PT2900254T - Alfa-1-microglobulina para a sua utilização no tratamento de doenças relacionadas com mitocôndrias - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ALFA—1—MICROGLOBULINA PARA A SUA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DE DOENÇAS RELACIONADAS COM MITOCÔNDRIAS

Campo da invenção A presente invenção baseia-se na descoberta que a alfa-1-microgobulina (AIM) desempenha um papel importante na proteção das mitocôndrias frente ao dano. A AIM une-se a uma subunidade do complexo I, a proteger desse modo a estrutura e função das mitocôndrias. Foram envolvidas as mitocôndrias em várias doenças humanas e as descobertas reveladas no presente documento apoiam a utilização de AIM no tratamento de doenças relacionadas com mitocôndrias.

Antecedentes da invenção

As mitocôndrias são organelos em células eucarióticas. Geram a maioria do fornecimento de células de adenosina trifosfato (ATP), que se utiliza como fonte de energia. Portanto, as mitocôndrias são indispensáveis para a produção de energia, para a sobrevivência de células eucarióticas e para uma correta função celular. Além do fornecimento de energia, as mitocôndrias estão envolvidas em outros vários processos tais como sinalização celular, diferenciação celular, morte celular assim como o controlo do ciclo celular e crescimento celular. Em particular, as mitocôndrias são reguladores cruciais da apoptose celular e também desempenham um papel principal em múltiplas formas de morte celular não apoptótica tal como, por exemplo, necrose.

Nos últimos anos foram publicados muitos artigos que descrevem a contribuição mitocondrial a uma variedade de doenças. Algumas doenças podem provocar-se por mutações ou deleções no genoma mitocondrial, enquanto que outras podem provocar-se por dano da função mitocondrial. Atualmente há tratamento disponível que pode curar doenças mitocondriais.

Em vista da importância reconhecida de manter ou recuperar uma função mitocondrial normal, há uma necessidade de identificar substâncias que se possam utilizar para proteger a estrutura e função mitocondriais ou que se possam utilizar para recuperar ou tratar disfunções nas mitocôndrias. A alfa-l-microglobulina (AIM) é uma proteína tissular e plasmática de 26 kDa que foi isolada e caracterizada a partir do plasma, fígado e urina de várias espécies a incluir o homem e solha (31). No plasma, a AIM encontra-se na forma livre assim como unida de maneira covalente a outras proteínas plasmáticas grandes. Em seres humanos, a AIM forma complexos com IgA, albumina e protrombina (5). A AIM livre e diversos complexos de alto peso molecular também estão presentes na matriz extracelular de todos os tecidos que se originam tanto do plasma como da síntese periférica (4). Nos tecidos, a AIM localiza-se preferencialmente nas interfases entre sangue e tecido nos vasos sanguíneos, ar e tecido no pulmão, e mãe e feto na placenta, especialmente em sítios de lesão (44). Não se conhece a função fisiológica da AIM, mas foi mostrado que tem atividade redutase, e que une hemo livre e radicais, o que sugere que pode ter funções protetoras durante situações com stress oxidativo (31). A AIM une-se a muitos tipos de células, em muitos casos seguido por internalização (36, 49).

Descrição detalhada da invenção

Os presentes inventores realizaram uma investigação detalhada da captação celular de AIM, e no transcurso disso encontrou-se que a proteína se localiza principalmente nas mitocôndrias em células danadas, e pode proteger a estrutura e função mitocondriais. A presente invenção refere-se à utilização de AIM para prevenir ou tratar doenças relacionadas com mitocôndrias. Tal como se mostra nos exemplos, a AIM tem um efeito beneficente sobre as células expostas à quantidade excessiva de stress e forçadas a produzir ATP a altas taxas. Em tais situações, a AIM pode manter a produção de ATP das células apesar do stress ambiental. Posto que a AIM se une a uma subunidade dos complexos da cadeia respiratória, prevê-se que se possa utilizar a AIM em geral para prevenir ou tratar doenças que envolvem piora ou dano das mitocôndrias ou dano de (pelo menos partes de) a função mitocondrial.

As doenças mitocondriais resultam de falhas das mitocôndrias, que são compartimentos especializados presentes em cada célula do corpo exceto os glóbulos vermelhos. Quando as mitocôndrias falham, gera-se cada vez menos energia dentro da célula e produzir-se-á lesão celular ou inclusive morte celular. Se se repete este processo por todo o corpo se compromete gravemente a vida da pessoa à que lhe esteja a ocorrer isso.

As doenças das mitocôndrias aparecem com mais frequência em órgãos que demandam muita energia tal como o cérebro, coração, fígado, músculos esqueléticos, rim e o sistema endócrino e respiratório.

Os sintomas de uma doença mitocondrial podem incluir perda do controlo motor, dor e debilidade muscular, convulsões, problemas visuais/de audição, doenças cardíacas, doenças hepáticas, transtornos gastrointestinais, dificuldades para engolir e mais.

Uma doença mitocondrial pode ser hereditária ou pode dever-se a mutações espontâneas, que conduzem a funções alteradas das proteínas ou moléculas de ARN que residem normalmente nas mitocôndrias.

Foi encontrado que muitas doenças envolvem uma deficiência mitocondrial tal como uma deficiência do complexo I, II, III ou IV ou uma deficiência enzimática como, por exemplo, deficiência de piruvato desidrogenase. Sem embargo, a imagem é complexa e muitos fatores podem estar envolvidos nas doenças.

Até o momento, não estão disponíveis tratamentos curativos. Os únicos tratamentos disponíveis são aqueles que podem aliviar os sintomas e retardar a progressão da doença.

Por conseguinte, as descobertas dos presentes inventores e descritas no presente documento são muito importantes já que demonstram o efeito beneficente da AIM sobre as mitocôndrias em relação tanto com manter a estrutura mitocondrial como à capacidade de restaurar um defeito mitocondrial induzido. A invenção refere-se à AIM para a sua utilização no tratamento de uma doença mitocondrial. Tais doenças incluem, mas não se limitam a, doenças no sistema neurológico, o cérebro, coração, fígado, músculos esqueléticos, rim e o sistema endócrino e respiratório. Muitas doenças podem ter um defeito mitocondrial e, por conseguinte, mais doenças que as mencionadas no presente documento também podem ser relevantes para o seu tratamento ou prevenção utilizando AIM. A morte celular, ou acidental, induzida por stress ou apoptótica, frequentemente envolve ativação da degradação celular e programas de reciclagem (7) . Portanto, a morte celular é um processo dependente de energia que necessita funções mitocondriais conservadas e intactas. Sugere-se que a eliminação autofagocitica de mitocôndrias (mitofagia) desempenha um papel fundamental durante a morte celular programada (23). Portanto, há uma necessidade de mitocôndrias funcionais durante a morte celular programada, e ainda não se entende como se consegue isso. 0 complexo I, II, III e IV são complexos de proteínas incrustados na membrana interna da mitocôndria. Conhecem-se como a cadeia respiratória e funcionam acoplando a transferência de elétrons entre um dador de elétrons (tal como NADH) e um aceitador de elétrons (tal como O2) com a transferência de iões H+. 0 gradiente de protões eletroquímico resultante através da membrana interna utiliza-se para gerar energia química na forma de adenosina trifosfato (ATP) mediante oxidação de glucose, piruvato e NADH, que se produzem todos no citosol da célula. Este processo de respiração celular, também conhecido como respiração aeróbica, depende da presença de oxigénio. Quando o oxigénio é limitado, os produtos glicolíticos se metabolizarão mediante fermentação anaeróbica, um processo que é independente das mitocôndrias. A produção de ATP a partir de glucose é aproximadamente 13 vezes maior durante a respiração aeróbica em comparação com a fermentação.

Os presentes inventores mostraram que a proteína AIM de baixo peso molecular do tecido e plasma humano se une a mitocôndrias e mais especificamente ao complexo I mitocondrial. Além disso, mostrou-se que a proteína pode proteger as mitocôndrias do inchamento induzido por hemo e a perda da capacidade de produção de ATP. A basear-se nestas descobertas, foi sugerido que AIM pode participar no mecanismo de manutenção celular. A AIM pode exercer esta proteção mediante vários mecanismos diferentes, que atualmente não se conhecem. Independentemente do mecanismo de ação, os estudos notificados no presente documento indicam claramente que a AIM tem efeitos beneficentes para as mitocôndrias e, por conseguinte, a AIM é uma possível substância farmacológica para o tratamento ou a prevenção de doenças mitocondriais. Além disso, a AIM pode utilizar-se para a prevenção e/ou o tratamento de efeitos secundários mitocondriais em pacientes sujeitos a tratamento com fármacos que provocam tais efeitos secundários. Os exemplos incluem tratamento com estatinas, etc. Além disso, a AIM pode utilizar-se em cosméticos, por exemplo, para tratar modificações da pele relacionadas com a idade, ou pode utilizar-se na prevenção e/ou o tratamento de efeitos mitocondriais não desejados provocados por substâncias ou condições no ambiente.

Tal como se mencionou anteriormente, a AIM une-se a uma subunidade do complexo I. Isto poderia indicar que a AIM é especialmente adequada para a sua utilização no tratamento de doenças mitocondriais em que há um defeito na cadeia respiratória. Mais especificamente, poderia indicar que a AIM é especialmente adequada para a sua utilização no tratamento de deficiência do complexo I ou doenças relacionadas com o complexo I.

Tal como se notifica nos exemplos no presente documento, utilizou-se a indução de apoptose celular para imitar situações caracterizadas por lesões celulares induzidas por stress que provocam dano à membrana plasmática e destruição da barreira externa da célula. A AIM exógena uniu-se de maneira intracelular com alta afinidade quanto às células puderam internalizar iodeto de propídio (PI), o que sugere que o mecanismo de captação é uma fuga passiva de AIM do compartimento extracelular. Portanto, a união de AIM às mitocôndrias também deve produzir-se em células necróticas com membranas plasmáticas rompidas. Está a ficar cada vez mais claro que muitas formas de morte celular necrótica in vivo realmente podem descrever-se como uma série regulada de acontecimentos de desintegração celular dependente de ATP, isto é, necrose programada a seguir rotas específicas denominadas necroptose (7, 46). Portanto, um possível papel para a AIM é participar na conservação da função mitocondrial tanto em células apoptóticas como necroptóticas e possivelmente outros tipos de células necróticas durante a morte celular não autofágica, com o fim de determinar a disponibilidade de ATP para os processos de degradação celular dependente de energia. Não se conhece o mecanismo de proteção da estrutura e função mitocondriais. Atribuiu-se à AIM uma função antioxidante baseada na sua redutase, e propriedades de união de hemo e radicais (2, 53). Portanto, pode especular-se que estas propriedades estão envolvidas nos efeitos protetores. Alternativamente, posto que a AIM parece ser um componente endógeno de pelo menos um dos complexos de proteínas grandes (complexo I) pode ter um efeito estruturalmente estabilizante sobre o complexo. Durante a apoptose, a necroptose e outras formas de morte celular, a união adicional de AIM exógena pode ser necessária para manter a estrutura e função físico-químicas do complexo de proteínas respiratório. Outra possibilidade é que a união de AIM ao complexo I possa ter efeitos beneficentes sobre outros componentes da membrana interna mitocondrial, tal como proteínas de poros ou lipídeos de membrana.

Investigaram-se as interações entre AIM e mitocôndrias e observou-se uma união específica em vários tipos celulares diferentes, isto é, células sanguíneas humanas de origem linfocítica, mielocítica e leucocítica, queratinócitos humanos, e mitocôndrias de fígado de rato isoladas. Tomados juntos, os resultados sugerem que as interações e os efeitos protetores estudados neste caso podem generalizar-se a todos os tipos de células.

