PT805983E - Processos e compostos para deteccao magnetorrelaxometrica de analitos e sua utilizacao - Google Patents

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DESCRIÇÃO “PROCESSOS E COMPOSTOS PARA DETECÇÃO MAGNETORRELAXOMÉTRICA DE ANALITOS E SUA UTILIZAÇÃO” A invenção refere-se ao objecto caracterizado nas reivindicações, isto é, um processo para detecção magnetorrelaxométrica qualitativa e/ou quantitativa de analitos em fases líquidas e sólidas, compostos para a detecção magnetorrelaxométrica e sua utilização na análise e na imunomagnetografia. É sabido que a imunocintilografia permite detectar estruturas patológicas in vivo com o auxílio de substâncias de estrutura específica marcadas radioactivamente que de seguida também são designados como marcadores. Normalmente são utilizados com anticorpos marcados ou fragmentos de anticorpos marcados com emissores de raios -γ. De forma semelhante, também são utilizadas outras substâncias de estrutura específica como, por exemplo, péptidos ou ácidos oligonucleicos ou polinucleicos ou são experimentadas durante a investigação. A proporção da radioactividade especificamente ligada é, no entanto, em todos estes processos, reduzida. Por conseguinte, o nível de marcadores que se acumulam não formados especificamente nestas ensaios e, por conseguinte, circulando no sangue ou em orgãos como o fígado, rins, resultante das vias urinárias ou bexiga. Esta elevada radiação de segundo plano reduz de muitas formas uma detecção suficiente das estruturas patológicas. Panchapakesan [Immunol. Cell. Biol., 70 (1992) 295 e Ziegler [New England Journal of Medicine, 324 (1991) 430] apontam, por isso, para as possibilidades de melhoramento da imunocintilografia. As possibilidades deste tipo são descritas na EP 0 251 494. A maioria dos processos procura a acelerar a desligação da radioactividade não ligada especificamente.

Por isso, foi proposta a distinta utilização de anticorpos conjugados com substânias paramagnéticas ou superparamagnéticas ou fragmentos de anticorpos para localização '.·3 &

ti de estruturas patológicas in vivo. Como processos de detecção interessam, no presente caso, para os anticorpos marcados a tomografia do "spin" nuclear ou para a magnetometria dependente de mudanças de susceptibilidade (WO 93/05818 e WO 91/15243). Também nestes processos de detecção se verifica o problema de partículas de sinais variáveis através de partículas não ligadas dos marcadores, assim como, estão disponíveis através de variações naturais da susceptibilidade e relaxação da textura. Por isso, os métodos não são muitas vezes sensíveis suficientemente para detectar apenas quantidades reduzidas de marcadores formados especificamente.

Em contrapartida não é conhecido um processo para possibilitar apenas a detecção da proporção dos marcadores ligados e que , por conseguinte, não seja influenciado pela medida do marcador não formado. É ainda conhecido o facto de as ensaios de imunidade, assim como, as ensaios de ligação (por exemplo, ensaios de ligação de receptores) possibilitarem a determinação de um elevado número de substâncias, que podem ser de relevância biológica, em amostras de combinações diferentes. No presente caso, é contudo, determinado apenas um parâmetro por amostra numa análise. T. Chard fornece uma panorâmica actual dos diferentes processos em [An Introduction to Radio-immmunoassay and Related Techniques: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 4a Ed., Elsevier Science Publishers, Amsterdão (1990)]. Os fundamentos de todas as ensaios de ligação são a elevada de sensibilidade de comprovação dos isótopos ou de outros compostos marcados com a elevada especificidade de reacções de receptores-ligandos.

Contudo, os processos de ensaio conhecidos possuem as seguintes desvantagens: • Os processos para a determinação simultânea de analitos diferentes dentro das mesmas amostras baseados na ligação de diferentes sondas marcadas, por radiofluorescência ou enzimologicamente ao analito. Assim são, geralmente, medidos após subsequente desligação e lavagem as actividades não ligadas ou ligadas para a determinação quantitativa dos analitos. A quantidade dos diferentes ϋ rótulos de sondas utilizáveis é, assim, fortemente limitada. Assim surgem, por exemplo, no caso dos radioisótopos diferentes, os denominados fenómenos de sobreposição como marcadores de sondas, que conduzem a uma perda rápida da exactidão quantitativa dos sinais individuais. A combinação de diferentes enzimas como rótulo de sondas causam problemas semelhantes, em que a condutibilidade é dificultada também pela procura indispensável de condições de reacção que permitem a determinação simultânea num sistema das reacções com enzimas. • A sensibilidade do processo é limitada, por exemplo, pelas acções de mudanças não específicas entre a matriz e a sonda, ou através de possibilidade de marcação limitada da sonda (actividade específica reduzida). • A realização bem sucedida do processo pressupõe ffequentemente um processamento do material da amostra recolhida (por exemplo, preparação de soro ou plasma de sangue completo, extração de amostras com dissolventes orgânicos, concentração dos analitos através de processos cromatográficos tc.). • Para a realização bem sucedida dos processos os procedimentos de desligação e lavagem, que servem para a desligação de receptores ou ligandos formados e não formados, são na maioria das vezes imprescindíveis. • Para a realização de ensaios de radioimunidade a utilização é mais dispendiosa e os nuclídeos radiadores usados na manipulação dispendiosos. • A armazenagem dos marcadores utilizados até ao momento provoca na prática frequentes problemas, uma vez que ou são estáveis (ensaios de radioimunidade) e, por conseguinte, devem ser recentemente produzidos ou reagem sensivelmente a influências ambientais. O objectivo da presente invenção foi desenvolver processos inovadores, que vencem os inconvenientes do estado da técnica e que estão especialmente em posição de, sem a 4 4

ϋ utilização de substâncias radioactivas, detectar o local de acumulação e a medida do marcador formado sem desligação prévia do marcador não formado.

Este objectivo é atingido através da presente invenção.

Verificou-se que a detecção qualitativa e/ou quantitativa dos analitos se concretiza em fases líquidas e/ou sólidas quando partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas são utilizadas como marcação magnética comprovativa em ensaios de imunidade ou outros ensaios de ligação sendo determinada a relaxação da sua magnetização como grandeza de medição.

