em água e solventes hidrofílicos e tem uma estabilidade química aumentada. Boa solubilidade e estabilidade em água ou solventes hidrofílicos de um composto activo são em geral apreciados nesta técnica, para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para a administração do medicamento.
Contudo, tendo em vista a semelhança das propriedades dos compostos da fórmula I e seus sais, o que é referido no presente pedido em relação às actividades biológicas dos compostos da fórmula I aplica-se também aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e vice-versa.
Um método apropriado para a preparação dos compostos deste
invento (aqui a seguir definido como "Método A") compreende a) reacção de um composto da fórmula III
COOH
III
em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I, com uma serinamida apropriada da fórmula IV:
nh2
IV em que R1, alq e R2 são tal como na fórmula I, num solvente orgânico inerte na presença de um agente de condensação; b) ciclizando a porção serina do composto obtido da fórmula Illa /
O HO
N alq - R2 \
CO
Illa com um reagente de ciclizaçâo apropriado a fim de se obter a ciclização de serina-oxazolina.
De acordo com o método A, a quiralidade do composto final é determinada pela quiralidade do reagente serinamida utilizado, com retenção da configuração do centro quiral serina. Assim, para se obter os derivados de amida com uma quiralidade correspondendo à natural, deverão ser utilizadas L-serinamidas.
Solventes apróticos orgânicos inertes úteis para a reacção de condensação de acordo com o método A são os solventes que não interferem de um modo desfavorável com o evoluir da reacção e são capazes de pelo menos parcialmente solubilizarem o material de partida antibiótico.
Exemplos dos referidos solventes são amidas orgânicas, éteres de glicois e poliois, fosforamidas, sulfóxidos. Exemplos preferidos são: dimetilf- ormamida, dimetoxietano, hexametilfosforamida, dimetilsulfóxido, dioxanu, e suas misturas. De preferência, é utilizada dimetilformamida (DMF). O agente de condensação no presente método é um agente apropriado para formar ligações amida em compostos orgânicos e em particular na síntese de peptideos.
Exemplos representativos e preferidos de agentes de condensação são (C1-C4) alquilo, fenilo ou fosforazidatos heterocíclicos tais como, difenil-fosforazidato (DPPA), dietil-fosforazidato, di(4-nitrofenil)-fosforazidato, dimor-folil-fosforazidato e difenilfosforocloridrato ou benzotriazol-l-il-oxi-trispirroli-dinofosfónio-hexafluorofosfato (PyBOP). O agente de condensação preferido é DPPA. O agente de condensação é geralmente utilizado num excesso ligeiramente molar, tal como de 1,1 a 1,5; de preferência o excesso molar de agente de condensação é 1,2 vezes maior do que a quantidade de composto de partida antibiótico GE 2270.
De acordo com o presente método, a serinamida da fórmula IV é normalmente usada num excesso molar ligeiro.
Em geral, é usado um excesso molar ligeiro de 1 a 1,5 vezes, embora seja preferido um excesso molar de 1,2 vezes.
Para que a amidação prossiga, é necessário que a serinamida da fórmula IV seja capaz de formar um sal com a função carboxi do material de partida do antibiótico. Como isto poderia requerer a utilização de uma maior quantidade de serinamida, nesse caso é conveniente adicionar uma base formadora de sal à mistura da reacção, pelo menos numa quantidade equimolai, e de preferência um excesso molar de 2 a 3 vezes, no que se refere ao material de partida do antibiótico.
Exemplos das referidas bases formadoras de sal são aminas terciárias orgânicas alifáticas ou aliciclicas tais como trimetilamina, trietilamina (TEA), N*metil pirrolidina ou bases heterocíclicas tais como picolina, etc.
Além disso, a serinamida da fórmula IV pode também ser introduzida de um modo conveniente no meio da reacção como um correspondente sal de adição de ácido, tal como hidrocloreto, trifluoroacetato, etc. Com efeito, pelo menos nalguns casos, a utilização da serinamida salificada da fórmula IV, que é então libertada in situ com as bases acima mencionadas, é preferida, particularmente quando o sal é mais estável do que a amina livre correspondente. Neste caso, é usada pelo menos uma proporção dupla molar e de preferência um excesso molar de 2 a 3 vezes de uma base forte capaz de libertar a serinamida da fórmula IV a partir dos seus sais, Também neste caso, a base apropriada é uma amina terciária orgânica alifática ou alicíclica tal como as que foram acima exemplificadas, de preferência TEA. A temperatura da reacção irá variar consideravelmente dependendo dos materiais de partida específicos e das condições de reacção. Em geral, é preferido conduzir a reacção a temperaturas entre 0o C e à temperatura ambiente, de preferência começando a cerca de 0o C e permitindo que a mistura alcance a temperatura ambiente durante a reacção. O tempo de reacção varia, também, consideravelmente dependendo de outros parâmetros da reacção; em geral a condensação fica completa em cerca de 5-24 horas. -25- -25-
/<4. -
Geralmente, a evolução da reacção é monitorizada por TLC (cromatografia de placa delgada) ou de preferência por HPLC (cromatografia líquida de elevada performance) de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Tendo como base os resultados destes ensaios qualquer pessoa especializada nesta tccnica será capaz de avaliar a evolução da reacção e decidir quando parar a reacção c iniciar a manipulação da massa da reacção de acordo com técnicas conhecidas per se. Por exemplo a mistura da reacção poderá ser vertida para uma solução básica aquosa para precipitação do composto da fórmula Illa sob a forma dc um sal de adição. A solução básica deverá ter um pH apropriado para precipitar o sal do composto desejado, sem modificar a sua estrutura química. Em geral, o pH varia entre 8 e 10, e é obtido com uma solução aquosa de uma base inorgânica, tal como hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos de metal alcalino ou alcalino terroso, etc. O composto da fórmula Illa é obtido sob a forma de um produto crú, após filtração e evaporação da solução básica acima referida, visto que o passo de purificação é de preferência realizado depois da reacção de ciclização. Contudo, quando se deseja obter um produto purificado, as técnicas de separação e de purificação conhecidas per se podem ser utilizadas, o que inclui, por exemplo, extraeção com solventes, precipitação por modificação do pH, precipitação por adição de não solventes, etc., em conjunto com separações e purificações posteriores por cromatografia de coluna. O passo b) do presente processo, isto é a ciclização de serina-oxazolina é realizada de acordo com métodos conhecidos per se nesta técnica.
De acordo com uma apresentação preferida, o composto da fórmula Illa é feito reagir com hidróxido de metoxicarbonilsulfamoiltrietilamónio, sal interno (reagente de Burgess), e a mistura da reacção é então submetida a refluxo para se obter a ciclização da oxazolina.
Com maior detalhe, o composto da fórmula Illa obtido é feito reagir com um excesso (cerca de 3:1 a 15:1) de reagente de Burgess, na presença de um solvente orgânico aprótico oxigenado, para se obter o correspondente éster sulfamoilo do reagente de Burgess.
Exemplos de solventes oxigenados apróticos orgânicos são éteres saturados lineares ou cíclicos de éteres de glicol. Exemplos preferidos dos referidos solventes são tetra-hidrofurano (THF), dioaxano. Solventes facultativamente clorinados podem também ser adicionados à mistura da reacção, tal como diclorometano (CH2CI2), clorofórmio, para aumentar a solubilidade dos reagentes.
Facultativamente, uma base poderá também ser adicionada à mistura da reacção, a fim de evitar efeitos secundários indesejáveis. Exemplos de bases são aminas terciárias orgânicas alifáticas ou alicíclicas tais como trimetilamina, trietilamina (TEA), N-metil pirrolidina ou bases heterocíclicas tais como picolina, etc; de preferência é utilizada TEA. A temperatura da reacção irá variar consideravelmente dependendo dos materiais de partida específicos e das condições da reacção. Em geral, é preferível conduzir a reacção a temperaturas variando entre 18° C e 30° C, de preferência à temperatura ambiente. O tempo da reacção também varia consideravelmente dependendo de outros parâmetros da reacção; em geral a reacção tica completa em cerca de 4 a 20 horas.
Geralmente, a evolução da reacção é monitorizada por TLC ou de preferência por HPLC de acordo com métodos conhecidos nesta técnica.
Depois da reacção ficar completa, é adicionado um álcool secundário ou terciário à mistura da reacção, para arrefecimento brusco da reacção. O referido álcool deverá ser capaz de reagir com o reagente de Burgess nào reagido e ser transformado em compostos olefínicos, de preferência olefinas com baixo ponto de ebulição. Assim, um álcool secundário ou terciário (C3-C5) poderá ser utilizado apropriadamente, tal como isopropanol, tert-butanol, 1-metil-propanol. 1,1-dimetil-propanol, 1,2-dimetil-propanol, 1-etilpropanol; de preferência, c utili/ado isopropanol. A mistura da reacção é então submetida a refluxo para ciclização da oxazolina. O tempo e a temperatura do refluxo irão variar principalmente dependendo dos solventes presentes na mistura da reacção. Por exemplo, se os solventes de ebulição (por exemplo álcoois, solventes clorinados) forem removidos antes do refluxo, serão obtidas temperaturas de refluxo mais elevadas. Assim, dependendo do tipo de solventes presentes na mistura de refluxo, a temperatura irá variar entre 50° C e 80° C. Em geral, quanto maior for a temperatura de refluxo, tanto mais curto será o tempo, com o tempo de refluxo variando consequentemente entre 20 e 5 horas.
Também neste caso, a evolução da reacção é monitorizada por TLC ou de preferência por HPLC de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Tendo como base os resultados destes ensaios um indivíduo especializado nesta técnica será capaz de decidir quando deve interromper o refluxo e iniciar a manipulação da massa da reacção de acordo com métodos conhecidos per se, as quais incluem, tal como foi acima referido, extraeção com solventes, precipitação por modificação do pH, precipitação por adição de não solventes, etc., em conjunto com outras técnicas cromatográficas de separações e purificações, tais como cromatografia "flash" (por exemplo gel de sílica usando misturas de diclorometano/metanol como eluente), cromatografia de fase reversa ou cromato-grafía sobre óxido de alumínio neutro (usando misturas de diclorometano/metanol como eluente). O material de partida da fórmula III em que o grupo GE é tal que 1 -y f λ W é fenilo, W é hidroxi, X é metilo e X é metoximetileno, correspondendo ao factor A3 do antibiótico GE 2270, e o processo de hidrólise para a sua preparação, são apresentados na Patente dos E.U.A. No. 5.139.778.
Em geral, as condições hidrolíticas acima mencionadas envolvem a utilização de misturas de meios acídicos aquosos tamponados ou não tamponados e solventes orgânicos polares. A temperatura da reacção varia dependendo de factores tais como a força e a concentração do ácido utilizado, e está geralmente compreendida entre -10° C e 90° C. Acontece também que o tempo de reacção varia consideravelmente dependendo de parâmetros tais como a temperatura, a força do ácido e sua concentração; geralmente, o tempo varia entre alguns minutos e várias horas.
