PT2380558E - Disposição de câmaras de interacção e de contrapressão para microfluidização - Google Patents

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PT2380558E
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Harald Rueckl
Hanno Scheffczik
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Novartis Ag
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Description

1
DESCRIÇÃO
"DISPOSIÇÃO DE CÂMARAS DE INTERACÇÃO E DE CONTRAPRESSÃO PARA MICROFLUIDIZAÇÃO"
CAMPO TÉCNICO
Esta invenção é no campo de fabrico emulsão de óleo-em-água adjuvantes para vacinas por meio de microfluidização.
TÉCNICA ANTERIOR 0 adjuvante de vacina conhecido como 'MF59' [1-3] é uma emulsão submicrónica de óleo-em-água de esqualeno, polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80), e trioleato de sorbitano (também conhecido como Span 85). Pode também incluir iões de citrato, por exemplo, 10 mM tampão citrato de sódio. A composição da emulsão por volume pode ser cerca de 5 % de esqualeno, cerca de 0,5 % de Tween 80 e cerca de 0,5 % de Span 85. O adjuvante e a sua produção são descritos em mais pormenor no Capitulo 10 da referência 4, capitulo 12 da referência 5 e capítulo 19 da referência 6.
Como é descrito em referência 7, MF59 é fabricado numa escala comercial pela dispersão de Span 85 na fase de esqualeno e Tween 80 na fase aquosa, seguido por mistura de alta velocidade para formar uma emulsão grossa. Esta emulsão grossa é então passada repetidamente através de um microfluidizador para produzir uma emulsão que tem um tamanho uniforme de gotícula de óleo. Como é descrito na referência 6, a emulsão microfluidizada é então filtrada através de uma membrana de 0,22 pm com a finalidade de remover qualquer gotículas grandes de óleo, e o tamanho de gotícula médio da emulsão resultante permanece sem mudar durante pelo menos 3 anos a 4 °C. O conteúdo de esqualeno da emulsão final pode ser medido como é descrito na referência 8. 2 A referência 84 revela nanoemulsões obtidas por meio de várias passagens em canais de interacção com microcanais de tipo Y ou Z.
Emulsões de óleo-em-água contêm goticulas de óleo. As goticulas maiores de óleo contida nestas emulsões podem agir como locais de nucleação para agregação, levando a degradação da emulsão durante o armazenamento. É um objecto da invenção proporcionar métodos adicionais e melhorados para a produção de emulsões de óleo-em-água microfluidizadas (tais como MF59), em particular métodos que são adequados para utilização numa escala comercial e que proporcionam microfluidização melhorada para proporcionar emulsões com menos partículas grandes.
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende: passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de gotícula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de gotícula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de gotícula de óleo médio. 0 dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z e um módulo de processamento auxiliar que compreende pelo menos um canal, em que o módulo de processamento auxiliar é posicionado a jusante da câmara de interacção. A primeira emulsão pode ser introduzida na câmara de interacção a uma primeira pressão e a segunda emulsão pode sair do módulo de processamento auxiliar a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão. Numa forma de realização, entre 80 e 95 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de interacção e de 5 a 20 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui bruscamente através 3 do módulo de processamento auxiliar. A presente invenção também proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende a etapa de passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio. 0 dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais e um módulo de processamento auxiliar que compreende uma pluralidade de canais. A primeira emulsão pode (i) ser introduzida na câmara de interacção a uma primeira pressão e a segunda emulsão pode sair do módulo de processamento auxiliar a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão; ou a primeira emulsão pode (ii) ser introduzida no módulo de processamento auxiliar a uma primeira pressão e a segunda emulsão pode sair da câmara de interacção a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão. Numa forma de realização, entre 80 e 95 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de interacção e de 5 a 20 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui bruscamente através do módulo de processamento auxiliar.
Como é descrito em mais pormenor a seguir, a primeira emulsão pode ter um tamanho de goticula de óleo médio de 5000 nm ou menos, por exemplo, um tamanho médio entre 300 nm e 800 nm. O número de goticulas de óleo na primeira emulsão com um tamanho >1,2 pm pode ser de 5 x 1011 /ml ou menos, como será descrito a seguir. Goticulas de óleo com um tamanho > 1,2 pm são desvantajosas uma vez que podem causar pode cause instabilidade da emulsão devido a aglomeração e coalescência de goticulas [14].
Após formação, a primeira emulsão pode então ser 4 submetido a pelo menos uma passagem de microfluidização para formar a segunda emulsão que tem um tamanho reduzido de goticula de óleo médio. Como será descrito a seguir, o tamanho de goticula de óleo médio da segunda emulsão é 500 nm ou menos. O número de goticulas de óleo na segunda emulsão que tem um tamanho > 1,2 pm pode ser 5 x IO10 /ml ou menos, como será descrito a seguir. Para conseguir estas características pode ser necessário passar os componentes de emulsão através do dispositivo de microfluidização uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 vezes. A segunda emulsão pode então ser filtrada, por exemplo, através de uma membrana de polietersulfona hidrofilica, para dar uma emulsão de óleo-em-água que pode ser adequada para utilização como um adjuvante de vacina. 0 tamanho de goticula de óleo médio da emulsão de óleo-em-água produzida após a filtração pode ser de 220 nm ou menos, por exemplo, entre 135-175 nm, entre 145-165 nm, ou cerca de 155 nm. O número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm presentes na emulsão de óleo-em-água produzida após a filtração pode ser de 5 x 108 /ml ou menos, por exemplo, 5 x 107 /ml ou menos, 5 x 106 /ml ou menos, 2 x 106 /ml ou menos ou 5 x 105 /ml ou menos. A emulsão final de óleo-em-água formada após a filtração pode ter pelo menos 102 vezes menos goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm em comparação com a primeira emulsão, e de maneira ideal pelo menos 103 vezes menos (por exemplo, 104 vezes menos).
Em algumas formas de realização, mais de um ciclo de etapas (i) e (ii) é utilizado antes da etapa (iii) . De maneira similar, múltiplas repetições de etapas individuais (i) e (ii) pode ser utilizada.
Em geral, o método é realizado entre 20-60 °C, e de maneira ideal a 40±5 °C. Embora o primeiro e o segundo componentes de emulsão possam ser relativamente estáveis mesmo em temperaturas mais altas, colapso térmico de alguns 5 componentes podem ainda ocorrer e assim temperaturas menores são preferidas.
Componentes de emulsão 0 tamanho de goticula de óleo médio (isto é, o diâmetro médio em número da goticulas de óleo da emulsão) pode ser medido utilizando uma técnica de dispersão de luz dinâmica, como é descrito na referência 13. Um exemplo de uma máquina de medição de dispersão de luz dinâmica é o analisador de tamanho de partícula submicrónica Nicomp 380 (de Particle Sizing Systems). O número de partículas que têm um tamanho > 1,2 pm pode ser medido utilizando um contador de partículas tal como o Accusizer™ 770 (de Particle Sizing Systems).
Os métodos da invenção são utilizados para o fabrico de emulsões de óleo-em-água. Estas emulsões incluem três ingredientes núcleo: um óleo; um componente aquoso; e um tensioactivo.
Devido a que as emulsões são destinadas a utilização farmacêutica então o óleo será tipicamente biodegradável (metabolizável) e biocompatível. O óleo utilizado pode compreender esqualeno, um óleo de fígado de tubarão que é um terpenóide ramificado, insaturado (C30H50; [ (CH3) 2C [=CHCH2CH2C (CH3) ] 2=CHCH2-] 2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9). Esqualeno é particularmente preferidos para utilização na presente invenção. O óleo da presente invenção pode compreender uma mistura (ou combinação) de óleos, por exemplo, que compreende esqualeno e pelo menos um óleo adicional.
Ao invés de (ou além de) utilizar esqualeno uma emulsão pode compreender óleo(s) incluindo aqueles de, por exemplo, um animal (tal como peixe) ou uma fonte vegetal. Fontes para óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e óleo de oliva, os mais comummente disponíveis, exemplificam os 6 óleos de noz. Óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo, obtidos da semente de jojoba. Óleos de semente incluem óleo de açafrão, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e semelhantes. No grupo de grãos, óleo de milho é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos de cereal tal como trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticale e semelhantes podem também ser utilizados. Ésteres de ácido gordo de 6-10 carbonos de glicerol e 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente em óleos de semente, podem ser preparados por meio de hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados partindo dos óleos de nozes e sementes. Óleos e gorduras de leite de mamíferos são metabolizáveis e assim pode ser utilizada. Os procedimentos para a separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para a obtenção de óleos puros de fontes animais são bem conhecidos na especialidade. A maioria dos peixes contêm óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia tal como espermacete exemplificam diversos dos óleos de peixe que podem ser utilizados no presente documento. Um número de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de isopreno 5-carbono e são geralmente referidas como terpenóides. Esqualano, o análogo saturado de esqualeno, pode também ser utilizado. Óleos de peixe, incluindo esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveis de fontes comerciais ou podem ser obtidos por meio de métodos conhecidos na especialidade.
Outros óleos úteis são os tocoferóis, particularmente em combinação com esqualeno. Onde a fase de óleo de uma emulsão inclui um tocoferol, qualquer dos α, β, γ, δ, 8 ou ξ tocoferóis podem ser utilizada, mas α-tocoferóis são preferidos. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ambos ser utilizados. Um α-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol. O 7 tocoferol pode tomar diversas formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isómeros. Sais incluem sais orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se um sal deste tocoferol é para ser utilizada, o sal preferido é o succinato. Uma combinação de óleo que compreende esqualeno e um tocoferol (por exemplo, DL-a-tocoferol) pode ser utilizada. 0 componente aquoso pode ser água (por exemplo, w.f.i.) ou pode incluir componentes adicionais, por exemplo, solutos. Por exemplo, podem incluir sais para formar um tampão, por exemplo, sais de citrato ou fosfato, tais como sais de sódio. Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidina; ou um tampão citrato. Tampões serão tipicamente incluídos no intervalo de 5-20 mM. 0 tensioactivo é preferentemente biodegradável (metabolizável) e biocompatível. Tensioactivos podem ser classificados por seu 'HLB' (equilíbrio hidrófilo/lipófilo), onde um HLB no intervalo de 1-10 geralmente significa que o tensioactivo é mais solúvel em óleo que em água, e um HLB no intervalo de 10-20 é mais solúvel em água que em óleo. Emulsões preferentemente compreendem pelo menos um tensioactivo que tem um HLB de pelo menos 10, por exemplo, pelo menos 15, ou preferentemente pelo menos 16. com A invenção pode ser utilizada com tensioactivos incluindo, mas não limitados a: os tensioactivos de ésteres de polioxietileno sorbitano (comummente referidos como os Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido butileno (BO), vendido sob o nome comercial DOWFAX™, tal como copolímeros de bloco de EO/PO lineares; octoxinóis, que pode varias no número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiil) repetidos, com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse; (octilfenoxi)poli- etoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipideos tal como fosfatidilcolina (lecitina); derivado de laurilo de éteres gordos de polioxietileno, cetilo, álcoois de estearilo e oleilo (conhecidos como tensioactivos Brij), tal como trietilenoglicol monolaurilo éter (Brij 30); polioxietileno-9-laurilo éter; e ésteres de sorbitano (comummente conhecidos como os SPANs), tal como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. tensioactivos Preferidos para incluir na emulsão são polissorbato 80 (Tween 80; polioxietileno sorbitano monooleato), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.