De seguida são descritos processos que se sobrepõem às desvantagens dos processos conhecidos para realização de ensaios de imunidade ou outros ensaios de ligação. O processo de acordo com a invenção depende da utilização de substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas, de seguida também denominadas de marcadores magnéticos que são combinadas com substâncias detectoras ou substâncias de estrutura específica, de seguida também designadas como analitos. As combinações deste tipo de marcadores magnéticos com analitos ou substâncias de estrutura específica, que são mais pormenorizadamente descritas nesta patente, também são designadas de seguida de marcadores magnéticos. Pela da utilização do termo de substâncias coloidais ou partículas coloidais é descrita tanto a zona maior de partículas ou substâncias da zona maior de coloidais, isto é, a zona de 1 nma cerca de 1000 nm, como a sua respectiva utilização como fase dispersa num meio de dispersão adequado, que geralmente é aquoso. As substâncias ou partículascoloidais podem estar presentes sob a forma seca ou liofilizada para fim da capacidade de transporte e de armazenagem melhorada, contudo, durante a realização das medidas estão presentes no estado de dispersão na fase líquida.

Além disso, o processo depende de técnicas de medição especiais que permitem determinar a relaxação da magnetização, após a magnetização da marcação magnética 5 5

ou do marcador magnético. Os processos de medição descritos na presente memória da patente de acordo com a invenção são também subsequentemente designados de relaxometriamagnética ou magnetorrelaxometria ou detecção de magneterelaxometria.

Um fundamento essencial da invenção consiste no facto de magnetização relaxar livremente partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas movíveis após o corte de um campo exterior magnetizado a dentro do tempo de medição através de dois mecanismos diferentes: (i) rotação da partícula total coloidal a dentro de líquido circundante, em que a constante de tempo do diâmetro hidrodinâmico das partículas inclusive do invólucro, depende da viscosidade do líquido de suporte e da temperatura, que reflecte principalmente os parâmetros do ambiente que envolve as partículas, este mecanismo é de seguida designado como relaxação de Brown ou como superparamagnetismo extrínseco e (ii) rotação do vector de magnetização interna dentro das partículas coloidais, em que a constante de tempo depende muito sensivelmente do material e forma (constantes de anisotropia do material em partícula utilizado), volumes e a temperatura das partículas utilizadas. Estes são essencialmente parâmetros intrínsecos da partícula, este mecanismo é de seguida designado como relaxação de Néel ou como superparamagnetismo intrínseco. O objectivo da invenção é assim atingido uma vez que foi utilizado em ensaios de imunidade ou então ensaios de ligação de partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas como marcadores magnéticos comprovativos, cuja relaxação Brown decorreu mais rapidamente sob as condições de medição num estado não ligado do que a relaxação Néel. A utilização das partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas deste tipo possibilita então, através da modificação do mecanismo de relaxação dominante, respectivamente, por meio do aumento do volume da partícula que ocorre através da ligação, a determinação específica da proporção dos marcadores 6

magnéticos ligado em conjunto simultaneamente com marcadores magnéticos não ligados presentes na amostra de medição.

Através da utilização de processos de medição sensíveis, pelo procedimento de acordo com a invenção sob utilização de ensaio de imunidade de ligação específica de elevada sensibilidade de partículas ferromagnéticas e ferrimagnéticas ou então de uma análise de ligação, que tanto podem ser executadas em fase líquida como em fase sólida. Como processo de medição especialmente sensível após magnetização da amostra ser determinada, num campo magnetizador e após uma desligação do campo, o relaxação da magnetização por meio de detectores de campo magnéticos de elevada sensibilidade (como, por exemplo, "Dispositivos de interferência Quântica Supercondutores" Superconducting Quantum Interference Devices" (SQUIDs), bobinas de indução, magnetómetros de portão de fluxo, sensores gigantes de resistência magnética ou transformador magnetoresistivo) ou a susceptibilidade complexa da amostra em função da frequência do campo de magnetização.

No processo de acordo com a invenção para a detecção quantitativa magnetorrelaxométrica de analitos em fases líquidas e sólidas, as substâncias de estrutura específica que ligam analitos são, em primeiro lugar, marcadas com partículas coloidais ferrimagnéticas ou ferromagnéticas.

Estas substâncias de estrutura específica magneticamente marcadas são ignoradas em amostras medidas líquidas ou imobilizadas e a amostra medida é magnetizada por intermédio de um campo magnético colocadas no exterior. Após a desligação do campo exterior a relaxação da magnetização do marcador magnético é medida por intermédio de sensores de campo magnético. Realiza-se agora a avaliação dos resultados da medição, tal como nos processos de ensaio directo descritos que se seguem de acordo com métodos conhecidos dos técnicos especializados. 7

O processo de acordo com a invenção para a detecção magnetorrelaxométrica quantitativa de analitos em fases líquidas e sólidas também pode ser realizada por forma a que os analitos primeiramente (i) sejam marcados com partículas coloidais ferrimagnéticas ou ferromagnéticas, e subsequentemente (ii) estes analitos marcados magnéticamente sejam inseridos numa amostra a medir, líquida ou imobilizada, sejam adicionadas substâncias que ligam os analitos especificamente sejam utilizadas, e a amostra a medir seja magnetizada através de um campo magnético colocado no exterior e após a desligação do campo exterior seja medida a relaxação da magnetização do marcador magnético por intermédio de sensores do campo magnético.

Realiza-se agora a avaliação dos resultados da medição, tal como nos processos de análise competitivos descritos em seguida de acordo com os métodos conhecidos dos técnicos especializados, isto é, são aplicados de forma semelhante às imuno ou radio ensaios.

Em ambos os casos referidos pode também ser utilizada para análise a ligação através da formação da susceptibilidade complexa modificada do marcador magnético ou do marcador magnético em função da frequência. A discriminação até agora possível apenas em casos excepcionais entre marcadores ligados e não ligados é possibilitada por intermédio da utilização dos seus mecanismos de relaxação distintos ou através da influência causada pela ligação do tempo de relaxação do marcador magnético.

