PT2293804E - Vírus herpes simplex (hsv) com tropismo modificado, suas utilizações e processo de preparação - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Vírus Herpes Simplex (HSV) com tropismo modificado, suas utilizações e processo de preparação"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a um vírus herpes simplex (HSV) modificado, a utilizações do HSV modificado, a uma preparação farmacêutica e a um processo de preparação de um HSV modificado.

ANTECEDENTES

Uma nova fronteira no tratamento de tumores é a viroterapia oncolítica, pela qual um vírus competente em termos de replicação infecta as células tumorais, propaga-se de célula para célula do tumor e destrói as mesmas. Dois destes tumores são o cancro mamário e o cancro dos ovários, que afectam animais tais como humanos. Cerca de 30% dos tumores mamários de humanos, bem como alguns tumores dos ovários, são altamente malignos e metastáticos.

Estes tumores devem a sua elevada malignidade e metastaticidade à expressão de um receptor molecular específico da superfície celular, denominado HER2, que pertence à família dos receptores de factor de crescimento epidérmico, e são geralmente tratados com cirurgia ou cirurgia combinada com radioterapia ou quimioterapia. O HSV é um vírus patogénico para células de mamífero [o HSV-1 é descrito e.g. em Ejercito, P. M., et al. (1968), J. Gen. Virol. 2:357 e o seu genoma tem o número de acesso NC-001806 (GenBank)]. O HSV entra nas células por um processo em múltiplos passos. O primeiro passo é a fixação à superfície celular, mediado por interacção das glicoproteínas gB e gC (Laquerre S., Argnani R., Anderson D. B., Zucchini S., Manservigi R., Glorioso J. C. (1998), J. Virol. 72(7):6119-30). Isto é seguido pela interacção mais específica da glicoproteína D (gD) do invólucro do virião com um dos seus receptores de 2 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ entrada: nectina-l/HveC, HVEM/HveA, e porções sulfatadas ligadas a 0 de sulfato de heparano (Spear P. G., Eisenberg R. J., Cohen G. H., (2000) Virology 275:1-9) (Campadelli-Fiume G., Cocchi F., Menotti L., Lopez M. (2000) Reviews in Medicai Virology, 10:305-319) (Campadelli-Fiume G. et al. (2007) Rev. Med. Virol., 17:313-326) (os códigos GenBank para os receptores são os seguintes: nectina-1 alfa AF060231, nectina-1 beta AF110314, HVEM U70321).

Em anos recentes, têm existido tentativas para utilizar HSVs modificados por engenharia genética como agentes oncoliticos principalmente para tratar glioma maligno. Uma vez que os vírus do tipo selvagem são virulentos, e atingem e destroem muitas células e tecidos diferentes, os HSVs oncoliticos candidatos têm sido grandemente atenuados. Os vírus que têm chegado aos ensaios clínicos foram tornados dependentes, no que se refere à sua replicação, de células tumorais em divisão pela deleção de dois genes de HSV, nomeadamente o gene gama 143.5 - que codifica a proteína ICP34.5 cujo papel é impedir o desligar da síntese de proteínas em células infectadas, e o gene UL39 - que codifica a subunidade grande de ribonucleótido-redutase. Estes vírus estão deteriorados pela baixa capacidade em replicarem-se, mesmo em células em divisão, uma característica que resulta em dois efeitos negativos. Primeiro, a administração de tais vírus a tumores não consegue produzir um elevado rendimento de vírus de progenitura, capazes de se propagarem de célula para célula do próprio tumor, e assim de amplificar a resposta a uma qualquer dose terapêutica determinada do vírus. Segundo, os vírus são difíceis de desenvolver e dificilmente podem ser produzidos em grande escala (108-109 unidades de formação de placas PFU/ml) para produzir a quantidade de vírus requerida para aplicações clínicas. Adicionalmente, a capacidade preservada do vírus para se ligar a qualquer célula portadora de um dos receptores naturais para o HSV retira o vírus aos tecidos de tumor que mais o necessitam e diminui o efeito terapêutico de morte de células tumorais, e pode exercer infecção indesejada de células e tecidos não cancerosos, incluindo a sua morte por apoptose. É de notar que, mesmo que estes vírus fossem redireccionados a receptores específicos de tumor, eles estão não obstante altamente atenuados. 3 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Recentemente HSVs redireccionados a receptores específicos têm sido transformados por engenharia genética de modo a poderem infectar células que é necessário destruir, mantendo ao mesmo tempo elevada capacidade para se replicarem e propagarem de célula para célula. Ainda que estes vírus tenham uma boa capacidade para se propagarem entre células tumorais, estes infectam ainda indesejavelmente células e tecidos não cancerosos. 0 pedido de patente com o número de publicação W02004/033639 revela um HSV recombinante que expressa uma citoquina natural sobre o seu invólucro glicoproteico. Embora a utilização de HSV recombinante deste tipo tenha sido proposta para tratamento de tumores, é importante enfatizar que: o receptor visado tem um ligando natural de pequeno tamanho tal que este pode ser facilmente inserido em gD, e o HSV recombinante proposto é ainda capaz de interactuar com receptores nectina-1/HveC e HVEM/HveA. Em particular, a W02004/033639 não consegue identificar mutações que resultariam num HSV recombinante que não é mais capaz de se ligar a nectina-l/HveC e que é capaz de se ligar a receptores (tais como HER2/ErbB2) de células doentes.

Zhou, G. et ai. (2003) J. Virol. Vol. 77, N.° 6, páginas 3759-3767 revela um conjunto de mutantes de inserção-deleção de gD para mapear os domínios de gD requeridos para bloquear a apoptose por vírus gD-l“ e gD-l+ e aqueles envolvidos na fusão célula-célula exibindo essas modificações, especialmente deleções na parte N-terminal de gD, afectam a ligação a nectina-1.

Daqui decorre que existe ainda uma necessidade na especialidade de agentes terapêuticos virais direccionados selectivamente a células que é necessário destruir. Em particular, existe uma necessidade de agentes terapêuticos virais direccionados a receptores que não possuem qualquer ligando natural e que são sobre-expressos ou expressos selectivamente em células doentes, tais como células de cancro. 4 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

SUMARIO É um objectivo do presente invento proporcionar um HSV modificado como definido pelas reivindicações concebido para eliminar pelo menos parcialmente os inconvenientes da especialidade conhecida e que, ao mesmo tempo, é fácil de implementar.

Outros objectivos do presente invento são proporcionar utilizações do HSV modificado de acordo com as reivindicações, preparações farmacêuticas e um processo de preparação do HSV modificado. especificado significado A não ser que o contrário seja explicitamente, os termos seguintes têm o seguinte aqui depois indicado.

Como aqui utilizado, "anticorpo de cadeia simples" (scFv) refere-se a um anticorpo de cadeia simples "propriamente dito" (i.e. possuindo dois domínios ligados por um ligador) ou outros derivados de anticorpo similares (e.g. domínios do tipo V simples). Vantajosamente, os "anticorpos de cadeia simples" são anticorpos de cadeia simples "propriamente ditos". Um exemplo não limitante de um anticorpo de cadeia simples "propriamente dito" é o scHER2 (revelado nos exemplos reportados abaixo).

Como aqui utilizado, "percentagem de identidade" ou "% de identidade" entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos refere-se à percentagem de resíduos aminoácido ou nucleótido idênticos em posições correspondentes nas duas sequências alinhadas optimamente.

Para estabelecer a "percentagem de identidade" das duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos, as sequências são alinhadas; para se ter um alinhamento óptimo, são possíveis lacunas (gaps) (deleções ou inserções - que possivelmente podem estar localizadas nos extremos das sequências). Comparam-se os resíduos aminoácido ou nucleótido. Onde uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo aminoácido ou nucleótido que ocupa a posição correspondente na segunda sequência, as moléculas são idênticas nessa 5 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ posição. A "percentagem de identidade" entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas das sequências [i.e. % de identidade = (número de posições idênticas / número de posições totais) x 100].

De acordo com concretizações vantajosas, as sequências têm o mesmo comprimento (o mesmo número de resíduos aminoácido ou nucleótidos).

Vantajosamente, as sequências comparadas não têm lacunas. A percentagem de identidade pode ser obtida utilizando algoritmos matemáticos. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático, que é utilizado para comparar duas sequências, é o algoritmo de Karlin e Altschul [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 2264-2268] modificado por Karlin e Altschul [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 5873-5877].

De modo a obter alinhamentos também na presença de uma ou mais lacunas, é possível utilizar métodos que dão uma penalidade relativamente elevada para cada lacuna e uma penalidade mais baixa para cada resíduo aminoácido ou nucleótido adicional (um tal resíduo aminoácido ou nucleótido adicional é definido como uma extensão da lacuna). Penalidades elevadas resultam, obviamente, em alinhamentos óptimos com um número de lacunas inferior.

Um exemplo de um programa (software) concebido para produzir um tal tipo de alinhamento é o programa BLAST conforme revelado em Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389-3402. Para este propósito, podem-se utilizar programas BLASTn e BLASTp com parâmetros por defeito. Nos programas BLAST usualmente utiliza-se a matriz BLOSUM62.

Um exemplo vantajoso e não limitante de um programa para obtenção de um alinhamento óptimo é o pacote GCG Winsconsin Bestfit (Universidade de Winsconsin, E.U.A.; Devereux et ai., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Também neste caso, utilizam-se os parâmetros por defeito (que proporcionam uma penalidade de -12 para cada lacuna e uma penalidade de -4 para cada extensão). 6 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Como aqui utilizado, "percentagem de homologia" ou "% de homologia" entre duas sequências de aminoácidos ou nucleótidos refere-se à percentagem de resíduos aminoácido ou nucleótido homólogos em posições correspondentes nas duas sequências alinhadas optimamente. A "percentagem de homologia" entre duas sequências é estabelecida de um modo substancialmente idêntico ao que foi acima descrito no que se refere à determinação da "percentagem de identidade" excepto pelo facto de no cálculo se considerarem também posições homólogas e não apenas posições idênticas.

No que se refere às sequências de nucleótidos, duas posições homólogas podem ter dois nucleótidos diferentes, mas estes dois nucleótidos, dentro do codão respectivo, codificam o mesmo aminoácido.

No que se refere às sequências de aminoácidos, duas posições homólogas possuem dois aminoácidos idênticos ou homólogos. Resíduos aminoácido homólogos têm propriedades físico-químicas similares, por exemplo, aminoácidos pertencentes a um mesmo grupo: aromáticos (Phe, Trp, Tyr), ácidos (Glu, Asp), polares (Gin, Asn), básicos (Lys, Arg, His), alifáticos (Ala, Leu, Ile, Vai), com um grupo hidroxilo (Ser, Thr), com uma cadeia lateral curta (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) . É de esperar que substituições entre tais aminoácidos homólogos não alterem um fenótipo de proteína (substituições de aminoácidos conservativas).

Exemplos específicos de substituições conservativas neste campo técnico são revelados em várias referências [e.g. Bowie et al., Science, 247:1306-1310 (1990)].

Exemplos adicionais de programas e/ou artigos referentes ao estabelecimento de alinhamentos óptimos e/ou percentagens de homologia e/ou identidade são citados, por exemplo, em US2008003202, US2007093443, WO2006048777, W02007149406.

Como aqui utilizada, "posição correspondente" refere-se a uma posição de uma sequência de aminoácidos ou nucleótidos 7 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ correspondente (frente a frente), após ter sido realizado um alinhamento, a uma dada posição de uma sequência de referência.

Por exemplo, uma posição correspondente a uma dada posição de gD possuindo a SEQ ID N0:1 pode ser identificada alinhando a SEQ ID N0:1 com uma sequência peptídica de interesse; o alinhamento pode ser obtido quer manualmente quer como acima revelado por referência à determinação da percentagem de identidade.

Como aqui utilizada, "uma cadeia polipeptídica nua" refere-se a um polipéptido que não é modificado pós-tradução ou de outro modo modificado quimicamente, mas contém apenas aminoácidos ligados covalentemente.

Como aqui utilizado, "ligando capaz de se ligar em condições específicas a um receptor" refere-se a um ligando que, quando inserido em HSV através de técnicas de biologia molecular, permite ao HSV penetrar numa célula através da interacção com esse receptor, com o qual o ligando foi concebido para se ligar. Em particular, o ligando é capaz de se ligar em condições específicas a um receptor, quando o HSV, que o contém, é capaz de interagir com esse receptor passando os testes revelados no exemplo 5 reportado abaixo ou testes análogos (com receptores diferentes).

