CN109867717A

CN109867717A - 一种血浆中α1微球蛋白的提取方法

Info

Publication number: CN109867717A
Application number: CN201910257872.9A
Authority: CN
Inventors: 苏少博; 裴朝红
Original assignee: Shanxi Ruiya Force Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shanxi Ruiya Force Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2019-06-11

Abstract

本发明公开了一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，依次进行以下步骤制得，1）取α1微球蛋白免疫后的羊血浆，沉降后初步分离血细胞等多种物质；2）离心取上清，采用硫酸铵沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v）使血清充分沉淀；3）分离沉淀充分复溶，透析和浓缩；4）利用凝胶过滤层析柱对步骤3）处理过的滤液进行初步分离，收集含有α1微球蛋白的洗脱液；5）利用Protein G亲和层析柱对步骤4）收集到的洗脱液进行亲和层析，收集滤液进行除盐、浓缩处理后即得α1微球蛋白；6）利用SDS‑PAGE鉴定α1微球蛋白纯度。本方法步骤简单，安全性高，稳定性高且获得蛋白纯度较高，适合实验室及中试放大生产。

Description

一种血浆中α1微球蛋白的提取方法

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其是涉及一种血浆中α1微球蛋白的提取方法。

背景技术

α1微球蛋白（alpha 1-microglobulin，α1-MG）是人体内相对分子质量约26000 ~33000KDa的小分子糖蛋白，通常由182个氨基酸残基组成，最早由 Ekstrom 等从慢性镉中毒患者的尿液中分离、提纯得到，电泳时位于α1区带而得名。其独特的大小和电荷的不均一性，使功能变得十分重要。作为判断肝脏及肾脏功能的重要指标，在体内分布广泛，主要由肝细胞或淋巴细胞特异性合成后，随血液运输分配到体内各种组织中。在血液中，α1微球蛋白主要存在形式有游离、与免疫球蛋白IgA或白蛋白结合形式存在。当重度肝功能损害时，由于肝细胞受损，使肝脏合成、代谢和分泌α1-MG 减少，肝病患者血清中 α1-MG 含量降低。游离型α1-MG能自由地通过肾小球滤过膜，但在近曲小管处因重吸收作用几乎又被吸收，同时结合形式的α1-MG不能通过肾小球滤过，正常情况下人的尿液中只可以检测到游离型α1-MG的存在，一旦由于肾小球滤过功能受损或肾小管重吸收和代谢能力降低，就会导致结合形式α1-MG 更多地由血液释放到尿液中，引起α1-MG的含量增高。因此，α1-MG作为筛查早期肾病、肝病的重要指标，在临床，门诊及健康诊断等多方面被广泛应用。

由于 α1-MG 在疾病诊断上有广泛的应用，因此开发高效的纯化方案具有显著的现实意义和应用价值。现有报道的相关的提纯方法均比较复杂，操作繁琐且费用高，见沈新义等《人尿液α1—微球蛋白的分离,纯化及鉴定》（第二军医大学学报,1992,13），所用的传统的纤维介质DE52/CM52，流速慢，重生效果差，寿命短，不适合量化生产。

发明内容

本发明所要解决的问题就是提供一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，为制备诊断试剂盒中抗体原料提供基础，其技术方案如下：

一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，包括以下步骤：

1）取α1微球蛋白抗原免疫后的新鲜羊血浆，待血液凝固后，取血浆离心除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出淡黄色透明液体-血清；

2）虹吸法吸出上层淡黄色透明液体，采用硫酸铵沉淀法沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v）。血清充分沉淀后，采用pH7.5的磷酸钾缓冲液复溶沉淀，采用生理盐水溶液透析，采用PEG20000浓缩蛋白。

3）取装有sephadex G100填料的色谱柱，用pH7.5的磷酸钾缓冲液作为平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用相同缓冲液以0.5 mL/min洗脱，收集洗脱液，用PEG20000浓缩收集液。

4）吸取Protein G亲和层析介质匀浆到一个预先装有1mL Binding Buffer的层析柱内，让填料填料自然沉降到柱子底部，加入5 mL Binding Buffer到柱中，让Buffer缓慢流出，流速为1mL/min。将步骤3）中的浓缩液用Binding Buffer 1:1稀释，开始加样，流速约为0.2-0.5 mL/min，收集流出液，后续用SDS-PAGE检测纯化效率。使用大约30 mL BindingBuffer洗涤，流速大约为2 mL/min，边洗涤边检测280nm处的吸光度，直至出现稳定值。洗涤完毕后，开始加入10-15 mL Elution Buffer，使用1 mL/min较低流速，收集洗脱液，再调节pH至7.4，即为纯的α1微球蛋白。其中Binding Buffer为：20Mm NaHPO4，0.15M NaCl，pH8.0。Elution Buffer为：0.1 M甘氨酸 pH 2.5。

5）利用SDS-PAGE鉴定α1微球蛋白纯度。采用12%分离胶，5%浓缩胶，取50 μL样品溶液加10 μL 10ｘ样品缓冲液混合均匀，煮沸5min，12000rpm离心5min上样。

本发明的有益效果是：

本发明提供的方法中，使用的sephadex G100，这种胶pH范围宽，载量大，更适合 α1-MG的纯化，而且整体操作简便，重复性强，单次操作生产量大。

附图说明

图1为本发明实施例纯化后α1微球蛋白SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对本发明的内容作进一步的阐述，但实施例仅是本发明的较佳实施方式，故凡依本发明专利申请范围所述的特征及原理所做的等效变化，均包括于本发明专利申请范围内。