Tal como se notifica no presente documento, encontrou-se que a AIM interage com quatro proteínas diferentes: a subunidade NDUFAB1 na parte hidrofóbica do complexo NADH desidrogenase (45), N-acetilglucosamine cinase (18), a proteína de união a ARNnp LSm5 (40), e um antígeno canceroso, NY-CO-3 (42) . Nenhuma das quatro proteínas era um falso positivo, isto é, que interage com a proteína de fusão isco de união a ADN ou com qualquer proteína fundida a ela. Portanto, consideraram-se os candidatos como proteínas de interação com AIM verdadeiras no sistema de duplo híbrido de levedura. Considerando que oito dos onze clones isolados mediante o sistema de duplo híbrido de levedura eram a mesma subunidade do complexo I, considerou-se esta proteína como a mais interessante das proteínas e, portanto elegeu-se como alvo de investigações adicionais. Confirmou-se também a união a mitocôndrias mediante enfoques metodológicos alternativos e pôde atribuir-se um papel funcional da associação como compatível com a função antioxidante da AIM. Sem embargo, pode especular-se sobre os envolvimentos fisiológicos da união de AIM a N-acetilglucosamine cinase, a proteína de união a ARNnp LSm5 e NY-CO-3. Estas proteínas localizam-se no citosol, núcleo e membrana plasmática, respetivamente, e o papel da união a estas proteínas pode ser localizar a AIM internalizada em outros compartimentos celulares além das mitocôndrias. Outra possibilidade é que a união a estas três proteínas reflete outras funções de AIM não relacionadas com antioxidação e eliminação de radicais. A AIM é um membro da família das proteínas lipocalinas. As lipocalinas constituem um grupo funcionalmente diverso de aproximadamente 50 proteínas de bactérias, plantas e animais, que têm uma semelhança de sequência de aminoácidos habitualmente de ao redor de 20-25% e compartilham determinadas características comuns estruturais que indicam uma origem evolutiva comum (11, 12, 51). De maneira interessante, duas lipocalinas encontradas em plantas e algas verdes, violaxantina desepoxidase (VDE) e zeaxtantina epoxidase (ZDE), localizam-se nas membranas dos tilacoides de cloroplastos, os organelos fotossintéticos que produzem ATP de plantas, em que se associam com o sistema captador de luz II e participam no sistema de fotoproteção de xantofila (revisado em (14)). Há um paralelismo óbvio entre o ciclo de proteção de violaxantina e os resultados neste documento: a presença de um sistema de proteção baseado em lipocalinas nos organelos de conversão de energia tanto de plantas como de animais. A hipotetizar que as mitocôndrias e cloroplastos têm uma espécie primitiva procariótica ou eucariótica comum (vejam-se (15, 30, 50)), pode especular-se que estes dois sistemas de lipocalinas estão relacionados evolutivamente.

Quando se submete uma célula a uma lesão fatal se degradará em última instância e os seus componentes se reciclarão. Isto é habitualmente um processo que consome energia e altamente complexo que é necessário controlar de maneira meticulosa com o fim de proteger o ambiente circundante, isto é, tecido e células vizinhas, frente a um dano adicional. A conservação e a manutenção da maquinaria de energia mitocondrial durante este processo são vitais. Mostra-se que a AIM de glicoproteina de plasma e tecido pode ter um papel fundamental na manutenção da produção de energia mitocondrial e ajudar simultaneamente à cadeia respiratória e evitar desse modo reações destrutivas não desejadas com tecido saudável. Portanto, estas descobertas sugerem um mecanismo novo de manutenção da homeostase mitocondrial.

No presente contexto o termo "alfa-l-microglobulina" pretende cobrir a alfa-l-microglobulina tal como se identifica em SEQ ID NO: 1 (AIM humana) assim como SEQ ID NO: 2 (AIM recombinante humana) assim como homólogos, fragmentos ou variantes das mesmas que têm atividades terapêuticas similares. Num aspecto preferido, a alfa-l-microglobulina é de acordo com SEQ ID NO: 1 ou 2 tal como se identifica no presente documento. Na lista de sequências proporciona-se a lista de sequências da sequência de aminoácidos de AIM humana e AIM recombinante humana (SEQ ID NO 1 e 2, respetivamente) e as correspondentes sequências de nucleotideos (SEQ ID NO 3 e 4, respetivamente).

Tal como se mencionou anteriormente também podem utilizar-se homólogos de AIM de acordo com a descrição no presente documento. Em teoria pode utilizar-se AIM de todas as espécies a incluir a mais primitiva encontrada até agora, que é de peixe (solha) . A AIM também está disponível em forma isolada de ser humano, ratazana, rato, coelho, cobaia, vaca e solha.

Considerando os homólogos, variantes e fragmentos de AIM, foram identificados os seguintes como partes importantes da proteína: Y22 (tirosina, pos. 22, pares de bases 64-66) C34 (cisteína, posição 34, pares de bases 100-102) K69 (lisina, pos. 69, pares de bases 205-207) K92 (lisina, pos. 92, pares de bases 274-276) K118 (lisina, pos. 118, pares de bases 352-354) K130 (lisina, pos. 130, pares de bases 388-390) Y132 (tirosina, pos. 132, pares de bases 394-396) L180 (leucina, pos. 180, pares de bases 538-540) 1181 (isoleucina, pos. 181, pares de bases 541-543) P182 (prolina, pos. 182, pares de bases 544-546) R183 (arginina, pos. 183, pares de bases 547-549) (A numeração de aminoácidos e nucleotideos ao longo de todo o documento refere-se a SEQ ID 1 e 3; se é outra AIM de outra espécie, empregam-se análogos de AIM ou sequências recombinantes dos mesmos, um especialista na área saberá como identificar os aminoácidos do(s) sítio(s) ativo(s) ou sítio(s) responsável/responsáveis da atividade enzimática).

Em particular foi observado que o efeito protetor celular de AIM depende do grupo tiolilo livre da cadeia lateral C34 e se regula pelos resíduos K92, K118 e K130. Portanto, acredita-se que os análogos de AIM que contêm estas partes da proteína e/ou configurados de maneira similar têm efeitos similares aos da AIM e, portanto, estão abrangidos pela presente invenção. A AIM humana está substituída com oligossacarídeos em três posições, dois de tipo complexo sialilados, provavelmente de hidratos de carbono diantenários unidos a Asnl7 e Asn96 e um oligossacarídeo mais simples unido a Thr5. 0 conteúdo em hidratos de carbonos de proteínas AIM de diferentes espécies varia muito, embora, oscilando de nada de glicosilação em absoluto em Xenopus leavis passando por um espectro de diferentes padrões de glicosilação. Sem embargo, um sítio de glicosilação, correspondente a Asn96 no homem, conserva-se em mamíferos, o que sugere que este hidrato de carbono específico pode ser funcionalmente importante. A AIM é de cor amarela parda quando se purifica a partir de plasma ou urina. A cor está provocada por compostos heterogéneos unidos de maneira covalente a diversos grupos laterais de aminoácidos localizados principalmente na entrada na bolsa. Estas modificações representam provavelmente os produtos de degradação oxidados de oxidantes orgânicos presos de maneira covalente por AIM in vivo, por exemplo, radicais hemo, quinurenina e tirosilo. A AIM também é heterogénea em carga e tamanho e as moléculas de AIM de cor mais altamente marrom estão carregadas mais negativamente. A provável explicação para a heterogeneidade é que diferentes grupos laterais se modificam num grau variável com diferentes radicais, e que as modificações alteram a carga neta da proteína. Foram localizadas as substâncias coloridas unidas de maneira covalente em Cys34 e Lys92, Lysll8 e Lysl30, a última com massas moleculares de entre 100 e 300 Da. Encontrou-se o metabolito de triptofano quinurenina unido de maneira covalente a resíduos lisilo em AIM de urina de pacientes em hemodiálise e parece ser a fonte da cor marrom da proteína neste caso. Fragmentos oxidados do radical sintético ABTS (ácido 2,2'-azino-di-(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico) estavam unidos às cadeias laterais de Y22 e Y132. C34 é o centro reativo de AIM. Torna-se muito eletronegativo, o que significa que tem um alto potencial para doar elétrons, pela proximidade das cadeias laterais carregadas positivamente de K69, K92, K118 e K130, que induzem uma desprotonização do grupo tiol de C34. Os dados preliminares mostram que C34 é um dos grupos mais eletronegativos conhecidos.

Teoricamente, os aminoácidos que caracterizam as propriedades enzimáticas e não enzimáticas únicas de AIM (C34, Y22, K92, K118, K130, Y132, L180, 1181, P182, R183), que se descreverão em mais detalhe a seguir, podem dispor-se numa configuração tridimensional similar em outro framework, por exemplo, uma proteína com a mesma dobra global (outra lipocalina) ou uma molécula orgânica ou inorgânica completamente artificial tal como um polímero de plástico, uma nanopartícula ou um polímero metálico.

Por conseguinte, preferem-se homólogos, fragmentos ou variantes que compreendem uma estrutura que inclui o centro reativo e o seu entorno tal como se descreveu anteriormente.

Podem realizar-se modificações e alterações na estrutura dos polipéptidos desta descrição e ainda dão como resultado uma molécula que tem características similares às do polipéptido (por exemplo, uma substituição de aminoácidos conservativa). Por exemplo, determinados aminoácidos podem substituir-se por outros aminoácidos numa sequência sem perda apreciável de atividade. Devido a que são a capacidade interativa e a natureza de um polipéptido as que definem a atividade funcional biológica do polipéptido, podem fazer-se determinadas substituições de sequência de aminoácidos numa sequência de polipéptidos e ainda assim obter um polipéptido com propriedades similares.

Ao fazer tais alterações, pode considerar-se o índice hidropático de aminoácidos. A importância do índice hidropático de aminoácidos na hora de conferir uma função biológica interativa a um polipéptido entende-se em geral na técnica. Sabe-se que podem substituir-se determinados aminoácidos por outros aminoácidos que têm uma pontuação ou índice hidropático similar e ainda dar como resultado um polipéptido com atividade biológica similar. A cada aminoácido foi designado um índice hidropático a basear-se nas suas características de hidrofobicidade e carga. Os índices são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

Acredita-se que o caráter hidropático relativo do aminoácido determina a estrutura secundária do polipéptido resultante, que por sua vez define a interação do polipéptido com outras moléculas, tais como enzimas, substratos, recetores, anticorpos, antígenos e similares. Conhece-se na técnica que um aminoácido se pode substituir por outro aminoácido que tem um índice hidropático similar e obter ainda um polipéptido funcionalmente equivalente. Em tais alterações, prefere-se a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2, preferem-se particularmente os que estão dentro de ± 1 e inclusive preferem-se mais particularmente os que estão dentro de ±0,5. A substituição de aminoácidos similares pode realizar-se também a basear-se em hidrofilicidade, particularmente quando se pretende que o péptido ou polipéptido equivalente bioloqicamente funcional criado desse modo seja para a sua utilização em realizações imunológicas. Foram designados os seguintes valores de hidrofilicidade a resíduos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (—2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode substituir-se por outro que tem um valor de hidrofilicidade similar e obter ainda um polipéptido biologicamente equivalente e, em particular, um imunologicamente equivalente. Em tais alterações, prefere-se a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2, preferem-se particularmente os que estão dentro de ± 1 e inclusive preferem-se mais particularmente os que estão dentro de ± 0,5.

Tal como se resumiu anteriormente, as substituições de aminoácidos baseiam-se em geral na semelhança relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, a sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Os especialistas na área conhecem bem as substituições a modo de exemplo que têm em consideração uma ou mais das características anteriores e incluem, mas não se limitam a (resíduo original: substituição a modo de exemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gin, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gin), (lie: Leu, Vai), (Leu: Ile, Vai), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr) , (Ser: Thr) , (Thr: Ser), (Trp: Tyr) , (Tyr: Trp, Phe) e (Vai: Lie, Leu) . Portanto as formas de realização desta divulgação contemplam eguivalentes funcionais ou biológicos de um polipéptido tal como se expôs anteriormente. Em particular, as formas de realização dos polipéptidos podem incluir variantes que têm aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 95% de identidade de sequência com o polipéptido de interesse.

No presente contexto, a homologia entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de ácido nucleico descreve-se pelo parâmetro ''identidade". Os alinhamentos de sequências e o cálculo de pontuações de homologia podem realizar-se utilizando um alinhamento de Smith-Waterman completa, útil para alinhamentos tanto de proteína como de ADN. As matrizes de pontuação por defeito BLOSUM50 e a matriz de identidade utilizam-se para os alinhamentos de proteína e ADN respetivamente. A penalização para o primeiro resíduo num espaço é de -12 para proteínas e de -16 para ADN, enquanto que a penalização para resíduos adicionais num espaço é de -2 para proteínas e -4 para ADN. O alinhamento pode realizar-se com o pacote FASTA versão v20u6. Múltiplos alinhamentos de sequências de proteínas podem realizar-se utilizando "ClustalW". Múltiplos alinhamentos de sequências de ADN podem realizar-se utilizando o alinhamento de proteína como molde, substituindo os aminoácidos com o correspondente codão da sequência de ADN.

