KR20190015544A - 변형된 당단백질 d를 갖는 헤르페스 바이러스 - Google Patents

변형된 당단백질 d를 갖는 헤르페스 바이러스 Download PDF

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알마마 테르 스투디오룸 유니베르시타‘ 디 볼로냐
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Abstract

본 발명은 표적 분자(들)에 결합할 수 있으며, 당단백질 D에 융합되거나 삽입될 수 있는 이종 펩티드 및 선택적으로 폴리펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스에 관한 것이다. 재조합 헤르페스 바이러스는 gD의 천연 수용체로부터 바이러스를 디타겟팅하기 위한 변형을 추가적으로 포함할 수 있다. 이는 헤르페스 바이러스가 치료 목적을 위한 세포, 및 바이러스 생산을 위한 세포를 효율적으로 표적화 할 수 있게 한다. 본 발명은 헤르페스 바이러스, 종양, 감염, 퇴행성 질환 또는 노화 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 헤르페스 바이러스, gD를 암호화하는 핵산 및 벡터, gD를 포함하는 폴리펩티드, 및 헤르페스 바이러스, 핵산, 벡터 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함한다. 또한, 헤르페스 바이러스로 세포를 감염시키기 위한 또는 헤르페스 바이러스를 생산하기 위한 방법이 개시된다.

Description

변형된 당단백질 D를 갖는 헤르페스 바이러스
본 발명에 이르는 연구는 유럽 연합의 7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)/ERC 지원금 협정(ERC grant agreement) n°340060 하에 유럽 연구 위원회(European Research Council)로부터 자금을 지원받았다.
의료 서비스의 꾸준한 발전에도 불구하고, 치료될 수 없거나 충분히 치료될 수 없는 질병 및 병리의 부담은 여전히 높아지고 있다. 그 중에서도 특출난 것은 수많은 형태의 종양, 특히 화학 방사선 요법 또는 생물학적 약제 또는 이들의 조합으로 치료되지만 성공은 제한적인, 종양의 전이 형태이다.
종양 치료의 대안적인 접근법은 복제가능 바이러스(replication competent virus)가 종양 세포를 감염시키고, 종양 세포 간(cell to cell)에 퍼져 그것들을 파괴하는 종양 용해 바이러스 치료법(oncolytic virotherapy)이다.
단순포진 바이러스(Herpes simplex virus, HSV)는 인간에 대한 병원성 바이러스이다. 배양에서, 이는 많은 수의 포유류 세포를 감염시킨다. 이는 표적 세포 유형에 따라, 원형질막에서 또는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해, 막 융합에 의해 세포로 들어가는 외피보유 바이러스(enveloped virus)이다. 표적 세포 내로의 HSV의 진입(entry)은 바이러스 당단백질 gD, gH/gL, gC 및 gB의 복잡한 상호작용 및 구조적 변화가 필요한 다단계 프로세스이다. 이들 당단백질은 HSV 입자의 가장 바깥쪽의 구조이며 막으로 이루어지는, 바이러스 외피(envelope)를 구성한다. 세포 진입을 위해, gC 및 gB는 HSV 입자의 세포 표면 헤파란 황산(heparan sulfate)에 대한 첫 번째 부착(attachment)을 매개한다. 그 후, gD는 nectin-1(인간: HveC) 및 HVEM(HveA로도 알려져 있음)인 적어도 두 개의 다른(alternative) 세포 수용체에 결합하여, 비리온(virion)-세포막 융합으로 이어지는 연쇄적 사건을 일으키는 gD에서의 구조적 변화를 야기한다는 점에서 표적 세포와 바이러스의 더욱 특이적인 상호작용이 일어난다. 그 때문에, 중간(intermediate) 단백질 gH/gL(이종 이량체(heterodimer))이 활성화되어 막 융합을 촉진시키는 gB를 촉발시킨다.
종양 용해성 HSV(oncolytic HSV, o-HSV)는 최근 수년간 종양 용해제(oncolytic agent)로서 사용되어 왔다. 야생형 HSV 바이러스는 독성이 매우 강하기 때문에, o-HSV는 약독화(attenuated)될 필요가 있다. 임상 시험에 도달한 T-VEC/임리직 및 바이러스는 감염된 세포에서 단백질 합성의 차단(shut off)을 막는 역할을 하는 ICP34.5 단백질을 암호화하는 감마 γ134.5 유전자 및 리보뉴클레오티드 리덕타아제(ribonucleotide reductase)의 큰 서브유닛을 암호화하는 UL39 유전
Figure pct00001
전사를 포함하는, 하나 이상의 HSV 유전자의 결실을 갖는다. 자손 바이러스(progeny virus)를 고수율로 생산하지 못하는 것과 같은 이들 바이러스에 의해 나타나는 몇 가지 단점 이외에, 이들은 또한 그들의 천연 수용체를 포함하고 있는 임의의 세포에 결합하는 보존된(preserved) 능력이 있다. 따라서, 종양 세포를 죽이는 치료 효과는 감소되고, 바이러스는 의학 용도에 한계가 있을 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위한 하나의 접근법은 종양 세포에 대개 고도의 특이적 친화성(tropism)을 나타내는 o-HSV의 유전자 조작이었으며, 그렇지 않은 경우 약독화되지 않았다. 이 접근법은 종양-특이적 수용체에 대한 HSV 친화성의 리타겟팅(retargeting)으로 정의되었다.
암-특이적 수용체에 대한 HSV의 리타겟팅은 특정 리간드를 암호화하는 이종 서열을 보유하도록 하는 gD의 유전적 변형을 수반한다. 재조합 바이러스로 감염되면, 야생형 gD 대신 그것의 외피에 키메라 gD-리간드 당단백질을 갖는 자손 바이러스가 형성된다. 리간드는 선택된 세포 상에 특이적으로 발현되는 분자와 상호작용하여, 재조합 o-HSV의 선택된 세포 내로의 진입을 가능하게 한다. HSV의 리타겟팅에 성공적으로 사용되었던 리간드의 예는 IL13α, uPaR, HER2에 대한 단일 사슬 항체 및 EGFR에 대한 단일 사슬 항체이다.
리타겟팅은 재조합 바이러스가 선택된 세포를 표적화하는 것을 수반하지만, 리타겟팅은 재조합 바이러스가 여전히 그것의 천연 세포 수용체를 표적화하는 능력을 막지 않으므로 신체 세포의 감염 및 사멸을 초래한다. 헤르페스 바이러스가 그것의 천연 수용체에 결합하여 신체의 정상 세포가 사멸하는 것을 막기 위하여, 천연 수용체에 대한 결합을 감소시키려는 시도가 있어 왔다. 이것은 재조합 헤르페스 바이러스가 비변형 헤르페스 바이러스의 천연 수용체에 대한 결합 능력을 감소시키거나 또는 이를 전혀 갖지 않는 것을 의미하는 "디타겟팅(detargeting)"으로 불리우며, 이에 의해 용어 "감소된"은 이러한 변경을 감소시키는 결합을 하지 않는 동일한 헤르페스 바이러스와 비교하여 사용된다. 이는 정상 세포가 감염되지 않거나, 또는 감소된 정도로 감염되어 정상 세포가 사멸되지 않거나 또는 정상 세포가 덜 사멸되는 효과를 갖는다. 이러한 디타겟팅된 헤르페스 바이러스는 정상 세포를 덜 감염시키거나 감염시키지 않음으로써 유해한 활성을 감소시키고, 질병 세포를 사멸시킴으로써 유익한 활성을 증가시킨다.
당업계는 HSV를 질병-특이적 수용체로 리타겟팅하기 위한 방법을 알고 있으나, 리타겟팅될 수 있는 능력을 가지는 이들 HSV는 대량으로 생산될 수 있으며 질병 치료용 제약으로서 이용 가능하도록 증식될 필요가 있다. 안전성을 이유로, 인간에의 질병 세포, 예컨대 종양 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질의 도입을 피하기 위하여, HSV의 증식 및 생산을 위한 세포는 질병 세포여서는 안된다는 점에 비춰 볼 때, HSV는 HSV의 증식 및 생산을 위해 인체에 유해한 성분을 생성하지 않는 "안전한" 세포를 감염시킬 수 있게 하기 위한 추가적인 변형을 포함할 필요가 있다. 그러나 선행 기술은 아직 안전한 세포에서 질병-특이적 수용체로 리타겟팅되는 능력을 갖는 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 가능하게 하는 방법을 개시하지 않았다. 더욱이, 선행 기술은 아직 HSV의 질병-특이적 수용체 및 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 위한 안전한 세포로의 리타겟팅 이외에 HSV의 디타겟팅을 가능하게 하는 방법을 개시하지 않았다.
당업계는 한편으로는 제거되어야 할 필요가 있는 질병 세포이고 다른 한편으로는 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산에 사용되는 세포인 상이한 세포로 헤르페스 바이러스를 표적화하기 위한 리타겟팅 전략을 제공할 필요가 있다. 또한, 당업계에서 이러한 헤르페스 바이러스는 신체의 정상 세포를 감염시킬 수 없을 필요가 있다.
본 발명은 바이러스를 재조합 헤르페스 바이러스를 증식시키고 생산하는데 사용되는 세포 상의 수용체로 그리고 제거될 필요가 있는 세포로 리타겟팅하고, gD의 천연 수용체로부터 바이러스를 디타겟팅하는 변형된 gD 단백질을 갖는 재조합 HSV를 기술한다.
특히, 본 발명자들은 gD와의 융합 단백질로서 특정 표적 분자에 대한 짧은 길이의 펩티드 리간드를 포함하는 재조합 HSV를 제조할 수 있으며, 이로 인해 짧은 길이의 리간드임에도 불구하고 HSV가 각 표적 분자를 가지는 세포로 리타겟팅됨을 보여 주었다.
본 발명자들은 gD에서 또 다른 특정 표적 분자에 대한 추가 리간드의 추가적인 존재가 HSV를 또한 이 추가의 특정 표적 분자로 리타겟팅될 수 있게 한다는 것을 보여 주었다. 본 발명자들은 HVEM 결합 부위 내로의 리간드의 삽입 및/또는 nectin-1 결합 부위로 구성되는 아미노산의 결실에 의한 천연 수용체 HVEM 및 nectin-1에 대한 gD의 결합 부위의 불활성화가 그것의 천연 수용체로부터 재조합 HSV의 디타겟팅을 초래한다는 것을 보여 주었다. 본 발명자들은 상기의 조합, 즉 gD로의 두 개의 리간드의 삽입 및 gD로부터의 특정 서열의 결실이 재조합 HSV를 리간드(들)의 표적 분자(들)로 리타겟팅하고, gD의 천연 수용체로부터 디타겟팅한다는 것을 보여 주었다. 그렇게 함으로써, HSV 감염성이 유지되어 리간드의 표적 분자를 가지는 세포 내, 즉 HSV의 증식 및 생산을 위한 세포 내 및 질병 세포 내로 재조합 HSV가 들어가게 되는 반면, 리간드의 표적 분자를 가지지 않지만 gD의 천연 수용체를 갖는 세포의 감염성(infectivity)은 없어진다(abolished).
도 1: R87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 게놈 구성(organization). HSV-1 게놈의 서열 배열은 역 반복 IR 서열을 직사각형 박스로서 보여준다. 상류 및 하류 Gly-Ser 링커에 의해 개재되는(bracketed) GCN4 펩티드는 R-87 및 R-89에서 gD의 AA 24와 25 사이에 삽입된다. 상류 및 하류 Gly-Ser 링커에 의해 개재되는 GCN4 펩티드는 R-97에서 gD의 AA 35-39 대신, R-99에서 gD의 AA 214-223 대신, R-97에서 gD의 AA 219-223 대신 삽입된다. scFv-HER2 서열(VL-링커-VH)은 R-87에서 gD의 AA 35-39 대신 삽입된다. scFv-HER2 서열(VL-링커-VH)은 R-89에서 gD의 AA 214-223 대신 삽입된다. scFv-HER2 서열(VL-링커-VH)은 R-97, R-99 및 R-99-2에서 gD의 AA 24와 25 사이에 삽입된다. 모든 재조합체는 UL3 - UL4 영역 사이에 삽입된 LOX-P 개재된 p-Belo-BAC와 EGFP 서열을 갖는다.
도 2: R-87의 친화성. R-87은 (A) SK-OV-3 세포 또는 (B) Vero-GCN4R 세포에서 성장시켰다. J 세포는 wt-HSV, J-HER2, J-nectin-1에 대한 수용체를 발현하지 않으며, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-87로 감염시키고, 녹색 형광현미경으로 EGFP를 관찰하였다. 패널 e, f, g 및 h에 있는 세포를 허셉틴(Herceptin)/트라스투주맙(Trastuzumab)의 존재하에 중화 용량(neutralizing dose)(28 μg/ml)으로 감염시켰다. R-87은 J-HER2 세포(d, h)외에도, Vero-GCN4R 세포(b, f) 및 HER2-양성 암세포주 SK-OV-3(c, g) 모두를 감염시키고, 이는 또한 HER2의 원숭이 오소로그(simian ortholog)(a)를 발현하는 wt-Vero 세포를 감염시킨다. 허셉틴은 wt-Vero, SK-OV-3 및 J-HER2 세포(e, g, h)의 R-87 감염을 억제하지만, Vero-GCN4R 세포(f)는 억제하지 않는다. R-87은 gD 수용체 HVEM과 nectin-1으로부터 디타겟팅되었기 때문에, J-nectin-1, J-HVEM 및 J 세포(i, j, k)를 감염시키지 못한다.