Misturas de tensioactivos podem ser incluídas na emulsão, por exemplo, misturas de Tween 80/Span 85, ou misturas de Tween 80/Triton- X100. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano tal como polioxietileno sorbitano monooleato (Tween 80) e um octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) é também adequaod. Outra combinação útil compreende lauret 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol. Misturas úteis podem compreender um tensioactivo com um valor de HLB no intervalo de 10-20 (por exemplo, Tween 80, com um HLB de 15,0) e um tensioactivo com um valor de HLB no intervalo de 1-10 (por exemplo, Span 85, com um HLB de 1,8) .
Formação da primeira emulsão
Antes da etapa de microfluidização, os componentes de emulsão podem ser misturados para formar uma primeira emulsão.
Gotículas de óleo na primeira emulsão podem ter um tamanho médio de 5000 nm ou menos, por exemplo, 4000 nm ou menos, 3000 nm ou menos, 2000 nm ou menos, 12 0 0 nm ou menos, 1000 nm ou menos, por exemplo, um tamanho médio 9 entre 800 e 1200 nm ou entre 300 nm e 800nm.
Na primeira emulsão o número de goticulas de óleo com um tamanho >1,2 pm pode ser 5 x 1011/ml ou menos, por exemplo, 5 x 1010 /ml ou menos ou 5 x 109 /ml ou menos. A primeira emulsão pode então ser microfluidizada para formar uma segunda emulsão que tem um tamanho menor de goticula de óleo médio que a primeira emulsão e/ou menos goticulas de óleo com tamanho >1,2 pm. O tamanho de goticula de óleo médio da primeira emulsão pode ser conseguido pela mistura dos primeiros componentes da emulsão num homogeneizador. Por exemplo, como é mostrado em Figura 1, pode ser combinados num recipiente de mistura (12) e então os componentes combinados podem ser introduzidos (13) num homogeneizador mecânico, tal como um homogeneizador de rotor-estator (1).
Homogeneizadores podem operar numa maneira vertical e/ou horizontal. Por conveniência num ambiente comercial, homogeneizadores em linha são preferidos.
Os componentes são introduzidos num homogeneizador de rotor-estator e encontram um rotor girando rapidamente contendo ranhuras ou orifícios. Os componentes são jogados de forma centrífuga para fora numa maneira semelhante a bomba e passam através das ranhuras/ orifícios. Em algumas formas de realização o homogeneizador inclui múltiplas combinações de rotores e estatores, por exemplo, uma disposição concêntrica de anéis de dente de pente, como é mostrado pelas características (3) & (4); (5) & (6) e (7) & (8) na Figura 1 e na Figura 2. Os rotores em homogeneizadores em grande escala úteis podem ter anéis de dente de pente na borda de um impulsor de múltiplas lâminas orientados horizontalmente (por exemplo, característica (9) na Figura 1) alinhado em tolerância próxima para emparelhar dentes num revestimento estático. A primeira emulsão forma via uma combinação de turbulência, cavitação e cizalhamento mecânico que ocorre dentro da lacuna entre o rotor e o 10 estator. Os componentes são introduzidos de forma útil numa direcção paralela ao eixo do rotor.
Um importante parâmetro de desempenho em homogeneizadores de rotor-estator é a velocidade de ponta do rotor (velocidade periférica). Este parâmetro é uma função tanto da velocidade de rotação como do diâmetro do rotor. Uma velocidade de ponta de pelo menos 10 ms-1 é útil, e de maneira ideal mais rápido, por exemplo, >20 ms-1, >30 ms”1, >40 ms”1, etc. Um velocidade de ponta de 40 ms"1 pode ser facilmente conseguida a 10.000 rpm com um pequeno homogeneizador ou a menores velocidades de rotação (por exemplo, 2.000 rpm) com um homogeneizador maior. Homogeneizadores de alto cisalhamento adequados são comercialmente disponíveis.
Para fabrico em escala comercial o homogeneizador deveria de maneira ideal ter uma taxa de fluxo de pelo menos 300 L/h, por exemplo, >400 L/h, >500 L/h, >600 L/h, >700 L/h, >800 L/h, >900 L/h, >1000 L/h, >2000 L/h, 5000 L/h, ou Mesmo >10000 L/h. Homogeneizadores de alta capacidade adequados são comercialmente disponíveis.
Um homogeneizador preferido proporciona uma taxa de cizalhamento de entre 3xl05 e lxlO6 s”1, por exemplo, entre 3xl05 e 7xl05 s”1, entre 4xl05 e 6xl05 s”1, por exemplo, cerca de 5xl05 S”1.
Embora o homogeneizador de rotor-estator gere relativamente puco calor durante a operação, o homogeneizador pode ser arrefecido durante a utilização. De maneira ideal, a temperatura da primeira emulsão é mantido abaixo der 60 °C durante a homogeneização, por exemplo, a seguir 45 °C.
Em algumas formas de realização o primeiro componente de emulsão pode ser homogeneizado múltiplas vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes) . Para evitar a necessidade de u ma longa séria de contentores e homogeneizadores a componentes de emulsão 11 podem em vez disso ser circulados (por exemplo, como é mostrado pela caracteristica (11) em Figura 1) . Em particular, a primeira emulsão pode ser formada pela circulação dos primeiros componentes de emulsão através de um homogeneizador uma pluralidade de vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, etc. vezes). No entanto, ciclos demais podem ser indesejáveis já que pode produzir re-coalescência como é descrito na referência 14. Assim o tamanho de goticulas de óleo pode ser monitorada se homogeneizador circulação é utilizada para verificar que um tamanho desejado de goticula é alcançado e/ou que não está ocorrendo re-coalescência. A circulação através do homogeneizador é vantajosa devido a que pode reduzir o tamanho médio das goticulas de óleo na primeira emulsão. Circulação é também vantajosa devido a que pode reduzir o número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm na primeira emulsão. Estas reduções em tamanho médio de goticula e número de goticulas >1,2 pm na primeira emulsão pode proporcionar vantagens no(s) processo(s) a jusante. Em particular, a circulação dos primeiros componentes de emulsão através do homogeneizador pode levar a um processo de microfluidização melhorado que pode então resultar num número reduzido de goticulas de óleo que têm um tamanho 1,2 pm na segunda emulsão, isto é, após a microfluidização. Esta melhoria nos segundos parâmetros de emulsão pode proporcionar desempenho de filtração melhorada. O desempenho de filtração melhorada pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão de óleo-em-água é MF59.
Dois tipos de circulação particulares são referidos no presente documento como "tipo I" e "tipo II". A circulação de tipo I é ilustrada na Figura 5, enquanto a circulação de tipo II é ilustrada na Figura 6. A circulação dos primeiros componentes de emulsão pode 12 compreender uma circulação de tipo I de transferência dos primeiros componentes de emulsão entre um primeiro contentor de pré-mistura e um homogeneizador. 0 primeiro contentor de pré-mistura pode ser desde 50 até 500 L em tamanho, por exemplo, de 100 a 400 L, de 100 a 300 L, de 200 a 300 L, 250 L ou 280 L. O primeiro contentor de pré-mistura pode ser fabricado de aço inoxidável. A circulação de tipo I pode ser continuada durante de 10 a 60 minutos, por exemplo, de 10 a 40 minutos ou 20 minutos. A circulação dos primeiros componentes de emulsão pode compreender uma circulação de tipo II de transferência dos primeiros componentes de emulsão de um primeiro contentor de pré-mistura, através de um primeiro homogeneizador a um segundo contentor de pré-mistura (opcionalmente que têm as mesmas propriedades como o primeiro contentor de pré-mistura) , e então através de um segundo homogeneizador. O segundo homogeneizador usualmente será o mesmo que o primeiro homogeneizador, mas em algumas disposições o primeiro e o segundo homogeneizadores são diferentes. Em segui à passagem dos primeiros componentes de emulsão através do segundo homogeneizador, os primeiros componentes de emulsão podem ser transferidos de volta ao primeiro contentor de pré-mistura, por exemplo, se o processo circulação de tipo II é para ser repetido. Assim os componentes de emulsão podem viajar numa figura de oito rota entre o primeiro e segundo contentores de pré-mistura via um homogeneizador individual (veja-se a Figura 6) . A circulação de tipo II pode ser levada a cabo uma única vez ou uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 etc vezes. A circulação de tipo II é vantajosa, em comparação com a circulação de tipo I, porque pode ajudar a garantir que a totalidade dos componentes da primeira emulsão passe através do homogeneizador. O esvaziamento do primeiro contentor de pré-mistura significa que o conteúdo de 13 emulsão completo passou através do homogeneizador, no segundo contentor de pré-mistura. De maneira similar, o conteúdo do segundo contentor de pré-mistura pode ser esvaziado, de novo garantindo que todos passaram através do homogeneizador. Assim a disposição de tipo II pode assegurar de maneira conveniente que a totalidade dos componentes de emulsão são homogeneizados pelo menos duas vezes, o que pode reduzir tanto o tamanho médio das goticulas de óleo como o número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 μιη na primeira emulsão. Um circulação de tipo II ideal assim envolve esvaziar o primeiro contentor de pré-mistura e passar substancialmente a totalidade do seu conteúdo através do homogeneizador no segundo contentor de pré-mistura, seguido pelo esvaziamento do segundo contentor de pré-mistura e re-passar substancialmente a totalidade do seu conteúdo através do homogeneizador de volta no primeiro contentor de pré-mistura. Assim todas as partículas passam através do homogeneizador pelo menos duas vezes, enquanto isto é difícil de conseguir com a circulação de tipo I.
Em algumas formas de realização uma combinação de circulações de tipo I e tipo II é utilizada, e esta combinação pode proporcionar uma primeira emulsão com boas características. Em particular, esta combinação pode reduzir enormemente o número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm na primeira emulsão. Esta combinação podem compreender qualquer ordem de circulação de tipo I e II, por exemplo, tipo I seguido por tipo II, tipo II seguido por tipo I, tipo I seguido por tipo II seguido por tipo I de novo etc. Numa forma de realização, a combinação compreende 20 minutos de circulação de tipo I seguido por uma única circulação de tipo II, isto é, transferência dos primeiros componentes de emulsão circulados de um primeiro contentor de pré-mistura, através de um primeiro homogeneizador para um segundo contentor de pré-mistura, e 14 então através de um segundo homogeneizador uma vez. 0 primeiro e o segundo contentores de pré-mistura podem ser mantidos sob um gás inerte, por exemplo, azoto, por exemplo, a até 0,5 bar. Isto pode evitar que os componentes de emulsão oxidem, o que é particularmente vantajoso se um dos componentes de emulsão é esqualeno. Isto pode proporcionar um aumento na estabilidade da emulsão.