实施例1：

第一步，取α1微球蛋白免疫后的羊血浆，常温下自然沉降过夜，次日于4℃下，4000ｘg离心15min，去除红细胞、白细胞、血小板出等多种血细胞；

第二步，吸出上层淡黄色透明液体，采用硫酸铵沉淀法沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v），置于4℃过夜沉淀。血清充分沉淀后，次日于4℃下，8000ｘg离心20min，弃上清，收集沉淀。采用pH7.5的磷酸钾缓冲液将沉淀复溶，并采用生理盐水溶液于4℃下过夜透析，以除去血清中存有的大量硫酸铵，透析结束后，采用PEG20000浓缩蛋白；

第三步，取装有sephadex G100填料的色谱柱（2cm*60cm），用pH7.5的磷酸钾缓冲液作为平衡缓冲液平衡所述色谱柱，将第二步中的浓缩液上样，然后用相同缓冲液以0.5 mL/min的流速洗脱，同时检测280nm处的吸光度，收集洗脱液直至 280nm处的吸光度出现恒定值，用PEG20000浓缩收集液。

第四步，吸取Protein G亲和层析介质匀浆到一个预先装有1mL Binding Buffer的层析柱内，让填料填料自然沉降到柱子底部，加入5 mL Binding Buffer到柱中，让Buffer缓慢流出，流速为1mL/min。将步骤3）中的浓缩液用Binding Buffer 1:1稀释，开始加样，流速约为0.2-0.5 mL/min，收集流出液，后续用SDS-PAGE检测纯化效率。使用大约30mL Binding Buffer洗涤，流速大约为2 mL/min，边洗涤边检测280nm处的吸光度，直至出现稳定值。洗涤完毕后，开始加入10-15 mL Elution Buffer，使用1 mL/min较低流速，收集洗脱液，再调节pH至7.4。其中Binding Buffer为：20Mm NaHPO4，0.15M NaCl，pH 8.0。ElutionBuffer为：0.1 M甘氨酸 pH 2.5。之后用截留量为10KD的超滤膜进行浓缩，即为纯的α1微球蛋白。

第五步，利用SDS-PAGE鉴定α1微球蛋白纯度。采用12%分离胶，5%浓缩胶，取50 μL样品溶液加10 μL 10ｘ样品缓冲液混合均匀，煮沸5min，12000rpm离心5min后取样10μL加入凝胶点样孔。连接电泳仪，调整电压至80 V,待样品全部进入凝胶后，换用130 V，开始电泳直至溴酚蓝指示剂达到凝胶底部。电泳结束后将胶块置于蒸馏水洗涤2次，再置于R-250染色液中过夜染色，蒸馏水洗涤脱色，检测目的蛋白。

本实施例获得的α1微球蛋白分子量为35KDa，α1微球蛋白的纯度为90%，回收率为85%。

本发明提供的方法纯化后α1微球蛋白SDS-PAGE图谱如图1所示。

图1中，从左至右分别为Maker、羊血清样品、33%硫酸铵沉淀羊血清后的样品、羊血清亲和层析纯化后的样品。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于，包含如下步骤：

2）虹吸法吸出上层淡黄色透明液体，采用硫酸铵沉淀法使血清充分沉淀，离心分离沉淀，将沉淀复溶于缓冲液中，充分复溶后，进行透析，浓缩；

3）凝胶过滤层析；

4）Protein G亲和层析；

5)SDS-PAGE法鉴定α1微球蛋白纯度。

2.根据权利要求1所述的血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于：所述离心条件为4℃下，4000ｘg离心15min。

3.根据权利要求1所述的血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于：所述硫酸铵沉淀法沉淀至溶液硫酸铵终饱和浓度达到33%（w/v）使血清充分沉淀。

4.根据权利要求1所述的血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于：所述沉淀复溶缓冲液采用pH7.5的磷酸钾缓冲液，透析缓冲液采用生理盐水溶液，采用PEG20000浓缩蛋白。

5.根据权利要求1所述的血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤3）具体为：取装有sephadex G100填料的色谱柱，用pH7.5的磷酸钾缓冲液作为平衡缓冲液平衡所述色谱柱，上样，然后用相同缓冲液以0.5 mL/min洗脱，收集洗脱液，用聚乙二醇20000浓缩收集液。

6.根据权利要求1所述的血浆中α1微球蛋白的提取方法，其特征在于：所述步骤4）具体为：吸取Protein G亲和层析介质匀浆到一个预先装有1mL Binding Buffer的层析柱内，让填料填料自然沉降到柱子底部，加入5 mL Binding Buffer到柱中，让Buffer缓慢流出，流速为1mL/min；将步骤3）中的浓缩液用Binding Buffer 1:1稀释，开始加样，流速约为0.2-0.5 mL/min，收集流出液，后续用SDS-PAGE检测纯化效率；使用大约30 mL Binding Buffer洗涤，流速大约为2 mL/min，边洗涤边检测280nm处的吸光度，直至出现稳定值；洗涤完毕后，开始加入10-15 mL Elution Buffer，使用1 mL/min较低流速，收集洗脱液，再调节pH至7.4，即为纯的α1微球蛋白；其中Binding Buffer为：20Mm NaHPO4，0.15M NaCl，pH 8.0；Elution Buffer为：0.1 M甘氨酸 pH 2.5。