도 3: R-89의 친화성. R-89는 (A) SK-OV-3 세포 또는 (B) Vero-GCN4R 세포에서 성장시켰다. J 세포는 wt-HSV, J-HER2, J-nectin-1에 대한 수용체를 발현하지 않으며, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-89로 감염시키고, 녹색 형광현미경으로 EGFP를 관찰하였다. 패널 e, f, g 및 h에 있는 세포를 허셉틴/트라스투주맙의 존재하에 중화 용량(28 μg/ml)으로 감염시켰다. R-89는 J-HER2 세포(d, h)외에도, Vero-GCN4R 세포(b, f) 및 HER2-양성 암세포주 SK-OV-3(c, g) 모두를 감염시키고; 이는 또한 HER2의 원숭이 오소로그(a)를 발현하는 wt-Vero 세포를 저조하게(poorly) 감염시킨다. 허셉틴은 wt-Vero, SK-OV-3 및 J-HER2 세포(e, g, h)의 R-89 감염을 억제하지만, Vero-GCN4R 세포(f)는 억제하지 않는다. R-89는 gD 수용체 HVEM과 nectin-1으로부터 디타겟팅되었기 때문에, J-nectin-1, J-HVEM 및 J 세포(i, j, k)를 감염시키지 못한다.
도 4: R-97의 친화성. R-97은 SK-OV-3 세포에서 성장시켰다. J 세포는 wt-HSV, J-HER2, J-nectin-1에 대한 수용체를 발현하지 않으며, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-97로 감염시키고, 녹색 형광현미경으로 EGFP를 관찰하였다. 패널 e, f, g 및 h에 있는 세포를 허셉틴/트라스투주맙의 존재하에 중화 용량(28 μg/ml)으로 감염시켰다. R-97은 J-HER2 세포(d, h)외에도, Vero-GCN4R 세포(b, f) 및 HER2-양성 암세포주 SK-OV-3(c, g) 모두를 감염시키고; 이는 또한 HER2의 원숭이 오소로그(a)를 발현하는 wt-Vero 세포를 감염시킨다. 허셉틴은 wt-Vero, SK-OV-3 및 J-HER2 세포(e, g, h)의 R-97 감염을 억제하지만, Vero-GCN4R 세포(f)는 억제하지 않는다. R-97은 gD 수용체 HVEM과 nectin-1으로부터 디타겟팅되었기 때문에, J-nectin-1, J-HVEM 및 J 세포(i, j, k)를 감염시키지 못한다.
도 5: R-99의 친화성. R-99는 (A) SK-OV-3 세포 또는 (B) Vero-GCN4R 세포에서 성장시켰다. J 세포는 wt-HSV, J-HER2, J-nectin-1에 대한 수용체를 발현하지 않으며, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-99로 감염시키고, 녹색 형광현미경으로 EGFP를 관찰하였다. 패널 e, f, g 및 h에 있는 세포를 허셉틴/트라스투주맙의 존재하에 중화 용량(28 μg/ml)으로 감염시켰다. R-99는 J-HER2 세포(d, h) 외에도, Vero-GCN4R 세포(b, f) 및 HER2-양성 암세포주 SK-OV-3(c, g) 모두를 감염시키고; 이는 또한 HER2의 원숭이 오소로그(a)를 발현하는 wt-Vero 세포를 감염시킨다. 허셉틴은 wt-Vero, SK-OV-3 및 J-HER2 세포(e, g, h)의 R-99 감염을 억제하지만, Vero-GCN4R 세포(f)는 억제하지 않는다. R-99는 gD 수용체 HVEM과 nectin-1으로부터 디타겟팅되었기 때문에, J-nectin-1, J-HVEM 및 J 세포(i, j, k)를 감염시키지 못한다.
도 6: R-99-2의 친화성. R-99-2는 SK-OV-3 세포에서 성장시켰다. J 세포는 wt-HSV, J-HER2, J-nectin-1에 대한 수용체를 발현하지 않으며, J-HVEM은 지시된 수용체만을 발현한다. 지시된 세포를 R-99-2로 감염시키고, 녹색 형광현미경으로 EGFP를 관찰하였다. 패널 e, f, g 및 h에 있는 세포를 허셉틴/트라스투주맙의 존재하에 중화 용량(28 μg/ml)으로 감염시켰다. R-99-2는 J-HER2 세포(d, h)외에도, Vero-GCN4R 세포(b, f) 및 HER2-양성 암세포주 SK-OV-3(c, g) 모두를 감염시키고; 이는 또한 HER2의 원숭이 오소로그(a)를 발현하는 wt-Vero 세포를 감염시킨다. 허셉틴은 wt-Vero, SK-OV-3 및 J-HER2 세포(e, g, h)의 R-99-2 감염을 억제하지만, Vero-GCN4R 세포(f)는 억제하지 않는다. R-99-2는 gD 수용체 HVEM과 nectin-1으로부터 디타겟팅되었기 때문에, J-nectin-1, J-HVEM 및 J 세포(i, j, k)를 감염시키지 못한다.
도 7: (A) SK-OV-3 세포 및 (B) Vero-GCN4R 세포에서 재조합 R-87, R-89, R-99의 수율과 R-LM113의 수율, 및 자손(progeny) 바이러스의 세포 외 배지로의 방출(C, D). Vero-GCN4R 또는 SK-OV-3 세포에서의 R-87, R-89 및 R-99의 복제의 범위를 R-LM112 바이러스의 그것과 비교하였다. 0.1 PFU/세포의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)(Vero-GCN4R에서의 복제에 대해 Vero-GCN4R에서 적정하고, SK-OV-3 세포에서의 복제에 대해 SK-OV-3 세포에서 적정한 접종물)로 지시된 바이러스를 이용하여 세포를 감염시켰다. 감염 후 24시간 및 48시간에 샘플을 수집하고, 자손 바이러스를 SK-OV-3 세포로 적정하였다(A, B). (C) SK-OV-3 세포 또는 (D) Vero-GCN4R 세포를 패널 A(접종물이 SK-OV-3 세포로 적정됨)에서와 같이 0.1 PFU/세포의 MOI로 R-87, R-89, R-99 및 R-LM113를 이용하여 감염시켰다. 감염 후 48시간에 샘플을 수집하고, 세포 외 배지(외부)에 방출되고, 세포-관련 분획(내부) 또는 세포 관련 플러스 배지(내부 + 외부)에 존재하는 자손 비리온을 적정하였다.
도 8: 상이한 세포주에서의 R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 플라크 크기 및 평판 배양 효율(plating efficiency). (A) 비교를 위해 R-87, R-89, R-97, R-99, R-99-2 및 R-LM113의 복제 분취액(aliquot)을 Vero-GCN4R, wt-Vero 및 SK-OV-3 세포에 평판 도말하였다. 3일 후, 형광 현미경 하에서 플라크의 수를 세었다. (B) 상이한 세포주에서의 R-87, R-89, R-97, R-99, R-99-2 및 R-LM113의 상대적 평판 배양 효율. 계수된 플라크의 수는 SK-OV-3 세포에서 계수된 플라크의 백분율로서 나타내었다.
도 9: (A) SK-OV-3 세포 및 (B) Vero-GCN4R 세포에 대하여 R-87, R-89, R-99 및 R-LM113에 의해 야기된 세포독성(cytotoxicity). 세포를 지시된 바이러스(3 PFU/세포)로 감염시켰다. 감염 후 지시된 날짜에서 Alamar-blue 분석법을 통해 세포독성을 측정하였다. Vero-GCN4R 세포에서 R-KM113을 제외하고는, 모든 바이러스가 SK-OV-3 및 Vero-GCN4R에 대해 세포독성을 유발했음을 알 수 있으며, 이는 바이러스가 GCN4R로 리타겟팅되지 않았다는 사실과 일치한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 특징은 개별 단락으로 기술된다. 그러나 이는 단락에 기술된 특징이 다른 단락에 기술된 특징 또는 특징들과 분리되어 있음을 의미하는 것은 아니다. 오히려, 단락에 기술된 특징은 다른 단락에 기술된 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "포함하다/포함하는"은 구체적으로 언급되지 않은 개시된 특징 및 추가 특징을 "포함하는" 것을 의미한다. 용어 "포함하다/포함하는"은 또한 지시되는 특징으로 "구성되는/이루어지는" 것을 의미하므로, 지시되는 특징을 제외한 추가의 특징을 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 제품은 지시된 바와 같은 특징 이외에 부가적인 특징을 특징으로 할 수 있다.
첫 번째 양상에서, 본 발명은 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 D(glycoprotein D, gD)에 융합되거나 삽입되는 표적 분자에 결합할 수 있는, 5 내지 131개의 아미노산 길이를 가지는 이종(heterologous) 펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스를 제공한다.
이의 구현예에서, 이종 펩티드 리간드는 5 내지 120개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 100개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 80개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 60개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 45개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 35개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산 또는 여전히 더욱 바람직하게는 12 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는다.
이의 구현예에서, 이종 펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자(GCN4 yeast transcription factor)의 일부(part), 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프, 더욱 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 GCN4 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부를 포함하며, 가장 바람직하게는 펩티드는 서열번호 12로 표시된다.
이의 구현예에서, 이종 펩티드 리간드는 세포 배양물(cell culture)에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하거나, 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하거나, 또는 재조합 헤르페스 바이러스는 하나 초과의 이종 펩티드 리간드를 포함하며, 여기에서 하나 초과의 이종 펩티드 리간드 중 하나는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하고, 하나 초과의 이종 펩티드 리간드 중 다른 하나는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하며, 바람직하게는 여기에서 헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하는 세포의 막과 융합하는 능력, 여전히 더욱 바람직하게는 상기 세포에 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 상기 세포를 사멸시키는 능력을 갖는다.
선행하는 구현예의 구현예에서, 세포 배양물에 존재하는 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포, 바람직하게는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 세포주(cell line), 더욱 바람직하게는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포, 여전히 더욱 바람직하게는 Vero 세포이고, 및/또는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자는 항체, 항체 유도체(derivative) 또는 항체 모방체(mimetic), 바람직하게는 단일-사슬 항체(scFv), 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 GCN4 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 구성되는 scFv 또는 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 scFv이다. 가장 바람직하게는, 세포 배양물에 존재하는 세포는 서열번호 18로 표시되는 scFv를 표적 분자로서 가지는 Vero 세포이다.
이의 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 gD에 융합되거나 삽입되는, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 더 포함하고, 바람직하게는 헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하는 질병 세포의 막과 융합하는 능력, 여전히 더욱 바람직하게는 상기 세포에 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 상기 세포를 사멸시키는 능력을 갖는다.
선행하는 구현예의 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 펩티드 리간드, 및 이종 폴리펩티드 리간드를 포함한다.
선행하는 네 개의 단락의 구현예에서, 질병 세포에 존재하는 표적 분자는 종양 세포 상에 존재하고, 바람직하게는 표적 분자는 종양 관련 수용체, 더욱 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII을 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원(member), 또는 MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CEA-CAM, Ep-CAM, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질(Folate-binding protein), gp100, GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린(Ephrin) 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(protein-tyrosine kinase, TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13R알파, UPAR, 테나신(Tenascin), PD-1, PD-L1, CTL-A4, TIM-3, LAG3, B7-H3, 또는 IDO를 포함하는 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드(gangioside) GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1, 가장 바람직하게는 HER2이고, 또는 질병 세포는 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포이고, 더욱 바람직하게는 종양 세포, 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합하는 scFv 또는 가장 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 scFv이다.
이의 구현예에서, gD는 수용체 HVEM 및/또는 nectin-1과 상호작용하는 재조합 헤르페스 바이러스의 능력이 감소, 바람직하게는 실질적으로 제거(ablated)되도록 변형된다.
이의 구현예에서, gD의 nectin-1 결합 부위는 불활성화되며, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동(homologous) gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이들의 서브셋을 함유하거나, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이들의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223을 함유하는 gD의 부분(portion)이 gD로부터 결실된다. 더욱 바람직하게는, 아미노산 35 내지 39, 아미노산 214 내지 223 또는 아미노산 219 내지 223이 결실된다.
선행하는 구현예의 구현예에서, 이종 펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키거나, 또는 이종 폴리펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시킨다.
이의 구현예에서, gD의 HVEM 결합 부위는 불활성화되며, 바람직하게는 이종 펩티드 리간드 또는 이종 폴리펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 gD의 아미노산 6과 34의 사이 또는 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 아미노산 24와 25 사이에 삽입된다.
선행하는 구현예의 구현예에서, 이종 펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 gD의 6과 34의 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키거나, 또는 이종 폴리펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 6과 34의 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 이종 펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시킨다. 바람직하게는, 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되거나, 또는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신에 gD에 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 12로 표시되는 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 서열번호 16으로 표시되는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 대신 또는 아미노산 214 내지 223 대신 또는 아미노산 219 내지 223 대신 gD에 삽입되거나, 또는 서열번호 16으로 표시되는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 서열번호 12로 표시되는 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 대신 또는 아미노산 214 내지 223 대신 또는 아미노산 219 내지 223 대신에 gD에 삽입된다.