Como foi mencionado anteriormente, a entrada inicial para o homogeneizador pode ser uma mistura não homogeneizada dos primeiros componentes de emulsão. Esta mistura pode ser preparada pela mistura dos primeiros componentes individual de emulsão individualmente mas, em algumas formas de realização, componentes múltiplos podem ser combinados antes desta mistura. Por exemplo, se a emulsão inclui um tensioactivo com um HLB a seguir 10 então este tensioactivo pode ser combinado com um óleo antes de misturar. De maneira similar, se a emulsão inclui um tensioactivo com um HLB acima de 10 então este tensioactivo pode ser combinado com um componente aquoso antes de misturar. Sais de tampão podem ser combinados com um componente aquoso antes de misturar, ou pode ser adicionado separadamente.
Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim um método pode envolvem preparar uma primeira emulsão cujo volume é superior a 1 litro, por exemplo, > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, >250 litros, etc.
Após sua formação, a primeira emulsão pode ser microfluidizada, ou pode ser armazenada para esperar a microfluidização.
Em algumas formas de realização, em particular aquelas onde múltiplos ciclos de etapas (i) e (ii) são utilizados, a entrada para o homogeneizador será a saida de um microfluidizador, tal que a primeira emulsão é 15 microfluidizada e então de novo submetido a homogeneização. Microfluidização
Após sua formação a primeira emulsão é microfluidizada com a finalidade de reduzir seu tamanho de goticula de óleo médio e/ou para reduzir o número de goticulas de óleo que têm um tamanho de >1,2 pm.
Instrumentos de microfluidização reduzem o tamanho de goticula de óleo médio por correntes impulsionadas de componentes de entrada através de canais geometricamente fixos a alta pressão e alta velocidade. A pressão na entrada à câmara de interacção (também denominada a "primeira pressão") pode ser substancialmente constante (isto é, ±15 %; por exemplo, ±10 %, ±5 %, ±2 %) durante pelo menos 8 5 % do tempo durante que componentes são alimentados no microfluidizador, por exemplo, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 99 % ou 100 % do tempo durante o qual a emulsão é alimentada no microfluidizador.
Em uma forma de realização, a primeira pressão é 1300 bar ± 15 % (18 KPSI ± 15 %), isto é, entre 1100 bar e 1500 bar (entre 15 kPSI e 21 kPSI) durante 85 % do tempo durante o qual a emulsão é alimentada no microfluidizador. Dois perfis de pressão adequados são mostrados em Figura 3. Na Figura 3A a pressão é substancialmente constante durante pelo menos 85 % do tempo, enquanto em Figura 3B a pressão continuamente permanece substancialmente constante.
Um aparelho de microfluidização tipicamente compreende pelo menos uma bomba intensificadora (preferentemente duas bombas, que podem ser sincrónicas) e uma câmara de interacção. A bomba intensificadora, que é de maneira ideal accionada de modo eléctrico-hidráulico, proporciona alta pressão (isto é, a primeira pressão) to força uma emulsão em e através da câmara de interacção. A natureza sincrónica da bombas intensificadoras pode ser utilizada para proporcionar a pressão substancialmente constante da 16 emulsão discutida anteriormente, o que significa que a goticulas de emulsão são todas expostas a substancialmente o mesmo nível de forças de cizalhamento durante a microfluidização.
Uma vantagem da utilização de uma pressão substancialmente constante é que pode reduzir os falhos por fadiga no dispositivo de microfluidização, que pode levar a uma vida mais longa do dispositivo. Uma vantagem adicional da utilização de uma pressão substancialmente constante é que os parâmetros da segunda emulsão podem ser melhorados. Em particular, o número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm presentes na segunda emulsão pode ser reduzida. Além disso, o tamanho de gotícula de óleo médio da segunda emulsão pode ser reduzido quando uma pressão substancialmente constante é utilizada. A redução no tamanho de gotícula de óleo médio e no número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm na segunda emulsão pode proporcionar desempenho de filtração melhorado. 0 desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão é MF59. A câmara de interacção pode conter uma pluralidade, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc, de canais de geometria fixa em que a emulsão passa. A emulsão entra na câmara de interacção através de uma linha de entrada que pode ter um diâmetro de entre 200 e 250 mm. A emulsão se divide em correntes conforme entra na câmara de interacção e, sob alta pressão, acelera a alta velocidade. Conforme passa através dos canais, a forças produzida pela alta pressão pode agir para reduzir o tamanho de gotícula de óleo da emulsão e reduzir o número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm. Estas forças podem incluir: forças de cizalhamento, através de deformação da corrente de emulsão que ocorre a partir do com paredes do canal; forças de impacto, através de colisões que ocorrem quando 17 correntes de emulsão em alta velocidade colidem uma com a outra; e forças de cavitação, através de formação e colapso de cavidades dentro da corrente. A câmara de interacção usualmente inclui partes não móveis. Podem incluir superfícies de canal de cerâmica (por exemplo, alumina) ou diamante (por exemplo, diamante policristalino). Outras superfícies podem ser feitas de aço inoxidável. A geometria fixa da pluralidade de canais na câmara de interacção pode ser geometria de tipo "Y" ou geometria de tipo "Z".
Numa câmara de interacção de geometria de tipo Y uma única corrente de emulsão de entrada é dividida em primeira e segunda correntes de emulsão, que são então recombinadas num única corrente de emulsão de saída. Antes de recombinação, cada uma das primeira e segunda correntes de emulsão podem independentemente ser divididas numa primeira e segunda pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) de sub-correntes. Quando as correntes de emulsão são recombinadas, a primeira e segunda correntes de emulsão (ou suas sub- correntes) estão de maneira ideal a fluir em direcções substancialmente opostas (por exemplo, a primeira e segunda correntes de emulsão, ou suas sub- correntes, estão a fluir em substancialmente o mesmo plano (± 20°) e a direcção de fluxo da primeira corrente de emulsão é 180 ± 20° diferente da direcção de fluxo da segunda corrente de emulsão). As forças produzidas quando a correntes de emulsão são recombinadas podem agir para reduzir o tamanho de gotícula de óleo da emulsão e reduzir o número de gotículas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm.
Numa câmara de interacção de geometria de tipo Z a corrente de emulsão passa ao redor de uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc) de cantos em ângulo substancialmente recto (isto é, 90 ± 20°). A Figura 4 ilustra uma câmara de interacção com geometria de tipo Z e dois cantos em ângulo recto na direcção de fluxo. Durante 18 sua passagem ao redor dos cantos, um corrente de emulsão de entrada pode ser dividida numa pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) de sub-correntes e então recombinadas num única corrente de emulsão de saída (por exemplo, como é mostrado em Figura 4, com guatro sub-correntes (32)). A divisão e então recombinação (31) podem ocorrer em qualquer ponto entre a entrada e a saída. As forças produzidas quando a emulsão entra em contacto com as paredes do canal conforme passa ao redor dos cantos podem agir para reduzir o tamanho de gotícula de óleo da emulsão e reduzir o número de gotículas de óleo que têm um tamanho >1,2 μιη. Um exemplo de uma câmara de interacção de tipo Z é a câmara de interacção E230Z de Microfluidics.
Em uma forma de realização, a corrente de emulsão passa ao redor de dois cantos em ângulo substancialmente recto. No ponto quando a entrada corrente de emulsão passa ao redor do primeiro canto em ângulo substancialmente recto, é dividido em cinco sub-correntes. No ponto quando as sub-correntes passam ao redor do segundo canto em ângulo substancialmente recto, são recombinadas numa única corrente de emulsão de saída.
No estado da técnica tem sido usual utilizar Câmaras de interacção de tipo Y para emulsões de óleo-em-água como aquelas da presente invenção. No entanto, foi descoberto que é vantajosa a utilização uma câmara de interacção com geometria de canal de tipo Z para emulsões de óleo-em-água porque isto pode levar a uma maior redução no número de gotículas de óleo que têm um tamanho de >1,2 μιη presentes na segunda emulsão em comparação com uma câmara de interacção de geometria de tipo Y. A redução em número de gotículas de óleo que têm um tamanho >1,2 μιη na segunda emulsão pode proporcionar desempenho de filtração melhorado. O desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante a filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão é 19 MF59 .
Um aparelho de microfluidização preferido opera a uma pressão entre 170 bar e 2750 bar (aproximadamente de 2500 psi a 40000 psi), por exemplo, a cerca de 345 bar, cerca de 690 bar, cerca de 1380 bar, cerca de 2070 bar, etc.
Um aparelho de microfluidização preferido opera a uma taxa de fluxo de até 20 L/min, por exemplo, até 14 L/min, até 7 L/min, até 3,5 L/min, etc.
Um aparelho de microfluidização preferido tem uma câmara de interacção que proporciona um taxa de cizalhamento em excesso de lxlO6 s-1, por exemplo, > 2,5x106s~1, >5x106 s-1, >107s-1, etc.
Um aparelho de microfluidização podem incluir múltiplas câmaras de interacção que são utilizadas em paralelo, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais, mas é mais útil incluir uma única câmara de interacção. O dispositivo de microfluidização pode compreender um módulo de processamento auxiliar (APM; também conhecidos em microfluidizadores como uma câmara de contrapressão — estes termos são utilizada de maneira intercambiável no presente documento) que compreende pelo menos um canal. O APM contribui para a redução no tamanho médio das gotículas de óleo na emulsão sendo passada através do dispositivo de microfluidização, embora a maioria da redução ocorra na câmara de interacção. Como foi mencionado anteriormente, os componentes de emulsão são introduzidos à câmara de interacção pela(s) bomba(s) intensificadora sob uma primeira pressão. Os componentes de emulsão geralmente saem do APM a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão (por exemplo, pressão atmosférica). Em geral, entre 80 e 95 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de interacção (por exemplo, desde Pi até P2 em Figura 4) e de 5 a 20 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui bruscamente através do módulo de processamento 20 auxiliar, por exemplo, a câmara de interacção pode proporcionar aproximadamente 90 % da queda de pressão enquanto o APM pode proporcionar aproximadamente 10 % da queda de pressão. Se a pressão cai bruscamente através da câmara de interacção e a pressão cai bruscamente através do módulo de processamento auxiliar do não conta para a totalidade da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressão, Isto podem ser devido a um queda de pressão finita através dos conectores entre a câmara de interacção e o módulo de processamento auxiliar. O APM usualmente inclui partes não móveis. Pode incluir superfícies de canal de cerâmica (por exemplo, alumina) ou diamante (por exemplo, diamante policristalino). Outras superfícies podem ser feitas de aço inoxidável. 0 APM é geralmente posicionado a jusante da câmara de interacção e pode também ser posicionado sequencial à câmara de interacção. No estado da técnica, APMs são geralmente posicionada a jusante de câmaras de interacção que compreende canais de tipo Y para suprimir a cavitação e deste modo aumentar a taxa de fluxo na câmara de tipo Y em até 30 %. Além disso, no estado da técnica APMs são geralmente posicionados a montante de câmaras de interacção que compreende canais de tipo Z para reduzir o tamanho de aglomerados grandes. No último caso, o APM somente diminui a taxa de fluxo nas câmaras de tipo Z em até 3 %. No entanto, encontrou-se que o posicionamento do APM a jusante de uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z é vantajosa na presente invenção porque pode levar a uma maior redução em tamanho de gotícula de óleo médio e uma maior redução no número de gotículas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 pm presentes na segunda emulsão. Como foi discutido anteriormente, a redução em número de gotículas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm na segunda emulsão pode proporcionar desempenho de filtração 21 melhorado. 0 desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão de óleo-em-água é MF59. Uma vantagem adicional deste posicionamento de uma câmara de interacção de tipo Z e um APM a jusante é que it pode levar a uma diminuição de pressão mais lenta após a câmara de interacção. A diminuição de pressão mais lenta pode levar a um aumento em estabilidade do produto porque existe menos gás encerrado na emulsão.