Como aqui utilizado, "capacidade do HSV (em particular do HSV modificado) de interactuar com um receptor" refere-se à capacidade do HSV de penetrar numa célula através da interacção com esse receptor. Em particular, também neste caso, esta capacidade é avaliada por meio dos testes revelados no exemplo 5 reportado abaixo ou testes análogos (para receptores diferentes).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Concretizações não limitantes do presente invento serão descritas a titulo de exemplo com referência aos desenhos apensos, nos quais: 8 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ A Figura 1 A mostra uma representação esquemática dos genomas de HSV-BAC recombinantes descritos neste invento. É apresentada a cadeia principal de gDminus-EGFP-HSV-BAC como exemplo. É apresentada a cadeia principal de gDminus-EGFP-HSV-BAC. Os HSV-BACs são derivados de pYEbacl02 (Tanaka, M., H. Kagawa, Y. Yamanashi, T. Sata, e Y. Kawaguchi, 2003, "Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo", J. Virol. 77:1382-91, [Tanaka, 2003 #672]), que transporta sequências de pBeloBACll inseridas entre UL3 e UL4. Em gDminus-EGFP-HSV-BAC a cassete de repórter (a27-EGFP) está inserida nas sequências BAC. A gDminus-LacZ-HSV-BAC tem a mesma estrutura, mas tem LacZ em vez de EGFP. A Figura 1B mostra representações esquemáticas de mapas lineares de gD wt (a) e das proteínas quiméricas de qD; (b) gD de R-LM31 recombinante, possuindo uma substituição no resíduo aminoácido 34; (c) gD de R-LM39 recombinante, possuindo mutações nos resíduos aminoácido 34, 215, 222 e 223; (d) gD de R-LM113 recombinante, possuindo scHER2L em vez dos resíduos aminoácido 6-38; (e) gD de R-LM249 recombinante, possuindo LscHER2L em vez dos resíduos aminoácido 61-218. Os números a negrito indicam o comprimento em resíduos aminoácido de cada fragmento. Os números em caracteres normais referem-se a resíduos aminoácido de acordo com as coordenadas de gD wt. L, ligadores. TM, domínio de transmembrana gD. VH e VL, domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo 4D5 anti-HER2/neu. Δ, deleção. As barras estão desenhadas à escala. - A Figura 2 mostra que o vírus recombinante R-LM31 não é desviado do receptor nectina-1. Micrografias de células J negativas em receptor (A) e J-HER2 (B), J-hNectina-1 (C) e J-mNectina-1 (D) expressando HER2 humano, e nectina-1 humana ou murina, respectivamente, foram expostas a R-LM31 com 10 PFU/célula. A infecção foi monitorizada como actividade de β-galactosidase por coloração de X-gal in situ 16 h após infecção. E. A mobilidade electroforética de gDs wt e quiméricas expressas em células SKOV3 infectadas com vírus recombinantes R-LM5, R- LM13, RLM31, R-LM39, R-LM113 e 9 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ R- LM249. Lisados de células infectadas foram separados por SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose e visualizados por quimiluminescência intensificada. Os números à esquerda representam posições de migração de marcadores de massa molecular (em kilodalton). As setas indicam a mobilidade electroforética aparente das gDs wt ou quiméricas. De baixo para cima, gD do tipo selvagem (gD wt) expressa por virus recombinante R-LM5, gD(Δ61-218)-LscHER2L expressa por virus recombinante R-LM249, gD(Δ6-38)-scHER2L expressa por virus recombinante R-LM113. A migração de gD-scHER2L expressa por R- LM13, RLM31 e R-LM39 é indistinguível da de gD(A6-38)-SCHER2L. A Figura 3 mostra a infecção de um arranjo de linhas de células com vírus recombinantes R-LM113 e R-LM249. Monocamadas das linhas de células indicadas foram infectadas com 5 PFU/célula, e mediu-se a expressão de gene repórter de EGFP 24 h mais tarde por meio de um fluorómetro. Os números à esquerda indicam a intensidade de EGFP em unidades arbitrárias. A Figura 4 mostra o desenvolvimento vírus recombinantes R-LM39, R-LM113 e R-LM249 e de vírus de controlo R-LM5 e R-LM13. (A a G) Culturas em replicado de células J (A), J-Nectina-1 (B) , J-HVEM (C) , J-HER2 (D), SK0V3 (E) , 1-143 tk“ (F) ou HEp-2 (G) foram infectadas com vírus recombinantes R- LM5 V), R-LM13 (·), R-LM39 (Δ), R-LM113 (x) ou R-LM249 (À) com 1 PFU/células. Colheu-se o vírus de progenitura às 3, 24 e 48 h após infecção e titulou-se em células SK0V3. - A Figura 5 mostra o bloco de infecção de células SK0V3 com R-LM39 (A) , R-LM113 (B) ou R-LM249 (C) por anticorpos para HER2 (Herceptina) ou nectina-1 (R1.302) . As células SK0V3 foram pré-incubadas com as concentrações indicadas de IgG purificada de Herceptina (Δ), Rl.302 (o) ou a combinação de Herceptina mais Rl.302 (·) ou IgGs de ratinho irrelevantes (χ) durante 2 h a 4°C. Adicionou-se vírus ao meio contendo anticorpo e deixou-se adsorver às células durante 90 min a 4°C. Monitorizou-se a infecção 16 h mais tarde como a expressão de EGFP. Cem por cento indica as leituras de EGFP em culturas infectadas com vírus não tratadas. 10 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ - A Figura 6A mostra a inibição da propagação de célula para célula por Herceptina. Células SK0V3 infectadas com diluições em série dos vírus indicados foram cobertas com meio contendo 1% de Agarose Seaplaque ± 10 pg/ml de Herceptina. Fotografaram-se as placas individuais às 48 h, e mediram-se as áreas de placa por meio da ferramenta de histograma do programa Photoshop e expressaram-se como pixéis x 103. Para cada virus, mediram-se as áreas de 4 ou 5 placas. Os histogramas representam médias, barras de erro e desvios-padrão . A Figura 6B mostra placas representativas referidas em relação à Figura 6A.

As Figuras 7 a 15 mostram mapas dos plasmídeos seguintes: pLM5, pLM13 (scHER2L entre os aa 24 e 25 de gD madura), pLM31 (obtido por mutagénese de pLM13 para introduzir a substituição V34S), pS31 (plasmídeo de vaivém obtido por subclonagem do fragmento Nrul-Pmel a partir de pLM31 em Smal de pST76KSR), pS39 (plasmídeo de vaivém obtido por mutagénese de pS31 com o iniciador gD_215G-222N-223l_PvuI), pLMl13 (possui a sequência codificando gD onde os aa 6-38 da proteína madura estão substituídos por scHER2L), pS113 (plasmídeo de vaivém obtido por subclonagem do fragmento Nrul-Pmel a partir de pLM113 em Smal de pST76KSR), pLM249 (possui a sequência codificando gD onde os aa 61-218 da proteína madura estão substituídos por scHER2 flanqueado por ligadores), pS249 (plasmídeo de vaivém obtido por subclonagem do fragmento Nrul-Pmel a partir de pLM249 em Smal de pST76KSR), respectivamente; os números itálicos a negrito sublinhados indicam as coordenadas no plasmídeo completo final; os números em caracteres normais indicam as coordenadas no vector original e fragmentos. A Figura 16 mostra a actividade citotóxica de vírus recombinantes R-LM113 e R-LM249 em comparação com vírus de controlo R-LM5. Os histogramas representam os números de células totais (eixo dos y: número de células x 104) . Para cada amostra de células infectadas contaram-se ambas as fracções de células aderentes (a) e desprendidas (d). As partes a sombreado dos histogramas representam a fracção de células não viáveis (Eritrosina B positivas), e os valores 11 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ correspondentes estão indicados nos valores em percentagem sobre os histogramas. NI, células de controlo não infectadas.

DESCRIÇÃO DE CONCRETIZAÇÕES ILUSTRATIVAS

Os objectos do presente invento são: 1) Um vírus herpes simplex modificado (HSV) compreendendo um invólucro glicoproteico no qual um anticorpo de cadeia simples heterólogo substitui uma porção apagada do domínio de gD do referido invólucro glicoproteico para formar uma proteína de fusão, onde a) a referida porção apagada começa numa posição dentro dos aminoácidos 1 a 8 e termina numa posição dentro dos aminoácidos 38 a 55 de gD; ou começa numa posição dentro dos aminoácidos 40 a 61 e termina numa posição dentro dos aminoácidos 210 a 218 de gD; b) o referido anticorpo de cadeia simples compreende um domínio leve variável (VL) e um domínio pesado variável (VH) separados por um ligador (Ll), onde o ligador permite a VL e a VH assumirem a conformação apropriada de modo a que o anticorpo de cadeia simples se possa ligar em condições específicas a um receptor que é expresso em células tumorais mas não substancialmente em células não tumorais; c) o invólucro está modificado de um modo tal que a capacidade do HSV modificado para interactuar com o receptor nectina-l/HveC é reduzida. 2) Um HSV modificado de acordo com o ponto 1, onde o invólucro está modificado de um modo tal que a capacidade do HSV modificado para interactuar com os receptores nectina-1/HveC e HVEM/HveA está reduzida ou substancialmente removida. 3) Um HSV modificado de acordo com o ponto 1 ou 2, onde a porção apagada de gD começa na posição 6 e termina na posição 38, ou começa na posição 61 e termina na posição 218. 4) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores, onde a referida gD possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1. 12 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ 5) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores, onde o referido receptor expresso em células tumorais possui pelo menos 90% de identidade com um receptor seleccionado entre: HER2/ErbB2, EGFR1, EGFR3, PMSA, CEA, GD2, VEGFR1 e VEGFR2. 6) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos precedentes, onde o referido anticorpo de cadeia simples compreende adicionalmente um segundo ligador (L2) e/ou um terceiro ligador (L3), onde: VH está localizada entre e liga LI e L2, e VL está localizada entre e liga LI e L3. 7) onde: Um HSV modificado de acordo com um dos pontos 6-8, VL possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 2 VH possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 3 LI possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 4 L2 possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 5 L3 possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 6 ou com a SEQ ID NO:7. 8) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores, onde a referida proteína de fusão resultante da substituição de uma porção de gD pelo referido ligando peptídico possui pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO:9 ou com a SEQ ID NO:10. 9) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores compreendendo adicionalmente um marcador, e em particular um marcador adequado para visualização de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, carcinoma da cabeça e pescoço, tecido neoangiogénico de um tumor, neuroblastoma e/ou suas metástases. 10) Uma preparação farmacêutica compreendendo um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores 1-9 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. 13 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ 11) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores 1-9 para utilização no tratamento de uma doença tumoral, e em particular de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, carcinoma da cabeça e pescoço ou um neuroblastoma. 12) Um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores 1-9 para utilização no tratamento de uma metástase de uma doença tumoral, e em particular de uma metástase de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, melanoma, ou de um neuroblastoma. 13) Um processo para preparação de um HSV modificado de acordo com um dos pontos anteriores 1-9, compreendendo:

Deleção de uma porção do ADN codificando a gD do HSV, substituição da porção apagada pelo ADN codificando o anticorpo de cadeia simples determinando a capacidade do HSV modificado resultante para se ligar a pelo menos um receptor expresso por células tumorais mas não substancialmente por células não tumorais.

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento é proporcionado um vírus herpes simplex (HSV) modificado compreendendo um invólucro glicoproteico, que possui um ligando peptídico heterólogo capaz de se ligar em condições específicas a um receptor determinado expresso por células doentes e substancialmente não (ou pouco) expresso por células não doentes. 0 invólucro glicoproteico é assim modificado de um modo tal que a capacidade do HSV modificado para se ligar em condições específicas ao receptor nectina-1/HveC é reduzida (em relação a HSV do tipo selvagem) . Vantajosamente, a capacidade do HSV modificado para se ligar em condições específicas a receptor nectina-l/HveC é substancialmente removida.

De acordo com algumas concretizações preferidas, a capacidade do HSV modificado para se ligar em condições especificas ao receptor HVEM/HveA é reduzida, vantajosamente substancialmente removida. 14 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

As concretizações ilustrativas são reveladas utilizando como um vírus exemplificativo um membro da família Herpesviridae, HSV-1. HSV-1 e HSV-2 são vírus herpes simplex. A matéria sujeito do presente invento estende-se a qualquer membro da família Herpesviridae e não está limitada às concretizações exemplificativas reveladas nos exemplos. Muitos HSV são conhecidos na especialidade. Estes vírus podem conter um ou mais genes mutados. Exemplos de vírus recombinantes contendo genes heterólogos e métodos de preparação e utilização destes vírus são descritos na US5599691. Genes heterólogos incluem genes codificando proteínas marcadoras (tais como proteínas fluorescentes verde ou vermelha ou suas variações, luciferase ou β-galactosidase), que permitem a detecção de células infectadas expressando a proteína. 0 HSV modificado aqui proporcionado tem a vantagem de manter uma parte relevante da infecciosidade do vírus do tipo selvagem.

De acordo com concretizações específicas, o ligando peptídico é inserido em gD (glicoproteína D) do invólucro glicoproteico de HSV nas posições como definidas na reivindicação 1. Uma porção de gD está apagada.

Vantajosamente, o ligando peptídico está inserido em vez da porção apagada, em particular, tal que o ligando peptídico e a gD formam uma proteína de fusão.

Usualmente, a gD do tipo selvagem (madura) tem a sequência peptídica SEQ ID N0:1. A gD do tipo selvagem deriva de um precursor, que tem a sequência peptídica SEQ ID NO:34. 0 precursor mencionado é codificado pela sequência de nucleótidos SEQ ID NO:35.

De acordo com algumas concretizações do presente invento, antes de ser modificada, a gD possui pelo menos 80% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO: 1. 15 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

De acordo com algumas concretizações, a porção que se prolonga entre as posições correspondendo a de 40 a 61, de um lado, e de 210 a 218, do outro lado, está apagada. Vantajosamente, a porção apagada prolonga-se entre as posições correspondendo a 61, de um lado, e a 218, do outro lado.

Aqui, os loci (posições) das sequências peptídicas modificados ou não modificado são identificados por referência à numeração de aminoácidos dos residuos aminoácido em posições correspondentes de uma gD do tipo selvagem (madura) não modificada conforme identificada pela SEQ ID NO:l. As posições correspondentes podem ser identificadas por alinhamento dos residuos não modificados (ver acima). Por exemplo, apresentamos aqui a seguir a numeração das sequências de gD do tipo selvagem (SEQ ID NO:l) e do seu precursor (SEQ ID NO:34) SEQ ID NO:1 KYALADASLK MADPNRFRCK DLPVLDQLTD PPGVRRVYHI QAGLPDPFQP PSLPITVYYA 60 VLERACRSVL LNAPSEAPQI VRGASEDVRK QPYNLTIAWF RMGGNCAIPI TVMEYTECSY 120 NKSLGACPIR TQPRWNYYDS FSAVSEDNLG FLMHAPAFET AGTYLRLVKI NDWTEITQFI 180 LEHRAKGSCK YALPLRIPPS ACLSPQAYQQ GVTVDSIGML PRFIPENQRT VAVYSLKIAG 240 WHGPKAPYTS TLLPPELSET PNATQPELAP EDPEDSALI.E DPVGTVAPQ1 PPNWHIPSIQ 300 DAATPYHPPA TPNNMGLIAG AVGGSLLAAL VICGIVYWMR RRTQKAPKRI RLPHIREDDQ 360 PSSHQPLFY 369 SEQ ID NO:34

MGGAAARLGA VILFWXVGL HGVRG KYALADASLK HADPMRFRGK DLPVLD0LTD PPGVRRVYHI QAGLPDPFQP PSLPITVYYA 60 VLERACRSVL LNAPSEAPQI VRGASEDVRK QPYNLTIAWF RMGGNCAIPI TVMEYTECSY 120 NKSLGACPIR TQPRWNYYDS FSAVSEDNLG FLMHAPAFET AGTYLRLVKI NDWTEITQFI 180 LEHRAKGSCK YALPLRIPPS ACLSPQAYQQ GVTVDSIGML PRFIPENQRT VAVYSLKIAG 240 300

WHGPKAPYTS TLLPPELSET PNATQPELAP EDPEDSALLE DPVGTVAPQI PFNWHIPSIQ 16 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ DAATPYHPPA TPNNMGLIAG AVGGSLLAAL VICGIVYWMR RRTQKAPKRI RLPHIREDDQ 360 PSSHQPLFY 369

De acordo com algumas concretizações, a porção apagada prolonga-se entre posições correspondendo a de 1 a 8, de um lado, e de 38 a 55, do outro lado. Vantajosamente, a porção apagada está localizada entre as posições correspondendo a 6, de um lado, e 38, do outro lado. 0 ligando peptídico acima mencionado é qualquer tipo de ligando adequado conhecido na especialidade, por exemplo uma citoquina, um factor de crescimento, um derivado de anticorpo monoclonal ou, vantajosamente, um anticorpo de cadeia simples.

