ES2599034T3 - Alfa-1-microglobulina para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con mitocondrias - Google Patents
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Abstract
Alfa-1-microglobulina para su uso en el tratamiento de una enfermedad mitocondrial o para su uso en la reparación, restauración o mantenimiento de la función mitocondrial.
Description
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DESCRIPCION
Alfa-1-microglobulina para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con mitocondrias Campo de la invencion
La presente invencion se basa en el hallazgo que la alfa-1-microgobulina (AIM) desempena un papel importante en la proteccion de las mitocondrias frente al dano. La A1M se une a una subunidad del complejo I, protegiendo de ese modo la estructura y funcion de las mitocondrias. Se han implicado las mitocondrias en varias enfermedades humanas y los hallazgos dados a conocer en el presente documento apoyan el uso de A1M en el tratamiento de enfermedades relacionadas con mitocondrias.
Antecedentes de la invencion
Las mitocondrias son organulos en celulas eucariotas. Generan la mayorfa del suministro de celulas de adenosfn trifosfato (ATP), que se usa como fuente de energfa. Por tanto, las mitocondrias son indispensables para la produccion de energfa, para la supervivencia de celulas eucariotas y para una correcta funcion celular. Ademas del suministro de energfa, las mitocondrias estan implicadas en otros varios procesos tales como senalizacion celular, diferenciacion celular, muerte celular asf como el control del ciclo celular y crecimiento celular. En particular, las mitocondrias son reguladores cruciales de la apoptosis celular y tambien desempenan un papel principal en multiples formas de muerte celular no apoptotica tal como, por ejemplo, necrosis.
En los ultimos anos se han publicado muchos artfculos que describen la contribucion mitocondrial a una variedad de enfermedades. Algunas enfermedades pueden provocarse por mutaciones o deleciones en el genoma mitocondrial, mientras que otras pueden provocarse por dano de la funcion mitocondrial. Actualmente hay tratamiento disponible que puede curar enfermedades mitocondriales.
En vista de la importancia reconocida de mantener o recuperar una funcion mitocondrial normal, hay una necesidad de identificar sustancias que puedan usarse para proteger la estructura y funcion mitocondriales o que puedan usarse para recuperar o tratar disfunciones en las mitocondrias.
La alfa-1-microglobulina (A1M) es una protefna tisular y plasmatica de 26 kDa que se ha aislado y caracterizado a partir del plasma, hfgado y orina de varias especies incluyendo el hombre y platija (31). En el plasma, la A1M se encuentra en forma libre asf como unida de manera covalente a otras protefnas plasmaticas grandes. En seres humanos, la A1M forma complejos con IgA, albumina y protrombina (5). La A1M libre y diversos complejos de alto peso molecular tambien estan presentes en la matriz extracelular de todos los tejidos que se originan tanto del plasma como de la sfntesis periferica (4). En los tejidos, la A1M se ubica preferencialmente en las interfases entre sangre y tejido en los vasos sangufneos, aire y tejido en el pulmon, y madre y feto en la placenta, especialmente en sitios de lesion (44). No se conoce la funcion fisiologica de la A1M, pero se ha mostrado que tiene actividad reductasa, y que une hemo libre y radicales, lo que sugiere que puede tener funciones protectoras durante situaciones con estres oxidativo (31). La A1M se une a muchos tipos de celulas, en muchos casos seguido por internalizacion (36, 49).
Descripcion detallada de la invencion
Los presentes inventores han realizado una investigacion detallada de la captacion celular de A1M, y en el transcurso de ello se encontro que la protefna se ubica principalmente en las mitocondrias en celulas danadas, y puede proteger la estructura y funcion mitocondriales.
La presente invencion se refiere al uso de A1M para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con mitocondrias. Tal como se muestra en los ejemplos, la A1M tiene un efecto beneficioso sobre las celulas expuestas a cantidad excesiva de estres y forzadas a producir ATP a altas tasas. En tales situaciones, la A1M puede mantener la produccion de ATP de las celulas a pesar del estres ambiental. Puesto que la A1M se une a una subunidad de los complejos de la cadena respiratoria, se preve que la A1M pueda usarse en general para prevenir o tratar enfermedades que implican empeoramiento o dano de las mitocondrias o dano de (al menos partes de) la funcion mitocondrial.
Las enfermedades mitocondriales resultan de fallos de las mitocondrias, que son compartimentos especializados presentes en cada celula del cuerpo excepto los globulos rojos. Cuando las mitocondrias fallan, se genera cada vez menos energfa dentro de la celula y se producira lesion celular o incluso muerte celular. Si se repite este proceso por todo el cuerpo se compromete gravemente la vida de la persona a la que le este ocurriendo esto.
Las enfermedades de las mitocondrias aparecen mas a menudo en organos que demandan mucha energfa tal como el cerebro, corazon, hfgado, musculos esqueleticos, rinon y el sistema endocrino y respiratorio.
Los sfntomas de una enfermedad mitocondrial pueden incluir perdida del control motor, dolor y debilidad muscular,
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convulsiones, problemas visuales/de audicion, enfermedades cardfacas, enfermedades hepaticas, trastornos gastrointestinales, dificultades para tragar y mas.
Una enfermedad mitocondrial puede ser hereditaria o puede deberse a mutaciones espontaneas, que conducen a funciones alteradas de las protefnas o moleculas de ARN que residen normalmente en las mitocondrias.
Se ha encontrado que muchas enfermedades implican una deficiencia mitocondrial tal como una deficiencia del complejo I, II, III o IV o una deficiencia enzimatica como, por ejemplo, deficiencia de piruvato deshidrogenasa. Sin embargo, la imagen es compleja y muchos factores pueden estar implicados en las enfermedades.
Hasta el momento, no estan disponibles tratamientos curativos. Los unicos tratamientos disponibles son aquellos que pueden aliviar los sfntomas y retardar la progresion de la enfermedad.
Por consiguiente, los hallazgos de los presentes inventores y descritos en el presente documento son muy importantes ya que demuestran el efecto beneficioso de la AIM sobre las mitocondrias con respecto tanto a mantener la estructura mitocondrial como a la capacidad de restaurar un defecto mitocondrial inducido.
La invencion se refiere a la AIM para su uso en el tratamiento de una enfermedad mitocondrial. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades en el sistema neurologico, el cerebro, corazon, hfgado, musculos esqueleticos, rinon y el sistema endocrino y respiratorio. Muchas enfermedades pueden tener un defecto mitocondrial y por consiguiente, mas enfermedades que las mencionadas en el presente documento tambien pueden ser relevantes para su tratamiento o prevencion usando AIM.
La muerte celular, ya sea accidental, inducida por estres o apoptotica, frecuentemente implica activacion de la degradacion celular y programas de reciclaje (7). Por tanto, la muerte celular es un proceso dependiente de energfa que necesita funciones mitocondriales conservadas e intactas. Se sugiere que la eliminacion autofagocftica de mitocondrias (mitofagia) desempena un papel fundamental durante la muerte celular programada (23). Por tanto, hay una necesidad de mitocondrias funcionales durante la muerte celular programada, y aun no se entiende como se logra eso.
El complejo I, II, III y IV son complejos de protefnas incrustados en la membrana interna de la mitocondria. Se conocen como la cadena respiratoria y funcionan acoplando la transferencia de electrones entre un donador de electrones (tal como NADH) y un aceptor de electrones (tal como O2) con la transferencia de iones H+. El gradiente de protones electroqufmico resultante a traves de la membrana interna se usa para generar energfa qufmica en forma de adenosfn trifosfato (ATP) mediante oxidacion de glucosa, piruvato y NADH, que se producen todos en el citosol de la celula. Este proceso de respiracion celular, tambien conocido como respiracion aerobica, depende de la presencia de oxfgeno. Cuando el oxfgeno es limitado, los productos glicolfticos se metabolizaran mediante fermentacion anaerobica, un proceso que es independiente de las mitocondrias. La produccion de ATP a partir de glucosa es aproximadamente 13 veces mayor durante la respiracion aerobica en comparacion con la fermentacion.
Los presentes inventores han mostrado que la protefna AIM de bajo peso molecular del tejido y plasma humano se une a mitocondrias y mas especfficamente al complejo I mitocondrial. Ademas, se mostro que la protefna puede proteger las mitocondrias de la hinchazon inducida por hemo y la perdida de la capacidad de produccion de ATP. Basandose en estos hallazgos, se ha sugerido que AIM puede participar en el mecanismo de mantenimiento celular. La AIM puede ejercer esta proteccion mediante varios mecanismos diferentes, que actualmente no se conocen. Independientemente del mecanismo de accion, los estudios notificados en el presente documento indican claramente que la AIM tiene efectos beneficiosos para las mitocondrias y, por consiguiente, la AIM es una posible sustancia farmacologica para el tratamiento o la prevencion de enfermedades mitocondriales. Ademas, la AIM puede usarse para la prevencion y/o el tratamiento de efectos secundarios mitocondriales en pacientes sujetos a tratamiento con farmacos que provocan tales efectos secundarios. Los ejemplos incluyen tratamiento con estatinas, etc. Ademas, la AIM puede usarse en cosmeticos, por ejemplo para tratar modificaciones de la piel relacionadas con la edad, o puede usarse en la prevencion y/o el tratamiento de efectos mitocondriales no deseados provocados por sustancias o condiciones en el ambiente.
Tal como se menciono anteriormente, la A1M se une a una subunidad del complejo I. Esto podrfa indicar que la A1M es especialmente adecuada para su uso en el tratamiento de enfermedades mitocondriales en las que hay un defecto en la cadena respiratoria. Mas especfficamente, podrfa indicar que la A1M es especialmente adecuada para su uso en el tratamiento de deficiencia del complejo I o enfermedades relacionadas con el complejo I.
Tal como se notifica en los ejemplos en el presente documento, se uso la induccion de apoptosis celular para imitar situaciones caracterizadas por lesiones celulares inducidas por estres que provocan dano a la membrana plasmatica y destruccion de la barrera externa de la celula. La A1M exogena se unio de manera intracelular con alta afinidad en cuanto las celulas pudieron internalizar yoduro de propidio (PI), lo que sugiere que el mecanismo de captacion es una fuga pasiva de A1M del compartimento extracelular. Por tanto, la union de A1M a las mitocondrias tambien debe producirse en celulas necroticas con membranas plasmaticas rotas. Esta quedando cada vez mas claro que muchas formas de muerte celular necrotica in vivo realmente pueden describirse como una serie regulada de
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acontecimientos de disgregacion celular dependiente de ATP, es decir, necrosis programada siguiendo rutas especfficas denominadas necroptosis (7, 46). Por tanto, un posible papel para la A1M es participar en la conservacion de la funcion mitocondrial tanto en celulas apoptoticas como necroptoticas y posiblemente otros tipos de celulas necroticas durante la muerte celular no autofagica, con el fin de determinar la disponibilidad de ATP para los procesos de degradacion celular dependiente de energfa.
No se conoce el mecanismo de proteccion de la estructura y funcion mitocondriales. A la AIM se le ha atribuido una funcion antioxidante basada en su reductasa, y propiedades de union de hemo y radicales (2, 53). Por tanto, puede especularse que estas propiedades estan implicadas en los efectos protectores. Alternativamente, puesto que la AIM parece ser un componente endogeno de al menos uno de los complejos de protefnas grandes (complejo I) puede tener un efecto estructuralmente estabilizante sobre el complejo. Durante la apoptosis, la necroptosis y otras formas de muerte celular, la union adicional de AIM exogena puede ser necesaria para mantener la estructura y funcion fisicoqufmicas del complejo de protefnas respiratorio. Otra posibilidad es que la union de AIM al complejo I pueda tener efectos beneficiosos sobre otros componentes de la membrana interna mitocondrial, tal como protefnas de poros o lfpidos de membrana.
Se investigaron las interacciones entre AIM y mitocondrias y se observo una union especffica en varios tipos celulares diferentes, es decir, celulas sangufneas humanas de origen linfocftico, mielocftico y leucocftico, queratinocitos humanos, y mitocondrias de hfgado de raton aisladas. Tomados juntos, los resultados sugieren que las interacciones y los efectos protectores estudiados en este caso pueden generalizarse a todos los tipos de celulas.