Em geral, quando são utilizadas condições de hidrólise mais suaves, por exemplo tempo de reacção mais curto e temperatura mais baixa ou força do ácido ou concentração mais baixa, o factor Aj é normalmente obtido, enquanto que condições de hidrólise mais fortes proporcionam o factor A2 do antibiótico GE 2270. Para se obter o factor A3 do antibiótico GE 2270, são necessárias condições de hidrólise ainda mais drásticas. O factor A2 pode também ser convertido no factor A3 por meio de hidrólise básica com produto alcalino diluído.
Seguindo o processo acima referido, mas começando a partir do Factor R2, C,, C2 ou Factor amitiamicina A e de GE 2270 em vez de factor A de GE 2270, são obtidos os respectivos materiais de partida da fórmula ΠΙ. A serinamida da fórmula IV é preparada de acordo com técnicas conhecidas per se de síntese de peptídeos, descritas num certo número de livrros de referência tais como E. Gross and J. Meienhofer "The Peptides", Vol. 3, Academic Press, New York, 19S1 e M. Bodansky and A. Bodansky "The Practice ofPeptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 1984.
Como um processo geral, uma serina N-protegida é feita reagir com a amina desejada da fórmula IVa
FP H—/ IVa
Qlq-R2 em que R1, alq, e R2 são tal como foram definidos na fórmula I. Tal como foi acima referido, quando são desejados derivados da amida da fórmula I com uma quiralidade correspondente à natural, serão utilizadas L-serinamidas; consequentemente, a amina da fórmula IVa será feita reagir com uma L-serina N-protegida.
Tal como é sabido nesta técnica, as reacções de amidação podem ser realizadas na presença de um agente de condensação (por exemplo fosforazidatos tais como difenilfosforazidato, DPPA) ou então o amino ácido N-protegido pode ser feito reagir sob a forma de um éster activado (tal como pentafluorofenilo, N-hidroxisuccinimida ou éster 1-hidroxibenzotiazole).
Os grupos de protecção utilizados no processo acima descrito são os grupos geralmente utilizados na síntese de peptideos. De preferência, a N-protecção de serina é realizada com um grupo de protecção que seja facilmente removido em condições hidrolíticas ácidas ou neutras, tais como t-butoxicarbonilo (Boc) ou benziloxicarbonilo (Cbz). -30- *
De preferência, a N-desprotecção da serinamida é realizada apenas pouco antes da reacção de amidação com o material de partida de GE 2270, de modo a evitar a formação de produtos secundários indesejáveis. A amina da fórmula geral IVa é um composto comercialmente disponível ou é preparada de acordo com técnicas conhecidas per se, descritas num certo número de livros de referência, tais como "Comprehensive Organic Synthesis", vol. 1991, Pergamon Press.
Outro método (aqui a seguir definido como "Método B") para a preparação dos compostos do invento consiste em fazer reagir um composto da fórmula V
em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I, com uma serinamida da fórmula IV tal como foi acima definido, num solvente orgânico prótico.
Também neste caso, a quiralidade do composto final é determinada pela quiralidade do reagente serinamida utilizado, com retenção da configuração do centro quiral da serina.
Solventes orgânicos próticos preferidos são os solventes que não interferem desfavoravelmente com a evolução da reacção e são capazes de pelo menos solubilizarem parcialmente o material de partida do antibiótico. Exemplos preferidos desses solventes são (C1-C4) álcoois, tais como metanol, etanol, propanol, iso-piopaiiol, butanol, isobutanol c suas misturas.
De preferência, também quantidades minor de um solvente orgânico aprótico são adicionadas, para aumentar a solubilidade do material de partida de GE 2270; solventes preferidos são neste caso solventes clorinados, sendo particularmente preferido o diclorometano.
Além disso, como a serinamida da fórmula IV é de preferência utilizada sob a forma de sal de adição de ácido, uma base tal como foi anteriormente definida é de preferência adicionada à mistura da reacção. A quantidade total de base irá depender do número de grupos amínicos salifícados de serinamida; como regra geral, se "n" for o número de equivalentes de grupos amínicos salifícados, então equivalentes "n-1" da base são adicionados.
Exemplos das bases referidas são, tal como foi acima referido, aminas terciárias orgânicas alifáticas ou alicíclicas tais como trimetilamina, trietilamina (TEA), N-metil-pirrolidina ou bases heterocíclicas tais como a picolina, etc., sendo preferida a TEA. A temperatura da reacção irá variar consideravelmente dependendo dos materiais de partida específicos e das condições de reacção. Em geral, é preferido conduzir a reacção a temperaturas variando entre 15° C e 30° C, de um modo conveniente à temperatura ambiente.
Também o tempo de reacção varia consideravelmente dependendo dos outros paraâmetros da reacção; em geral a condensação fica completa em cerca de 20-40 horas.
Geralmente, a evolução da reacção é monitorizada por TLC ou de preferência por HPLC de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Tendo como base os resultados destes ensaios um especialista nesta técnica será capaz -32-
V & ι ·/ ' de avaliar a evolução da reacção e de decidir quando interromper a reacção e iniciar a manipulação da massa da reacção de acordo com técnicas conhecidas per se, que incluem, tal como foi acima referido, extracção com solventes, precipitação por modificação do pH, precipitação pela adição de não solventes, etc., em conjunto com outras separações cromatográficas e técnicas de purificação, tais como cromatografia "flash" (por exemplo sobre gel de sílica usando misturas dc diclorometano/etanol como eluente), cromatografia de fase reversa ou cromatografia sobre óxido de alumínio neutro (usando misturas de diclorometano/mctanol como eluente).
Um mctodo apropriado para a preparação do material de partida da fórmula V é tal como foi descrito no Pedido de Patente Europeia no. 565567, aqui incorporado como referência. O factor A2 do antibiótico GE 2270 (preparado tal como foi descrito na Patente dos E.U.A. No. 5.139.778 acima citada), ou os derivados correspondentes de factor B2, Q, C2 ou factor amitiamicina A dc GE 2270, é feito reagir com amónia na presença de um solvente prótico orgânico, de preferência (C1-C4) álcool, sendo particularmente preferido o metanol. Após cerca de 2 a 4 dias, de preferência 3 dias, a solução é evaporada e o resíduo é manipulado de acordo com técnicas conhecidas per se acima referidas, obtendo-se desse modo 0 respectivo derivado de amida da fórmula:
O composto obtido é por seu lado feito reagir com uma solução de reagente de Burgess num solvente aprótico orgânico. Solventes apropriados são éteres cíclicos ou de glicol tais como solventes THF ou dioxano ou solventes clorinados tais como diclorometano (CH2CI2) ou clorofórmio, 011 suas misturas; sendo de preferência utilizada uma mistura de THF/CH2CI2. -33-
Além disso, uma base é adicionada facultativamente à mistura da reacção, tal como foi previamente descrito; de preferência é utilizada trietilamina.
Facultativamente, mais reagente de Burgess poderá ser adicionado à mistura da reacção após 12 a 20 horas, de preferência após 16 horas. A temperatura da reacção, dependendo dos outros parâmetros da reacção, pode variar entre 18° C e 30° C, de preferência à temperatura ambiente.
Acontece também que o tempo de reacção varia consideravelmente dependendo dos outros parâmetros da reacção: em geral a reacção fica completa em cerca de 12 a 36 horas após a última adição de reagente de Burgess.
De um modo geral, a evolução da reacção é monitorizada por TLC ou de preferência por HPLC de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Tendo como base os resultados destes ensaios um especialista nesta técnica será capaz de decidir quando interromper a reacção e iniciar a manipulação da massa da reacção de acordo com técnicas conhecidas per se, as quais incluem, tal como foi acima referido, extracção com solventes, precipitação por modificação do pH, precipitação pela adição de não-solventes, etc., em conjunto com outras técnicas de separações e de purificações, tais como cromatografia "flash" (por exemplo sobre gel de sílica usando misturas de diclorometano/metanol como eluente). O correspondente derivado nitrilo da fórmula
CN
GE -34-
V c assim obtido, o qual é então dissolvido em etanol, de preferência na presença de um cosolvcnte clorinado (por exemplo diclorometano, clorofórmio), e a solução é arrefecida a cerca 0o C; HC1 seco é então feito borbulhar através da solução durante de 4 a 8 horas, de preferência durante 6 horas. Λ mistura da reacção é de preferência deixada repousar a cerca de 4o C durante dc 10a 18 horas, sendo então vertida para uma solução básica de tamponamento para neutralização do HC1 em excesso; essa solução, tendo um pH inferior a 10, é gcralmente um tampão fosfato ou carbonato, de preferência um tampão carbonato, sendo particularmente preferida uma solução aquosa saturada de carbonato dc sódio. O sólido que precipita é manipulado de acordo com técnicas conhecidas per se acima conhecidas, obtendo-se assim o material de partida desejado da fórmula V.
Um outro método para a preparação dos compostos do invento (aqui a seguir definidos como "Método C") consiste em fazer reagir um composto da fórmula VI o
VI
em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I, com uma amina da fórmula geral IVa: -35- í/i ή *, *-*V /<?·. y~*, e R1 / IVa
H—N ^alq — R2 1 0 em que R , alq, e R são tal como foram definidos na fórmula I, na presença de um solvente orgânico inerte e de um agente de condensação.
Solventes apróticos orgânicos inertes úteis são tal como foram definidos para o método A.
Também o tipo e quantidades de agente de condensação são os definidos para a reacção de condensação do método A. O material de partida da fórmula VI é de preferência usado na sua forma salificada, de preferência sob a forma de um sal de metal alcalino, sendo particularmente preferido o sal de sódio. Assim, ácido forte é convenientemente adicionado à mistura da reacção, para libertação do composto do seu sal; em geral é de preferência adicionado um excesso 2 vezes maior de equivalentes ácidos. Exemplos de ácidos fortes são ácidos halídricos ou ácido sulfúrico; de preferencia é utilizado ácido clorídrico.
Tal como foi acima referido, a base que forma sal é de preferência adicionada à mistura da reacção; o tipo e a quantidade dessa base irá variar dependendo dos parâmetros acima definidos (isto é, a quantidade de amina da reacção e utilização de amina salificada), assim como na presença do ácido forte acima referido; se o referido ácido estiver presente, pelo menos uma quantidade equivalente de base para cada equivalente de ácido é posteriormente adicionada à mistura da reacção. A temperatura da reacção irá variar de um modo considerável dependendo dos materiais de partida específicos e das condições da reacção. Em -36-
geral, é preferido conduzir a reacção a temperaturas variando enUe 15° C e 30° C, convenientemente à temperatura ambiente.
Também o tempo da reacção varia consideravelmente dependendo dos outros parâmetros da reacção. Em geral a reacção de condensação fica completa em cerca de 10-16 horas.