Um APM contém pelo menos um canal de geometria fixa em que a emulsão passa. O APM pode conter uma pluralidade, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc, de canais de geometria fixa em que a emulsão passa. O canal ou canais do APM podem ser lineares ou não lineares. Canais não lineares adequados são de geometria de tipo "Z" ou geometria de tipo "Y", que são o mesmo que aqueles foi descrito anteriormente para a câmara de interacção. Numa forma de realização, o canal, ou canais, do APM são de geometria de tipo Z. Uma pluralidade de canais de tipo Z divide a emulsão em correntes conforme entra no APM.
Em contraste às recomendações dos fabricantes, a utilização de um APM que compreende uma pluralidade de canais de geometria fixa é vantajosa em comparação com um único canal de geometria fixa APM porque pode levar a uma maior redução no número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm presentes na segunda emulsão. Como foi discutido anteriormente, a redução no número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm na segunda emulsão pode proporcionar desempenho de filtração melhorado. O desempenho de filtração melhorado pode levar a menos perdas de conteúdo durante filtração, por exemplo, perdas de esqualeno, Tween 80 e Span 85 quando a emulsão de óleo-em-água é MF 5 9 .
Um aparelho de microfluidização gera calor durante a 22 operação, que pode aumente uma temperatura de emulsão em 15-20 °C com relação à primeira emulsão. Vantajosamente, portanto, a emulsão microfluidizada é arrefecida tão logo quanto possível. A temperatura da segunda emulsão pode ser mantida abaixo de 60 °C, por exemplo, abaixo de 45 °C. Assim uma saída da câmara de interacção e/ou um saída do APMs pode alimentar num mecanismo de arrefecimento, tal como um permutador de calor ou serpentina de refrigeração. A distância entre a saída e o mecanismo de arrefecimento deve ser mantido tão curta quanto como possível para encurtar o tempo global reduzindo atrasos por arrefecimento. Numa forma de realização, a distância entre a saída do microfluidizador e o mecanismo de arrefecimento é entre 20-30 cm. Um mecanismo de arrefecimento é particularmente útil quando uma emulsão é submetida a múltiplas etapas de microfluidização, para prevenir sobreaquecimento da emulsão. O resultado da microfluidização é uma emulsão de óleo-em-água, a segunda emulsão, em que o tamanho médio das gotículas de óleo é de 500 nm ou menos. Este tamanho médio é particularmente útil já que facilita a esterilização por filtro da emulsão. Emulsões em que pelo menos 80 % em número das gotículas de óleo têm um tamanho médio de 500 nm ou menos, por exemplo, 400 nm ou menos, 300 nm ou menos, 200 nm ou menos ou 165 nm ou menos, são particularmente útil. Além disso, o número de gotículas de óleo na segunda emulsão que tem um tamanho > 1,2 μιη é 5 x 1010 /ml ou menos, por exemplo, 5 x 109 /ml ou menos, 5 x 108 /ml ou menos ou 2 x 108 /ml ou menos. A entrada inicial para a microfluidização pode ser a primeira emulsão. Em algumas formas de realização, no entanto, a emulsão microfluidizada é submetida a microfluidização de novo, tal que múltiplas séries de microfluidização ocorrem. Em particular, a segunda emulsão pode ser formada pela circulação dos segundos componentes 23 de emulsão através de um dispositivo de microfluidização uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc vezes. A segunda emulsão pode ser formada pela circulação dos segundos componentes de emulsão através de um dispositivo de microfluidização de 4 a 7 vezes. A circulação dos segundos componentes de emulsão pode compreender uma circulação de tipo I de transferência dos segundos componentes de emulsão entre um primeiro contentor de emulsão (opcionalmente que têm as mesmas propriedades como o primeiro contentor de pré-mistura) e o dispositivo de microfluidização. A circulação dos segundos componentes de emulsão pode compreender uma circulação de tipo II de transferência dos segundos componentes de emulsão desde um primeiro contentor de emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização até um segundo contentor de emulsão (opcionalmente que têm as mesmas propriedades como o primeiro contentor de pré-mistura), e então através de um segundo dispositivo de microfluidização. O segundo dispositivo de microfluidização pode ser o mesmo que o primeiro dispositivo de microfluidização. Alternativamente, o segundo dispositivo de microfluidização pode ser diferente do primeiro dispositivo de microfluidização. O primeiro contentor de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro contentor de pré-mistura. Alternativamente, a primeiro contentor de emulsão pode ser o mesmo que o segundo contentor de pré-mistura. O segundo contentor de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro contentor de pré-mistura. Alternativamente, a segundo contentor de emulsão pode ser o mesmo que o segundo contentor de pré-mistura. O primeiro contentor de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro contentor de pré-mistura e o segundo contentor de emulsão pode ser o mesmo que o segundo contentor de pré- mistura. Alternativamente, o primeiro contentor de emulsão pode ser o mesmo que o segundo contentor de pré-mistura e o segundo contentor de emulsão pode ser o mesmo que o primeiro contentor de pré-mistura.
Como um alternativa, o primeiro e o segundo contentores de emulsão podem ser diferentes do primeiro e o segundo contentores de pré-mistura.
Em seguida à passagem dos segundos componentes de emulsão através do segundo dispositivo de microfluidização, os segundos componentes de emulsão podem ser transferidos de volta ao primeiro contentor de emulsão, por exemplo, se a circulação de tipo II processo é para ser repetida. A circulação de tipo II pode ser levada a cabo uma única vez ou uma pluralidade de vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 etc vezes. A circulação de tipo II é vantajosa já que assegura que a totalidade dos segundos componentes de emulsão passaram através do dispositivo de microfluidização pelo menos 2 vezes, o que reduz o tamanho médio das goticulas de óleo e o número de goticulas de óleo que têm um tamanho >1,2 pm na segunda emulsão.
Uma combinação de circulação de tipo I e circulação de tipo II pode ser utilizada durante a microfluidização. Esta combinação pode compreender qualquer ordem de circulação de tipo I e II, por exemplo, tipo I seguido por tipo II, tipo II seguido por tipo I, tipo I seguido por tipo II seguido por tipo I de novo etc. 0 primeiro e o segundo contentores de emulsão podem ser mantidos sob um gás inerte, por exemplo, até 0,5 bar de azoto. Isto evita que os componentes de emulsão se oxidem, o que é particularmente vantajoso se um dos componentes de emulsão é esqualeno. Isto leva a um aumento na estabilidade da emulsão.
Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim um método pode envolver microfluidizar um 25 volume superior a 1 litro, por exemplo, >5 litros, >10 litros, >20 litros, >50 litros, >100 litros, >250 litros, etc.
Filtração
Após a microfluidização, a segunda emulsão é filtrada. Esta filtração retira quaisquer goticulas grandes de óleo que têm sobreviveram aos procedimentos de homogeneização e microfluidização. Embora pequeno em termos de número, estas goticulas de óleo podem ser grandes em termos de volume e podem agir como locais de nucleação para agregação, levando a degradação da emulsão durante o armazenamento. Além disso, esta etapa de filtração pode conseguir esterilização por filtro. A membrana de filtração particular adequada para esterilização por filtro depende das caracteristicas de fluido da segunda emulsão e o grau de filtração requerido. Umas caracteristicas de filtro podem afectar sua adequabilidade para filtração da emulsão microfluidizada. Por exemplo, seu tamanho de poro e caracteristicas de superfície podem ser importantes, particularmente quando se filtra uma emulsão a base de esqualeno. O tamanho de poro de membranas utilizadas com a invenção deve permitir a passagem das goticulas desejadas enquanto retém as goticulas indesejadas. Por exemplo, deveria reter goticulas que têm um tamanho de > 1 pm enquanto permite a passagem de goticulas < 200nm. Um filtro de 0,2 pm ou 0,22 pm é ideal, e pode também conseguir esterilização por filtro. A emulsão pode ser pré-filtrada, por exemplo, através de um filtro de 0,45 pm. A pré-filtração e filtração podem ser conseguidas em uma etapa pela utilização de conhecidos filtros de dupla camada que incluem um primeira camada de membrana com poros maiores e um segunda camada de membrana com poros menores. Filtros de dupla camada são particularmente úteis com a invenção. A primeira camada de 26 maneira ideal tem um tamanho de poro >0,3 μιη, tal como entre 0,3-2 μιη ou entre 0,3-1 μπι, ou entre 0,4-0,8 μπι, ou entre 0,5-0,7 μπι. Um tamanho de poro de <0,75 μιη na primeira camada é preferido. Assim a primeira camada pode ter um tamanho de poro de 0,6 μιη ou 0,45 μπι, por exemplo. A segunda camada de maneira ideal tem um tamanho de poro que é menos de 75 % de (e de maneira ideal menos de a metade de) o tamanho de poro da primeira camada, tal como entre 25-70 % ou entre 25-49 % do tamanho de poro da primeira camada, por exemplo, entre 30-45 %, tal como 1/3 ou 4/9, do tamanho de poro da primeira camada. Assim a segunda camada pode ter um tamanho de poro <0,3 μπι, tal como entre 0,15-0,28 μπι ou entre 0,18-0,24 μπι, por exemplo, um tamanho de poro de 0,2 μπι ou 0,22 μπι da segunda camada. Num exemplo, a primeira camada de membrana com poros maiores proporciona um filtro de 0,45 μπι, enquanto a segunda camada de membrana com poros menores proporciona um filtro de 0,22 μπι. A membrana de filtração e/ou a membrana de pré-filtração pode ser assimétrica. Uma membrana assimétrica é uma em que o tamanho de poro varia desde um lado da membrana ao outro, por exemplo, em que o tamanho de poro é maior na face de entrada que na face de saída. Um lado da membrana assimétrica pode ser referido como a "superfície de poro mais grosso", enquanto o outro lado da membrana assimétrica pode ser referidos como a "superfície de poro fino". Num filtro de dupla camada, um ou (de maneira ideal) ambas as camadas podem ser assimétricas. A membrana de filtração pode ser porosa ou homogénea. Um membrana homogénea é usualmente um filme denso que varia desde 10 até 200 μπι. Uma membrana porosa tem uma estrutura porosa. Numa forma de realização, a membrana de filtração é porosa. Num filtro de camada dupla, ambas as camadas podem ser porosas, ambas as camadas podem ser homogéneas, ou pode existir uma camada porosa e uma homogénea. Um filtro de camada dupla preferido é um em que ambas as camadas são 27 porosas .