Alternativamente pode utilizar-se um software diferente para alinhar sequências de aminoácidos e sequências de ADN. 0 alinhamento de duas sequências de aminoácidos determina-se, por exemplo, utilizando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. 0 programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito. A matriz de substituição utilizada é BLOSUM62, a penalização por abertura de espaço é de 10 e a penalização por extensão de espaço é de 0,5. 0 grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos; por exemplo, SEQ ID NO: 1 e uma sequência de aminoácidos diferente (por exemplo, SEQ ID NO: 2) calcula-se como o número de coincidências exatas num alinhamento das duas sequências, dividido entre o comprimento da "SEQ ID NO: 1" ou o comprimento da "SEQ ID NO: 2", qualquer que for a mais curta. 0 resultado expressa-se na identidade em percentagem.

Uma coincidência exata produz-se quando as duas sequências têm resíduos de aminoácido idênticos nas mesmas posições da superposição.

Se for relevante, o grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos pode determinar-se mediante o método Wilbur-Lipman utilizando o software LASER-GENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplos: penalização de espaço de 10 e penalização por comprimento de espaço de 10.

Os parâmetros de alinhamento por pares são Ktuple=3, penalização de espaço=3, e janelas=20. Numa forma de realização particular, a percentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos de um polipéptido com, ou em relação a, aminoácidos de SEQ ID NO: 1 determina-se i) alinhando as duas sequências de aminoácidos utilizando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalização por abertura de espaço de 10 e uma penalização por extensão de espaço de 0,5; ii) contando o número de coincidências exatas no alinhamento; iii) dividindo o número de coincidências exatas entre o comprimento da mais curta das duas sequências de aminoácidos, e iv) convertendo o resultado da divisão de iii) em percentagem. A percentagem de identidade em relação a, ou com, outras sequências da invenção calcula-se de maneira análoga. A modo de exemplo, uma sequência de polipéptido pode ser idêntica à sequência de referência, isto é ser idêntica a 100%, ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de aminoácido em comparação com a sequência de referência de modo que a % de identidade é menos de 100%. Tais alterações selecionam-se de: pelo menos uma deleção, substituição (incluindo substituição conservativa e não conservativa) ou inserção de aminoácido, e em que ditas alterações podem produzir-se nas posições amino ou carboxilo-terminais da sequência de polipéptido de referência ou em qualquer sitio entre as posições terminais das mesmas, intercaladas ou individualmente entre os aminoácidos na sequência de referência, ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

As variantes de aminoácidos conservativas também podem compreender resíduos de aminoácido que não se produzem de maneira natural. Os aminoácidos que não se produzem de maneira natural incluem, sem limitação, trans-3-metilprolina, 2, 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metil-glicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- e 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenil-alanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina e 4-fluorofenilalanina. Conhecem-se na técnica vários métodos para incorporar residuos de aminoácido que não se produzem de maneira natural em proteínas. Por exemplo, pode empregar-se um sistema in vitro em que se suprimem mutações sem sentido utilizando ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Conhecem-se na técnica métodos para sintetizar aminoácidos e aminoacilar ARNt. Levam-se a cabo transcrição e tradução de plasmideos que contêm mutações sem sentido num sistema livre de células que compreende um extrato de E. coli S30 e enzimas disponíveis comercialmente e outros reativos. Purificam-se proteínas mediante cromatografia. Num segundo método, a tradução leva-se a cabo em Xenopus oocytes mediante microinjeção de ARNm mutado e ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Dentro de um terceiro método, cultivam-se células de E. coli em ausência de um aminoácido natural a ser substituído (por exemplo, fenilalanina) e em presença do/dos aminoácido(s) que não se produz(em) de maneira natural desejado(s) (por exemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina ou 4-fluorofenilalanina) . 0 aminoácido que não se produz de maneira natural incorpora-se na proteína no lugar do seu homólogo natural. Os resíduos de aminoácido que se produzem de maneira natural podem converter-se em espécies que não se produzem de maneira natural mediante modificação química in vitro. A modificação química pode combinar-se com mutagénese dirigida a um sítio para expandir adicionalmente o intervalo de substituições. As estruturas químicas alternativas que proporcionam uma estrutura tridimensional suficiente para suportar as propriedades antioxidantes de AIM podem proporcionar-se mediante outras tecnologias, por exemplo, armaduras artificiais, substituições de aminoácidos e similares. Além disso, as estruturas que imitam os sitios ativos de AIM tal como se listam anteriormente e se representam nas figuras 3 e 6 se contemplam como que têm a mesma função que AIM. AIM para a sua utilização em doenças relacionadas com mitocôndrias específicas

Mais especificamente, a invenção refere-se a AIM para a sua utilização no tratamento de uma doença relacionada com mitocôndrias selecionada do seguinte: • doença de Alpers (poliodistrofia infantil progressiva) • sindrome de Barth (cardiomiopatia infantil letal) • defeitos da beta-oxidação • cardiomiopatia • deficiência de carnitina-acilcarnitina • deficiência de carnitina • sindromes de deficiência de creatina (sindromes de deficiência de creatina cerebral (CCDS) incluem: deficiência de guanidinoacetato metiltransferase (deficiência de GAMT), deficiência de L-arginina:glicina amidinotransferase (deficiência de AGAT) e deficiência de transportador de creatina relacionada com SLC6A8 (deficiência de SLC6A8). • deficiência da coenzima Q10 • deficiência do complexo I (deficiência de NADH desidrogenase (NADH-CoQ redutase)) • deficiência do complexo II (deficiência de succinato desidrogenase) • deficiência do complexo III (deficiência de ubiquinona-citocromo c oxidorredutase) • deficiência do complexo IV/deficiência de COX (a deficiência de citocromo c oxidasa provoca-se por um defeito no complexo IV da cadeia respiratória) • deficiência do complexo V (deficiência de ATP sintase)

• deficiência de COX • CPEO (sindrome de oftalmoplegia externa progressiva crónica)

• deficiência de CPT I

• deficiência de CPT II • ataxia de Friedreich (FRDA ou FA) • encefalomiopatia

• acidúria glutárica tipo II • KSS (sindrome de Kearns-Sayre) • acidose láctica • LCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia longa)

• LCHAD • doença ou síndrome de Leigh (encefalomielopatia necrotizante subaguda) • LHON (neuropatia ótica hereditária de Leber) • doença de Luft • MCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média) • MELAS (encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios similares a acidente cerebrovascular) • MERRF (epilepsia mioclónica e doença de fibras vermelhas rasgadas) • MIRAS (sindrome atáxico mitocondrial recessivo) • citopatia mitocondrial • depleção de ADN mitocondrial • encefalopatia mitocondrial inclui: encefalomiopatia, encefalomielopatia • miopatia mitocondrial • MNGIE (transtorno mioneurogastrointestinal e encefalopatia) • NARP (neuropatia, ataxia e retinite pigmentosa) • sindrome de Pearson • deficiência de piruvato carboxilase • deficiência de piruvato desidrogenase

• mutações de POLG • deficiências da cadeia respiratória • SCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia curta)

• SCHAD • VLCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa)

Com referência à informação da página web de United Mitochondrion Disease Foundation, algumas das doenças mencionadas anteriormente discutem-se em mais detalhe a seguir:

Deficiência do complexo 1: no interior da mitocôndria há um grupo de proteínas que levam elétrons ao longo de quatro reações em cadeia (complexos I-IV), que dão como resultado a produção de energia. Esta cadeia conhece-se como a cadeia de transporte de elétrons. Um quinto grupo (complexo V) gera a ATP. Juntas, a cadeia de transporte de elétrons e a ATP sintase formam a cadeia respiratória e o processo completo conhece-se como fosforilação oxidativa ou OXPHOS. 0 complexo I, a primeira etapa nesta cadeia, é o sítio mais comum para anomalias mitocondriais, representando até um terço das deficiências da cadeia respiratória. Apresentando-se com frequência no nascimento ou na infância precoce, a deficiência do complexo I é habitualmente um transtorno neurodegenerativo progressivo e é responsável por uma variedade de sintomas clínicos, particularmente em órgãos e tecidos que requerem altos níveis de energia, tais como cérebro, coração, fígado e músculos esqueléticos. Foram associados vários transtornos mitocondriais específicos com deficiência do complexo I incluindo: neuropatia ótica hereditária de Leber (LHON), MELAS, MERRF e síndrome de Leigh (LS) . Há três formas principais de deficiência do complexo I: i) Transtorno multissistémico infantil fatal caracterizado por falta de tono muscular, atraso no desenvolvimento, doença cardíaca, acidose láctica e insuficiência respiratória. ii) Miopatia (doença muscular) - começa na infância ou na idade adulta, e se caracteriza por debilidade ou intolerância ao exercício. iii) Encefalomiopatia mitocondrial (doença cerebral e muscular) - começa na infância ou na idade adulta e envolve combinações de sintomas variáveis que podem incluir: paralisia muscular do olho, retinopatia pigmentaria (alterações de cor da retina com perda de visão), perda de audição, neuropatia sensorial (dano no nervo que envolve os órgãos sensoriais), convulsões, demência, ataxia (coordenação muscular anómala) e movimentos involuntários. Esta forma de deficiência do complexo I pode provocar síndrome de Leigh e MELAS. A maior parte dos casos de deficiência do complexo I resulta de herança recessiva autossómica (combinação de genes nucleares defeituosos tanto da mãe como do pai). Com menos frequência, o transtorno herda-se da mãe ou é esporádico e o defeito genético está no ADN mitocondrial.

Tratamento: Como com todas as doenças mitocondriais, atualmente não há cura para a deficiência do complexo I. Uma variedade de tratamentos, que podem ou não ser eficazes, pode incluir terapias metabólicas tais como: riboflavina, tiamina, biotina, coenzima Q10, carnitina e a dieta cetogénica. As terapias para a forma multissistémica infantil não foram satisfatórias. A evolução clinica e o prognóstico para os pacientes com deficiência do complexo I são sumamente variáveis e podem depender do defeito genético especifico, a idade de aparição, os órgãos envolvidos e outros fatores.

Deficiência do complexo III: Os sintomas incluem quatro formas principais: i) Encefalomiopatia infantil fatal, acidose láctica congénita, hipotensão, postura distrófica, convulsões e coma. Fibras vermelhas rasgadas comuns. ii) Encefalomiopatias de inicio tardio (da infância à vida adulta): diversas combinações de debilidade, baixa estatura, ataxia, demência, perda de audição, neuropatia sensorial, retinopatia pigmentaria e sinais piramidais. Fibras vermelhas rasgadas comuns. Possível acidose láctica. iii) Miopatia, com intolerância ao exercício que evolui a debilidade fixa. Fibras vermelhas rasgadas comuns. Possível acidose láctica. iv) Cardiomiopatia histiocitoide infantil.

Deficiência do complexo IV/Deficiência de COX: Os sintomas incluem duas formas principais: 1. Encefalomiopatia: Normalmente normal durante os primeiros 6 a 12 meses de vida e logo mostra regressão de desenvolvimento, ataxia, acidose láctica, atrofia ótica, oftalmoplegia, nistagmo, distonia, sinais piramidais e problemas respiratórios. Convulsões frequentes. Pode provocar sindrome de Leigh. 2. Miopatia: Duas variantes principais: 1. Miopatia infantil fatal: pode começar pouco depois do nascimento e ir acompanhada de hipotensão, debilidade, acidose láctica, fibras vermelhas rasgadas, insuficiência respiratória e problemas renais. 2. Miopatia infantil benigna: pode começar pouco depois do nascimento e ir acompanhada de hipotensão, debilidade, acidose láctica, fibras vermelhas rasgadas, problemas respiratórios, mas (se a criança sobrevive) ir seguida de uma melhoria espontânea. KSS (sindrome de Kearns-Sayre): A KSS é uma doença mitocondrial multissistémica lentamente progressiva que com frequência começa com a caida das pálpebras (ptose). Outros músculos do olho eventualmente chegam a estar envolvidos, dando como resultado paralisia do movimento do olho. A degeneração da retina habitualmente provoca dificuldade para ver em ambientes com pouca luz. A KSS caracteriza-se por três caracteristicas principais: • aparição típica antes dos 20 anos de idade embora possa produzir-se na aleitação ou na idade adulta • paralisia de músculos do olho específicos (denominada oftalmoplegia externa progressiva crónica - CPEO) • degeneração da retina que provoca acumulação anómala de material pigmentado (colorido) (retinopatia pigmentaria).