Tal como se notifica en el presente documento, se encontro que la AIM interacciona con cuatro protefnas diferentes: la subunidad NDUFAB1 en la parte hidrofoba del complejo NADH deshidrogenasa (45), N-acetilglucosamina cinasa (18), la protefna de union a ARNnp LSm5 (40), y un antfgeno canceroso, NY-CO-3 (42). Ninguna de las cuatro protefnas era un falso positivo, es decir, que interacciona con la protefna de fusion cebo de union a ADN o con cualquier protefna fusionada a ella. Por tanto, se consideraron los candidatos como protefnas de interaccion con A1M verdaderas en el sistema de doble hfbrido de levadura. Considerando que ocho de los once clones aislados mediante el sistema de doble hfbrido de levadura eran la misma subunidad del complejo I, se considero esta protefna como la mas interesante de las protefnas y por tanto se eligio como diana de investigaciones adicionales. Se confirmo tambien la union a mitocondrias mediante enfoques metodologicos alternativos y pudo atribuirse un papel funcional de la asociacion como compatible con la funcion antioxidante de la A1M. Sin embargo, puede especularse sobre las implicaciones fisiologicas de la union de A1M a N-acetilglucosamina cinasa, la protefna de union a ARNnp LSm5 y NY-CO-3. Estas protefnas se ubican en el citosol, nucleo y membrana plasmatica, respectivamente, y el papel de la union a estas protefnas puede ser ubicar la A1M internalizada en otros compartimentos celulares ademas de las mitocondrias. Otra posibilidad es que la union a estas tres protefnas refleja otras funciones de A1M no relacionadas con antioxidacion y eliminacion de radicales.
La A1M es un miembro de la familia de las protefnas lipocalinas. Las lipocalinas constituyen un grupo funcionalmente diverso de aproximadamente 50 protefnas de bacterias, plantas y animales, que tienen una similitud de secuencia de aminoacidos habitualmente de alrededor del 20-25% y comparten determinadas caracterfsticas comunes estructurales que indican un origen evolutivo comun (11, 12, 51). De manera interesante, dos lipocalinas encontradas en plantas y algas verdes, violaxantina desepoxidasa (VDE) y zeaxtantina epoxidasa (ZDE), se ubican en las membranas de los tilacoides de cloroplastos, los organulos fotosinteticos que producen ATP de plantas, en los que se asocian con el sistema captador de luz II y participan en el sistema de fotoproteccion de xantofila (revisado en (14)). Hay un paralelismo obvio entre el ciclo de proteccion de violaxantina y los resultados en este documento: la presencia de un sistema de proteccion basado en lipocalinas en los organulos de conversion de energfa tanto de plantas como de animales. Hipotetizando que las mitocondrias y cloroplastos tienen un especie primitiva procariota o eucariota comun (veanse (15, 30, 50)), puede especularse que estos dos sistemas de lipocalinas estan relacionados evolutivamente.
Cuando se somete una celula a una lesion fatal se degradara en ultimo instancia y sus componentes se reciclaran. Esto es habitualmente un proceso que consume energfa y altamente complejo que es necesario controlar de manera meticulosa con el fin de proteger el ambiente circundante, es decir, tejido y celulas vecinas, frente a un dano adicional. La conservacion y el mantenimiento de la maquinaria de energfa mitocondrial durante este proceso son vitales. Se muestra que la A1M de glicoprotefna de plasma y tejido puede tener un papel fundamental en el mantenimiento de la produccion de energfa mitocondrial y ayudar simultaneamente a la cadena respiratoria y evitar de ese modo reacciones destructivas no deseadas con tejido sano. Por tanto, estos hallazgos sugieren un mecanismo novedoso de mantenimiento de la homeostasis mitocondrial.
En el presente contexto el termino “alfa-1-microglobulina” pretende cubrir la alfa-1-microglobulina tal como se identifica en SEQ ID NO: 1 (A1M humana) asf como SEQ ID NO: 2 (A1M recombinante humana) asf como homologos, fragmentos o variantes de las mismas que tienen actividades terapeuticas similares. En un aspecto preferido, la alfa-1-microglobulina es segun SEQ ID NO: 1 o 2 tal como se identifica en el presente documento. En la lista de secuencias se proporciona la lista de secuencias de la secuencia de aminoacidos de A1M humana y A1M recombinante humana (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) y las correspondientes secuencias de nucleotidos (SEQ
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ID NO 3 y 4, respectivamente).
Tal como se menciono anteriormente tambien pueden usarse homologos de AIM segun la descripcion en el presente documento. En teorfa puede usarse AIM de todas las especies incluyendo la mas primitiva encontrada hasta ahora, que es de pez (platija). La AIM tambien esta disponible en forma aislada de ser humano, rata, raton, conejo, cobaya, vaca y platija.
Considerando los homologos, variantes y fragmentos de AIM, se han identificado los siguientes como partes importantes de la protefna:
Y22 (tirosina, pos. 22, pares de bases 64-66)
C34 (cistefna, posicion 34, pares de bases 100-102)
K69 (lisina, pos. 69, pares de bases 205-207)
K92 (lisina, pos. 92, pares de bases 274-276)
K118 (lisina, pos. 118, pares de bases 352-354)
K130 (lisina, pos. 130, pares de bases 388-390)
Y132 (tirosina, pos. 132, pares de bases 394-396)
L180 (leucina, pos. 180, pares de bases 538-540)
I181 (isoleucina, pos. 181, pares de bases 541-543)
P182 (prolina, pos. 182, pares de bases 544-546)
R183 (arginina, pos. 183, pares de bases 547-549)
(La numeracion de aminoacidos y nucleotidos a lo largo de todo el documento se refiere a SEQ ID 1 y 3; si es otra A1M de otra especie, se emplean analogos de A1M o secuencias recombinantes de los mismos, un experto en la tecnica sabra como identificar los aminoacidos del/de los sitio(s) activo(s) o sitio(s) responsable(s) de la actividad enzimatica).
En particular se ha observado que el efecto protector celular de A1M depende del grupo tiolilo libre de la cadena lateral C34 y se regula por los residuos K92, K118 y K130. Por tanto, se cree que los analogos de A1M que contienen estas partes de la protefna y/o configurados de manera similar tienen efectos similares a los de la A1M y por tanto, estan abarcados por la presente invencion.
La A1M humana esta sustituida con oligosacaridos en tres posiciones, dos de tipo complejo sialilados, probablemente de hidratos de carbono diantenarios unidos a Asn17 y Asn96 y un oligosacarido mas sencillo unido a Thr5. El contenido en hidratos de carbonos de protefnas A1M de diferentes especies varfa mucho, aunque, oscilando de nada de glicosilacion en absoluto en Xenopus leavis pasando por un espectro de diferentes patrones de glicosilacion. Sin embargo, un sitio de glicosilacion, correspondiente a Asn96 en el hombre, se conserva en mamfferos, lo que sugiere que este hidrato de carbono especffico puede ser funcionalmente importante.
La A1M es de color amarillo pardo cuando se purifica a partir de plasma u orina. El color esta provocado por compuestos heterogeneos unidos de manera covalente a diversos grupos laterales de aminoacidos ubicados principalmente en la entrada en la bolsa. Estas modificaciones representan probablemente los productos de degradacion oxidados de oxidantes organicos atrapados de manera covalente por A1M in vivo, por ejemplo radicales hemo, quinurenina y tirosilo.
La A1M tambien es heterogenea en carga y tamano y las moleculas de A1M de color mas altamente marron estan cargadas mas negativamente. La probable explicacion para la heterogeneidad es que diferentes grupos laterales se modifican en un grado variable con diferentes radicales, y que las modificaciones alteran la carga neta de la protefna. Se han ubicado las sustancias coloreadas unidas de manera covalente en Cys34 y Lys92, Lys118 y Lys130, la ultima con masas moleculares de entre 100 y 300 Da. Se encontro el metabolito de triptofano quinurenina unido de manera covalente a residuos lisilo en A1M de orina de pacientes en hemodialisis y parece ser la fuente del color marron de la protefna en este caso. Fragmentos oxidados del radical sintetico ABTS (acido 2,2'-azino-di-(3- etilbenzotiazolin)-6-sulfonico) estaban unidos a las cadenas laterales de Y22 e Y132.
C34 es el centro reactivo de A1M. Se vuelve muy electronegativo, lo que significa que tiene un alto potencial para donar electrones, por la proximidad de las cadenas laterales cargadas positivamente de K69, K92, K118 y K130, que
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inducen una desprotonizacion del grupo tiol de C34. Los datos preliminares muestran que C34 es uno de los grupos mas electronegativos conocidos.
Teoricamente, los aminoacidos que caracterizan las propiedades enzimaticas y no enzimaticas unicas de AIM (C34, Y22, K92, K118, K130, Y132, l1 80, I181, P182, R183), que se describiran en mas detalle a continuacion, pueden disponerse en una configuracion tridimensional similar en otro entramado, por ejemplo una protefna con el mismo plegamiento global (otra lipocalina) o una molecula organica o inorganica completamente artificial tal como un polfmero de plastico, una nanopartfcula o un polfmero metalico.
Por consiguiente, se prefieren homologos, fragmentos o variantes que comprenden una estructura que incluye el centro reactivo y sus alrededores tal como se describio anteriormente.
Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de los polipeptidos de esta descripcion y aun dan como resultado una molecula que tiene caracterfsticas similares a las del polipeptido (por ejemplo, una sustitucion de aminoacidos conservativa). Por ejemplo, determinados aminoacidos pueden sustituirse por otros aminoacidos en una secuencia sin perdida apreciable de actividad. Debido a que son la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipeptido las que definen la actividad funcional biologica del polipeptido, pueden hacerse determinadas sustituciones de secuencia de aminoacidos en una secuencia de polipeptidos y aun asf obtener un polipeptido con propiedades similares.
Al hacer tales cambios, puede considerarse el fndice hidropatico de aminoacidos. La importancia del fndice hidropatico de aminoacidos a la hora de conferir una funcion biologica interactiva a un polipeptido se entiende en general en la tecnica. Se sabe que pueden sustituirse determinados aminoacidos por otros aminoacidos que tienen una puntuacion o fndice hidropatico similar y aun dar como resultado un polipeptido con actividad biologica similar. A cada aminoacido se le ha asignado un fndice hidropatico basandose en sus caracterfsticas de hidrofobicidad y carga. Los indices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistefna/cistefna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se cree que el caracter hidropatico relativo del aminoacido determina la estructura secundaria del polipeptido resultante, que a su vez define la interaccion del polipeptido con otras moleculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antfgenos y similares. Se conoce en la tecnica que un aminoacido puede sustituirse por otro aminoacido que tiene un fndice hidropatico similar y obtener aun un polipeptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ± 2, se prefieren particularmente los que estan dentro de ± 1 e incluso se prefieren mas particularmente los que estan dentro de ± 0,5. La sustitucion de aminoacidos similares tambien puede realizarse basandose en hidrofilicidad, particularmente cuando se pretende que el peptido o polipeptido equivalente biologicamente funcional creado de ese modo sea para su uso en realizaciones inmunologicas. Se han asignando los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoacido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistefna (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Se entiende que un aminoacido puede sustituirse por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y obtener aun un polipeptido biologicamente equivalente y, en particular, uno inmunologicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos valores de hidrofilicidad estan dentro de ± 2, se prefieren particularmente los que estan dentro de ± 1 e incluso se prefieren mas particularmente los que estan dentro de ± 0,5.
Tal como se resumio anteriormente, las sustituciones de aminoacidos se basan en general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoacido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamano y similares. Los expertos en la tecnica conocen bien las sustituciones a modo de ejemplo que toman en consideracion una o mas de las caracterfsticas anteriores e incluyen, pero no se limitan a (residuo original: sustitucion a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Trp: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Lle, Leu). Por tanto las realizaciones de esta divulgacion contemplan equivalentes funcionales o biologicos de un polipeptido tal como se expuso anteriormente. En particular, las realizaciones de los polipeptidos pueden incluir variantes que tienen aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% y el 95% de identidad de secuencia con el polipeptido de interes.
En el presente contexto, la homologfa entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de acido nucleico se describe por el parametro “identidad”. Las alineaciones de secuencias y el calculo de puntuaciones de homologfa pueden realizarse usando una alineacion de Smith-Waterman completa, util para alineaciones tanto de protefna como de ADN. Las matrices de puntuacion por defecto BLOSUM50 y la matriz de identidad se usan para las alineaciones de protefna y ADN respectivamente. La penalizacion para el primer residuo en un hueco es de -12 para protefnas y de -16 para ADN, mientras que la penalizacion para residuos adicionales en un hueco es de -2 para protefnas y -4 para ADN. La alineacion puede realizarse con el paquete FASTA version v20u6.
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Multiples alineaciones de secuencias de protefnas pueden realizarse usando “ClustalW”. Multiples alineaciones de secuencias de ADN pueden realizarse usando la alineacion de protefna como molde, reemplazando los aminoacidos con el correspondiente codon de la secuencia de ADN.
Alternativamente puede usarse un software diferente para alinear secuencias de aminoacidos y secuencias de ADN. La alineacion de dos secuencias de aminoacidos se determina por ejemplo usando el programa Needle del paquete EMBOSS (
http://emboss.org) version 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineacion global descrito. La matriz de sustitucion usada es BLOSUM62, la penalizacion por abertura de hueco es de 10 y la penalizacion por extension de hueco es de 0,5.
http://emboss.org) version 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineacion global descrito. La matriz de sustitucion usada es BLOSUM62, la penalizacion por abertura de hueco es de 10 y la penalizacion por extension de hueco es de 0,5.