De acordo com algumas concretizações especificas, o ligando peptídico é capaz de se ligar em condições específicas ao receptor determinado, que possui pelo menos 90% de homologia, vantajosamente identidade, em relação ao receptor HER2/ErbB2. 0 HER2/ErbB2 é um receptor que é sobre-expresso, e.g., por células de tumor de ovário, tumor mamário, tumor do estômago e tumor de glândula salivar (Hynes N. E. e Η. A. Lane, "ERBB receptors and câncer: the complexity of targeted inhibitors", Nat. Rev. Câncer (2005) 5: 341; Holbro, T. &

Hynes, N. E. "ErbB receptors: directing key signaling networks throughout life", Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 195-217 (2004); Hynes, N. E. & Stern, D. F. "The biology of erbB-2/neu/HER-2 and its role in câncer", Biochim. Biophys. Acta 1198, 165-184 (1994)), e que é expresso com niveis muito baixos em tecidos não malignos (Yamamoto et al., Nature, 1986 Jan 16-22; 319(6050): 230-4) (Press M.F et al., Oncogene (1990) 5:953).

De acordo com outras concretizações, o ligando peptídico é capaz de se ligar em condições específicas ao receptor determinado, que possui pelo menos 90% de homologia, vantajosamente identidade, em relação a um determinado receptor escolhido entre o grupo consistindo de: EGFR1 (receptor 1 de factor de crescimento epidérmico) [Carpenter, 17 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ G. (1992), "Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction", Faseb. J. 6(14), 3283-9], EGFR3 [Hynes, N. E., e Lane, Η. A. (2005), "ERBB receptors and câncer: the complexity of targeted inhibitors", Nat. Rev. Câncer 5(5), 341-54], PMSA (antigénio associado à membrana prostática), CEA (antigénio carcinoembriónico), GD2 (disialogangliósido, expresso em neuroblastoma e em melanoma), receptores 1 e 2 de VEGF (factor de crescimento endotelial vascular) expressos em neovasculatura [Carmeliet, P. (2005) "VEGF as a key mediator of angiogenesis in câncer", Oncology 69 Supl. 3, 4-10]. É importante salientar que, para alguns dos receptores acima mencionados, são conhecidos ligandos naturais, e.g. EGF, VEGF. No estado da técnica, são conhecidos anticorpos monoclonais e anticorpos de cadeia simples, que visam receptores expressos por células doentes. Por exemplo, foram produzidos J591, J415 e J533 (ver o pedido de patente com o número de publicação US20030007974). Foram descritos anticorpos de cadeia simples para EGFR1 (Nakamura, T., Peng, K. W., Vongpunsawad, S., Harvey, M., Mizuguchi, H., Hayakawa, T., Cattaneo, R., e Russell, S. J. (2004), "Antibody-targeted cell fusion", Nat. Biotechnol. 22(3), 331-6), para EGFR3 (Horak, E., Heitner, T., Robinson, Μ. K., Simmons, Η. H., Garrison, J., Russeva, M., Furmanova, P., Lou, J., Zhou, Y., Yuan, Q. A., Weiner, L. M., Adams, G. P., e Marks, J. D. (2005), "Isolation of scFvs to in vitro produced extracellular domains of EGFR family members", Câncer Biother. Radiopharm. 20(6), 603-13), para VEGFR2/KDR (scFv A7, Boldicke, T., Tesar, M., Griesel, C., Rohde, M., Grone, H. J., Waltenberger, J., Kollet, O., Lapidot, T., Yayon, A., e Weich, H. (2001), "Anti-VEGFR-2 scFvs for cell isolation. Single-chain antibodies recognizing the human vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2/flk-1) on the surface of primary endothelial cells and preselected CD34+ cells from cord blood", Stem Cells 19(1), 24-36).

Foram preparados anticorpos de cadeia simples contra CEA: inter alia, scFv MFE23 (que foi revelado em: Chowdhury et al., Retargeting Retrovirus, 2004 Mol. Ther. 9:85, Imaging, Mayer A., Clin. Câncer Res. 6 (5): 1711 (2000), e no pedido de patente com o número de publicação US20020090709) e 18 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ scFv Τ84.66 (que foi revelado em: Hu, Câncer Research (1996) 56:3055; Olafsen T. et ai., Protein Eng. Des. Sei. (2004) 17:21; Wong Y.J. et al., Clin. Câncer Res. (2004) 10:5014; Kenanova V. et al., Câncer Res. (2005) 65:622; US20030171551). São também conhecidos na especialidade o anticorpo monoclonal MAb 3F8 (US20040116379, US20040115688, US6716422, Kushner B.H. et al., (2001) 19 : 4189, Tur M.K. et al.r Int. J. Molec. Med. (2001) 8:579, US20040180386) e o anticorpo de cadeia simples scFv 14.18 contra GD2. O ligando pode ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% de homologia (vantajosamente identidade) com um ligando escolhido entre o grupo consistindo de: scFv J591, scFv MFE23, MAb 3F8, scFv T84.66 e scFv 14.18.

De acordo com algumas concretizações, o ligando consiste de pelo menos trezentos aminoácidos; vantajosamente pelo menos trezentos e vinte, trezentos e sessenta ou duzentos e quarenta.

Vantajosamente, o ligando compreende um primeiro domínio (VL) e um segundo domínio (VH) e um primeiro ligador (Ll), que liga o primeiro e o segundo domínios (VL, VH) e é capaz de permitir ao primeiro e ao segundo domínios (VL, VH) assumirem uma posição relativa adequada; o primeiro e o segundo domínios (VL, VH) estando concebidos para se ligarem ao referido receptor determinado. O ligando compreende adicionalmente um segundo ligador (L2) e/ou um terceiro ligador (L3) . O segundo domínio (VH) está localizado entre e conecta o primeiro e o segundo ligadores (Ll, L2). O primeiro dominio (VL) está localizado entre e conecta o primeiro e o terceiro ligadores (Ll, L3). O primeiro domínio (VL) consiste de pelo menos cem aminoácidos, vantajosamente não mais do que cento e dezassete aminoácidos. O segundo domínio (VH) consiste de pelo menos cento e dez, vantajosamente não mais do que cento e trinta, aminoácidos. O primeiro ligador (Ll) consiste de pelo menos doze, vantajosamente não mais do que trinta, aminoácidos. 19 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

De acordo com algumas concretizações, o primeiro dominio (VL) possui pelo menos 80% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:2

NTAVAWYQQK PGKAPKLLIY PEDFATYYCQ QHYTTPPTFG

SDIQMTQS.PS SLSASVGDRV '·. TITCRASQDV

’ SASFLYSGVP SRFSGSRSGT DFTLTISSLQ QGTKVEI O primeiro dominio (VL) pode ter pelo menos 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:3

SEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFNI KDTYIHWVRQ APGKGLEWVA RIYPTNGYTR YADSVKGRFT ISADTSKNTA YLQMNSLRAE DTAVYY CSRW GGDGFYAMDY WGQGTLVTVS

De acordo com algumas concretizações, o primeiro ligador (Ll) possui pelo menos 50% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:4

KSDMPMADPN RFRGKNLVFH

De acordo com algumas concretizações, o segundo ligador (L2) possui pelo menos 50% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:5

SSGGGSGSGG S SEQ ID NO:8

SSGGGSGSGG SG

De acordo com algumas concretizações, o terceiro ligador (L3) consiste de pelo menos dois e, vantajosamente, não mais do que oito aminoácidos. O terceiro ligador (L3) possui pelo menos 50% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7. 20 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ SEQ ID ΝΟ:6 ΕΝ

SEQ ID ΝΟ:7 HSSGGGSG

De acordo com algumas concretizações particulares, o ligando peptídico é inserido em gD (glicoproteína D) do invólucro glicoproteico e uma porção da gD é apagada tal que a gD modificada obtida possui pelo menos 70% de homologia,

vantajosamente identidade, em relaçao à SEQ ID NO:10 ou ID NO:9. SEQ ID NO : 10 KYALADASLK MADPNRFRGK DLPVLDQLTD PPGVRRVYHI QAGLPDPFQP PSLPITVYYA HSSGGGSGSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQDVNT AVAWYQQKPG KAPKLLIYSA SFLYSGVPSR FSGSRSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQH YTTPPTFGQG TKVEIKSDMP MADPNRFRGK NLVFHSEVQL VESGGGLVQP GGS LRLSCAA SGFNIKDTYI HWVRQAPGKG LEWVARIYPT NGYTRYADSV KGRFTISADT SKNTAYLQMN SLRAEDTAVY Y CSRWGGDGF YAMDYWGQGT LVTVSSSGGG SGSGGSGMLP RFIPENQRTV AVYSLKIAGW HGPKAPYTST LLPPELSETP NATQPELAPE DPEDSALLED PVGTVAPQIP PNWHIPSIQD AATPYHPPAT PNNMGLIAGA VGGSLLAALV ICGIVYWMRR RTQKAPKRIR LPHIREDDQP SSHQPLFY SEQ ID NO : 9 KYALAENSDI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRAS QDVNTA VAWYQQKPGK APKLLIYSAS FLYSGVPSRF SGSRSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQHY TTPPTFGQGT KVEIKSDMPM ADPNRFRGKN LVFHSEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFNIKDTYIH WVRQAPGKGL EWVARIYPTN GYTRYADSVK 21 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

GRFTISADTS KNTAYLQMNS LRAEDTAVYY CSRWGGDGFY AMDYWGQGTL VTVSSSGGGS GSGGSHIQAG LPDPFQPPSL PITVYYAVLE RACRSVLLNA PSEAPQIVRG ASEDVRKQPY NLTIAWFRMG GNCAIPITVM EYTECSYNKS LGACPIRTQP RWNYYDSFSA VSEDNLGFLM HAPAFETAGT YLRLVKINDW TEITQFILEH RAKGSCKYAL PLRIPPSACL SPQAYQQGVT VDSIGMLPRF IPENQRTVAV YSLKIAGWHG PKAPYTSTLL PPELSETPNA TQPELAPEDP EDSALLEDPV GTVAPQIPPN WHIPSIQDAA TPYHPPATPN NMGLIAGAVG

GSLLAALVIC GIVYWMRRRT QKAPKRIRLP HIREDDQPSS HQPLFY

Os precursores da SEQ ID NO: 10 e da SEQ ID NO: 9 podem ser expressos pela SEQ ID NO:36 e pela SEQ ID NO:37, respectivamente.

As sequências peptídicas aqui reveladas, em particular a gD modificada, podem ser alteradas pós-tradução. Alterações possíveis incluem, mas não estão limitadas a, glicosilação, peguilação, albuminação, farnisilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação.

Em relação a este aspecto, será de notar que a gD do tipo selvagem possui oligossacáridos ligados a N adicionados a cada sequência de consenso específica (Asn-X-Ser e/ou Asn-X-Thr) (Sodora, D. L., G. H. Cohen, e R. J. Eisenberg, 1989, "Influence of asparagine-linked oligosaccharides on antigenicity, Processing, and cell surface expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein D", J. Virol. 63:5184-93) e possíveis oligossacáridos ligados a O adicionados a um ou mais resíduos Ser e/ou Thr. Vantajosamente, também a gD modificada e/ou o ligando incluem estas modificações.

Surpreendentemente, observou-se experimentalmente que o HSV modificado de acordo com o presente invento, ainda que as sequências de aa 7-32, que na gD wt estão envolvidas na interacção com HVEM, nem sempre estejam apagadas, não apenas perdeu a capacidade para interagir com nectina-1, mas também com HVEM, e por conseguinte está desviado (detargeted) de ambos os receptores naturais HVEM e nectina-1. 22 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Em relação a este aspecto, será de notar que, contrariamente aos esforços descritos por Zhou e Roizman (W02004/033639) , o ligando utilizado (neste caso o scFv) não é inserido no terminal N de gD, mas está inserido entre duas porções de gD que contêm resíduos que não podem ser apagados (nomeadamente do terminal N até ao resíduo aa 60, e a região 218-extremidade). Uma característica particular do HSV modificado é que estas porções estão ligadas em conjunto numa única cadeia polipeptídica, e estão ligadas e são mantidas em conjunto, em particular, pelo scFv que, neste caso, preenche simultaneamente duas funções (i) proporciona o novo ligando para os receptores a serem visados (e deste modo dirige o tropismo do vírus recombinante para o receptor escolhido), e (ii) proporciona a função de andaime que, na gD wt, está localizada na porção dobrada de Ig incluída no polipéptido 61-218.

Outras modificações que conceptualmente melhoram a capacidade do vírus direccionado para especificamente se ligar e entrar em células, que expressam o receptor visado pelo ligando heterólogo, incluem a remoção de sequências específicas em glicoproteína gB (resíduos aminoácido 68-77) e gC (resíduos aminoácido 136-152) que possibilitam a ligação ao receptor de HSV não específico, sulfato de heparano. Estas sequências, ou suas extensões, podem ser substituídas pelo ligando heterólogo escolhido, de modo a concentrar adicionalmente o vírus recombinante nas células escolhidas.

Uma implementação adicional consiste na introdução no genoma virai de mutações que favorecem grandemente a propagação do vírus de uma célula infectada para uma célula adjacente próxima. São conhecidas mutações que exercem este efeito. Tipicamente fazem com que as células infectadas formem um sincício (ou policariócito) com células próximas, e são denominadas mutações sinciciais (syn). Exemplos destas mutações são A40V localizada na gK e R858H, T813I, R796C localizadas em gB.

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é proporcionado o HSV modificado acima identificado para utilização como um medicamento, vantajosamente para tratamento de tumores; em particular, tumor de ovário, tumor 23 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, neuroblastoma, carcinoma da cabeça e pescoço, tecido neoangiogénico, em particular tecidos neoangiogénicos de um tumor, e/ou suas metástases. Vantajosamente, o HSV modificado acima identificado é utilizado para tratamento de tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do estômago, tumor da glândula salivar e suas metástases. Vantajosamente, o HSV modificado acima identificado é proporcionado para utilização no tratamento de tumor de ovário, tumor mamário e suas metástases.

