PT586002E - Anticorpos monoclonais que reconhecem o receptor do factor de crescimento epidermico, celulas e metodos para a sua producao e composicoes que os incluem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ” ANTICORPOS MONOCLONAIS QUE RECONHECEM O RECEPTOR DO FACTOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO, CÉLULAS E MÉTODOS PARA A SUA PRODUÇÃO E COMPOSIÇÕES QUE OS INCLUEM”

CAMPO DO INVENTO

Este invento está relacionado com o campo dos anticorpos monoclonais e proporciona um método para a selecção de híbridos produtores de anticorpos monoclonais que reconhecem o receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), um antigénio presente em células normais e em células tumorais de origem epitelial. Estes anticorpos apresentam propriedades excelentes e podem ser usados no diagnóstico, tratamento e pesquisa, particularmente de neoplasmas malignos e outras doenças.

Este invento também está relacionado com composições terapêuticas e de diagnóstico que utilizam estes anticorpos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR O Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), um polipeptídeo de 53 aminoácidos, 6KD de peso molecular, que estimula a proliferação de células epiteliais e do mesenquimatosas, tem sido considerado como um dos factores de crescimento envolvidos nas transformações malignas (Cohen S. e Carpenter G., PNAS USA 72, 1317, 1975). Esta acção é desempenhada principalmente através do seu receptor de membrana, uma glicoproteína de 1186 aminoácidos de 170 -2- f

KD de peso molecular. O Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF-R) tomou-se objecto de crescente interesse na pesquisa contra o cancro (Carpenter G. e Cohen S., Receptor Regulation (série B), Vol. 13,41, Lefkowitz, Ed. Chapman and Hall).

Foram detectados níveis elevados de Receptor de EGF em tumores malignos de origem epitelial, tais como cancro da mama, bexiga, ovário, vulva, cólon, pulmão, cérebro e esófago. Desconhece-se o papel desempenhado por EGF e pelo seu receptor na regulação do crescimento de tumores, mas tem sido sugerido que a expressão do Receptor de RGF em células tumorais proporciona um mecanismo autócrino de estimulação do crescimento, conducente à proliferação descontrolada (Schlessinger J., Schreiber A.B., Levi A., Liberman T. e Yarden Y., Crit. rev. Biochem. 14 (2), 93-111, 1983).

Demonstrou-se que a presença de EGF-R em células tumorais é uma indicação de mau prognóstico no cancro da mama humano. Também tem sido considerado que este receptor do factor de crescimento poderá alargar o conceito de dependência hormonal no cancro da mama (Perez R., Pascual M.R., Macias A. e Lage A., Breast câncer Research and Treatment 4,189-193, 1984).

Existem descrições de alguns estudos com anticorpos monoclonais (MAbs) obtidos contra o receptor de EGF, especificamente seleccionados pelo reconhecimento antigénico que bloqueia a ligação de EGF a EGF-R. Estudos preliminares com alguns destes anticorpos demonstraram que o receptor de EGF apresenta uma acumulação preferencial em tumores de origem epidermóide. Daqui resulta o valor potencial da aplicação destes anticorpos monoclonais na imunodetecção e imunoterapia destes tumores (Mendelsohn J., Masui H. e MacLeod C., Proc. Am. Assoe. Can. Res. 26, 287-294, 1985; Gullick W.J., Marsden J.J., Whitle N., Ward B., Borrow L. e Waterfield M.D., Câncer Research 46,285-292, 1985). -3- A utilização de modificadores da resposta biológca para projectar esquemas de tratamento para diferentes doenças constitui uma alternativa muito atraente. Os anticorpos monoclonais constituem um grupo de biomoléculas a ser usado para tais fins (Deusch K., Mauthe B., Reiter C., Endres N., Classen M. e iethmuller G., Proceeding of the International Congress of Immunology, Budapest Hungary, 11,1992). A imunoterapia com anticorpos monoclonais está a ser estudada por muitos investigadores para testar a sua eficácia no tratamento de diferentes localizações neoplásicas (Frodin J.E., Philtedt P., Lefvert A.K. e Mellsted H., Hybridoma, Vol. 7, N°4, 1988). Têm sido propostas muitas modalidades, entre elas: anticorpos monoclonais nativos, conjugados com drogas, bi-específicos, anti-idiotípicos e humanos. A expressão elevada do receptor de EGF em tumores epidermóides pouco diferenciados oferece a possibilidade de considerar os anticorpos como uma via de tratamento onco-específico, quer na forma nativa quer conjugados com drogas, toxinas ou radionuclidos (Vollmar A.M., Banker D.E., Mendelsohn J. e H.R., J. Cell Physiol. 131, 418-425, 1987). Estão em andamento ensaios clínicos para o tratamento de tumores malignos com estes anticorpos monoclonais (Magdelenat H., Delarue J.Y., Mady E., Faillot T., Vega F. e Poisson M., Proceedings of VI Conference of MESTNO International Journal of Tumor Markers, Nice, France, Nov. 1991).

Os anticorpos contra o receptor de EGF que têm sido usados em tratamento têm sido seleccionados principalmente em termos de reconhecimento antigénico, produzindo inibição do crescimento de tumores através desta acção. Esta inibição ocorre através do mecanismo de transdução de sinal em que o -4- receptor de EGF está envolvido (Mendelsohn J., Kawamoto T., Sato G., Sato D., Schlesinger J., Givol D. e Kris R., US Appl. N° 23988, EP 0359282).

Por outro lado alguns gangliósidos têm sido considerados como inibidores da fosforilação do receptor de EGF e como inibidores da transdução de sinal celular, resultando na inibição da proliferação celular. Isto indica que o gangliósido poderá ser considerado um tratamento eficaz para diferentes localizações neoplásicas, especialmente tumores com receptores de EGF (Davis, RJ., J. Biol. Chem. 265, 12059-12066, 1990).

Ainda tem sido descrita a possibilidade de um controlo do crescimento autócrino nalguns tumores, envolvendo os seus próprios factores de crescimento na proliferação. Isto poderá sugerir a utilização deste mecanismo para inibir o crescimento de tumores via anticorpos monoclonais contra factores de crescimento e receptores de factores de crescimento, e considerá-la como uma outra terapia possível para os neoplamas malignos (Todaro C.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5258-5262, 1980). Ainda, os autores deste invento obtiveram evidência experimental da presença de EGF e EGF-R em tumores da mama (dados não publicados).

Até agora, ninguém avaliou a possibilidade de seleccionar hibridomas que produzam anticorpos monoclonais com as características desejáveis de: reconhecimento antigénico, citotoxicidade celular mediada pelo complemento ou dependente de anticorpo, inibição do crescimento de tumores e efeito sinergístico na inibição da proliferação de certas linhas celulares através da combinação com gangliósidos ou com anticorpos monoclonais contra EGF. O único aspecto que tem sido avaliado é a possibilidade da inibição do crescimento de tumores através da inibição do sinal de transdução produzido através do receptor de EGF. -5-

Nos métodos usados até agora, têm sido seleccionados híbridos de acordo com o reconhecimento antigénico e, ainda, os anticorpos têm sido obtidos através de imunizações com o antigénio obtido a partir de linhas de células tumorais e tem sido seleccionado de acordo com a actividade anti-tumoral através deste reconhecimento antigénico.

Os investigadores envolvidos neste campo não têm tido em consideração o possível efeito anti-tumoral que estes anticorpos monoclonais poderão induzir através de citotoxicidade mediada pelo complemento ou dependente de anticorpos, nem a combinação com outras biomoléculas tais como gangliósidos ou factores de crescimento ou outros anticorpos contra factores de crescimento, que possam induzir um efeito sinergístico na inibição da proliferação em linhas celulares de cancro em combinação com os anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF.

Masui et al., Câncer Rsearch 46 (11), 1986, 5592-5598, descreve MAbs contra o Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF-R) que podem evitar a proliferação de algumas células tumorais em cultura, portadoras destes receptores de EGF, mas não de todas.