El grado de identidad entre una secuencia de aminoacidos; por ejemplo SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoacidos diferente (por ejemplo SEQ ID NO: 2) se calcula como el numero de coincidencias exactas en una alineacion de las dos secuencias, dividido entre la longitud de la “SEQ ID NO: 1” o la longitud de la “SEQ ID NO: 2”, cualquiera que sea la mas corta. El resultado se expresa en la identidad en porcentaje.
Una coincidencia exacta se produce cuando las dos secuencias tienen residuos de aminoacido identicos en las mismas posiciones de la superposicion.
Si es relevante, el grado de identidad entre dos secuencias de nucleotidos puede determinarse mediante el metodo Wilbur-Lipman usando el software LASER-GENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parametros de alineacion multiples: penalizacion de hueco de 10 y penalizacion por longitud de hueco de 10.
Los parametros de alineacion por pares son Ktuple=3, penalizacion de hueco=3, y ventanas=20. En una realizacion particular, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoacidos de un polipeptido con, o con respecto a, aminoacidos de SEQ ID NO: 1 se determina i) alineando las dos secuencias de aminoacidos usando el programa Needle, con la matriz de sustitucion BLOSUM62, una penalizacion por abertura de hueco de 10 y una penalizacion por extension de hueco de 0,5; ii) contando el numero de coincidencias exactas en la alineacion; iii) dividiendo el numero de coincidencias exactas entre la longitud de la mas corta de las dos secuencias de aminoacidos, y iv) convirtiendo el resultado de la division de iii) en porcentaje. El porcentaje de identidad con respecto a, o con, otras secuencias de la invencion se calcula de manera analoga.
A modo de ejemplo, una secuencia de polipeptido puede ser identica a la secuencia de referencia, es decir ser identica al 100%, o puede incluir hasta un determinado numero entero de alteraciones de aminoacido en comparacion con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad es menos del 100%. Tales alteraciones se seleccionan de: al menos una delecion, sustitucion (incluyendo sustitucion conservativa y no conservativa) o insercion de aminoacido, y en las que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo- terminales de la secuencia de polipeptido de referencia o en cualquier sitio entre las posiciones terminales de las mismas, intercaladas o bien individualmente entre los aminoacidos en la secuencia de referencia, o bien en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Las variantes de aminoacidos conservativas tambien pueden comprender residuos de aminoacido que no se producen de manera natural. Los aminoacidos que no se producen de manera natural incluyen, sin limitacion, trans- 3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metil-glicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxi-etilcistefna, hidroxietilhomocistefna, nitro-glutamina, homoglutamina, acido pipecolico, acido tiazolidincarboxflico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenil-alanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen en la tecnica varios metodos para incorporar residuos de aminoacido que no se producen de manera natural en protefnas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido usando ARNt supresores qufmicamente aminoacilados. Se conocen en la tecnica metodos para sintetizar aminoacidos y aminoacilar ARNt. Se llevan a cabo transcripcion y traduccion de plasmidos que contienen mutaciones sin sentido en un sistema libre de celulas que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas disponibles comercialmente y otros reactivos. Se purifican protefnas mediante cromatograffa. En un segundo metodo, la traduccion se lleva a cabo en Xenopus oocytes mediante microinyeccion de ARNm mutado y ARNt supresores qufmicamente aminoacilados. Dentro de un tercer metodo, se cultivan celulas de E. coli en ausencia de un aminoacido natural que va a reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del/de los aminoacido(s) que no se produce(n) de manera natural deseado(s) (por ejemplo, 2- azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoacido que no se produce de manera natural se incorpora en la protefna en lugar de su homologo natural. Los residuos de aminoacido que se producen de manera natural pueden convertirse en especies que no se producen de manera natural mediante modificacion qufmica in vitro. La modificacion qufmica puede combinarse con mutagenesis dirigida a un sitio para expandir adicionalmente el rango de sustituciones. Las estructuras qufmicas alternativas que proporcionan una estructura tridimensional suficiente para soportar las propiedades antioxidantes de A1M pueden proporcionarse mediante otras tecnologfas por ejemplo armazones artificiales, sustituciones de aminoacidos y similares. Ademas, las estructuras que imitan los sitios activos de A1M tal como se listan anteriormente y se representan en las figuras 3 y 6 se contemplan como que tienen la misma funcion que A1M.
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AIM para su uso en enfermedades relacionadas con mitocondrias especificas
Mas especfficamente, la invencion se refiere a AIM para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con mitocondrias seleccionada de lo siguiente:
• enfermedad de Alpers (poliodistrofia infantil progresiva)
• sfndrome de Barth (cardiomiopatfa infantil letal)
• defectos de la beta-oxidacion
• cardiomiopatfa
• deficiencia de carnitina-acilcarnitina
• deficiencia de carnitina
• sfndromes de deficiencia de creatina (sfndromes de deficiencia de creatina cerebral (CCDS) incluye: deficiencia de guanidinoacetato metiltransferasa (deficiencia de GAMT), deficiencia de L-arginina:glicina amidinotransferasa (deficiencia de AGAT) y deficiencia de transportador de creatina relacionada con SLC6A8 (deficiencia de SLC6A8).
• deficiencia de la coenzima Q10
• deficiencia del complejo I (deficiencia de NADH deshidrogenasa (NADH-CoQ reductasa))
• deficiencia del complejo II (deficiencia de succinato deshidrogenasa)
• deficiencia del complejo III (deficiencia de ubiquinona-citocromo c oxidorreductasa)
• deficiencia del complejo IV/deficiencia de COX (la deficiencia de citocromo c oxidasa se provoca por un defecto en el complejo IV de la cadena respiratoria)
• deficiencia del complejo V (deficiencia de ATP sintasa)
• deficiencia de COX
• CPEO (sfndrome de oftalmoplejfa externa progresiva cronica)
• deficiencia de CPT I
• deficiencia de CPT II
• ataxia de Friedreich (FRDA o FA)
• encefalomiopatfa
• aciduria glutarica tipo II
• KSS (sfndrome de Kearns-Sayre)
• acidosis lactica
• LCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga)
• LCHAD
• enfermedad o sfndrome de Leigh (encefalomielopatfa necrotizante subaguda)
• LHON (neuropatfa optica hereditaria de Leber)
• enfermedad de Luft
• MCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media)
• MELAS (encefalomiopatfa mitocondrial, acidosis lactica y episodios similares a accidente cerebrovascular)
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• MERRF (epilepsia mioclonica y enfermedad de fibras rojas rasgadas)
• MIRAS (sfndrome ataxico mitocondrial recesivo)
• citopatfa mitocondrial
• deplecion de ADN mitocondrial
• encefalopatfa mitocondrial incluye: encefalomiopatfa, encefalomielopatfa
• miopatfa mitocondrial
• MNGIE (trastorno mioneurogastrointestinal y encefalopatfa)
• NARP (neuropatfa, ataxia y retinitis pigmentosa)
• sfndrome de Pearson
• deficiencia de piruvato carboxilasa
• deficiencia de piruvato deshidrogenasa
• mutaciones de POLG
• deficiencias de la cadena respiratoria
• SCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta)
•SCHAD
• VLCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga)
Con referencia a la informacion de la pagina web de United Mitochondrion Disease Foundation, algunas de las enfermedades mencionadas anteriormente se discuten en mas detalle a continuacion:
Deficiencia del complejo 1: En el interior de la mitocondria hay un grupo de protefnas que llevan electrones a lo largo de cuatro reacciones en cadena (complejos I-IV), que dan como resultado la produccion de energfa. Esta cadena se conoce como la cadena de transporte de electrones. Un quinto grupo (complejo V) genera la ATP. Juntas, la cadena de transporte de electrones y la ATP sintasa forman la cadena respiratoria y el proceso completo se conoce como fosforilacion oxidativa u OXPHOS.
El complejo I, la primera etapa en esta cadena, es el sitio mas comun para anomalfas mitocondriales, representando hasta un tercio de las deficiencias de la cadena respiratoria. Presentandose a menudo en el nacimiento o en la infancia temprana, la deficiencia del complejo I es habitualmente un trastorno neurodegenerativo progresivo y es responsable de una variedad de sfntomas clfnicos, particularmente en organos y tejidos que requieren altos niveles de energfa, tales como cerebro, corazon, hfgado y musculos esqueleticos. Se han asociado varios trastornos mitocondriales especfficos con deficiencia del complejo I incluyendo: neuropatfa optica hereditaria de Leber (LHON), MELAS, MERRF y sfndrome de Leigh (LS).
Hay tres formas principales de deficiencia del complejo I:
i) Trastorno multisistemico infantil fatal - caracterizado por falta de tono muscular, retraso en el desarrollo, enfermedad cardfaca, acidosis lactica e insuficiencia respiratoria.
ii) Miopatfa (enfermedad muscular) - comienza en la infancia o en la edad adulta, y caracterizada por debilidad o intolerancia al ejercicio.
iii) Encefalomiopatfa mitocondrial (enfermedad cerebral y muscular) - comienza en la infancia o en la edad adulta e implica combinaciones de sfntomas variables que pueden incluir: paralisis muscular del ojo, retinopatfa pigmentaria (cambios de color de la retina con perdida de vision), perdida de audicion, neuropatfa sensorial (dano en el nervio que implica los organos sensoriales), convulsiones, demencia, ataxia (coordinacion muscular anomala) y movimientos involuntarios. Esta forma de deficiencia del complejo I puede provocar sfndrome de Leigh y MELAS.
La mayor parte de los casos de deficiencia del complejo I resultan de herencia recesiva autosomica (combinacion de genes nucleares defectuosos tanto de la madre como del padre). Con menos frecuencia, el trastorno se hereda de la madre o es esporadico y el defecto genetico esta en el ADN mitocondrial.
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Tratamiento: Como con todas las enfermedades mitocondriales, actualmente no hay cura para la deficiencia del complejo I. Una variedad de tratamientos, que pueden o no ser eficaces, puede incluir terapias metabolicas tales como: riboflavina, tiamina, biotina, coenzima Q10, carnitina y la dieta cetogenica. Las terapias para la forma multisistemica infantil no han sido satisfactorias.
La evolucion clfnica y el pronostico para los pacientes con deficiencia del complejo I son sumamente variables y pueden depender del defecto genetico especffico, la edad de aparicion, los organos implicados y otros factores.
Deficiencia del complejo III: Los sfntomas incluyen cuatro formas principales:
i) Encefalomiopatfa infantil fatal, acidosis lactica congenita, hipotension, postura distrofica, convulsiones y coma. Fibras rojas rasgadas comunes.
ii) Encefalomiopatfas de inicio tardfo (de la infancia a la vida adulta): diversas combinaciones de debilidad, baja estatura, ataxia, demencia, perdida de audicion, neuropatfa sensorial, retinopatfa pigmentaria y signos piramidales. Fibras rojas rasgadas comunes. Posible acidosis lactica.
iii) Miopatfa, con intolerancia al ejercicio que evoluciona a debilidad fija. Fibras rojas rasgadas comunes. Posible acidosis lactica.
iv) Cardiomiopatfa histiocitoide infantil.
Deficiencia del complejo IV/Deficiencia de COX: Los sfntomas incluyen dos formas principales:
1. Encefalomiopatfa: Normalmente normal durante los primeros 6 a 12 meses de vida y luego muestra regresion de desarrollo, ataxia, acidosis lactica, atrofia optica, oftalmoplejfa, nistagmo, distoma, signos piramidales y problemas respiratorios. Convulsiones frecuentes. Puede provocar sfndrome de Leigh.
2. Miopatfa: Dos variantes principales:
1. Miopatfa infantil fatal: puede comenzar poco despues del nacimiento e ir acompanada de hipotension, debilidad, acidosis lactica, fibras rojas rasgadas, insuficiencia respiratoria y problemas renales.
2. Miopatfa infantil benigna: puede comenzar poco despues del nacimiento e ir acompanada de hipotension, debilidad, acidosis lactica, fibras rojas rasgadas, problemas respiratorios, pero (si el nino sobrevive) ir seguida de una mejorfa espontanea.
KSS (sfndrome de Kearns-Sayre): El KSS es una enfermedad mitocondrial multisistemica lentamente progresiva que a menudo comienza con la cafda de los parpados (ptosis). Otros musculos del ojo eventualmente llegan a estar implicados, dando como resultado paralisis del movimiento del ojo. La degeneracion de la retina habitualmente provoca dificultad para ver en ambientes con poca luz.
El KSS se caracteriza por tres caracterfsticas principales:
• aparicion tfpica antes de los 20 anos de edad aunque puede producirse en la lactancia o en la edad adulta
• paralisis de musculos del ojo especfficos (denominada oftalmoplejfa externa progresiva cronica - CPEO)
• degeneracion de la retina que provoca acumulacion anomala de material pigmentado (coloreado) (retinopatfa pigmentaria).