Além disso, um ou mais dos seguintes estados está presente: • bloqueio de sinais elétricos no coração (defeitos da condução cardíaca) • proteína do líquido cefalorraquidiano elevada • incoordenação de movimentos (ataxia).

Os pacientes com KSS também podem ter problemas tais como surdez, demência, disfunção renal e debilidade muscular. Anomalias endócrinas incluindo retardo do crescimento, baixa estatura ou diabetes também podem ser evidentes. A KSS é um transtorno raro. Provoca-se habitualmente por uma deleção (perda) grande simples de material genético dentro do ADN das mitocôndrias (ADNmt), em vez de no ADN do núcleo celular. Estas deleções, das que há mais de 150 espécies, surgem normalmente de maneira espontânea. Com menos frequência, a mutação transmite-se pela mãe.

Como com todas as doenças mitocondriais, não há cura para a KSS.

Os tratamentos baseiam-se nos tipos de sintomas e órgãos envolvidos, e podem incluir: coenzima Q10, insulina para diabetes, fármacos cardíacos e um marca-passo cardíaco que pode salvar vidas. Pode considerar-se a intervenção cirúrgica para a caída das pálpebras, mas deve levar-se a cabo por especialistas em centros cirúrgicos oftálmicos. A KSS é lentamente progressiva e o prognóstico varia dependendo da gravidade. A morte é comum na terceira ou quarta década e pode dever-se a falhas orgânicas.

Doença ou sindrome de Leigh (encefalomielopatia necrotizante subaguda): Sintomas: convulsões, hipotensão, fatiga, nistagmo, escassos reflexos, dificuldades para comer e engolir, problemas respiratórios, escassa função motora e ataxia.

Causas: deficiência de piruvato desidrogenase, deficiência do complexo I, deficiência do complexo II, deficiência do complexo IV/COX, NARP. A doença de Leigh é um transtorno neurometabólico progressivo com uma aparição geral na aleitação ou a infância, com frequência após uma infecção virai, mas também pode produzir-se em adolescentes e adultos. Caracteriza-se em MRI por lesões necrotizantes visíveis (tecido morto ou que está morrendo) no cérebro, particularmente no mesencéfalo e troncoencéfalo. A criança com frequência parece normal no nascimento, mas normalmente começa a apresentar sintomas no prazo de poucos meses a dois anos de idade, embora o tempo possa ser muito mais cedo ou mais tarde. Os sintomas iniciais podem incluir a perda de habilidades básicas tais como sucção, controlo da cabeça, andar e falar. Isto pode ir acompanhado de outros problemas tais como irritabilidade, perda de apetite, vómitos e convulsões. Pode haver períodos de forte descenso ou restabelecimento temporal de algumas funções.

Eventualmente, a criança também pode ter complicações cardíacas, renais, da visão e respiratórias. Há mais de um defeito que provoca a doença de Leigh. Isto inclui uma deficiência em piruvato desidrogenase (PDHC), e defeitos da enzima da cadeia respiratória - complexos I, II, IV e V. Dependendo do defeito, o modo de herança pode ser dominante ligado a cromossoma X (defeito do cromossoma X e a doença produz-se habitualmente em homens só), recessivo autossómico (herdado de genes tanto da mãe como do pai) e materno (da mãe só) . Também pode haver casos espontâneos que não são herdados em absoluto. Não há cura para a doença de Leigh. Os tratamentos envolvem em geral variações de terapias com vitaminas e complementos, com frequência numa combinação "coquetel" e são só parcialmente eficazes. Diversos sítios de recursos incluem a possível utilização de: tiamina, coenzima Q10, riboflavina, biotina, creatina, succinato e idebenona. Também estão provando-se fármacos experimentais, tais como dicloroacetato (DCA) em algumas clínicas. Em alguns casos, pode ordenar-se uma dieta especial e deve monitorizar-se por parte de um nutricionista com conhecimentos de transtornos metabólicos. 0 prognóstico para a doença de Leigh é mau. Dependendo do defeito, os indivíduos normalmente vivem desde poucos anos até a metade da adolescência. Os diagnosticados com síndrome similar a Leigh ou quem não apresenta sintomas até a idade adulta tende a viver mais. MELAS (encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios similares a acidente cerebrovascular): Sintomas: baixa estatura, convulsões, episódios similares a acidente cerebrovascular com déficits neurológicos focalizados, dores de cabeça recorrentes, regressão cognitiva, progressão da doença, fibras vermelhas rasgadas.

Causa: Mutações pontuais de ADN mitocondrial: A3243G (a mais comum). MELAS - Miopatia mitocondrial (debilidade muscular), encefalopatia (doença cerebral e do sistema nervoso central), acidose láctica (acumulação de um produto de resíduo celular) e episódios similares a acidente cerebrovascular (paralisia parcial, perda parcial da visão ou outras anomalias neurológicas). MELAS é um transtorno neurodegenerativo progressivo com aparição típica entre as idades de 2 e 15, embora possa produzir-se na aleitação ou até na idade adulta. Os sintomas iniciais podem incluir episódios similares a acidente cerebrovascular, convulsões, enxaquecas e vómitos recorrentes.

Habitualmente, o paciente parece normal durante a aleitação, embora a baixa estatura seja comum. Menos comuns são os sintomas na aleitação precoce que podem incluir atraso no desenvolvimento, dificuldades de aprendizagem ou transtorno por déficit de atenção. A intolerância ao exercício, debilidade das extremidades, perda de audição e diabetes também podem preceder à aparição dos episódios similares a acidente cerebrovascular.

Os episódios similares a acidente cerebrovascular, com frequência acompanhados de convulsões, são o sintoma distintivo de MELAS e provocam paralisia parcial, perda da visão e defeitos neurológicos focais. Os defeitos acumulativos graduais destes episódios com frequência dão como resultado combinações variáveis de perda de habilidades motoras (fala, movimento e alimentação), sensação alterada (perda da visão e perda das sensações corporais) e piora mental (demência). Os pacientes com MELAS também podem padecer sintomas adicionais incluindo: debilidade muscular, disfunção de nervos periféricos, diabetes, perda de audição, problemas cardíacos e renais e anomalias digestivas. 0 ácido láctico habitualmente acumula-se a altos níveis no sangue, o líquido cefalorraquidiano ou ambos. MELAS herda-se da mãe devido a um defeito no ADN dentro das mitocôndrias. Há pelo menos 17 mutações diferentes que podem provocar MELAS. De longe a mais prevalente é a mutação A3243G, que é responsável de aproximadamente 80% dos casos. Não há cura ou tratamento específico para MELAS. Embora ensaios clínicos não demonstrassem a sua eficácia, os tratamentos gerais podem incluir terapias metabólicas tais como: CoQlO, creatina, filoquinona e outras vitaminas e complementos. Podem requerer-se fármacos tais como medicamentos contra as convulsões e insulina para o tratamento de sintomas adicionais. Alguns pacientes com disfunção muscular podem beneficiar-se de exercício supervisado moderado. Em determinados casos, outras terapias que podem recomendar-se incluem dicloroacetato (DCA) e menadiona, embora estes não se utilizem de maneira rotineira devido ao seu potencial para ter efeitos secundários prejudiciais. O prognóstico para MELAS é mau. Normalmente, a idade de morte é de entre 10 e 35 anos, embora alguns pacientes possam viver mais. A morte pode vir como resultado de perda de massa corporal geral devido a demência progressiva e debilidade muscular, ou complicações a partir de outros órgãos afetados tais como coração ou rins. MERRF é uma síndrome multissistémica progressiva que habitualmente começa na infância, mas a aparição pode produzir-se na idade adulta. A taxa de progressão varia amplamente. A aparição e o grau dos sintomas podem diferir entre irmãos afetados.

As caracteristicas clássicas de MERRF incluem: • mioclonia (espasmos musculares breves, repentinos, de contração) - o sintoma mais característico • convulsões epilépticas • ataxia (coordenação alterada) • fibras vermelhas rasgadas (uma anomalia microscópica caracteristica observada na biopsia muscular de pacientes com MERRF e outros transtornos mitocondriais). Os sintomas adicionais podem incluir: perda de audição, acidose láctica (nivel de ácido láctico elevado no sangue), baixa estatura, intolerância ao exercício, demência, defeitos cardíacos, anomalias oculares e piora da fala.

Embora uns poucos casos de MERRF sejam esporádicos, a maioria dos casos herdam-se da mãe devido a uma mutação dentro das mitocôndrias. A mutação de MERRF mais comum é A8344G, que representa mais de 80% dos casos (artigo de

GeneReview). Foi notificado que outras quatro mutações de ADN mitocondrial provocam MERRF. Embora uma mãe transmita a sua mutação de MERRF a todos os seus filhos, alguns pode ser que nunca apresentem sintomas.

Como com todos os transtornos mitocondriais, não há cura para MERRF. As terapias podem incluir a coenzima Q10, L-carnitina e diversas vitaminas, com frequência numa combinação "coquetel". 0 tratamento das convulsões habitualmente requer fármacos anticonvulsivos. Também podem ser necessários medicamentos para o controlo de outros sintomas. 0 prognóstico para MERRF varia amplamente dependendo da idade de aparição, o tipo e a gravidade de sintomas, os órgãos envolvidos e outros fatores.

Depleção de ADN mitocondrial: Os sintomas incluem três formas principais: 1. Miopatia congénita: Debilidade neonatal, hipotensão que requer ventilação assistida, possível disfunção renal. Acidose láctica grave. Fibras vermelhas rasgadas proeminentes. A morte devido à insuficiência respiratória habitualmente produz-se antes de um ano de idade. 2. Miopatia infantil: Após o desenvolvimento precoce normal até um ano de idade, aparece debilidade e piora rapidamente, provocando insuficiência respiratória e morte normalmente no prazo de poucos anos. 3. Hepatopatia: Fígado aumentado e falha renal intratável, miopatia. Acidose láctica grave. A morte é normal no prazo do primeiro ano. A invenção refere-se à utilização de alfa-l-microglobulina no tratamento de uma doença relacionada com mitocôndrias. A doença pode ser qualquer uma das doenças especificadas no presente documento ou como uma única doença ou em qualquer combinação de doenças especificadas no presente documento. Por exemplo, a invenção refere-se à utilização de alfa-1-microglobulina no tratamento de uma das doenças mencionadas no presente documento ou no tratamento de uma seleção das doenças mencionadas no presente documento sem ter em conta se foi mencionada explicitamente a seleção especifica. Portanto, a seleção de doenças ou transtornos pode selecionar-se aleatoriamente. A doença pode ser ou estar provocada por um defeito mitocondrial ou uma irregularidade na função mitocondrial.

Em particular a invenção refere-se à utilização de alfa-1-microglobulina no tratamento ou a profilaxia de transtornos da cadeia respiratória. Mais especificamente os transtornos da cadeia respiratória envolvem os defeitos do complexo I, II, III, IV ou V.

Mais especificamente, a invenção refere-se à utilização de alfa-l-microglobulina no tratamento ou a profilaxia de disfunções mitocondriais em crianças ou jovens adultos. Os exemplos incluem doença de Alpers, síndrome de Barth, ataxia de Fridreich, KSS, doença ou síndrome de Leigh, LHON, MELAS, MERRF, MIRAS e NARP

Mais especificamente, a invenção refere-se à utilização de alfa-l-microglobulina no tratamento ou a profilaxia de disfunções mitocondriais em mulheres. A invenção refere-se também à utilização de alfa-1-microglobulina no tratamento ou a profilaxia de dano ou disfunção de retina ou doenças oculares associadas com defeito(s) ou disfunção/disfunções mitocondrial/mitocondriais.

Administração terapêutica: A via e/ou o modo de administração de AIM pode variar dependendo do resultado desejado. Um especialista na área é consciente de que as vias ou modos de administração, assim como regimes, podem ajustar-se para proporcionar a resposta terapêutica desejada. As vias de administração incluem, mas não se limitam a, administração parenteral, entérica, mucosa/tópica incluindo intravenosa, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intracerebral, oral, perorai, dérmica, mediante inalação, etc. A AIM pode formular-se numa composição farmacêutica desenhada para a utilização particular. Um especialista na área saberá como encontrar orientação para desenhar diversas composições farmacêuticas, veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. 1990, Mack Publishing.