Rodeck et al., Câncer Research 47(14), 1987, 3692-3696, descreve um MAb (MAb425) que reage com o receptor de RGF em células tumorais humanas originadas em diferentes tecidos, mas apresenta um efeito modulador distinto no crescimento de células A431. Tal como apresentado na figura 2 e na discussão da página 3695, o MAb425 poderá estimular o crescimento celular nalguns tumores humanos. Cárter et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89(10), Maio 1992, 4285- -6- 4289, descreve o MAb humanizado humAb4D5-8 dirigido contra o oncogene HER2. Este receptor da tirosina-cinase pertence à família HER tal como o receptor de EGF (HER1), mas são moléculas diferentes com diferente importância fisiológica na embriogénese e desenvolvimento normais e também na carcinogénese.

Hanai et al., J. Biol. Chem. 263(13), 1988, 6296-6301, descreve que o gangliósido De-N-acetil-GM3 actua como um promotor forte da Cinase do Receptor do Factor de Crescimento Epidérmico e como estimulador do crescimento celular.

SUMÁRIO DO INVENTO

Este invento proporciona anticorpos monoclonais e um método de selecção dos híbridos que os produzam, com caracteristicas qualitativamente superiores que podem ser usados para desenvolver sistemas de diagnóstico, tratamento e pesquisa.

De acordo com o que foi descrito, o principal objectivo deste invento é proporcionar anticorpos monoclonais tendo propriedades superiores, que reconheçam, com elevada afinidade, o receptor de EGF na placenta humana ou em células A-431, sendo capazes de inibir a ligação de EGF, tendo a capacidade de produzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos, tendo a capacidade de desenvolver actividade citotóxica mediada pelo complemento, também tendo a propriedade de inibir o crescimento tumoral em determinadas linhas celulares e apresentando um efeito sinergístico na inibição da proliferação destas linhas celulares quando usados em combinação com gangliósidos ou anticorpos monoclonais contra EGF. -7-

Um outro objectivo deste invento é proporcionar um método de selecção de novas linhas celulares híbridas que produzam os anticorpos monoclais atrás referidos.

Um outro objectivo é proporcionar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais que possuam os critérios de selecção.

Um dos objectivos mais importantes deste invento é proporcionar uma composição farmacêutica contendo os anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF e gangliósidos ou anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF e gangliósidos ou anticorpos monoclonais contra EGF, que produzam um efeito sinergístico na inibição do crescimento celular. A importância desta preparação poderá ser de grande impacto no tratamento de cancro do pulmão, qualquer outro tumor de origem epidermóide, com origem no sistema nervoso ou qualquer outro tumor portador de Receptor de RGF.

Assim, o invento deverá proporcionar o método de selecção atrás referido para obtenção de anticorpos monoclonais assim produzidos e composições que usem estes anticorpos, para diagnóstico e tratamento.

Este invento proporciona um anticorpo monoclonal que reconhece o receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), sendo capaz de inibir a ligação de EGF ao receptor, sendo capaz de inibir o crescimento de células tumorais dependentes de EGF e ainda, tendo pelo menos uma das seguintes propriedades: a) possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos, b) possui actividade citotóxica mediada pelo complemento, c) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células -8- tumorais quando combinado com um gangliósido, d) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um anticorpo monoclonal contra EGF, ou um derivado do referido anticorpo monoclonal seleccionado entre as suas formas humanizadas, quiméricas, reconformacionadas, bi-específicas, conjugadas e anti-idiotípicas, ou um fragmento do referido anticorpo monoclonal ou do referido derivado seleccionado entre os seus fragmentos Fv, Fab, Fab’ e F(ab’)2.

De acordo com o invento, prefere-se um anticorpo monoclonal que possua citotoxicidade celular dependente de anticorpos e actividade citotóxca mediada pelo complemento. Preferencialmente, o referido anticorpo monoclonal é ainda capaz de produzir um efeito sinergístico na inibição da proliferação de células tumorais se combinado com um gangliósido, e/ou capaz de produzir um efeito sinergístico na inibição da proliferação de células tumorais se combinado com um anticorpo monoclonal contra EGF.

De acordo com este invento, prefere-se que o anticorpo monoclonal reconheça o receptor de EGF humano presente nas células normais e o receptor de EGF presente em células tumorais, mais preferencialmente que reconheça o receptor de EGF de placenta humana e o receptor de EGF da linha de celular tumoral A-431.

De acordo com o invento, prefere-se que o anticorpo monoclonal seja capaz de inibir o crescimento das linhas celulares tumorais de pulmão dependentes de EGF U-1752 e/ou H-125; que tenha uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos num teste que use a linha celular A-431 como células alvo; e que tenha uma actividade citotóxica mediada pelo complemento num teste que use a linha celular A-431 como células alvo. -9-

Prefere-se um anticorpo monoclonal que seja capaz de produzir um efeito sinergético na inibição da proliferação de células tumorais (tais como células H-125) se combinado com o gangliósido N-acetil GM3 e que seja capaz de produzir um efeito sinergístico na inibição da proliferação de células tumorais (tais como células H-125) se combinado com um anticorpo monoclonal anti-EGF.

Mais preferencialmente, o anticorpo mnoclonal deste invento é uma imunoglobulina do tipo IgG 2a.

Este invento proporciona ainda uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal conforme aqui é definido, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente. Em particular, o invento proporciona uma composição farmacêutica para usar no tratamento terapêutico ou profilático de neoplasmas malignos ou doenças pré-neoplásicas, compreendendo uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal como aqui é definido, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente. Numa realização ainda mais preferida do invento, a referida composição farmacêutica contem um gangliósido e/ou um anticorpo monoclonal contra EGF.

Este invento proporciona ainda um processo para a preparação de um anticorpo monoclonal que reconheça EGF-R humano, compreendendo os passos de imunização de um animal de laboratório com EGF-R humano, ou um seu derivado antigénico ou fragmento, isolamento de células produtoras de anticorpos a partir do animal imunizado, imortalização das referidas células produtoras de anticorpos, selecção, entre as referidas células imortalizadas, de uma célula que produza um anticorpo monoclonal que reconheça EGF-R humano, capaz de inibir a ligação de EGF ao receptor, capaz de inibir o -10- crescimento de células tumorais dependentes de EGF e ainda, que tenha pelo menos uma das seguintes propriedades: a) possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos, b) possui actividade citotóxica mediada pelo complemento, c) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um gangliósido, d) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um anticorpo monoclonal contra EGF, e isolamento do anticorpo monoclonal produzido pelas referidas células seleccionadas.

Preferencialmente, o passo de imortalização das células produtoras de anticorpos, isoladas a partir do animal imunizado, é realizado através da fusão das células com células de mieloma para produzir células de hibridoma. O animal usado no passo de imunização preferencialmente é um animal roedor, mais preferencialmente um ratinho ou um rato. No processo, o animal é imunizado preferencialmente com EGF-R de placente humana.

De acordo com o invento, prefere-se que as células imortalizadas produtoras do anticorpo monoclonal seleccionado sejam cultivadas in vitro, num meio de cultura do próprio tecido, ou in vivo, num fluido corporal histocompatível, ou em fermentadores com um meio de produção, seguido de separação das células imortalzadas do referido meio. O anticorpo monoclonal produzido pode ser então purificado e facultativamente derivatizado ou fragmentado.

Este invento também proporciona uma célula imortalizada produtora de um anticorpo monoclonal como aqui definido e compreende a utilização do referido anticorpo monoclonal. - 11 -

Numa realização típica, este invento consiste na imunização de ratinhos com uma fracção parcialmente purificada de receptor do factor de crescimento epidérmico de placenta humana; remoção dos respectivos baços e preparação de uma suspensão celular; fusão das células do baço com células de mieloma na presença de um promotor de fusão; diluição e cultura das células; avaliação do sobrenadante que contem o hibridoma; selecção e clonagem de um hibridoma que produza anticorpos com as seguintes características: reconhecimento do receptor de EGF, com elevada afinidade, e com capacidade para inibir a ligação de EGF ao receptor, capacidade de produzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), actividade citotóxica mediada pelo complemento, inibição do crescimento tumoral em determinadas linhas celulares e um efeito sinsergístico na inibição da proliferação destas linhas celulares em combinação com gangliósidos ou anticorpos monoclonais contra EGF; recuperação do anticorpo a partir do líquido sobrenadante e colheita do tumor ascítico ou do soro que contem os anticorpos pretendidos. A selecção, preparação e caracterização das células híbridas (hibridomas) e dos anticorpos resultantes serão melhor compreendidas com a descrição e exemplos que se seguem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O método de preparação de hibridomas geralmente inclui as fases descritas abaixo, as quais incluem os métodos usados na selecção de hibridomas.