Ademas, uno o mas de los siguientes estados esta presente:
• bloqueo de senales electricos en el corazon (defectos de la conduccion cardiaca)
• protefna del lfquido cefalorraqufdeo elevada
• incoordinacion de movimientos (ataxia).
Los pacientes con KSS tambien pueden tener problemas tales como sordera, demencia, disfuncion renal y debilidad muscular. Anomalfas endocrinas incluyendo retardo del crecimiento, baja estatura o diabetes tambien pueden ser evidentes.
El KSS es un trastorno raro. Se provoca habitualmente por una delecion (perdida) grande simple de material
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genetico dentro del ADN de las mitocondrias (ADNmt), en vez de en el ADN del nucleo celular. Estas deleciones, de las que hay mas de 150 especies, surgen normalmente de manera espontanea. Con menos frecuencia, la mutacion se transmite por la madre.
Como con todas las enfermedades mitocondriales, no hay cura para el KSS.
Los tratamientos se basan en los tipos de sfntomas y organos implicados, y pueden incluir: coenzima Q10, insulina para diabetes, farmacos cardfacos y un marcapasos cardfaco que puede salvar vidas. Puede considerarse la intervencion quirurgica para la cafda de los parpados, pero debe llevarse a cabo por especialistas en centros quirurgicos oftalmicos.
El KSS es lentamente progresivo y el pronostico varfa dependiendo de la gravedad. La muerte es comun en la tercera o cuarta decada y puede deberse a fallos organicos.
Enfermedad o sfndrome de Leigh (encefalomielopatfa necrotizante subaguda): Sfntomas: convulsiones, hipotension, fatiga, nistagmo, escasos reflejos, dificultades para comer y tragar, problemas respiratorios, escasa funcion motora y ataxia.
Causas: deficiencia de piruvato deshidrogenasa, deficiencia del complejo I, deficiencia del complejo II, deficiencia del complejo IV/COX, NARP.
La enfermedad de Leigh es un trastorno neurometabolico progresivo con una aparicion general en la lactancia o la ninez, a menudo tras una infeccion viral, pero tambien puede producirse en adolescentes y adultos. Se caracteriza en MRI por lesiones necrotizantes visibles (tejido muerto o que esta muriendo) en el cerebro, particularmente en el mesencefalo y troncoencefalo.
El nino a menudo parece normal en el nacimiento, pero normalmente comienza a presentar sfntomas en el plazo de pocos meses a dos anos de edad, aunque el tiempo puede ser mucho mas temprano o mas tarde. Los sfntomas iniciales pueden incluir la perdida de habilidades basicas tales como succion, control de la cabeza, andar y hablar. Esto puede ir acompanado de otros problemas tales como irritabilidad, perdida de apetito, vomitos y convulsiones. Puede haber periodos de fuerte descenso o restablecimiento temporal de algunas funciones. Eventualmente, el nino tambien puede tener complicaciones cardfacas, renales, de la vision y respiratorias.
Hay mas de un defecto que provoca la enfermedad de Leigh. Esto incluye una deficiencia en piruvato deshidrogenasa (PDHC), y defectos de la enzima de la cadena respiratoria - complejos I, II, IV y V. Dependiendo del defecto, el modo de herencia puede ser dominante ligado a cromosoma X (defecto del cromosoma X y la enfermedad se produce habitualmente en hombres solo), recesivo autosomico (heredado de genes tanto de la madre como del padre) y materno (de la madre solo). Tambien puede haber casos espontaneos que no son heredados en absoluto.
No hay cura para la enfermedad de Leigh. Los tratamientos implican en general variaciones de terapias con vitaminas y complementos, a menudo en una combinacion “coctel” y son solo parcialmente eficaces. Diversos sitios de recursos incluyen el posible uso de: tiamina, coenzima Q10, riboflavina, biotina, creatina, succinato e idebenona. Tambien estan probandose farmacos experimentales, tales como dicloroacetato (DCA) en algunas clfnicas. En algunos casos, puede ordenarse una dieta especial y debe monitorizarse por parte de un dietista con conocimientos de trastornos metabolicos.
El pronostico para la enfermedad de Leigh es malo. Dependiendo del defecto, los individuos normalmente viven desde pocos anos hasta la mitad de la adolescencia. Los diagnosticados con sfndrome similar a Leigh o quien no presenta sfntomas hasta la edad adulta tiende a vivir mas.
MELAS (encefalomiopatfa mitocondrial, acidosis lactica y episodios similares a accidente cerebrovascular): Sfntomas: baja estatura, convulsiones, episodios similares a accidente cerebrovascular con deficits neurologicos focalizados, dolores de cabeza recurrentes, regresion cognitiva, progresion de la enfermedad, fibras rojas rasgadas.
Causa: Mutaciones puntuales de ADN mitocondrial: A3243G (la mas comun). MELAS - Miopatfa mitocondrial (debilidad muscular), encefalopatfa (enfermedad cerebral y del sistema nervioso central), acidosis lactica (acumulacion de un producto de residuo celular) y episodios similares a accidente cerebrovascular (paralisis parcial, perdida parcial de la vision u otras anomalfas neurologicas).
MELAS es un trastorno neurodegenerativo progresivo con aparicion tfpica entre las edades de 2 y 15, aunque puede producirse en la lactancia o hasta en la edad adulta. Los sfntomas iniciales pueden incluir episodios similares a accidente cerebrovascular, convulsiones, migranas y vomitos recurrentes.
Habitualmente, el paciente parece normal durante la lactancia, aunque la baja estatura es comun. Menos comunes son los sfntomas en la lactancia temprana que pueden incluir retraso en el desarrollo, dificultades de aprendizaje o
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trastorno por deficit de atencion. La intolerancia al ejercicio, debilidad de las extremidades, perdida de audicion y diabetes tambien pueden preceder a la aparicion de los episodios similares a accidente cerebrovascular.
Los episodios similares a accidente cerebrovascular, a menudo acompanados de convulsiones, son el sfntoma distintivo de MELAS y provocan paralisis parcial, perdida de la vision y defectos neurologicos focales. Los defectos acumulativos graduales de estos episodios a menudo dan como resultado combinaciones variables de perdida de habilidades motoras (habla, movimiento y alimentacion), sensacion alterada (perdida de la vision y perdida de las sensaciones corporales) y empeoramiento mental (demencia). Los pacientes con MELAS tambien pueden padecer sfntomas adicionales incluyendo: debilidad muscular, disfuncion de nervios perifericos, diabetes, perdida de audicion, problemas cardiacos y renales y anomalfas digestivas. El acido lactico habitualmente se acumula a altos niveles en la sangre, el lfquido cefalorraqufdeo o ambos.
MELAS se hereda de la madre debido a un defecto en el ADN dentro de las mitocondrias. Hay al menos 17 mutaciones diferentes que pueden provocar MELAS. De lejos la mas prevalente es la mutacion A3243G, que es responsable de aproximadamente el 80% de los casos.
No hay cura o tratamiento especffico para MELAS. Aunque ensayos clfnicos no han demostrado su eficacia, los tratamientos generales pueden incluir terapias metabolicas tales como: CoQ10, creatina, filoquinona y otras vitaminas y complementos. Pueden requerirse farmacos tales como medicamentos contra las convulsiones e insulina para el tratamiento de sfntomas adicionales. Algunos pacientes con disfuncion muscular pueden beneficiarse de ejercicio supervisado moderado. En determinados casos, otras terapias que pueden recomendarse incluyen dicloroacetato (DCA) y menadiona, aunque estos no se usan de manera rutinaria debido a su potencial para tener efectos secundarios perjudiciales.
El pronostico para MELAS es malo. Normalmente, la edad de muerte es de entre 10 y 35 anos, aunque algunos pacientes pueden vivir mas. La muerte puede venir como resultado de perdida de masa corporal general debido a demencia progresiva y debilidad muscular, o complicaciones a partir de otros organos afectados tales como corazon o rinones.
MERRF es un sfndrome multisistemico progresivo que habitualmente comienza en la infancia, pero la aparicion puede producirse en la edad adulta. La tasa de progresion varfa ampliamente. La aparicion y el grado de los sfntomas pueden diferir entre hermanos afectados.
Las caracterfsticas clasicas de MERRF incluyen:
• miocloma (espasmos musculares breves, repentinos, de contraccion) - el sfntoma mas caracterfstico
• convulsiones epilepticas
• ataxia (coordinacion alterada)
• fibras rojas rasgadas (una anomalfa microscopica caracterfstica observada en la biopsia muscular de pacientes con MERRF y otros trastornos mitocondriales). Los sfntomas adicionales pueden incluir: perdida de audicion, acidosis lactica (nivel de acido lactico elevado en la sangre), baja estatura, intolerancia al ejercicio, demencia, defectos cardiacos, anomalfas oculares y empeoramiento de la habla.
Aunque unos pocos casos de MERRF son esporadicos, la mayorfa de los casos se heredan de la madre debido a una mutacion dentro de las mitocondrias. La mutacion de MERRF mas comun es A8344G, que representa mas del 80% de los casos (artfculo de GeneReview). Se ha notificado que otras cuatro mutaciones de ADN mitocondrial provocan MERRF. Aunque una madre transmitira su mutacion de MERRF a todos sus hijos, algunos puede que nunca presenten sfntomas.
Como con todos los trastornos mitocondriales, no hay cura para MERRF. Las terapias pueden incluir la coenzima Q10, L-carnitina y diversas vitaminas, a menudo en una combinacion “coctel”. El tratamiento de las convulsiones habitualmente requiere farmacos anticonvulsivos. Tambien pueden ser necesarios medicamentos para el control de otros sfntomas.
El pronostico para MERRF varfa ampliamente dependiendo de la edad de aparicion, el tipo y la gravedad de sfntomas, los organos implicados y otros factores.
Depletion de ADN mitocondrial: Los sfntomas incluyen tres formas principales:
1. Miopatfa congenita: Debilidad neonatal, hipotension que requiere ventilacion asistida, posible disfuncion renal. Acidosis lactica grave. Fibras rojas rasgadas prominentes. La muerte debido a insuficiencia respiratoria habitualmente se produce antes de un ano de edad.
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2. Miopatfa infantil: Tras el desarrollo temprano normal hasta un ano de edad, aparece debilidad y empeora rapidamente, provocando insuficiencia respiratoria y muerte normalmente en el plazo de pocos anos.
3. Hepatopatfa: Hfgado aumentado y fallo renal intratable, miopatfa. Acidosis lactica grave. La muerte es normal en el plazo del primer ano.
La invencion se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento de una enfermedad relacionada con mitocondrias. La enfermedad puede ser una cualquiera de las enfermedades especificadas en el presente documento o bien como una unica enfermedad o bien en cualquier combinacion de enfermedades especificadas en el presente documento. Por ejemplo, la invencion se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento de una de las enfermedades mencionadas en el presente documento o en el tratamiento de una seleccion de las enfermedades mencionadas en el presente documento sin tener en cuenta si se ha mencionado explfcitamente la seleccion especffica. Por tanto, la seleccion de enfermedades o trastornos puede seleccionarse al azar. La enfermedad puede ser o estar provocada por un defecto mitocondrial o una irregularidad en la funcion mitocondrial.
En particular la invencion se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento o la profilaxis de trastornos de la cadena respiratoria. Mas especfficamente los trastornos de la cadena respiratoria implican los defectos del complejo I, II, III, IV o V.
Mas especfficamente, la invencion se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento o la profilaxis de disfunciones mitocondriales en ninos o jovenes adultos. Los ejemplos incluyen enfermedad de Alpers, sfndrome de Barth, ataxia de Fridreich, KSS, enfermedad o sfndrome de Leigh, LHON, mElAS, MERRF, MIRAS y NARP
Mas especfficamente, la invencion se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento o la profilaxis de disfunciones mitocondriales en mujeres.
La invencion tambien se refiere al uso de alfa-1-microglobulina en el tratamiento o la profilaxis de dano o disfuncion de retina o enfermedades oculares asociadas con defecto(s) o disfuncion(es) mitocondrial(es).
Administracidn terapeutica: La via y/o el modo de administracion de A1M puede variar dependiendo del resultado deseado. Un experto en la tecnica es consciente de que las vfas o modos de administracion, asf como regfmenes, pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica deseada. Las vfas de administracion incluyen, pero no se limitan a, administracion parenteral, enterica, mucosa/topica incluyendo intravenosa, subcutanea, intramuscular, intradermica, intracerebral, oral, peroral, dermica, mediante inhalacion, etc.
La A1M puede formularse en una composicion farmaceutica disenada para el uso particular. Un experto en la tecnica sabra como encontrar orientacion para disenar diversas composiciones farmaceuticas, vease por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. 1990, Mack Publishing.