Para a administração ocular pode administrar-se AIM numa composição líquida ou num dispositivo médico incluindo lentes de contacto ou outros insertos oftálmicos. As composições líquidas incluem soluções, dispersões, emulsões e suspensões e podem apresentar-se na forma de colírios ou em forma de dose única ou na forma de múltiplas doses, ou pode apresentar-se como pós secos para a reconstituição com um líquido antes da sua aplicação. A composição pode apresentar-se também como loções, cremes, pomadas ou géis oculares. Podem incluir-se excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como solventes (por exemplo, água, óleos incluindo óleos naturais ou vegetais como, por exemplo, óleo de rícino), um agente de aumento da viscosidade como goma gelana, goma xantana, poli(álcoois vinílicos), derivados de celulose, por exemplo, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, etc.), conservantes como parabenos ou cloreto de benzalcónio, agentes de ajuste do pH (por exemplo, ácido cloridrico, hidróxido de sódio, tampões como fosfato ou citrato), agentes de aumento da estabilidade, agentes de ajuste da tonicidade (por exemplo, cloreto de sódio), etc.

Para a administração oral pode formular-se AIM em composições sólidas, semissólidas ou liquidas. As composições podem estar na forma farmacêutica unitária ou na forma farmacêutica de múltiplas unidades. As composições incluem pós, comprimidos, cápsulas, envelopes, películas, wafers, géis, cremes, pomadas, soluções, dispersões, emulsões, suspensões, pulverizações, etc. A composição inclui um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais excipientes (e excipientes para outros tipos de composições) conhecem-se bem por um especialista na área (veja-se, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Science" editado por Gennaro et al. (Mack Publishing Company), em "Handbook of Pharmaceutical Excipients" editado por Rowe et al. (PhP Press) e em monografias oficiais (por exemplo, Ph.Eur. ou USP) relacionadas com excipientes relevantes para tipos de formulação específica e para métodos para preparar uma formulação específica. A AIM administra-se preferivelmente na forma de uma composição farmacêutica. Devido à natureza de polipéptido de AIM as composições podem desenhar-se preferivelmente para a sua utilização parenteral, mas AIM pode aplicar-se também localmente, por exemplo, na pele em relação com cicatrização de feridas, em articulações, ou nas cavidades cerebrais. Pode formular-se AIM num liquido, por exemplo, numa solução, uma dispersão, uma emulsão, uma suspensão, etc., ou pode estar numa formulação adequada para a administração à pele tal como, por exemplo, uma loção, um creme, uma pomada, uma suspensão, uma emulsão, uma pasta, um pó, um parche, um emplastro, uma bandagem, um sabão, um champô, loção de proteção solar, etc. Além disso, pode incluir-se AIM em dispositivos ou equipas médicas, por exemplo, como recobrimento libertável em cateteres, etc.

Alternativa e adicionalmente, podem incluir-se portadores específicos para selecionar como alvo o princípio ativo a uma parte específica do corpo. Por exemplo, um complexo de anticorpo-AlM em que o anticorpo se dirige à localização de eleição ("direcionamento") por a sua especificidade para um determinado epitopo; uma célula mãe ou uma célula recombinante com tais propriedades de direcionamento, por exemplo, recetores de integrina específicos para um tecido e com a capacidade artificial ou natural para secretar grandes quantidades de AIM. 0 tratamento seria mais eficiente já que o fármaco se concentraria num sítio particular, sangramento, etc., e se requereria menos AIM.

Para utilização parenteral os solventes adequados incluem água, óleos vegetais, propilenglicol e solventes orgânicos aprovados em geral para tais fins. Em geral, um especialista na área pode encontrar orientação em "Remington's Pharmaceutical Science" editado por Gennaro et al. (Mack Publishing Company), em "Handbook of Pharmaceutical Excipients" editado por Rowe et al. (PhP Press) e em monografias oficiais (por exemplo, Ph.Eur. ou USP) em relação com excipientes relevantes para os tipos de formulação específica e com métodos para preparar uma formulação específica. A invenção ilustra-se nas seguintes figuras e exemplos. Legenda das figuras

Figura 1. União de AIM a células intactas e apoptóticas. A. Cultivaram-se células HCQ.4 em plásticos recobertos com anticorpo de hámster anti-CD3 de rato (4 μρ/ιηΐ) durante 18 horas. Para a análise da união de AIM, incubaram-se 1 x 106 células com AIM 1 mg/ml, lavaram-se, incubaram-se com anticorpos de rato anti-AIM, lavaram-se e finalmente incubaram-se com anticorpo de cabra anti-IgG de rato conjugado com FITC (GAM-FITC). Analisaram-se 10000 células para determinar a união de AIM (pico aberto). Estabeleceu-se a referência mediante células incubadas com BSA na primeira etapa (pico sombreado). Comparou-se a união a células apoptóticas (histograma da direita) com células sem tratar (histograma da esquerda). B. Correlacionou-se a união de AIM com a captação de PI mediante cultivo de células HCQ.4 em presença de etanol a 5% ou DMSO a 10% durante 15 horas. Para a análise de citometria de fluxo, incubou-se AIM com células, seguido por anticorpos de rato anti-AIM e anticorpo de cabra anti-IgG de rato conjugado com FITC. Antes da análise, tingiram-se também as células mediante PI para detetar células mortas. C. Analisou-se a união de AIM a células apoptóticas da linha de células pre-B 70Z/3 mediante citometria de fluxo. Induziu-se a apoptose das células mediante o fármaco de benzamida, declopramida (3-CPA), durante 15 horas e analisaram-se para determinar a união de AIM mediante incubação de AIM biotinilada, seguido por SAPE. Estabeleceu-se a referência mediante células incubadas com SAPE só (pico sombreado). D. Células K562 incubadas com AIM 20 μΜ e 0,25 mg/ml durante 2 h e submetidas a coloração com anticorpos de rato anti-AIM seguido por fragmentos F(ab')2 de anticorpo de cabra anti-IgG de rato (Alexa Fluor® 594; rojo). Montaram-se as células utilizando o reagente ProLong Gold AntiFade com DAPI e inspeção visual e realizou-se o registo. A imagem é representativa para três experiências separadas. O tamanho da barra é 10 μΜ. E. Determinou-se a especificidade da união de AIM mediante um ensaio de união a células competitivo. Compararam-se as células HCQ.4, em que se induziu apoptose mediante reticulação com anticorpo anti-CD3 durante 18 horas (histograma da direita), com células HCQ.4 sem tratar (histograma da esquerda). Misturaram-se lxlO6 células/mostra com 1 μg/ml de 125I-A1M (1), 125I-A1M mais adição de 2,5 mg/ml de AIM sem marcar (2), ovalbumina (3), BSA (4) ou AGP (5). Incubaram-se as células durante 30 minutos a 4°C, centrifugaram-se num gradiente de sacarose para separar a proteína não unida, congelaram-se então os tubos e separou-se o sedimento celular e contaram-se num contador γ. Apresentam-se os resultados como valores médios de um triplicado a partir de uma experiência ± SEM. Realizou-se a comparação estatística entre grupos utilizando o teste da t de Student. ***p < 0,001.

Figura 2. Estudos de tempos da união de AIM a células apoptóticas. A. Induziu-se apoptose em células HCQ.4 mediante cultivo sobre plásticos recobertos com anticorpo anti-CD3. Tomaram-se amostras em diferentes pontos de tempo após a indução (0, 1, 2, 4, 8 e 16 horas). Tingiram-se as células com AIM conjugada com FITC (0,1 mg/ml) e PI. Analisaram-se 10000 células. B. Analisou-se a união de AIM a células pre-B, induzidas a apoptose mediante incubação com a benzamida 3-CPA, mediante citometria de fluxo e correlacionou-se com a união de anexina V e a captação de 7AAD. Incubaram-se as células 70Z/3 apoptóticas com AIM biotinilada (0,025 mg/ml) seguido por SAPE, anexina V e 7AAD. Analisaram-se 10000 células e separaram-se em células negativas para 7AAD (diagrama da esquerda) e células positivas para 7AAD (diagrama da direita) respetivamente.

Figura 3. União de AIM a mitocôndrias analisada mediante microscopia confocal e microscopia eletrónica de transmissão. A. Lavaram-se células K562 incubadas com meio só (esquerda) ou AIM 0,25 mg/ml (direita) durante 2 h e incubaram-se com Mito-Tracker (vermelho) durante 15 minutos, e lavaram-se em meio fresco. Após a lavagem, tingiram-se então as células com anticorpo de rato monoclonal anti-AIM (BN 11.3) a 5 μg/ml seguido por fragmentos F(ab')2 de anticorpo de cabra anti-IgG de rato (Alexa Fluor® 488; verde). Montaram-se as células utilizando o reagente ProLong Gold AntiFade com DAPI (azul) e inspeção visual e realizou-se o registo utilizando microscopia confocal. A imagem é representativa de três experiências separadas. A barra de escala indica 5 μιη. B. Uma visão geral de queratinócitos primários humanos incubados durante 20 horas a TA com AIM 10 μΜ. Destacam-se as estruturas mitocondriais com setas e mostram-se em aumento maior em (C). Realizou-se a imunomarcagem de seções finas de queratinócitos primários humanos com anticorpo anti-AIM marcado com ouro e mostrou-se que se correlaciona com mitocôndrias. Destaca-se isto com pontas de seta (C) . Prepararam-se as amostras e observaram-se tal como se descreve em materiais e métodos. A barra de escala em (B) indica 2 μυ e em (C) 0,1 μιη.

Figura 4. União de AIM a mitocôndrias analisada pela união de 125I-A1M. A. Investigou-se a especificidade da união de AIM a mitocôndrias misturando aproximadamente 2,5 μg/ml de 125I-A1M com 0,5 mg de mitocôndrias purificadas em presença ou ausência de 1,0 mg/ml de proteína sem marcar (AIM ou AGP) em PBS + BSA a 4%. Incubaram-se as misturas a 4°C durante 30 minutos, centrifugaram-se num gradiente de sacarose para separar a proteína não unida, congelaram-se então os tubos e separou-se o sedimento celular e contaram-se num contador γ. Cada ponto representa a média ± SEM de três determinações. Realizou-se a comparação estatística entre os grupos utilizando o teste da t de Student. ***p < 0,001. B. Investigou-se adicionalmente a especificidade da união de AIM a mitocôndrias utilizando BN-PAGE e imunotransferência de tipo Western. Separaram-se cinco μρ de proteínas de membrana mitocondrial de 2 indivíduos separados num gel Bis-Tris a 4-16% para BN-PAGE e transferiram-se a uma membrana de PVDF. Após o bloqueio, incubaram-se as membranas com anticorpos frente à subunidade NDUFV1 do complexo I, núcleo I do complexo III, AIM de rato, ou tingiram-se com Coomassie. C. Investigou-se também a associação do complexo I mediante imunoprecipitação de mitocôndrias recém-preparadas com anticorpos frente ao complexo I. Após a imunoprecipitação, separaram-se as proteínas unidas e eluídas em SDS-PAGE a 12% e transferiram-se a membrana de PVDF. Após o bloqueio, incubaram-se as membranas com anticorpos frente a AIM de rato. Banda esquerda, material de partida mitocondrial (SM) e banda direita, material unido e eluído (IP).

Figura 5. Investigou-se a especificidade da união de AIM a mitocôndrias utilizando BN-PAGE, SDS-PAGE e imunotransferência de tipo Western. Suspenderam-se as mitocôndrias recém-isoladas em PBS, sedimentaram-se mediante centrifugação e dissolveram-se até uma concentração de 5 mg/ml em tampão MB2. Solubilizaram-se as proteínas de membrana mitocondrial mediante incubação com 0,5-4,0 g de digitonina/g de proteína durante 5 min sobre gelo. Centrifugaram-se as amostras, recolheu-se o sobrenadante e adicionou-se SBG até uma concentração final de 4,5%. A. Separaram-se então cinco μρ de proteínas de membrana mitocondrial de 2 indivíduos separados (SI e S2) sobre um gel Bis-Tris a 4-16% para BN-PAGE e transferiram-se a uma membrana de PVDF. Após o bloqueio, incubaram-se as membranas com anticorpos frente à subunidade NDUFV1 (esquerda) do complexo I, AIM (médio) e núcleo I da subunidade do complexo III. B. Separaram-se proteínas mitocondriais isoladas (15 μρ/banda) tratadas com tripsina (0-100 U de tripsina) em SDS-PAGE a 12% e transferiram-se a uma membrana de PVDF. Após o bloqueio, incubou-se a membrana com anticorpos frente a AIM.