A. Imunização de ratinhos com uma fracção parcialmente purificada de EGF-R de placenta humana. Se bem que se tenha observado que os ratinhos Balb/c são os melhores, poderão ser usadas outras linhas de ratinhos. O - 12- programa de imunização e a concentração de antigénio devem ser cuidadosamente medidos para produzir quantidades úteis de células do baço adequadamente estimuladas. Um dos métodos que funciona bem consiste em: 4 imunizações nos dias 0, 14, 21 e 28, com 25 pg de imunogénio por ratinho em 0,2 ml de solução salina de fosfatos, com adjuvante completo no dia 0 e adjuvante incompleto nos dias 14, 21 e 28. A última inoculação foi de 50 pg aplicada intravenosamente, antes da fusão celular. B. Remoção do baço de cada um dos ratinhos imunizados e preparação de uma suspensão de células de baço usando o meio adequado. Aproximadamente 50 ml de meio por baço é adequado de acordo com técnicas experimentais conhecidas. C. Fusão da suspensão de células do baço com células de mieloma de murganho, de uma linha celular adequada, sob o efeito de um agente de fusão. A proporção preferida é de 10 células do baço por célula de mieloma. Um volume total aproximado de 0,1-1 ml de meio de fusão para 108 células é adequado. Muitas linhas celulares de mieloma de murganho são conhecidas e estão disponíveis na comunidade académica ou em bancos especializados. No entanto, a linha celular usada deverá ser do chamado tipo "resistente à droga" de forma a que, ao contrário dos híbridos, as células de mieloma fundidas não sobrevivam num meio selectivo. As classes mais geralmente usadas são as linhas celulares resistentes a 8-azaguanina, que não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase e, portanto, não sobreviverão num meio HAT (hipoxantina-aminopterina e timidina). É também preferível usar uma linha de mieloma da classe conhecida como "não secretora", uma vez que estas não produzem anticorpos por si sós. No entanto, caso seja necessário, as classes que secretam também podem ser usadas.

Se bem que o agente promotor da fusão preferido seja polietilenoglicol com um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 4000, outros promotores poderão ser usados. D. Diluição e cultura em placas com alvéolos da mistura de células de baço não fundidas, células de mieloma não fundidas e células fundidas num meio selectivo que não mantenha as células de mieloma não fundidas (i.e. HAT). Após uma semana, as células do baço não fundidas cessam de se multiplicar. Por outro lado, as células fundidas continuam a reproduzir-se como resultado das características malignas herdadas do mieloma parental e da capacidade de sobrevivência das células do baço parentais no ambiente selectivo.

E. MÉTODOS DE SELECÇÃO DE HIBRIDOMAS 1. Análise do sobrenadante dos hibridomas em cada alvéolo para determinar a presença dos anticorpos que com elevada afinidade reconhecem selectivamente o receptor de EGF da placenta humana e o receptor presente na linha celular tumoral A-431 e estes anticorpos monoclonais sendo também capazes de inibir a ligação de EGF ao receptor. Esta avaliação pode ser feita de acordo com as técnicas preferidas de radio-receptores ou de imunoensaio usando como antigénios as linhas celulares ricas em receptor de EGF e o receptor da placenta humana que foi parcialmente purificado de acordo com os métodos de purificação por afinidade descritos abaixo. 2. Avaliação do sobrenadante dos hibridomas, em cada um dos alvéolos, para determinar a presença de anticorpos que tenham as propriedades de inibir o crescimento tumoral de linhas celulares de cancro do pulmão. Concentrações diferentes do anticorpo monoclonal são adicionadas às células em suspensão e faz-se uma comparação com um grupo testemunha, um sem - 14- anticorpo e outro com uma quantdade irrelevante de anticorpo. As medições da concentração de proteína são realizadas pelo método de Lowry Rosebrough, mas poderá ser usado qualquer outro método de medição da concentração de proteína total. 3. Avaliação do sobrenadante dos hibridomas em cada um dos alvéolos para determinar a presença dos anticorpos que tenham as propriedades de produzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos, usando o método de medição convencional para esta actividade, o qual é realizado com células alvo marcadas com 51 Cr, células efectoras e diferentes concentrações de anticorpo monoclonal. 4. Avaliação do sobrenadantes dos hibridomas em cada um dos alvéolos para determinar a presença dos anticorpos que possuam as propriedades de produzir actividade citotóxica mediada pelo complemento. Isto é conseguido com métodos convencionais para medição desta actividade, usando células alvo marcadas com 51 Cr, complemento de coelho e diferentes concentrações do anticorpo monoclonal. 5. Avaliação do sobrenadante dos hibridomas em cada um dos alvéolos para determinar a presença de anticorpos que tenham a propriedade de produzir efeito sinergístico na inibição da proliferação celular quando são combinados com gangliósidos.

Obtem-se uma suspensão celular que se ressuspende em meio de cultura e os gangliósidos são adicionados numa gama de concentrações de 0,5-50 microMoles. Em seguida os anticorpos monoclonais (sobrenadante) são adicionados numa gama de concentrações de 10 a 100 microgramas por ml. No terceiro e sexto dia a concentração de proteína total é medida, sendo - 15- preferencialmente usado o método de Lowry Rosebrough, mas poderá ser usado qualquer outro método. 6. Avaliação do sobrenadante de hibridoma em cada um dos alvéolos para determinar a presença dos anticorpos que possuam a propriedade de produzir efeito sinergético na inibição da proliferação celular quando são combinados com um anticorpo monoclonal contra EGF.

Uma suspensão celular pode ser obtida e ressuspensa em meio de cultura e o MAb contra EGF é adicionado numa gama de concentrações adequadas e os anticorpos monoclonais são adicionados numa gama de concentrações de 10 a 100 microgramas por ml. Nos terceiro e sexto dia mede-se a concentração de proteína total, preferencialmente usa-se o método de Lowry Rosebrough, mas poderá ser usado qualquer outro método de medição da concentração de proteína total. F. Selecção (i.e. via diluição limite) e clonagem do hibridoma produtor de anticorpos.

Uma vez seleccionado o hibridoma pretendido e clonado pelo menos duas vezes, os anticorpos podem ser produzidos usando um de dois métodos: a) Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos através da cultura in vitro do hibridoma num meio adequado durante o tempo indicado, seguido da recuperação do anticorpo pretendido a partir do sobrenadante. O meio e o tempo adequados são conhecidos ou facilmente determinados. Esta técnica in vitro produz um anticorpo essencialmente mono-específico, essencialmente isento de outras imunoglobulinas específicas anti-humano. Existe uma pequena -16- quantidade de outras imunoglobulinas uma vez que o meio contem soro xenogeneico (soro fetal ou soro de vitela recém-nascida). Este método in vitro pode sofrer um aumento de escala em bio-reactores para se obter as quantidades adequadas dos anticorpos monoclonais pretendidos. b) O outro método de produção envolve a injecção do hibridoma preferencialmente num ratinho singeneico. Após um período de incubação adequado, o hibridoma causará a formação de tumores não sólidos que produzem anticorpos. Estes proporcionarão uma concentração elevada dos anticorpos pretendidos (5-20 mg/ml) na corrente sanguínea e no exsudado peritoneal (ascites) do murganho hospedeiro. Se bem que estes hospedeiros também apresentem anticorpos normais no sangue, nas ascites a concentração de anticorpos monoclonais é maior. Ainda, uma vez que os anticorpos normais não são especificamente anti-humano, os anticorpos monoclonais obtidos estão essencialmente livres de qualquer outra imunoglobulina anti-humana contaminante. As imunoglobulinas produzidas pela incorporação de cadeias leves de mieloma são peptídeos irrelevantes inespecíficos que apenas diluem os anticorpos monoclonais sem afectar a sua especificidade.