Em relação a este aspecto, é importante salientar que o HSV modificado acima mencionado é particularmente útil para tratamento de metástases de tumor. Isto é devido ao facto de assim que o HSV modificado é administrado, este difunde-se e infecta autonomamente a metástase. 0 HSV modificado pode ser administrado a um sujeito por quaisquer meios conhecidos. Em particular, o HSV modificado pode ser administrado directamente na área de um tumor ou, alternativamente, sistemicamente, por exemplo onde a metástase foi detectada ou o tumor não é acessível directamente.

Preparações farmacêuticas contendo o HSV modificado estão substancialmente desprovidas de impurezas que podem causar danos ao sujeito, em particular seres humanos ou outros mamíferos. Preparações farmacêuticas compreendem vantajosamente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 HSV modificado pode ser formulado para cada tipo conhecido de administração: em particular, para administração oral ou parentérica ou rectal ou em formas concebidas para inalação ou insuflação (tanto pela boca como pelo nariz). As formulações para utilização parentérica são vantajosas.

Para administração oral, as preparações farmacêuticas podem estar, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas preparados utilizando métodos conhecidos com excipientes aceitáveis de um ponto de vista farmacêutico tais como 24 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ agentes ligantes (por exemplo amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou metilcelulose); cargas (por exemplo lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); aditivos (por exemplo estearato de magnésio, talco, sílica); desintegrantes (por exemplo amido de batata); e/ou agentes lubrificantes (por exemplo laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos conhecidos. Preparações líquidas para administração oral podem ter a forma, por exemplo, de soluções ou suspensões xaroposas, ou podem estar na forma de um produto seco que pode ser dissolvido em água ou noutro líquido antes da utilização. Estas preparações podem ser preparadas de modos conhecidos com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo sorbitol, derivados de celulose, gorduras hidrogenadas alimentares); agentes emulsionantes (por exemplo lecitina ou goma-arábica); líquidos não aquosos (por exemplo óleo de amêndoa, ésteres oleosos, etanol ou óleos vegetais fraccionados); e/ou conservantes (por exemplo p-hidroxibenzoato de metilo ou propilo, ácido sórbico ou ácido ascórbico). As preparações podem também conter, em casos apropriados, agentes de tamponamento, agentes corantes, aromatizantes e/ou edulcorantes.

As preparações administração oral podem ser formuladas de um modo conhecido, de modo a proporcionar uma libertação controlada do composto activo. 0 HSV modificado pode ser formulado, de um modo conhecido, para administração parentérica por injecção ou administração contínua. As formulações para injecção podem estar na forma de doses individuais, por exemplo em ampolas ou recipientes multidose contendo conservantes. A preparação pode estar na forma de uma suspensão, em líquidos aquosos ou oleosos, e pode conter elementos de formulação tais como agentes dispersantes e estabilizantes. Alternativamente, o composto activo pode estar em forma de pó a ser dissolvido imediatamente antes do uso num líquido adequado, por exemplo água esterilizada. 0 HSV modificado pode ser formulado para administração rectal como supositórios ou enemas, por exemplo contendo 25 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ excipientes para supositórios de um tipo conhecido tal como manteiga de cacau ou outras gorduras. 0 HSV modificado pode também ser formulado, de um modo conhecido, como preparações com libertação prolongada. Estas preparações com libertação prolongada podem ser administradas por meio de um implante (por exemplo subcutâneo ou intramuscular) ou por meio de uma injecção intramuscular. Assim, por exemplo, o HSV modificado pode ser formulado com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo uma emulsão ou um óleo) ou com resinas de permuta iónica, ou como derivados relativamente fracamente solúveis, tais como sais relativamente fracamente solúveis.

Para administração intranasal, o HSV modificado pode ser formulado para administração por meio de um dispositivo (conhecido), por exemplo em forma de pó com transportadores adequados.

As dosagens do HSV modificado podem ser definidas como o número de unidades formadoras de placas (pfu). Exemplos de dosagens incluem ΙΟ3, ΙΟ4, ΙΟ5, ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, 109, IO10 ou 1011 pfu. 0 sujeito a ser tratado pode ser qualquer mamífero, por exemplo um ser humano. Outros exemplos de animais que podem ser tratados são: animais de pecuária tais como gado, suínos, cabras, ovelhas, cavalos; animais de estimação tais como gatos e cães; coelhos, ratinhos e ratos.

Em alguns casos é possível administrar o HSV modificado em conjunto com tratamentos adicionais de quimioterapia, imunoterapia, radioterapia e/ou outros tipos de tratamentos.

Em particular, o HSV modificado pode ser utilizado em combinação com inibidores de angiogénese tais como, por exemplo: endostatina (EntreMED), SU5416, SU6668 (Sugen, San Francisco), talidomida, COL-3 (Collagenex, Newton PA), AG3340 (Agouron, LaJolla, CA) , marimastat (British Biotech), neovastat (Aeterna, Quebec), BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb). 26 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é proporcionada a utilização de um HSV modificado para visualização de uma condição fisiológica, vantajosamente para identificação de uma metástase de tumor. Por conseguinte, é aqui proporcionada a utilização do HSV modificado para preparar uma composição para visualização de uma condição fisiológica. Uma tal composição pode ser preparada utilizando métodos conhecidos de modo a que esta possa ser administrada a um sujeito.

Vantajosamente, a visualização pode ser dirigida a: tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, carcinoma da cabeça e pescoço, tecido neoangiogénico, em particular tecidos neoangiogénicos de um tumor, e neuroblastoma e/ou suas metástases; vantajosamente, tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do estômago, tumor da glândula salivar e suas metástases; em particular, tumor de ovário, tumor mamário e suas metástases. A visualização de condições fisiológicas pode ser obtida por métodos de imagiologia da expressão do gene timidina-quinase (TK) utilizando técnicas de detecção altamente sensíveis tais como PET ou SPECT (Sharma et al., "Molecular imaging of gene expression and protein function in vivo with PET and SPECT", J. Magn. Reson. Imaging., 16 (4):336-51, 2002) (Vries et al., "Scintgraphic Imaging of HSV Gene Therapy, Curr. Pharm. Des., 8(16):1435-50, 2002) (Vries et al., "Positron Emission Tomography: measurement of transgene expression", Methods, 27(3):234, 2002).

Alternativamente é possível fundir uma proteína não essencial (por exemplo Usll) e uma proteína repórter susceptível de ser identificada in vivo (por exemplo proteínas fluorescentes vermelha ou verde ou suas variações, luciferase ou β-galactosidase).

Quando se utiliza luciferase, a sua presença pode ser destacada por meio de um substrato luminescente ou cromático adequado. A proteína repórter pode estar fundida com uma timidina-quinase (Soling et al., "Intercellular localization of Herpes simplex vírus of the type 1 thymidine kinase fused 27 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ to different fluorescent proteins depends on choice of fluorescent tag", FEBS Lett., 527(1-3):153, 2002).

De acordo com um aspecto adicional do presente invento, é proporcionado um processo de preparação de um HSV modificado como definido acima. O processo compreende uma fase de inserção, durante a qual uma sequência de nucleótidos codificando o ligando peptídico é inserida no ADN de HSV de modo a que o HSV modificado assim obtido expresse o ligando peptídico sobre o seu invólucro.

Vantajosamente, o ADN do HSV é manipulado de modo a que a sequência de codificação de gD do HSV modificado possua pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de homologia, vantajosamente identidade, em relação à SEQ ID NO:36 ou à SEQ ID NO:37, em particular à SEQ ID NO:37.

Ligandos adequados, vantajosamente anticorpos de cadeia simples, podem ser identificados antes da inserção utilizando técnicas conhecidas para ensaio da sua capacidade de ligação a pelo menos um receptor expresso pelas células doentes.

Outras características do presente invento serão clarificadas pela descrição seguinte de alguns exemplos ilustrativos.

Exemplo 1 - Construção de HSV expressando gDs modificadas geneticamente possuindo deleções substituídas por um anticorpo de cadeia simples dirigido contra HER2/Neu e possuindo EGFP como gene repórter. A) Deleção de gD a partir de HSV-BAC.

Para gerar um vírus gDminus, realizou-se o procedimento "ET-cloning" em bactérias (Muyrers, J. P., Y. Zhang, G. Testa, e A. F. Stewart, 1999, "Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination", Nucleic Acids Res 27:1555-7). Uma cassete de resistência à canamicina flanqueada por dois locais FRT foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pFRT-2, com iniciadores que continham nas suas extremidades 5' 60 nt de sequências flanqueando a ORF de gD: gDup_Kan_f (TGT TCG GTC ATA AGC TTC 28 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ AGC GCG AAC GAC CAA CTA CCC CGA TCA TCA GTT ATC CTT AAG CCA GTG ΑΑΤ TCG AGC TCG GTA C) (SEQ ID Ν0:11) e gDdown_Kan_r (ACT ΤΑΤ CGA CTG TCC ACC ΤΤΤ CCC CCC TTC CAG ACT CGC ΤΤΤ ΑΤΑ TGG AGT ΤΑΑ GGT CCC GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTC C) (SEQ ΙΌ Ν0:12) . Ο pFRT-2 foi construído por inserção do gene de resistência à canamicina derivado de pCP15 nos locais Nsil de pCP16 substituindo o gene de resistência à tetraciclina (Cherepanov, P. P., e W. Wackernagel, 1995, "Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant", Gene 158:9-14). 0 produto de PCR foi introduzido por electroporação em E. coli DH10B (Stratagene) alojando YEbacl02 HSV-BAC (Tanaka, Μ., H. Kagawa, Y. Yamanashi, T. Sata, e Y. Kawaguchi, 2003, "Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo", J. Virol. 77:1382-91) e expressando transientemente recombinases Red-β e Red-γ de fago lambda a partir de plasmídeo pKD46 (Datsenko, K. A., e B. L. Wanner, 2000, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:6640-5). Os clones recombinantes foram seleccionados sobre placas contendo dois antibióticos, 25 yg/ml de canamicina (o marcador contido no produto de PCR) e 20 pg/ml de cloranfenicol (o marcador contido nas sequências de HSV-BAC), para assegurar a substituição da sequência de codificação de gD pela cassete de resistência à canamicina. Para remover a cassete de canamicina, os clones positivos foram submetidos a electroporação com pCP20 (Cherepanov, P. P., e W. Wackernagel, 1995, "Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant", Gene 158:9-14), um plasmídeo expressando recombinase FLP de levedura, que é direccionada a sequências de FRT. Finalmente, as colónias foram ensaiadas quanto à perda do marcador de canamicina e quanto à resistência a cloranfenicol. O genoma gDminus HSV-BAC resultante, designado 102gD“FRT, foi verificado por Southern blot, PCR, sequenciação e quanto à capacidade para formar placas apenas em R6, e não noutras linhas de células. 29 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ Β) Engenharia de genes repórter E6FP (proteína fluorescente verde intensificada) ou LacZ em 102gD“FRT HSV-BAC. 0 segundo passo na engenharia de recombinação de HSV-BAC foi a inserção dos genes repórter EGFP ou LacZ, gerando assim gDminus-EGFP-HSV-BAC ou gDminus-LacZ-HSV-BAC. Como local de inserção do gene repórter escolhemos as próprias sequências pBeloBAC, de modo a que o gene marcador possa ser apagado em conjunto com as sequências BAC por recombinase Cre, se requerido (Fig. 1 A) . A sequência de codificação de EGFP seguida pelo sinal de poliadenilação da hormona de crescimento de bovino (BGH) foi amplificada por PCR a partir de pCMS-EGFP (Clontech) com iniciadores EGFP_BamHI_f (CAA CCC GGG ATC CAC CGG TCG CCA CCA TGG TGA GC) (SEQ ID NO: 13) e EGFP+pA_BamHI_r (CCC CTT GGG ATC CTG CCC CAC CCC ACC CCC CAG AAT AG) (SEQ ID NO: 14), e clonada a jusante do promotor a27 de HSV. A cassete a27-EGFP foi inserida entre duas sequências de 700 bp, amplificadas por PCR a partir do plasmídeo pBeloBacll (Número de Acesso GenBank: U51113). As duas sequências de 700 bp acima mencionadas foram designadas por pBeloBacl1-up [iniciadores Sal_pBelo_1209-f: TTG CCA GTC GAC ATT CCG GAT GAG CAT TCA TCA GGC GGG CA (SEQ ID NO: 15) e pBelo_l8 9 7_Xho_r: GCA AAA ACT CGA GTG TAG ACT TCC GTT GAA CTG ATG GAC (SEQ ID NO:16)] e pBeloBacll-down [iniciadores Mun_pBe 1 o_l 8 9 8_f: GGA AGT CAA TTG GAA GGT TTT TGC GCT GGA TGT GGC TGC CC (SEQ ID NO:17) e pBelo_2586_Eco_r: CAC ACT GAA TTC GCA ATT TGT CAC AAC ACC TTC TCT AGA AC (SEQ ID NO:18)]. Na construção resultante, a cassete a27-EGFP ficou inserida entre os nt 1897 e 1898 (coordenadas originais) de pBeloBacll. A cassete a27-EGFP, mais as sequências de flanqueamento de pBeloBacll, foi subclonada no vector de vaivém pST76KSR (Adler, Η., M. Messerle, M. Wagner, e U. H. Koszinowski, 2000, "Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial chromosome", J. Virol. 74:6964-74) para recombinação homóloga em bactérias. Para inserção de LacZ, seguimos a mesma estratégia, clonando sequências pBeloBacll-up e pBeloBacll-down num plasmídeo já contendo a cassete a27-LacZ. A inserção relevante e regiões adjacentes foram sequenciadas quanto à exactidão em todos os plasmídeos. 30 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ C) Construção de vectores de vaivém para inserção de gD quimérica em BACs gDminus. 0 vector de vaivém de gD denominado pS31 (Fig. 10) possui o scHER2L (scFv anti-HER2 mais um ligador de serina glicina de 9-aa) inserido entre os resíduos aa 24 e 25 de gD, mais a substituição V34S (Fig. 1 B, b) . Foi construído como se segue. Primeiro, a substituição V34S foi introduzida por mutagénese dirigida em pLM13 (Fig. 8), uma construção transportando scHER2L inserido entre os resíduos aa 24 e 25 de gD, gerando pLM31 (Fig. 9). A mutagénese foi realizada por meio do kit Stratagene Quickchange II (Stratagene) com iniciadores gD_34S_StuI 5'-TCC TCC GGG GAG CCG GCG CGT GTA CCA CAT CCA GGC AGG CCT ACC GG-3 ' (SEQ ID NO: 19) e o seu reverso. Os iniciadores continham os locais de restrição silenciosos indicados, para facilidade de rastreio dos clones mutantes. A seguir, a cassete contendo o gD+scHER2 mutagenizado mais sequências genómicas de gD de flanqueamento a montante e a jusante (cerca de 500 bp cada) foi transferida para o vector de vaivém pST76KSR para permitir a recombinação homóloga em E. coli.