Os analitos ligados a fases sólidas podem de acordo com a invenção, ser especialmente evidenciados, para o que substâncias de estrutura específica que ligam os analitos são primeiramente (i) marcadas com partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas que relaxam no intervalo de tempo da medição, em que as partículas coloidais ferrimagnéticas e 8

ferromagnéticas são seleccionadas, de modo que a relaxação de Brown sob as condições de medição apresente um tempo de relaxação mais curto do que a relação de Néel e subsequentemente (ii) estas substâncias marcadas magneticamente são utilizadas numa amostra imobilizada a medir e a amostra medir é magnetizada por intermédio de um campo magnético exterior de intensidade apropriada aplicado, e após o campo exterior ser deslizado, é medida a relaxação da magnetização dos marcadores magnéticos por intermédio de sensores do campo magnético, em que o diferente comportamento de relaxação dos marcadores magnéticos, não ligados e ligados com fase sólida é utilizado para a análise. Como grandeza de medição a susceptibilidade complexa da amostra pode ser determinada em função da frequência.

Também neste caso é possível combinar os analitos comprovadores com os marcadores magnéticos, em vez de substâncias de estrutura específica.

Os analitos em fase líquida podem de acordo com a invenção ser especialmente evidenciados para o que substâncias de estrutura específica que ligam os analitos são primeiramente (i) marcados com partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas que relaxam na gama do tempo da medição, em que as partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas são seleccionadas, de modo que a relaxação Brown sob as condições de medição apresente um tempo de relaxação mais curto que a relação de Néel e subsequentemente (ii) estas substâncias magneticamente marcadas são utilizadas numa amostra imobilizada a medir, e a amostra a medir é magnetizada por intermédio de um campo magnético exterior de intensidade apropriada e após desligação do campo exterior é medida a relaxação da magnetização dos marcadores magnéticos por intermédio de sensores do campo magnético, em que o diferente comportamento de relaxação dos marcadores ligados com os analitos em comparação com os marcadores magnéticos não ligados é utilizado para análise. 9

Como grande de medição, a susceptibilidade complexa da amostra pode ser determinada como função da frequência.

Também neste caso é possível combinar os .analitos detectores com os marcadores magnéticos em vez de substâncias de estruturas específicas.

Como substâncias de estrutura específica entendem-se todas as substâncias que se ligam especificamente com uma determinada estrutura. Como substâncias de estrutura específica estão compreendidos especialmente anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina e substâncias que ligam biotina como Avidina e Estreptavidina, agonistas que se ligam especificamente com receptores como citoquinas, linfoquinas, endotilinas ou os seus antagonistas, especificamente péptidos e proteínas, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótidos, ácidos ribonucleícos, ácidos desoxirribonuclicos, hidratos de carbono, lipoproteínas, etc. Como substâncias de estrutura específica são preferidos substâncias, cuja constante de ligação se situa na gama de 105 - 10!5 (mol/1)'1. Especialmente preferidas são as substâncias cuja constante de formação se situa na gama de ΙΟ7- 1015 (mol/1)'1.

As substâncias de estrutura específica ou os analitos a detectar são marcados com o auxílio dos processos correntes da imunoquímica, química dos péptidos e químicos das proteínas com as partículas ferrimagnéticas ou ferromagnéticas. Especialmente vantajosas são as ligações covalentes entre as substâncias de estrutura específica designadamente os analitos a detecções com o invólucro estabilizador das substâncias que formam partículas ferrimagnéticas ou ferromagnéticas. Exemplos de métodos especialmente adequados são a activação e acoplamento por meio de carbodiimidas [Jakoby and Wilchek, ed. Methods Enzymol. (1974) 34], a ligação de bases Schiff de depois da acção de periodatos sobre compostos contendo hidratos de carbono (Wichek and Bayer, ed. Methods Enzym 184: 177), que eventualmente podem ser reduzidos para uma possível estabilização, o acoplamento através de dealdeído glutárico [Heitzmann and Richards, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71 (1974) 3537], a reticulação transversal das partículas bromoacetiladas com substâncias tioliladas [Angerer et. al.; Cell 9 (1976) 81], 10 assim como a alquilação redutora [Bayer et al.; J. Histochem. Cytochem. 24 (1976) 933].

Também podem ser preparadas partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com um invólucro estabilizador da substância de estrutura específica ou dos analitos a detectar, em que as partículas são directamente inseridas após produção numa solução da substância de estrutura específica, eventualmente na presença de uma material auxiliar como, por exemplo, proteínas, hidratos de carbono, assim como, substâncias sintéticas ou parcialmente sintéticas de superfície activa e etc., ou directamente produzidas na presença das substâncias de estrutura específica.

Partículas coloidais adequadas e suspensões que contêm estas partículas são descritas em WO 92/12735, WO/92/22586, EP 0 186 616 e US 4 101 435. O processo de acordo com a invenção pode ser utilizado, por exemplo, na fertilidade, histocompatibilidade, alergologia, infectologia, higiene, genética, virologia, bacteriologia, toxicologia, patologia, análise do ambiente e diagnósticos medicinais.

Um outro objectivo da presente invenção é a utilização de compostos para a detecção magnetorrelaxométrica, que consistem em partículas ferrimagnéticas ou ferromagnéticas móveis isentas de suspensões coloidais e substâncias específica das estruturas nomeadamente analitos a detectar, em que como substâncias específicas das estruturas se entendem especialmente anticorpos fragmentos de anticorpos, biotina e substâncias que ligam biotina como Avidina e Estreptavidina, agonistas que se ligam especificamente a receptores como citoquinas, linfoquinas, endotelinas ou os seus antagonistas, outros péptidas específicos e proteínas, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótidos, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos ensilados, hidratos de carbono, lipoproteínas, etc.