De acordo com este aspecto, o invento proporciona linhas celulares de hibridoma capazes de produzir anticorpos monoclonais que reconhecem o receptor EGF com uma afinidade elevada, capazes de inibir a ligação de EGF ao receptor, capazes de produzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos, capazes de desenvolver actividade citotóxica mediada pelo complemento, podendo inibir o crescimento tumoral nalgumas linhas celulares e em combinação com gangliósidos, ou anticorpos monoclonais contra EGF, produzir um efeito sinergístico na inibição de proliferação das mesmas.

Os referidos anticorpos poderão ser usados para desenvolver -17- técnicas de imunodetecção, desenvolver novos tratamentos com biomoléculas, estudo da topografia molecular dos antigénios, desenvolver anticorpos anti-idiotípicos e humanizados, estudar a sua utilização na regulação idiotípica da rede imunitária e imunopurificação e caracterização estrutural do antigénio que reconhecem. G. OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA COM OS ANTICORPOS MONOCLONAIS OBTIOS QUE INDUZEM EFEITO IMUNOLÓGICO.

Uma vez obtidos os anticorpos purificados, desenvolve-se uma composição terapêutica que contem uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma obtido de acordo com o Método de Selecção de Hibridomas, e que induz efeito imunológico. Os anticorpos seleccionados segundo este critério foram caracterizados relativamente à actividade citotóxica mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo. Isto foi demonstrado usando técnicas convencionais; a linha celular A-431 marcada com 51 Cr foi usada como células alvo. As células alvo numa concentração adequada foram pipetadas para microplacas com o anticorpo monoclonal. A fonte de complemento pode ser soro humano ou de coelho em meio de cultura. A incubação das linhas celulares H-125 com os MAbs mostrou, na presença de complemento, um efeito citotóxico. A citotoxicidade celular mediada por anticorpos foi realizada usando macrófagos peritoneais de ratinho Balb/c como células efectoras, permitindo obter um efeito citolítico.

Nesta preparação deverá usar-se um veículo farmacêutico, o qual pode ser qualquer um dos usados na farmacopeia convencional, ou maltose, ou trealose, sacarose ou polietilenoglicol 800 ou a combinação destes com o catião - 18-

Zn, em diferentes concentrações. Esta preparação poderá ser do referido anticorpo ou de seus fragmentos (Fv, Fab, Fab', F(ab')2) ou de anticorpo humanizado, quimérico, "reconformacionado" ou qualquer um dos anticorpos atrás referidos conjugados com toxinas, radionuclidos ou qualquer outra droga disponível ou pode ser dos anticorpos anti-idiotípicos (AB2, AB·) obtidos contra o referido anticorpo; para o tratamento ou prevençãode neoplasmas malignos ou doenças pré-neoplásicas, especialmente em tumores do sistema nervoso central, tumores da cabeça e pescoço e da mama e adenocarcinomas do pulmão.

H. OBTENÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA A PARTIR DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS OBTIDOS EM COMBINAÇÃO COM UM GANGLIÓSIDO

Uma vez obtidos os anticorpos purificados, desenvolveu-se uma composição terapêutica que contem uma quantidade eficaz de quaisquer anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma produzido pelo Método de Selecção de Hibridomas, incluindo uma concentração adequada de um gangliósido.

Foi demonstrado efeito sinergístico pela combinação destes anticorpos monoclonais e diferentes gangliósidos. Diferentes concentrações de gangliósidos produziram inibição do crescimento da proliferação celular quando combinados com anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF.

Obteve-se uma suspensão celular a partir das linhas celulares H-125 e U-175, respectivamente, e ressuspendeu-se em meio de cultura. Adicionou-se os gangliósidos, numa gama de concentrações de 0,5-50 microMoles e os anticorpos monoclonais contra o Receptor de EGF numa gama de concentrações de 10 a 100 microgramas por mil. - 19-

Aos terceiro e sexto dias mediu-se a concentração de proteína total pelo método de Lowry Rosebrough (Lowry D.H., J. Biol. Chem. 193:265, 1951), mas qualquer outro método poderá ser usado. Observou-se um efeito sinergético da combinação Gangliósido-anticorpo monoclonal contra o receptor EGF na inibição da proliferação de uma linha celular de cancro do pulmão relativamente às testemunhas usadas no teste.

Houve quase 100% de inibição da proliferação relativamente à testemunha; o efeito produzido pela combinação é superior ao simples efeito aditivo de ambas as moléculas independentemente.

Nesta preparação deverá ser usado um veículo farmacêutico, o qual pode ser qualquer um dos usados na farmacopeia convencional, ou maltose ou trealose, sacarose ou polietilenoglicol 800 ou a combinação destes com catião Zn, em diferentes concentrações. Esta preparação poderá ser do referido anticorpo ou dos seus fragmentos (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou de anticorpo humanizado, quimérico, "reconformacionado", bi-específico ou qualquer um dos anticorpos atrás referidos conjugados com toxinas, radionuclidos ou qualquer outra droga disponível ou pode ser dos anticorpos anti-idiotípicos (AB, AB·) obtidos contra os referidos anticorpos; para o tratamento ou prevenção de neoplasmas malignos ou doenças pré-neoplásicas, especialmente tumores do sistema nervoso central, tumores da cabeça e pescoço, e tumores da mama e adenocarcinomas do pulmão.

I. Obtenção de uma composição terapêutica a partir dos anticorpos monoclonais obtidos em combinação com anticorpos monoclonais contra EGF

Uma vez obtidos os anticorpos purificados, desenvolveu-se uma composição terapêutica contendo uma quantidade eficaz de quaisquer anticorpos monoclonais sintetizados pelo hibridoma produzido pelo Método de Selecção de Hibridomas, incluindo uma concentração adequada de um anticorpo monoclonal contra EGF e um veículo farmacêutico, que pode ser qualquer um dos usados na farmacopeia convencional, ou maltose, trealose, sacarose ou polietilenoglicol 800 ou a combinação destes com o catião Zn, em diferentes concentrações. Esta preparação poderá ser do referido anticorpo ou dos seus fragmentos (Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou de anticorpo humanizado, quimérico, "reconformacionado", bi-específico ou qualquer um dos anticorpos atrás referidos conjugado com toxinas, radionuclidos ou qualquer outra droga disponível ou de anticorpos anti-idiotípicos (AB, AB·) obtidos contra os referidos anticorpos; para o tratamento ou prevenção de neoplasmas malignos ou doenças pré-neoplásicas, especialmente tumores do sistema nervoso central, tumores da cabeça e pescoço, e tumores da mama e adenocarcinomas do pulmão. EXEMPLO 1

MÉTODOS DE SELECÇÃO DE HIBRIDOMAS a) Selecção de hibridomas de acordo com o método de reconhecimento antigénico O sobrenadante de hibridomas em cada uma dos alvéolos foi avaliado para determinar a presença de anticorpos, que com elevada afinidade selectivamente reconhecem o receptor de EGF de placenta humana e o receptor da linha celular A-431 de origem epidermóide e sendo também capazes de inibir a união de EGF com o receptor.

Após a fusão celular, as células foram cultivadas em meio HAT selectivo (hipoxantina, aminopterina e timidina) a 37°C com uma atmosfera húmida e 5% de C02. -21 -

Três semanas mais tarde, 10 μΐ de sobrenadante das culturas que contêm hibridomas foram adicionados aos alvéolos de placas de cloreto de polivinilo que foram previamente revestidas com extractos de membrana placentária ou da linha celular A-431, a qual contem o receptor de EGF. A detecção dos anticorpos que reagem com o antigénio expresso nestes extractos de membranas foi feita através de um ensaio imunoenzimático indirecto em fase sólida. O antigénio foi imobilizado através do revestimento de placas de clorteo de polivinilo com receptor de EGF solúvel parcialmente purificado. Usou-se a solução tampão HEPES 10 mM, pH 7,5. A sonda usada como segundo anticorpo foi um anticorpo anti-ratinho conjugado com peroxidase (Amersham).