Para construir pS39 (Fig. 11), adicionaram-se as substituições D215G, R222N, F223I a gD clonado em pS31 por meio do iniciador gD_215G-222N-223l_PvuI 5'-AGG GGG TGA CGG TGG GCT CGA TCG GGA TGC TGC CCA ACA TCA TCC CCG AGA ACC-3 ' (SEQ ID NO:20) e do seu reverso (Fig. 1 B, c).

O vector de vaivém pS113 (Fig. 13) contém gD, na qual os resíduos aa 6-38 foram apagados e substituídos por scHER2L [scFv anti-HER2 seguido por um ligador de serina-glicina de 11 aa: SSGGGSGSGGS (SEQ ID NO:5), codificado pela sequência TCGAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGGATCC (SEQ ID NO:21)] (Fig. 1 B, d) . Para gerar esta construção, locais de restrição EcoRI e BamHI foram introduzidos sequencialmente em ORF de gD em pLM5 (Fig. 7). O local de restrição EcoRI foi inserido nas posições de aminoácido 6-8 da sequência de proteína e o local de restrição BamHI foi inserido nas posições de aminoácido 37-39 da sequência de proteína, por meio dos iniciadores mutagénicos gD_6/8_EcoRI_f 5'-CAA ATA TGC CTT GGC GGA GAA TTC TCT CAA GAT GGC CG-3' (SEQ ID NO:22) e gD_37/38_BamHI_f 5'-CGG GGG TCC GGC GCG GAT CCC ACA TCC AGG CGG G-3 ' (SEQ ID 31 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ ΝΟ:23), respectivamente. A inserção do local EcoRI introduz as substituições D6E e A7N. 0 scHER2L foi amplificado a partir de pS2019a (Sidhu, S. S., B. Li, Y. Chen, F. A. Fellouse, C. Eigenbrot, e G. Fuh, 2004, "Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions", J. Mol. Biol. 338:299-310) com iniciadores scFv_x6_Eco_f 5'-GCA AAG GAA TTC CGA TAT CCA GAT GAC CCA GTC CCC G-3' (SEQ ID NO:24) e scFv_SG_x3 7_BamH 5'-CGG AGG ATC CAC CGG AAC CAG AGC CAC CGC CAC TCG AGG-3 ' (SEQ ID NO:25). Esta construção foi designada por pLM113 (Fig. 12). O plasmideo de vaivém final pS113 foi construído por subclonagem da gD produzida por engenharia em conjunto com sequências genómicas de flanqueamento (fragmento Nrul-Pmel) em pST76KSR (Fig. 13). O vector de vaivém pS249 contém gD, na qual os resíduos aa 61-218 foram apagados e substituídos por LscHER2L [scFv anti-HER2 flanqueado por ligadores de serina-glicina, a montante de 8 aa: HSSGGGSG (SEQ ID NO:7), codificado pela sequência CATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGA (SEQ ID NO:26); a jusante de 12 aa: SSGGGSGSGGSG (SEQ ID NO:8), codificado pela sequência TCGAGTGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGGATCCGGT (SEQ ID NO:27)] em vez de resíduos aa de gD 61 a 218 (Fig. 1 B, e). A mutagénese e clonagem foram realizadas em pLM5 (Fig. 7), um plasmideo contendo ORF de gD clonada em pcDNA3.1(-) (Invitrogen), flanqueado por duas sequências genómicas de flanqueamento a montante e a jusante de 500 bp (Menotti, L., A. Cerretani, e G. Campadelli-Fiume, 2006, "A herpes simplex virus recombinant that exhibits a single-chain antibody to HER2/neu enters cells through the mammary tumor receptor, independently of the gD receptors", J. Virol. 80:5531-9). Primeiro, dois locais Ndel foram inseridos na sequência de codificação substituindo os aminoácidos 61-62 e 218-219 de gD madura, respectivamente, utilizando os iniciadores mutagénicos gD_61 /62_NdeI_f (5'-ACG GTT TAC TAC GCC CAT ATG GAG CGC GCC TGC C-3') (SEQ ID NO:28) e gD_218/219_NdeI_f (5'-GAC GGT GGA CAG CAT CCA TAT GCT GCC CCG CTT C-3') (SEQ ID NO: 29) . A seguir, um ligador de serina-glicina de 9 aa foi inserido hibridando e ligando no local Ndel os dois oligonucleótidos fosforilados P-SG9Bam7/Nde_f (5'-TAG TAG TGG CGG TGG CTC TGG ATC CGG-3') (SEQ ID NO:30) e P-SG9Bam7/Nde_r (5'-TAC CGG ATC CAG AGC CAC CGC CAC TAC-3 ' ) (SEQ ID NO: 31), 32 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ contendo um local BamHI silencioso. 0 scHER2 foi amplificado a partir de pS2019a (Sidhu, S. S., B. Li, Y. Chen, F. A. Fellouse, C. Eigenbrot, e G. Fuh, 2004, Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions", J. Mol. Biol. 338:299-310) com iniciadores scFv_Bam_f (5'-GGC TTA TGG ATC CGA TAT CCA GAT GAC CCA GTC CCC-3') (SEQ ID NO:32) e scFv_SG_x37_BamH_r (5'-CGG AGG ATC CAC CGG AAC CAG AGC CAC CGC CAC TCG AGG-3') (SEQ ID NO:33) e inserido no local BamHI do ligador de serina-glicina. O comprimento da inserção total é de 801 bp, codificando 267 resíduos aa. A construção foi designada por pLM249. Finalmente, a cassete contendo gDA61-218+LscHER2L produzido por engenharia, mais sequências genómicas de gD de flanqueamento a montante e a jusante (o fragmento Nrul-Pmel de pLM249) , foi subclonada em Smal do vector de vaivém pST76KSR gerando pS249 (Fig. 14) para recombinação homóloga em E. coli. A inserção relevante e regiões adjacentes foram sequenciadas quanto à exactidão em todos os plasmídeos. D) Geração de genomas recombinantes por substituição em dois passos em bactérias. O procedimento aplicado para gerar genomas recombinantes em E. coli foi essencialmente como descrito, com ligeiras modificações, em 0'Connor, Μ., M. Peifer, e W. Bender, 1989, "Construction of large DNA segments in Escherichia coli", Science 244:1307-12; Messerle, Μ., I. Crnkovic, W. Hammerschmidt, H. Ziegler, e U. H. Koszinowski, 1997, "Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:14759-63; Borst, E. M., G. Hahn, U. H. Koszinowski, e M. Messerle, 1999, "Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants", J. Virol. 73:8320-9. Resumidamente, E. coli DH10B electrocompetentes (Stratagene) alojando os genomas gDminus HSV-BAC relevantes foram submetidas a electroporação com o vector de vaivém em cuvetes de electroporação de 0,2 cm (Bio-Rad) a 200 O, 25 yF, 2,5 kV, plaqueadas sobre ágar LB contendo 25 yg/ml de Kana (o marcador do vector de vaivém) e 20 yg/ml de Cam (o marcador de BAC, Tanaka, Μ., H. Kagawa, Y. Yamanashi, T. Sata, e Y. 33 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Kawaguchi, 2003, "Construction of an excisable bacterial artificial chromosome containing a full-length infectious clone of herpes simplex virus type 1: viruses reconstituted from the clone exhibit wild-type properties in vitro and in vivo", J. Virol. 77:1382-91), e incubadas a 30°C de um dia para o outro para permitir a expressão de RecA a partir do vector de vaivém. Os clones foram replaqueados em LB+Kana+Cam a 43°C para permitir a identificação daqueles clones alojando os co-integrados (visíveis como grandes colónias, em comparação com o fenótipo de "colónia pequena" sensível à temperatura determinado por vectores de vaivém não integrados). Subsequentemente, deixaram-se os co-integrados resolver por plaqueamento dos clones em LB+Cam a 30°C, e clones contendo o HSV-BAC resolvido foram seleccionados em placas LB+Cam suplementadas com 10% de sacarose. Finalmente, os clones foram verificados quanto à perda de resistência a Kana, e quanto à presença da inserção desejada por PCR de colónias. A recombinação entre o 102gD~FRT HSV-BAC e os vectores de vaivém apropriados gerou ADNs de gDminus-EGFP-HSV-BAC, ou gDminus-LacZ-HSV-BAC, que contêm a cassete a27promotor-EGFP (ou a27promotor-LacZ) inserida nas sequências BAC (Fig. 1 A). Os vírus foram reconstituídos por transfecção do ADN de BAC nas células R6 complementando gD. O gDminus-HSV-BAC foi utilizado como recipiente para a geração de recombinantes contendo a gD produzida por engenharia. Os genomas recombinantes foram verificados por PCR e sequenciação. Os vírus foram reconstituídos por transfecção dos ADNs de BAC em células R6 (Zhou, G., V. Galvan, G. Campadelli-Fiume, e B. Roizman, 2000, "Glycoprotein D or J delivered in trans blocks apoptosis in SK-N-SH cells induced by a herpes simplex virus 1 mutant lacking intact genes expressing both glycoproteins", J. Virol. 74:11782-91, seguida por uma única passagem em células BHK (rim de hamster bebé), e subsequente desenvolvimento em células J-HER2 (Menotti, L., A. Cerretani, e G. Campadelli-Fiume, 2006, "A herpes simplex virus recombinant that exhibits a single-chain antibody to HER2/neu enters cells through the mammary tumor receptor, independently of the gD receptors", J. Virol. 80:5531-9) ou SKOV3 (ATCC# HTB-77). As 34 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ reservas de vírus foram desenvolvidas em células J-HER2 ou SK0V3 e submetidas a passagens em série durante mais de 10 passagens. O título de vírus foi determinado em células SK0V3.

Exemplo 2 - Ensaio de infecção com o recombinante R-LM31 possuindo a substituição V34S em gD.

Os recombinantes de l.a geração R-LM11 e R-LM11L possuíam scHER2 inserido entre os resíduos aa 24 e 25 de gD (Menotti, L., A. Cerretani, e G. Campadelli-Fiume, 2006, "A herpes simplex virus recombinant that exhibits a single-chain antibody to HER2/neu enters cells through the mammary tumor receptor, independently of the gD receptors", J. Virol. 80:5531-9). A inserção alterou o terminal N tal que a entrada através de HVEM foi impedida. A entrada através de nectina-1 foi mantida (Menotti, L., A. Cerretani, e G. Campadelli-Fiume, 2006, "A herpes simplex virus recombinant that exhibits a single-chain antibody to HER2/neu enters cells through the mammary tumor receptor, independently of the gD receptors", J. Virol. 80:5531-9). A primeira tentativa para gerar um recombinante desviado (detargeted) de nectina-1 consistiu na inserção da mutação V34S em gD-scHER2 (Fig. 1 b). Quando introduzida na gD redireccionada a IL-13, a substituição V34S diminuiu fortemente a entrada através de nectina-1 (Zhou, G., e B. Roizman, 2006, "Construction and properties of a herpes simplex virus 1 designed to enter cells solely via the IL-13alpha2 receptor", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:5508-13). O ADN de LM31-BAC recombinante foi gerado por recombinação homóloga em E. coli. O genoma do recipiente era gDminus-LacZ-HSV-BAC. O vírus recombinante R-LM31 foi obtido por transfecção do ADN de LM31-BAC nas células R6 complementando gD. O tropismo de R-LM31 foi ensaiado em células J expressando nectina-1 de humano ou murino, ou HER2 de humano, e monitorizado como a actividade de β-galactosidase. Como se mostra na Fig. 2 A-D, o R-LM31 recombinante infectou células J-nectina-1 (Cocchi, F., L. Menotti, P. Mirandola, M. Lopez, e G. Campadelli-Fiume, 1998, "The ectodomain of a novel member of the immunoglobulin superfamily related to the poliovirus receptor has the attibutes of a bonafide receptor for herpes simplex viruses 1 and 2 in human cells", J. Virol. 72:9992-10002) (através de 35 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ qualquer dos receptores humano ou murino) ; por isso não foi desviado de nectina-1. 0 resultado mostra que o efeito da substituição V34S varia dependendo da inserção presente em go.

Exemplo 3 - Mobilidade electroforética de gDs wt e quimérica expressas em células SKOV3. Células SK0V3 foram infectadas com R-LM5 (a sequência peptidica de gD de R-LM5 é a SEQ ID N0:1, cujo precursor é expresso pela sequência de nucleótidos SEQ ID NO:35), R-LM13 (a sequência peptidica de gD de R-LM13 é a SEQ ID NO:42, cujo precursor é expresso pela sequência de nucleótidos SEQ ID NO:43), R-LM31 (a sequência peptidica de gD de R-LM31 é a SEQ ID NO:38, cujo precursor é expresso pela sequência de nucleótidos SEQ ID NO:39), R-LM39 (a sequência peptidica de gD de R-LM39 é a SEQ ID NO:40, cujo precursor é expresso pela sequência de nucleótidos SEQ ID NO:41), R-LM113 (SEQ ID NO:9) e R-LM249 para uma MOI de 10 pfu/célula. Após 24 h separaram-se os lisados de células infectadas por SDS-PAGE, transferiram-se para membranas de nitrocelulose (Amersham), e visualizaram-se por Western blotting com MAb BD80 contra a porção C-terminal de gD do ectodominio, seguindo-se IgG anti-ratinho conjugado com peroxidase e quimiluminescência intensificada (Fig. 2 E). Nos recombinantes R-LM31 e R-LM39 a presença de scHER2L resulta numa migração mais lenta, como no vírus protótipo R-LM13, em comparação com R-LM5 portador da gD wt. No recombinante R-LM113 a mobilidade electroforética de gD quimérica é indistinguível da dos recombinantes R-LM13, R- LM31, RLM39. No recombinante R-LM249, a substituição de 158 resíduos aa de gD por LscHER2L resulta numa migração intermédia entre a gD wt e a gD de R-LM113 (onde 6-38 resíduos aa de gD estão substituídos por scHER2L). O R-LM113 produz menos gD do que R-LM5 ou R- LM249, uma vez que foi necessário carregar a pista correspondente com 10 vezes mais lisado em comparação com R- LM5 ou RLM249 para obter o sinal observado na Fig. 2. Esta produção inferior de gD foi anteriormente reportada para vírus possuindo uma deleção no terminal N de gD (Zhou, G., e B. Roizman, 2006, "Construction and properties of a herpes simplex virus 1 designed to enter cells solely via the IL-13alpha2 receptor, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:5508-13). 36 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Exemplo 4 - Infecção de um arranjo de linhas de células por R-LM113 e R-LM249.