Os compostos para a detecção magnetorrelaxométrica podem consistir também em combinações de várias partículas ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com tempos de 11

relaxação discrimináveis, porque através da utilização de diferentes marcadores magnéticos com a respectiva muito apertada distribuição dos tempos de relaxação e/ou de momentos magnéticos para diferentes substâncias de estrutura específica, ou analitos, é possível obter resultados de mediões individuais, discrimináveis, de uma amostra. Por conseguinte, é possibilitada uma determinação directa, simultânea e quantitativa de vários analitos.

Como meios de suspensão interessam todos líquidos, nos quais as partículas coloidais são livres de se mover. Especialmente adequados são água, soluções aquosas de materiais auxiliares superficialmente activos como, por exemplo, agentes tencioactivos hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos e proteínas, assim como misturas de água com álcoois como, por exemplo, glicerol e polietilenoglicol. Os meios de suspensão podem adicionalmente conter materiais auxiliares que modificam a pressão osmótica como, por exemplo, sal de cozinha. Além disso, podem estar contidas substâncias tampão que determinam valor do pH como, por exemplo, fosfatos.

Os compostos das partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com substâncias de estrutura específica ou analitos a detectar podem estar presentes, também sob a forma seca, eventualmente em combinação com outros materiais auxiliares que, por exemplo, facilitam a secagem ou aumentam a estabilidade do produto seco (por exemplo, como liofilizado). A determinação do analito pode ser realizada com ou sem os procedimentos de desligação e lavagem. Na realização de medições com procedimentos de desligação entre marcadores magnéticos ligados e não ligados podem ser utilizadas, de acordo com a invenção todas as substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas como marcadores magnéticos para a detecção magnetorrelaxométrica. Especiais exigências sobre os tempos de relaxação de Brown e nos tempos de relaxação de Néel são nestes casos dispensáveis. 12

Com base na detecção de ligação dependente de mecanismos físicos, podem ser excluídos sinais de medição não específicos (fenómenos de matriz). A especificidade do processo depende apenas da especificidade “real” da substância de estrutura específica (reactividade cruzada de anticorpos, ligação não específica de ligandos).

Devido à elevada sensibilidade do processo de acordo com a invenção são facilmente alcançados os limites de detecção normais de ensaios de formação.

Como substâncias para a marcação magnética podem ser utilizados todos os materiais ferromagnéticos ou ferrimagnéticos, que se dispersam coloidalmente num meio adequado para detecção magnetorrelaxométrica. Para utilização das substâncias para detecções magnetorrelaxométricas, que são realizadas sem procedimento de desligação entre marcadores magnéticos ligado s e não ligado s, o tempo de relaxação de Néel dos marcadores magnéticos, sob condições de medição, deve ser maior do que o tempo de relaxação de Brown do marcador magnético. Especialmente adequadas são as partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas magnetorrelaxométricascom tempos de relaxação Brown em meios aquosos na gama dos 10'8 - 10'1 e tempo de relaxação Néel superior a 10'8. Para a realização de medidas sem operação de desligação o tempo de medição e a viscosidade do meio de dispersão utilizado devem ser determinados com os tempos de relaxação das partículas ferromagnéticas ou ferrimagnéticas, pois o meio de suspensão determina essencialmente a constante de tempo da relaxação de Brown. São preferidas as partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas de ferro, óxidos de ferro, ferritos de bário, ferritos de estrôncio, cobalto, níquel, ferritos de níquel, ferritos de cobalto e dióxido de crómio cujo tempo de relaxação de Néel é superior ao tempo de relaxação de Brown. A utilização de marcadores magnéticos com um tamanho apertado dè partículas divididas e/ou momentos magnéticos é no geral vantajosa. Uma desligação dos marcadores magnéticos em ffacções pode ser alcançada com uma divisão limitada do tamanho de partículas, por exemplo, através de um processo cromatográfico ou sob 13

utilização de processos especiais de filtração (por exemplo, sistemas de vidro capilar ou filtração tangencial), através da utilização de peneiros moleculares ou por intermédio de centrifugação. Os marcadores magnéticos podem produzir-se com possíveis momentos de unidade, por exemplo, através da peneiração num campo de gradiente magnético.

As substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas podem ser temporizadas com um invólucro de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, proteínas, péptidos, nucleótidos, agentes tensioactivos, monómeros, oligómeros ou polímeros e/ou lipidos. O tamanho das partículas das substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas situa-se para maior vantagem entre 1 nm e 400 nm. Especialmente são os tamanhos das partículas entre 1 nm e 100 nm.

De acordo com a invenção segue a detecção magnetorrelaxométrica com dispositivos de medição que permite uma magnetização da amostra examinada por intermédio de um campo magnético adequado e subsequentemente possibilitar a medição da relaxação magnética do marcador magnético. Um circuito de medição para. a detecção magnetorrelaxométrica de analitos, como o que foi usado nos exemplos está representado na Figura 1. Ao contrário de todos os outros processos já anteriormente conhecidos (JP-235774 e WO 91/15243) no processo da medição de relaxação da magnetização de acordo com a invenção, a magnetização estática não é medida na presença do campo magnetizador, sendo medida a modificação ao longo do tempo na ausência do campo magnetizador. Em primeiro lugar, só são acessíveis informações sobre o estado de ligação do marcador. Como consequência, é evitada uma influência do sinal de medição através dos componentes dia magnéticos ou paramagnéticos relativos a impurezas. Eventualmente a sensibilidade de medição pode ser decisivamente aumentada. É ainda possível a medição da magnetização dependente de frequência do marcador na sequência de um campo de mutação magnética apropriado (determinação da susceptibilidade complexa como função da frequência) por meio de sensores de alta 14

sensibilidade como, por exemplo, SQUIDs, na ausência do campo. No presente caso a dependência da frequência específica da susceptibilidade do marcador magnético utilizada em oposição a uma dependência separada da frequência determinável dos componentes para magnéticos ou diamagnéticos. Também este processo está em oposição ao processo proposto na WO 91/15243 para determinação da susceptibilidade de substâncias superparamagnéticas. Na WO 91/15243 não é descrita nem a dependência da fequência da susceptibilidade do marcador magnético nem um processo para utilização desta propriedade.