As culturas de hibridoma que contendo anticorpos reagem com extractos de membrana contendo o receptor, são seleccionadas e clonadas duas vezes de acordo com o método de diluição limite, na presença de células condicionantes. O método tem a característica especial de seleccionar simultaneamente os anticorpos contra ambos os antigénios; o receptor da placenta humana, que possui epitopos normais, e o receptor da linha celular A-431, cujos epitopos surgem durante a progressão maligna, o que significa que o epitopo seleccionado no anticorpo pelo Método de Selecção é preservado nas moléculas de receptor presentes em tecidos normais e também surge na maior parte das moléculas de receptor presentes em tecido tumoral de origem epidermóide. b) Selecção de hibridomas de acordo com a actividade anti-tumoral O sobrenadante dos hibridomas de cada um dos alvéolos foi avaliado para determinar a presença dos anticorpos que inibem o crescimento -22- tumoral em linhas celulares de cancro do pulmão U-1752 e H-125 (NCI, Bethesda, Maryland). Estas linhas celulares apresentam dependência de EGF para a sua proliferação. O meio de cultura usado foi RPMI-1640 (Gibco, USA) suplementado com 5-10% de soro fetal. As células foram mantidas em estufas a 37°C numa atmosfera húmida e numa mistura de ar-dióxido de carbono (95%-5%). O efeito inibidor dos anticorpos monoclonais foi medido nas células em suspensão com tripsina e ressuspensas em concentrações de 2,5 x 104 células/ml de cultura à qual se adicionou diferentes concentrações de anticorpo monoclonal: 10, 30 e 100 pg/ml. Um grupo testemunha com um anticorpo irrelevante foi também estudado em concentrações de 100 μg/ml. As suspensões celulares foram colocadas em placas de cultura de 24 alvéolos (1 ml por alvéolo) e cada uma das amostras foi testada três vezes. Prepararam-se placas para cada uma das linhas celulares e analizaram-se as diferentes tempos de exposição (1,3, 5 e 7 dias). A determinação do número total de células foi feita de acordo com o método quantitativo de determinação da proteína total (D.H. Lowry). A inibição da proliferação das linhas celulares de cancro do pulmão H-125 e U-1752 foi produzida em 50% relativamente à testemunha, este resultado pode ser observado na Figura 12.

Esta parte do método de selecção tem a característica particular de os hibridomas seleccionados produzirem anticorpos monoclonais com um reconhecimento específico do antigénio e simultaneamente apresentarem a capacidade para inibir o crescimento tumoral. -23- c) Selecção do hibridoma de acordo com a capacidade para produzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos. O sobrenadante de hibridoma em cada um dos alvéolos foi avaliado para determinar a presença dos anticorpos que produzem citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Usou-se uma técnica de medição convencional desta actividade; a linha celular A-431 marcada com 51 Cr (100 pCi) foi usada como células alvo.

As células efectoras foram as células do sangue de adultos normais preparadas com um gradiente de Ficoll-Hypaque em que as células mononucleadas do sangue periférico foram separadas, lavadas três vezes e ajustadas numa proporção de CÉLULA EFECTORA/CÉLULA ALVO de 200:1.

As células alvo numa concentração de 104 foram pipetadas para placas de 96 alvéolos que continham 25 μΐ de anticorpo monoclonal (líquido ascítico diluído a 1/10). As placas com as células alvo e o anticorpo foram incubadas a 4°C durante 30 minutos. As células efectoras (100 μΐ) foram adicionadas à placa e centrifugadas imediatamente a 100 xg durante 2 minutos. Foram em seguida incubadas durante quatro horas numa câmara húmida a 37°C com 5-95% de C02-ar. Nesta experiência demonstrou-se um efeito inibidor dependente de anticorpo de 22%.

Nesta parte do método de selecção, os hibridomas obtidos são produtores de anticorpos monoclonais possuindo as três propriedades: reconhecimento antigénico, inibição do crescimento tumoral e ao mesmo tempo, citotoxicidade celular dependente de anticorpos. d) Selecção do hibridoma de acordo com a capacidade para produzir actividade citotóxica mediada pelo complemento. -24-

O sobrenadante de cada um dos alvéolos foi analisado para determinar a presença de anticorpos que produzam actividade citotóxica mediada pelo complemento, usando o método de medição convencional e uma linha celular A-431, marcada com 51 Cr (100 pCi), foi usada como células alvo.

As células alvo numa concentração de 104 foram pipetadas para placas de 96 alvéolos contendo 25 μΐ de anticorpo monoclonal (líquido ascítico diluido a 1/10). A fonte de complemento consistiu em 100 μΐ de soro de coelho a 25% em meio de cultura. Incubou-se durante quatro horas numa câmara húmida, a 37°C, com 5-95% de C02-ar. As placas foram mais tarde centrifugadas e as contagens por minuto (cpm) foram medidas em 100 μΐ do sobrenadante num contador gama.

Testaram-se várias soluções de trabalho dos anticorpos para verificar qual o valor máximo de toxicidade. Nesta experiência observou-se um efeito inibidor mediado pelo complemento de 60% como se mostra na Figura 14. e) selecção do hibridoma de acordo còm a capacidade para produzir um efeito sinergístico em combinação com N-acetil GM3 A linha celular H-125, expressando 104-105 sítios de ligação ao receptor de EGF e classificada como um adenocarcinoma do pulmão, foi usada como modelo experimental para o despiste. Obteve-se uma suspensão celular com 104-105 células por ml e ressuspendeu-se em meio de cultura. Adicionou-se em seguida N-acetil GM3 numa concentração de 5 microgramas e um anticorpo monoclonal contra o Receptor de EGF numa concentração de 30 microgramas -25- por ml. Aos terceiro e sexto dias mediu-se a concentração de proteína total pelo método de Lowry Rosebrough.

Observou-se um efeito sinergístico da combinação de N-acetil GM3-anticorpo monoclonal contra o receptor de EGF na inibição da proliferação de uma linha celular do cancro do pulmão, relativamente às testemunhas usadas neste teste. Houve quase 100% de inibição da proliferação relativamente à testemunha. Assim o efeito produzido pela combinação é muito mais do que o simples efeito aditivo de ambas as moléculas independentemente. Este resultado está apresentado na Figura 15. f) Selecção do hibridoma de acordo com a capacidade para produzir um efeito sinergístico em combinação com os anticorpos monoclonais contra EGF. A linha celular H-125, expressando 104-105 sítios de ligação ao receptor de EGF e classificada como adenocarcinoma do pulmão, foi usada como modelo experimental para o despiste. Obteve-se uma suspensão celular com 104-105 células por ml e ressuspendeu-se em meio de cultura. Os MAbs contra EGF foram adicionados numa concentração de 5 microMoles e os anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF numa concentração de 30 microgramas por ml. Aos terceiro e sexto dias mediu-se a concentração de proteína total pelo método de Lowry Rosebrough.

Observou-se um efeito sinergético da combinação de MAbs contra EGF-anticorpos monoclonais contra receptor de EGF na inibição da proliferação de uma linha celular de cancro do pulmão, relativamente às testemunhas usadas neste teste. -26-

Os anticorpos produzidos pelos hibridomas, obtidos com base no método de selecção usado, possuem propriedades superiores que os distinguem por: reconhecimento antigénico de elevada afinidade para o receptor de EGF; citotoxicidade celular dependente de anticorpos; actividade citotóxica mediada pelo complemento; capacidade para inibir o crescimento tumoral em linhas celulares e um efeito sinergístico em combinação com N-acetil GM3 ou com MAbs contra EGF. EXEMPLO 2

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS OBTIDOS PELO PROCESSO DE SELECÇÃO

Os anticorpos monoclonais obtidos são imunoglobulinas do tipo IgG2a secretadas pelos hibridomas, obtidos a partir da fusão do mieloma de ratinho SP2/Agl4 com linfócitos do baço de ratinhos Balb/c imunizados com uma fracção parcialmente purificada do receptor de EGF de placenta humana. A purificação do receptor de EGF solubilizado foi realizada por cromatografia de afinidade. Resumidamente: a fracção membranar de placenta humana foi solubilizada numa solução tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, 10% de glicerina e 1% de Triton X-100 durante 1 hora à temperatura ambiente. O homogenato foi centrifugado a lOOOOg. O sobrenadante foi aplicado numa coluna de matriz de afinidade com EGF. A fracção enriquecida em EGF foi eluida com uma solução tampão de etanolamina 5 mM, pH 9,7, com 10% de glicerina e 1% de Triton X-100. Esta fracção, enriquecida em Receptor de EGF solubilizado, tem a capacidade de ligar 125I-EGF e apresentou uma banda principal de 170 KD em SDS-PAGE. Processou-se cem gramas de cada vez. O rendimento médio foi -27- de 15-25 μg de receptor de EGF parcialmente purificado por grama de tecido molhado.