상기 단락에서 사용된 "이의 구현예에서"는 "첫 번째 양상에서" 또는 "이의 구현예에서"라는 제목의 각각의 선행하는 단락에 대한 역 참조를 의미한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 인간에서 질병 세포를 감염시키고 사멸시키는 목적을 제공한다. 이는 헤르페스 바이러스의 제공 및 그로 인한 이의 증식과 생산을 필요로 한다. 종양 세포와 같은 질병 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질이 인간에 도입되는 것을 피하기 위해 질병 세포에서의 헤르페스 바이러스의 증식은 피해야만 하므로, 재조합 헤르페스 바이러스는 헤르페스 바이러스의 생산에 유용한 세포를 감염시킬 수 있도록 조작되어야 하고, 인간에게 해로울 수 있는 물질을 생산하지 않아야 한다. 이러한 세포는 또한 본원에서 "안전한" 세포로 지칭된다. 이는 증식 및 생산을 위한 이러한 세포로의 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 리타겟팅을 필요로 한다. 이를 달성하기 위하여, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 당단백질 D는 gD에 융합되거나 삽입되는 이종 펩티드 리간드를 포함하도록 변형된다. 펩티드는 짧은 길이에도 불구하고, 헤르페스 바이러스의 생산에 안전하게 사용될 수 있는 세포의 표면에 접근 가능한 표적 분자에 결합할 수 있게 한다. 표적 분자에 결합하기 위한 펩티드의 사용은 재조합 헤르페스 바이러스를 증식시키고 생산하는데 안전하게 사용될 수 있는 세포 상의 이러한 표적 분자의 접근 가능성을 필요로 한다. 이는 다시 펩티드에 결합할 수 있는 표적 분자를 포함하도록 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 안전하게 생산할 수 있는 세포의 변형을 요구할 수 있다. 이러한 리간드 및 표적 분자의 상호의존적 생산은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 바이러스 생산을 위한 세포로 효율적으로 리타겟팅시킬 수 있는 매우 효과적인 리간드/표적 분자 쌍(pair)을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 질병 세포의 제거에 유용하도록 하기 위하여, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 헤르페스 바이러스를 증식 및 생산에 유용한 세포로 리타겟팅하는 이종 펩티드 리간드에 추가하여, 헤르페스 바이러스를 질병 세포로 리타겟팅하는 gD에 융합되거나 삽입되는 리간드를 더 포함한다. 결과적으로, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 헤르페스 바이러스를 증식과 생산에 유용한 세포로 리타겟팅하는 이종 펩티드 리간드 및 헤르페스 바이러스를 질병 세포로 리타겟팅하는 이종 펩티드 리간드 또는 이종 폴리펩티드 리간드인 gD에 융합되거나 삽입되는 리간드를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스가 세포 배양물에 존재하는 세포 및 아마도 질병 세포로 효율적으로 리타겟팅되도록 하기 위하여, 세포 상에 존재하는 gD의 천연 수용체에 대한 재조합 헤르페스 바이러스의 결합 부위는 불활성화되는 것이 유리하다. 이는 감염시키고자 하는 세포로의 효율적인 표적화를 가능하게 하는 반면, 헤르페스 바이러스에 의해 자연적으로 감염된 정상 세포의 감염은 감소된다. gD는 숙주 세포로의 바이러스 진입에 필수적이며, 헤르페스 바이러스 감염성에 필수적인 역할을 한다. 천연 수용체에 대한 gD의 결합 부위의 불활성화는 리간드(들)의 표적 분자를 가지는 세포로의 리타겟팅을 촉진(favor)한다. 따라서, 본 발명의 구현예에서, gD의 천연 HVEM 및/또는 nectin-1 결합 부위(들)는 불활성화되어, 그것에의 결합 및 따라서 이들 수용체를 가지는 세포에 대한 결합이 감소된다. 본 발명자들은 nectin-1 결합 부위 내에 새로운 영역을 발견하였으며, HVEM 결합 부위의 불활성화와 함께 그 결실은 재조합 헤르페스 바이러스를 gD의 천연 수용체로부터 효율적으로 디타겟팅시키고, 따라서 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 정상 세포로부터 디타겟팅시킨다. 본 발명의 바람직한 구현예인 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 결실된 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 결실된 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 리간드의 삽입에 의한 nectin-1에 대한 결합 부위의 불활성화 및 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 리간드의 삽입에 의한 HVEM에 대한 결합 부위의 불활성화의 조합은 리간드의 표적 분자를 가지는 세포로 매우 효율적으로 리타겟팅되고, gD의 천연 수용체로부터 디타겟팅되는 헤르페스 바이러스를 생성시킨다.
더욱 일반적으로, gD의 천연 수용체로부터 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 디타겟팅하는 것은 아미노산 6과 34의 사이, 예컨대 아미노산 24 내지 25 사이의 리간드의 삽입에 의한 HVEM 결합 부위의 불활성화와 같은 gD의 HVEM 결합 부위의 불활성화에 의해 얻어질 수 있다. gD의 천연 수용체로부터 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 디타겟팅하는 것은 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실, 예컨대 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 리간드의 삽입에 의한 nectin-1 결합 부위의 불활성화와 같은 gD의 nectin-1 결합 부위의 불활성화에 의해 얻어질 수 있다. gD의 천연 수용체로부터 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 디타겟팅하는 것은 아미노산 24와 25 사이에 리간드의 삽입에 의한 HVEM 결합 부위의 불활성화, 및 아미노산 35와 39 또는 이의 서브셋, 또는 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실에 의한 nectin-1 결합 부위의 불활성화와 같은, gD의 HVEM 결합 부위 및 nectin-1 결합 부위의 불활성화에 의해 얻어질 수 있다. gD의 천연 수용체로부터 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 디타겟팅하는 것은 아미노산 24 내지 25 사이의 리간드의 삽입에 의한 HVEM 결합 부위의 불활성화 및 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 리간드의 삽입에 의한 nectin-1 결합 부위의 불활성화에 의해 얻어질 수 있다. 아미노산 숫자는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산을 지칭한다.
따라서, 본 발명에서 재조합 헤르페스 바이러스의 하나 이상의 리간드의 표적 분자로의 리타겟팅은 gD의 천연 수용체로부터의 재조합 헤르페스 바이러스의 디타겟팅과 효과적으로 조합될 수 있어, 증식 및 생산에 유용한 세포와 질병 세포를 효과적으로 감염시키고 사멸시키는 재조합 헤르페스 바이러스를 생성시킨다.
상기에 대한 대안으로서, 이종 펩티드 리간드는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있다. 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 것으로 본원에 정의되는 이종 폴리펩티드 리간드와의 가능한 조합에서, 두 리간드 모두 재조합 헤르페스 바이러스를 동일하거나 상이한 질병 세포 상에 존재하는 하나 이상의 표적 분자(들) 위의 하나 이상의 결합 부위(들)로 표적화시키는데 유용할 수 있다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 적어도 두 개의 리간드, 예컨대 2개, 3개 또는 4개의 리간드, 바람직하게는 2개의 리간드를 포함하며, 이는 gD에 융합되거나 삽입된다. 표적 세포는 증식 및 생산에 유용한 것을 포함하거나, 또는 표적 세포는 증식 및 생산에 유용한 것과 질병 세포인 것을 포함하거나, 또는 표적 세포는 질병 세포인 것을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드, gD 및 세포는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 적어도 두 개의 리간드, 예컨대 2개, 3개 또는 4개의 리간드, 바람직하게는 2개의 리간드를 포함하며, 여기에서 하나의 리간드는 HVEM 결합 부위에 삽입된다. 바람직하게는, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 적어도 두 개의 리간드, 예컨대 2개, 3개 또는 4개의 리간드, 바람직하게는 2개의 리간드를 포함하며, 여기에서 하나의 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 6 및 34, 바람직하게는 아미노산 24 내지 25 사이에 삽입된다. 표적 세포는 증식 및 생산에 유용한 것을 포함하거나, 또는 표적 세포는 증식 및 생산에 유용한 것과 질병 세포인 것을 포함하거나, 또는 표적 세포는 질병 세포인 것을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드, gD 및 세포는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋의 결실, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실을 포함한다. 헤르페스 바이러스 및 gD는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실, 및 HVEM 결합 부위에, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 6과 34 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25 사이에 리간드의 삽입을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드 및 gD는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실 및 결실된 아미노산 대신 리간드의 삽입을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드 및 gD는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실, 및 HVEM 결합 부위에 리간드의 삽입, 및 결실된 아미노산 대신 리간드의 삽입을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드 및 gD는 본원에 정의된 바와 같다.
상기 이외에도, 헤르페스 바이러스는 매우 일반적인 방식으로 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실, 및 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 24 내지 25 사이에 리간드의 삽입, 및 결실된 아미노산 대신 리간드의 삽입을 포함한다. 헤르페스 바이러스, 리간드 및 gD는 본원에 정의된 바와 같다.
당단백질 D(gD)는 단순포진 바이러스가 숙주 세포에 들어가는데 필수적인 55 kDa의 비리온 외피 당단백질이며, 헤르페스 바이러스 감염성에 필수적인 역할을 한다. 세포 내로 단순포진 바이러스가 들어갈 때, 이종 이량체 gH/gL과 gD의 상호작용은 세포 내로의 헤르페스 바이러스의 진입에 관여하는 4개의 당단백질 gD, gH, gL 및 gB를 포함하는 활성화 캐스케이드에서 중요한 사건(event)이다. 활성화 캐스케이드는 gD가 수용체 중 하나인 nectin-1, HVEM 및 변형된 헤파란 황산에 결합하여 시작되고, gH/gL로 전달되고, 마지막으로 gB로 전달된다. gB는 표적 세포막과 헤르페스 바이러스의 융합을 수행한다. 이종 이량체 gH/gL은 gD의 프로퓨전 도메인(profusion domain)과 상호작용하며, 프로퓨전 도메인은 세포 진입 동안 gD의 수용체 중 하나와 gD의 상호작용 시 제거된다(dislodged). gD는 헤르페스 바이러스가 그것의 천연 수용체로 표적화되는 원인이 되는 어떤 특정 영역을 포함한다. 이것들은 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여, 아미노산 7 내지 32 사이에 위치하는 HVEM-1 결합 부위 및 보다 광범위하고 불연속적이며 아미노산 36과 39, 132-134 및 213 내지 223 사이의 3개의 영역에 주로 위치하는 중요한 잔기를 포함하는 nectin-1 결합 부위이다. 상이한 단순포진 바이러스-1과 단순포진 바이러스-2 균주 및 임상적 분리 균주(isolate)뿐만 아니라 동물 오르소로그의 다양한 gD의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 당업계에 공지되어 있다. 단지 예시적인 목적으로, 이에 제한되지 않고, 서열번호 1로서 본원에 개시된 인간 헤르페스 바이러스 1의 gD의 아미노산 서열을 참조한다. 전구체 gD의 상응하는 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열은 미국 국립생물공학정보센터(National Centre for Biotechnology Information(NCBI); National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank 등록 번호(accession number) GU734771.1의 좌표 138281 내지 139465로부터 입수 가능하다.
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서열번호 1
gD 상동체(homolog)는 헤르페스 바이러스과(Herpesviridae)의 알파 서브패밀리의 일부 구성원(member)에서 발견되었다. 따라서 본원에 언급된 용어 "당단백질 D"는 헤르페스 바이러스과의 gD-암호화 구성원(gD-encoding member)에서 발견되는 임의의 gD 상동체를 말한다. 대안적으로, 본원에 언급된 gD는 서열번호 1의 서열과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동일성(identity)을 가지는 임의의 gD를 말한다. 대안적으로, 본원에 언급된 gD는 서열번호 1과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성(homology)을 가지는 임의의 gD를 말한다. 본원에 언급된 gD는 또한 gD의 단편을 포함한다. 바람직하게는, 헤르페스 바이러스과에서 발견되는 임의의 gD, 상기 정의된 바와 같이 서열번호 1의 서열에 대해 아미노산 동일성을 가지는 임의의 gD, 및 gD의 임의의 단편을 포함하는 본원에 언급된 gD는 서열번호 1에 따른 gD와 동일한 활성을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 바이러스의 세포 내로의 진입 과정 동안, gD는 그것의 수용체 중 하나에 결합하고, 그것에 의하여 여전히 더욱 바람직하게는 gH/gL 이종 이량체와 상호작용하며, 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 프로퓨전 도메인을 제거한다.
본원에 사용된 "서열 동일성"의 백분율은 두 개의 최적으로 정렬된(aligned) 서열에서 상응하는 위치에서의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 이는 비교 창(comparison window)에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기에서 비교 창의 아미노산 서열의 단편은 두 개의 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(reference sequence)인 서열번호 1(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(예를 들어, 갭(gap) 또는 오버행(overhang))을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창에서의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 1981년 Smith 및 Waterman의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, 1970년 Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 1988년 Pearson 및 Lipman의 유사도 검색 방법에 의해, 1993년 Karlin 및 Altschul에 의해 변경된 1990년 karlin 및 Altschul의 알고리즘에 의해, 또는 이들 알고리즘의 전산화된 실행(computerized implementation)(위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전자 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI에 있는 GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 검색(inspection)에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 갭 가중치(gap weight)에 대해 5.00의 디폴트값 및 갭 가중치 길이(gap weight length)에 대해 0.30이 사용된다.