Em uma forma de realização, a segunda emulsão é pré-filtrada através de uma membrana porosa assimétrica, hidrofílica e então filtrada através de outra membrana porosa assimétrica hidrofílica que têm poros menores que a membrana de pré-filtração. Isto pode utilizar um filtro de camada dupla. A(s) membrana(s) de filtro pode ser autoclavadas antes de utilização para garantir que é/são estéril(eis).
Membranas de filtração são tipicamente feitas de materiais de suporte poliméricos tal como PTFE (politetra-fluoro-etileno) , PES (polietersulfona) , PVP (polivinil pirrolidona), PVDF (fluoreto de polivinilideno) , náilons (poliamidas), PP (polipropileno), celuloses (incluindo ésteres de celulose), PEEK (polieteretercetona), nitrocelulose, etc. Estes têm características variáveis, com alguns suportes sendo intrinsecamente hidrofóbicos (por exemplo, PTFE) e outros sendo intrinsecamente hidrofílicos (por exemplo, acetatos de celulose). No entanto, estas características intrínsecas podem ser modificadas tratando a superfície da membrana. Por exemplo, é conhecido preparar membranas hidrofilizadas ou hidrofobizadas tratando-as com outros materiais (tais como outros polímeros, grafite, silicone, etc.) para revestir a superfície da membrana, por exemplo, veja-se a secção 2,1 de referência 15. Num filtro de camada dupla as duas membranas podem ser feitas de diferentes materiais ou (de maneira ideal) do mesmo material.
Um filtro para ideal utilização com a invenção tem uma superfície hidrofílica, em contraste com o ensinamento das referências 9-12 de que filtros hidrofóbicos (polissulfona) deveriam ser utilizados. Os filtros com superfícies hidrofílicas podem ser formados a partir de materiais hidrofílicos, ou por meio de hidrofilização de materiais hidrofóbicos, e um filtro preferido para utilização com a 28 invenção é uma membrana de polieterssulfona hidrofílica. Diversos métodos diferentes são conhecidos para transformar membranas de PES hidrofóbicas em membranas de PES hidrofilicas. Com frequência é conseguida revestindo a membrana com um polímero hidrofílico. Para proporcionar união permanente do polímero hidrofílico ao PES uma camada de revestimento hidrofílica é usualmente submetida a uma reacção de reticulação ou enxerto. A referência 15 revela um processo para modificar as propriedades de superfície de uma polímero hidrofóbico que tem extremidades de cadeia funcionalizáveis, que compreende colocar em contacto o polímero com uma solução de um fracção de ligante para formar uma ligação covalentes, e então colocar em contacto o polímero hidrofóbico reagido com uma solução de um agente modificante. A referência 16 revela um método de hidrofilização de membrana de PES por meio de revestimento directo da membrana, envolvendo pré-humedecimento com álcool, e então embebimento numa solução aquosa contendo um monómero hidrofílico, um monómero polifuncional (reticulante) e um iniciador de polimerização. 0 monómero e os reticulante são então polimerizados utilizando polimerização iniciada por calor ou UV para formar um revestimento de polímero hidrofílico reticulado na superfície da membrana. De maneira similar, as referências 17 e 18 revelam o revestimento de uma membrana de PES pelo embebimento numa solução aquosa de polímero hidrofílico (óxido de polialquileno) e pelo menos um monómero polifuncional (reticulante) , e então polimerizar um monómero para proporcionar um revestimento hidrofílico não extraível. A Referência 19 descreve a hidrofilização de membrana de PES por uma reacção de enxerto em que uma membrana de PES é submetida a tratamento de plasma de hélio a baixa temperatura seguido por enxerto de monómero hidrofílico N-vinil-2-pirrolidona (NVP) sobre a superfície da membrana. Além disso, tais processos são revelados nas 29
Referências 20 a 26.
Em métodos que não contam com revestimento, PES pode ser dissolvido num solvente, combinado com um aditivo hidrofilico solúvel, e então a solução combinada é utilizada para moldar um membrana hidrofilica, por exemplo, por meio de precipitação ou iniciando co-polimerização. Tais métodos são revelados nas Referências 27 a 33. Por exemplo, a referência 33 revela um método de preparar uma membrana modificada de carga hidrofilica que tem baixos extraiveis de membrana e permite rápida recuperação de resistividade de água ultrapura, que têm um estrutura de rede de polímero interpenetrante reticulada formada preparando um solução polímero de um mistura de PES, PVP, polietilenoimina, e éter alifático diglicidilo, formando um filme fino da solução, e precipitando o filme como uma membrana. Um processo similar é revelado na referência 34.
Abordagens híbridas podem ser utilizadas, em que aditivos hidrofílicos são presentes durante a formação de membrana e são também adicionados posteriormente como um revestimento, por exemplo, veja-se a referência 35.
Hidrofilização de membrana de PES pode também ser conseguida pelo tratamento com plasmas de baixa temperatura. A referência 36 descreve modificação hidrofilica de membrana de PES por meio de tratamento com plasma de CO2 a baixa temperatura.
Hidrofilização de membrana de PES pode também ser conseguida por meio de oxidação, como é descrito na referência 37. Este método envolve pré-humedecimento de um membrana de PES hidrofóbica num líquido que têm uma baixa tensão superficial, expondo a membrana de PES húmida a uma solução aquosa de oxidante, e então aquecimento.
Inversão de fase pode também ser utilizada, como é descrito na referência 38.
Um ideal membrana de PES hidrofilica pode ser obtida por meio de tratamento de PES (hidrofóbico) com PVP 30 (hidrofílica). Tratamento com PEG (hidrofílica) ao invés de de PVP tem sido encontrado para dar um membrana de PES hidrofilizada é que facilmente obstruída (particularmente quando utiliza uma emulsão contendo esqualeno) e também desvantajosamente liberta formaldeído durante autoclavagem.
Um filtro de camada dupla preferido tem uma primeira membrana de PES hidrofílica e uma segunda membrana de PES hidrofílica.
Membranas hidrofílicas conhecidas incluem Bioassure (de Cuno); EverLUX™ polietersulfona; STilUX™ polietersulfona (ambas de Meissner) ; membranas Millex GV, Millex HP, Millipak 60, Millipak 200 e Durapore CVGL01TP3 (de Millipore); Membrana Fluorodyne™ EX EDF, Supor™ EAV; Supor™ EBV, Supor™ EKV (todas de Pall); Sartopore™ (de Sartorius); membrana de PES hidrofílica de Sterlitech; e membrana de PES WFPES de Wolftechnik.
Durante a filtração, a emulsão pode ser mantida a uma temperatura de 40 °C ou menos, por exemplo, 30 °C ou menos, para facilitar a filtração estéril bem sucedida. Algumas emulsões podem não passar através de um filtro estéril quando estão uma temperatura de superior a 40 °C. É vantajosa levar a cabo a etapa de filtração dentro de 24 horas, por exemplo, dentro de 18 horas, dentro de 12 horas, dentro de 6 horas, dentro de 2 horas, dentro de 30 minutos, de produzir a segunda emulsão porque após este tempo pode não ser possível passar a segunda emulsão através do filtro estéril sem entupir o filtro, como é discutido em referência 39.
Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim um método pode envolver filtrar um volume superior a 1 litro, por exemplo, > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc. A emulsão final O resultado de microfluidização e filtração é uma emulsão de óleo-em-água em que o tamanho médio das 31 gotículas de óleo podem ser inferior a 220 nm, por exemplo, 155 ± 20 nm, 155 ± 10 nm ou 155 ± 5 nm, e em que o número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm pode ser 5 x 108 /ml ou menos, por exemplo, 5 x 107 /ml ou menos, 5 x 106 /ml ou menos, 2 x 106 /ml ou menos ou 5 x 105 /ml ou menos. O tamanho de goticula de óleo médio de emulsões descritas no presente documento (incluindo a primeira e a segunda emulsões) é geralmente não inferior a 50 nm.
Os métodos da invenção podem ser utilizados em larga escala. Assim um método pode envolver preparar um emulsão final com um volume superior a 1 litro, por exemplo, > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc.
Uma vez que a emulsão de óleo-em-água foi formada, pode ser transferida em garrafas de vidro estéril. As garrafas de vidro podem ser 5 L, 8 L, ou 10 L em tamanho. Alternativamente, o óleo-em-água pode ser transferido numa bolsa flexível estéril (bolsa flex). A bolsa flex pode ser 50 L, 100 L ou 250 L em tamanho. Além disso, a bolsa flex pode ser ajustada com um ou mais conectores estéreis para conectar a bolsa flex ao sistema. A utilização de um bolsa flex com conectores estéreis é vantajosa em comparação com garrafas de vidro porque a bolsa flex é maior que as garrafas de vidro significando que pode não ser necessário mudar a bolsa flex para armazenar toda a emulsão fabricado numa única batelada. Isto pode proporcionar um sistema fechado estéril para o fabrico da emulsão que pode reduzir a probabilidade de impurezas estarem presentes na emulsão final. Isto pode ser particularmente importante se a emulsão final é utilizada para propósitos farmacêuticos, por exemplo, se a emulsão final for o adjuvante MF59.
Quantidades preferidas de óleo (% em volume) na emulsão final são entre 2-20 %, por exemplo, cerca de 10 %. Um conteúdo de esqualeno de cerca de 5 % ou cerca de 10 % é 32 particularmente útil. Um conteúdo de esqualeno (p/v) de entre 30-50 mg/ml é útil, por exemplo, entre 35-45 mg/ml, 36-42 mg/ml, 38-40 mg/ml, etc.