Para la administracion ocular puede administrarse A1M en una composicion lfquida o en un dispositivo medico incluyendo lentes de contacto u otros insertos oftalmicos. Las composiciones lfquidas incluyen disoluciones, dispersiones, emulsiones y suspensiones y pueden presentarse en forma de colirios o bien en forma de dosis unica o bien en forma de multiples dosis, o puede presentarse como polvos secos para la reconstitucion con un lfquido antes de su aplicacion. La composicion tambien puede presentarse como lociones, cremas, pomadas o geles oculares. Pueden incluirse excipientes farmaceuticamente aceptables tales como disolventes (por ejemplo agua, aceites incluyendo aceites naturales o vegetales como por ejemplo aceite de ricino), un agente de aumento de la viscosidad como goma gellan, goma xantana, poli(alcoholes vinflicos), derivados de celulosa por ejemplo carboximetilcelulosa sodica, metilcelulosa, etc.), conservantes como parabenos o cloruro de benzalconio, agentes de ajuste del pH (por ejemplo acido clorhfdrico, hidroxido de sodio, tampones como fosfato o citrato), agentes de aumento de la estabilidad, agentes de ajuste de la tonicidad (por ejemplo cloruro de sodio), etc.
Para la administracion oral puede formularse A1M en composiciones solidas, semisolidas o lfquidas. Las composiciones pueden estar en forma farmaceutica unitaria o en forma farmaceutica de multiples unidades. Las composiciones incluyen polvos, comprimidos, capsulas, sobres, pelfculas, obleas, geles, cremas, pomadas, disoluciones, dispersiones, emulsiones, suspensiones, pulverizaciones, etc. La composicion incluye uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Tales excipientes (y excipientes para otros tipos de composiciones) se conocen bien por un experto en la tecnica (vease por ejemplo “Remington's Pharmaceutical Science” editado por Gennaro et al. (Mack Publishing Company), en “Handbook of Pharmaceutical Excipients” editado por Rowe et al. (PhP Press) y en monograffas oficiales (por ejemplo Ph.Eur. o USP) relacionadas con excipientes relevantes para tipos de formulacion especffica y para metodos para preparar una formulacion especffica.
La A1M se administra preferiblemente en forma de una composicion farmaceutica. Debido a la naturaleza de polipeptido de A1M las composiciones pueden disenarse preferiblemente para su uso parenteral, pero A1M tambien puede aplicarse localmente por ejemplo en la piel en relacion con cicatrizacion de heridas, en articulaciones, o en las cavidades cerebrales. Puede formularse A1M en un lfquido, por ejemplo en una disolucion, una dispersion, una emulsion, una suspension, etc., o puede estar en una formulacion adecuada para la administracion a la piel tal
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como, por ejemplo, una locion, una crema, una pomada, una suspension, una emulsion, una pasta, un polvo, un parche, un emplasto, un vendaje, un jabon, un champu, locion de proteccion solar, etc. Ademas, puede incluirse AIM en dispositivos o equipos medicos, por ejemplo como recubrimiento liberable en cateteres, etc.
Alternativa y adicionalmente, pueden incluirse portadores especfficos para seleccionar como diana el principio activo a una parte especffica del cuerpo. Por ejemplo un complejo de anticuerpo-AIM en el que el anticuerpo se dirige a la ubicacion de eleccion (“direccionamiento”) por su especificidad para un determinado epftopo; una celula madre o una celula recombinante con tales propiedades de direccionamiento, por ejemplo receptores de integrina especfficos para un tejido y con la capacidad artificial o natural para secretar grandes cantidades de AIM. El tratamiento serfa mas eficiente ya que el farmaco se concentrarfa en un sitio particular, sangrado, etc., y se requerirfa menos A1M.
Para uso parenteral los disolventes adecuados incluyen agua, aceites vegetales, propilenglicol y disolventes organicos aprobados en general para tales fines. En general, un experto en la tecnica puede encontrar orientacion en “Remington's Pharmaceutical Science” editado por Gennaro et al. (Mack Publishing Company), en “Handbook of Pharmaceutical Excipients” editado por Rowe et al. (PhP Press) y en monograffas oficiales (por ejemplo, Ph.Eur. o USP) en relacion con excipientes relevantes para los tipos de formulacion especffica y con metodos para preparar una formulacion especffica.
La invencion se ilustra en las siguientes figuras y ejemplos.
Leyenda de las figuras
Figura 1. Union de AIM a celulas intactas y apoptoticas. A. Se cultivaron celulas HCQ.4 en plasticos recubiertos con anticuerpo de hamster anti-CD3 de raton (4 pg/ml) durante 18 horas. Para el analisis de la union de A1M, se incubaron 1 x 106 celulas con A1M 1 mg/ml, se lavaron, se incubaron con anticuerpos de raton anti-A1M, se lavaron y finalmente se incubaron con anticuerpo de cabra anti-IgG de raton conjugado con FITC (GAM-FITC). Se analizaron 10000 celulas para determinar la union de A1M (pico abierto). Se establecio la referencia mediante celulas incubadas con BSA en la primera etapa (pico sombreado). Se comparo la union a celulas apoptoticas (histograma de la derecha) con celulas sin tratar (histograma de la izquierda). B. Se correlaciono la union de A1M con la captacion de PI mediante cultivo de celulas HCQ.4 en presencia de etanol al 5% o DMSO al 10% durante 15 horas. Para el analisis de citometrfa de flujo, se incubo A1M con celulas, seguido por anticuerpos de raton anti-A1M y anticuerpo de cabra anti-IgG de raton conjugado con FITC. Antes del analisis, se tineron tambien las celulas mediante PI para detectar celulas muertas. C. Se analizo la union de A1M a celulas apoptoticas de la lfnea de celulas pre-B 70Z/3 mediante citometrfa de flujo. Se indujo la apoptosis de las celulas mediante el farmaco de benzamida, declopramida (3-CPA), durante 15 horas y se analizaron para determinar la union de A1M mediante incubacion de A1M biotinilada, seguido por SAPE. Se establecio la referencia mediante celulas incubadas con SAPE solo (pico sombreado). D. Celulas K562 incubadas con A1M 20 pM y 0,25 mg/ml durante 2 h y sometidas a tincion con anticuerpos de raton anti-A1M seguido por fragmentos F(ab')2 de anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (Alexa Fluor® 594; rojo). Se montaron las celulas usando el reactivo ProLong Gold AntiFade con DAPI e inspeccion visual y se realizo el registro. La imagen es representativa para tres experimentos separados. El tamano de la barra es 10 pM. E. Se determino la especificidad de la union de A1M mediante un ensayo de union a celulas competitivo. Se compararon las celulas HCQ.4, en las que se indujo apoptosis mediante reticulacion con anticuerpo anti-CD3 durante 18 horas (histograma de la derecha), con celulas HCQ.4 sin tratar (histograma de la izquierda). Se mezclaron 1x10 celulas/muestra con 1 pg/ml de I-A1M (1), I-A1M mas adicion de 2,5 mg/ml de A1M sin marcar (2), ovoalbumina (3), BSA (4) o AGP (5). Se incubaron las celulas durante 30 minutos a 4°C, se centrifugaron en un gradiente de sacarosa para separar la protefna no unida, entonces se congelaron los tubos y se separo el sedimento celular y se contaron en un contador y. Se presentan los resultados como valores medios de un triplicado a partir de un experimento ± EEM. Se realizo la comparacion estadfstica entre grupos usando la prueba de la t de Student. ***P < 0,001.
Figura 2. Estudios de tiempos de la union de A1M a celulas apoptoticas. A. Se indujo apoptosis en celulas HCQ.4 mediante cultivo sobre plasticos recubiertos con anticuerpo anti-CD3. Se tomaron muestras en diferentes puntos de tiempo tras la induccion (0, 1, 2, 4, 8 y 16 horas). Se tineron las celulas con A1M conjugada con FITC (0,1 mg/ml) y PI. Se analizaron 10000 celulas. B. Se analizo la union de A1M a celulas pre-B, inducidas a apoptosis mediante incubacion con la benzamida 3-CPA, mediante citometrfa de flujo y se correlaciono con la union de anexina V y la captacion de 7AAD. Se incubaron las celulas 70Z/3 apoptoticas con A1M biotinilada (0,025 mg/ml) seguido por SAPE, anexina V y 7AAD. Se analizaron 10000 celulas y se separaron en celulas negativas para 7AAD (diagrama de la izquierda) y celulas positivas para 7AAD (diagrama de la derecha) respectivamente.
Figura 3. Union de A1M a mitocondrias analizada mediante microscopfa confocal y microscopia electronica de transmision. A. Se lavaron celulas K562 incubadas con medio solo (izquierda) o A1M 0,25 mg/ml (derecha) durante 2 h y se incubaron con Mito-Tracker (rojo) durante 15 minutos, y se lavaron en medio fresco. Tras el lavado, entonces se tineron las celulas con anticuerpo de raton monoclonal anti-A1M (BN 11.3) a 5 pg/ml seguido por fragmentos F(ab')2 de anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (Alexa Fluor® 488; verde). Se montaron las celulas usando el reactivo ProLong Gold AntiFade con DAPI (azul) e inspeccion visual y se realizo el registro usando
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microscopfa confocal. La imagen es representativa de tres experimentos separados. La barra de escala indica 5 pm. B. Una vision general de queratinocitos primarios humanos incubados durante 20 horas a TA con AIM 10 pM. Se destacan las estructuras mitocondriales con flechas y se muestran en aumento mayor en (C). Se realizo el inmunomarcaje de secciones delgadas de queratinocitos primarios humanos con anticuerpo anti-A1M marcado con oro y se mostro que se correlaciona con mitocondrias. Esto se destaca con puntas de flecha (C). Se prepararon las muestras y se observaron tal como se describe en materiales y metodos. La barra de escala en (B) indica 2 pm y en (C) 0,1 pm.
Figura 4. Union de A1M a mitocondrias analizada por la union de 125I-A1M. A. Se investigo la especificidad de la union de A1M a mitocondrias mezclando aproximadamente 2,5 pg/ml de 125I-A1M con 0,5 mg de mitocondrias purificadas en presencia o ausencia de 1,0 mg/ml de protefna sin marcar (A1M o AGP) en PBS + BSA al 4%. Se incubaron las mezclas a 4°C durante 30 minutos, se centrifugaron en un gradiente de sacarosa para separar la protefna no unida, entonces se congelaron los tubos y se separo el sedimento celular y se contaron en un contador y. Cada punto representa la media ± EEM de tres determinaciones. Se realizo la comparacion estadfstica entre los grupos usando la prueba de la t de Student. ***P < 0,001. B. Se investigo adicionalmente la especificidad de la union de A1M a mitocondrias usando BN-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Se separaron cinco pg de protefnas de membrana mitocondrial de 2 individuos separados en un gel Bis-Tris al 4-16% para BN-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Tras el bloqueo, se incubaron las membranas con anticuerpos frente a la subunidad NDUFV1 del complejo I, nucleo I del complejo III, A1M de raton, o se tineron con Coomassie. C. Se investigo tambien la asociacion del complejo I mediante inmunoprecipitacion de mitocondrias recien preparadas con anticuerpos frente al complejo I. Tras la inmunoprecipitacion, se separaron las protefnas unidas y eluidas en SDS- PAGE al 12% y se transfirieron a membrana de PVDF. Tras el bloqueo, se incubaron las membranas con anticuerpos frente a A1M de raton. Banda izquierda, material de partida mitocondrial (SM) y banda derecha, material unido y eluido (IP).
Figura 5. Se investigo la especificidad de la union de A1M a mitocondrias usando BN-PAGE, SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western. Se suspendieron las mitocondrias recien aisladas en PBS, se sedimentaron mediante centrifugacion y se disolvieron hasta una concentracion de 5 mg/ml en tampon MB2. Se solubilizaron las protefnas de membrana mitocondrial mediante incubacion con 0,5-4,0 g de digitonina/g de protefna durante 5 min sobre hielo. Se centrifugaron las muestras, se recogio el sobrenadante y se anadio SBG hasta una concentracion final del 4,5%. A. Entonces se separaron cinco pg de protefnas de membrana mitocondrial de 2 individuos separados (S1 y S2) sobre un gel Bis-Tris al 4-16% para BN-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Tras el bloqueo, se incubaron las membranas con anticuerpos frente a la subunidad NDUFV1 (izquierda) del complejo I, A1M (medio) y nucleo I de la subunidad del complejo III. B. Se separaron protefnas mitocondriales aisladas (15 pg/banda) tratadas con tripsina (0-100 U de tripsina) en SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Tras el bloqueo, se incubo la membrana con anticuerpos frente a A1M.
Figura 6. A1M protege la estructura mitocondrial. Se incubaron queratinocitos primarios humanos durante 20 horas a TA con medio de cultivo solo (A), hemo 20 pM (B) o hemo 20 pM + A1M 0,25 mg/ml (C). Se destacan las estructuras mitocondriales con flechas y se representan en detalle (imagenes ampliadas). Se prepararon las muestras y se observaron tal como se describe en materiales y metodos. La barra de escala indica 2 pm (vision general) y 0,5 pm (imagen ampliada).