Um outro aspecto do processo referente à invenção possibilita a detecção do local de paragem e a medida do marcador ligado específico sem influência através do marcador circulador no sangue. Neste processo é impedida a utilização de substâncias radioactivas, uma vez que até ao presente são intratáveis para a realização do processo cintigráfico do estado da técnica.

Os processos de acordo com a invenção dependem, portanto, da diferença no tempo de relaxação entre marcadores ligados e não ligados magnéticos em líquidos, assim como a modificação do mecanismo de relaxação dominante através da formação do marcador magnético a fases sólidas também poderem ser utilizadas para detecção magnetorrelaxométrica de substâncias ou estruturas in vivo. Os processos deste tipo são também de seguida caracterizados como imunemagnetografia ou imunomagnetografia. A medição in vivo da divisão espacial que se aplica numa gama temporal da medição de um marcador magnético relaxante pode verificar-se através de dois métodos de medição distintos: 1. Produção de um campo magnético o mais possivelmente homogéneo em volumes interessantes. A desligação do campo e medição da divisão espacial do campo magnético relaxante é por intermédio de um canal multisensor. Este deve abranger o objecto de medição se possível totalmente. Para geração de suficiente informação de medição é, de qualquer modo, possível uma múltipla realização sob um repouso sequencial do objecto de medição. 2. A produção sequencial de um campo local especialmente limitado, a desligação do campo e medição da divisão espacial do campo magnético relaxante por intermédio de um sensor de um canal. A utilização de um sensor de multicanais é, de qualquer forma, possível.

Ambos os métodos pretendem especificamente um ganho de máxima informação tanto da magnetização do objecto de medição como da medição do campo magnético resultante nas três direcções espaço. A medição é descrita através de um modelo em que encontra utilização, como o da análise do campo magnético de correntes bioeléctricas. Como fundamento é considerado o modelo do dipolo, multidipolo ou multidipolo magnético. O parâmetro especial do modelo, especialmente o local dos dipolos ou multipól são encontrados através de um processo de aproximação adequado, que minimiza as anomalias entre dado de medição e parâmetros de modelo. Estes parâmetros fornecem a explicação sobre a divisão espacial das partículas magnetizadoras.

Um procedimento análogo é conhecido e comprovado para a análise do campo magnético de correntes bioeléctricas.

Como processos e compostos adequados para imunemagnetografia podem ser utilizados todos os processos e substâncias mencionados para detecção magnetorrelaxométrica.

Especialmente adequados para realização da imunemagnetografia são os marcadores magnéticos, que se podem construir biologicamente e são compatíveis. Isto verifica-se especialmente para marcadores magnéticos que consistem em óxidos de ferro.

Para realização de detecções in vivo magnetorrelaxométricasde formação específica é indispensável, que os tempos de relaxação de Brown nas combinações introduzidas nos corpos humanos de substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas com substâncias de estrutura específica à temperatura do corpo em líquido do corpo são inferiores aos tempos de relaxação de Néel.

Como substâncias de estrutura específica estão especialmentecompreendidas na imunemagnetografia todas as substâncias que se formam na estrutura comprovativa do corpo humano. Especialmente adequados são os anticorpos, fragmentos de anticorpos, agonistas que se ligam especialmente a receptores ou os respectivos antogónitas, péptidas e proteínas específicos, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleotidos, ribonuclídeos, desoxiribonuclídeos, hidratos de carbono ou lipoproteínas. Dos agonistas que se ligam a receptores são adequados especialmente citoquinas, linfoquinas ou endotelinas.

Bastante adequadas são todas as substâncias de estrutura específica que apresentam uma constante de ligação na gama dos ΙΟ5- 1015 (mol/1)'1. Especialmente adequadas são todas as substâncias de estrutura específica que apresentam uma constante de ligação na gama dos ΙΟ7- 1015 (mol/1)'1.

Os exemplos que se seguem servem para exemplificação que se segue do objectivo da invenção, sem a qual estes ficariam limitados.

Exemplo 1

100 μξ de um anticorpo monoclonal contra colagénio ΙΠ, de seguida referido como anti-colagénio ΙΠ, são dissolvidas em 500 μ\ de solução 0,1 M de hidrogeno carbonato de sódio. 1 ml de suspensão de magnético revestida com dextrano (Meito Sangyo) com 1 mol de Fe/1 e um tamanho das partículas de cerca de 40 nm é temporizado através de um coluna Sephadex (Pharmacia PD 10) com de hidrogénio carbonato de sódio 0,1 M. À suspensão são adicionados 0,5 ml de solução 10 milimolar de periodato de sódio. A

I 17 solução fica a repousar durante 2 horas no escuro. Subsequentemente, é eluída através de uma coluna PD 10 com de solução 0,1 M de hidrogénio carbonato de sódio. À suspensão é adicionada a solução de anticolagénio III. A mistura fica a repousar durante 3 horas, a uma temperatura de 4°C na obscuridade. Subsequentemente, são adicionados 5 mg de NaBH4 como substância sólida e brevemente agitada. A mistura fica a repousar durante 8 horas, a uma temperatura de 4°C na obscuridade. Subsequentemente, é eluído o anticolagénio III marcador de magnelite (de seguida referido como Mag-Anti-Colagénio III) através de uma coluna PD 10 com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato (posteriormente PBS, pH 7,4). E incubada uma solução de 5 μ% de colagénio III em 200 μ\ e tampão (solução de sal de cozinha temporizada (PBS) ) num recipiente de amostra de poliestireno. Subsequentemente, a fase líquida é rejeitada. O recipiente da amostra é lavado três vezes com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato contendo 0,1 % Tween® 20 (posteriormente PBST). À amostra são adicionadas 5 μ\ de Mag-Anti-Colagénio III em 200 μ\ de PBST. É incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara magnética protegida num campo com a intensidade de 2 mT a 4 cm a jusante do detector-Squid (ver Figura 1). 400 milésimos de segundo após a desligação do campo magnético é realizada a medição do relaxação durante 100 segundos. Na amostra é detectada uma relaxação através de um campo que desvanece. O sinal de relaxação da amostra contendo colagénio III está representado na Figura 2.