본원에 사용된 "상동성 백분율"은 두 개의 최적으로 정렬된 서열에서 상응하는 위치에 상동인 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 두 서열 간의 "상동성 백분율"은 계산상 상동인 위치뿐만 아니라 동일한 위치 또한 고려된다는 사실을 제외하고는, "동일성 백분율"의 결정과 관련하여 상기 기술된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 정해진다. 두 개의 상동 아미노산은 두 개의 동일하거나 상동인 아미노산을 가진다. 상동 아미노산 잔기는 유사한 화학-물리적 특징을 가지며, 예를 들어 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 산성 아미노산(Glu, Asp), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Lie, Val), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 또는 짧은 곁사슬을 갖는 아미노산(Gly, Ala, Ser, Thr, Met)등 같은 그룹에 속하는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 상동 아미노산 사이의 치환은 단백질 표현형(phenotype)을 변화시키지 않는(보존적(conservative) 치환) 것으로 예측된다.
gD는 서열번호 1에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 경우, 서열번호 1에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 가지는 경우, 또는 서열번호 1에 따른 gD와 동일한 활성을 가지는 경우 "상동(homologous)"이거나 "상동체(homolog)"이다. 바람직하게는, "동일한 활성"은 gD가 세포 수용체에 결합하고, 더욱 바람직하게는 바이러스의 세포 내로의 진입 과정 동안, gD는 gH/gL 이종 이량체와 상호작용하며, 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 프로퓨전 도메인을 제거하게 된다. 상동체는 또한 상기 나타낸 바와 같은 활성을 가지는 전장(full length) gD의 단편일 수 있다.
상동 gD의 상응하는 영역은 Smith-Waterman 알고리즘과 다음의 정렬 파라미터: MATRIX: BLOSUM62, GAP OPEN: 10, GAP EXTEND: 0.5를 사용하는 경우에, 서열번호 1에 따른 gD의 주어진 영역과 정렬되는 gD의 영역이다. 이 알고리즘은 일반적으로 공지되어 있고, 쌍 단위(pairwise) 서열 비교를 수행하는 경우에 당업계에서 사용되며, 당업자들은 이를 적용하는 방법을 알고 있다. 서열번호 1의 주어진 영역의 일부 또는 일부들만이 상기 알고리즘과 파라미터를 이용하여 상동 gD의 서열과 정렬되는 경우, 용어 "상응하는 영역"은 서열번호 1의 주어진 영역의 일부(들)와 정렬되는 영역을 말한다. 이 경우, 리간드가 삽입되는 상동 gD 내의 영역은 서열번호 1의 주어진 영역의 일부(들)와 정렬되는 아미노산만을 포함한다. 용어 "상응하는 영역"은 또한 상응하는 인접(flanking) 서열에 의해 측면에 위치하는(flanked) 영역을 말하며, 여기에서 인접 서열은 상기 알고리즘과 파라미터를 이용하여 서열번호 1의 영역에 인접하는 서열로 정렬된다. 이들 인접 서열은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 아미노산 길이이다. 사용될 수 있는 또 다른 알고리즘은 1970년 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘, 1988년 Pearson 및 Lipman의 유사도 방법, 또는 1993년 Karlin 및 Altschul에 의해 변경된 1990년 kariln 및 Altschul의 알고리즘, 또는 이들 알고리즘의 전산화된 실행일 수 있다. 용어 "상응하는 아미노산"은 상응하는 영역 내에 존재하며, 정렬에서 서열번호 1의 주어진 아미노산의 대응부(counterpart)인 아미노산을 말한다. 상응하는 아미노산은 상응하는 영역 내에 존재하는 한, 정렬에서 서열번호 1에 있는 이의 대응부와 동일하지 않아야 한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 당단백질 D" 또는 "키메라 gD"는 gD 리간드(들)에 융합되거나 삽입되는 gD를 의미한다. 키메라 gD는 재조합 바이러스에 의해 암호화되고, 재조합 바이러스를 생산하는 세포를 이용하여 합성되며, 비리온의 외피에 통합된다. 유전공학에 의해 재조합 바이러스를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, BAC 기술을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 키메라 당단백질 D를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 gD(서열번호 2 내지 11로 예시됨)는 이종 펩티드 리간드와 아마도 이종 폴리펩티드 리간드를 가지며, 이에 의해 gD 부분(portion)이 야생형(wt) 바이러스에 대해 수행하는 활성에 더하여 바이러스에 새로운 활성이 부여된다. 일단 키메라 gD가 재조합 바이러스의 외피의 일부가 되면, 리간드(들)의 표적 분자(들)에 대한 재조합 바이러스의 결합이 가능해지고, 재조합 바이러스의 친화성을 리간드(들)의 표적 분자(들)를 가지는 세포(들)로 리타겟팅한다. 바람직하게는, 리간드(들)의 표적 분자(들)에 대한 결합 시, 키메라 gD는 gH/gL 이종 이량체와 상호작용하고, 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 프로퓨전 도메인이 제거되며, 여전히 더욱 바람직하게는 리간드의 표적 분자를 통해 재조합 헤르페스 바이러스가 세포 내로 들어간다. 리간드의 표적 분자를 가지는 세포와의 융합 후, 재조합 헤르페스 바이러스는 세포에 들어가고, 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염된 세포는 이종 펩티드 리간드(들)를 가지는 키메라 gD를 비롯한 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 단백질을 생산한다. 감염된 세포는 세포를 용해하여 죽이는 자손(progeny) 바이러스를 생산한다.
gD 내로의 리간드(들)의 삽입 부위에 따라, 천연 수용체(들)에 대한 재조합 헤르페스 바이러스의 표적화 특성은 유지될 수 있고, gD는 그것의 천연 수용체(들)에 결합하고 천연 수용체(들)를 통해 세포 진입을 매개하는 능력을 유지할 수 있다. 그러나 리간드(들)는 천연 수용체(들)에 대한 gD의 결합 능력이 감소되도록 하는 부위에서 gD에 삽입되는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 gD의 특정 아미노산의 번호(number) 또는 영역의 표시는 처음 25개의 아미노산을 포함하는 N-말단 신호 서열을 포함하는, 서열번호 1로 구성되는 gD의 "성숙(mature)" 형태를 나타낸다. gD의 "성숙" 형태는 성숙 gD의 아미노산 1에 상응하는 서열번호 1의 아미노산 26에서 시작하여, 성숙 gD의 아미노산 369에 상응하는 아미노산 394까지를 포함한다. 서열번호 1과 상이한 아미노산 서열을 갖는 gD 당단백질 또한 본 발명에 포함되므로, 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD와 관련된 특정 아미노산의 번호 또는 특정 아미노산 영역의 표시 또한 상동 gD의 아미노산의 번호 또는 영역을 의미하며, 이는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD의 각각의 아미노산의 번호 또는 영역에 상응한다. 아미노산 번호 6 내지 34; 24 내지 25; 35 내지 39; 214 내지 223; 또는 219 내지 223은 성숙 gD를 지칭하며, 본원에서 사용된 바와 같이 서열번호 1의 전구체 gD의 각각의 아미노산 번호 31 내지 59; 49 내지 50; 60 내지 64; 239 내지 248; 또는 244 내지 248에 상응한다. 용어 "서열번호 1로 구성되는 성숙 gD"는 서열번호 1의 아미노산 26 내지 394를 지칭하며, 성숙 gD의 아미노산 1 내지 369에 상응한다.
본원에서 사용된 용어 "리타겟팅(retargeting)"은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스가 헤르페스 바이러스 내로 도입된 리간드(들)에 의해 결합된 표적 분자를 표적으로 한다는 것을 의미한다. 그러나 재조합 헤르페스 바이러스는 여전히 gD의 천연 수용체를 표적으로 할 수 있다. 리타겟팅은 재조합 헤르페스 바이러스가 gD의 천연 수용체를 더 이상 표적으로 할 수 없음을 의미하는 "디타겟팅(detargeting)"과는 다르다.
본원에 언급된 용어 "재조합(recombinant)" 헤르페스 바이러스는 이종 펩티드(들) 또는 폴리펩티드를 암호화하는 추가의 핵산 서열을 포함하도록 유전자 재조합에 의해 유전적으로 조작된 헤르페스 바이러스를 말한다. 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sandri-Goldin et al., 2006을 참조). 그러나, 본 발명은 유전공학 방법에 한정되지 않는다. 또한, gD에 각각 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 헤르페스 바이러스를 생산하기 위하여 다른 방법도 사용될 수 있다.
본원에 언급된 용어 "헤르페스 바이러스"는 헤르페스 바이러스과의 이중-나선 DNA 바이러스의 구성원을 말하며, 이는 잠복성(latent) 또는 용균성(lytic) 감염을 일으킨다. 헤르페스 바이러스는 모두 그 게놈이 80 내지 200개의 유전자를 암호화하는 상대적으로 큰(약 100,000 내지 200,000 염기쌍), 이중 나선의 선형 DNA로 이루어지며, 그 자체가 바이러스 단백질과 바이러스 mRNA를 모두 함유하고 있는 표피(tegument)라 불리는 단백질 층과 외피(envelope)라 불리는 지질 이중층 막으로 싸여진, 캡시드(capsid)라 불리는 20면체(icosahedral) 단백질 케이지에 싸여있다는 점에서 공통의 구조를 공유한다. 이 전체 입자는 또한 비리온으로도 알려져 있다. 용어 "헤르페스 바이러스"는 또한 예를 들어, 실험실에서 변형된 헤르페스 바이러스와 같은 하나 이상의 돌연변이 된 유전자를 포함하는 돌연변이 된 헤르페스 바이러스과의 구성원을 말한다.
바람직한 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 단순포진 바이러스 1(Herpes Simplex Virus 1, HSV-1), 단순포진 바이러스 2(Herpes Simplex Virus 2, HSV-2), 돼지 알파-헤르페스 바이러스(swine alpha-herpesvirus), 가성광견병 바이러스(Pseudorabiesvirus, PRV), 침팬지 알파1 헤르페스 바이러스(Chimpanzee alpha1 herpesvirus, ChHV), 파핀 헤르페스 바이러스 2(Papiine herpesvirus 2, HVP2), 세르코피테신 헤르페스 바이러스 1(Cercopithecine herpesvirus 1, CeHV1), 세르코피테신 헤르페스 바이러스 2(Cercopithecine herpesvirus 2, CeHV2), 마카신 헤르페스 바이러스 1(Macacine herpesvirus 1, MHV1), 사이미린 헤르페스 바이러스 1(Saimiriine herpesvirus 1, HVS1), 소 헤르페스 바이러스 1(Bovine herpesvirus 1, BoHV-1), 소 헤르페스 바이러스 5(Bovine Herpesvirus 5, BoHV-5), 말 헤르페스 바이러스 1(Equine herpesvirus 1, EHV-1), 개 헤르페스 바이러스 1(Canine herpesvirus 1, CHV), 고양이 헤르페스 바이러스 1(Feline herpesvirus 1, FHV-1), 오리 장염 바이러스(Duck enteritis virus, DEV), 과일 박쥐 알파헤르페스 바이러스 1(Fruit bat alphaherpesvirus 1, FBAHV1), 소 헤르페스 바이러스 2(Bovine herpesvirus 2, BoHV-2), 토끼 헤르페스 바이러스 4(Leporid herpesvirus 4, LHV-4), 말 헤르페스 바이러스 3(Equine herpesvirus 3, EHV-3), 말 헤르페스 바이러스 4(Equine herpesvirus 4, EHV-4), 말 헤르페스 바이러스 8(Equine herpesvirus 8, EHV-8), 말 헤르페스 바이러스 9(Equid herpesvirus 9, EHV-9), 돼지 헤르페스 바이러스 1(Suid herpesvirus 1, SuHV-1), 마레크병 바이러스 혈청형 2(Marek's disease virus serotype 2, MDV2), 매 헤르페스 바이러스 타입 1(Falconid herpesvirus type 1, FaHV-1), 칠면조 헤르페스 바이러스 3(Gallid herpesvirus 3, GaHV-3), 칠면조 헤르페스 바이러스 2(Gallid herpesvirus 2, GaHV-2), 칠면조 헤르페스 바이러스 1(Gallid herpesvirus 1, GaHV-1), 앵무과 헤르페스 바이러스 1(Psittacid herpesvirus 1, PsHV-1) 또는 멜레아그리드 헤르페스 바이러스 1(Meleagrid herpesvirus 1, MeHV-1)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 헤르페스 바이러스는 HSV-1 또는 HSV-2이고, 가장 바람직하게는 HSV-1이다.
본원에서 사용된 용어 "이종"은 헤르페스 바이러스 게놈에 의해 암호화되지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 헤르페스 바이러스의 것들을 말한다. 바람직하게는, 용어 "이종"은 리간드의 표적 분자를 가지며 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염되는 세포에 결합하는 펩티드 리간드 또는 폴리펩티드 리간드를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 연속적이며 비분지된 펩티드 사슬이다. 본원에서 사용된 용어 "펩티드"는 5 내지 131개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 120개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 100개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 80개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 60개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 45개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 35개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산, 예컨대 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개 또는 29개의 아미노산, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 12 내지 20개의 아미노산으로 이루어지는 짧은 사슬이다. 최소 길이는 5개의 아미노산 잔기이다. 대안적으로, 최소 길이는 수용체에 대한 폴리펩티드의 에피토프 또는 결합 영역의 길이이다. 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 임의의 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드는 길이에 제한되지 않으며, 이로 인해 그 길이는 리간드가 의미하는 한 표적 분자에 결합할 수 있거나 또는 표적 분자가 의미하는 한 리간드에 결합할 수 있는 분자 또는 분자의 어셈블리(assembly)가 형성되는 한, 5개의 아미노산과 같은 몇 개의 아미노산 또는 수용체에 대한 에피토프 또는 결합 영역의 길이가 수백 개 또는 수천 개의 아미노산의 범위일 수 있다. 본 발명에서, 폴리펩티드는 리간드로서 또는 표적 분자로서 사용될 수 있다. 2 이상의 폴리펩티드 사슬이 항체와 같은 복합체에 조립될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 또한 폴리펩티드 사슬의 어셈블리(assembly)를 포함한다. "펩티드"와 "폴리펩티드" 간의 차이점은 펩티드는 상기 나타낸 바와 같이 짧은 길이를 가지며 단일 펩티드 사슬로 이루어지는 반면, 폴리펩티드는 임의의 길이일 수 있으며 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어질 수 있거나 또는 폴리펩티드 사슬의 어셈블리를 형성할 수 있다.