Quantidades preferidas de tensioactivos (% em peso) na emulsão final são: ésteres de polioxietileno sorbitano (tais como Tween 80) de 0,02 a 2 %, em particular cerca de 0,5 % ou cerca de 1 %; ésteres de sorbitano (tais como Span 85) de 0,02 a 2 %, em particular cerca de 0,5 % ou cerca de 1 %; octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (tais como Triton X—10 0) de 0,001 a 0,1 %, em particular de 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxiet ileno (tais como lauret 9) de 0,1 a 20 %, preferentemente de 0,1 a 10 % e em particular de 0,1 a 1 % ou cerca de 0,5 %. Um conteúdo de polissorbato 80 (p/v) de entre 4-6 mg/ml é útil, por exemplo, entre 4,1-5,3 mg/ml. Um conteúdo de trioleato de sorbitano (p/v) de entre 4-6 mg/ml é útil, por exemplo, entre 4,1-5,3 mg/ml. O processo é particularmente útil para preparar qualquer das seguintes emulsões de óleo-em-água: • Uma emulsão que compreende esqualeno, polissorbato 80 (Tween 80), e trioleato de sorbitano (Span 85). A composição da emulsão em volume pode ser cerca de 5 % de esqualeno, cerca de 0,5 % de polissorbato 80 e cerca de 0,5 % de trioleato de sorbitano. Em termos de peso, estas quantidades se tornam 4,3 % de esqualeno, 0,5 % de polissorbato 80 e 0,48 % de trioleato de sorbitano. Este adjuvante é conhecido como 'MF59'. A emulsão de MF59 vantajosamente inclui iões de citrato, por exemplo, 10 mM de tampão citrato de sódio. • Emulsões que compreendem esqualeno, um α-tocoferol (de maneira ideal DL-a-tocoferol), e polissorbato 80. Estas emulsões podem ter (em peso) desde 2 até 10 % de esqualeno, desde 2 até 10 % de α-tocoferol e desde 0,3 até 3 % de polissorbato 80, por exemplo, 4,3 % de esqualeno, 4,7 % de a-tocoferol, 1,9 % de polissorbato 80. A razão de peso de esqualeno:tocoferol é preferentemente < 1 (por exemplo, 33 0,90) já que isto proporciona uma emulsão mais estável. A razão de volume de esqualeno e polissorbato 80 pode estar presente de cerca de 5:2, ou a uma razão de peso de cerca de 11:5. Tal emulsão pode ser feita dissolvendo polissorbato 80 em PBS para dar um solução a 2 %, então misturando 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-cx-tocof erol e 5 ml de esqualeno), então microfluidizando a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo submicrónicas, por exemplo, com um tamanho entre 100 e 250 nm, preferentemente cerca de 180 nm. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão pode também incluir um monofosforil lipídeo 3-O-desacilado A ('3d-MPL'). A emulsão pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão que compreende esqualeno, um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um succinato de α-tocoferol) . A emulsão pode incluir estes três componentes a uma razão de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 mg/ml de polissorbato 80, 110 mg/ml de Triton X-100 e 100 de mg/ml de succinato de α-tocoferol), e estas concentrações devem incluir qualquer contribuição destes componentes a partir de antigénios. A emulsão pode também incluir um 3d-MPL. A emulsão pode também incluir uma saponina, tal como QS21. A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão que compreende esqualeno, um solvente aquoso, um tensioactivo não iónico de éter de alquil polioxietileno hidrofílico (por exemplo, éter de cetoestearil polioxietileno (12)) e um tensioactivo não iónico hidrofóbico (por exemplo, um éster de sorbitano ou éster manídeo, tal como monoleato de sorbitano ou ' Span 80'). A emulsão é preferentemente termoreversivel e/ou tem pelo menos 90 % das gotículas de óleo (em volume) com um tamanho inferior a 200 nm [40] . A emulsão pode também 34 incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotector (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilinaltosídeo e/ou sacarose); e/ou um alquilpoliglicosideo. Pode também incluir um agonista de TLR4, tal como um cuja estrutura quimica não inclui um anel de açúcar [41] . Tais emulsões podem ser liofilizadas.
As composições destas emulsões, expressas anteriormente em termos de percentagem, pode ser modificadas por meio de diluição ou concentração (por exemplo, por um número inteiro, tal como 2 ou 3 ou por uma fracção, tal como 2/3 ou 3/4), em que suas razões permanecem as mesmas. Por exemplo, um F59 concentrado 2 vezes teria cerca de 10 % de esqualeno, cerca de 1 % de polissorbato 80 e cerca de 1 % de trioleato de sorbitano. Formas concentradas podem ser diluídas (por exemplo, com um solução de antigénio) para dar uma concentração final desejada de emulsão.
As emulsões da invenção são de maneira ideal armazenadas a entre 2 °C e 8 °C. Não devem ser congeladas. Devem de maneira ideal ser mantidas longe da luz directa. Em particular, emulsões contendo esqualeno e vacinas da invenção deveriam ser protegidas para evitar quebra fotoquímica de esqualeno. Se as emulsões da invenção são armazenadas então isto é preferentemente numa atmosfera inerte, por exemplo, N2 ou árgon.
Vacinas
Embora seja possível administrar os adjuvantes de emulsão de óleo-em-água por si a pacientes (por exemplo, para proporcionar um efeito adjuvante para um antigénio que foi administrado separadamente ao paciente), é mais usual misturar o adjuvante com um antigénio antes de administração, para formar uma composição imunogénica, por exemplo, uma vacina. A mistura de emulsão e antigénio pode ocorrer extemporaneamente, no momento de utilização, ou pode ocorrer durante o fabrico da vacina, antes de 35 carregar. Os métodos da invenção podem ser aplicados em ambas as situações.
Assim um método da invenção pode incluir uma etapa de processo adicional de misturar a emulsão com um componente de antigénio. Como uma alternativa, pode incluir uma etapa adicional de embalar o adjuvante num kit como um componente de kit juntamente com um componente de antigénio.
Em geral, portanto, a invenção pode ser utilizada quando se prepara vacinas misturadas ou quando se prepara kits incluindo antigénio e adjuvante prontos para misturar. Onde a mistura ocorre durante fabrico então os volumes de antigénio a granel e emulsão que são misturados serão tipicamente superior a 1 litro, por exemplo, > 5 litros, > 10 litros, > 20 litros, > 50 litros, > 100 litros, > 250 litros, etc. Onde a mistura ocorre no ponto de utilização então os volumes que são misturados serão tipicamente menores de 1 mililitro, por exemplo, < 0,6 ml, < 0,5 ml, < 0,4 ml, < 0,3 ml, < 0,2 ml, etc. Em ambos os casos é usual para volumes substancialmente iguais de emulsão e solução de antigénio a ser misturados isto é, substancialmente 1:1 (por exemplo, entre 1,1:1 e 1:1,1, preferentemente entre 1,05:1 e 1:1,05, e mais preferentemente entre 1,025:1 e 1:1,025). Em algumas formas de realização, no entanto, um excesso de emulsão ou um excesso de antigénio pode ser utilizado [42]. Onde um volume em excesso de um componente é utilizado, o excesso geralmente será de pelo menos 1,5:1, por exemplo, > 2:1, > 2,5:1, > 3:1, > 4:1, > 5:1, etc.
Onde antigénio e adjuvante são apresentados como componentes separados dentro de um kit, são fisicamente separados um do outro dentro do kit, e esta separação pode ser conseguida de várias maneiras. Por exemplo, os componentes podem estar em contentores separados, tais como frascos. Os conteúdos de dois frascos podem então ser misturados quando for necessário, por exemplo, removendo o conteúdo de um frasco e adicionando-o ao outro frasco, ou 36 separadamente removendo o conteúdo de ambos os frascos e misturando-os num terceiro contentor.
Em outra disposição, um dos componentes de kit está numa seringa e o outro está num contentor tal como um frasco. A seringa pode ser utilizada (por exemplo, com uma agulha) para inserir seus conteúdos no frasco para mistura, e a mistura pode então ser retirada na seringa. Os conteúdos misturados da seringa podem então ser administrados a um paciente, tipicamente através de uma nova agulha estéril. Embalando um componente numa seringa elimina a necessidade de utilizar um seringa separada para administração ao paciente.
Em outra disposição preferida, os dois componentes de kit são mantidos juntamente, mas separadamente na mesma seringa, por exemplo, um seringa de câmara dupla, tal como aquelas reveladas nas Referências 43-50 etc. Quando a seringa é accionada (por exemplo, durante a administração a um paciente) então o conteúdo das duas câmaras são misturados. Esta disposição evita a necessidade de uma etapa de mistura separada no momento de utilização. O conteúdo dos vários componentes de kit geralmente todos estarão em forma líquida. Em algumas disposições, um componente (tipicamente o componente de antigénio ao invés do componente de emulsão) está em forma seca (por exemplo, num forma liofilizada), com o outro componente estando em forma líquida. Os dois componentes podem ser misturados com a finalidade de reactivar o componente seco e dar uma composição líquida para administração a um paciente. Um componente liofilizado serão tipicamente localizados dentro de um frasco ao invés de uma seringa. Os componentes secos podem incluir estabilizantes tal como lactose, sacarose ou manitol, bem como misturas dos mesmos, por exemplo, misturas de lactose/sacarose misturas, sacarose /manitol, etc. Uma disposição possível usa um componente de emulsão líquido num seringa pré-carregada e um componente 37 liofilizado de antigénio num frasco.
Se as vacinas contêm componentes além de emulsão e antigénio então estes componentes adicionais podem ser incluídos em um destes dois componentes de kit, ou pode ser parte de um terceiro componente de kit.
Contentores adequados para vacinas misturadas da invenção, ou para componentes individuais de kit, incluem frascos e seringas descartáveis. Estes contentores devem ser estéreis.
Onde uma composição/componente é localizado num frasco, o frasco é preferentemente feito de um vidro ou material plástico. 0 frasco é preferentemente esterilizado antes da composição ser adicionada ao mesmo. Para evitar problemas com pacientes sensíveis a látex, frascos são preferentemente vedados com uma tampa livre de látex, e a ausência de latex em todo o material de embalagem é preferido. Numa forma de realização, um frasco tem uma tampa de borracha de butilo. 0 frasco pode incluir uma única dose de vacina/componente, ou podem incluir mais de uma dose (um frasco 'multidose'), por exemplo, 10 doses. Numa forma de realização, um frasco inclui 10 x 0,25 ml doses de emulsão. Os frascos preferidos são feitos de vidro incolor.
Um frasco pode ter uma coberta (por exemplo, um fecho Luer) adaptada tal que uma seringa pré-carregada pode ser inserida na coberta, o conteúdo da seringa pode ser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir material liofilizado no mesmo), e o conteúdo do frasco pode ser removido de volta na seringa. Após a remoção da seringa do frasco, uma agulha pode então ser unida e a composição podem ser administradas a um paciente. A coberta é preferentemente localizada dentro de um selo ou cobertura, tal que o selo ou cobertura tem que ser removidos antes da coberta pode ser acedida.
Onde uma composição/componente é embalado numa 38 seringa, a seringa não terá normalmente uma agulha unida à mesma, embora uma agulha separada possa ser fornecida com a seringa para montagem e utilização. Agulhas seguras são preferidas. Agulhas de 1 polegada calibre de 23, 1 polegada calibre de 25 e 5/8 polegada calibre de 25 são típicas. As seringas podem ser proporcionadas com etiquetas retiráveis em que o número de lote, estação de influenza e data de expiração do conteúdo podem ser impressos, para facilitar manter um registo. 0 êmbolo na seringa preferentemente tem uma tampa para evitar que o êmbolo seja acidentalmente removido durante aspiração. A seringas podem ter um coberta e/ou êmbolo de borracha de látex. Seringas descartáveis contêm uma única dose de vacina. A seringa geralmente terá uma coberta de ponta para selar a ponta antes da união de uma agulha, e a coberta de ponta é preferentemente feita de uma borracha de butilo. Se a seringa e agulha são embaladas separadamente então a agulha é preferentemente ajustada com uma protecção de borracha de butilo. A emulsão pode ser diluída com um tampão antes de embalar num frasco ou uma seringa. Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris; um tampão borato; um tampão succinato; um tampão de histidina; ou um tampão citrato. Diluição pode reduzir a concentração dos componentes de adjuvante enquanto retêm suas proporções relativas, por exemplo, para proporcionar um adjuvante de "meia potência".
Contentores podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a administração a crianças. Por exemplo, uma seringa contendo uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que mostra um volume de 0,25 ml.