Exemplo 2

Uma solução de 5 μ% de colagénio V é incubada em 200 μ\ de tampão PBS pH 7,4, num recipiente de amostra de poliestireno. Subsequentemente, a fase líquida é rejeitado. O recipiente de amostra é lavado três vezes com tampão de lavagem PBST, é pH 7,4. À amostra são adicionados 5 μ\ de Mag-Anti-Colagénio III, preparado de acordo com o exemplo 1, em 200 μ\ de PBST. É incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara magnética protegida num campo de intensidade 2 mT de 4 cm a jusante do detector-Squid (ver Figura 1). Após a desligação do campo de magnetização a amostra é medida. A medição do relaxação é realizada durante 100 segundos após 400 milésimos de segundo de desligação do campo. Na amostra contendo colagénio V não é detectável no âmbito da capacidade de medição um campo magnético desvanecido (ver Figura 3).

Exemplo 3 A uma solução de 100 /rg de colagénio em 1 ml de PBS são adicionados 100 μΐ de solução de dialdeído glutárico (3% em água). A solução é agitada durante 24 horas 4°Ce depois centrifugada. O bolo contém colagénio ΙΠ reticulado precipitado. O colagénio ΠΙ reticulado é suspenso em 1 ml de PBS. (Amostra 1). A uma solução de 100 μ% de colagénio em 1 ml de PBS são adicionadas 100 μΐ de solução de dialdeído glutárico (3% em água). A solução é agitada durante 24 horas a 4°C e depois centrifugada. A pílula contém colagénio V reticulado precipitado. O colagénio V reticulado é suspenso em 1 ml de PBS. (Amostra 2). Às amostras 1 e 2 são adicionados respectivamente 5 μ\ da suspensão Mag-Anti-Colagénio 1Π do exemplo 1. É incubada durante 1 hora a uma temperatura de 37°C. Subsequentemente, ambas as amostras são magnetizadas numa câmara protegida num campo magnético de intencidade 2 mT sob um detector-SQUID. 400 milissegundos após a desligação do campo de magnetização a medição do relaxação é medida. Na amostra 1 é medido um campo que se desvanece. Na amostra 2 não é detectável nenhum campo.

Exemplo 4 A partir de 10 ml de uma solução de 1,9 mg/ml de colagénio ΙΠ em PBS (pH 7,4) são preparados 5 ml das seguintes diluições: lOOOOng/ml, 1000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml A partir de cada diluição são pipetadas três vezes 1 ml para tubos de ensaio pequenos de poliestireno (capacidade 2,5 ml). É inibido a uma temperatura de 37°C durante 1 hora. 19

De seguida é rejeitado o conteúdo dos tubos. Os tubos são lavados 3 vezes respectivamente com 1 ml de PBST cada um.

Em cada tubinho são adicionados 1 ml de uma diluição 1 : 100 de anticorpo marcado com magnético, produzido de acordo com o exemplo 1. Os tubos ficam a repousar durante 1 hora à temperatura ambiente. De seguida, as amostras são magnetizadas com a disposição de medição esquematizado na Figura 1 (2 mT) e após a desligação do campo magnetizador a relaxação é medida durante 100 segundos. A avaliação das diferenças das densidades de fluxo magnético medidas em B, 200 milissegundos e 100 segundos após a desligação do campo magnetizador, em função da concentração de colagénio na amostra, é reproduzida na Figura 4.

Exemplo 5 100 ,ug de um anticorpo monoclonal contra colagénio III, de seguida referido com anticolagénio III, são dissolvidos em 500 μ\ 0,1 M de solução de carbonato de sódiohidrogénio. 1 ml de suspensão de magnelite revestida com dextrano (Meito Sangyo) com 1 mol de F,e/1 e um tamanho de partículas de cerca de 40 nm são temporizadas através de um coluna Sephadex (Pharmacia PD 10) com hidrogénio carbonato de sódio 0,1 M. À suspensão são adicionados 0,5 ml de solução 10 mmol de periodato de sódio. A. solução fica a repousar durante 2 horas para na obscuridade. Subsequentemente, é eluída através de uma PD 10 com solução 0,1 M com hidrogénio de carbonato de sódio. A suspensão é adicionada a solução de anticolagénio III. A mistura fica a repousar durante 3 horas, a uma temperatura de 4°C na obscuridade. Subsequentemente, são adicionados 5 mg de NaBH4 como substância sólida e brevemente agitada. A mistura fica a repousar durante 8 horas, a uma temperatura de 4°C na obscuridade. Subsequentemente, o anticolagénio II marcador de magnelite (de seguida referido de Mag-Anti-Colagénio III) é eluído através de uma coluna PD 10 com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato (posteriormente PBS, pH 7,4). Cada 20 μ\ da suspensão de Mag-Anti-Colagénio III e diluído com 390 μ\ de solução de sal de cozinha temporizada pH 7,4, que contém adicionalmente 0,1 % de PBST e é

despejado em três recipientes de amostra de ácido poliacrilíco, que respectivamente apresentam uma capacidade intensa de 500 μ\. Ao primeiro recipiente de amostra são adicionados 100 μΐ de uma solução aquosa de albumina soro humana (1 mg de albumina/ml) (amostra 1). Ao segundo recipiente de amostra são adicionados 100 μ\ de uma solução de colagénio V em PBST (1 μ% de colagénio V/ml) (amostra 2). Ao terceiro recipiente de amostra são adicionados 100 μ\ de uma solução de colagénio III em PBST (1 μ% de colagénio IlI/ml) (amostra 3). 200 segundos após a adição das soluções de proteína as amostras são magnetizadas com a disposição de medição esquematizada na Figura 1 (2 mT) e 20 milissegundos após a desligação do campo magnetizador, determina-se respectivamente a relaxação magnética inicial durante 1 segundo. Nas amostras 1 e 2 não é detectável no âmbito da capacidade de medição qualquer campo magnético desvanecente. Na amostra 3 pelo contrário é detectável um campo magnético desvanecente. As medições são repetidas após o despejo do recipiente de amostra e lavagem três vezes com 500 μ\ de PBST de cada vez. Em nenhum dos recipientes de amostra é detecável no âmbito da capacidade de medição um campo magnético desvanecente.