본원에서 언급된 리간드는 세포의 표면에 접근 가능한 표적 분자에 결합하거나 결합할 수 있다. 바람직하게는, 이는 세포의 표면에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있으며, 이에 의해 "특이적으로 결합(specifically bind)"이라는 용어는 리간드가 특정의 관심 표적 분자에는 결합하는 반면, 세포 상에 존재하는 다른 분자 또는 리간드가 유기체에서 접촉할 수 있는 다른 분자에는 상당한 양(10%, 5%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만)으로 결합하지 않았던 또는 결합하지 않는 결합 반응을 말한다. 일반적으로, 표적 분자에 "특이적으로 결합"하는 리간드는 그 표적 분자에 대해 약 105(예를 들어, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 또는 그 이상) 몰(mole)/리터(liter)보다 큰 평형 친화도 상수(equilibrium affinity constant)를 가질 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 바이러스가 세포와 융합하는 능력을 매개하므로, 더욱 바람직하게는 바이러스는 그 후 세포에 들어가고, 더욱 바람직하게는 세포를 사멸시킨다. 리간드는 인간에게 유해하지 않은 것으로 이해된다. 또한, 리간드는 헤르페스 바이러스 단백질이 아니거나, 또는 헤르페스 바이러스 단백질로부터 변형에 의해 유래되지 않는다. 본원에서 언급된 용어 "리간드"는 5 내지 131개의 아미노산 길이를 갖는 이종 펩티드 리간드뿐만 아니라 이종 폴리펩티드 리간드를 또한 지칭한다.
본 발명은 재조합 헤르페스 바이러스가 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 펩티드 리간드를 포함한다는 사실을 특징으로 한다. 펩티드 리간드는 131개의 아미노산 길이를 초과하지 않는 한, 세포에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드일 수 있다. 리간드는 수용체 분자와 같은 천연 표적 분자의 천연 리간드일 수 있고, 이는 세포에 접근 가능하다. 리간드는 인공 표적 분자에 결합하도록 선택된 천연 폴리펩티드이며, 이에 의해 표적 분자는 리간드에 결합할 수 있도록 설계된다. 천연 폴리펩티드는 임의의 유기체로부터, 바람직하게는 인간에 해롭지 않은 유기체로부터 유래 될 수 있다. 예를 들어, 천연 폴리펩티드는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로마이세스 속으로부터의 폴리펩티드와 같은 진균 또는 세균성 폴리펩티드이다. 펩티드 리간드는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 인공 폴리펩티드일 수 있다. 인공 폴리펩티드 리간드는 특정 표적 분자에 결합하도록 기능하는 비-자연적으로 발생한 아미노산 서열을 갖는다. 인공 폴리펩티드 리간드의 서열은 아미노산의 삽입, 결실, 치환 및/또는 부가를 포함하는, 변형된 천연 폴리펩티드로부터 유래 될 수 있고, 이에 의해 상응하는 천연 폴리펩티드의 결합 능력은 유지된다. 예를 들어, 리간드는 상응하는 전장 폴리펩티드가 결합하는 표적 분자에 결합할 수 있는 한, 상기 언급된 천연 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 대안적으로, 천연 폴리펩티드는 상응하는 천연 폴리펩티드에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하도록 변형되고, 이에 의해 변형된 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 것과 같은 상응하는 천연 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 여전히 대안적으로, 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 항체 유도체 또는 항체 모방체이다. 항체 유도체 또는 항체 모방체는 단일 특이적(mono-specific)(즉, 세포의 표면에 접근 가능한 하나의 표적 분자에 특이적임) 또는 예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적(예를 들어, Castoldi et al., 2013, Castoldi et al., 2012) 등의 다중 특이적(multi-specific)(즉, 동일 또는 상이한 세포의 표면상에 접근 가능한 하나 이상의 표적 분자에 특이적임)일 수 있다. 본 발명의 바람직한 펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 가장 바람직하게는 서열번호 12의 서열(GCN4 펩티드)이고, 이는 리간드에 결합할 수 있도록 설계되는 인공 표적 분자에 결합할 수 있다. 상기 인공 표적 분자는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하며 바이러스의 증식 및 생산에 사용된다.
GCN4 효모 전사 인자는 최신 기술(state of the art)(예를 들어, Arndt and Fin, 1986; Hope and Struhl, 1987을 참조)이다. 예시적인 GCN4 효모 전사 인자는 서열번호 15로 표시되는 유전자(GenBank 등록 번호 AJ585687.1)에 의해 암호화되는 서열번호 14로 표시되는 GCN4 효모 전사 인자(UniProtKB - P03069)이다. 본원에서 언급된 용어 "GCN4 효모 전사 인자(GCN4 yeast transcription factor)"는 자연에 존재하는 임의의 GCN4 효모 전사 인자를 말한다. 대안적으로, 본원에서 언급된 GCN4 효모 전사 인자는 서열번호 14의 서열에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동일성을 갖는 임의의 GCN4 효모 전사 인자를 말한다. 대안적으로, 본원에서 언급된 GCN4 효모 전사 인자는 서열번호 14에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 갖는 임의의 GCN4 효모 전사 인자를 말한다. GCN4 효모 전사 인자가 서열번호 14에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 경우, 서열번호 14에 대하여 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 아미노산 상동성을 갖는 경우, 또는 서열번호 14에 따른 GCN4 효모 전사 인자와 같은 동일한 활성을 갖는 경우, "상동"이거나 "상동체"이다. 바람직하게는, "동일한 활성"은 GCN4 효모 전사 인자가 서열번호 14에 따른 GCN4 효모 전사 인자와 같은 동일한 방식으로 전사 인자로서 작용한다는 의미로 이해될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "이의 일부"는 표적 분자가 생성될 수 있는 GCN4 효모 전사 인자의 "일부"가 결합할 수 있는 임의의 부분을 포함한다. 바람직하게는, "이의 일부"의 길이는 5 내지 131개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 120개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 100개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 80개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 60개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 45개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 35개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산, 예컨대 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개 또는 29개의 아미노산, 또는 여전히 더욱 바람직하게는 12 내지 20개의 아미노산 펩티드 길이인 것이고, 이에 의해 펩티드는 링커 서열과 같은 추가 서열을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, "이의 일부"의 길이는 12개의 아미노산이다. 가장 바람직한 "이의 일부"는 GCN4 효모 전사 인자(GCN4 에피토프)의 에피토프 YHLENEVARLKK(서열번호 13)이다. 에피토프 YHLENEVARLKK는 서열번호 18로 표시되는 scFv에 의해 인식되는 12개의 아미노산으로 이루어진다. gD에의 융합 또는 삽입을 위해, 에피토프 YHLENEVARLKK는 각 측면에 두 개의 인접 wt(야생형) GCN4 잔기와 하나(융합을 위한 것) 또는 두 개(삽입을 위한 것)의 GS 링커를 더 포함할 수 있다. 두 개의 GS 링커를 포함하는 이 구조물(construt)은 본원에서 GCN4 펩티드(서열번호 12)로 명명된다. 이 20개의 아미노산 펩티드는 헤르페스 바이러스에 "이의 일부"가 결합하는 표적 분자를 포함하는 세포주를 감염시키고 그 내부에서 복제되는 능력을 부여한다.
본 발명은 또한 재조합 헤르페스 바이러스가 선택적으로 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 포함한다는 사실을 특징으로 한다. 폴리펩티드 리간드는 질병 세포에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드 리간드는 수용체 분자와 같은 천연 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 리간드일 수 있고, 이는 질병 세포에 접근 가능하다. 이러한 리간드의 예는 사이토카인, 케모카인, 우로키나아제 플라스미노겐 활성물질(urokinase plasminogen activator, UPa), 면역 체크포인트 차단물질(blocker) 또는 성장 인자일 수 있다. 공지의 예는 EGF 및 IL13이다. 대안적으로, 리간드는 표적 분자에 결합하는 항체이다. 천연 폴리펩티드는 임의의 유기체로부터, 바람직하게는 인간에 해롭지 않은 유기체로부터 유래 될 수 있다. 폴리펩티드 리간드는 질병 세포에 접근 가능한 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 인공 폴리펩티드일 수 있다. 인공 폴리펩티드 리간드의 서열은 아미노산의 삽입, 결실, 치환 및/또는 부가를 포함하는 천연 폴리펩티드로부터 유래 될 수 있고, 이에 의해 상응하는 천연 폴리펩티드의 결합 능력은 유지된다. 예를 들어, 리간드는 그 일부가 상응하는 전장 폴리펩티드가 결합하는 표적 분자에 결합할 수 있는 한, 상기 언급된 천연 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 대안적으로, 천연 폴리펩티드는 상응하는 천연 폴리펩티드에 대하여 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하도록 변형되고, 이에 의해 변형된 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 것과 같은 상응하는 천연 폴리펩티드의 활성을 유지한다. 여전히 대안적으로, 폴리펩티드는 표적 분자에 결합하는 항체 유도체 또는 항체 모방체이다. 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체는 단일 특이적(즉, 세포의 표면에 접근 가능한 하나의 표적 분자에 특이적임) 또는 예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적(예를 들어, Castoldi et al., 2013, Castoldi et al., 2012) 등의 다중 특이적(즉, 동일 또는 상이한 세포의 표면상에 접근 가능한 하나 이상의 표적 분자에 특이적임)일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 리간드는 인공 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 항체 유도체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv이고, 이는 질병 세포, 바람직하게는 종양 세포, 더욱 바람직하게는 HER2를 발현하는 종양 세포, 예컨대 유방암(breast cancer) 세포, 난소암(ovary cancer) 세포, 위암(stomach cancer) 세포, 폐암(lung cancer) 세포, 두경부암(head and neck cancer) 세포, 골육종(osteosarcoma) 세포, 다형성 신경교모종(glioblastoma multiforme) 세포 또는 침샘 종양(salivary gland tumor) 세포 상의 천연 수용체에 결합할 수 있다. 여전히 더욱 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 HER2에 결합할 수 있는 scFv이다. 가장 바람직한 구현예에서, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 16으로 표시되는 scFv이다.
본원에서 언급된 용어 "항체 유도체"는 적어도 하나의 항체 가변 도메인을 포함하지만, 항체의 전체 구조를 포함하지 않는 분자를 말한다. 항체 유도체는 여전히 표적 분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체 유도체는 바이러스가 세포와 융합하는 능력을 매개하므로, 더욱 바람직하게는 바이러스는 그 후 세포에 들어가고, 여전히 더욱 바람직하게는 세포를 사멸시킨다. 상기 유도체는 Fab, Fab2, scFv, Fv와 같은 항체 단편, 또는 이들의 일부, 또는 기타 유도체, 또는 나노바디, 디아바디, 미니바디, 낙타과(camelid) 단일 도메인 항체, 단일 도메인 또는 Fab 단편, 가변 영역의 중쇄 및 경쇄의 도메인(예컨대, Fd, V람다(Vlambda)와 V카파(Vkappa)를 포함하는 VL, VH, VHH)뿐만 아니라 적어도 두 개의 구조적 루프(structural loop)에 의해 연결된 면역글로불린 도메인의 두 개의 베타-나선으로 이루어지는 미니 도메인과 같은 면역글로불린의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 항체 유도체는 단일 사슬 항체이고, 더욱 바람직하게는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질인 scFv는 짧은 링커 펩티드와 연결된다. VH의 N-말단은 VL의 C-말단과 연결되거나, 또는 VL의 N-말단은 VH의 C-말단과 연결된다.
본원에서 언급된 용어 "항체 모방체(antibody mimetic)"는 항체와 마찬가지로 항원과 특이적으로 결합할 수 있지만, 항체와 구조적으로 관련이 없는 유기 화합물을 말한다. 이는 주로 약 3 내지 20 kDa의 몰 질량(molar mass)을 갖는 인공 펩티드 또는 단백질이다. 이는 치료 또는 진단적 효과를 가질 수 있다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 애피바디(affibody), 애필린(affilin), 애피머(affimer), 애피틴(affitin), 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), DARPins, 피노머(fynomer), 쿠니츠 도메인 펩티드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 단백질 A의 Z 도메인, 감마 B 결정질(Gamma B crystalline), 유비퀴틴(ubiquitin), 시스타틴(cystatin), 술폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)로부터의 Sac7D, 리포칼린(ipocalin), 막 수용체의 도메인, 안키린 반복 모티브(ankyrin repeat motive), Fyn의 SH3 도메인, 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인, 피브로넥틴의 10th 타입 III 도메인, 합성 이형 2가 또는 이형 다가 리간드(synthetic heterobivalent or heteromultivalent ligands)(Josan et al., 2011, Xu et al., 2012, Shallal et al., 2014)이다.