Estes anticorpos monoclonais possuem as seguintes características:

Uma elevada afinidade de ligação para o receptor, com valores de Kd de IO-9 M calculado através de uma curva de concentração semi-saturada, como se mostra na Figura 1, esta afinidade é semelhante à afinidade do receptor para EGF. São capazes de inibir a ligação de 125I-EGF ao receptor de membrana, usando uma fracção de microssomas de placenta humana (Figura 2 e Figura 4), é possível deduzir dos seus valores de Ki de IO'8 M, que o sítio de ligação não é o mesmo do Factor de Crescimento Epidérmico e que a inibição é provocada por um efeito espacial ou conformacional. Estes anticorpos monoclonais suprimem o efeito de EGF na linha celular A431, mesmo na presença de agentes sinergéticos tais como IFN gama (Figura 6 e 7). Estes MAbs também inibem o crescimento clonogénico dependente de EGF das células NRK e inibem a auto-fosforilação dependente do receptor de EGF (Figura 8) considerado como um passo crucial na transdução dos sinais de proliferação celular, o que demonstra o papel antagonístico de EGF desempenhado por estes anticorpos monoclonais.

Foram realizados estudos que corroboram este efeito usando o MAb e o seu fragmento Fab obtido por digestão com papaína (Figura 9 e 10). Este efeito provou ser dependente da dose. O fragmento retem a mesma capacidade para suprimir a proliferação celular induzida por EGF.

Também se demonstrou a capacidade destes anticorpos -28- monoclonais para inibirem a proliferação celular de diferentes linhas celulares. Nas linhas celulares de cancro do pulmão estudadas (H-125 e U-1752) encontrou-se que, nas concentrações de 10 pg/ml destes anticorpos, o crescimento diminuiu ligeiramente e não houve diferença significativa em comparação com a testemunha, no entanto, quando foi aplicado em concentrações de 30 pg/ml, a inibição do crescimento foi conseguida na cultura por volta do dia 3, permanecendo estacionária e no quinto dia observou-se uma inibição de 50% comparado com a testemunha (Figuras 12 e 13).

Estes anticorpos monoclonais são também caracterizados pela actividade citotóxica mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos. A incubação da linha celular H-125 com os anticorpos monoclonais mostrou, na presença de complemento de coelho, um efeito citotóxico de 60% numa concentração de 12,5 pg/ml (Figura 14). A citotoxicidade celular mediada pelos anticorpos, realizada usando macrófagos peritoneais de ratinho Balb/c como células efectoras numa proporção de 110:1 (Efectora:Alvo), produziu um efeito citolítico de 22%.

Foi também demonstrado o efeito sinergético demonstrado pela combinação destes anticorpos monoclonais e diferentes concentrações de gangliósidos. Esta combinação pode produzir uma inibição de crescimento da proliferação celular. N-acetil GM3 foi adicionado numa concentração de 5 micromoles e o MAb foi adicionado numa concentração de 30 microgramas por ml.

Observou-se um efeito sinergético da combinação de N-acetil GM3-anticorpo monoclonal contra o receptor de EGF na inibição da proliferação -29- de uma linha celular de cancro do pulmão, relativamente às testemunhas usadas no teste.

Houve quase 100% de inibição da proliferação relativamente ao controlo; o efeito produzido pela combinação é superior ao simples efeito aditivo de ambas as moléculas independentemente (Figura 15).

Realizou-se um estudo da sequência das regiões variáveis da cadeia pesada das imunoglobulinas obtidas através da Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR). Para sequenciação usaram-se amplificações de pelo menos 2 amostras de PCR independentes e de pelo menos dois clones em pUC19 independentes. Uma vez amplificadas, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada foram clonadas no vector pUC19 e a sequência da cadeia pesada foi identificada.

De acordo com a base de dados Kabat, esta sequência foi classificada como sendo do grupo miscelânea. O re-ordenamento das regiões variáveis da cadeia pesada define o epitopo do receptor de EGF que é reconhecido por estes anticorpos monoclonais. EXEMPLO 3

CARACTERIZAÇÃO DA REACTIVIDADE DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS OBTIDOS PELO PROCESSO DE SELECÇÃO

Para este estudo seleccionaram-se tecidos frescos, estes incluíram amostras de coração, fígado, pulmão, rim, baço, ovário, pâncreas, cérebro, -30- -30-

testículos, glândulas adrenais, hipófise, nódulos linfáticos, medula, tiróide., amígdalas, estômago, intestino delgado, cólon, pele, glândula submaxilar, placenta e cerebelo. Foram igualmente estudados vários tecidos nervosos, hematopoiéticos e tumores do tipo sarcoma.

Os tecidos frescos foram congelados em azoto líquido e guardados a -20°C. O estudo histopatológico foi realizado usando secções coradas com hematoxileneosina. Secções consecutivas, baseadas nos blocos avaliados histopatologicamente, foram usadas para corar com a técnica de imunoperoxidase. A reactividade dos tecidos foi demonstrada usando o complexo biotina-estreptavidina-peroxidase (Amersham, U.K.). O estudo incluiu secções com testemunhas positivas (secções de pele) e negativas (solução salina tamponada com tris). A reacção com a enzima produz um precipitado castanho e foi classificada como se segue: * ausência de reacção (-); * reacção ligeira (+); * reacção moderada (++); * reacção intensa (+++).

Retirou-se tecido normal fresco duma autópsia recente e observou-se uma reactividade intensa do tecido de acordo com o padrão estabelecido no pâncreas e testículos.

Retirou-se tecido normal fresco numa autópsia recente e observou-se uma reactividade do tecido moderadamente intensa de acordo com o -31 - padrão estabelecido nos seguintes tecidos: placenta, pele, próstata, fígado rim, ovário, tiróide, intestino e tecido não linfóide das amígdalas (Tabela 1).

Os tumores epidermóides e os tumores do sistema nervoso central, tais como glioma, meningioma, histiocitoma maligno, neuro-fibrossarcoma, assim como tumores mamários e da nasofaringe apresentaram reacção intensa, de acordo com o padrão estabelecido, e em concentração muito mais elevada do que nos tecidos normais da mesma origem (Tabela 2). A detecção apenas ocorre em tecido contendo o receptor, o que demonstra o reconhecimento específico do epitopo da molécula, e daí a sua natureza particular, assim como a ausência de epítopos relacionados em outros antigénios. EXEMPLO 4

DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO TERAPÊUTICO QUE INDUZ EFEITO IMUNOLÓGICO

Desenvolveu-se um composto terpêutico contendo uma quantidade eficaz de anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma, obtido através do Método de Selecção de Hibridomas, que produz citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Para tal, usámos a técnica convencional de medição desta actividade. A linha celular A-431, marcada com 51 Cr (100 pCi), foi usada como células alvo. As células efectoras foram células do sangue de adultos normais, preparadas com um gradiente de Ficoll-Hypaque, em que as células mononucleadas do sangue periférico foram separadas, lavadas três vezes e ajustadas numa proporção de CÉLULA EFECTORA/CÉLULA ALVO de 200:1. -32-

As placas com as células alvo e o anticorpo foram incubados a 4°C durante 30 minutos. As células efectoras (100 μΐ) foram adicionadas à placa e centrifugadas imediatamente a lOOxg durante 2 minutos. Em seguida foram incubadas durante quatro horas numa câmara húmida a 37°C com 5-95% de C02-ar. As contagens por minuto (cpm) foram medidas em 100 μΐ de sobrenadante num contador gama. A actividade citotóxica mediada pelo complemento foi medida usando o método convencional de medição e a linha celular A-431 marcada com o isótopo 51 Cr (100 pCi) como células alvo.