Figura 7. Se incubaron queratinocitos primarios humanos durante 20 horas a TA con medio de cultivo solo (A), H2O2 250 pM (B) o H2O2 250 pM + A1M 0,25 mg/ml (C). Se destacan las estructuras mitocondriales con flechas y se representan en detalle (imagenes ampliadas). Se prepararon las muestras y se observaron tal como se describe en materiales y metodos. La barra de escala indica 2 pm (vision general) y 0,5 pm (imagen ampliada).
Figura 8. A1M protege la funcion mitocondrial. Se investigo el efecto de A1M sobre la funcion mitocondrial midiendo la produccion de ATP de mitocondrias purificadas expuestas a hemo o H2O2. Se incubaron las mitocondrias con hemo 1-20 pM, con o sin A1M 0,25 mg/ml (A) o H2O2 20-250 pM con o sin A1M 0,25 mg/ml (B) durante 30 minutos. Se recogieron las mitocondrias mediante centrifugacion y se midio la produccion de ATP usando un kit de ensayo de luminiscencia. Se normalizaron los niveles de ATP con la correspondiente protefna de muestra. Cada punto representa la media ± EEM de tres determinaciones. Se realizo una comparacion estadfstica entre grupos usando la prueba de la t de Student. *P < 0,05.
Figura 9. Lista de secuencias de A1M
Figura 10. Cuantificacion de PCR en tiempo real de ARNr mitocondrial (A) y A1M celular, ARNm de HO1 y SOD (B) durante el cultivo de retina en condiciones moderadas y de estres. Cada valor de AAt corresponde a la cantidad de ARN en condiciones de estres en relacion con la cantidad de ARN en condiciones moderadas, determinada mediante PCR en tiempo real y normalizada con respecto a gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa. Cada barra es la media de mediciones duplicadas de cultivos por triplicado.
Parte experimental
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Ejemplo 1
Materiales y metodos Protefnas y anticuerpos
Se aislo AIM plasmatica monomerica humana mediante cromatograffa de afinidad con anticuerpo anti-A1M y cromatograffa en gel Sephacryl S-300, tal como se describio anteriormente (48). Se purifico A1M humana recombinante, que contenfa His-tag N-terminal, a partir del medio de cultivo de celulas de insectos infectadas con baculovirus (48) o expresadas en E. coli y se purificaron y replegaron tal como se describe (20) con la adicion de una etapa de purificacion de cromatograffa de intercambio ionico (32). Se adquirieron a1-glicoprotefna acida (AGP) de suero humano y ovoalbumina de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EE.UU.) y la albumina de suero bovino (BSA) era de Roche Diagnostics Scandinavia AB (Bromma, Suecia). Se adquirio hemina (cloruro de ferriprotoporfirina IX) de Porphyrin Products, Inc. (Logan, UT) y se preparo una disolucion madre 10 mM fresca disolviendo en dimetilsulfoxido (DMSO; Sigma-Aldrich). H2O2 era de Acros Organics (Geel, Belgica). Se produjeron anticuerpos monoclonales de raton frente a A1M humana (BN11.3) tal como se describe (29). Se prepararon anticuerpos policlonales de conejo anti-A1M de raton (Sven; fraccion de IgG) inmunizando un conejo con A1M de raton marcada con His expresada en celulas de insectos infectadas con baculovirus (41). Se proporciono gentilmente el anticuerpo de hamster anti-CD3 de raton 145.2C11 por el Dr. Rikard Holmdahl, Lund University. Se adquirieron anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de raton conjugado con isotiocianato de fluorescefna (GAM-FITC) y estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SAPE) de DAKO A/S (Glostrup, Dinamarca), la 7-aminoactinomicina D (7 AAD) era de Sigma-Aldrich Co. y la anexina V-FITC era de Trevigen Inc. (Gaithersburg, MD, EE.UU.).
Cultivo celular
Se emplearon una lfnea celular de hibridoma de celulas T CD4+ de raton (HCQ.4), una lfnea de celulas pre-B murina (70Z/3), una lfnea celular eritroide humana (K562) y queratinocitos primarios humanos (Cambrex Biologics, Karlskoga, Suecia) para estudios sobre la union de A1M a celulas y mitocondrias. Se cultivaron las celulas tal como se describio anteriormente (25, 28, 37) y se procesaron y analizaron tal como se describe a continuacion.
Induccion de apoptosis
Se indujo apoptosis en el hibridoma de celulas T mediante tres tratamientos diferentes: se incubaron celulas sobre plasticos recubiertos con anticuerpo anti-CD3 (4 pg/ml) (43) o se incubaron en medio complementado con o bien etanol al 5% o bien el 10% de DMSO (24). Se incubaron las celulas en una incubadora de CO2 a 37°C durante diversos tiempos. Se detecto apoptosis como fragmentacion de AND mediante electroforesis en gel de agarosa (descrito a continuacion) y se midio la viabilidad celular mediante exclusion con azul trfpano. En la lfnea de celulas pre-B 70Z/3, se indujo apoptosis mediante el farmaco de benzamida declopramida (3-CPA, Oxigene Inc.) tal como se describe en (25).
Electroforesis en agarosa
Para detectar la fragmentacion de ADN, se lisaron aproximadamente 1x106 celulas, se trataron con proteinasa K y ARNasa A y se analizaron mediante electroforesis en agarosa.
Marcaje de A1M
Para el analisis de union de A1M a celulas, se biotinilo A1M, se conjugo con FITC o se radiomarco con 125I. Se biotinilo A1M con biotina-N-hidroxisuccinimida de brazo largo (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EE.UU.) (9) y se diluyo hasta una concentracion de 0,2 mg/ml. Se conjugo A1M con FITC tal como se describio anteriormente (13) mediante FITC adsorbido en Celite (Calbiochem Corp, San Diego, CA, EE.UU.). Se marco A1M con 125I usando el metodo de cloramina T (16). La radioactividad especffica obtenida fue de alrededor de 0,1-0,2 MBq/pg.
Citometria de flujo
Se analizo la union de A1M a celulas mediante citometria de flujo. Se analizaron aproximadamente 1x106 celulas para determinar la union de A1M en una de tres maneras diferentes: 1. Se incubaron las celulas con 1 mg/ml de plasma o A1M de celula de insecto recombinante, seguido por 10 pg/ml de anticuerpo de raton monoclonal anti-A1M (BN 11.3) y GAM-FITC (diluido 20 veces). 2. Se incubaron las celulas con A1M biotinilada 10 pg/ml seguido por SAPE (diluido segun las recomendaciones del fabricante). 3. Se incubaron las celulas con A1M conjugada con FITC 0,1 mg/ml. Se realizaron todas las incubaciones en PBS + 1 mg/ml de BSA durante 10 minutos a TA. Entre las incubaciones, se lavaron las celulas 2-3 veces en PBS. Para detectar la fuga de celulas, se incubaron las celulas con yoduro de propidio (PI; Invitrogen Inc.) o 7AAD (segun instrucciones del fabricante). Para detectar celulas 70Z/3 apoptoticas, tambien se incubaron las celulas con anexina V conjugada con FITC en un tampon que contenfa Ca2+
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(segun las instrucciones del fabricante). Se realizaron todos los analisis usando un equipo Becton Dickinson FACSorter y el paquete de software Cell Quest.
Fluorescencia y microscopfa confocal
Se lavaron celulas K562 y se resuspendieron en medio de cultivo hasta 0,5 - 4,0 x 106 celulas/ml y se incubaron con o sin AIM tal como se indica en las leyendas de las figuras. Entonces o bien se incubaron las celulas con Mito- Tracker (Invitrogen Inc.) durante 15 minutos a 37°C y se lavaron en medio fresco (figura 3A) o bien se lavaron directamente en medio fresco (figura 1C). Tras el lavado, se realizo la tincion de las celulas resuspendiendo en medio de Na helado (KCl 5,4 mM; KH2PO4 1,2 mM; MgSO4 0,8 mM; D-glucosa 5,6 mM; NaCl 127 mM; Hepes 10 mM; CaCl2 1,8 mM; pH 7,3), fijacion con BD CellFIX al 1% sobre hielo durante 15 min y a TA durante 45 min. Se lavaron las celulas en disolucion de bloqueo (medio de Na; BSA al 1%; suero de cabra al 5%) seguido por permeabilizacion en Triton-X al 0,02% y bloqueo en BSA al 1%, suero de cabra al 5%, Tween-20 al 0,2% durante 1 hora a TA. Entonces se tineron las celulas a 4°C durante la noche con anticuerpo de raton monoclonal anti-A1M (BN 11.3) a 5 pg/ml. Despues, se aplicaron fragmentos F(ab')2 de anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (Alexa Fluor® 594; Invitrogen Inc.), durante 1 h a TA. Se montaron las celulas usando el reactivo ProLong Gold AntiFade con DAPI. Para la microscopfa de fluorescencia, se realizaron inspeccion visual y el registro de imagenes usando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse TE300 equipado con una camara CCD refrigerada Hamamatsu C4742-95, usando un objetivo Plan Apochromat 100 x. Para la microscopfa confocal, se realizaron analisis de celulas y marcadores fluorescentes usando un microscopio de epifluorescencia (Nikon Eclipse TE300) y un microscopio de barrido laser confocal (Zeiss LSM 510 Meta). Se equipo el microscopio de epifluorescencia con las combinaciones de filtro apropiadas para visualizar selectivamente los fluoroforos usados. Se realizaron analisis usando una lente Plan Apochromat 100 x y se recogieron los datos de imagenes con una camara CCD Hamamatsu C4742-95. Para analizar el marcaje y comarcaje intracelular en estructuras subcelulares, se registro el barrido confocal de secciones opticas a traves de las celulas. Para excitacion de los fluoroforos, se uso la lfnea de laser de 405 nm para DAPI (laser de diodo 405-30), se uso la lfnea de laser de 488 nm para Alexa Fluor 488 (laser de argon) y la lfnea de laser de 561 nm para Mito-Tracker (DPSS 561-10). Se detectaron las longitudes de onda de emision de fluoroforo individual usando los siguientes filtros: paso banda de 420-480 nm para DAPI, paso banda de 505-550 nm para Alexa Fluor 488 y paso largo de 575 nm para Mitotracker. Se ajusto el agujero para deteccion de Alexa Fluor 488 (excitacion de 488 nm) para corresponder a 1 (una) unidad Airy, y entonces se ajustaron los agujeros para los demas canales de deteccion para proporcionar secciones opticas del mismo espesor, es decir para garantizar las comparaciones de los correspondientes volumenes confocales. Se optimizaron la potencia del laser y los ajustes de deteccion (ganancia y compensacion) para los canales individuales, proporcionando un rango de deteccion de desde pixeles altamente saturados de estructuras mayores hasta pixeles no saturados de estructuras pequenas. Se escanearon secuencialmente los diferentes fluoroforos, es decir con ajustes optimos para un fluoroforo en cada canal, a un tamano de marco de 512 x 512 o 1024 x 1024. Para determinar la morfologfa celular, se obtuvieron imagenes de contraste por interferencia diferencial (DIC) usando el laser de 405 nm como luz transmitida. Se determino la relacion espacial entre la fluorescencia Alexa Fluor 488 (verde) y la fluorescencia Mito-Tracker (roja) a traves de la fusion de las secciones opticas de los canales barridos individualmente (amarillo cuando presentan una ubicacion conjunta), confirmado a traves de analisis de imagenes fusionadas usando el software LSM Zen (“Profile”, datos no mostrados).