Geralmente, a evolução da reacção é monitorizada por TLC ou de preferência por HPLC de acordo com métodos conhecidos nesta técnica. Tendo como base os resultados desses ensaios um especialista nesta técnica será capaz de avaliar a evolução da reacção e decidir quando parar a reacção e iniciar a manipulação da massa da reacção de acordo com técnicas conhecidas per se, que incluem, tal como foi acima referido, extracção com solventes, precipitação por modificação do pH, precipitação por adição de não solventes, etc., em conjunto com outras separações cromatográficas e técnicas de purificação, tais como cromatografia "flash" (por exemplo sobre gel de sílica usando misturas de diclorometano/metanol como eluente), cromatografia de fase reversa ou cromatografia sobre óxido de alumínio neutro (usando misturas de diclorometano/metanol como eluente).
Um método apropriado para a preparação de material de partida da fórmula VI consiste em fazer reagir uma solução do material de partida da fórmula geral V em etanol, de preferência na presença de um co-solvente clorinado (por exemplo diclorometano, clorofórmio) com um sal éster de L-serina (C1-C4) alquilo, de preferência hidrocloreto de éster metílico. A temperatura da reacção irá variar entre 15° C e 30° C, de preferência a mais ou menos a temperatura ambiente, durante um tempo de reacção variando entre 3 e 5 dias, de preferência cerca de 4 dias. A mistura da reacção é então manipulada de acordo com técnicas -37- -37- Ici ίί»/· /<>.ν v^-e * conhecidas per se, e o sólido obtido é purificado por meio de técnicas cromatográficas conhecidas, de preferência por cromatografia sobre gel de sílica, obtendo-se desse modo o composto da fórmula:
0-2 em que Z representa (C1-C4) alquilo. 0 composto acima referido é então dissolvido num solvente orgânico inerte (por exemplo alquilamidas, alquilnitrilos, éteres saturados lineares ou cíclicos, éteres glicólicos, fosforamidas, solventes clorinados ou suas misturas; de preferência dioxano) e hidrolisado com uma base forte, tal como um hidróxido de metal alcalino terroso, de preferência hidróxido de sódio, obtendo-se o correspondente sal de sódio de ácido carboxílico, o qual pode ser recuperado de acordo com técnicas conhecidas per se, por exemplo por adição de não solventes, de preferência éter etílico. O assim obtido material de partida é em geral uma mistura de dois epímeros, visto que a hidrólise básica leva normalmente à epimerização do centro quiral no anel de oxazolina. Esta mistura pode ser separada ou utilizada como tal para a reacção de condensação com a amina, obtendo-se desse modo uma mistura epimérica dos compostos do invento.
Se desejado, a mistura epimérica pode ser separada (antes ou após a reacção de condensação) de acordo com técnicas conhecidas per se, tais como 38- > HPLC de fase reversa, cromatografia sobre óxido de alumínio neutro ou básico ou HPLC em fases quirais. O quadro que se segue apresenta a fórmula estrutural de alguns compostos representativos do invento, para os quais a actividade antimicrobiana e a metodologia de preparação são apresentadas na parte que se segue da especificação. A molécula central de todos os compostos, isto é o grupo GE, corresponde ao factor A do antibiótico GE 2270. É pretendido que todos os compostos sejam misturas enantioméricas (enantiómeros R,S), com excepção dos compostos 4s, lOs, 19s e 21s, que correspondem a enantiómeros S.
CompostoN°. 3 4,4s 5 6 7 8 9 "olq - R2 (CH2)CH3 —NH—CH2—\ ]\-J A-i —NH—(CH2h“'N I —NH-(CH2)2—NtCaHsfe —N(CH3>—(CH2)2—N(CH3)2 —NH-(CH2)3—N(CH3)2r~\ -p —CH3 —NH-(CH2h~N(CH3)2 —N(C2H5) —(CH2)2—N(CH3)2 —NtCaHs)—(CH^—N(C2Hs)2 —H' grupo 10,10$ 11 -o- N(CH3)2 —NH-tCH^—NtCHtCHs)^
12 -39- η r· R1 composto —grupo N°. ^ alq “ R2 CONH2 13 14
-NH
15 16 17 18 19.19S 20 21,21s —N(CH3)—CH2-CO“-N(CH2)2—N(CH3)2 ch3 —NH-CH—CO-N{CH2)2—N(CH3)2 I I CH3 CHs —N(CH3)—(CH2)2 N(CHí)2—N(CH3>2 )-V CH3 -N (CH2)3-N(CH3)2V_/ "“N(CH3)—{CHsh— _ H CH3 -N(CH3)-(CH2)2 v__/
(CH2)2—OH Λ"λ /~\ -N N—(CH2)2-N O v_/ w CH2—N(CHa)—(CH2W—N(CH3)2 -N 7 A actividade antimicrobiana dos compostos do invento pode ser demonstrada por uma série de testes padrão in vitro. A concentração inibidora mínima (CIM) foi determinada por metodologia de diluição de microcaldo, na presença de 0,01% (p/v) de albumina do soro bovino (BSA). BSA é adicionada ao diluente a fim de evitar possível aderência dos compostos do invento à superfície plástica dos recipientes de microtitulação, tal como é também apresentado por B. Goldstein et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 32 (1993), 741-745. -40- Γ·
Os produtos inoculados foram 104 CFU/ml, com excepção para Propionibacterium acnes e Bacteroides Fragilis (105 CFU/ml).
As CIMs foram registadas após 18-24 horas, excepto para Hacmophilus influenzae. P. acnes. B. fragilis (48 horas).
Todos os microorganismos foram incubados a 37° C; H. influenzae numa atmosfera de CO2 a 5%, anaerobicos numa mistura N2-CO2-H2 (80:10:10); outros organismos ao ar.
Os meios de cultura são: caldo Oxoid Iso-Sensitest para estafílo-cocos e Enterococcus faecalis; caldo Difco Todd Hewitt para estreptococos; caldo de infusão de cérebro e coração Difco + 1% de Difco Supplement C para H. influenzae: caldo Difco Wilkins-Chalgren para anaeróbios. CIMs para alguns microorganismos são referidas mais abaixo no
Quadro I.
ClM (los compostos (pg/ml) r- 0,13 n.t. d - 00 n.t. n.t. 4-í d d Ό 0,06 nt· d *^f 0,25 0,25 n.t. n.t. 128 n.t. o o θ' n.t. c - 0,25 V) CM θ' (N n.t. d 32 d ΙΛ 0,06 0,06 O θ' - 0,25 C"» T-H θ' 0,5 0,016 0,03 00 64 0,06 Ό O θ' 0,06 0,5 cn θ' θ' IO θ' 0,016 1 0,016 00 m 0,06 n.t. d (N 0,5 0,5 n.t. n.t. n.t. 128 CM 0,06 n.t. d - 0,25 0,5 -51- +-j d d n.t. 128 - 0,06 n.t. d (N 0,25 0,5 (N n.t. d n.t. oo CM ESTIRPE Código Interno Staphylococcus aureus LI65 Staph. epidermidis ATCC 12228 LI47 Staph. Haemolyticus L602 Streptococcus pyogenes L49 Strept. Pneumoniae L44 Strept. Sanguis LI 721 Strept. agalactiae L310 Enteròcocc. faecalis ATCC 7080 LI49 Propionibact. acnes ATCC 6919 L1014 Bacteroides fragilis ATCC 25285 L1011 " "' " — 1"" I Haemoph. influenzae ATCC 19418 L970
/Jf CIM dos compostos (pg/ml) Tf 0,06 4-j d 4—1 d <N ir> «N θ' <N θ' 4- 4-j d 4-j d 4-j d n.t ro θ' 0,5 >/^ θ' rt θ' n.t. 4-4 d 43 O θ' 0,13 >128 128 12 0,06 4-» d +-» c <N Ο r\ O 4- +j d 4-> d 4-4 d 4-j d F"4 0,13 •4-» d 4-4 d OO CN -4- >128 4-4 d 4-4 d n.t. n.t. lOs 0,03 0,06 0,13 - 0,5 0,5 Γ4 0,03 0,016 00 00 10 0,06 4-j d 4-* C Γ4 0,25 θ' 4-^ d n.t. n.t. n.t. β\ 0,06 +j d 4-j d <N o" - 32 n.t. 4-j d n.t. 4-j d 00 0,06 4-j d 4-j d OO cT Ψ ‘ < Tf 4-i d n.t. 4-j d n.t. ESTIRPE Código Interno Staphylococcus aureus L16 5 Staph. epidermidis ATCC 12228 LI47 Staph. haemolyticus L602 Streptococcus pyogenes L49 Strept. pneumoniae L44 Strept sanguis L1721 Strept agalactiae L310 Enterococc. faecalis ATCC 7080 LI49 Propionibact. acnes ATCC 6919 L1014 Bacteroides fragilis ATCC 25285 L1011 Haemoph. influenzae ATCC 19418 L970 -42-
-43-
ο IR R O w o P4 Q < D θ' 21s 0,06 0,06 0,016 ΙΛ o 0,13 n.t. 4-5 d 0,03 0,016 00 OO 0,06 n.t. n.t. - 0,25 0,25 't 4-5 d n.t. n.t. 4-* d 20 VO o o n.t. n.t. 0,5 - >128 4-5 d n.t. 4-5 d n.t. 19s 0,06 0,06 0,13 - 0,13 n.t. 4-5 d 0,016 0,016 00 00 OS 0,06 0,06 0,13 - 0,13 0,13 CM 0,016 0,016 rt* vo 4«H 00 0,06 4-j d 1 n.t. (N 0,25 0,25 4-5 d n.t. -4-5 d +-j d r- *4 0,06 n.t. 4-» d (N o" 0,5 oo -t-j d n.t. 4-5 d 4-» d v© 0,06 4-5 d 4-5 d (N 0,25 0,25 oo d 4-5 d 4-5 d 4-5 d ID 4-4 0,06 n.t. n.t. 0,25 0,5 4-5 d n.t. n.t. n.t. ESTIRPE Código Interno Staphylococcus aureus LI65 Staph. epidermidis ATCC 12228 L147 Staph. haemolyticus L 602 Streptococcus pyogenes L49 Strept. pneumoniae L44 Streot. sanguis LI721 Strept agalactiae L310 Enterococc. faecalis ATCC 7080 L149 Propionibact. acnes ATCC 6919 L1014 Bacteroides Fragilis ATCC 25285 L1011 Haemoph. influenzae ATCC 19418 L970
Tendo em vista as suas propriedades, os compostos do invento podem ser usados como ingredientes activos na preparação de medicamentos para tratamento humano ou animal.
Em particular, os derivados de amida do antibiótico GE 2270 da fórmula I são agentes antimicrobianos principalmente activos contra bactérias gram positivas. A indicação terapêutica principal das substancias antibióticas do invento consiste assim no tratamento de infecções relacionadas com a presença de microorganismos susceptíveis a essas substancias. O termo "tratamento" pretende abranger também a profilaxia, tratamento e cura. O paciente que recebe este tratamento é qualquer animal necessitado desse tratamento, incluindo primatas, em particular o ser humano, e outros mamíferos tais como equinos, gado bovino, porcos, carneiros, aves domésticas e animais de companhia em geral.