Monocamadas de um arranjo de linhas de células com origem em roedor, símio ou humano foram infectadas a MOI crescente, e mediu-se a expressão do gene repórter de EGFP (Clontech) 24 h mais tarde por meio de um fluorómetro. Foram captadas imagens digitais com uma câmara Kodak ligada a um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan. R-LM113 e R-LM249 infectaram células J-HER2, mas não células J expressando nectina-1 de humano ou nectina-1 de murino como o único receptor (Fig. 3). 0 desvio (detargeting) em relação a nectina-1 de murino foi confirmado pela falha em infectar células L e NIH-3T3. As células de humano eram susceptíveis a R-LM113 e R-LM249, desde que estas expressassem HER2 com um nível elevado (SK0V3). Células HER2-negativas, e.g. células HEp-2 ATCC# CCL-23, 1-143 tk“ (Post, L. E., e Roizman, B. (1981), "A generalized technique for deletion of specific genes in large genomes: alpha gene 22 of herpes simplex virus 1 is not essential for growth", Cell 25(1), 227-32) e RH4 (rabdomiossarcoma) (Ricci, C., L. Landuzzi, I. Rossi, C. De Giovanni, G. Nicoletti, A. Astolfi, S. Pupa, S. Menard, K. Scotlandi, P. Nanni, e P. L. Lollini, 2000, "Expression of HER/erbB family of receptor tyrosine kinases and induction of differentiation by glial growth factor 2 in human rhabdomyosarcoma cells", Int. J. Câncer 87:29-36), foram infectadas num nível negligenciável. Interessantemente, R-LM113 e R-LM249 eram específicos para HER2 de humano, na medida em que não conseguiram infectar a linha de células de ratinho TT12.E2 expressando o ortólogo de rato de HER2 (neu-NT) (De Giovanni, C., G. Nicoletti, L. Landuzzi, A. Astolfi, S. Croci, A. Comes, S. Ferrini, R. Meazza, M. Iezzi, E. Di Cario, P. Musiani, F. Cavallo, P. Nanni, e P. L. Lollini, 2004, "Immunoprevention of HER-2/neu transgenic mammary carcinoma through an interleukin 12-engineered allogeneic cell vaccine", Câncer Res. 64:4001-9).

Exemplo 5 - Ensaio de replicação de vírus. Células J, J-hNectin-1, J-HVEM, J-HER2, SKOV3, 1-143 tk e HEp-2 cultivadas em placas de 12 poços foram infectadas com 37 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ os vírus indicados na Fig. 4 com uma MOI de 1 pfu/célula durante 90 min a 37°C. Após adsorção do vírus, o inoculo foi removido e o vírus não penetrado foi inactivado por meio de uma lavagem ácida (ácido cítrico 40 mM, KC1 10 mM, NaCl 135 mM [pH 3]) (Brunetti, C. R., R. L. Burke, B. Hoflack, T. Ludwig, K. S. Dingwell, e D. C. Johnson, 1995, "Role of mannose-6-phosphate receptors in herpes simplex virus entry into cells and cell to cell transmission", J. Virol. 69:3517-28). Culturas em replicado foram congeladas nos tempos indicados (3, 24, 48 h) após infecção. A progenitura virai (intracelular mais extracelular) foi titulada em células SKOV3. O desenvolvimento de R-LM39, R-LM113 e R-LM249 foi comparado com o vírus recombinante R-LM5 (codificando gD do tipo selvagem) e R-LM13 (codificando gD-scHER2L quimérica sem quaisquer mutações ou deleções adicionais), (i) o R-LM39 foi incapaz de se desenvolver em células J-HVEM, mas replicou-se em células J-HER2 e em células J-nectina-1, implicando que poderia utilizar tanto HER2 como nectina-1 como receptores (Fig. 4 B, C, D). Por conseguinte, replicou-se nas linhas de células de humano SKOV3 (que expressam tanto nectina-1 como HER2), 1-143 tk“ e células HEp-2 (que expressam nectina-1) (Fig. 4 E, F, G). (ii) R-LM113 desenvolveu-se eficientemente em células J-HER2, melhor do que R-LM249 e R-LM5 (Fig. 4 D) . Em células SKOV3, R-LM113 e R-LM249 replicaram-se com títulos apenas 1 a 1,5 ordens de grandeza inferiores ao vírus de controlo R-LM5 (Fig. 4 E). (iii) R-LM113 e R-LM249 foram desviados tanto de nectina-1 como de HVEM, conforme avaliado pela sua incapacidade para se desenvolverem em células J-nectina-1 e em células J-HVEM, bem como nas 1-143 tk_ e HEp-2 de humano com títulos superiores a 102, 103, 104 pfu/ml (Fig. 4 B, C, F, G) .

Exemplo 6 - Inibição por anticorpos da infecção por virus. Células SKOV3 cultivadas em placas de 96 poços foram incubadas durante 2 h em gelo com concentrações crescentes de anticorpos (R1.302 para nectina-1, Herceptina para HER2, ou imunoglobulinas de ratinho) diluídos em DMEM sem soro, e depois com o inoculo virai com a MOI de 2 pfu/célula 38 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ (conforme titulado em células SK0V3) durante 90 min adicionais em gelo. Após adsorção do virus, removeu-se o virus não ligado e lavaram-se as células duas vezes com RPMI+Glutamax arrefecido em gelo suplementado com 2,5% de FBS. Cobriram-se as células com meio contendo a mesma concentração de anticorpos ou IgGs, mudaram-se rapidamente para 37°C, e incubaram-se durante 16 h. A infecção foi quantificada como a intensidade de fluorescência de EGFP por meio de um leitor de placas Victor (Perkin Elmer). O valor de 100% representa dados obtidos com células infectadas com virus, na ausência de anticorpos. O uso de receptor foi confirmado em experiências de bloqueio de virus com Herceptina, MAb R1.302 ou mistura dos dois anticorpos. Os resultados na Fig. 5 mostram que o R-LM39 não foi bloqueado por Herceptina ou R1.302 administrados individualmente, mas apenas pelos dois anticorpos em combinação (Fig. 5 A) . Os resultados implicam que o R-LM39 pode utilizar alternativamente nectina-1 ou HER2 como receptores, documentando adicionalmente a ausência de desvio em relação a nectina-1. Pelo contrário, R-LM113 e R-LM249 foram bloqueados por Herceptina (Fig. 5 B e C). A combinação de Herceptina mais MAb R1.302 exerceu a mesma inibição que a Herceptina sozinha; o MAb R1.302 não teve qualquer efeito. A infecção por R-LM113 ou R-LM249 foi inibida por Herceptina sozinha, enquanto o MAb R1.302 sozinho não teve qualquer efeito. Concluímos que R-LM113 e R-LM249 podem entrar nas células apenas através do receptor HER2, de acordo com os resultados que se mostram na Fig. 4.

Exemplo 7 - Inibição da formação de placa de R-LM113 e R- LM249 por Herceptina.

Investigámos se R-LM113 e R-LM249 utilizaram HER2 não apenas para a infecção por vírus, mas também para a propagação de célula para célula. Células SKOV3 foram infectadas com diluições em série dos vírus indicados e cobertas com meio contendo 1% de agarose Seaplaque, com ou sem a adição de 10 yg/ml de Herceptina (MAb para HER2, Genentech). As placas fluorescentes foram monitorizadas com um microscópio de fluorescência Zeiss, e captaram-se imagens de 5 placas por amostra às 48 h após infecção. Mediram-se as 39 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ áreas das placas com a ferramenta de histograma do Photoshop. Como se mostra na Fig. 6, a exposição à Herceptina de monocamadas de SK0V3 infectadas com R-LM113 e R-LM249 reduziu o tamanho de placas (na Figura 6, -Herceptina indica na ausência de Herceptina; +Herceptina indica na presença de Herceptina) . 0 tamanho de placa de R-LM5 e de outros vírus não desviados (non-detargeted) (R-LM13 e R-LM39) não foi reduzido por Herceptina.

Exemplo 8 - Actividade citotóxica dos vírus recombinantes.

Investigámos se R-LM113 e R-LM249 mantinham a actividade citotóxica do vírus parental HSV-1. Células SK0V3 foram semeadas em placas de 12 poços (4 x 105 células/poço) e infectadas no dia seguinte com R-LM5, R-LM116 ou R-LM249 com uma MOI de 3 pfu/célula. Após três dias, digeriram-se as células infectadas com tripsina e determinou-se o número de células viáveis e não viáveis por meio do ensaio de exclusão de Eritrosina B. Resumidamente, misturaram-se as células 1:1 com Eritrosina B (Sigma) a 0,04% em PBS, carregaram-se num hemocitómetro e contaram-se. As células não viáveis incorporaram o corante e aparecem de cor vermelha. O número de células não viáveis foi reportado como uma fracção do número de células total (vermelhas mais incolores). As células desprendidas da monocamada e presentes no sobrenadante das amostras infectadas foram colhidas e contadas do mesmo modo. Como controlo incluíram-se poços replicados de células não infectadas. Como se mostra na Fig. 16, a infecção virai quase impede as células de se dividirem, uma vez que o número total de células é inferior quando comparado com o de células não infectadas. Além disso, a infecção causa citotoxicidade celular, uma vez que a percentagem de células não viáveis é superior em culturas infectadas em relação a culturas replicadas não infectadas. O efeito da infecção dos recombinantes R-LM113 e R-LM249 é comparável com o do vírus R- LM5, portador de gD do tipo selvagem, indicando que o redireccionamento (retargeting) e o desvio (detargeting) do vírus não afectaram as propriedades citotóxicas dos recombinantes. 40 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ Dl BOLOGNA <120> VÍRUS HERPES SIMPLEX (HSV) COM TROPISMO MODIFICADO, SUAS UTILIZAÇÕES E PROCESSO DE PREPARAÇÃO <130> E6277/08-WO <160> 43

<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Vírus herpes simplex <400> 1

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 S 10 15

Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro Vai Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro 20 25 30

Gly vai Arg Arg Vai Tyr His Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 35 40 45

Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr vai Tyr Tyr Ala Vai Leu Glu Arg 50 55 60

Ala Cys Arg Ser Vai Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gin lie 65 70 75 80

Vai Arg Gly Ala Ser Glu Asp Vai Arg Lys Gin Pro Tyr Asn Leu Thr 85 90 95

Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Vai 100 105 110

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 115 120 125

Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Vai 130 135 140

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 145 ISO 155 160

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Vai Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile 165 170 175

Thr Gin Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 180 185 190 41 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gin Ala Tyr 195 200 205 Gin Gin Gly val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile 210 215 220 Pro Glu Asn Gin Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 225 230 235 240 Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 245 250 255 Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro 275 280 285 Gin Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gin Asp Ala Ala Thr 290 295 300 Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320 Ala Vai Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val 325 330 335 Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 340 345 350 Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gin Pro Ser Ser His Gin Pro Leu Phe 355 360 365 Tyr <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Anticorpo de cadeia simples <400> 2 Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr 20 25 30 Ala val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu 35 40 45 95 42 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr 85 90 Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 <210> 3 <211> 12 0 <212> PRT <213> Art il Eic ial <220> <223> Anticorpo de cadeia simpl es <400> 3 Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 1 5 10 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 20 25 Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 65 70 75 Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 100 105 Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Art iJ Eic ial <220> <223> Anticorpo de cadeia simpl es <400> 4 Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg 30 10 15 95 15

Leu Vai Phe His 20 <210> 5 <211> 11 43 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <212> PRT <213> <220> Artificial <223> Anticorpo de cadeia simples <400> 5

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser 15 10 <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> <400> Glu Asn 1 Anticorpo de cadeia simples 6 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 7

His Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 8

Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly 15 10 <210> 9 <211> 596 <212> PRT <213> <220> Artificial <223> <400> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples 9 44 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Lys Tyr Ala Leu Ala Glu Asn Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro 15 10 15

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg 20 25 30

Ala Ser Gin Asp vai Asn Thr Ala . 35 40

Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 45

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 50 55

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 60

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 65 70

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr 75 80

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 85

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 90 95

Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro 100

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai 105 110

Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly 115 120 125

Lys Asn Leu Vai Phe His Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly 130 135 140

Gly Leu val Gin Pro Gly Gly ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 145 150 155 160

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr ile His Trp Val Arg Gin Ala Pro 165 170 175

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr 180 185 190

Thr Arg Tyr Ala Asp ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp 195 200 205

Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 210 215 220

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 225 230 235 240 45 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Vai Thr vai Ser Ser Ser 255

Ile Gin Ala Gly Leu Pro 270

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 245 250

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser His 260 265

Asp Pro Phe Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Vai Tyr Tyr Ala Vai 275 280 285

Leu Glu Arg Ala Cys Arg Ser Vai Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala 290 295 300

Pro Gin Ile Vai Arg Gly Ala Ser Glu Asp Vai Arg Lys Gin Pro Tyr 305 310 315 320

Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro 325 330 335

Ile Thr Vai Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly 340 345 350

Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe 355 360 365

Ser Ala Vai Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala 370 375 380

Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Vai Lys Ile Asn Asp Trp 385 390 395 400

Thr Glu Ile Thr Gin Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys 405 410 415

Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro 420 425 430

Gin Ala Tyr Gin Gin Gly Vai Thr Vai Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro 435 440 445

Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gin Arg Thr Vai Ala Vai Tyr Ser Leu Lys 450 455 460

Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu 465 470 475 480

Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala 485 490 495

Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Vai Gly Thr 500 505 510 46 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Vai Ala Pro Gin Ile Pro Pro Asn Trp His ile Pro Ser Ile Gin Asp 515 520 525 Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu 530 535 540 Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Xla Ala Leu Val Ile Cys 545 550 555 560 Gly Ile Vai Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg 565 570 575 Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gin Pro Ser Ser His Gin 580 585 590 Pro Leu Phe Tyr 595 <210> 10 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 10 Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 5 10 15 Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro val Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro 20 25 30 Gly Vai Arg Arg Val Tyr His Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 35 40 45 Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr val Tyr Tyr Ala His Ser Ser Gly 50 55 €0 Gly Gly Ser Gly ser ASp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu 65 70 75 80 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin 85 90 95 Asp Vai Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 100 105 110 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro 115 120 125 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 130 135 140 47 47 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His 145 150 155 160

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 165 170 175

Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu 180 185 190

Vai Phe His Ser Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai 195 200 205

Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 210 215 220

Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly 225 230 235 240

Leu Glu Trp Vai Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 245 250 255

Ala Asp ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 260 265 270

Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 275 280 285

Vai Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 290 295 300

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ser Gly Gly Gly 305 310 315 320

Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn 325 330 335

Gin Arg Thr Vai Ala Vai Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly 340 345 350

Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu 355 360 365

Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 370 375 380

Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Vai Gly Thr Vai Ala Pro Gin Ile Pro 385 390 395 400

Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gin Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His 405 410 415 48 48 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Vai Gly 420 425 430

Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Vai Ile Cys Gly Ile Vai Tyr Trp Met 435 440 445

Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile 450 455 460

Arg Glu 465 Asp Asp Gin Pro Ser Ser His Gin 470 Pro Leu Phe Tyr 475 <210> 11 <211> 82 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 11 tgttcggtca taagcttcag cgcgaacgac caactacccc gatcatcagt tatccttaag 60 ccagtgaatt cgagctcggt ac 32 <210> 12 <211> 82 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 12 acttatcgac tgtccacctt tccccccttc cagactcgct ttatatggag ttaaggtccc 60 gaccatgatt acgccaagct cc 32 <210> 13 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 13 caacccggga tccaccggtc gccaccatgg tgagc 35 <210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 14 ccccttggga tcctgcccca ccccaccccc cagaatag 38 <210> 15 49 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <40 0> 15 ttgccagtcg acattccgga tgagcattca tcaggcgggc a 41 <210> 16 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 16 gcaaaaactc gagtgtagac ttccgttgaa ctgatggac 39 <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 17 ggaagtcaat tggaaggttt ttgcgctgga tgtggctgcc c 41 <210> 18 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 18 cacactgaat tcgcaatttg tcacaacacc ttctctagaa c 41 <210> 19 <211> 47

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 19 tcctccgggg agccggcgcg tgtaccacat ccaggcaggc ctaccgg 47 <210> 20 <211> 54 50 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 20 agggggtgac ggtgggctcg atcgggatgc tgcccaacat catccccgag aacc 54 <210> 21 <211> 33 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> <400> Anticorpo de cadeia simples 21 tcgagtggcg gtggctctgg ttccggtgga tcc 33 <210> 22 <211> 38 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 22 caaatatgcc ttggcggaga attctctcaa gatggccg 38 <210> 23 <211> 34 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 23 cgggggtccg gcgcggatcc cacatccagg cggg 34 <210> 24 <211> 37 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 24

gcaaaggaat tccgatatcc agatgaccca gtccccg 37 <210> 25 <211> 39 <212> ADN 51 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 25 cggaggatcc accggaacca gagccaccgc cactcgagg 39 <210> 26 <211> 24

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Anticorpo de cadeia simples <400> 26 catagtagtg gcggtggctc tgga 24 <210> 27 <211> 36

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Anticorpo de cadeia simples <400> 27 tcgagtggcg gtggctctgg ttccggtgga tccggt 36 <210> 28 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 28 acggtttact acgcccatat ggagcgcgcc tgcc 34 <210> 29 <211> 34

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador sintético <400> 29 gacggtggac agcatccata tgctgccccg cttc 34 <210> 30 <211> 27

<212> ADN <213> Artificial <220> 52 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <223> Oligo <400> 30 tagtagtggc ggtggctctg gatccgg 27 <210> 31 <211> 27 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> <400> Oligo 31 taccggatcc agagccaccg ccactac 27 <210> 32 <211> 36 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 32 ggcttatgga tccgatatcc agatgaccca gtcccc 36 <210> 33 <211> 39 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador sintético <400> 33 cggaggatcc accggaacca gagccaccgc cactcgagg 39 <210> 34 <211> 394 <212> PRT <213> <400> Vírus herpes simplex 34 53 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Vai Ile Leu Phe Vai Vai 15 10 15

Ile Vai Gly Leu His Gly Vai Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30

Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn 35 40

Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 45

Vai Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro 50 55

Pro Gly Vai Arg Arg Vai Tyr His 60

Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro SS 70

Phe Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile 75 80

Thr Vai Tyr Tyr Ala Vai Leu Glu 85

Arg Ala Cys Arg Ser Vai Leu Leu 90 95

Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gin 100

Ile Vai Arg Gly Ala Ser Glu Asp 105 110

Vai Arg Lys Gin Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly 115 120 125

Gly Asn Cys Ala lie Pro Ile Thr Vai Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser 130 135 140 54 54 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp 145 ISO 155 160

Asn Tyr Tyr Asp ser Phe ser Ala vai Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe 165 170 175

Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu 180 185 190 val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gin Phe Ile Leu Glu Kis 195 200 205

Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg ile Pro Pro 210 215 220 ser Ala Cys Leu Ser Pro Gin Ala Tyr Gin Gin Gly val Thr val Asp 225 230 235 240

Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gin Arg Thr Val 245 250 255

Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro 260 265 270

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala 275 280 285

Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu 290 295 300

Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gin Ile Pro Pro Asn Trp His 305 310 315 320

Ile Pro Ser Ile Gin Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr 325 330 335

Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala val Gly Gly ser Leu Leu 340 345 350

Ala Ala Leu val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr 355 360 365

Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp 370 375 380

Gin Pro Ser Ser His Gin Pro Leu Phe Tyr 385 390 <210> 35 <211> 1185 <212> ADN <213> Vírus herpes simplex <400> 35 55 55 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 180 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 240 acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 300 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 360 accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 420 accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 480 aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 540 cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 600 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 660 cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 720 agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc 780 ttgaagatcg ccgggtggca cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg 840 gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 900 tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac 960 ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc cggccacccc gaacaacatg 1020 ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt 1080 gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc 1140 cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actag 1185 <210> 36 <211> 1512

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 36 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaaca tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 180 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 240 acggtctact acgcceatag tagtggcggt ggctctggat ccgatatcca gatgaeccag 300 tccccgagct ccctgtccgc ctctgtgggc gatagggtca ccatcacctg ccgtgccagt 360 caggatgtga atactgctgt agcctggtat caacagaaac caggaaaagc tccgaagctt 420 ctgatttact cggcatcctt cctctactct ggagtccctt ctcgcttctc tggtagccgt 480 56 56 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ tccgggacgg atttcactct gaccatcagc agtctgcagc cggaagactt cgeaacttat 540 tactgtcagc aacattatac tactcctccc acgttcggac agggtaccaa ggtggagatc 600 aaatcggata tgccgatggc tgatccgaac cgtttccgcg gtaagaacct ggtttttcat 660 tctgaggttc agctggtgga gtctggcggt ggcctggtgc agccaggggg ctcactccgt 720 ttgtcctgtg cagcttctgg cttcaacatt aaagacacct atatacactg ggtgcgtcag 780 gccccgggta agggcctgga atgggttgoa aggatttatc ctacgaatgg ttatactaga 840 tatgccgata gcgtcaaggg ccgtttcact ataagcgcag acacatccaa aaacacagcc . 900 tacctacaaa tgaacagctt aagagctgag gacactgccg tctattattg tagccgctgg 960 ggaggggacg gcttctatgc Catggactac tggggtcaag gaacactagt caccgtctcc 1020 tcgagtggcg gtggctctgg ttccggtgga tccggtatgc tgccccgctt catccccgag 1080 aaccagcgca ccgtcgccgt atacagcttg aagatcgccg ggtggcacgg gcccaaggcc 1140 ccatacacga gcaccctgct gcccccggag ctgtccgaga cccccaacgc cacgcagcca 1200 gaactcgccc cggaagaccc cgaggattcg gccctcttgg aggaccccgt ggggacggtg 1260 gcgccgcaaa tcccaccaaa ctggcacata ccgtcgatcc aggacgccgc gacgccttac 1320 catcccccgg ccaccccgaa caacatgggc ctgatcgccg gcgcggtggg cggcagtctc 1380 ctggcagccc tggtcatttg cggaattgtg tactggatgc gccgccgcac tcaaaaagcc 1440 ccaaagcgca tacgcctccc ccacatccgg gaagacgacc agccgtcctc gcaccagccc 1500 ttgttttact ag 1512 <210> 37 <211> 1866 <212> ADN <213> Artificial <2 2 0> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 37 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gagaattccg atatccagat gacccagtcc 120 ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag 1B0 gatgtgaata ctgctgtagc ctggtatcaa cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg 240 atttactcgg catccttcct ctactctgga gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc 300 gggacggatt tcactctgac catcagcagc ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac 360 tgtcagcaac attatactac tcctcccacg ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa 420 tcggatatgc cgatggctga tccgaaccgt ttccgcggta agaacctggt ttttcattct 480 gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg 540 tcctgtgcag cttctggctt caacactaaa gacaccCaca tacacCgggt gcgccaggcc 600 ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaagg atttatccta cgaatggtta tactagatat 660 57 57 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ gccgatagcg tcaagggccg tttcaetata agcgcagaca catecaaaaa cacagcctac 720 ctacaaatga acagcttaag agctgaggac actgccgtct attattgtag ccgctgggga 780 ggggacggct tctatgctat ggactaetgg ggtcaaggaa cactagtcac cgtctcctcg 840 agtggcggtg gctctggttc cggtggatcc cacatccagg cgggcctacc agacccgttc 900 cagcccccca gcctcccgat cacggtttac tacgccgtgt tggagcgcgc ctgccgcagc 960 gtgctcctaa acgcaccgtc ggaggccccc cagattgtec gcggggcctc cgaagacgtc 1020 cggaaacaac cctacaacct gaccatcgct tggtttcgga tgggaggcaa ctgtgctatc 1080 cccatcacgg tcatggagta caccgaatgc tcctacaaca agtctctggg ggcctgteec 1140 atccgaacgc agccccgctg gaactactat gacagcttca gcgcegtcag cgaggataac 1200 ctggggttcc tgatgcacgc ccccgcgttt gagaccgccg gcacgtacct gcggctcgtg 1260 aagataaacg actggacgga gattacacag tttatcctgg agcaccgagc caagggctcc 1320 tgtaagtacg ccctcccgct gcgcatcccc ccgtcagcct gcctgtcccc ccaggcctac 1380 cagcaggggg tgacggtgga cagcatcggg atgctgcccc gcttcatccc cgagaaccag 1440 cgcaccgtcg ccgtatacag cttgaagatc gccgggtggc acgggcccaa ggccccatac 1500 acgagcaccc tgctgccccc ggagctgtcc gagaccccca acgccacgca gccagaactc 1560 gccccggaag accccgagga ttcggccctc ttggaggacc ccgtggggac ggtggcgccg 1620 caaatcccac caaactggca cataccgtcg atccaggacg ccgcgacgcc ttaccatccc 1680 ccggccaccc cgaacaacat gggcctgatc gccggcgcgg tgggcggcag tctcctggca 1740 gccctggtca tttgcggaat tgtgtactgg atgcgccgcc gcactcaaaa agccccaaag 1800 cgcatacgcc tcccccacat ccgggaagac gaccagccgt cctcgcacca gcccttgttt 1860 tactag 1866

<210> 38 <211> 625 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 38

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Aap Pro Asn Arg 15 10 15

Phe Arg Gly Lys Gly Ile Pro Vai Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser 20 25 30

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 35 40 45

Arg Ala Ser Gin Asp vai Asn Thr Ala Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 50 55 60 58 58 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Pro GXy Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 65 70 75 B0

Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110

Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys-115 120 125 val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg 130 135 140

Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly 145 150 155 160

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 165 170 175

Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gin Ala 180 185 190

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly 195 200 205

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Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 225 230 235 240

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Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser ser 260 265 270

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro 275 280 285

Gly Ser Arg Arg Val Tyr His Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 290 295 300

Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr val Tyr Tyr Ala val Leu Glu Arg 305 310 315 320

Ala Cys Arg Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gin Ile 325 330 335 59 59 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ val Arg Gly Ala Ser Glu Asp vai Arg Lys Gin Pro Tyr Asn Leu Thr 340 345 350

Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr val 355 360 365

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 370 375 380

Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp ser Phe ser Ala Val 385 390 395 400

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 405 410 415

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu ile 420 425 430

Thr Gin Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 435 440 445

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gin Ala Tyr 450 455 460

Gin Gin Gly Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile 465 470 475 480

Pro Glu Asn Gin Arg Thr val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 485 490 495

Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 500 505 510

Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 515 520 525

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Gin Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gin Asp Ala Ala Thr 545 550 555 560

Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 565 570 575

Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val 580 585 590

Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 595 600 605

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Tyr 625

<210> 39 <211> 1953 <212> ADN 60 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 39 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgccttcgcg gcaaaggaat tccggtctcc gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 180 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat 240 actgctgtag cctggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg 300 gcatccttcc tctactctgg agtcccttct cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat 360 ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa 420 cattatacta ctcctcccac gttcggacag ggtaccaagg tggagatcaa atcggataCg 480 ccgatggctg atecgaaccg tttccgcggt aagaacctgg tttttcattc tgaggttcag 540 ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca 600 gcttctggct ccaacattaa agacacctat atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag 660 ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct acgaatggtt atactagata tgccgatagc 720 gtcaagggcc gtttcactat aagcgcagac acatccaaaa acacagccta cctacaaatg 780 aacagcttaa gagcCgagga cactgccgtc Cattactgta gccgctgggg aggggacggc 840 Ctctatgcta tggactactg gggtcaagga acactagtca ccgtctcctc gagtggcggt 900 ggctctggtt ccggtctgga ccagctgacg gatcctccgg ggagccggcg cgtgtaccac 960 atccaggcag gcctaccgga occgttccag ccccccagcc tcccgatcac ggtttactac 1020 gccgtgttgg agcgcgcctg ccgcagcgtg ctcctaaacg caccgtcgga ggccccccag 1080 attgtccgcg gggccCccga agacgtccgg aaacaaccct acaacctgac catcgcttgg 1140 tttcggatgg gaggcaactg tgctatcccc atcacggtca tggagtacac cgaatgctcc 1200 tacaacaagt ctctgggggc ctgtcccatc cgaacgcagc cccgctggaa ctactatgac 1260 agcttcagcg ccgtcagcga ggataacctg gggttcctga tgcacgcccc cgcgtttgag 1320 accgccggca cgtacctgcg gctcgtgaag ataaacgact ggacggagat tacacagttt 1380 atcctggagc accgagccaa gggctcctgt aagtacgccc tcccgctgcg catccccccg 1440 tcagcctgcc tgtcccccca ggcctaccag cagggggtga cggtggacag catcgggatg 1500 ctgccccgct tcatccccga gaaccagcgc accgtcgccg tatacagctt gaagatcgcc 1560 gggtggcacg ggcccaaggc cccatacacg agcaccctgc tgcccccgga gctgtccgag 1620 acccccaacg ccacgcagcc agaacccgcc ccggaagacc ccgaggattc ggccctcttg 1680 gaggaccccg tggggacggt ggcgccgcaa atcccaccaa actggcacat accgtcgatc 1740 caggacgccg cgacgcctta ccatcccccg gccaccccga acaacatggg cctgatcgcc 1800 ggcgcggtgg gcggcagtct cctggcagcc ctggtcattt gcggaattgt gtactggatg 1860 cgccgccgca ctcaaaaagc cccaaagcgc atacgcctcc cccacatccg ggaagacgac 1920 1953 cagccgtcct cgcaccagcc cttgttttac tag