Exemplo 6 100 de Avidina são dissolvidos em 500 μ\ de solução 0,1 M de hidrogénio carbonato de sódio. 1 ml de suspensão de magnelite revestida com dextrano com 1 mol de Fe/1 e um tamanho de partículas de cerca de 40 nm é temporizado através de uma coluna Sephadex (Pharmacia PD 10) com hidrogénio carbonato de sódio 0,1 M. À suspensão são adicionados 0,5 ml de solução 10 mmol de periodato de sódio. A solução fica a repousar durante 2 horas na escuridão. Subsequentemente, é eluída através de uma PD 10 com de solução 0,1 M de hidrogénio carbonato de sódio. À suspensão é adicionada a solução de anticolagénio III. A mistura fica a repousar durante 3 horas, a uma temperatura de 4°C na escuridão. Subsequentemente, são adicionados 5 mg de NaBH4 como substância sólida e agitá-se durante um curto intervalo de tempo. A mistura fica a repousar durante 8 horas, a uma temperatura de 4°C na escuridão. Subsequentemente, é eluída a Avidina marcada com magnelito (de seguida referida de Mag-Avidina através 21

de uma coluna PD 10 com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato (posteriormente PBS, pH 7,4). 1 mg de albumina de soro de vaca é conjugado com biotina-N-hidroxissuccínimida (Sigma) (de seguida designado como biotina-albumina) e diluído até uma concentração de 1 μ% / ml em PBS. 1 ml da diluição de biotina-albumina é incubado durante 3 horas à temperatura ambiente num recipiente para amostra de poliestireno. Subsequentemente, a fase líquida é rejeitada. O recipiente da amostra é lavado três vezes com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato contendo 0,1 % Tween® 20 (posteriormente PBST). À amostra são adicionados 5 μ\ de Mag-Avidina. É incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara magnética protegida num campo de intensidade 2 mT a 4 cm a jusante do detector-Squid (ver Figura 1). 400 milésimos de segundos após a desligação do campo magnético é realizada a medição do relaxação durante 100 segundos. Na amostra é medido um campo magnético que desvanece. 1 ml de uma diluição de albumina de soro de vaca em PBS (0,1 mg/ ml) é incubado durante 3 horas à temperatura ambiente num recipiente para amostras de poliestireno. SubseqUentemente, a fase líquida é rejeitada. O recipiente da amostra é lavado três vezes com solução de sal de cozinha temporizada com fosfato contendo 0,1 % de Tween® 20 (posteriormente PBST). À amostra são adicionados 5 μ\ de Mag-Avidina. É incubado durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara magnética protegida num campo de intensidade 2 mT 4 cm a jusante do detector-Squid (ver Figura 1). 400 milésimos de segundos após a desligação do campo magnético é realizada a medição do durante 100 segundos. Na amostra é medido um campo magnético que não desvanece no âmbito dos limites de confiança de medição.

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Claims (30)

1 s li . V- REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas, caracterizado pelo facto de se utilizarem partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas como marcação magnética de detecção em ensaios de imunidade ou outros ensaios de ligação e ser determinada a relaxação da sua magnetização como grandeza de medição.

2. Processo para a detecção quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas por intermédio de medições de relaxação magnéticos, caracterizado pelo facto de se utilizarem partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas serem como marcação magnética de detecção em ensaios de imunidade ou outros ensaios de ligação, cujo relaxação Brown decorre mais rapidamente sob as condições de medição do que a relaxação de Néel.

3. Processo para a detecção quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas por intermédio de medições da susceptibilidade complexa em função da frequência, caracterizado pelo facto de serem utilizadas partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas como marcação magnética de detecção em ensaios de imunidade ou outros ensaios de ligação, cujo relaxação de Brown decorre mais rapidamente sob as condições de medição do que a relaxação de Néel.

4. Processo para a detecção quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas, caracterizado pelo facto de as substâncias de estrutura específica formadoras de analitos serem primeiramente (i) marcadas com partículas coloidais ferrimagnéticas ou ferromagnéticas e subsequentemente (ii) estas substâncias de estrutura especifica serem inseridos marcadas numa amostra de medição, líquida ou imobilizada, serem utilizadas substâncias que ligam os analitos especificamente, e a amostra medida ser magnetizada através de um campo magnético colocado no exterior e após a desligação do campo exterior ser medida a relaxação da magnetização do marcador magnético por intermédio de sensores de campo magnético.

5. Processo para a detecção quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas, caracterizado pelo facto de os analitos serem primeiramente (i) marcados com partículas coloidais ferrimagnéticas ou ferromagnéticas e subsequentemente (ii) estes analitos marcados magneticamente serem utilizados numa amostra de medição, líquida ou imobilizada, serem utilizadas, substâncias que ligam os analitos especificamente e a amostra medida ser magnetizada através de um campo magnético exterior e após a desligação do campo exterior ser medida a relaxação da magnetização do marcador magnético por intermédio de sensores de campo magnético.

6. Processo para a detecção quantitativa de analitos formados em fase líquida, caracterizado pelo facto de as substâncias que ligam os analitos de forma específica serem primeiramente (i) marcadas com as partículas coloidais relaxadas ferrimagnéticas e ferromagnéticas na gama do tempo da medição, em que as partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas são seleccionadas, para que o relaxação de Brown sob as condições de medição apresente um tempo de relaxação mais curto do que a relação de Néel e subsequentemente (ii) estas substâncias marcadas magnéticas serem utilizadas numa amostra imobilizada a medir, e a amostra medida ser magnetizada por intermédio de um campo magnético exterior de intensidade apropriada e após desligação do campo exterior ser'medida a relaxação da magnetização do marcador magnético por intermédio de sensores de campo magnético, em que o diferente processo de relaxação de marcador magnético, não ligado e ligado de fase sólida é utilizado para análise.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de os analitos comprovadores serem marcados com partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas que se relaxam na gama do tempo da medição, cujo relaxação de Brown sob as condições de medição apresenta um tempo de relaxaçãomais curto que a relação de Néel e por as substâncias formadoras de analitos serem adicionalmente utilizadas numa amostra imobilizada de medida, cujas substâncias especificamente formadoras de analitos estão presentes na amostra imobilizada.