Os compostos do invento podem ser administrados como tal ou em mistura com veículos farmaceuticamente aceitáveis e podem também ser administrados conjuntamente com outros agentes antimicrobianos. A terapêutica conjunta inclui assim a administração sequencial, simultânea e separada dos compostos activos de um modo tal que os efeitos terapêuticos do primeiro composto administrado não tenham desaparecido quando o comprimido subsequente seja administrado. A dosagem do ingrediente activo depende de muitos factores que incluem o tipo, idade e condições do paciente, ingrediente activo específico e formulação seleccionada para administração, esquema de administração, etc.
Testes experimentais para a determinação da sensibilidade dos microorganismos isolados a partir do paciente podem também oferecer uma indicação útil para seleccionar a dosagem apropriada.
Em geral, dosagens antimicrobianas eficazes são utilizadas sob a forma de dosagem unitária simples.
Aplicações repetidas destas formas de dosagem, por exemplo de 2 a 6 vezes por dia, são em geral preferidas. Uma dosagem eficaz pode em geral variar entre 0,5-50 mg/kg do peso corporal/dia.
De qualquer modo, o médico assistente será capaz de determinar a dosagem óptima para um determinado paciente numa determinada situação.
Os compostos do invento podem ser formulados em formulações apropriadas para administração parentérica contendo um veículo líquido, de acordo com processos conhecidos per se nesta técnica. Exemplos de veículos apropriados para a preparação de formas de dosagem injectáveis dos compostos do invento são água, veículos aquosos (por exemplo injecções de Dextrose), solventes miscíveis com a água (por exemplo álcool etílico, polietileno glicol, propileno glicol, etc.) e veículos não aquosos (por exemplo "óleos fixados" tais como óleo de milho, óleo de sementes de algodão, óleo de amendoim e óleo de gergelim). Facultativamente, a preparação injectável poderá ainda conter agente tensio-activo (por exemplo mono-oleato de polioxietileno-sorbitano ou óleo de pimenteiro polietoxilado), tampões para estabilização da solução (por exemplo -46- citratos, acetatos e fosfatos) e/ou antioxidantes (por exemplo ácido ascórbico ou bisulfito de sódio).
Por exemplo, uma formulação típica para administração parentérica pode conter 5 a 50 mg de um composto do invento por ml da preparação final. O composto irá geralmcnte ser formulado em água para injecção, facultativamente em mistura com 10-20% de um agente tensio activo o qual pode ser um éster de ácido gordo polioxictilcno-sorbitano, um derivado de óleo de polioxietileno-rícino ou um derivado de óleo de pimenteiro hidrogenado polioxietileno; facultativamentc, a formulação pode ainda conter 10-20% de um agente de solubilização tal como propileno glicol, dimetilacetamida, dimetilformamida, ter-butil-N-hidroxicarabamato, 1,2-, 1,3-, ou 1,4-butandiol, oleato de etilo, tetra-hidrofurfuril-polictileno-glicol 200, isosorbido de dimetilo, álcool benzílico, etc. Um agente de solubilização preferido é propileno glicol.
Esteres de ácido gordo polioxietileno-sorbitano encontram-se comercialmente disponíveis e alguns deles são comercializados com o nome comercial "Twecn". São também conhecidos com o nome não proprietário de "polissorbatos". Seus exemplos são polissorbato 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 e 85. Preferido para utilização nas formulações do invento é polissorbato 80 (mono-9- octadecanoato de sorbitano, derivados de poli(oxi-l,2-etanodi-ilo)). *
Oleos de rícino polioxietilénicos e óleos de rícino polioxietilémeos hidrogenados encontram-se também comercialmente disponíveis. Alguns deles estão comercializados com o nome comercial "Cremophor". Exemplos desses compostos são os conhecidos como Cremophor EL (óleo de rícino polioxietilado), Cremophor RH 40 (óleo de rícino hidrogenado polioxietilado), Cremophor RH 60 (óleo de rícino hidrogenado PEG 60) ou Emulphor EL-719 (óleo vegetal polioxietilado).
Caso seja necessário, o pH da preparação pode ser ajustado com um agente de tamponamento apropriado; de um modo conveniente, pode ser usado TRIS (isto é, tri-hidroximetilaminometano), fosfato ou tampões acetato.
Uma formulação particularmente preferida para administração parentérica é uma formulação contendo um composto do invento em forma salificada dissolvida em água destilada, sem quaisquer excipientes.
Um exemplo de uma tal preparação é o que se segue
Composto 4s 50 mg Água para injecção 1 ml pH 5 com ácido acético
Deve-se ter cuidado para fixar o pH num valor de cerca de 5 para ajudar a solubilização do produto, mas não inferior a 4,5 visto poder ocorrer uma possível hidrólise do anel oxazolina da molécula.
Exemplos de formulações dos compostos do invento em mistura com excipientes apropriados, por administração parentérica, são os que se seguem: composto 4s 100 mg propileno glicol 1 ml água para injecção q.s. 5 ml tampão fosfato pH 8-8,5 composto 4s 50 mg Crcmophor RH 40 1 g água para injecção q.s. 10 ml tampão fosfato pH 8-8,5
Uma outra formulação farmacêutica é representada por uma formulação apropriada para uma aplicação tópica sobre uma pele ou membrana mucosa intacta ou lesada. Exemplos dessas formulações são pós, unguentos, cremes c loções. Os excipientes nestas formulações são os veículos farmaceu-ticamcntc aceitáveis usuais tais como bases oleaginosas para unguentos (por exemplo cera de ésteres cetílicos, ácido oleico, azeite, parafina, espermacete, gliccrite de amido); bases absorventes para unguentos (por exemplo lanolina anidra, petrolato hidrofílico), bases em emulsão para unguentos (por exemplo álcool cctílico, monostearato de glicerilo, lanolina, ácido esteárico), bases solúveis na água para unguentos (por exemplo éteres glicólicos e seus derivados que incluem polietileno glicois, poli(oxi-l,2-etanedi-il)-alfa-hidro-omega-hidroxi-octadecanoato, polissorbatos, e mono-estearatos de polietileno glicois).
Estas formulações podem conter outros excipientes conhecidos, tais como agentes de conservação e são preparados tal como é conhecido nesta técnica e é referido em livros de referência tais como Remington's Pharmaceutical Sciences, Seventeenth edition, 1985, Mack Publishing Co.
Uma preparação tópica preferida é um unguento contendo de 1% a 10% de um composto do presente invento.
Para além da sua utilização como medicamentos em terapêutica humana e veterinária, os compostos do invento podem também ser usados como promotores do crescimento animal. -49- -49-
I i
Com esta finalidade, um composto do invento é administrado por via oral numa ração apropriada. A concentração exacta utilizada é a que é requerida para proporcionar o agente activo numa quantidade eficaz promotora do crescimento quando são consumidas quantidades normais de ração. A adição do composto activo do invento à ração animal é de preferência realizada preparando uma pré-mistura alimentar apropriada contendo o composto activo numa quantidade eficaz e incorporando a pré-mistura na ração completa.
De um modo alternativo, um concentrado intermediário ou suplemento alimentar contendo o ingrediente activo pode ser misturado com a ração. O modo pelo qual essas pré-misturas alimentares e rações completas podem ser preparadas e administradas é descrito em livros de referência, tais como "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 ou "Livestock Feeds and Feeding", O and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977.
Para ilustrar melhor o invento, são apresentados os exemplos que se seguem.
EXEMPLOS MÉTODO A - Reacção de factor A3 de GE 2270 (ver preparação no. 3) com a L-serinamida e subsequente ciclização
Exemplo Al: Preparação de composto lOs A uma solução de factor A3 de GE 2270 (1 mmol) em DMF (10 ml) e TEA (2,2 mmol), DPPA (1,2 nxmol) é adicionado com agitação a 0o C. A temperatura é deixada subir até à temperatura ambiente e após 4,5 horas uma solução do sal clorídrico da L-serinamida seleccionada (1,2 mmol) e TEA (3 mmol) e.m DMF (3 ml) é adicionada com agitação. A reacção é deixada a agitar durante a noite à temperatura ambiente sendo então vertida para NaHC03 aquoso 0,06 M (200 ml). O precipitado é recolhido por filtração, é deixado secar ao ar sendo em seguida purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2CI2 contendo de 4% a 10% de MeOH como o eluente. A fim de facilitar a eluição, TEA de 0,1% a 1% (v/v) pode ser adicionado ao eluente. Fracções contendo 0 produto de condensação são combinadas e o solvente é evaporado. Lavagem minuciosa do sólido obtido com éter etílico proporciona o produto de condensação sob a forma de um pó fino.
Uma solução de hidróxido de metoxicarbonilsulfamoil-trietilamó-nio, sal interno (reagente Burgess) (5 mmol) em CH2CI2 seco (3 ml) é adicionada gota a gota numa atmosfera de argão à temperatura ambiente durante 6 horas a uma solução agitada do produto de condensação acima referido (1 mmol) em tetra-hidrofurano (THF) seco (30 ml). No fim da adição da solução Burgess, o desaparecimento do produto de condensação e a formação de um aducto mais hidrofílico é controlado por HPLC; em seguida, isopropanol (30 ml) é adicionado para arrefecer bruscamente o excesso de reagente. A agitação é continuada durante 2 horas à temperatura ambiente e em seguida a mistura da reacção é submetida a refluxo (cerca de 70° C) durante 6 horas a fim de ciclizar o anel oxazolina. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, a mistura crua é purificada sobre óxido de alumínio neutro de grau I (merck) usando de 2,5% a 5% de MeOH em CH2C12 como o eluente. Fracções contendo o composto do título s3o combinadas c o solvente é evaporado até à secura sob pressão reduzida a fim de proporcionar um sólido o qual é posteriormente purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2CI2 contendo de 4% a 10% de MeOH como o eluente. Para facilitar a eluição, TEA He 0,1% a 1% (v/v) pode ser adicionado ao eluente. FracçÕes contendo 0 composto do título são combinadas e o solvente é evaporado. Lavagem minuciosa com éter etílico proporciona o composto do título sob a forma de um pó fino.