본원에서 언급된 펩티드 링커는 폴리펩티드 내에서, 다른 공급원으로부터 유래된 폴리펩티드 서열을 연결하는 역할을 한다. 이러한 링커는 당단백질 D 서열과 이종 폴리펩티드 리간드를 연결하여 적절한 폴딩(folding)을 가능하게 하거나, 이종 폴리펩티드 리간드 내의 리간드 부분을 연결하는 역할을 한다. 이는 또한 리간드 서열을 gD 이외의 당단백질 서열과 연결하는 역할을 한다. 링커는 전형적으로 1 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 8개, 12개 또는 20개의 아미노산과 같은 8 내지 20개의 아미노산 사이의 길이를 가지며, 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이는 아미노산(들) Gly 및/또는 Ser 및/또는 Thr을 포함하고, 바람직하게는 이는 Gly, Ser 및/또는 Thr로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 이는 아미노산 Gly 및/또는 Ser로 이루어진다. Gly 및/또는 Ser에 기초한 링커는 유연성(flexibility), 우수한 용해성 및 단백질 분해(proteolysis)에 대한 저항성을 제공한다. 대안적으로, 링커는 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 가장 많이(predominantly) 포함하지 않을 수 있지만, 글리신, 세린 및/또는 트레오닌이 존재하지 않거나 또는 단지 작은 정도로만 존재할 수는 없다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에서, 리간드는 gD에 융합되거나 삽입될 수 있다. 이와 관련하여, 본원에서 언급된 용어 "융합된(fused)" 또는 "융합(fusion)"은 펩티드 링커를 통해 직접 또는 간접적으로 펩티드 결합에 의해 gD의 N-말단 또는 C-말단 아미노산에 대한 리간드의 첨가를 말한다. "융합된" 또는 "융합"이 gD의 말단에 대한 추가를 의미하는 반면 "삽입(insertion)"은 gD 내로의 통합(incorporation)을 의미하는 한, "융합된" 또는 "융합"은 "삽입"과는 다르다.
리간드가 gD 내로 삽입된다는 의미로 본원에서 언급된 용어 "삽입된" 또는 "삽입"은 gD 내로의 리간드의 통합을 말하며, 여기에서 통합된 리간드는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해, 더욱 상세하게는 삽입물(insert)에 대하여 상류(upstream) 및/또는 하류(downstream)에 위치된 펩티드 링커를 통해, 직접 또는 간접적으로 펩티드 결합에 의해 gD의 두 개의 아미노산 사이에 도입된다. 링커는 리간드에 직접적으로 연결된다. gD에 대한 리간드의 융합 또한 성숙 gD의 아미노산 1 바로 앞에 서열번호 1 또는 상동 gD로 예시되는 gB 전구체 내로의 리간드 서열의 삽입으로 볼 수 있으며; 이러한 삽입은 본원에서 융합으로 지칭된다. 융합되거나 삽입되는 리간드를 가지는 gD는 본원에서 키메라 gD로 지칭된다. 키메라 gD는 비리온 외피의 일부이다. "링커"의 정의는 상기 기술된 바와 같다.
용어 "아미노산 6과 34 사이에 삽입된" 또는 "아미노산 6과 34 사이의 삽입" 등은 리간드가 아미노산 6과 아미노산 34를 비롯한 두 개의 인접한 아미노산 사이에 삽입되는 것을 의미한다.
본원에서 언급된 용어 "이종 펩티드 리간드"는 2개, 3개 또는 4개의 리간드와 같은 하나 이상의 펩티드 리간드(들)를 포함한다. 이는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스가 "이종 펩티드 리간드"를 언급함으로써 하나의 이종 펩티드 리간드를 포함할 수 있거나, 또는 그러한 리간드 중 2개 이상, 예컨대 3개 또는 4개를 포함할 수 있음을 의미하며, 바람직하게는 재조합 헤르페스 바이러스는 하나 또는 두 개의 펩티드 리간드(들)를 포함한다. 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 동일한 세포 또는 상이한 세포 상에 존재할 수 있는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 리간드 중 하나는 세포 배양물에 존재하는 세포에 결합할 수 있고, 다른 리간드는 질병 세포 상에 존재하는 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 즉, 연속하여(successively) 상이한 부위 또는 동일한 부위 상의 gD 분자에 위치하는 하나의 gD에 융합되거나 또는 삽입될 수 있거나, 또는 리간드는 상이한 gD에 융합되거나 또는 삽입될 수 있다.
본원에서 언급된 용어 "이종 폴리펩티드 리간드"는 상기와 유사하게, 2개, 3개 또는 4개의 리간드와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 리간드(들)를 의미한다. 바람직하게는, 재조합 헤르페스 바이러스는 하나의 폴리펩티드 리간드를 포함한다. 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 동일한 세포 또는 상이한 세포 상에 존재할 수 있는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자에 결합할 수 있다. 하나 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 즉, 연속하여 상이한 부위 또는 동일한 부위 상의 gD 분자에 위치하는 하나의 gD에 융합되거나 또는 삽입될 수 있거나, 또는 리간드는 상이한 gD에 융합되거나 또는 삽입될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 하나의 펩티드 리간드 및 질병 세포에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 하나의 폴리펩티드 리간드를 포함한다.
상기와 유사하게, 본원에서 언급된 용어 "표적 분자"는 2개, 3개 또는 4개의 표적 분자와 같은 하나 이상의 표적 분자(들)를 포함한다. 결과적으로, 재조합 헤르페스 바이러스는 하나의 표적 분자에 결합할 수 있거나, 또는 동일하거나 상이한 세포 상에 존재할 수 있는 2개, 3개 또는 4개의 상이한 표적 분자와 같은 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 표적 분자는 세포의 표면에 접근 가능하며, 이종 펩티드 또는 폴리펩티드 리간드에 의해 결합 될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 표적 분자는 폴리펩티드, 당지질 또는 배당체(glycoside)와 같은 천연 분자일 수 있다. 예를 들어, 표적 분자는 단백질 수용체와 같은 수용체일 수 있다. 수용체는 리간드의 결합을 통해 외부로부터 화학 신호를 받아서 어떤 형태의 세포 반응을 일으키는, 세포막에 묻혀있는 분자이다. 대안적으로, 표적 분자는 세포의 표면에 존재하는, 효소, 수송물질 또는 이온 채널과 같은 약물 표적인 분자일 수 있다. 질병 세포에 대하여, 표적 분자는 하기 언급되는 바와 같은 특이적 또는 비정상적 방식으로 유기체의 질병 세포 상에 천연으로 존재한다. "특이적 방식(specific manner)"은 표적 분자가 질병 세포 상에서는 과발현되지만, 그것은 미미한 정도, 즉 정상 세포 상에서 발현되는 각각의 정상 세포 상에 통상적으로 존재하는 정도가 아니라는 의미로 이해될 수 있다. "비정상적 방식(abnormal manner)"은 표적 분자가 각각의 비 질병 세포의 각각의 분자와 비교하여, 돌연변이된 형태로 질병 세포 상에 존재한다는 의미로 이해될 수 있다. 따라서, 특이적으로 발현되거나 돌연변이된 표적 분자와 같은 표적 분자로 헤르페스 바이러스를 리타겟팅하는 것은 표적 분자를 가지지 않거나, 낮은 수준으로 표적 분자를 가지거나, 야생형(돌연변이되지 않은) 표적 분자를 가지는 세포와 비교하여, 표적 분자를 가지는 세포의 감염율 및 박멸율(eradication rate)이 높아진다. 질병 세포 상의 바람직한 표적 분자는 HER2 분자이다. 각각의 리간드는 바람직하게는 인공 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 항체 유도체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합할 수 있는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 scFv이다. 질병 세포의 표적화에 대하여 가장 바람직한 리간드/표적 분자 쌍은 서열번호 16/HER2 분자 쌍이다.
대안적으로, 표적 분자는 인공 분자일 수 있다. 본원에서 언급된 용어 "인공 표적 분자"는 자연적으로 발생하지 않은, 즉 비천연 아미노산 서열을 가지는 분자이다. 이러한 인공 분자는 예를 들어, Douglas 등(Douglas et al., 1999); 및 Nakamura 등(Nakamura et al., 2005)에 기술되어 있는 것과 같이, 세포 표면상에 세포에 의해 발현되도록 제작될 수 있거나, 또는 세포 표면에 결합될 수 있다. 인공 표적 분자는 특정 리간드에 결합하는 기능을 하거나 또는 세포에 의해 비-자연적으로 발현되거나 또는 세포에 결합되는, 비-자연적으로 발생한 아미노산 서열을 갖는다. 인공 표적 분자는 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하기 위해 사용될 수 있는 세포 배양물에 존재하는 세포의 표면상에 존재할 수 있다. 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 바람직한 인공 표적 분자는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자이다. 각각의 리간드는 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 가장 바람직하게는 서열번호 12의 서열이다. 세포 배양물에 존재하는 세포의 표적화에 대하여 가장 바람직한 리간드/표적 분자 쌍은 서열번호 12/서열번호 18 쌍이다.
바람직한 구현예에서, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자는 종양 관련 수용체, 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII을 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원, 또는 MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CEA-CAM, Ep-CAM, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질, gp100, GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13R알파, UPAR, 테나신, PD-1, PD-L1, CTL-A4, TIM-3, LAG3, B7-H3, 또는 IDO를 포함하는 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드 GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1이고, 가장 바람직하게는 HER2이다. 바람직하게는, 표적 분자는 유방암 세포, 난소암 세포, 위암 세포, 폐암 세포, 두경부암 세포, 골육종 세포, 다형성 신경교모종 세포 또는 침샘 종양 세포와 같은 일부 종양 세포에 의해 과발현되지만, 비악성(non-malignant) 조직에서는 매우 낮은 수준으로 발현되는 HER2이다. 종양 관련 수용체는 특이적 또는 비정상적 방식으로 종양 세포에 의해 발현되는 수용체이다. 대안적으로, 표적 분자는 세포를 감염시키는 병원체(예를 들어, 바이러스, 세균 또는 기생충)와 같은 감염원(infectious agent)으로부터 유래되는 분자이다. 표적 분자는 감염된 세포(예컨대, HBV로부터의 HBsAg, HIV로부터의 gpl20, HCV로부터의 E1 또는 E2, EBV로부터의 LMP1 또는 LMP2)의 표면에서 발현된다. 병원체는 만성 감염성 질환과 같은 감염성 질환을 유발할 수 있다. 여전히 대안적으로, 표적 분자는 퇴행성 장애 관련 세포, 또는 CXCR2 또는 IL-1 수용체와 같은 노화세포에 의해 발현된다.
본원에서 언급된 용어 "세포"는 표적 분자를 가지며, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 임의의 세포이다. 세포는 원치 않으며 제거되어야 하는 세포, 예컨대 질병 세포와 같은 자연적으로 발생한 세포일 수 있다. 질병 세포의 예는 아래에 주어진다. 바람직한 질병 세포는 HER2를 포함하는 세포이다. 대안적으로, 세포는 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 역할을 하는 세포일 수 있다. 이러한 세포는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있고, 헤르페스 바이러스를 생산할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 인간에서 종양 세포와 같은 질병 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질의 도입을 피하기 위하여 질병 세포에서 헤르페스 바이러스의 증식은 피해야만 하므로, 헤르페스 바이러스를 생산하는 세포는 인간에 존재하는 경우 해를 끼치지 않는 세포, 예를 들어 비 질병 세포이다. 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하기 위해, 세포는 세포 배양물에 존재한다. 따라서, 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 역할을 하는 세포는 본원에서 "세포 배양물에 존재하는 세포"로 명명한다. 따라서, 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포일 수 있고, 바람직하게는 세포는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 세포주이다. 이러한 세포의 예는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이고, 바람직하게는 Vero 세포이다. 바람직하게는, 세포 배양물에 존재하는 세포는 상응하는 모(parent) 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않는 표적 분자를 발현하도록 변형되거나, 또는 세포 배양물에 존재하는 세포는 변형되어 그것의 표면상의 표적 분자와 결합한다. 더욱 바람직하게는, 세포는 항체 유도체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자를 표적 분자로서 포함한다.
"배양된" 세포는 당업계에 공지된 바와 같이, 유지되고 증식되는 시험관 내(in vitro) 세포 배양물에 존재하는 세포이다. 배양된 세포는 일반적으로 자연환경을 벗어난, 제어된 조건하에서 성장된다. 일반적으로, 배양된 세포는 다세포 진핵생물, 특히 동물 세포에서 유래된다. "헤르페스 바이러스의 성장을 위해 승인된 세포주"는 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포주, 즉 바이러스가 세포에 들어가 바이러스를 증식시키고 생산할 수 있는 것으로 이미 밝혀진 임의의 세포주를 포함하는 것을 의미한다. 세포주는 단일 세포에서 유래된 세포의 집단이며, 동일한 유전적 구성을 포함한다. 재조합 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 위한 바람직한 세포는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이다.
본원에서 사용된 용어 "질병 세포"는 유기체에 부정적인 영향을 미치기 때문에 원하지 않는 세포를 말한다. 이러한 세포의 박멸은 그것의 사멸이 생명을 살리거나 유기체의 건강을 증진시키기 때문에 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 질병 세포는 비정상적인 성장을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 세포는 종양 세포이다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 세포는 만성 감염 세포, 퇴행성 장애관련 세포 또는 노화 세포와 같은 감염된 세포이다.