Figura 6. AIM protege a estrutura mitocondrial. Incubaram-se queratinócitos primários humanos durante 20 horas a TA com meio de cultivo só (A) , hemo 20 μΜ (B) ou hemo 20 μΜ + AIM 0,25 mg/ml (C) . Destacam-se as estruturas mitocondriais com setas e representam-se em detalhe (imagens ampliadas). Prepararam-se as amostras e observaram-se tal como se descreve em materiais e métodos. A barra de escala indica 2 μιη (visão geral) e 0,5 μιη (imagem ampliada) .

Figura 7. Incubaram-se queratinócitos primários humanos durante 20 horas a TA com meio de cultivo só (A) , H2O2 250 μΜ (B) ou H2O2 250 μΜ + AIM 0,25 mg/ml (C) . Destacam-se as estruturas mitocondriais com setas e representam-se em detalhe (imagens ampliadas). Prepararam-se as amostras e observaram-se tal como se descreve em materiais e métodos. A barra de escala indica 2 μιη (visão geral) e 0,5 μιη (imagem ampliada).

Figura 8. AIM protege a função mitocondrial. Investigou-se o efeito de AIM sobre a função mitocondrial medindo a produção de ATP de mitocôndrias purificadas expostas a hemo ou H2O2. Incubaram-se as mitocôndrias com hemo 1-20 μΜ, com ou sem AIM 0,25 mg/ml (A) ou H2O2 20-250 μΜ com ou sem AIM 0,25 mg/ml (B) durante 30 minutos. Recolheram-se as mitocôndrias mediante centrifugação e mediu-se a produção de ATP utilizando um kit de ensaio de luminescência. Normalizaram-se os níveis de ATP com a correspondente proteína de amostra. Cada ponto representa a média ± SEM de três determinações. Realizou-se uma comparação estatística entre grupos utilizando o teste da t de Student. *P < 0,05.

Figura 9. Lista de sequências de AIM

Figura 10. Quantificação de PCR em tempo real de ARNr mitocondrial (A) e AIM celular, ARNm de HOI e SOD (B) durante o cultivo de retina em condições moderadas e de stress. Cada valor de AAt corresponde à quantidade de ARN em condições de stress em relação com a quantidade de ARN em condições moderadas, determinada mediante PCR em tempo real e normalizada em relação com gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Cada barra é a média de medições duplicadas de cultivos por triplicado.

Parte experimental

Exemplo 1

Materiais e métodos

Proteínas e anticorpos

Isolou-se AIM plasmática monomérica humana mediante cromatografia de afinidade com anticorpo anti-AIM e cromatografia em gel Sephacryl S-300, tal como se descreveu anteriormente (48). Purificou-se AIM humana recombinante, que continha His-tag N-terminal, a partir do meio de cultivo de células de insetos infectadas com baculovirus (48) ou expressadas em E. coli e purificaram-se e redobraram tal como se descreve (20) com a adição de uma etapa de purificação de cromatografia de intercâmbio iónico (32). Adquiriram-se (Xi-glicoproteína ácida (AGP) de soro humano e ovalbumina de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, E.U.A.) e a albumina de soro bovino (BSA) era de Roche Diagnostics Scandinavia AB (Bromma, Suécia). Adquiriu-se hemina (cloreto de ferriprotoporfirina IX) de Porphyrin Products, Inc. (Logan, UT) e preparou-se uma solução mãe 10 mM fresca dissolvendo em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich). H2O2 era de Acros Organics (Geel, Bélgica). Produziram-se anticorpos monoclonais de rato frente a AIM humana (BN11.3) tal como se descreve (29). Prepararam-se anticorpos policlonais de coelho anti-AIM de rato (Sven; fração de IgG) imunizando um coelho com AIM de rato marcada com His expressada em células de insetos infectadas com baculovirus (41). Proporcionou-se gentilmente o anticorpo de hámster anti-CD3 de rato 145.2C11 pelo Dr. Rikard Holmdahl, Lund University. Adquiriram-se anticorpo de cabra anti-imunoglobulina de rato conjugado com isotiocianato de fluoresceina (GAM-FITC) e estreptavidina conjugada com ficoeritrina (SAPE) de DAKO A/S (Glostrup, Dinamarca), a 7-aminoactinomicina D (7 AAD) era de Sigma-Aldrich Co. e a anexina V-FITC era de Trevigen Inc. (Gaithersburg, MD, E.U.A.).

Cultivo celular

Empregaram-se uma linha celular de hibridoma de células T CD4+ de rato (HCQ.4), uma linha de células pre-B murina (70Z/3), uma linha celular eritróide humana (K562) e queratinócitos primários humanos (Cambrex Biologies,

Karlskoga, Suécia) para estudos sobre a união de AIM a células e mitocôndrias. Cultivaram-se as células tal como se descreveu anteriormente (25, 28, 37) e processaram-se e analisaram-se tal como se descreve a seguir.

Indução de apoptose

Induziu-se apoptose no hibridoma de células T mediante três tratamentos diferentes: incubaram-se células sobre plásticos recobertos com anticorpo anti-CD3 (4 μρ/ιηΐ) (43) ou incubaram-se em meio complementado com ou etanol a 5% ou 10% de DMSO (24). Incubaram-se as células numa incubadora de CO2 a 37°C durante diversos tempos. Detetou-se apoptose como fragmentação de ADN mediante eletroforese em gel de agarose (descrito a seguir) e mediu-se a viabilidade celular mediante exclusão com azul de tripano. Na linha de células pre-B 70Z/3, induziu-se apoptose mediante o fármaco de benzamida declopramida (3-CPA, Oxigene Inc.) tal como se descreve em (25).

Eletroforese em agarose

Para detetar a fragmentação de ADN, lisaram-se aproximadamente lxlO6 células, trataram-se com proteinase K e ARNase A e analisaram-se mediante eletroforese em agarose.

Mareagem de AIM

Para a análise de união de AIM a células, biotinilou-se AIM, conjugou-se com FITC ou radiomarcou-se com 125I.

Biotinilou-se AIM com biotina-N-hidroxisuccinimida de braço longo (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, E.U.A.) (9) e diluiu-se até uma concentração de 0,2 mg/ml.

Conjugou-se AIM com FITC tal como se descreveu anteriormente (13) mediante FITC adsorvido em Celite (Calbiochem Corp, San Diego, CA, E.U.A.). Marcou-se AIM com 125I utilizando o método de cloramina T (16). A radioatividade especifica obtida foi de ao redor de 0,ΙΟ, 2 ΜΒς/μρ.

Citometria de fluxo

Analisou-se a união de AIM a células mediante citometria de fluxo. Analisaram-se aproximadamente lxlO6 células para determinar a união de AIM em uma de três maneiras diferentes: 1. Incubaram-se as células com 1 mg/ml de plasma ou AIM de célula de inseto recombinante, seguido por 10 μg/ml de anticorpo de rato monoclonal anti-AIM (BN 11.3) e GAM-FITC (diluído 20 vezes). 2. Incubaram-se as células com AIM biotinilada 10 μρ/ιηΐ seguido por SAPE (diluído de acordo com as recomendações do fabricante). 3. Incubaram-se as células com AIM conjugada com FITC 0,1 mg/ml. Realizaram-se todas as incubações em PBS + 1 mg/ml de BSA durante 10 minutos a TA. Entre as incubações, lavaram-se as células 2-3 vezes em PBS. Para detetar a fuga de células, incubaram-se as células com iodeto de propídio (PI; Invitrogen Inc.) ou 7AAD (de acordo com instruções do fabricante) . Para detetar células 70Z/3 apoptóticas, incubaram-se também as células com anexina V conjugada com FITC num tampão que continha Ca2+ (de acordo com as instruções do fabricante). Realizaram-se todas as análises utilizando um equipamento Becton Dickinson FACSorter e o pacote de software Cell Quest.

Fluorescência e microscopia confocal

Lavaram-se células K562 e ressuspenderam-se em meio de cultivo até 0,5 - 4,0 x 106 células/ml e incubaram-se com ou sem AIM tal como se indica nas legendas das figuras. Então ou incubaram-se as células com Mito-Tracker (Invitrogen Inc.) durante 15 minutos a 37°C e lavaram-se em meio fresco (figura 3A) ou lavaram-se diretamente em meio fresco (figura 1C). Após a lavagem, realizou-se a coloração das células ressuspendendo em meio de Na gelado (KC1 5,4 mM; KH2PO4 1,2 mM; MgS04 0, 8 mM; D-glucose 5,6 mM; NaCl 127 mM; Hepes 10 mM; CaCl2 1,8 mM; pH 7,3), fixação com BD CellFIX a 1% sobre gelo durante 15 min e a TA durante 45 min. Lavaram-se as células em solução de bloqueio (meio de Na; BSA a 1%; soro de cabra a 5%) seguido por permeabilização em Triton-X a 0,02% e bloqueio em BSA a 1%, soro de cabra a 5%, Tween-20 a 0,2% durante 1 hora a TA. Tingiram-se então as células a 4°C durante a noite com anticorpo de rato monoclonal anti-AIM (BN 11.3) a 5 μg/ml. Depois, aplicaram-se fragmentos F(ab')2 de anticorpo de cabra anti-IgG de rato (Alexa Fluor® 594; Invitrogen Inc.), durante lha TA. Montaram-se as células utilizando o reagente ProLong Gold AntiFade com DAPI. Para a microscopia de fluorescência, realizaram-se inspeção visual e o registo de imagens utilizando um microscópio de fluorescência invertido Nikon Eclipse TE300 equipado com uma câmara CCD refrigerada Hamamatsu C4742-95, utilizando um objetivo Plan Apochromat 100 x. Para a microscopia confocal, realizaram-se análises de células e marcadores fluorescentes utilizando um microscópio de epifluorescência (Nikon Eclipse TE300) e um microscópio de varredura laser confocal (Zeiss LSM 510 Meta). Equipou-se o microscópio de epifluorescência com as combinações de filtro apropriadas para visualizar seletivamente os fluoróforos utilizados. Realizaram-se análises utilizando uma lente Plan Apochromat 100 x e recolheram-se os dados de imagens com uma câmara CCD Hamamatsu C4742-95. Para analisar a mareagem e comarcagem intracelular em estruturas subcelulares, registou-se a varredura confocal de seções óticas através das células. Para excitação dos fluoróforos, utilizou-se a linha de laser de 405 nm para DAPI (laser de diodo 405-30), utilizou-se a linha de laser de 488 nm para Alexa Fluor 488 (laser de árgon) e a linha de laser de 561 nm para Mito-Tracker (DPSS 561-10). Detetaram-se os comprimentos de onda de emissão de fluoróforo individual utilizando os seguintes filtros: passa-banda de 420-480 nm para DAPI, passa-banda de 505-550 nm para Alexa Fluor 488 e passa longo de 575 nm para Mitotracker. Ajustou-se o buraco para deteção de Alexa Fluor 488 (excitação de 488 nm) para corresponder a 1 (uma) unidade Airy, e ajustaram-se então os buracos para os demais canais de deteção para proporcionar seções óticas da mesma espessura, isto é para garantir as comparações dos correspondentes volumes confocais. Otimizaram-se a potência do laser e os ajustes de deteção (ganho e compensação) para os canais individuais, proporcionando um intervalo de deteção de desde pixels altamente saturados de estruturas maiores até pixels não saturados de estruturas pequenas. Scanearam-se sequencialmente os diferentes fluoróforos, isto é com ajustes ótimos para um fluoróforo em cada canal, a um tamanho de marco de 512 x 512 ou 1024 x 1024. Para determinar a morfologia celular, obtiveram-se imagens de contraste por interferência diferencial (DIC) utilizando o laser de 405 nm como luz transmitida. Determinou-se a relação espacial entre a fluorescência Alexa Fluor 488 (verde) e a fluorescência Mito-Tracker (vermelha) através da fusão das seções óticas dos canais varridos individualmente (amarelo quando apresentam uma localização conjunta), confirmado através de análise de imagens fundidas utilizando o software LSM Zen ("Profile", dados não mostrados).