Exemplo A2: Preparação de composto 21s A uma solução de factor A3 de GE 2270 (1 mmol) em DMF (10 ml) e TEA (2,2 mmol), DPPA (1,2 mmol) é adicionado com agitação a 0o C. A temperatura é deixada subir até à temperatura ambiente e após 4,5 horas uma solução de sal clorídrico da L-serinamida seleccionada (1,2 mmol) e TEA (3 mmol) em DMF (3 ml) é adicionada com agitação. A mistura da reacção é deixada a agitar durante a noite à temperatura ambiente sendo então vertida para NaHC03 0,06 M aquoso (200 ml). O precipitado é recolhido por filtração, deixado secar ao ar sendo em seguida purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2CI2 contendo de 4% a 10% de MeOH como eluente. A fim de facilitar a eluição, TEA de 0,1% a 1% (v/v) pode ser adicionado ao eluente. Fracções contendo 0 produto de condensação são combinadas e o solvente é evaporado. Lavagem minuciosa do sólido com éter etílico proporciona o produto de condensação sob a forma de um pó fino. O reagente de Burgess (4 mmol) e TEA (4 mmol) são adicionados numa atmosfera de argão à temperatura ambiente com agitação até uma solução do produto dc condensação acima mencionado (1 mmol) em CH2C12 seco (30 ml). Após 20 minutos THF seco (30 ml) é adicionado a fim de permitir que a reacção se inicie e a agitação é continuada à temperatura ambiente durante 13 horas. Após a adição de isopropanol (25 ml) para fazer reagir o excesso de reagente Burgess, a reacção é submetida a refluxo (cerca de 56° C) durante 18 horas para ciclizar o anel oxazolina. Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, a mistura da reacção crua é purificada sobre óxido de alumínio neutro de grau I (merck) usando de 2,5% a 5% de MeOH em CH2C12 como o eluente. Fracções contendo o composto do título são combinadas e o solvente é evaporado até à secura sob pressão reduzida para proporcionar um sólido o qual é posteriormente purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2C12 contendo de 4% a 10% de MeOH como eluente. Para facilitar a eluição, TEA de 0,1% a 1% (v/v) pode ser adicionado ao eluente. Fracções contendo o composto do título são combinadas e o solvente é evaporado. Lavagem minuciosa do sólido com éter etílico proporciona o composto do título sob a forma de um pó fino. MÉTODO B - Reacção do material de partida de GE III (ver preparação no. 6) com L-serinamida (ver preparação no. 18).
Exemplo Bl: Preparação de compostos 4s, lOs, 19s, 21s A uma solução de material de partida GE-III (1 mmol) em etanol absoluto (35 ml), CH2C12 (3,5 ml) e TEA (3 ou 6 mmol), L-serinamida preparada de acordo com a preparação 18 (3 mmol) é adicionada com agitação à temperatura ambiente. Após cerca de 30 horas, a mistura da reacção é vertida para NaHC03 0,06 M aquoso (100 ml) e o sólido formado é isolado por centrifugação, é lavado com mais água sendo em seguida misturado com CH2CI2 contendo algumas gotas de metanol. A solução é seca sobre Na2S04 e o solvente é evaporado sob pressão reduzida a fim de proporcionar um sólido o qual é cromatografado sobre óxido de alumínio grau I (Merck) usando de 2,5% a 5% de MeOH em CH2CI2 como eluente. Fracções contendo o composto do título são combinadas c o solvente é evaporado até à secura sob pressão reduzida a fim de proporcionar um sólido o qual é posteriormente purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2C12 contendo de 4% a 10% de MeOH como eluente. Facultativamente de 0,1% a 1% de TEA é adicionado ao eluente. Fracções contendo o composto do título são combinadas e 0 solvente é evaporado. Lavagem minuciosa do sólido obtido com éter etílico proporciona 0 composto do título sob a forma de um pó fino. / MÉTODO C - Reacção do material de partida GE V (ver preparação no. 8) com a amina seleccionada
Exemplo Cl: preparação de composto 10 A uma solução agitada do sal de sódio do composto GE V (1 mmol) em DMF (30 ml), TEA (4 mmol) e HC1 IN aquoso (2 mmol) são adicionados à temperatura ambiente. Após alguns minutos, a amina seleccionada (1,5 mmol) e DPPA (1,2 mmol) são-lhe adicionados e a agitação é continuada durante a noite. A mistura da reacção é então vertida para água (150 ml) e o sólido que se forma é isolado por centrifugação, lavado com água e em seguida misturada com CH2C12 contendo algumas gotas de metanol. A solução é seca sobre Na2S04 e o solvente é evaporado sob pressão reduzida a fim de proporcionar um sólido o qual é cromatografado sobre óxido de alumínio neutro de grau T (Merck) usando de 2,5% a 5% de MeOH em CH2CI2 como o eluente.
Fracções contendo o composto do título são combinadas e o solvenle é evaporado. Lavagem minuciosa do sólido obtido com éter etílico proporciona o composto do título sob a forma de um pó fino.
Exemplo C2: Preparação de compostos 1 a 21 (mistura de epímeros) A uma solução agitada do sal de sódio do composto GE V (0,1 mmol) em DMF (9,7 ml), TEA (0,4 mmol) e HC1 IN aquoso (0,2 mmol) são adicionados à temperatura ambiente. Após alguns minutos, uma solução em DMF 0,2 M da amina seleccionada (0,2 mmol) e uma solução em DMF 0,12 M de DPPA (0,14 mmol) são adicionados à mesma temperatura e a agitação é continuada durante a noite.
Exemplo C3: Preparação de composto 13 A reacção é realizada substancialmente tal como foi descrito no Exemplo Cl. Quando o produto da reacção tenha sido purificado por cromato-grafia "flash", o sólido obtido (1 mmol) é tratado com ácido trifluoroacético (TFA) (7 ml). A suspensão é feita girar durante alguns minutos até se obter uma solução e TFA é evaporado sob pressão reduzida no frio. O produto gomoso contendo ainda vestígios de TFA é então tratado com éter etílico e o sal trifluoroacetato do composto do título é obtido sob a forma de um pó fino.
Os compostos obtidos de acordo com os exemplos acima referidos foram caracterizados pelos seus tempos de retenção HPLC, de acordo com a metodologia que se segue, "HPLC-1": - Coluna: RP18 (Merck) 5 pm - Eluente: Fase A: formiato de amónio 0,05 M;
Fase B: acetonitrilo - Giadiciitc: uiiiiutus 0 2 15 25 %B 40 40 80 80 - Taxa dc fluxo: 0,7 ml/min - Detecção: UV a 254 nm e 310 nm.
Os tempos de retenção de compostos lOs, 19 e 19s também foram determinados dc acordo com a metodologia que se segue, "HPLC-2": - Coluna: Supclcosil LC 3DP (Supelco) 5 pm - Elucntc: Fase Λ: [AcONa (1,3 g/1), LiCl (1,2 g/1)]: acctonitrilo 95:5, pH 5 (AcOH);
Fase B: [AcONa (1,3 g/1), LiCl (1,2 g/1)]: acctonitrilo 30:70, pH 5 (AcOH) - Gradiente: minutos 0 10 30 40 45 55 %B 30 40 50 60 70 90 - Taxa de fluxo: 1,5 ml/min - Detecção: UV a 254 nm.
Os tempos de retenção de compostos 4, 4s e 21s foram também determinados dc acordo com a metodologia que se segue, "HPLC-3": - Coluna: Supelcosil LC 3DP (Supelco) 5 pm - Eluente: Fase A: [AcONa (1,3 g/1), LiCl (1,2 g/1)]: acetonitrilo 95:5, pH 5 (AcOH)
Fase B: [AcONa (1,3 g/1), LiCl (1,2 g/1)]: - Gradiente: minutos 0 10 40 45 90 %B 30 40 50 50 90 - Taxa de fluxo: 1,5 ml/min - Detecção: UV a 254 nm.
Tempos de retenção (min) determinados de acordo com a metodologia HPLC-1
Composto Tempo de retenção Composto Tempo de retenção 1 12,6; 12,9 12 12,5 2 12,5 13 12,6 3 12,8 14 11,4 4 13,7 15 11,7 4s 13,7 16 14,8 5 11,6 17 13,7 6 13,4 18 13,3;14,4 7 12,3 19 10,0 8 14,4 19s 10,0 9 15,9 20 12,4 10 13,3 21 15,1 lOs 13,3 21s 15,1 11 14,2
Tempos de retenção (min) determinados de acordo com a metodologia HPLC-2
Composto Tempo de retenção lOs 30,09 19 28,17; 30,33 19s 28,17
Tempos de retenção (min) determinados de acordo com a metodologia HPLC-3
Composto Tempo de retenção 4 28,07;30,96 4s 28,07 21s 32,85
Os compostos 4, 4s, 10, lOs, 13, 19, 19s e 21s foram também caracterizados por meio de espectros 'H-RMN, espectros FAB-MS e espectros UV; metodologias e dados são referidos aqui a seguir. η -57-
Os espectros de 'H RMN foram registados com um espectrórucUo AMX 600 usando DMSO-d^ (Hexadeuterodimetilsulfóxido) como solvente (s = singlet, b = singlet amplo, d = doublet, dd = doublet de doublets, t = triplet, m = multiplet)
Composto 4 'H R.M.N. (DMSO d6) δ (ppm): 0,85 (d, 3H); 0,88 (d, 3H); 1,37 (dd, 1H); 2,17 • (m, 4H); 2,26 (s, 3H); 2,49 (d, 3H); 2,59 (s, 3H); 2,72 (dd, 1H); 3,3, 3,6-3,5, 4,0- 3,9 (m, 4H); 3,39 (s, 3H); 3,79 (dd, 1H); 4,28 (dd, 1H); 4,54 (dd, 1H); 4,87 (m, 1H); 4,98 (s, 2H); 5,01 (dd, 1H); 5,30 (m, 2H); 5,25 (dd, 1H); 5,20 (dd, 1H); 6,02 (d, 1H); 7,38-7,23 (m, 7H); 8,29 (m, 2H); 8,43 (m, 2H); 8,54, 8,53 (s, s, 1H); 8,60 (s, 1H); 8,68 (m, 2H); 9,00 (d, 1H).
Composto 4s 'H R.M.N. (DMSO dé) δ (ppm) : 0,87 (d, 3H); 0,90 (d, 3H); 1,49 (dd, 1H); 2,20 (m, 1H); 2,23 (s, 3H); 2,30 (s, 3H); 2,46 (d, 3H); 2,59 (s, 3H); 2,70 (dd, 1H); ® 2,92, 3,28 (s, s, 3H); 3,39 (s, 3H); 3,48-3,33 (m, 2H); 3,65-3,48 (m, 2H); 3,80 (dd, 1H); 4,31 (dd, 1H); 4,54 (t, 1H); 4,86 (m, 1H); 4,99 (s, 2H); 5,04 (dd, 1H); 5,18 (dd, 1H); 5,28 (m, 3H); 5,88 (d, 1H); 7,41-7,20 (m, 7H); 8,24 (s, 1H); 8,32-8,27 (m, 2H); 8,38 (d, 1H); 8,48 (s, 1H); 8,55 (s, 1H); 8,60 (d, 1H); 8,65 (d, 1H); 8,83 (d, 1H).
Composto 10 *H R.M.N. (DMSO d*) δ (ppm) : 0,84 (d, 3H); 0,87 (d, 3H); 1,75-1,25 (m, 4H); 2,00-1,75 (m, 2H); 2,15 (m, 1H); 2,19 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,37 (m, 1H); 2,47 (d, 3H); 2,57 (s, 3H); 2,75-2,65 (m, 2H); 3,37 (s, 3H); 3,78 (dd, 1H); 4,27 (dd, i -58- 1H); 4,35 (m, 2H); 4,51 (dd, 1H); 5,00-4,90 (m, 4H); 5,36- 5,17 (m, 411); 6,02 (d, 1H); 7,35-7,21 (m, 7H); 8,27 (m, 2H); 8,41 (m, 2H); 8,51 (s, 1H); 8,59 (s, 1H); 8,67 (m, 2H); 8,98 (d, 1H).