Onde um contentor de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é utilizado, então é preferido utilizar um contentor feito de um vidro de borossilicato ao invés de um vidro de cal sodada. Vários antigénios podem ser utilizados com emulsões de 39 óleo-em-água, incluindo, mas não limitados a: antigénios virais, tais como proteínas virais de superfície; antigénios bacterianos, tais como proteína e/ou antigénios de sacárido; antigénios fúngicos; antigénios de parasita; e antigénios de tumor. A invenção é particularmente útil para vacinas contra vírus influenza, HIV, ancilóstomo, vírus da hepatite B, vírus da herpes simplex, ravia, vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, Staphilococcus aureus, clamídia, coronavírus SARS, vírus da varicela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Epstein Barr vírus, papilomavírus humano, etc. Por exemplo: • Antigénios de vírus influenza. Estes podem tomar a forma de um vírus vivo ou um vírus inactivado. Onde um vírus inactivado é utilizado, a vacina podem compreender virião completo, virião dividido, ou antigénios de superfície purificados (incluindo hemaglutinina e, usualmente, também incluindo neuraminidase). Antigénios de influenza podem também ser apresentados na forma de virossomas. 0 antigénios podem ter qualquer subtipo de hemaglutinina, seleccionada a partir de Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H 10, Hll, H12, H 13, H 14, H15 e/ou H16. A vacina pode incluir antigénio(s) de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do vírus influenza, incluindo vírus da influenza A e/ou vírus da influenza B, por exemplo, uma vacina monovalente A/HSN1 ou A/H1N1, ou uma vacina trivalentes A/H1N1 + A/H3N2 + B. O vírus influenza pode ser um estirpe reclassifiçada, e pode ter sido obtido por meio de técnicas de genética reversa [por exemplo, 51-55] . Assim o vírus pode incluir um ou mais segmentos de ARN de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6 segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos de HA e N sendo de uma estirpe de vacina, isto é, uma reclassificação de 6:2). Os vírus utilizados como a fonte dos antigénios podem ser crescidos em ovos (por exemplo, ovos embrionados de 40 galinha) ou em cultura celular. Onde cultura celular é utilizada, o substrato de células será tipicamente uma linha celular de mamífero, tal como MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; POR.C6; WI-38; etc.. Linhas celulares de mamífero preferidas para crescer vírus influenza incluem: células MDCK [56-59], derivado de rim canino Madin Darby; células Vero [60-62], derivado de Rim de macaco verde africano; ou células POR.C6 [63], derivado de retinoblastos embrionários humanos. Onde vírus foram crescidos en um linha celular de mamífero então a composição vantajosamente será livre de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina e ovomucóide) e de ADN de frango, deste modo reduzindo a alerginicidade. Doses unitárias de vacina são tipicamente padronizadas por referência a conteúdo de hemaglutinina (HA), tipicamente medido por meio de SRID. As vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 pg de HA por estirpe, embora doses menores podem ser utilizada, particularmente quando utilizando um adjuvante. Doses f raccionárias tal como Vè (isto é, 7,5 pg de HA por estirpe), H e 1/8 tem sido utilizada [64, 65], assim como doses maiores (por exemplo, doses de 3x ou 9x [66, 67]). Assim vacinas podem incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por estirpe de influenza, preferentemente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg, 0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7 pg, 0,5-5 pg, etc. Doses particulares incluem, por exemplo, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 3,75, cerca de 1,9, cerca de 1,5, etc. por estirpe. • Vírus da imunodeficiência humana, incluindo HIV-1 e HIV-2. O antigénio é tipicamente um antigénio de envelope. • Antigénios de superfície do Vírus da Hepatite B. Este antigénio é preferentemente obtido por meio de métodos de ADN recombinante, por exemplo, após expressão numa levedura Saccharomyces cerevisiae. Diferente de HBsAg virai nativa, o antigénio recombinante expresso em levedura é não 41 glicosilado. Pode estar na forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de cerca de 20 nm), incluindo uma matriz de lipídeo que compreende fosfolipídeos. Diferente de partículas HBsAg nativas, as partículas expressas em levedura podem incluir fosfatidilinositol. 0 HBsAg pode ser de qualquer dos subtipos aywl, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- e adrq+. • Ancilóstoma, particularmente como visto em caninos (Ancilostoma caninum). Este antigénio pode ser Ac-MTP- 1 recombinante (metaloprotease semelhante a astacina) e/ou um hemoglobinase aspártica (Ac-APR-1), que pode ser expressa num sistema baculovírus/ célula de insecto como uma proteína segregada [68,69]. • Antigénios de vírus Herpes simplex (HSV). Um antigénio HSV preferido para utilização com a invenção é glicoproteína de membrana gD. É preferido utilizar gD de uma estirpe HSV-2 (antigénio 'gD2'). A composição pode utilizaro um foram de gD em que a região de âncora de membrana C-terminal foi deletada [70], por exemplo, um gD truncado que compreende aminoácidos 1-306 da proteína natural com a adição de aparagina e glutamina na terminação C. Esta forma da proteína inclui o péptido sinal que é clivado para proporcionar uma proteína de 283 aminoácidos madura. A deleção da âncora possibilita que a proteína seja preparada em forma solúvel. • Antigénios de papilomavírus humano (HPV). Antigénios de HPV preferidos para utilização com a invenção são proteínas capsídeo LI, que pode montar para formar estruturas conhecidas como partículas semelhante a vírus (VLPs). As VLPs podem ser produzidas por meio de expressão recombinante de LI em células de levedura (por exemplo, em S. cerevisiae) ou em células de insecto (por exemplo, em células de Spodoptera, tais como S. frugiperda, ou em células Drosophila). Para células de levedura, vectores 42 plasmídeo podem portar o(s) gene(s) Ll; para células de insecto, vectores baculovírus podem portar o(s) gene(s) Ll. Mais preferentemente, a composição inclui VLPs de Ll de tanto estirpes HPV- 16 como HPV-18. Esta combinação bivalente tem mostrado que é altamente eficaz [71], Além de estirpes HPV- 16 e HPV-18, é também possível incluir VLPs de Ll de estirpes de HPV-6 e HPV-11. A utilização de estirpes de HPV oncogénicas é também possível. Uma vacina pode incluir entre 20-60 pg/ml (por exemplo, cerca de 40 pg/ml) de Ll por estirpe de HPV. • Antigénios de Antraz. Antraz é causado pelo Bacillus anthracis. Os antigénios de B. anthracis adequados incluem componentes A (factor letal (LF) e factor de edema (EF)), ambos dos quais podem compartir um componente B comum conhecido como antigénio protector (PA). Os antigénios podem opcionalmente ser destoxifiçados. Detalhes adicionais podem ser encontrados nas Referências [72 to 74]. • Antigénios de S. aureus. Uma variedade de antigénios de S. aureus é conhecida. Antigénios adequados incluem sacáridos capsulares (por exemplo, de uma estirpe de tipo 5 e/ou tipo 8) e proteínas (por exemplo, IsdB, Hla, etc.). Antigénios capsulares de sacárido são de maneira ideal conjugados a uma proteína portadora. • Antigénios de S. pneumoniae. Uma variedade de antigénios de S. pneumoniae é conhecida. Antigénios adequados incluem sacáridos capsulares (por exemplo, de um ou mais de serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, e/ou 23F) e proteínas (por exemplo, pneumolisina, pneumolisina destoxifiçada, proteína D de tríade polihistidina (PhtD), etc.). Antigénios capsulares de sacárido são conjugados de maneira ideal a uma proteína portadora. • Antigénios de cancro. Uma variedade de antigénios específico de tumor é conhecida. A invenção pode ser utilizada com antigénios que provocam uma resposta 43 imunoterapêutica contra cancro de pulmão, melanoma, cancro de mama, cancro de próstata, etc.
Uma solução do antigénio normalmente será misturada com a emulsão, por exemplo, a uma razão de volume 1:1. Esta mistura pode ser realizada por um fabricante d vacina, antes de carregar, ou pode ser realizada no ponto de utilização, por um profissional sanitário.
Composições farmacêuticas
Composições feitas utilizando os métodos da invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Podem incluir componentes além da emulsão e o antigénio opcional. A composição pode incluir um conservante tal como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É preferido, no entanto, que a vacina deva ser substancialmente livre de (isto é, inferior a 5 pg/ml) material mercurial, por exemplo, livre de tiomersal [75,76]. Vacinas e componentes não contendo mercúrio são mais preferidos. 0 pH de uma composição geralmente será entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo, entre 6,5 e 7,5. Um processo da invenção pode portanto incluir uma etapa de ajustar o pH da vacina antes de embalar. A composição é preferentemente estéril. A composição é preferentemente não pirogénica, por exemplo, contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e preferentemente < 0,1 EU por dose. A composição é preferentemente livre de glúten. A composição pode incluir material para uma imunização única, ou podem incluir material para imunizações múltiplas (isto é, um kit 'multidose'). A inclusão de um conservante é preferida em disposições multidose.
Vacinas são tipicamente administrados num volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, embora uma meia dose (isto é, cerca de 0,25 ml) possa ser administrada a crianças. Métodos de tratamento, e administração da vacina A invenção proporciona kits e composições preparadas 44 utilizando os métodos da invenção. As composições preparadas de acordo com os métodos da invenção são adequadas para administração a pacientes humanos, e a invenção proporciona um método de aumentar uma resposta imune num paciente, que compreende a etapa de administra tal composição ao paciente. A invenção também proporciona estes kits e composições para utilização como medicamentos. A invenção também proporciona a utilização de: (i) uma preparação aquosa de um antigénio; e (ii) uma emulsão de óleo-em-água preparada de acordo com a invenção, no fabrico de um medicamento para criar uma resposta imune num paciente. A resposta imune criada por estes métodos e usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpo, preferentemente uma resposta de anticorpo protectora.
As composições podem ser administradas de várias maneiras. A via de imunização mais preferida é por injecção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna), mas outras vias disponíveis incluem injecção subcutânea, intranasal [77-79], oral [80], intradérmica [81,82], transcutânea, transdérmica [83], etc.
Vacinas preparadas de acordo com a invenção pode ser utilizada para tratar tanto crianças como adultos. O paciente pode ter menos de 1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 15-55 anos de idade, ou pelo menos 55 anos de idade. O paciente pode ser idoso (por exemplo, > 50 anos de idade, preferentemente > 65 anos), os jovens (por exemplo, < 5 anos de idade) , pacientes hospitalizados, trabalhadores sanitários, forças armadas e pessoal militar, mulheres grávidas, os doentes crónicos, pacientes imunodeficientes, e pessoas viajando ao estrangeiro. A vacinas não são adequadas unicamente para estes grupos, no entanto, e pode ser utilizada mais geralmente num população. 45
Vacinas da invenção podem ser administradas a pacientes a substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a consulta médica ou visita a um profissional sanitário) outras vacinas.