As células alvo numa concentração de 104 foram pipetadas para placas de 96 alvéolos contendo 25 μΐ de anticorpo monoclonal (líquido ascítico) diluido a 1/10. A fonte de complemento consistiu em 100 μΐ de soro de coelho a 25% em meio de cultura. Incubou-se durante quatro horas numa câmara húmida, a 37°C, com 5-95% de C02-ar. As placas foram mais tarde centrifugadas e as contagens por minuto foram medidas em 100 μΐ de sobrenadante num contador gama. Foram testadas várias soluções de trabalho do anticorpo para verificar qual era a toxicidade máxima.

Estas experiências mostraram que na presença de complemento de coelho uma actividade citotóxica de 59%, numa concentração de 12,5 pg/ml, e o efeito citotóxico celular mediado por anticorpos realizado com macrófagos peritoneais produziram um efeito citolítico de 22%. Λ -33 -

Esta preparação inclui um veículo farmacêutico que contem 2,55 mg de fosfato de sódio monobásico, 9,0 mg de fosfato de sódio dibásico, 43,00 mg de cloreto de sódio, 1 mg de polissorbato 80, 5,00 ml de água para injecção. EXEMPLO 5 DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO TERAPÊUTICO COM N-ACETIL GM3

Desenvolveu-se um composto terapêutico contendo uma quantidade eficaz do anticorpo monoclonal, produzido pelo hibridoma obtido através do Método de Selecção de Hibridomas, juntamente com N-acetil GM3.

Observou-se um efeito sinergético da combinação de N-acetil GM3 com os anticorpos monoclonais na inibição da proliferação de uma linha celular de cancro do pulmão.

Para realizar a experiência obteve-se uma suspensão celular e ressuspendeu-se em meio de cultura. Adicionou-se N-acetil GM3 numa concentração de 5 microMoles e o MAb foi adicionado numa concentração de 30 pg/ml. Nos terceiro e sexto dia mediu-se a proteína total pelo método de Lowry.

Houve quase 100% de inibição da proliferação relativamente à testemunha mas o efeito produzido foi superior do que o simples efeito aditivo.

Esta preparação inclui um veículo farmacêutico que contem 2,55 mg de fosfato de sódio monobásico, 9,00 mg de fosfato de sódio dibásico, 43,00 mg de cloreto de sódio, 1 mg de polissorbato 80 e 5,00 ml de água para injecção. -34- EXEMPLO 6

DESENVOLVIMENTO DE UM COMPOSTO TERAPÊUTICO COM MAB CONTRA EGF

Desenvolveu-se um composto terapêutico contendo uma quantidade eficaz de anticorpo monoclonal, produzido pelo hibridoma obtido de acordo com o Método de Selecção de Hibridomas, juntamente com um MAb anti-EGF, mais um veículo farmacêutica que contem 2,55 mg de fosfato de sódio monobásico, 9,00 mg de fosfato de sódio dibásico, 43,00 mg de cloreto de sódio, 1 mg de polissorbato 80, 5,00 ml de água para injecção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1- mostra as curvas de saturação obtidas durante a ELISA em fase sólida para as fracções de membrana placentária e de células A-431. O eixo da abcissa reflete o log da concentração de anticorpo. Um anticorpo irrelevante foi usado como testemunha negativa (as concentrações de anticorpo foram entre 0,5 e 7500 ng/ml).

Figura 2- mostra as curvas de deslocamento obtidas a partir da Análise de Receptor Radioactivo. O ensaio de competência foi realizado usando fracções de microssomas de placenta humana e diferentes concentrações do anticorpo e uma testemunha negativa (anticorpo monoclonal anti-citoqueratina). A curva de deslocamento de EGF foi usada como testemunha positiva.

Figura 3- mostra o ensaio de imuno-reactividade com o anticorpo monoclonal (ligação em pontos) com EGF-R purificado a partir de A-431. Pequenas quantidades (3,0, 1,0, 0,1 μΐ) do EGF-R purificado (30 ng/ml) -35- foram aplicadas na nitrocelulose e incubadas com diferentes concentrações do anticorpo.

Figura 4- mostra um ensaio competitivo entre diferentes anticorpos monoclonais contra o receptor de EGF, marcado com 125-iodo.

Figura 5- mostra um ensaio competitivo com uma fracção de microssomas de placenta humana e diferentes concentrações dos anticorpos monoclonais obtidos contra EGF-R. EGF marcado com 125-iodo foi usado com marcador radioactivo.

Figura 6- mostra o efeito do anticorpo monoclonal sobre células A-431. As células foram cultivadas com EGF (1 pg/ml); IFN Gama (100 pg/ml); EGF + G-IFN; e diferentes concentrações do anticorpo monoclonal sozinho ou combinado com IFN-Gama. A determinação das proteínas na monocamada celular foi realizada ao sétimo dia de cultura.

Figura 7- reflete o efeito antagonista dos anticorpos monoclonais na actividade biológica de EGF. As células foram cultivadas com EGF (1 pg/ml); IFN-Gama (100 pg/ml); EGF + G-IFN; e diferentes concentrações de anticorpo monoclonal em combinação com IFN-Gama e EGF. A determinação das proteínas na monocamada celular foi realizada no sétimo dia de cultura.

Figura 8- mostra a inibição da autofosforilação estimulada por EGF causada pelo anticorpo monoclonal no tecido membranar da placenta. As membranas foram incubadas com 32P-ATP na ausência (banda 1) ou na presença de EGF (bandas 2-8) e foram analisadas por electroforese em gel de policrilamida e autorradiografia. Os efeitos dos aumentos na concentração do -36- MAb são observados na incorporação de Fósforo-32 em EGF-R. As bandas 2 e 3 sem o MAb, banda 4: 1,8 pg/ml, banda 5: 6 μg/ml, banda 6: 18 pg/ml, banda 7:60 pg/ml e banda 8: 180 pg/ml do MAb.

Figura 9- demonstra que os fragmentos Fab mantêm a mesma capacidade do anticorpo monoclonal nas células A431 para inibir a ligação de EGF ao seu receptor. Realizou-se um ensaio competitivo com uma fracção de microssomas da placenta humana e diferentes concentrações do MAb e o seu fragmento Fab. EGF marcado com 125-iodo foi usado como marcador radioactivo.

Figura 10- mostra que os fragmentos Fab mantêm a mesma capacidade do anticorpo monoclonal nativo no efeito antagonista de EGF em células A-431. As células foram cultivadas em diferentes concentrações do MAb e seus fragmentos. A determinação das proteínas na monocamada celular foi realizada ao sétimo dia da cultura.

Figura 11- descreve os resultados da análise imuno-histoquímica do cancro da mama. As células epitelias do carcinoma ductal invasivo são fortemente coradas.

Figura 12- refere-se ao efeito dos anticorpos monoclonais na linha celular H-125; pode ser observado crescimento acelerado do grupo testemunha (o qual duplica o seu crescimento várias vezes). O grupo tratado com a concentração mais baixa (10 μg/ml) mostra um crescimento ligeiramente mais lento do que o grupo testemunha. Os grupos tratados com concentrações mais elevadas apresentaram algum crescimento celular durante os dias 1 e 2. Começando no dia 3, a cultura entrou numa fase estacionária sem crescimento, no dia 5 houve 50% de inibição comparativamente à testemunha. -37-

Figura 13- mostra o efeitos dos anticorpos monoclonais na linha celular U-1752. Os grupos tratado com a concentração mais baixa (10 microgramas/ml) não apresentaram diferenças relativamente à testemunha. Os grupos tratados com concentrações mais elevadas mostraram algum crescimento celular durante os dois primeiros dias começando no dia 3, a cultura entrou numa fase estacionária durante a qual não houve crescimento celular até ao Dia 5, a inibição foi de 50% relativamente à testemunha.

Figura 14- mostra o efeito de citotoxicidade celular na presença de complemento de coelho dos anticorpos monoclonais na linha celular H-125.

Figura 15- descreve o efeito da combinação dos anticorpos monoclonais numa concentração fixa com duas concentrações diferentes de N-acetil GM3 relativamente às testemunhas. O grupo testemunha N° 1 é um anticorpo irrelevante com a mesma concentração do anticorpo monoclonal contra Receptor de EGF. Os grupos testemunha N° 2 e N°3 contêm o mesmo anticorpo irrelevante na mesma concentração juntamente com N-acetil GM3 em duas concentrações diferentes. O grupo testemunha N°4 contemo anticorpo monoclonal sozinho numa concentração de 30 pg/ml. Os grupos N°5 e 6 possuem anticorpo monoclonal contra o Receptor de EGF numa concentração de 30 pg/ml e N-acetil GM3 em concentrações de 2,5 e 5 pg/ml, respectivamente.