Composto lOs 'H R.M.N. (DMSO de) δ (ppm) : 0,84 (d, 3H); 0,87 (d, 3H); 1,75-1,25 (m, 4H); 1,95-1,75 (m, 2H); 2,37-2,16 (m, 1H); 2,18 (s, 3H); 2,21 (s, 3H); 2,37 (m, 1H); 2,49 (d, 3H); 2,56 (s, 3H); 2,72-2,68 (m, 2H); 3,37 (s, 3H); 3,78 (dd, 1H); 4,27 (dd, 1H); 4,36 (m, 2H); 4,51 (dd, 1H); 4,90 (m, 1H); 4,97 (s, 2H); 5,00 (dd, 1H); 5,19 (dd, 1H); 5,25 (dd, 1H); 5,74-5,29 (m, 2H); 6,01 (d, 1H); 7,36-7,21 (m, 7H); 8,26 (m, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,42 (m, 2H); 8,51 (s, 1H); 8,59 (s, 1H); 8,67 (m, 2H); 8,98 (d, 1H).
Composto 13 'H R.M.N. (DMSO d6) δ (ppm) : 0,84 (d, 3H); 0,87 (d, 3H); 1,36 (dd, 1H); 2,20 (m, 1H); 2,47 (d, 3H); 2,58 (s, 3H); 2,75-2,60 (m, 2H); 3,00 (d, 1H); 3,38 (s, 3H); 3,77 (d, 1H); 4,22-4,0 (m, 3H); 4,27 (dd, 1H); 4,36 (br, 1H); 4,65 (dd, 1H); 4,85 (dd, 1H); 4,97 (s, 2H); 5,00 (d, 1H); 5,38-5,15 (m, 4H); 6,03 (br, 1H); 7,4-7,16 (m, 8H); 7,65 (br, 1H); 7,90 (br, 1H); 8,25 (d, 1H); 8,29 (s, 1H); 8,42 (m, 2H); 8,55 (s, 1H); 8,60 (s, 1H); 8,67 (m, 2H); 9,03 (d, 1H).
Composto 19 'H R.M.N. (DMSO de) δ (ppm) : 0,84 (d, 3H); 0,87 (d, 3H); 1,34 (dd, 1H); 2,16 (m, 1H); 2,46 (d, 3H); 2,58 (s, 3H); 2,65-2,25 (m, 10H); 2,69 (dd, 1H); 3,29,2,91 (s, s, 3H); 3,38 (s, 3H); 3,6-3,25 (m, 4H); 3,76 (dd, 1H); 3,95 (m, 1H); 4,26 (dd, 1H); 4,32 (m, 1H); 4,5 (m, 1H); 4,9 (m, 1H); 4,97 (s, 2H); 5,00 (dd, 1H); 5,20 -59-
/<ft Iqa-Y
Ui (dd, 1H); 5,25 (dd, 1H); 5,30 (m, 211); 6,01 (d, III); 7,4-7,2 (m, 711); 8,27 (m, 2H); 8,4 (m, 2H); 8,51 (s, 1H); 8,59 (s, 1H); 8,67 (m, 2H); 8,99 (d, 1H).
Composto 19s 'H R.M.N. (DMSO de) δ (ppm) : 0,84 (d, 3H); 0,87 (d, 3H); 1,36 (dd, 1H); 2,15 (m, 1H); 2,46 (d, 3H); 2,58 (s, 3H); 2,60-2,26 (m, 10H); 2,71 (dd, 1H); 3,30, 2,89 (s, s, 3H); 3,38 (s, 3H); 3,58-3,22 (m, 4H); 3,76 (dd, 1H); 4,95 (m, 1H); 4,26 (dd, 1H); 4,30 (m, 1H); 4,52 (m, 1H); 4,91 (m, 1H); 4,97 (s, 2H); 5,00 (dd, 1H); 5,20 (dd, 1H); 5,25 (dd, 1H); 5,30 (m, 2H); 6,01 (d, 1H); 7,44-7,21 (m, 7H); 8,27 (m, 2H); 8,41 (m, 2H); 8,51 (s, 1H); 8,60 (s, 1H); 8,68 (m, 2H); 9,00 (d, 1H).
Composto 21 s Ή R.M.N. (DMSO d6) δ (ppm): 0,85 (d, 3H); 0,88 (d, 3H); 1,32 (dd, 1H); 2,03-1,82 (m, 4H); 2,16 (s, 3H); 2,19 (s, 3H); 2,22 (s, 3H); 2,47 (d, 3H); 2,59 (s, 3H); 2,65-2,15 (m, 7H); 2,72 (dd, 1H); 3,39 (s, 3H); 3,72 (m, 1H); 3,80 (dd, 1H); 3,91 (m, 1H); 4,07 (m, 1H); 4,28 (dd, 1H); 4,52 (dd, 1H); 4,81 (dd, 1H); 4,99 (s, 2H); 5,01 (d, 1H); 5,15 (t, 1H); 5,20 (dd, 1H); 5,25 (t, 1H); 5,30 (dd, 1H); 6,08 (br, 1H); 7,41-7,20 (m, 7H); 8,29 (m, 2H); 8,43 (m, 2H); 8,54 (s, 1H); 8,60 (s, 1H); 8,69 (m, 2H); 9,03 (d, 1H).
Os espectros MS foram obtidos com um espectrómetro quadruplo de estádio triplo TSQ 700 Finningan.
Composto 4 FAB-MS m/z 1278 (MH+, 100%)
Composto 4s FAB-MS m/z 1278 (MH+, 100%)
Composto 10 FAB-MS m/z 1304 (MH+, 100%)
Composto lOsFAB-MS m/z 1304 (ΜΗ1-, 100%)
Composto 13 FAB-MS m/z 1305 (MH+, 100%)
Composto 19 FAB-MS m/z 1363 (MH", 100%)
Composto 19sFAB-MS m/z 1363 (MH+, 100%)
Composto 21sFAB-MS m/z 1361 (MH*, 100%)
Os espectros de absorção UV foram registados com um espectrofotómctro Perkin-Elmer Mod. Lambda 16 (200-800 nm).
Composto 4 UV (MeOH) Composto 4s UV (MeOH) Composto 10 UV (MeOH) Composto lOs UV (MeOH) Composto 13 UV (MeOH) Composto 19 UV (MeOH) Composto 19s UV (MeOH) Composto 21s UV (MeOH)
PREPARAÇÃO = 310 (El%, 1 cm = 253,8) λ™χ = 310 (El%, 1 cm = 259,2) Xmax = 310 (El%, 1 cm = 240,1) Lmax = 310 (El%, 1 cm = 248,4) Lmax = 310 (El%, 1 cm = 236,4) Xmax = 309 (El%, 1 cm = 237,9) λ™χ = 309 (El%, 1 cm = 240,3) ληΐ3χ = 311 (El%, 1 cm = 242,9)
E MATERIAIS DE PARTIDA PREPARAÇÃO DE MATERIAIS DE PARTIDA DE ANTIBIÓTICO GE 2270
Preparação 1: factor A de GE 2270 O factor A de GE 2270 é preparado por fermentação de Planobispora rosea ATCC 53773, tal como é descrito na Patente dos E.U.A. No. 5.202.241. A recuperação e o isolamento do factor são tal como foram ali descritos.
-61 - L if·' . í I. S,, \
Preparação 2: Factor A2 de GE 2270
Factor A de GE 2270 4'-de[4-[[2-(aminocarbonil)-l-pirrolidinil]carbonil]-4,5-di-hidro-2-oxazolil]4'-[[octa-hidro-1,4-dioxopirrolo[ 1,2-a]pirazin-3-il)metoxi]carbonilo]
Factor A2 de GE 2270 é preparado por hidrólise ácida controlada a partir do factor GE 2270, tal como é descrito ma Patente dos E.U.A. No. 5.139.778.
Preparação 3: Factor A3 GE 2270
Factor A de GE 2270 4,-carboxi-4'-de[4-[[2-(aminocarbonil)-l-pirrolidinil]-carbonil]-4,5-di-hidro-2-oxazolilo]
Factor A3 de GE 2270 é preparado por hidrólise básica controlada a partir de factor A2 de GE 2270, tal como é descrito na Patente dos E.U.A. No. 5.139.778.
Preparação 4: composto GE I
Factor A de GE 2270 ^-(aminocarboni^^-de^tp-íaminocarbonil)-!-pirrolidinil]carbonil]-4,5-di-hidro-2-oxazolilo]
Factor A2 de antibiótico GE 2270 (1 mmol) é dissolvido numa solução saturada de NH3 em metanol (10 ml). A solução é deixada repousar durante 3 dias à temperatura ambiente sendo em seguida evaporada sob pressão reduzida. O resíduo é misturado com metanol (2 ml) e o composto do título é precipitado com água, filtrado e deixado secar ao ar. Lavagem minuciosa com éter etílico proporciona o composto do título (GE-I) de factor A sob a forma de pó branco.
Preparação 5: composto GE II
Factor A de GE 2270 4'-ciano-4'-de[4-[[2-(aminocarbonil)-l-pi rrol idi n i I ]-carbonil]-4,5-di-hidro-2-oxazolilo]
Uma solução de reagente de Burgess (3,5 mmol) em CH2CI2 seco (5 ml) c adicionada gota a gota sob uma atmosfera de argão a uma solução bem agitada de composto GE I (1 mmol) em CH2C12 seco (15 ml), THF seco (20 ml) e TEA (2,25 ml) à temperatura ambiente. Após 16 horas é adicionado mais reagente de Burgess (1 mmol) em pequenas porções e a agitação é continuada à temperatura ambiente durante mais 24 horas. A mistura da reacção é então evaporada ate à secura sob pressão reduzida e o sólido crú é purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) usando CH2Cl2/MeOH 95:5 como eluente. O composto do título é obtido sob a forma de um pó branco.
Preparação 6: composto GE III
Factor A de GE 2270 4'-de[4-[[2-(aminocarbonil)-l-pirrolidinil]carbonil]-4,5-di-hidro-2-oxazolil]-4'-(etoxi-iminometilo) O composto GE II (1 mmol) é dissovido em etanol absoluto (80 ml) e CHCI3 (8 ml). A solução é arrefecida a 0o C e HC1 seco é feito borbulhar através dela durante 6 horas. A mistura da reacção é então deixada repousar durante a noite a 4o C e o solvente é evaporado sob pressão reduzida até se obter um pequeno volume. A solução concentrada é então vertida cuidadosamente para uma solução saturada aquosa de Na2C03 e o precipitado resultante é centri-fugado, lavado duas vezes com água sendo então redissolvido em clorofórmio contendo a quantidade mínima de etanol para ajudar a solubilizaçao do produto. A solução resultante é então transferida para um funil separador a fim de remover a camada aquosa. A fase orgânica é seca sobre Na2S04 e o solvente é evaporado sob pressão reduzida a fim de proporcionar um sólido branco o qual é triturado com éter e filtrado. O composto do título é obtido sob a forma de um pó bamco.