Processos intermediários A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende microfluidização de uma primeira emulsão para formar uma segunda emulsão e então filtração da segunda emulsão. A primeira emulsão tem as caracteristicas descritas anteriormente. A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende filtração de uma segunda emulsão, isto é, uma emulsão microfluidizada. A emulsão microfluidizada tem as caracteristicas descritas anteriormente. A invenção também proporciona um método para o fabrico de uma vacina, que compreende combinar uma emulsão com um antigénio, onde a emulsão tem as caracteristicas descritas anteriormente.
Formas de realização específicas
Formas de realização específicas da presente invenção incluem: • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende esqualeno, que compreende etapas de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; e (iii) filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana hidrofílica. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende etapas de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo 46 médio de 5000 nm ou menos; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; e (iii) filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana hidrofilica. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende etapas de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; e (iii) filtração da segunda emulsão utilizando uma membrana de polietersulfona hidrofilica. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em- água que compreende esqualeno, o método que compreende a etapa de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio utilizando um homogeneizador, em que a primeira emulsão é formada pela circulação dos primeiros componentes de emulsão através de um homogeneizador uma pluralidade de vezes. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em- água que compreende esqualeno, o método que compreende a etapa de (b) microfluidização de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio, em que a segunda emulsão é formada pela circulação dos segundos componentes de emulsão pela transferência dos segundos componentes de emulsão de um primeiro contentor de emulsão, através de um primeiro dispositivo de microfluidização a um segundo contentor de emulsão, e então através de um segundo dispositivo de microfluidização, em que o primeiro e o segundo dispositivo 47 de microfluidizaçãos são o mesmo. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende: passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z e um módulo de processamento auxiliar que compreende pelo menos um canal; em que o módulo de processamento auxiliar é posicionado a jusante da câmara de interacção. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende a etapa de passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção e um módulo de processamento auxiliar que compreende uma pluralidade de canais. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende a etapa de passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio, em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção e em que a pressão da componentes de emulsão na entrada da câmara de interacção é substancialmente constante for pelo menos 85 % do tempo durante que a emulsão é alimentados no microfluidizador. 48 • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende a etapa de formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio, em que formação da primeira emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo, azoto, por exemplo, at uma pressão de até 0,5 bar. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende a etapa de passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio, em que formação da segunda emulsão é levada a cabo sob um gás inerte, por exemplo, azoto, por exemplo, a uma pressão de até 0,5 bar. • Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água, que compreende etapas de (i) formação de uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio; (ii) microfluidização da primeira emulsão para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; (iii) filtração da segunda emulsão; (iv) transferência da emulsão de óleo-em-água numa bolsa flex estéril.
Geral O termo "que compreende" abrange "incluindo" bem como "que consiste", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou podem incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Onde for necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é 49 opcional e significa, por exemplo, x ± 10 %. A menos que seja especificamente indicado, um processo que compreende uma etapa de misturar dois ou mais componentes não requer qualquer ordem especifica de mistura. Assim componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Onde existem três componentes então dois componentes podem ser combinados um com o outro, e então a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc.
Onde materiais de animal (e particularmente bovino) são utilizados na cultura de células, devem ser obtidos de fontes que são livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livre de encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, é preferido células de cultura na total ausência de materiais derivados de animal.
BREVE DESCRIÇÃO DE DESENHOS A Figura 1 mostra um exemplo específico de um homogeneizador que pode ser utilizado para formar uma primeira emulsão. A Figura 2 mostra pormenor de um rotor e estator que pode ser utilizado em tal um homogeneizador. A Figura 3 mostra dois perfis de pressão para um modo de bomba intensificadora sincrónica. A Figura 4 mostra uma câmara de interacção de canal de tipo Z. A Figura 5 mostra uma circulação de tipo I, enquanto a Figura 6 mostra uma circulação de tipo II.
Contentores são marcados como "C" enquanto um homogeneizador é marcado como "Η". A direcção e a ordem de movimentos de fluido são mostradas. Na Figura 6 o homogeneizador tem duas setas de entrada e duas setas de saída, mas em realidade o homogeneizador tem um único canal de entrada e um único canal de saída.
MODOS PARA LEVAR A CABO A INVENÇÃO
Uma primeira emulsão que compreende esqualeno, 50 polissorbato 80, trioleato de sorbitano e tampão citrato de sódio foi preparada por meio de homogeneização. A primeira emulsão foi homogeneizada até que tinha um tamanho de goticula de óleo médio de 1200 nm ou menos e um número de goticulas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm de 5 x 109 /ml ou menos. A primeira emulsão foi então submetida a microfluidização para formar uma segunda emulsão. O dispositivo de microfluidização compreendia duas bombas intensificadoras sincrónicas proporcionando uma pressão substancialmente constante de aproximadamente 700 bar (isto é, aproximadamente 10000 psi). A emulsão foi passada através do dispositivo de microfluidização cinco vezes. A emulsão foi mantida a uma temperatura de 40 ± 5 °C durante a microfluidização através da utilização de um mecanismo de arrefecimento.
Quatro séries de teste foram levados a cabo. No primeiro par de séries de testes um módulo de processamento auxiliar (APM) de canal único foi posicionado a montante de uma câmara de interacção de tipo Z (IXC) de 8 canais, como recomendado pelo fabricante, e a taxa de fluxo da emulsão no microfluidizador dispositivo foi de 10,2 L/min. No segundo par de séries de testes, um APM multi-canal foi posicionado a jusante de um IXC de tipo Z de 8 canais e a taxa de fluxo da emulsão no microfluidizador dispositivo foi de 11,6 L/min. Ambas as séries foram conduzidas em larga escala (250 litros). Os resultados das quatro séries de testes estão no Quadro 1.
Como é mostrado no Quadro 1, as séries de testes em que o APM foi posicionado a jusante do IXC produziu emulsões com um menor tamanho de partícula médio e menos partículas com um 1,2 pm. Além disso, a ordem IXC-APM alcançou um diâmetro de partícula de < 200 nm após 1 passagem enquanto este tamanho não foi alcançado mesmo após 4 passagens com a ordem ΑΡΜ-IXC. Portanto, o posicionamento 51 do APM a jusante do IXC de tipo Z foi mostrado que é vantajoso para fabrico a larga escala.
Será entendido que a invenção foi descrita por meio de exemplo somente e modificações podem ser feitas enquanto permanece dentro do âmbito e espirito da invenção.
Quadro 1
Ordem APM-IXC IXC-APM número de série 1 2 3 4 Tamanho de goticula de óleo médio após 1 passagem 249 220,9 200,8 200,3 N°. de goticulas de óleo com um tamanho > 1,2 μιη após 2 passagens 180,7 x 106 175,4 x 106 54,3 x 106 62,1 x 106 Tamanho de goticula de óleo médio após 1 passagem 230 224, 9 170,9 167, 5 N°. de goticulas de óleo com um tamanho > 1,2 pm após 2 passagens 170,2 x 106 139,6 x 106 43,0 x 106 42, 8 x 106 Tamanho de goticula de óleo médio após 3 passagens 218 221,5 166,8 156, 7 N° . de goticulas de óleo com um tamanho > 1,2 pm após 3 passagens 166,7 x 106 164,3 x 106 36,7 x 106 42,5 x 106 Tamanho de goticula de óleo médio após 4 passagens 215 222,6 154,3 156,8 No. de goticulas de óleo com um tamanho > 1,2 pm após 4 passagens 127,6 x 106 115,6 x 106 35, 9 x 106 43,2 x 106
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Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende: passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de goticula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio; e filtração da segunda emulsão; em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais de tipo Z e uma câmara de contrapressão que compreende pelo menos um canal; e em que a câmara de contrapressão é posicionada a jusante da câmara de interacção. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira emulsão é introduzida na câmara de interacção a uma primeira pressão e a segunda emulsão sai da câmara de contrapressão a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão; e em que entre 80 e 95 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de interacção e de 5 a 20 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de contrapressão. 3. 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a câmara de contrapressão compreende uma pluralidade de canais.
4. Um método para o fabrico de uma emulsão de óleo-em-água que compreende a etapa de passar uma primeira emulsão que tem um primeiro tamanho de goticula de óleo médio através de um dispositivo de microfluidização para formar 2 uma segunda emulsão que tem um segundo tamanho de gotícula de óleo médio que é inferior ao primeiro tamanho de goticula de óleo médio e filtração da segunda emulsão; em que o dispositivo de microfluidização compreende uma câmara de interacção que compreende uma pluralidade de canais e uma câmara de contrapressão que compreende uma pluralidade de canais. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que a primeira emulsão: (i) é introduzida na câmara de interacção a uma primeira pressão e a segunda emulsão sai da câmara de contrapressão a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão; ou (ii) é introduzida na câmara de contrapressão a uma primeira pressão e a segunda emulsão sai da câmara de interacção a uma segunda pressão que é inferior à primeira pressão; e em que entre 80 e 95 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de interacção e de 5 a 20 % da diferença de pressão entre a primeira e a segunda pressões diminui através da câmara de contrapressão.
6. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o canal ou canais da câmara de contrapressão são canais de tipo Z.
7. O método de qualquer das reivindicações anteriores, que compreende a etapa de formação da primeira emulsão utilizando um homogeneizador.
8. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o primeiro tamanho de goticula de óleo médio é 5000 nm ou menos. 3 9. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o número de goticulas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 μιη na primeira emulsão é 5 x 1011 /ml ou menos.
10. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o segundo tamanho de goticula de óleo médio é 500 nm ou menos.
11. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o número de goticulas de óleo que têm um tamanho de > 1,2 pm na segunda emulsão é 5 x IO10 /ml ou menos.
12. Um método para preparar uma composição de vacina, que compreende preparar uma emulsão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e combinar a emulsão com um antigénio.
13. Um método para preparar um kit de vacina que compreende preparar uma emulsão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e embalar a emulsão num kit como um componente de kit juntamente com um componente de antigénio.
14. O método de acordo com a reivindicação 13, em que os componentes de kit são em frascos separados; por exemplo, em que os frascos são feitos de vidro de borossilicato.
15. O método de qualquer das reivindicações 12 a 14, em que a emulsão é um adjuvante de carga e o método compreende extrair doses unitárias do adjuvante de carga para embalar como componentes de kit.
16. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 12 a 15, em que o antigénio é um antigénio de vírus influenza; por exemplo, em que a combinação da emulsão e o antigénio forma uma composição de vacina e em que a composição de vacina inclui cerca de 15 mg, cerca de 10 mg, cerca de 7,5 mg, cerca de 5 mg, cerca de 3,8 mg, cerca de 1,9 mg, cerca de 1,5 mg de hemaglutinina por estirpe do vírus influenza. 17. 0 método de qualquer reivindicação anterior, em que: a câmara de interacção tem uma pluralidade de canais de geometria fixa em que a emulsão passa e em que a emulsão é acelerada sob pressão para reduzir o tamanho de gotícula de óleo da emulsão e reduzir o número de gotículas de óleo que têm um tamanho > 1,2 pm; em que os canais na câmara de interacção incluem uma pluralidade de cantos em ângulo substancialmente recto; e em que a câmara de contrapressão tem pelo menos um canal de geometria fixa em que a emulsão passa.
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