Sistema de duplo híbrido de levedura

Utilizou-se um sistema de duplo híbrido de levedura baseado em GAL4 para buscar proteínas celulares que interagem com AIM. Amplificou-se o ADN que codifica para a parte de AIM (aminoácidos 1-183) do gene AlM-bikunina (AMBP) mediante PCR utilizando um constructo pCR-Script como molde. Sequenciou-se completamente o fragmento e ligou-se no vetor de duplo híbrido de levedura, vetor fagomídeo pBD-GAL4 Cam (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.). Transformou-se então o vetor recombinante na cepa hóspede da levedura S. cerevisiae YRG-2 (Stratagene). Realizaram-se o crescimento e a manutenção das cepas da levedura e ensaios de duplo híbrido utilizando protocolos convencionais tal como se recomenda por Stratagene e http://www.umanitoba.ca/facuities/medicine/units/biochem/gi etz/. Transformaram-se aproximadamente 7,5 x 108 YRG-2 que portavam o plasmídeo isco, pBD-GAL4-AlM, com 15-20 μρ de uma biblioteca de ADNc MATCHMAKER de leucócitos humanos (Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, CA, E.U.A.). Analisaram-se os aproximadamente 2xl06 transformantes resultantes mediante ensaio de prototrofia de histidina e ensaio de elevação de colonias β-gal. Isolaram-se os plasmídeos de biblioteca recombinante dos transformantes His+LacZ+ e testaram-se de novo em ensaios de duplo híbrido diretos junto com o plasmídeo isco de AIM assim como com os plasmídeos isco que codificam para proteínas não relacionadas. Os plasmídeos que dão como resultado a ativação dos genes indicadores junto com o plasmídeo isco que codifica para AIM, mas não com os plasmídeos isco que codificam para proteínas não relacionadas, se consideravam positivos verdadeiros. Determinou-se a sequência de ADN dos insertos utilizando os iniciadores de vetor pAD5': 5'-tccagattacgctagcttgggtggtcatatg-3' e pAD3': 5'-gtgaacttgcggggtttttcagtatctacga-3'. Sequenciou-se completamente um dos insertos por Innovagen AB (Lund, Suécia).

Preparação de mitocôndrias a partir de tecido de fígado de rato

Recolheu-se tecido de fígado de rato em tampão de isolamento gelado (sacarose 320 mM, Trizma Base 10 mM, EGTA 2 mM) e homogeneizou-se posteriormente em 2 ml de tampão de homogeneização (tampão de isolamento complementado com BSA a 1%) . Prepararam-se mitocôndrias a partir de homogeneizados mediante centrifugação sequencial incluindo purificação por densidade em Percoll a 19%. Determinou-se a concentração de proteínas de preparações mitocondriais utilizando Nanodrop e utilizaram-se mitocôndrias isoladas sem congelamento.

Ensaio de união a células e a mitocôndrias competitivo.

Investigou-se a especificidade da união de AIM a células e mitocôndrias mediante um ensaio de união a células competitivo tal como se descreve (3, 49). Induziu-se apoptose em células HCQ.4 mediante reticulação de anticorpo anti-CD3 durante 15-18 horas. Recolheram-se as células e compararam-se com células normais no ensaio de união. Calculou-se uma constante de afinidade para a união utilizando uma representação de Scatchard dos dados.

Imunocaptura do complexo I

Realizou-se imunoprecipitação do complexo I sobre mitocôndrias recém-preparadas utilizando o kit de imunocaptura do complexo I (MitoSciences). Após a imunoprecipitação, eluiram-se as proteínas unidas utilizando tampão SDS e posteriormente analisaram-se utilizando SDS-PAGE e imunotransferência de tipo Western.

Isolamento dos complexos e supercomplexos de cadeia respiratória

Suspenderam-se os sedimentos mitocondriais não congelados, recém-isolados, em PBS complementado com inibidor de mini protease completo. Sedimentaram-se mitocôndrias durante 5 min a 5000 xg e posteriormente dissolveram-se até uma concentração de 5 mg/ml em tampão MB2 (ácido aminocapróico 1,75 M, Bis-Tris 7,5 mM pH 7,0, + EGTA 2 mM pH 8,0). Solubilizaram-se proteínas de membrana mitocondrial mediante incubação com digitonina a 0,5% durante 5 min sobre gelo. Centrifugaram-se as amostras durante 30 min a 13000 xg, recolheu-se o sobrenadante e mediu-se a concentração de proteína como antes. Finalmente, adicionou-se SBG (ácido aminocapróico 750 mM, Serva Blue G a 5%) até uma concentração final de 4,5%.

Blue native PAGE, SDS-PAGE e imunotransferência de tipo Western

Separaram-se cinco μρ de proteínas de membrana mitocondrial num gel Bis-Tris a 4-16% para BN-PAGE (Invitrogen Inc.) ou tingiram-se com azul brilhante de Coomassie ou transferiram-se a uma membrana de PVDF (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) utilizando o equipamento Iblot (Invitrogen Inc.). Separaram-se as proteínas imunoprecipitadas do complexo I num SDS-PAGE a 12% e transferiram-se a uma membrana de PVDF. Após o bloqueio durante a noite a 4°C incubaram-se as membranas com anticorpos frente à subunidade NDUFV1 do complexo I (Sigma) ou AIM de rato. Detetaram-se os anticorpos primários mediante incubação com o anticorpo de cabra anti-rato acoplado a HRP (DAKO) ou anticorpo de cabra anti-conejo (DAKO) .

Microscopia eletrónica de transmissão (MET)

Sedimentaram-se mediante centrifugação queratinócitos humanos (aproximadamente 1 milhão de células), incubados durante 20 horas a TA com hemo 20 μΜ, com ou sem AIM 10 μΜ, e fixaram-se posteriormente durante 1 hora a TA e logo durante a noite a 4°C em glutaraldeído a 2,5% em cacodilato de sódio 0,15 M, pH 7,4 (tampão cacodilato). Lavaram-se então as amostras com tampão cacodilato e fixaram-se posteriormente durante 1 hora a TA em tetróxido de ósmio a 1% em tampão cacodilato, desidrataram-se numa série graduada de etanol e incrustaram-se então em Epon 812 utilizando acetona como solvente intermediário. Secionaram-se os espécimes com uma faca de diamante em seções ultrafinas de 50-70 nm de espessura num ultramicrótomo LKB. Tingiram-se as seções ultrafinas com acetato de uranilo e citrato de chumbo. Observaram-se os espécimes num microscópio eletrónico JEOL JEM 1230 operado a 80 kV de voltagem de aceleração. Registaram-se imagens com uma câmara CCD Gatan Multiscan 791. Realizou-se a imunomarcagem das seções finas com anticorpo anti-AIM marcado com ouro (BN11.3) tal como se descreveu anteriormente (39) com a modificação que se utilizou Aurion-BSA como agente de bloqueio. Finalmente tingiram-se as amostras com acetato de uranilo e citrato de chumbo e observaram-se num microscópio eletrónico Jeol JEM 1230, operado a 80 kV de voltagem de aceleração. Registaram-se as imagens com uma câmara de dispositivo acoplado a carga Gatan Multiscan 791.

Ensaio de ATP

Mediu-se a produção de ATP celular utilizando um kit de ensaio de luminescência (Promega, Madison, WI), baseado na atividade dependente de ATP de luciferase. Normalizaram-se os níveis de ATP com o correspondente conteúdo em proteína da amostra.

Análise estatística

Realizou-se a análise estatística utilizando o software Origin 8. Utilizou-se o teste da t de Student para a avaliação estatística e considerou-se significativa quando P<0,05 .

Resultados

União específica de AIM a células danadas

Analisou-se a união de AIM a células apoptóticas e saudáveis mediante citometria de fluxo e comparou-se com células sem tratar. Em primeiro lugar, induziu-se apoptose em hibridomas de células T murinas (HCQ.4) mediante reticulação da molécula de CD3 com anticorpos anti-CD3 de rato imobilizados (figura IA, E), ou mediante incubação com etanol a 5% ou DMSO a 10% (figura 1B) . Estes tratamentos deram como resultado a fragmentação de ADN e captação de azul de tripano após 15-18 horas (não mostrado). Uma união débil de AIM pôde detetar-se para células sem tratar (figura IA, painel esquerdo). Uma união mais forte adicional pôde detetar-se para células reticuladas com anticorpo anti-CD3 (figura IA, painel direito) ou tratadas com etanol ou DMSO (figura IB). A união pôde correlacionar-se com a captação de PI, isto é só células que podiam incorporar PI apresentaram a união mais forte de AIM (figura IB). A citometria de fluxo de uma linha de células pre-B murina, induzida a apoptose utilizando o fármaco 3-CPA, e incubada com AIM seguido por anticorpo anti-AIM, mostrou resultados similares (figura 1C) , indicando que a união a células apoptóticas não se limita a células T.

Com o fim de caracterizar adicionalmente a união de AIM a células danadas, estudou-se a união utilizando microscopia de fluorescência da linha celular eritróide humana K562 (figura ID) e a linha celular promielocitica HL 60 (não mostrada) induzidas a apoptose mediante adição de hemo, e incubadas com AIM seguido por anticorpo anti-AIM. Tal como se ilustra na figura, puderam observar-se dois tipos diferentes de coloração, uma coloração granular débil na superfície celular da maioria das células e uma coloração mais pronunciada, intracelular e uniforme num subconjunto (aproximadamente 6%) das células. Obtiveram-se resultados similares com as células HL 60 (não mostrado). Estes resultados indicam que a união forte de AIM a células apoptóticas é principalmente intracelular, o que se confirmou mediante microscopia confocal (veja-se mais adiante; figura 3A).

Para investigar a especificidade da união, realizou-se um ensaio de união a células competitivo sobre células HCQ.4, induzidas a apoptose mediante reticulação de CD3 e comparou-se com células normais sem tratar. Adicionaram-se AIM marcada com 125I e um excesso de AIM sem marcar, ovalbumina, BSA ou AGP às células (figura 1E). Uniu-se mais AIM a células apoptóticas (figura 1E, esquerda) em comparação com células sem tratar (direita). O excesso de AIM sem tratar bloqueou a união de AIM a 125I ao mesmo nível basal para células apoptóticas que para células sem tratar. Encontrou-se que a redução é significativa (p<0,001). Nenhuma das proteínas controlo sem marcar pôde reduzir de maneira significativa a união de 125I-A1M a células sem tratar, indicando desse modo uma união específica de AIM. Em relação com as células apoptóticas, houve uma redução pequena, significativa, mediante as proteínas controlo (p<0,05). Esta pequena redução pode ser devido a um aumento da união de referência não específica a estruturas intracelulares expostas. Por conseguinte, os resultados indicam uma união mais forte específica de AIM a células apoptóticas. A partir de uma representação de Scatchard pôde determinar-se uma constante de afinidade para a união de AIM a células HCQ.4 apoptóticas a 1 x 106 M~2. A viabilidade destas células foi de 25% de acordo com a exclusão com azul de tripano (não mostrado).

Tal como se mencionou anteriormente, as células de união de AIM internalizaram PI (figura 1B). Isto indica que a união de AIM produziu-se tarde no processo apoptótico depois de que as membranas celulares iniciaram a fuga. Para confirmar este resultado, realizaram-se estudos de tempos sobre a união de AIM a células HCQ.4, induzidas a apoptose mediante reticulação com anticorpo anti-CD3. A citometria de fluxo de amostras tomadas em diversos pontos de tempo após a indução mostra que a captação de PI precede à união de AIM (figura 2A). Não se observou a clara correlação de união em células negativas para a captação de PI. Obteve-se o mesmo resultado quando se tingiram por triplicado as células pre-B murinas com AIM, anexina V (marcador para apoptose) e 7AAD (tinta marcadora para a permeabilidade de membrana celular) (figura 2B). Só células positivas para 7AAD mostraram uma forte união de AIM, enquanto que as células positivas para anexina V, mas não para 7AAD, não se uniram a AIM.