Preparação 7: composto GE IV
Factor A de GE 2270 9'-de[[2-(ammocarboml)-l-pirrolidinil]carbonil]-9'-(metoxicarbonilo) A uma solução de composto GE ΙΠ (1 mmol) numa mistura de etanol absoluto (35 ml) e CH2CI2 (3,5 ml), hidrocloreto de éster metílico de L-serina (1,5 mmol) é adicionado com agitação à temperatura ambiente sob uma atmosfera de argão. Após 4 dias o solvente é evaporado sob vácuo e o produto é purificado sobre placas de gel de sílica usando CI^Ch/MeOH 95:5 como eluente. O composto do título é obtido sob a forma de um pó branco.
Preparação 8: composto GE V
Factor A de GE 2270 4'-(R,S)-carboxi-4,-de[[2-(aminocarbonil)-l-pirrolidinilj-carbonilo] A uma solução de composto GE IV (1 mmol) em dioxano (35 ml), NaOH IN (2 mmol) é adicionado à temperatura ambiente com agitação. Após 15 minutos éter etílico é adicionado para precipitar o composto do título o qual é recolhido por filtração. O sal de sódio do composto do título é obtido sob a forma de um pó branco.
PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE PARTIDA AMINAS
Preparação 9: amina para composto 13
Trans-4-hidroxi-L-prolina (Aldrich) (30,00 g, 228,7 mmol) é dissolvida numa solução de HC1 em MeOH 12,9% p/p (250 ml) e a solução resultante é agitada durante 48 horas à temperatura ambiente. Após concentração do solvente o resíduo é misturado com acetato de etilo (500 ml) e trietilamina (38,2 ml, 274,4 mmol) e a suspensão é agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Sais inorgânicos são removidos por filtração, em seguida a solução é seca (MgS04) e concentrada para dar origem ao éster metílico puro sob a forma de um sólido branco. O éster metílico acima preparado (7,23 g, 50 mmol) é dissolvido em dioxano (30 ml). Uma solução de di-t-butilpirocarbonato (12,0 g, 55 mmol) em dioxano (60 ml) é então adicionada gota a gota, dimetilaminopiridina (100 mg, 0,8 mmol) é adicionada e a mistura da reacção é agitada durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução é concentrada até um volume pequeno e o resíduo é misturado com acetato de etilo (300 ml) e é lavado com ácido cítrico aquoso 1M (100 ml) seguindo-se carbonato de hidrogénio e sódio aquoso 1M (100 ml) e solução salina (100 ml). A solução orgânica é seca (MgS04) e evaporada até à secura para proporcionar o éster metílico N-Boc-protegido puro sob a forma de um óleo.
Cloreto de mesilo (3,87 ml, 50 mmol) é adicionado a uma solução agitada de éster metílico N-Boc-protegido acima preparado (9,0 g, 36,7 mmol) em piridina seca (70 ml) a 0o C. A agitação é continuada durante 4 horas, a piridina é concentrada in vacuo e o resíduo é misturado com acetato de etilo (100 ml). A solução é lavada com carbonato de hidrogénio e sódio aquoso 1M (50 ml),
scguindo-sc ácido cítrico aquoso 1M (50 ml) e solução salina (50 ml). A solução orgânica é seca (MgSO,») e evaporada até à secura e o resíduo é cristalizado a partir de acetato de etilo/éter de petróleo ligeiro produzindo o derivado O-mesilato puro sob a forma de um pó branco.
Uma solução do derivado O-mesilato acima preparado (7,13 g, 22,04 mmol) e azida de sódio (1,63 g, 25 mmol) em DMF (30 ml) é aquecida a 50° C durante 12 horas. O solvente é removido por destilação, e em seguida o resíduo é misturado com acetato de etilo (70 ml) e água (40 ml). A fase orgânica é lavada com solução salina (4 x 50 ml) até neutralidade da fase aquosa, lavada com HC1 aquoso 0,1M (20 ml) e solução salina (2 x 50 ml). A fase orgânica é seca (MgS04) e o solvente é evaporado até à secura in vacuo para proporcionar o éster metílico de cis-4-azido-L-prolina protegido sob a forma de um óleo espesso.
Uma solução agitada do éster metílico de cis-4-azido-L-prolina N-protegido acima preparado (4,5 g, 16,7 mmol) em THF (20 ml) é reduzida por tratamento com dicarboxilato de dietilazo (4,55 ml, 25 mmol) e trifenilfosfina 84,39 G, 16,7 mmol) à temperatura ambiente durante 16 horas. Após concentração da solução até um pequeno volume, o resíduo é purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) com cloreto de metileno/metanol 95/5 para dar origem a derivado cis-4-amino puro sob a forma de um óleo.
Uma solução do derivado cis-4-amino acima preparado (2,1 g, 8,72 mmol) em amónia metanólica a 11% (20 ml) é agitada à temperatura ambiente durante 60 horas. Após concentração in vacuo da solução até um volume pequeno, o resíduo é precipitado com acetato de etilo, a fim de proporcionar N-Boc-cis-4-amino-L-prolinamida pura sob a forma de um óleo.
Preparação 10: amina para composto 14
Uma solução de N-Cbz-sarcosina (Novabiochem) (2,0 g, 8,96 mmol), Ν,Ν,Ν'-trimetil-etilenodiamina (Aldrich) (1,25 ml, 9,86 mmol) e trietilamina (1,40 ml, 9,86 mmol) em DMF seca (30 ml) é agitada à temperatura ambiente. DPPA (2,2 ml, 9,86 mmol) é adicionado e a agitação à temperatura ambiente c continuada durante 2 horas. A mistura da reacção é vertida para água (500 ml), o pH é ajustado para 11 por adição de NaOH IN e a fase aquosa é extraída com éter etílico (3 x 200 ml). A fase orgânica é seca (MgS04) e concentrada até à secura. O produto crú é purificado por cromatografia "flash" sobre gel de sílica 60 (malha 400-230) com cloreto de metileno/metanol 8/2 para produzir Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina N-Cbz-sarcosinamida sob a forma de um óleo.
Uma suspensão da Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina N-Cbz-sarcosi-namida acima preparada (2,0 g, 6,51 mmol) e 10% de paládio sobre carvão (200 mg) em metanol (40 ml) é hidrogenada à temperatura ambiente e sob pressão atmosférica durante 1 hora. O catalisador é então removido por filtração e a concentração do solvente produziu a Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina sarcosina-mida não protegida pura sob a forma de um óleo.
Preparação 11: amina para composto 15
Uma solução de éster N-hidroxi succinimida N-Boc-L alanina (Novabiochem) (2,0 g, 7 mmol) e Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina (Aldrich) (1,0 ml, 7,7 mmol) em DMF seca (30 ml) é agitada à temperatura ambiente durante a noite sendo então vertida para água (600 ml), o pH é ajustado para 9 com carbonato de sódio e a fase aquosa é extraída com éter etílico (2 x 400 ml). A fase orgânica é seca (MgS04) e o solvente é evaporado in vacuo para proporcionar Ν,Ν,Ν'-trimetil-etilenodiamina N-Boc-L-alaninamida sob a forma de um óleo incolor. A N,N,N'-trimetiletilenodiamina N-Boc-L-alaninamida acima preparada (1,7 g, 6,23 mmol) é dissolvida a 0o C em TFA anidro (10 ml), sendo em seguida agitada durante 5 minutos. Após concentração do solvente a uma baixa temperatura in vacuo e várias lavagens do produto oleoso com éter etílico, o sal trifluoroacctato c dissolvido em água (10 ml), o pH da solução aquosa é ajustada para 11 com NaOH IN e em seguida o produto é extraído com CH2CI2 (2 x 20 ml). A fase orgânica é seca (MgS04) e concentrada até à secura in vacuo para dar origem a sal Ν,Ν,Ν'-trimctiletilenodiamina L-alaninamida trifluoroacéti-co puro sob a forma de um óleo gomoso.
Preparação 12: amina para composto 16
Uma solução de Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina-sarcosinamida (ver preparação 10) (750 mg, 4,33 mmol) em THF seco (15 ml) é agitada sob argão à temperatura ambiente. Hidreto de alumínio e lítio (495 mg, 13 mmol) é adicionado numa porção, a temperatura é levada até refluxo e 0 refluxo é continuado durante 6 horas adicionais. Após arrefecimento até 0o C acetato de etilo (1,5 ml) e NaOH 2,5 M (6 ml, 1,2 equivalentes) são cuidadosamente adicionados seguindo-se MgS04 sólido. A suspensão é agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos sendo em seguida filtrada. Após concentração do solvente N-(2-dimetilaminoetil)-N-(2-metilaminoetil)-metilamina pura é obtida sob a forma de um óleo.
Preparação 13: amina para composto 17 1-Benzilpiperazina (Aldrich) (9 ml, 50 mmol) e carbonato de potássio (14 g, 0,1 mole) são adicionados à temperatura ambiente até se obter uma solução agitada de cloreto hidrocloreto de 3-dimetilaminopropilo (Aldrich) (15,8 g, 0,1 mol) em etanol absoluto (300 ml). A mistura da reacção é submetida a refluxo durante 6 horas, o solvente é evaporado in vacuo e é adicionada água (300 ml) ao óleo resultante. Após extracção com CH2CI2 (200 ml), a fase orgânica é lavada com água (200 ml), seca (MgS04) e o solvente é evaporado in vacuo a fim de proporcionar a l-benzil-4-piperazina substituída sob a forma de um óleo.
Uma suspensão da l-benzil-4-piperazina substituída acima preparada (9,0 g, 35 mmol) e 10% de paládio sobre carvão (3 g) em etanol a 95% (300 ml) é hidrogenada à temperatura ambiente e sob pressão atmosférica durante 6 horas. O catalisador é separado por filtração e a solução é concentrada até à secura sob pressão reduzida para proporcionar o produto desbenzilado sob a forma de um óleo.
Preparação 14: amina para composto 18 A reacção é realizada tal como foi referido na preparação 10 condensando N-Cbz-sarcosina (Novabiochem) (2,0 g, 8,96 mmol) com 1-metilpiperazina (Aldrich) (986 mg, 9,86 mmol) e em seguida removendo o grupo Cbz-protector para proporcionar o composto esperado (1,05 g, rendimento global de 68%) sob a forma de um óleo sendo em seguida reduzida com hidreto de alumínio e lítio tal como foi descrito na preparação 12 a fim de proporcionar a triamina esperada sob a forma de um óleo.
Preparação IS: amina para composto 19 Λ reacção é realizada tal como foi referido na preparação 10 condensando N-Cbz-sarcosina (Novabiochem) (2,0 g, 8,96 mmol) com N-(2-hidiu.\ictil)pipcr<i£Íiia (Aldrich) (1,28 g, 9,86 mmol) e em seguida removendo o grupo Cbz-protcctor a fim de proporcionar o composto esperado sob a forma de um óleo o qual é então reduzido com hidreto de alumínio e lítio tal como foi descrito na preparação 12 a fim de proporcionar o álcool triamino esperado sob a forma de um óleo.