종양 세포의 경우, 기저(underlying) 질병은 종양이며, 바람직하게는 부신암(adrenal cancer), 항문암(anal cancer), 담도암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌/CNS 종양(brain/CNS tumor), 유방암, 원발부위 불명암(cancer of unknown primary treatment), 캐슬맨병(Castleman disease), 자궁경부암(cervical cancer), 결장/직장암(colon/rectum cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 식도암(esophagus cancer), 유잉 육종계열 종양(ewing family of tumors), 안암(eye cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 위장관 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor, gist), 임신성 융모 질환(gestational trophoblastic disease), 호지킨병(Hodgkin disease), 카포시 육종(Kaposi sarcoma), 신장암(kidney cancer), 후두 및 하인두암(laryngeal and hypopharyngeal cancer), 백혈병(leukemia), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 피부의 림프종, 악성 중피종(malignant mesothelioma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 비강 및 부비동암(nasal cavity and paranasal sinus cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 신경모세포종(neuroblastoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 구강 및 구인두암(oral cavity and oropharyngeal cancer), 골육종, 난소암, 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 뇌하수체 종양(pituitary tumor), 전립선암(prostate cancer), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 침샘암, 육종 - 성인 연조직암(adult soft tissue cancer), 피부암(skin cancer), 소장암(small intestine cancer), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 자궁육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldnstrom macroglobulinemia) 및 윌름스 종양(Wilms tumor)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 종양 질병은 HER2-양성 암(유방암, 난소암, 위암, 폐암, 두경부암, 골육종 및 다형성 신경교모종 등), EGFR-음성 암(두경부암, 다형성 신경교모종, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 유방암, 결장직장암 및 췌장암 등), EGFR-vIII-양성 암(다형성 신경교모종 등), PSMA-양성 암(전립선암 등), CD20+ 양성 림프종, 및 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 전형적 호지킨 림프종 및 면역력이 약화된(immunocompromised) 개체에서 발생하는 림프종(이식 후 및 HIV-관련 림프세포증식성 질환)과 같은 B-세포 림프세포증식성 질환(B-cell lymphoproliferative disorders), T-세포 림프세포증식성 질환, 혈관면역모세포 T-세포 림프종(angioimmunoblastic T-cell lymphoma), 결절외 비강형 자연 살해/T-세포 림프종(extranodal nasal type natural killer/T-cell lymphoma)이다.
감염된 세포의 경우, 기저 질병은 만성 감염 질병과 같은 감염 질병이며, 여기에서 감염원은 바이러스, 세균 또는 기생충일 수 있다. 예로는 폐결핵, 말라리아, 만성 바이러스성 간염(HBV, 간염 D 바이러스 및 HCV), 후천성 면역 결핍 증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS; 인간 면역결핍 바이러스인 HIV에 의해 유발됨), EBV 관련 질환 또는 HCMV 관련 질환이 있다.
퇴행성 장애 관련 세포의 경우, 기저 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 루게릭병(Lou Gehrig's Disease), 골관절염(osteoarthritis), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 샤리코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy), 당뇨병(diabete), 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 수전증(essential tremor), 프리히드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 원추각막(keratoconus), 구상각막(keratoglobus), 황반변성(macular degeneration), 마르팡 증후군(Marfan's syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 근위축증(muscular dystrophy), 니만 픽병(Niemann Pick disease), 골다공증(osteoporosis), 파킨슨병(Parkinson's Disease), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy), 전립선염(prostatitis), 망막색소 변성증(retinitis pigmentosa), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 또는 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있다. "퇴행성 장애 관련 세포"라는 용어는 장애와 관련이 있는 세포를 말하며, 세포의 변화(alteration)가 질병의 발병에 기여하거나 또는 세포가 질병의 결과로 변경된다는 것을 의미한다. 세포를 파괴하면 질병이 치료된다.
노화 세포의 경우, 기저 질병은 (i) 조기 노화(pre-mature aging)를 특징으로 하는 조로증(progeroid syndromes)이라고 불리는 희귀 유전 질환: 워너 증후군(Werner syndrome, WS), 블룸 증후군(Bloom syndrome, BS), 로트문드-톰슨 증후군(Rothmund-Thomson syndrome, RTS), 코케인 증후군(Cockayne syndrome, CS), 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum, XP), 털유황이상증(trichothiodystrophy) 또는 허친슨-길포드 조로증 증후군(Hutchinson-Gilford Progeria syndrome, HGPS), 또는 (ii) 비만(obesity), 2형 당뇨병(type 2 diabetes), 근손실증(sarcopenia), 골관절염, 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 만성 폐쇄성 폐질환, 백내장(cataract), 신경퇴행성 질병(neurodegenerative diseases), 전신성 자가면역 질병(systemic autoimmune diseases)(전신홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염 또는 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)) 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 통상적인 나이 관련 질환과 같은 노화 관련 질환이다.
리간드(들)와 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 gD의 융합은 헤르페스 바이러스를 각각의 표적 분자(들)를 가지는 세포(들)로 리타겟팅하게 한다. 게다가, 재조합 헤르페스 바이러스는 gD의 천연 수용체로부터 재조합 헤르페스 바이러스를 디타겟팅하기 위한 추가의 변형을 포함할 수 있다. 디타겟팅에 의하여, gD의 천연 수용체(들)를 포함하지만 정상 체세포와 같은 리간드(들)의 표적 분자(들)는 포함하지 않는 세포를 감염시키는 재조합 헤르페스 바이러스의 능력은 감소된다. 디타겟팅은 천연 수용체(들)인 HVEM 및/또는 nectin-1에 대하여 gD의 결합 부위(들)를 불활성화시킴으로써 얻어진다. HVEM 결합 부위의 불활성화는 HVEM으로부터의 디타겟팅을 초래하는 반면, nectin-1의 표적화는 유지된다. nectin-1 결합 부위의 불활성화는 nectin-1으로부터의 디타겟팅을 초래하는 반면, HVEM의 표적화는 유지된다. HVEM과 nectin-1 결합 부위 양쪽 모두의 불활성화는 gD의 천연 수용체로부터, 따라서 이들 수용체를 가지지만 정상 체세포와 같은 리간드(들)의 표적 분자를 가지지 않는 임의의 세포로부터의 디타겟팅을 초래한다. HVEM 결합 부위의 불활성화는 nectin-1과의 상호작용에도 중요한 일부 잔기를 동시에 제거하는 아미노산 잔기 6 내지 38의 결실(Menotti et al., 2008)로 예시되는 바와 같은 HVEM 결합 부위로부터의 서열의 결실, 또는 IL-3 또는 아미노산 잔기 24와 25 사이의 HER2에 대한 scFv의 삽입으로 예시되는 바와 같은 HVEM 결합 부위로의 성분의 포함(Xhou and Roizman, 2005; Menotti et al., 2008)을 비롯하여, 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 포함된 바와 같이, HVEM 결합 부위의 불활성화는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 6과 34 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25 사이에 본원에 정의된 바와 같은 리간드의 삽입에 의해 수행된다. HVEM 결합 부위의 불활성화에 대안적으로 또는 이에 더하여, nectin-1 결합 부위의 불활성화가 수행될 수 있다. nectin-1 결합 부위의 불활성화는 nectin-1과의 상호작용에도 중요한 일부 잔기를 동시에 제거하는 아미노산 잔기 6 내지 38의 결실(Menotti et al., 2008)로 예시되는 바와 같은 nectin-1 결합 부위로부터의 서열의 결실, 또는 nectin-1, Y38C와의 상호작용에 중요한 gD에서의 중요 아미노산 잔기의 돌연변이(Uchida et al., 2013)를 비롯하여, 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, nectin-1 결합 부위의 불활성화는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223의 결실에 의해 수행된다. 더욱 바람직하게는, nectin-1 결합 부위의 불활성화는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신, 본원에 정의된 바와 같은 리간드의 삽입에 의해 수행된다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 gD에 삽입되는 적어도 두 개의 리간드, 예컨대 2개, 3개 또는 4개의 리간드, 바람직하게는 2개의 리간드를 포함하며, 여기에서 리간드 중 하나는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 리간드 중 하나는 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 삽입된다. 여전히 더욱 바람직하게는, 하나의 리간드는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부, 가장 바람직하게는 서열번호 12의 서열(GCN4 펩티드)이고, 다른 리간드는 항체 유도체, 바람직하게는 scFv이며, 이는 질병 세포, 바람직하게는 종양 세포, 더욱 바람직하게는 HER2를 발현하는 종양 세포 상의 천연 수용체에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합할 수 있는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 scFv이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 서열번호 12 및 서열번호 16의 두 개의 리간드를 포함하며, 이에 의해 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 서열번호 12는 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 서열번호 16은 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 삽입되거나, 또는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 서열번호 16은 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 서열번호 12는 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 삽입된다.
본원에서 사용된 "불활성화"는 세포에 접근 가능한 천연 수용체(들)에 대한 gD의 결합의 원인이 되는 특정 영역(들)이, 결합 능력이 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%로 감소되어 헤르페스 바이러스가 세포에 들어가 세포를 죽이는 것에 대하여 부분적 또는 완전한 손실을 초래하는 방식으로 변형되는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 제거된(substantially ablated)"은 결합 능력이 예컨대, 적어도 95%, 97%, 99% 또는 100%로 감소되는 것을 의미한다.
"아미노산 35 내지 39" 또는 "아미노산 214 내지 223"이라는 용어는 각각 아미노산 35, 36, 37, 38 및 39로 이루어지는 영역 또는 아미노산 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 및 223으로 이루어지는 영역을 의미한다. "이의 서브셋"이라는 용어는 아미노산 35 내지 39로 이루어지는 영역으로부터 하나의 아미노산 또는 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개, 4개의 인접한 아미노산, 또는 아미노산 214 내지 223으로 이루어지는 영역으로부터 하나의 아미노산 또는 적어도 2개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 인접한 아미노산을 의미한다. 따라서, "이의 서브셋"은 아미노산 35, 36, 37, 38, 39, 35 내지 38, 35 내지 37, 35 내지 36, 36 내지 39, 36 내지 38, 36 내지 37, 37 내지 39, 37 내지 38 또는 38 내지 39를 의미할 수 있다. "이의 서브셋"은 아미노산 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 214 내지 215, 214 내지 216, 214 내지 217, 214 내지 218, 214 내지 219, 214 내지 220, 214 내지 221, 214 내지 222, 215 내지 216, 215 내지 217, 215 내지 218, 215 내지 219, 215 내지 220, 215 내지 221, 215 내지 222, 215 내지 223, 216 내지 217, 216 내지 218, 216 내지 219, 216 내지 220, 216 내지 221, 216 내지 222, 216 내지 223, 217 내지 218, 217 내지 219, 217 내지 220, 217 내지 221, 217 내지 222, 217 내지 223, 218 내지 219, 218 내지 220, 218 내지 221, 218 내지 222, 218 내지 223, 219 내지 220, 219 내지 221, 219 내지 222, 219 내지 223, 220 내지 221, 220 내지 222, 220 내지 223 또는 221 내지 222를 의미할 수 있다. "서브셋"이라는 용어는 하나 이상의 서브셋, 예컨대 2개, 3개, 4개 또는 5개의 서브셋을 포함할 수 있다. 예를 들어, "서브셋"은 아미노산 214 및 아미노산 219 내지 223을 포함할 수 있고, 이는 아미노산 214 및 아미노산 219 내지 223을 포함하지 않는 gD를 생성한다. 본원에 정의된 바와 같이, 서브셋의 결실은 gD의 nectin-1 결합 부위를 불활성화시켜 본원에 정의된 바와 같은 nectin-1에 대한 gD의 결합 능력을 감소시킨다. 상기 번호는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산을 참조한다.
이의 구현예에서, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gD 외에, 변형된 gB 당단백질을 포함할 수 있다. 변형된 gB는 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드를 가질 수 있다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gD 외에, 변형된 gH 당단백질을 포함할 수 있다. 변형된 gH는 본원에 정의된 바와 같은 이종 폴리펩티드 리간드를 가질 수 있다. 변형된 gH 당단백질은 Gatta 등(Gatta et al., 2015)에 개시된 바와 같을 수 있으나, 이들 서술에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gD 외에, 변형된 gB 및 변형된 gH 당단백질을 포함할 수 있으나, 이들 서술에 한정되는 것은 아니다. gB 및/또는 gH의 변형(들)은 본원에 정의된 바와 같은 질병 세포에 대한 헤르페스 바이러스의 친화성을 다시 지시(readdressing)하는 역할을 한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 키메라 gD를 포함할 수 있지만, 변형된 gB는 포함하지 않을 수 있거나, 또는 변형된 gH는 포함하지 않을 수 있거나, 또는 변형된 gB 및 변형된 gH는 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 이종 폴리펩티드 리간드와 같은 이종 폴리펩티드가 융합되거나 삽입되도록 변형된 gB를 포함하지 않을 수 있다. 게다가, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 이종 폴리펩티드 리간드와 같은 이종 폴리펩티드가 융합되거나 삽입되도록 변형된 gH를 포함하지 않을 수 있다. 게다가, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 이종 폴리펩티드 리간드와 같은 이종 폴리펩티드가 융합되거나 삽입되도록 변형된 gB를 포함하지 않을 수 있고, 이종 폴리펩티드 리간드와 같은 이종 폴리펩티드가 융합되거나 삽입되도록 변형된 gH를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 또한 세포, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 암호화할 수 있다. 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 분자는 또한 "면역치료 분자(immunotherapy molecule)"로도 불린다. 따라서, 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 조합된 종양 용해성(oncolytic) 및 면역치료 바이러스일 수 있다. 면역치료 바이러스는 세포에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는, 즉 세포에 대하여 유도되도록 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 분자를 암호화하는 바이러스이다. 이러한 바이러스의 예는 T-VEC이다(Liu et al., 2003).