<210> 40 <211> 625 <212> PRT 61 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 40

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Aan Arg 15 10 15

Phe Arg Gly Lys Gly lie Pro vai Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser 20 25 30

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 35 40 45

Arg Ala Ser Gin Asp Vai Asn Thr Ala Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 50 55 60

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 65 70 75 80

Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110

Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 115 120 125

Vai Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg 130 135 140

Glu Ser Gly 160

Gly Lys Asn Leu vai Phe His Ser Glu Vai Gin Leu vai 145 150 155 62 62 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 165 170 175

Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Vai Arg Gin Ala 180 135 190

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly 195 200 205

Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 210 215 220

Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 225 230 235 240

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 245 250 255

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 260 265 270

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro 275 280 285

Gly Ser Arg Arg Vai Tyr His Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 290 295 300

Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Vai Tyr Tyr Ala Vai Leu Glu Arg 305 310 315 320

Ala Cys Arg Ser Vai Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gin Ile 325 330 335

Vai Arg Gly Ala Ser Glu Asp Vai Arg Lys Gin Pro Tyr Asn Leu Thr 340 345 350

Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Vai 355 360 365

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 370 375 380

Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Vai 385 390 395 400

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 405 410 415

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Vai Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu ile 420 425 430 63 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Thr Gin Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 435 440 445

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gin Ala Tyr 450 455 460

Gin Gin Gly Vai Thr Vai Gly Ser Ile Gly Met Leu Pro Asn Ile Ile 465 470 475 480

Pro Glu Asn Gin Arg Thr Vai Ala Vai Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly 485 490 495

Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 500 505 510

Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 515 520 525

Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Vai Gly Thr Vai Ala Pro 530 535 540

Gin Ile Pro Pro Asn Trp His ile Pro Ser ile Gin Asp Ala Ala Thr 545 550 555 560

Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 565 570 575

Ala Vai Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Vai Ile Cys Gly Ile Vai 580 585 590

Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 595 600 605

Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gin Pro Ser Ser His Gin Pro Leu Phe 610 615 620

Tyr 625 <210> 41 <211> 1953 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 41 60 120 180 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat cgctttcgcg gcaaaggaat tccggtctcc gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat 240 64 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ actgctgtag cctggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg 300 gcatccttcc tctactctgg agtcccttct cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat 360 ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa 420 cattatacta ctcctcccac gctcggacag ggtaccaagg tggagatcaa atcggatatg 480 ccgatggctg acccgaaccg tttccgcggt aagaacctgg tttttcatCc tgaggttcag 540 ctggtggagt ctggcggtgg cceggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca 600 gcttctggct tcaacattaa agacacctat atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag 660 ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct acgaatggtt atactagata tgccgatagc 720 gCcaagggcc gtttcactat aagcgcagac acatccaaaa acacagccta cctacaaatg 780 aacagcctaa gagctgagga cactgccgtc tattattgta gccgctgggg aggggacggc 840 ttctatgcta tggactactg gggtcaagga acactagtca ccgtctcctc gagtggcggt 900 ggctctggtt ccggtctgga ccagctgacg gatcccccgg ggagccggcg cgtgtaccac 960 atccaggcag gcctaccgga cccgttccag ccccccagcc tcccgatcac ggtttactac 1020 gccgtgttgg agcgcgcctg ccgcagcgtg ctcctaaacg caccgtcgga ggccccccag 1080 attgtccgcg gggcctccga agacgtccgg aaacaaccct acaacctgac catcgcttgg 1140 tttcggatgg gaggcaactg tgctatcccc atcacggtca tggagtacac cgaatgctcc 1200 tacaacaagt ctctgggggc ctgtcccatc cgaacgcagc cccgctggaa ctactatgac 1260 agcttcagcg ccgtcagcga ggataacctg gggttcctga tgcacgcccc cgcgtttgag 1320 accgccggca cgtacctgcg gctcgtgaag ataaacgact ggacggagat tacacagttt 1380 atcctggagc accgagccaa gggctcctgt aagtacgccc tcccgctgcg catccccccg 1440 tcagcctgcc tgtcccccca ggcctaccag cagggggtga cggtgggctc gatcgggatg 1500 ctgcccaaca tcatccccga gaaccagcgc accgtcgccg tatacagctt gaagatcgcc 1560 gggtggcacg ggcccaaggc cccatacacg agcaccctgc cgcccccgga gctgtccgag 1620 acccccaacg ccacgcagcc agaactcgcc ccggaagacc ccgaggattc ggccctcttg 1680 gaggaccccg tggggacggt ggcgccgcaa atcccaccaa actggcacat accgtcgatc 1740 caggacgccg cgacgcctta ccatcccccg gccaccccga acaacatggg cctgatcgcc 1800 ggcgcggtgg gcggcagtct cctggcagcc ctggtcattt gcggaattgt gtactggatg 1860 cgccgccgca cCcaaaaagc cccaaagcgc atacgcctcc cccacatccg ggaagacgac 1920 1953 cagccgtcct cgcaccagcc cttgttttac tag <210> 42 <211> 625 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 42 65 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg 1 S 10 15

Phe Arg Gly Lys Gly Ile Pro Vai Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser 20 25 30

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys 35 40 45

Arg Ala Ser Gin Asp Vai Asn Thr Ala Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 50 55 60

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr 65 70 75 80

Ser Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105 110

Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 115 120 125 val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg 130 135 140

Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly 145 150 155 160

Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 165 170 175

Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr ile His Trp val Arg Gin Ala ISO 185 190

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg ile Tyr Pro Thr Asn Gly 195 200 205

Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala 210 215 220

Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 225 230 235 240

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe 245 250 255

Ser Ser

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 260 265 270 66 66 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Gin Leu Thr Asp Pro Pro 275 280 285

Gly Vai Arg Arg Vai Tyr His Ile Gin Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe 290 295 300

Gin Pro Pro Ser Leu Pro Ile Thr Vai Tyr Tyr Ala Vai Leu Glu Arg 305 310 315 320

Ala Cys Arg Ser Vai Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gin Ile 325 330 335

Vai Arg Gly Ala ser Glu Asp Vai Arg Lys Gin Pro Tyr Asn Leu Thr 340 345 350

Ile Ala Trp Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Vai 355 360 365

Met Glu Tyr Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro 370 375 380

Ile Arg Thr Gin Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Vai 385 390 395 400

Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr 405 410 415

Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu Vai Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu ile 420 425 430

Thr Gin Phe Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala 435 440 445

Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gin Ala Tyr 450 455 460

Gin Gin Gly Vai Thr Vai Asp Ser ile Gly Met Leu Pro Arg Phe lie 465 470 475 480

Pro Glu Asn Gin Arg Thr Vai Ala Vai Tyr Ser Leu Lys lie Ala Gly 485 490 495

Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu 500 505 510

Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gin Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp 515 520 525

Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Vai Gly Thr Vai Ala Pro 530 535 540 67 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ

Gin Xle Pro Pro Asn Trp His lie Pro Ser Ile Gin Asp Ala Ala Thr 545 550 555 560

Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly 565 570 575

Ala Vai Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Vai Ile Cys Gly Ile vai 580 585 590

Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gin Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu 595 600 605

Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gin Pro Ser Ser His Gin Pro Leu Phe 610 615 620

Tyr 625 <210> 43 <211> 1953 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> gD de HSV e anticorpo de cadeia simples <400> 43 atgggggggg otgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgcottggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaaggaat tccggtctcc gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 180 ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgcc gtgocagtca ggatgtgaat 240 aotgctgtag cctggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg 300 gcatccttcc tctactetgg agtcccttct cgcttctctg gtagccgttc cgggacggat 360 ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa 420 cattatacta ctcctcccac gttcggacag ggtaccaagg tggagatcaa atcggatatg 480 ccgatggctg atccgaaccg tttccgcggt aagaacctgg tttttcattc tgaggttcag 540 ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca 600 gcttctggct tcaacattaa agacacctat atacactggg tgcgtcaggc cccgggtaag 660 ggcctggaat gggttgcaag gatttatcct acgaatggtt atactagata tgccgatagc 720 gtcaagggcc gtttcactat aagcgcagac acatccaaaa acacagcota cctacaaatg 780 aacagcttaa gagctgagga cactgccgtc tattattgta gccgctgggg aggggacggc 840 ttctatgcta tggactactg gggtcaagga acactagtca ccgtctcctc gagtggcggt 900 ggctctggtt ccggtctgga ccagctgacg gatcctccgg gggtccggcg cgtgtaccac 960 atccaggcgg gcctaccaga cccgttccag ccccccagcc tcccgatcac ggtttactac 1020 68 ΕΡ 2 293 804/ΡΤ gccgtgttgg attgtccgcg tttcggatgg tacaacaagt agcttcagcg acegccggca atcctggagc tcagcctgcc ctgccccgct gggtggcacg acccccaacg gaggaccccg caggacgccg ggcgcggtgg cgccgccgca cagccgtcct

Lisboa, 2013 agcgcgcctg ccgcagcgtg gggcctccga agacgtccgg gaggcaactg tgctatcccc ctctgggggc ctgtcccatc ccgtcagcga ggataacctg cgtacctgcg gctcgtgaag accgagccaa gggctcctgt tgtcccccca ggcctaccag tcatccccga gaaccagcgc ggcccaaggc cccatacacg ccacgcagcc agaactcgcc tgggga.cggt ggcgccgcaa cgacgcctta ccatcccccg gcggcagtct cctggcagcc ctcaaaaagc cccaaagcgc cgcaccagcc cttgttttac -08-21 ctcctaaacg caecgtcgga aaacaacccC acaacctgac atcacggtca tggagtacac cgaacgcagc cccgctggaa gggttcctga tgcacgcccc ataaacgact ggacggagat aagtacgccc tcccgctgcg cagggggtga cggtggacag accgtcgccg tatacagctt agcaccctgc tgcccccgga ccggaagacc ccgaggattc atcccaccaa actggcacat gccaccccga acaacacggg ctggtcattt gcggaattgt atacgcctcc cccacatccg tag ggececccag 1080 catcgcttgg 1140 cgaatgctcc 1200 ctactatgac 1260 cgcgtttgag 1320 tacacagttt 1380 catceccecg 1440 catcgggatg 1500 gaagatcgcc 1560 gctgcccgag 1620 ggccotcttg 1680 accgtcgatc 1740 cctgatcgcc 1800 gtactggatg 1860 ggaagacgac 1920 1953

Claims (13)

1. ΕΡ 2 293 804/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Vírus herpes simplex modificado (HSV) compreendendo um invólucro glicoproteico no qual um anticorpo de cadeia simples heterólogo substitui uma porção apagada do domínio de gD do referido invólucro glicoproteico para formar uma proteína de fusão, onde a) a referida porção apagada começa numa posição dentro dos aminoácidos 1 a 8 e termina numa posição dentro dos aminoácidos 38 a 55 de gD; ou começa numa posição dentro dos aminoácidos 40 a 61 e termina numa posição dentro dos aminoácidos 210 a 218 de gD; b) o referido anticorpo de cadeia simples compreende um domínio leve variável (VL) e um domínio pesado variável (VH) separados por um ligador (Ll), onde o ligador permite a VL e a VH assumirem a conformação apropriada de modo a que o anticorpo de cadeia simples se possa ligar em condições especificas a um receptor que é expresso em células tumorais mas não substancialmente em células não tumorais; c) o invólucro está modificado de um modo tal que a capacidade do HSV modificado para interactuar com o receptor nectina-l/HveC é reduzida.
2. 2. HSV modificado de acordo com a reivindicação 1, onde o invólucro está modificado de um modo tal que a capacidade do HSV modificado para interactuar com os receptores nectina-1/HveC e HVEM/HveA está reduzida ou substancialmente removida.
3. 3. HSV modificado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde a porção apagada de gD começa na posição 6 e termina na posição 38, ou começa na posição 61 e termina na posição 218.
4. 4. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores, onde a referida gD possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 1.
5. 5. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores, onde o referido receptor expresso em células tumorais possui pelo menos 90% de identidade com um receptor ΕΡ 2 293 804/ΡΤ 2/3 seleccionado entre: HER2/ErbB2, EGFR1, EGFR3, PMSA, CEA, GD2, VEGFR1 e VEGFR2.
6. 6. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações precedentes, onde o referido anticorpo de cadeia simples compreende adicionalmente um segundo ligador (L2) e/ou um terceiro ligador (L3), onde: VH está localizada entre e liga LI e L2, e VL está localizada entre e liga LI e L3.
7. 7. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações 6-8, onde: VL possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:2 VH possui pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO:3 LI possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO:4 L2 possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO:5 L3 possui pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO:6 ou com a SEQ ID NO:7.
8. 8. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores, onde a referida proteína de fusão resultante da substituição de uma porção de gD pelo referido ligando peptídico possui pelo menos 70% de identidade com a SEQ ID NO:9 ou com a SEQ ID NO:10.
9. 9. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores compreendendo adicionalmente um marcador, e em particular um marcador adequado para visualização de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, carcinoma da cabeça e pescoço, tecido neoangiogénico de um tumor, neuroblastoma e/ou suas metástases.
10. 10. Preparação farmacêutica compreendendo HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores 1-9 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores 1-9 para utilização no tratamento de uma doença tumoral, e em particular de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, tumor do ΕΡ 2 293 804/ΡΤ 3/3 estômago, tumor da glândula salivar, melanoma, carcinoma da cabeça e pescoço ou um neuroblastoma.
12. 12. HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores 1-9 para utilização no tratamento de uma metástase de uma doença tumoral, e em particular de uma metástase de um tumor de ovário, tumor mamário, tumor da próstata, tumor do cólon, melanoma, ou de um neuroblastoma.
13. 13. Processo para preparação de HSV modificado de acordo com uma das reivindicações anteriores 1-9, compreendendo: Deleção de uma porção do ADN codificando a gD do HSV, substituição da porção apagada pelo ADN codificando o anticorpo de cadeia simples determinando a capacidade do HSV modificado resultante para se ligar a pelo menos um receptor expresso por células tumorais mas não substancialmente por células não tumorais. Lisboa, 2013-08-21