Sistema de doble hfbrido de levadura
Se uso un sistema de doble hfbrido de levadura basado en GAL4 para buscar protefnas celulares que interaccionan con A1M. Se amplifico el ADN que codifica para la parte de A1M (aminoacidos 1-183) del gen A1M-bikunina (AMBP) mediante PCR usando un constructo pCR-Script como molde. Se secuencio completamente el fragmento y se ligo en el vector de doble hfbrido de levadura, vector fagemido pBD-GAL4 Cam (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Entonces se transformo el vector recombinante en la cepa huesped de la levadura S. cerevisiae YRG-2 (Stratagene). Se realizaron el crecimiento y el mantenimiento de las cepas de la levadura y ensayos de doble hfbrido usando protocolos convencionales tal como se recomienda por Stratagene y
http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/units/biochem/gietz/. Se trasformaron aproximadamente 7,5 x 108 YRG-2 que portaban el plasmido cebo, pBD-GAL4-A1M, con 15-20 pg de una biblioteca de ADNc MATCHMAKER de leucocitos humanos (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Se analizaron los aproximadamente 2x106 transformantes resultantes mediante ensayo de prototroffa de histidina y ensayo de elevacion de colonias p-gal. Se aislaron los plasmidos de biblioteca recombinante de los transformantes His+LacZ+ y se sometieron a prueba de nuevo en ensayos de doble hfbrido directos junto con el plasmido cebo de A1M asf como con los plasmidos cebo que codifican para protefnas no relacionadas. Los plasmidos que dan como resultado la activacion de los genes indicadores junto con el plasmido cebo que codifica para A1M, pero no con los plasmidos cebo que codifican para protefnas no relacionadas, se consideraban positivos verdaderos. Se determino la secuencia de aDn de los insertos usando los cebadores de vector pAD5': 5'-tccagattacgctagcttgggtggtcatatg-3' y pAD3': 5'- gtgaacttgcggggtttttcagtatctacga-3'. Se secuencio completamente uno de los insertos por Innovagen AB (Lund, Suecia).
http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/units/biochem/gietz/. Se trasformaron aproximadamente 7,5 x 108 YRG-2 que portaban el plasmido cebo, pBD-GAL4-A1M, con 15-20 pg de una biblioteca de ADNc MATCHMAKER de leucocitos humanos (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). Se analizaron los aproximadamente 2x106 transformantes resultantes mediante ensayo de prototroffa de histidina y ensayo de elevacion de colonias p-gal. Se aislaron los plasmidos de biblioteca recombinante de los transformantes His+LacZ+ y se sometieron a prueba de nuevo en ensayos de doble hfbrido directos junto con el plasmido cebo de A1M asf como con los plasmidos cebo que codifican para protefnas no relacionadas. Los plasmidos que dan como resultado la activacion de los genes indicadores junto con el plasmido cebo que codifica para A1M, pero no con los plasmidos cebo que codifican para protefnas no relacionadas, se consideraban positivos verdaderos. Se determino la secuencia de aDn de los insertos usando los cebadores de vector pAD5': 5'-tccagattacgctagcttgggtggtcatatg-3' y pAD3': 5'- gtgaacttgcggggtttttcagtatctacga-3'. Se secuencio completamente uno de los insertos por Innovagen AB (Lund, Suecia).
Preparacion de mitocondrias a partir de tejido de higado de raton
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Se recogio tejido de hfgado de raton en tampon de aislamiento helado (sacarosa 320 mM, Trizma Base 10 mM, EGTA 2 mM) y se homogeneizo posteriormente en 2 ml de tampon de homogeneizacion (tampon de aislamiento complementado con BSA al 1%). Se prepararon mitocondrias a partir de homogeneizados mediante centrifugacion secuencial incluyendo purificacion por densidad en Percoll al 19%. Se determino la concentracion de protefnas de preparaciones mitocondriales usando Nanodrop y se usaron mitocondrias aisladas sin congelacion.
Ensayo de union a celulas y a mitocondrias competitive.
Se investigo la especificidad de la union de A1M a celulas y mitocondrias mediante un ensayo de union a celulas competitivo tal como se describe (3, 49). Se indujo apoptosis en celulas HCQ.4 mediante reticulacion de anticuerpo anti-CD3 durante 15-18 horas. Se recogieron las celulas y se compararon con celulas normales en el ensayo de union. Se calculo una constante de afinidad para la union usando una representacion de Scatchard de los datos.
Inmunocaptura del complejo I
Se realizo inmunoprecipitacion del complejo I sobre mitocondrias recien preparadas usando el kit de inmunocaptura del complejo I (MitoSciences). Tras la inmunoprecipitacion, se eluyeron las protefnas unidas usando tampon SDS y posteriormente se analizaron usando SDS-PAGe e inmunotransferencia de tipo Western.
Aislamiento de los complejos y supercomplejos de cadena respiratoria
Se suspendieron los sedimentos mitocondriales no congelados, recien aislados, en PBS complementado con inhibidor de mini proteasa completo. Se sedimentaron mitocondrias durante 5 min a 5000 xg y posteriormente se disolvieron hasta una concentracion de 5 mg/ml en tampon MB2 (acido aminocaproico 1,75 M, Bis-Tris 7,5 mM pH 7,0, + EGTA 2 mM pH 8,0). Se solubilizaron protefnas de membrana mitocondrial mediante incubacion con digitonina al 0,5% durante 5 min sobre hielo. Se centrifugaron las muestras durante 30 min a 13000 xg, se recogio el sobrenadante y se midio la concentracion de protefna como antes. Finalmente, se anadio SBG (acido aminocaproico 750 mM, Serva Blue G al 5%) hasta una concentracion final del 4,5%.
Blue native PAGE, SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western
Se separaron cinco pg de protefnas de membrana mitocondrial en un gel Bis-Tris al 4-16% para BN-PAGE (Invitrogen Inc.) o bien se tineron con azul brillante de Coomassie o bien se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) usando el equipo Iblot (Invitrogen Inc.). Se separaron las protefnas inmunoprecipitadas del complejo I en un SDS-PAGE al 12% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Tras el bloqueo durante la noche a 4°C se incubaron las membranas con anticuerpos frente a la subunidad NDUFV1 del complejo I (Sigma) o A1M de raton. Se detectaron los anticuerpos primarios mediante incubacion con el anticuerpo de cabra anti-raton acoplado a HRP (DAKO) o anticuerpo de cabra anti-conejo (DAKO).
Microscopia electronica de transmision (MET)
Se sedimentaron mediante centrifugacion queratinocitos humanos (aproximadamente 1 millon de celulas), incubados durante 20 horas a TA con hemo 20 pM, con o sin A1M 10 pM, y se fijaron posteriormente durante 1 hora a TA y luego durante la noche a 4°C en glutaraldehfdo al 2,5% en cacodilato de sodio 0,15 M, pH 7,4 (tampon cacodilato). Entonces se lavaron las muestras con tampon cacodilato y se fijaron posteriormente durante 1 hora a TA en tetroxido de osmio al 1% en tampon cacodilato, se deshidrataron en una serie graduada de etanol y entonces se incrustaron en Epon 812 usando acetona como disolvente intermedio. Se seccionaron los especfmenes con un cuchillo de diamante en secciones ultradelgadas de 50-70 nm de espesor en un ultramicrotomo LKB. Se tineron las secciones ultradelgadas con acetato de uranilo y citrato de plomo. Se observaron los especfmenes en un microscopio electronico JEOL JEM 1230 operado a 80 kV de voltaje de aceleracion. Se registraron imagenes con una camara CCD Gatan Multiscan 791. Se realizo el inmunomarcaje de las secciones delgadas con anticuerpo anti- A1M marcado con oro (BN11.3) tal como se describio anteriormente (39) con la modificacion que se uso Aurion-BSA como agente de bloqueo. Finalmente se tineron las muestras con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron en un microscopio electronico Jeol JEM 1230, operado a 80 kV de voltaje de aceleracion. Se registraron las imagenes con una camara de dispositivo acoplado a carga Gatan Multiscan 791.
Ensayo de ATP
Se midio la produccion de ATP celular usando un kit de ensayo de luminiscencia (Promega, Madison, WI), basado en la actividad dependiente de ATP de luciferasa. Se normalizaron los niveles de ATP con el correspondiente contenido en protefna de la muestra.
Analisis estadfstico
Se realizo el analisis estadfstico usando el software Origin 8. Se uso la prueba de la t de Student para la evaluacion estadfstica y se considero significativa cuando P<0,05.
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Resultados
Union especifica de AIM a celulas danadas
Se analizo la union de AIM a celulas apoptoticas y sanas mediante citometrfa de flujo y se comparo con celulas sin tratar. En primer lugar, se indujo apoptosis en hibridomas de celulas T murinas (HCQ.4) mediante reticulacion de la molecula de CD3 con anticuerpos anti-CD3 de raton inmobilizados (figura 1A, E), o mediante incubacion con etanol al 5% o DMSO al 10% (figura 1B). Estos tratamientos dieron como resultado la fragmentacion de ADN y captacion de azul trfpano tras 15-18 horas (no mostrado). Una union debil de A1M pudo detectarse para celulas sin tratar (figura 1A, panel izquierdo). Una union mas fuerte adicional pudo detectarse para celulas reticuladas con anticuerpo anti-CD3 (figura 1A, panel derecho) o tratadas con etanol o DMSO (figura 1B). La union pudo correlacionarse con la captacion de PI, es decir solo celulas que podfan incorporar PI presentaron la union mas fuerte de A1M (figura 1B). La citometrfa de flujo de una lfnea de celulas pre-B murina, inducida a apoptosis usando el farmaco 3-CPA, e incubada con A1M seguido por anticuerpo anti-A1M, mostro resultados similares (figura 1C), indicando que la union a celulas apoptoticas no se limita a celulas T.
Con el fin de caracterizar adicionalmente la union de A1M a celulas danadas, se estudio la union usando microscopfa de fluorescencia de la lfnea celular eritroide humana K562 (figura 1D) y la lfnea celular promielocftica HL 60 (no mostrada) inducidas a apoptosis mediante adicion de hemo, e incubadas con A1M seguido por anticuerpo anti-A1M. Tal como se ilustra en la figura, pudieron observarse dos tipos diferentes de tincion, una tincion granular debil en la superficie celular de la mayorfa de las celulas y una tincion mas pronunciada, intracelular y uniforme en un subconjunto (aproximadamente el 6%) de las celulas. Se obtuvieron resultados similares con las celulas HL 60 (no mostrado). Estos resultados indican que la union fuerte de A1M a celulas apoptoticas es principalmente intracelular, lo que se confirmo mediante microscopfa confocal (vease mas adelante; figura 3A).
Para investigar la especificidad de la union, se realizo un ensayo de union a celulas competitivo sobre celulas HCQ.4, inducidas a apoptosis mediante reticulacion de CD3 y se comparo con celulas normales sin tratar. Se anadieron A1M marcada con 125I y un exceso de A1M sin marcar, ovoalbumina, BSA o AGP a las celulas (figura 1E). Se unio mas A1M a celulas apoptoticas (figura 1E, izquierda) en comparacion con celulas sin tratar (derecha). El exceso de A1M sin tratar bloqueo la union de A1M a 125I al mismo nivel basal para celulas apoptoticas que para celulas sin tratar. Se encontro que la reduccion es significativa (p<0,001). Ninguna de las protefnas control sin marcar pudo reducir de manera significativa la union de 125I-A1M a celulas sin tratar, indicando de ese modo una union especifica de A1M. Con respecto a las celulas apoptoticas, hubo una reduccion pequena, significativa, mediante las protefnas control (p<0,05). Esta pequena reduccion puede ser debido a un aumento de la union de referencia no especifica a estructuras intracelulares expuestas. Por consiguiente, los resultados indican una union mas fuerte especifica de A1M a celulas apoptoticas. A partir de una representacion de Scatchard pudo determinarse una constante de afinidad para la union de A1M a celulas HCQ.4 apoptoticas a 1 x 106 M-1. La viabilidad de estas celulas fue del 25% segun la exclusion con azul trfpano (no mostrado).
Tal como se menciono anteriormente, las celulas de union de A1M internalizaron PI (figura 1B). Esto indica que la union de A1M se produjo tarde en el proceso apoptotico despues de que las membranas celulares han iniciado la fuga. Para confirmar este resultado, se realizaron estudios de tiempos sobre la union de A1M a celulas HCQ.4, inducidas a apoptosis mediante reticulacion con anticuerpo anti-CD3. La citometrfa de flujo de muestras tomadas en diversos puntos de tiempo tras la induccion muestra que la captacion de PI precede a la union de A1M (figura 2A). No se observo la clara correlacion de union en celulas negativas para la captacion de PI. Se obtuvo el mismo resultado cuando se tineron por triplicado las celulas pre-B murinas con A1M, anexina V (marcador para apoptosis) y 7AAD (tinte marcador para la permeabilidad de membrana celular) (figura 2B). Solo celulas positivas para 7AAD mostraron una fuerte union de A1M, mientras que las celulas positivas para anexina V, pero no para 7AAD, no se unieron a A1M.
Identificacion de protefnas de union a AIM intracelular
Para buscar protefnas celulares que interaccionan con A1M, se uso el sistema de doble hfbrido de levadura. Se uso ADNc que codifica para A1M como cebo para buscar protefnas que interaccionan con A1M en una biblioteca de leucocitos humanos. Se analizaron aproximadamente 2 x 106 transformantes para determinar la activacion del gen indicador. Un total de 168 colonias sobrevivieron sobre placas que carecfan de histidina y 13 de ellas tambien eran positivas para p-galactosidasa. Se aislaron los plasmidos de biblioteca recombinante His+LacZ+ y se sometieron a prueba en ensayos de doble hfbrido directos con plasmidos cebo que codifican solo para la protefna cebo asf como la protefna fusionada a protefnas no relacionadas. Se mostro que once plasmidos recombinantes codificaban para protefnas que interaccionaban con A1M, pero no con la protefna cebo u otras protefnas no relacionadas fusionadas con la misma. La secuenciacion de ADN de los insertos revelo que siete de ellos eran una forma truncada de la subunidad SDAP (NDUFAB1) en el complejo I mitocondrial, uno era la secuencia completa de la misma subunidad, uno era una protefna de union a ARNnp, uno era N-acetilglucosamina cinasa y uno era un antfgeno de cancer de colon. Todos los insertos estaban en el marco en el vector presa (tabla I).