8. Processo para a detecção quantitativa de analitos presentes em fase líquida, caracterizado pelo facto de as substâncias que formam os analitos de estrutura específica serem primeiramente (i) marcadas com partículas coloidais ferrimagnéticas e ferromagnéticas, cuja relaxação Brown apresenta um tempo de relaxação mais curto do que a relaxação de Néel, sob as condições de medição e subsequentemente (ii) estas substâncias marcadas magnética serem utilizadas numa amostra imobilizada medida, e a amostra medida ser magnetizada por intermédio de um campo magnético exterior de intensidade apropriada e após a desligação do campo exterior ser medida a relaxação da magnetização do marcador magnético por intermédio de sensores de campo magnético, em que o diferente processo de relaxação de marcador magnético, não ligado e ligado da fase sólida é utilizado para análise.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de os analitos comprovadores serem marcados com as partículas coloidais relaxadas ferrimagnéticas e ferromagnéticas na gama do tempo da medição, cuja relaxação de Brown sob as condições de medição apresenta um tempo de relaxação e por as substâncias formadoras de analitos serem adicionalmente utilizadas numa amostra imobilizada medida, cujas substâncias especificamente formadoras de analitos estão presentes na amostra medida.

10. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 4 a 9, caracterizado pelo facto de a susceptibilidade complexa estar presente como função da frequência para detecção da medição.

11. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de substâncias de estrutura específica serem anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina 4 ou substâncias que formem biotina como Avidina e Estreptavidina, especificamente em receptores que formemm agonistinas ou os seus respectivos antogonistas, especificamente péptidos e proteínas, receptores, enzimas, susbtratos de enzimas, nucleotidas, ribonuclídeos ensilados, desoxiribonuclídeos ensilados, hidratos de carbono ou lipoproteínas.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de os agonistas ligados por receptores serem citoquinas, linfoquinas ou endotelinas.

13. Processo de acordo com as reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo facto de as substâncias de estrutura específica possuírem uma constante de ligação na gama de 105 -1015 (mol/1)'1.

14. Processo de acordo com as reivindicações 11 e 12, caracterizado pelo facto de as substâncias de estrutura específica possuírem uma constante de ligação na gama de 107 -1015 (mol/1)·'.

15. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo facto de como sensores de campo magnético, serem utilizados dispositivos Interferencia Quânticos Supercondutores (Superconducting Quantum Interference Devices (SQUIDs)) bobinas de indução, magnetometros de portão de fluxo, sensores gigantes ou um transformador magnetorresistente.

16. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de ser realizada numa amostra uma determinação de dois ou mais analitos diferentes.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de serem utilizadas duas ou mais substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com tempos de relaxação de Brown ou de Néel discrimináveis. 5

18. Utilização de compostos para a detecção quantitativa de analitos em fase líquida ou sólida por intermédio de medições de relaxação magnética ou por intermédio de medições da susceptibilidade complexa em função da frequência, caracterizado pelo facto de consistirem em partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com substâncias de estrutura específica ou substâncias a detectar, cujo relaxação de Brown decorre mais rapidamente sob as condições de medição do que a relaxação de Néel.

19. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo facto de as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas possuírem um tamanho das partículas na gama dos 1 a 400 nm.

20. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo facto de as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas possuírem um tamanho das partículas na gama dos 1 a 100 nm.

21. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo facto de as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas serem temporizadas com um invólucro de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, proteínas, péptidos, nucleotidos, e/ou lipidos.

22. Utilização de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo facto de as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas possuírem um tamanho das partículas na gama dos 1 a 400 nm.

23. Utilização de acordo com a reivindicação 18, caracterizadas pelo facto de as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas possuírem um tamanho das partículas na gama dos 1 a 100 nm.

24. Utilização de acordo com as reivindicações 18, 22 e 23, caracterizada pelo facto de as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas serem temporizadas com um 6 I invólucro de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, proteínas, péptidas, nucleótidos, agnetes tensioactivos, polímeros e/ou lípidos.

25. Utilização de acordo com as reivindicações 18, 22 e 23, caracterizada pelo facto de as substâncias de estrutura específica serem anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina e substâncias que ligam biotina como Avidina ou Estreptavidina, especificamente em receptores que ligam agonisnas ou os seus respectivos antogonistas, péptidos e proteínos, especéticos receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótidos, ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, hidratos de carbono ou lipoproteínas.

26. Utilização do processo de acordo com as reivindicações 1-I7el9a21em fertilidade, histocompatibilidade, alergologia, infectologia, higiene, genética, virologia, bacteriologia, toxicologia, patologia, análise do ambiente e diagnóstico medicinal.

27. Utilização do processo de acordo com as reivindicações 18, 22 e 23 na fertilidade, histocompatibilidade, alergologia, infectologia, higiene, genética, virologia, bacteriologia, toxicologia, patologia, análise do ambiente e diagnóstico medicinal.

28. Utilização de combinações de substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas com substâncias de estruturas específicas ou de combinações de substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas com analitos de detecção nos processos de acordo com as reivindicações 1-I7el9a21.

29. Utilização de compostos para o aplicação em processos de acordo com as reivindicações 1 -17 e 19-21, caracterizado pelo facto de consistirem em combinações de substâncias ferrimgnéticas ou ferromagnéticas biologicamente degradáveis com substâncias de estruturas específicas em os tempos de relaxação de Brown das combinações de substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas com substâncias de estruturas específicas à temperatura do corpo em líquidos corporais são mais curtos do que os tempos de relaxação de Néel. 7

30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de as substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas serem óxidos de ferro que são biologicamente degradáveis. Lisboa, 2 H· JAU. 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

Américo áa Silva Carvalho Agente Oficiai de PrasríaSate industrial R.Castilho, 201 -3.e E - 1070 LISBOA Telefs. 38513 39 - 385 4613