Preparação 16: amina para composto 20 l-(4-morfolinocarbonilmetil)-piperazino (Acros Chimica) (2,13 g, 10 mmol) é reduzida tal como foi referido na preparação 12 a fim de proporcionar a triamina esperada sob a forma de um óleo.
Preparação 17: amina para composto 21 A uma solução de ácido (S)-(-)-2-pirrolidono-5-carboxílico (Aldrich) (500 mg, 3,87 mmol), Ν,Ν,Ν'-trimetiletilenodiamina (Aldrich) (0,54 ml, 4,26 mmol) e trietilamina (0,60 ml, 4,26 mmol) em DMF seca (5 ml), DPPA (0,95 ml, 4,26 mmol) é adicionado sob agitação à temperatura ambiente. A agitação é continuada durante 1 hora, e em seguida a mistura é vertida para éter etílico (100 ml). O sólido que precipitou é filtrado, lavado com éter etílico adicional (20 ml) e é deixado secar ao ar para proporcionar o produto de condensação esperado sob a forma de um sólido branco. A redução do composto acima descrito (560 mg, 2,62 mmol) de acordo com a preparação 12 proporcionou a triamina esperada sob a forma de um óleo.
PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE PARTIDA SERINAMIDAS
Preparação 18: preparação de serinamidas para compostos 4s, lOs, 19s e 21s.
Uma mistura de B-Cbz-L-serina (Novabiochem) (100 g, 0,42 mol) e pentafluorofenol (Aldrich) (84,7 g, 0,46 mol) em DMF anidra (250 ml) é arrefecida com agitação sob N2 a -10° C. A esta solução, uma solução de DCC (95,0 g, 0,46 mol) em DMF anidra (125 ml) é adicionada durante 30 minutos mantendo-se entretanto a temperatura da reacção a -10° C. A mistura da reacção é agitada a-10a-5°C durante 30 minutos adicionais e em seguida à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura da reacção é vertida para água (3,761). Após agitação durante 15 minutos, o sólido que se precipita é filtrado, lavado sobre o filtro com água (3 x 500 ml) e seco ao ar à temperatura ambiente. O sólido é então misturado com EtOAc (1 1) e o sólido residual (principalmente diciclo-hexilureia) é separado por filtração e lavado com mais EtOAc (3x150 ml). As soluções de EtOAc combinadas são evaporadas até à secura sob pressão reduzida. O sólido residual é dissolvido em CH2CI2 quente (3,2 1). A solução quente é filtrado sob gravidade e o solvente é submetido a ebulição até sólido começar a cristalizar. O sólido que cristalizou é filtrado e seco ao ar até à temperatura ambiente para dar origem a éster pentafluorofenílico de N-Cbz-L-serina sob a forma de um sólido branco. Éster pentafluorofenílico de N-Cbz-L-serina sólido (12,16 g, 0,03 mol) é adicionado durante 10 minutos sob uma atmosfera de N2 a uma solução agitada da amina seleccionada (0,03 mol) em 0Η2Ο2 (50 ml) à temperatura ambiente. No fim da adição a agitação é continuada durante 1 hora adicional à temperatura ambiente e em seguida a mistura da reacção é lavada com NaOH IN (3 x 20 ml). A fase orgânica é seca (MgS04) sendo em seguida evaporada até à secura sob pressão reduzida para proporcionar as N-Cbz-L-serinamidas esperadas sob a forma de óleos vítros que podem ser cristalizados a partir de Et20. A desprotecção do grupo Cbz-protector é realizado imediatamente antes da utilização de serinamida.
Uma suspensão da N-Cbz-L-serinamida acima preparada (5,0 g) e 10% de paládio sobre carvão (500 mg) em metanol (100 ml) é hidrogenada à temperatura ambiente e pressão atmosférica na presença de HC1 IN aquoso durante 1 hora. O catalisador é separado por filtração, lavado sobre filtro com metanol (2 x 100 ml) e o solvente é evaporado até à secura sob pressão reduzida. A trituração do sólido ceroso com Et20 proporcionou o sal clorídrico de serinamida esperado (80-100%) sob a forma de pós brancos.
Lisboa, 14 de Novembro de 2001
ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VÍCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
Claims (12)
- y*'i y*'iREIVINDICAÇÕES 1. Derivados básicos amida de antibióticos GE 2270 e GE 2270-afíns da fórmula geral Iem que: R1 representa hidrogénio, (C|-C4) alquilo ou di(C,-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno; alq representa (CpC4) alquileno, (C2-C5) alquileno-carbonilo ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo azoto; R representa aminocarbonilo, mono ou di(Ci-C4) alquilaminocarbonilo, ou um grupo NR3R4 em que R representa (CrC4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, ou di(Ci-C4) alquilamino-(Ci-C4) alquileno, e R4 representa (CrC4) alquilo, di(CrC4) alquilamino-(CrC4) alquileno ou hidroxi(C]-C4) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um átomo de azoto e facultativamente um heteroátomo seleccionado de entre azoto e oxigénio, facultativamente substituído com um grupo seleccionado de entre (C)-C4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, di(Ci-C4) alquilamino ou di(Ci-C4) alquilamino(C\-C4) alquileno; ou R1 e alq-R2 em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro heteroátomo seleccionado de entre oxigénio e azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C1-C4) alquilo, di(Ci-C4) alquilamino, di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno, hidroxi(Ci-C4) alquileno e um grupo alq2-R5 cm que alq2 é (C1-C4) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (C1-C4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno e R7 representa (C1-C4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino(Cr C4) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C|-C4) alquilo, hidroxi(Ci-C4) alquileno, di(CrC4) alquilamino e di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno; e o gmpo da fórmularepresenta um porção do núcleo antibiótico da fórmula -3- -3-em que: W1 representa fenilo W2 representa hidroxi ou ambos W1 e W2 representam metilo, X1 representa hidrogénio ou metilo, X2 representa hidrogénio, metilo ou metoximetileno, com a condição de que quando ambos W e W são metilo, 1 1 então X é metilo e X é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
- 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 da fórmula Ia -4-em que R1, alq, R2 e o grupo GE são tal como foram definidos na reivindicação 1.
- 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o grupo GE é tal como foi definido na reivindicação 1 e R1 representa hidrogénio ou (C1-C4) alquilo; alq representa (C1-C4) alquileno, (C2-C5) alquileno-carbonilo ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo azoto; R2 representa aminocarbonilo ou um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C4) alquilo e R4 representa (C1-C4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino-(CrC4) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, facultativamente substituído com um grupo seleccionado de entre (C1-C4) alquilo e hidroxi(Ci-C4) alquileno; ou R1 e alq-R2 em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel hctcrociclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um oulro átomo dc azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C|-C4) alquilo, di(CrC4) alquilamino, di(Ci-C4) alquilamino(CrC4) alquileno c um grupo alq2-R5 em que alq2 c (C1-C2) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que Rfa representa (CrC4) alquilo e R7 representa (CrC4) alquilo ou di(Ci-C4) alquilamino(Ci-C4) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio
- 4. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o grupo GE c tal como foi definido na reivindicação 1 e R1 representa hidrogénio ou (C1-C2) alquilo; alq representa (C1-C3) alquileno, (C2-C3) alquileno-carbonilo ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo azoto; R2 representa aminocarbonilo ou um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C3) alquilo e R4 representa (C1-C3) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino-(Ci-C2) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, facultativamente substituído com um grupo seleccionado de entre (CrC2) alquilo e hidroxi(Ci-C2) alquileno; ou R1 e alq-R2 em conjunto com 0 átomo de azoto adjacente formam um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo facultativamente um outro átomo de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (CrC2) alquilo, di(CrC2) alquilamino, di(Ci-C2) alquilamino(CrC2) alquileno e um grupo alq2-R5 em que alq2 é (Ci-C2) alquilo e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (CrC2) alquilo e R representa (Ci-C2) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino(Cr C2) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio
- 5. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o grupo GE é tal que W1 é fenilo, W2 é hidroxi, X1 é metilo, X2 é metoximetileno e R1 representa hidrogénio ou (C]-C2) alquilo; alq representa (C1-C3) alquileno; R2 representa um grupo NR3R4 em que R3 representa (C1-C3) alquilo e R4 representa (C1-C3) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino-(CpC2) alquileno, ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois átomos de azoto, facultativamente substituído com um grupo seleccionado de entre (CrC2) alquilo e hidroxi(Ci-C2) alquileno; 12* ou R e alq-R em conjunto com o átomo de azoto adjacente formam um anel -7- /< helerocíclico cum cinco ou seis membros contendo facullalivaiuenle um outro átomo de azoto, substituído facultativamente com um grupo seleccionado de entre (C1-C2+) alquilo, di(Ci-C2) alquilamino, di(Ci-C2) alquilamino(Ci-C2) alquileno e um grupo alq2-R5 em que alq2 é (Ci-C2) alquileno e R5 é um grupo NR6R7 em que R6 representa (C1-C2) alquilo e. R7 representa (C1-C2) alquilo ou di(Ci-C2) alquilamino(Ct-C2) alquileno ou um anel heterocíclico com cinco ou seis membros contendo um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto e oxigénio
- 6. Processo para a preparação de um composto da reivindicação 1 que compreende: COOHa) reacção de um composto da fórmula III III em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I, com uma serinamida, ou um seu sal de adição de ácido, da fórmula IV: R1IV em que R1, alq e R2 são tal como na reivindicação 1, num solvente orgânico aprótico na presença de um agente de condensação; b) ciclização da porção serina do composto obtido da fórmula Illama com um reagente de ciclização apropriado, a fim de obter o composto desejado da fórmula I.
- 7. Processo para a preparação de um composto da reivindicação 1 que compreende a reacção de um composto da fórmula VV em que o grupo GE é tal como foi definido na reivindicação 1, com uma serinamida, ou um seu sal de adição de ácido, da fórmula IV: IV -9-κRiem que R1, alq e R2 são tal como na reivindicação 1, num solvente orgânico prótico.
- 8. Processo para a preparação de um composto da reivindicação 1 que compreende a reacção de um composto da fórmula VI:VI ou um seu sal de adição de base, em que o grupo GE é tal como foi definido na fórmula I, com uma amina, ou seu sal de adição de ácido, da fórmula geral IVa: Ri / Η—N iva alq - R2 1 2 em que R , alq e R são tal como foram definidos na fórmula I, na presença de um solvente orgânico inerte e de um agente de condensação. -10-
- 9. Composto da fórmula -10- O“0-2 em que Z representa (C|-C4) alquilo e GE é tal como foi definido na reivindicação 1.
- 10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2,3,4 ou 5 para utilização como um medicamento.
- 11. Utilização de um composto de qualquer uma das reivindicações 1,2,3,4 ou 5 para preparação de um medicamento antimicrobiano.
- 12. Composição farmacêutica contendo um composto de qual- quer uma das reivindicações 1,2, 3,4 ou 5 em mistura com um veículo farmaceu-ticamente aceitável. Lisboa, 14 de Novembro de 2001ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA
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