Tabelas 1 e 2- mostram o padrão de reconhecimento de anticorpos monoclonais em tecido normal e tumoral realizado em cortes criostáticos de tecido fresco.

Depósito de linhas celulares- A431 = ATCC CRL 155 -38- TABELA 1 RECONHECIMENTO DO ANTICORPO MONOCLONAL EM ORGÃOS NORMAIS ORGÃO REACTIVIDADE - -/+ + ++ -H-+ Coração 3/3 Próstata 2/2 Fígado 3/3 Pulmão 3/3 Rim 2/2- Baço 2/2 Ovário 2/2 Pâncreas 1/2 1/2 Testículos 1/2 1/2 Glândulas adrenais 1/1 Hipófise 2/2 Nódulos linfáticos 2/2 Medula 1/1 Tiróide 2/2 Amígdalas 3/3 Estômago 2/2 Intestino delgado 2/2 Intestino grosso 2/2 Pele 2/2 Glândula submaxilar 2/2 Placenta 1/1 Cérebro 1/1 Crebelo 1/1 Legenda ausência de reacção (-); reacção fraca (+); reacção moderada (++); reacção forte (+++). secções criostáticas -39- TABELA 2 RECONHECIMENTO DO ANTICORPO MONOCLONAL EM TUMORES Orgão Reactividade - -/+ ++ +++ Glioma 1/1 Meningioma 1/1 Histiocitoma maligno 1/1 Neurofibrossarcoma 1/1 Cancro da mama 4/14 5/14 5/14 Cancro do pulmão 3/3 Tumores da cabeça e pescoço 5/5 Carcinoma basal 1/1 Legenda ausência de reacção (-); reacção fraca (+); reacção forte (+++).

Lisboa, 18 de Abril de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (29)

1. -1- REIVINDICACÕES 1. Um anticorpo monoclonal que reconhece o receptor do Factor de Crescimento Epidérmico, capaz de inibir a ligação de EGF ao seu receptor, capaz de inibir o crescimento de células de tumores dependentes de EGF e ainda possui as seguintes propriedades: a) possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos, b) possui actividade citotóxica mediada pelo complemento, c) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um gangliósido, d) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um anticorpo monoclonal contra EGF, ou um derivado do referido anticorpo monoclonal seleccionado entre formas dele humanizadas, quiméricas, reconformacionadas, bi-específicas, conjugadas e anti-idiotípicas, ou um fragmento do referido anticorpo monoclonal ou do referido derivado seleccionado entre os seus fragmentos Fv, Fab, Fab' e F(ab')2.
2. 2. Um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, o qual reconhece o receptor de EGF humano presente em células normais e o receptor de EGF presente em células tumorais.
3. 3. Um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, o qual reconhece o receptor de EGF da placenta humana e o receptor de EGF da linha de células tumorais A-431 (ATCC CRL 1555).
4. 4. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das -2- t reivindicações 1 a 3, o qual é capaz de inibir o crescimento de linhas celulares de tumores do pulmão U-1752 e/ou H-125.
5. 5. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o qual possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos num teste que usa a linha celular A-431 (ATCC CRL 1555) como células alvo.
6. 6. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o qual possui uma actividade citotóxica mediada pelo complemento num teste que usa a linha celular A-431 (ATCC CRL 1555) como células alvo.
7. 7. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o qual é capaz de produzir um efeito sinergético na inibição da proliferação de células de tumor H-125 se combinado com o gangliósido N-acetil GM3.
8. 8. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o qual é capaz de produzir um efeito sinergético na inibição da proliferação de células de tumor H-125 quando combinado com o anticorpo monoclonal anti-EGF.
9. 9. Um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, o qual é uma imunoglobulina do tipo IgG 2a.
10. 10. Uma composição compreendendo um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, juntamente com um veículo, um diluente ou um excipiente. -3-
11. 11. Uma composição farmacêutica para usar num tratamento terapêutico ou profilático de neoplasmas malignos ou doenças pré-neoplásicas, compreendendo uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, juntamente com um veículo, diluente ou excipiente.
12. 12. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, a qual contem o gangliósido N-acetil GM3.
13. 13. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, o qual contem um anticorpo monoclonal contra EGF.
14. 14. Um processo para a preparação de um anticorpo monoclonal o qual reconhece o receptor do Factor de Crescimento Epidérmico (EGF), compreendendo os passos de imunização num animal de laboratório com o receptor do EGF humano ou um derivado antigénico ou um seu fragmento, isolamento das células produtoras de anticorpos a partir do animal imunizado, imortalização das referidas células produtoras de anticorpos, selecção, de entre as referidas células imortalizadas, de uma célula que produza um anticorpo monoclonal que reconheça o receptor de EGF, capaz de inibir a ligação de EGF ao receptor, capaz de inibir o crescimento de células tumorais dependentes de EGF e, ainda, possui as seguintes propriedades: a) possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos, b) possui actividade citotóxica mediada pelo complemento, c) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um gangliósido, -4- d) é capaz de produzir um efeito sinergístico ao inibir a proliferação de células tumorais quando combinado com um anticorpo monoclonal contra EGF, e isolamento do anticorpo monoclonal produzido pelas referidas células seleccionadas.
15. 15. Um processo de acordo com a reivindicação 14, em que o passo de imortalização das células produtoras de anticorpos isoladas a partir do animal imunizado é realizado através da fusão das células com células de mieloma para produzir células de hibridoma.
16. 16. Um processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que o animal de laboratório usado no passo de imunização é um roedor, preferencialmente um ratinho ou rato.
17. 17. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, em que o animal de laboratório é imunizado com o receptor de EGF de placenta humana.
18. 18. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, em que o anticorpo monoclonal seleccionado reconhece o receptor de EGF humano presente em células normais e o receptor de EGF presente em células tumorais.
19. 19. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, em que o anticorpo monoclonal seleccionado reconhece o receptor de EGF de placenta humana e o receptor de EGF da linha celular tumoral A-431 (ATCC CRL 1555).
20. 20. Um processo de acordo com qualquer uma das -5- reivindicações 14 a 19, em que o anticorpo monoclonal seleccionado é capaz de inibir o crescimento das linhas celulares de tumor do pulmão dependentes de EGF U-1752 e/ou H-125.
21. 21. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, em que o anticorpo monoclonal seleccionado possui uma citotoxicidade dependente de anticorpo num teste que usa a linha celular A-431 (ATCC CRL 1555) como células alvo.
22. 22. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, em que o anticorpo monoclonal seleccionado tem uma actividade citotóxica mediada pelo complemento num teste que usa a linha celular A-431 (ATCC CRL 1555) como células alvo.
23. 23. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, em que o anticorpo monoclonal seleccionado é capaz de produzir um efeito sinergético na inibição da proliferação de células tumorais H-125 se combinado com o gangliósido N-acetil GM3.
24. 24. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 23, em que o anticorpo monoclonal seleccionado é capaz de produzir um efeito sinergético na inibição da proliferação de células tumorais H-125 se combinado com um anticorpo monoclonal anti-EGF.
25. 25. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, em que o anticorpo monoclonal seleccionado é uma imunoglobulina do tipo IgG 2a.
26. 26. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindica- -6- ções 14 a 25, em que as células imortalizadas produtoras do anticorpo monoclo-nal seleccionado são cultivadas, in vitro num meio de cultura do próprio tecido ou in vivo num fluido corporal histocompatível ou em fermentadores num meio de produção, seguido da separação das células imortalizadas do referido meio.
27. 27. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 26, em que o anticorpo monoclonal produzido é purificado e facultativamente derivatizado ou fragmentado.
28. 28. Uma célula imortalizada produtora de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
29. 29. Utilização de um anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento terapêutico ou profilático de neoplasmas malignos ou de doenças pré-neoplásicas. Lisboa, 18 de Abril de 2000

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