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Tabla 1. Protefnas que interaccionan con AIM encontradas en el sistema de doble hfbrido de levadura.
- Protefna
- N.° de colonias N.° de registro Genebank N.° de bases*
- NADH deshidrogenasa 8 kDa, subunidad SDAP (NDUFAB1)
- 7 NM_005003 142-670
- NADH deshidrogenasa 8 kDa, subunidad SDAP (NDUFAB1)
- 1 NM_005003 18-670
- Protefna similar a Sm
- asociada a ARNnp U6 (LSM5)
- 1 AF182291 14-735
- N-acetilglucosamina cinasa (NAGK)
- 1 AJ242910 7-1187
- Antfgeno 3 de cancer de colon definido
- serologicamente , NY-CO-3 (SDCCAG3)
- 1 AK001296 0-1441
* Segun la numeracion de bases del n.° de registro Genebank asignado en esta tabla.
Union de AIM al complejo I mitocondrial
Los resultados de los experimentos de doble hfbrido de levadura sugieren por tanto que una subunidad del complejo I mitocondrial es una protefna intracelular de union a AIM principal. Por tanto se investigo la union a mitocondrias, y al complejo I en particular, en detalle usando varios metodos independientes: microscopfa confocal, ME, fraccionamiento subcelular y PAGE. Usando una sonda fluorescente mitocondrial (Mito-Tracker) y microscopfa confocal se evaluo la ubicacion subcelular de la AIM intracelular en celulas K562 con o sin adicion de AIM exogena (figura 3A). Al analizar celulas sin A1M anadida de manera exogena se observo una tincion intracelular no especffica muy debil (no mostrado). Sin embargo, con la adicion de A1M exogena se observo una tincion especffica de mitocondrias, intensa. Tambien se estudio la ubicacion subcelular de la A1M unida mediante ME de transmision (MET) usando cultivos de queratinocitos humanos primarios (figura 3B-C). La MET de queratinocitos, que contienen A1M anadida de manera exogena e incubados con anticuerpo anti-A1M marcado con oro, mostro una ubicacion altamente especffica de A1M en las mitocondrias (figura 3C).
Se realizo la confirmacion de la union mitocondrial y verificacion de especificidad usando mitocondrias purificadas de hfgado de raton (figura 4A). Se incubo A1M marcada con 125I con las mitocondrias, con o sin un exceso de A1M sin marcar o la protefna de control AGP. El exceso de A1M sin marcar bloqueo la union 125I-A1M de manera significativa en las dos concentraciones mayores, mientras que AGP en la concentracion mas alta no tuvo efecto sobre la union. El analisis de Scatchard de los datos de union produjo una constante de afinidad de la union a 1,2 x 106 M"1.
Para investigar si se encuentra A1M endogena en mitocondrias asociadas con el complejo I, se purificaron mitocondrias de raton sin congelacion, se solubilizaron, se separaron en condiciones no desnaturalizantes y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos frente a subunidades del complejo I y III (denominadas NDUFV1 y nucleo I, respectivamente) y frente a A1M de raton (figura 4B). Los resultados muestran que A1M migra conjuntamente con la banda que contiene el complejo I principal y una banda muy compleja que contiene tanto el complejo I como III, mientras que no se observo migracion conjunta entre A1M y la banda que contiene el complejo III principal. Tomados juntos, esto respalda una asociacion especffica entre A1M y una subunidad del complejo I. Sin embargo, una fraccion grande de A1M migro a una posicion correspondiente a aproximadamente 350-400 kDa, lo que sugiere que A1M tambien se asocia con otras estructuras grandes, aun no identificadas, en mitocondrias. La intensidad de transferencia de todas las bandas disminuye con concentraciones de digitonina crecientes, lo que sugiere que todas las bandas observadas en los geles resultan de interacciones protefna-protefna no covalentes (figura 5A). Se confirmo la union entre A1M y el complejo I mediante la inmunoprecipitacion con anticuerpo anti-complejo I seguido por transferencia con anticuerpo anti-A1M (figura 4C). Los resultados mostraron que se precipitaron la mayorfa de las bandas positivas para A1M asociada a mitocondrias en el material de partida (figura 4C, izquierda). Ademas, en el inmunoprecipitado se observo una nueva banda, no detectable en el material de partida. La digestion con tripsina de mitocondrias intactas antes de SDS-PAGE e inmunotransferencia con anticuerpo anti-A1M no disminuyo la cantidad de A1M encontrada en las mitocondrias, lo que respalda una ubicacion de A1M en la membrana mitocondrial interna (figura 5B).
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AIM protege la estructura y la funcion mitocondriales
Planteando como hipotesis que el papel fisiologico de AIM unida a mitocondrias es conferir proteccion de este organulo, en primer lugar se empleo MET para investigar el impacto de A1M sobre la estructura de mitocondrias en celulas expuestas a hemo y H2O2 (figura 6 y 7). Se realizo MET sobre queratinocitos primarios humanos cultivados. Se observaron efectos destructivos extensivos por hemo (figura 6B) y H2O2 (figura 7B), es decir formacion vasta de vacuolas, desorganizacion estructural de fibras de queratina e hinchazon de las mitocondrias (figura 6B y 7B, ampliadas). Se contrarrestaron estos efectos mediante la adicion de AIM, observandose un impacto particular sobre el hinchazon mitocondrial (figura 6C y 7C, ampliadas). Los resultados sugieren que AIM protege y conserva las estructuras celulares de otra manera danadas y disgregadas.
A continuacion se investigaron los efectos de AIM sobre la funcion mitocondrial midiendo la produccion de ATP de mitocondrias purificadas expuestas a hemo o H2O2 (figura 8). Se observo una reduccion significativa en la tasa de produccion de ATP por hemo 5 y 20 pM (figura 8A). Se invirtio esta reduccion por AIM, y no se observo reduccion en la tasa de produccion de ATP por hemo en ninguna de las concentraciones sometidas a prueba cuando estaba presente AIM 10 pM. Se obtuvieron resultados similares usando H2O2 (figura 8B). Por tanto, H2O2 redujo de manera significativa la tasa de produccion de ATP, pero se invirtieron de manera significativa los efectos en presencia de A1M 10 pM.
Ejemplo 2. Condiciones de estres en cultivos de retina inducen dano estructural y funcional de mitocondrias, respuesta de antioxidacion celular y regulacion por incremento de A1M celular
Metodos
Se diseccionaron retinas de cerdo y se cultivaron en placas de Petri en condiciones moderadas y de estres in vitro tal como se describe para retinas de rata (Cederlund M, Ghosh F, Arner K, Andreasson S, Akerstrom B. Vitrous levels of oxidative stress biomarkers and the radical scavenger alpha-1-microglobulin/A1M in human rhegmatogenous retinal detachment. Graefe's Arch Clin Exp Ophtalmol (2013) 251: 725-732). Tras 2 h o 48 h, se aislo ARNm y se cuantifico, se sintetizo ADNc mediante transcripcion inversa y se cuantifico la cantidad de secuencias especfficas mediante PCR en tiempo real. Se normalizaron las cantidades obtenidas de cada especie de ARNm en cultivos en estres con respecto a ARNm a partir del gen de mantenimiento gliceraldehfdo-3-fosfato- deshidrogenasa y se expresaron en relacion con los genes normalizados en condiciones de no estres (AACt).
Resultados
Se regulo por disminucion drasticamente la expresion de ARN ribosomico especffico de mitocondrias (ARNr 12S) en retinas cultivadas 48 h en condiciones de estres en comparacion con condiciones moderadas (figura 10a), lo que sugiere dano en la estructura y la funcion mitocondriales. Al mismo tiempo, se regularon por incremento el gen de A1M y los dos genes de antioxidacion hemo oxigenasa 1 (HO1) y superoxido dismutasa (SOD) en cultivos con estres en comparacion con cultivos moderados tras tanto 2 h como 48 h (figura 10b), lo que sugiere que se activan los mecanismos de defensa celular de la retina incluyendo A1M.
Conclusiones
El estres retiniano durante el cultivo in vitro afecta de manera negativa a la estructura y la funcion mitocondriales de la retina y regula por incremento la defensa de la antioxidacion y la expresion de A1M. Estos resultados respaldan un papel de A1M en la proteccion mitocondrial durante el cultivo retiniano.
Lista de abreviaturas
Especies reactivas del oxfgeno ROS
Hemoglobina Hb
Superoxido dismutasa SOD
Glutation peroxidasa GPx
a1-microglobulina A1M
Violaxantina desepoxidasa VDE
Zeaxtantina epoxidasa ZDE
a1-Glicoprotefna acida AGP
Albumina de suero bovino BSA
Dimetilsulfoxido DMSO
Anticuerpo de cabra anti-inmunoglobulina de raton conjugado con isotiocianato de GAM-FITC fluorescefna
Estreptavidina conjugada con ficoeritrina SAPE
7-aminoactinomicina D 7 AAD
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Claims (5)
- 5101520253035404550556065Alfa-1-microglobulina para su uso en el tratamiento de una enfermedad mitocondrial o para su uso en la reparacion, restauracion o mantenimiento de la funcion mitocondrial.Alfa-1-microglobulina para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la enfermedad mitocondrial se selecciona de la siguiente lista:• enfermedad de Alpers (poliodistrofia infantil progresiva)• sfndrome de Barth (cardiomiopatfa infantil letal)• defectos de la beta-oxidacion• cardiomiopatfa• deficiencia de carnitina-acilcarnitina• deficiencia de carnitina• sfndromes de deficiencia de creatina (sfndromes de deficiencia de creatina cerebral deficiencia de guanidinoacetato metiltransferasa (deficiencia de GAMT), deficiencia de amidinotransferasa (deficiencia de AGAT) y deficiencia de transportador de creatina SLC6A8 (deficiencia de SLC6A8).• deficiencia de la coenzima Q10• deficiencia del complejo I (deficiencia de NADH deshidrogenasa (NADH-CoQ reductasa))• deficiencia del complejo II (deficiencia de succinato deshidrogenasa)• deficiencia del complejo III (deficiencia de ubiquinona-citocromo c oxidorreductasa)• deficiencia del complejo IV/deficiencia de COX (la deficiencia de citocromo c oxidasa se provoca por un defecto en el complejo IV de la cadena respiratoria)• deficiencia del complejo V (deficiencia de ATP sintasa)• deficiencia de COX• CPEO (sfndrome de oftalmoplejfa externa progresiva cronica)• deficiencia de CPT I• deficiencia de CPT II• ataxia de Friedreich (FRDA o FA)• encefalomiopatfa• aciduria glutarica tipo II• KSS (smdrome de Kearns-Sayre)• acidosis lactica• LCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga)•LCHAD• enfermedad o sfndrome de Leigh (encefalomielopatfa necrotizante subaguda)• LHON (neuropatfa optica hereditaria de Leber)• enfermedad de Luft(CCDS) incluye: L-arginina:glicina relacionada con101520253035
- 3.40 4.
- 5. 45
- 6.50 7.
- 8.• MCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media)• MELAS (encefalomiopatfa mitocondrial, acidosis lactica y episodios similares a accidente cerebrovascular)• MERRF (epilepsia mioclonica y enfermedad de fibras rojas rasgadas)• MIRAS (smdrome ataxico mitocondrial recesivo)• citopatfa mitocondrial• deplecion de ADN mitocondrial• encefalopatfa mitocondrial incluye: encefalomiopatia, encefalomielopatia• miopatfa mitocondrial• MNGIE (trastorno mioneurogastrointestinal y encefalopatfa)• NARP (neuropatfa, ataxia y retinitis pigmentosa)• smdrome de Pearson• deficiencia de piruvato carboxilasa• deficiencia de piruvato deshidrogenasa• mutaciones de POLG• deficiencias de la cadena respiratoria• SCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta)•SCHAD• VLCAD (deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga)Alfa-1-microglobulina para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el tratamiento o la profilaxis de trastornos de la cadena respiratoria.Alfa-1-microglobulina para su uso segun la reivindicacion 3, en la que los trastornos de la cadena respiratoria implican defectos del complejo I, II, III, IV o V.Alfa-1-microglobulina para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el tratamiento o la profilaxis de disfunciones mitocondriales en ninos o adultos jovenes.Alfa-1-microglobulina para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para eltratamiento de prevencion de enfermedad de Alpers, smdrome de Barth, ataxia de Fridreich, KSS,enfermedad o smdrome de Leigh, LHON, MELAS, MERRF, MIRAS y NARP.Alfa-1-microglobulina para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para eltratamiento o la profilaxis de disfunciones mitocondriales en mujeres.Alfa-1-microglobulina para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el tratamiento o la profilaxis de dano o disfuncion de retina o enfermedades oculares asociadas con defecto(s) o disfuncion(es) mitocondrial(es).
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