Identificação de proteínas de união a AIM intracelular

Para buscar proteínas celulares que interagem com AIM, utilizou-se o sistema de duplo híbrido de levedura. Utilizou-se ADNc que codifica para AIM como isco para buscar proteínas que interagem com AIM numa biblioteca de leucócitos humanos. Analisaram-se aproximadamente 2 x 106 transformantes para determinar a ativação do gene indicador. Um total de 168 colónias sobreviveu sobre placas que careciam de histidina e 13 delas também eram positivas para β-galactosidase. Isolaram-se os plasmídeos de biblioteca recombinante His+LacZ+ e testaram-se em ensaios de duplo híbrido diretos com plasmídeos isco que codificam só para a proteína isco assim como a proteína fusionada a proteínas não relacionadas. Mostrou-se que onze plasmídeos recombinantes codificavam para proteínas que interagiam com AIM, mas não com a proteína isco ou outras proteínas não relacionadas fundidas com a mesma. 0 sequenciamento de ADN dos insertos revelou que sete deles eram uma forma truncada da subunidade SDAP (NDUFAB1) no complexo I mitocondrial, um era a sequência completa da mesma subunidade, um era uma proteína de união a ARNnp, um era N-acetilglucosamine cinase e um era um antígeno de cancro de colo. Todos os insertos estavam no marco no vetor presa (tabela I).

Tabela 1. Proteínas que interagem com AIM encontradas no sistema de duplo híbrido de levedura.

* De acordo com a numeração de bases do n.° de registo Genebank designado nesta tabela.

União de AIM ao complexo I mitocondrial

Os resultados das experiências de duplo híbrido de levedura sugerem, portanto que uma subunidade do complexo I mitocondrial seja uma proteína intracelular de união a AIM principal. Portanto, investigou-se a união a mitocôndrias, e ao complexo I em particular, em detalhe utilizando vários métodos independentes: microscopia confocal, ME, fracionamento subcelular e PAGE. Utilizando uma sonda fluorescente mitocondrial (Mito-Tracker) e microscopia confocal avaliou-se a localização subcelular da AIM intracelular em células K562 com ou sem adição de AIM exógena (figura 3A). Ao analisar células sem AIM adicionada de maneira exógena observou-se uma coloração intracelular não específica muito débil (não mostrado). Sem embargo, com a adição de AIM exógena observou-se uma coloração específica de mitocôndrias, intensa. Estudou-se também a localização subcelular da AIM unida mediante ME de transmissão (MET) utilizando cultivos de queratinócitos humanos primários (figura 3B-C). A MET de queratinócitos, que contêm AIM adicionada de maneira exógena e incubados com anticorpo anti-AlM marcado com ouro, mostrou uma localização altamente específica de AIM nas mitocôndrias (figura 3C).

Realizou-se a confirmação da união mitocondrial e verificação de especificidade utilizando mitocôndrias purificadas de fígado de rato (figura 4A) . Incubou-se AIM marcada com 125I com as mitocôndrias, com ou sem um excesso de AIM sem marcar ou a proteína de controlo AGP. 0 excesso de AIM sem marcar bloqueou a união 125I-A1M de maneira significativa nas duas concentrações maiores, enquanto que AGP na concentração mais alta não teve efeito sobre a união. A análise de Scatchard dos dados de união produziu uma constante de afinidade da união a 1,2 x 106 M-1.

Para investigar se se encontra AIM endógena em mitocôndrias associadas com o complexo I, purificaram-se mitocôndrias de rato sem congelamento, solubilizaram-se, separaram-se em condições não desnaturalizantes e analisaram-se mediante imunotransferência de tipo Western utilizando anticorpos frente a subunidades do complexo I e III (denominadas NDUFV1 e núcleo I, respetivamente) e frente a AIM de rato (figura 4B) . Os resultados mostram que AIM migra conjuntamente com a banda que contém o complexo I principal e uma banda muito complexa que contém tanto o complexo I como III, enquanto que não se observou migração conjunta entre AIM e a banda que contém o complexo III principal. Tomados juntos, isto apoia uma associação especifica entre AIM e uma subunidade do complexo I. Sem embargo, uma fração grande de AIM migrou a uma posição correspondente a aproximadamente 350-400 kDa, o que sugere que AIM também se associa com outras estruturas grandes, ainda não identificadas, em mitocôndrias. A intensidade de transferência de todas as bandas diminui com concentrações de digitonina crescentes, o que sugere que todas as bandas observadas nos géis resultam de interações proteina-proteina não covalentes (figura 5A) . Confirmou-se a união entre AIM e o complexo I mediante a imunoprecipitação com anticorpo anti-complexo I seguido por transferência com anticorpo anti-AIM (figura 4C). Os resultados mostraram que se precipitaram a maioria das bandas positivas para AIM associada a mitocôndrias no material de partida (figura 4C, esquerda). Além disso, no imunoprecipitado observou-se uma nova banda, não detetável no material de partida. A digestão com tripsina de mitocôndrias intactas antes de SDS-PAGE e imunotransferência com anticorpo anti-AlM não diminuiu a quantidade de AIM encontrada nas mitocôndrias, o que apoia uma localização de AIM na membrana mitocondrial interna (figura 5B). AIM protege a estrutura e a função mitocondriais

Expondo como hipótese que o papel fisiológico de AIM unida a mitocôndrias é conferir proteção deste organelo, em primeiro lugar empregou-se MET para investigar o impacto de AIM sobre a estrutura de mitocôndrias em células expostas a hemo e H2O2 (figura 6 e 7) . Realizou-se MET sobre queratinócitos primários humanos cultivados. Observaram-se efeitos destrutivos extensivos por hemo (figura 6B) e H2O2 (figura 7B), isto é formação vasta de vacúolos, desorganização estrutural de fibras de queratina e inchamento das mitocôndrias (figura 6B e 7B, ampliadas). Contrarrestaram-se estes efeitos mediante a adição de AIM, observando-se um impacto particular sobre o inchamento mitocondrial (figura 6C e 7C, ampliadas). Os resultados sugerem que AIM protege e conserva as estruturas celulares de outra maneira danadas e desintegradas. A seguir investigaram-se os efeitos de AIM sobre a função mitocondrial medindo a produção de ATP de mitocôndrias purificadas expostas a hemo ou H2O2 (figura 8). Observou-se uma redução significativa na taxa de produção de ATP por hemo 5 e 20 μΜ (figura 8A) . Inverteu-se esta redução por AIM, e não se observou redução na taxa de produção de ATP por hemo em nenhuma das concentrações testadas quando estava presente AIM 10 μΜ. Obtiveram-se resultados similares utilizando H2O2 (figura 8B) . Portanto, H2O2 reduziu de maneira significativa a taxa de produção de ATP, mas se inverteram de maneira significativa os efeitos em presença de AIM 10 μΜ.

Exemplo 2. Condições de stress em cultivos de retina induzem dano estrutural e funcional de mitocôndrias, resposta de antioxidação celular e regulação por incremento de AlM celular Métodos

Dissecaram-se retinas de porco e cultivaram-se em placas de Petri em condições moderadas e de stress in vitro tal como se descreve para retinas de ratazana (Cederlund M, Ghosh F, Arner K, Andreasson S, Ãkerstrõm B. Vitrous levels of oxidative stress biomarkers and the radical scavenger alpha-l-microglobulin/AlM in human rhegmatogenous retinal detachment. Graefe's Arch Clin Exp Ophtalmol (2013) 251: 725-732). Após 2 h ou 48 h, isolou-se ARNm e quantificou-se, sintetizou-se ADNc mediante transcrição inversa e quantificou-se a guantidade de seguências específicas mediante PCR em tempo real. Normalizaram-se as guantidades obtidas de cada espécie de ARNm em cultivos em stress em relação com ARNm a partir do gene de manutenção gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e expressaram-se em relação com os genes normalizados em condições de não stress (AACt).

Resultados

Regulou-se por diminuição drasticamente a expressão de ARN ribossômico específico de mitocôndrias (ARNr 12S) em retinas cultivadas 48 h em condições de stress em comparação com condições moderadas (figura 10a), o gue sugere dano na estrutura e a função mitocondriais. Ao mesmo tempo, regularam-se por incremento o gene de AIM e os dois genes de antioxidação hemo oxigenase 1 (H01) e superóxido dismutase (SOD) em cultivos com stress em comparação com cultivos moderados após tanto 2 h como 48 h (figura 10b), o que sugere que se ativam os mecanismos de defensa celular da retina incluindo AIM.

Conclusões 0 stress retiniano durante o cultivo in vitro afeta de maneira negativa à estrutura e a função mitocondriais da retina e regula por incremento a defensa da antioxidação e a expressão de AIM. Estes resultados apoiam um papel de AIM na proteção mitocondrial durante o cultivo retiniano.

Lista de abreviaturas

Espécies reativas do oxigénio ROS

Hemoglobina Hb

Superóxido dismutase SOD

Glutationa peroxidase GPx

CCi-microglobulina AIM

Violaxantina desepoxidase VDE

Zeaxtantina epoxidase ZDE

(Xi-Glicoproteína ácida AGP

Albumina de soro bovino BSA

Dimetilsulfóxido DMSO

Anticorpo de cabra anti-imunoglobulina de rato GAM-FITC conjugado com isotiocianato de fluoresceina Estreptavidina conjugada com ficoeritrina SAPE

7-aminoactinomicina D 7 AAD

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Alfa-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização no tratamento de uma doença mitocondrial ou por a sua utilização na reparação, restauração ou manutenção da função mitocondrial.
2. 2. Alfa-l-microglobulina para a sua utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a doença mitocondrial selecionar-se da seguinte lista: • doença de Alpers (poliodistrofia infantil progressiva) • sindrome de Barth (cardiomiopatia infantil letal) • defeitos da beta-oxidação • cardiomiopatia • deficiência de carnitina-acilcarnitina • deficiência de carnitina • síndromes de deficiência de creatina (sindromes de deficiência de creatina cerebral (CCDS) incluem: deficiência de guanidinoacetato metiltransferase (deficiência de GAMT), deficiência de L-arginina:glicina amidinotransferase (deficiência de AGAT) e deficiência de transportador de creatina relacionada com SLC6A8 (deficiência de SLC6A8). • deficiência da coenzima Q10 • deficiência do complexo I (deficiência de NADH desidrogenase (NADH-CoQ redutase)) • deficiência do complexo II (deficiência de succinato desidrogenase) • deficiência do complexo III (deficiência de ubiquinona-citocromo c oxidorredutase) • deficiência do complexo IV/deficiência de COX (a deficiência de citocromo c oxidasa provoca-se por um defeito no complexo IV da cadeia respiratória) • deficiência do complexo V (deficiência de ATP sintase) • deficiência de COX • CPEO (sindrome de oftalmoplegia externa progressiva crónica) • deficiência de CPT I • deficiência de CPT II • ataxia de Friedreich (FRDA ou FA) • encefalomiopatia • acidúria glutárica tipo II • KSS (sindrome de Kearns-Sayre) • acidose láctica • LCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia longa) • LCHAD • doença ou síndrome de Leigh (encefalomielopatia necrotizante subaguda) • LHON (neuropatia ótica hereditária de Leber) • doença de Luft • MCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia média) • MELAS (encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios similares a acidente cerebrovascular) • MERRF (epilepsia mioclónica e doença de fibras vermelhas rasgadas) • MIRAS (síndrome atáxico mitocondrial recessivo) • citopatia mitocondrial • depleção de ADN mitocondrial • encefalopatia mitocondrial inclui: encefalomiopatia, encefalomielopatia • miopatia mitocondrial • MNGIE (transtorno mioneurogastrointestinal e encefalopatia) • NARP (neuropatia, ataxia e retinite pigmentosa) • síndrome de Pearson • deficiência de piruvato carboxilase • deficiência de piruvato desidrogenase • mutações de POLG • deficiências da cadeia respiratória • SCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia curta) • SCHAD • VLCAD (deficiência de acil-CoA desidrogenase de cadeia muito longa)
3. 3. Alfa-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no tratamento ou a profilaxia de transtornos da cadeia respiratória.
4. 4. Alfa-l-microglobulina para a sua utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por os transtornos da cadeia respiratória envolverem defeitos do complexo I, II, III, IV ou V.
5. 5. Alfa-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no tratamento ou a profilaxia de disfunções mitocondriais em crianças ou adultos jovens.
6. 6. Alfa-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para o tratamento de prevenção de doença de Alpers, sindrome de Barth, ataxia de Fridreich, KSS, doença ou sindrome de Leigh, LHON, MELAS, MERRF, MIRAS e NARP.
7. 7. Alta-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para o tratamento ou a profilaxia de disfunções mitocondriais em mulheres.
8. 8. Alfa-l-microglobulina caracterizada por a sua utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, no tratamento ou a profilaxia de dano ou disfunção de retina ou doenças oculares associadas com defeito(s) ou disfunção/disfunções mitocondrial/mitocondriais.