키메라 분자 gD 이외에, 면역치료 분자는 재조합 바이러스가 이종 펩티드 또는 폴리펩티드 리간드를 통한 세포의 특이적 표적화 및 사멸 외에, 특이적 또는 비특이적 방식으로 대상체의 면역계를 조절, 예를 들어 자극할 수 있게 한다. 대상체에서의 재조합 바이러스에 의한 면역치료 분자의 발현은 면역 반응을 유도할 수 있고, 결국 질병 세포를 죽인다. 면역치료요법은 특이적으로 작용할 수 있으며, 여기에서 면역치료 분자는 세포(들) 상에 존재하는 하나 또는 그 이상(one or some)의 특정 항원(들)에 대하여 대상체의 면역계를 조절, 예를 들어 자극한다. 예를 들어, 면역치료 분자는 특정 세포 표면 수용체, 예를 들어, CD20, CD274 및 CD279에 대한 항체일 수 있다. 일단 항원에 결합하면, 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)을 유도하거나, 보체 시스템을 활성화시키거나, 수용체가 이의 리간드와 상호작용하는 것을 방지할 수 있다. 이 모든 것이 세포 사멸로 이어질 수 있다. 바람직한 세포는 종양 세포이다. 이러한 기술은 당업계에 공지되고 승인되어 있다. 알렘투주맙(Alemtuzumab), 이필리뮤맙(Ipilimumab), 니보루맙(Nivolumab), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 리툭시맙(Rituximab)을 포함하는 암 치료에 승인된 여러 항체가 있다. 대안적으로, 면역치료 분자는 대상체의 면역계를 자극함으로써 비특이적으로 작용할 수 있다. 면역치료 분자의 예는 그 중에서도 특히 사이토카인, 케모카인 또는 면역 체크포인트 조절자이다. 예를 들어, 몇몇 사이토카인은 항종양 활성을 강화시키는 능력을 가지며, 수동적 암 치료제로서 사용될 수 있다. 면역치료 분자로서의 사이토카인의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 사이토카인의 예는 GM-CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-12 또는 인터페론-α이다. GM-CSF는 예를 들어, 호르몬 불응성 전립선암(hormone-refractory prostate cancer) 또는 백혈병의 치료에 사용된다. 인터류킨-2는 예를 들어, 악성 흑색종 및 신세포암(renal cell carcinoma)의 치료에 사용된다. IL-12는 교모세포종의 실험적 치료에 사용된다. 인터페론-α는 예를 들어, 모발성세포 백혈병(hairy-cell leukemia), AIDS 관련 카포시육종, 소포성 림프종(follicular lymphoma), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia) 및 악성 흑색종의 치료에 사용된다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 예를 들어, 바이러스 유전자 y134.5, UL39 및/또는 ICP47과 같은 바이러스의 독성을 약화시키는 것으로 알려져 있는 유전자의 결실 또는 변형에 의해 약독화될 수 있다. "약독화된(attenuated)"이라는 용어는 약화되거나(weakened) 또는 독성이 덜한 헤르페스 바이러스를 말한다. 조건부 약독화가 바람직하며, 여기에서 약독화는 비 질병 세포에만 영향을 미친다. 더욱 바람직하게는, 종양 세포와 같은 질병 세포만이 헤르페스 바이러스의 완전 독성(full virulence)에 의해 영향을 받는다. 조건부 약독화는 예를 들어, y134.5, UL39 및/또는 ICP47 유전자의 프로모터 영역을 질병 세포에서 독점적으로(exclusively) 발현되는 인간 유전자의 프로모터(예를 들어, 종양 세포에서의 서바이빈(survivin) 프로모터)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 조건부 약독화에 대한 추가적 변형은 ICP-4 프로모터 영역과 같은 IE 유전자(초기 발현 유전자(immediate early genes))의 전사를 담당하는 조절 영역을 질병 세포에서 독점적으로 발현되는 유전자의 프로모터 영역(예를 들어, 서바이빈 프로모터)으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변화는 질병 세포에서는 복제될 수 있지만 정상 세포에서는 복제될 수 없는 복제 조건부 HSV를 생성하게 할 것이다. 바이러스의 추가 변형에는 ICP4와 같은 필수 HSV 유전자의 3' 비번역 영역 내로 종양 세포가 아닌 정상 세포에 풍부하게 존재하는 마이크로 RNA(microRNA, miRs)에 반응하는 서열 요소의 삽입이 포함될 수 있다. 그 결과 정상 세포에서만 복제가 불가능한 바이러스가 다시 생길 것이다.
두 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스, 및 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함하는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 약제로서 사용될 수 있다. 약제의 생산을 위해, 헤르페스 바이러스는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스 및 원하는 특성을 제공하는 약학적으로 허용 가능한 담체와 같은 성분의 혼합물을 포함하는 약학적 투여 형태일 수 있다. 약학적 조성물은 당업계에 공지된 하나 이상의 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함할 수 있다. 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자(들)의 정의는 본 발명의 첫 번째 양상에서 언급된 바와 같다.
약학적 조성물은 전신, 비강, 비경구, 질, 국소, 질, 종양내 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 투여는 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여를 포함한다.
약학적 조성물은 캡슐, 정제, 알약, 파우더 및 과립과 같은 경구 투여를 위한 고체 투약 형태, 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제와 같은 경구 투여를 위한 액체 투약 형태, 예를 들어 멸균 주사용 수용액 또는 유성(oleaginous) 현탁액 등의 주사용 제제, 직장 또는 질 투여를 위한 조성물, 바람직하게는 좌약, 및 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치와 같은 국소 또는 경피 투여를 위한 투약 형태를 포함하는 다양한 투약 형태로 제형화 될 수 있다.
임의의 특정 대상체에 대한 구체적인 치료학적으로 유효한 투여 수준은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 활성, 투여 형태, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 치료 기간을 포함하는 다양한 인자 및 의학 분야에서 잘 알려진 것과 같은 인자에 의존할 것이다.
단일 또는 다중 용량으로 대상체에 투여되는 본 발명의 화합물의 총 투여량은 예를 들어, 103 내지 1010의 양일 수 있다. 단일 용량 조성물은 일일 용량을 구성하는 양 또는 그의 약수(submultiple)를 함유할 수 있다. 재조합 헤르페스 바이러스의 투여량은 플라크 형성 단위(plaque forming unit, pfu) 수로서 정의될 수 있다. 투여량의 예는 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 내지 1010을 포함한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 질병을 치료하는 역할을 하며, 이에 의해 질병 세포는 그 표면에 세포의 외부로부터 접근 가능한 특정 표적 분자를 발현하며, 표적 분자는 정상 세포에 의해 생산되지 않거나 정상 세포에 의해 낮은 정도로 생산된다. 정상 세포는 각각 정상 세포일 수 있다. "각각"은 질병 세포와 정상 세포는 같은 기원이지만, 질병을 유발하는 영향으로 인해 세포는 질병에 걸리게 되는 반면, 동일한 기원의 다른 세포는 건강을 유지한다.
세 번째 양상에서, 본 발명은 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 질병의 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자와 선택적으로 결합되는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 제공한다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스 및 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 분자는 동일한 약학적 조성물 또는 상이한 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다. 이들이 상이한 약학적 조성물에 존재하는 경우, 이들은 분자 전에 헤르페스 바이러스 또는 헤르페스 전에 분자 중 어느 쪽이든 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다. 헤르페스 바이러스 또는 분자는 상이한 빈도 및/또는 시점에서 투여될 수 있다. 그러나 병용 치료는 헤르페스 바이러스 및 분자가 질병의 동시 치료를 가능하게 하는 시간 간격 및/또는 시점에서 투여되는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 약학적 유효량의 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 투여함으로써 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하고, 예를 들어 자극하고/하거나 대상체의 특정 질병을 치료하는 역할을 하는 추가의 치료요법과 조합하여 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 추가의 치료는 다른 약물, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 조합된 바이러스요법 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화관련 장애의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 상기 정의된 바와 같은 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는, 예를 들어 자극하는 하나 이상의 분자(들)와 선택적으로 결합되는 본 발명의 헤르페스 바이러스의 용도를 개시한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 치료되는 대상체는 바람직하게는 인간이다.
네 번째 양상에서, 본 발명은 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 본 발명의 키메라 gD를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스의 게놈 또는 이의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 gD 당단백질의 신호 서열을 포함하는 키메라 gD의 전구체 형태를 암호화한다. 키메라 gD가 그것의 N-말단 아미노산에 융합된 리간드를 포함하도록 조작된 경우, 상응하는 핵산은 신호 서열의 마지막 아미노산과 성숙 단백질의 첫 번째 아미노산 사이에 삽입된 리간드의 핵산 서열을 갖는다.
다섯 번째 양상에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 플라스미드, 코스미드, 인공 크로모좀(예를 들어, 세균, 효모 또는 인간), 박테리오파지, 바이러스 벡터(레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스), 특히 바큘로바이러스 벡터, 또는 나노 공학적(nano-engineered) 물질(예를 들어, 오모실(ormosil))을 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 특히 하나 이상의 핵산 염기의 결실, 삽입 및/또는 돌연변이에 의해 변형되어, 그 독성이 바람직하게는 바이러스 벡터의 경우 약독화되거나, 질병 세포에서는 조건적으로 복제되지만 질병에 걸리지 않은 세포에서는 복제되지 않는 벡터이다. 예를 들어, γ134.5 유전자, UL39 유전자, ICP47 유전자 중 하나 또는 두 개의 카피의 결실은 바이러스의 약독화를 초래한다. 약독화 또는 약독화된은 약화되거나 독성이 덜한 바이러스를 말한다.
또한, 비 질병 세포에서 약독화된 표현형 및 질병 세포에서 비약독화된 표현형을 초래할, 질병 세포, 예를 들어 종양 세포에서 독점적으로 발현되는 인간 유전자의 프로모터(예를 들어, 종양 세포에서의 서바이빈 프로모터)로 γ134.5 유전자의 프로모터 영역을 치환하는 것이 포함된다. 추가의 변형은 ICP-4 프로모터 영역과 같은 IE 유전자의 전사를 담당하는 조절 영역을 질병 세포에서 독점적으로 발현되는 유전자의 프로모터(예를 들어, 서바이빈 프로모터)로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 변화는 질병 세포에서는 복제될 수 있지만 정상 세포에서는 복제될 수 없는 복제 조건부 헤르페스 바이러스를 생산할 것이다. 바이러스 자손의 증식을 위한 세포 배양 세포는 고수율의 바이러스 생산을 가능하게 하는 고수준의 특이적 프로모터 활성화 단백질을 제공할 것이다.
여섯 번째 양상에서, 본 발명은 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 키메라 gD를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일곱 번째 양상에서, 본 발명은 재조합 헤르페스 바이러스, 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 본 발명의 키메라 gD를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된 키메라 gD를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는, 세포는 세포 배양물의 세포이다. 적합한 세포 배양물 및 배양 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(Peterson and Goyal, 1988).
여덟 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포를 감염시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 목적은 대상체에서 원치 않는 세포를 감염시키고, 세포를 용해시켜 결국 세포를 죽이는 재조합 헤르페스 바이러스의 공급이다. 감염시키는 방법은 또한 세포 배양물에 존재하는 세포에서 재조합 헤르페스 바이러스의 성장을 돕는다. "감염(infecting)"은 바이러스가 세포막과 바이러스 표면 막의 융합을 통해 세포로 들어가서 바이러스 게놈과 같은 바이러스 성분이 세포 내로 방출되는 것을 의미한다. 바이러스로 세포를 감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 감염시킬 세포와 함께 바이러스를 배양하는 것이다(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988). "사멸(killing)"은 세포가 본 발명의 헤르페스 바이러스의 감염, 세포 내 바이러스 입자의 생산 및 최종적으로, 세포 용해에 의한 새로운 바이러스 입자의 방출로 인해 완전히 제거됨을 의미한다. 표면상에 리간드의 표적 분자를 가지고 있는 세포는 재조합 헤르페스 바이러스의 용균 효능을 시험하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 대상체, 예를 들어 종양 세포로부터 얻어진 질병 세포일 수 있다. 이 세포는 감염되어 재조합 헤르페스 바이러스에 의해 사멸된다. 성공적인 세포의 사멸은 대상체에서 종양 세포와 같은 세포를 제거하는 치료적 성공을 평가하기 위하여, 재조합 헤르페스 바이러스의 세포 특이성을 나타낸다. 추가 구현예에서, 비 질병 세포는 또한 동일한 대상체로부터, 또는 질병을 앓고 있지 않은 대조군 대상체, 즉 표면상에 리간드의 표적 분자를 가지고 있지 않은 또는 표적 분자를 낮은 정도로 가지고 있는 세포로부터 얻어질 수 있다. 이것에 의해, 비 질병 세포가 재조합 헤르페스 바이러스에 의한 감염에 취약한지 및/또는 어느 정도로 감염되었는지 여부를 시험할 수 있다. 다른 구현예에서, 비 질병 세포 및 질병 세포(예를 들어, 백혈병 세포와 같은 종양 세포)를 포함하는 세포 집단(예를 들어, 혈액과 같은 조직)에 포함되어 있는 질병 세포는 대상체로부터의 세포 집단의 분리(예를 들어, 백혈구성분 채집술(leukapheresis)) 후 사멸된다. 이는 특히 대상체 내로, 바람직하게는 세포 집단이 단리되는 동일한 대상체 내로의 세포 집단의 이식 후 동안, 질병 세포를 포함하지 않는 세포 집단, 예를 들어 백혈병 세포와 같은 질병 세포를 포함하지 않은 혈액을 얻을 수 있게 한다. 예를 들어 혈액과 백혈병의 경우, 이 방법은 종양 세포를 포함하지 않은 혈액의 재주입(re-infusion)을 돕는다. 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포를 사멸시키는 방법은 시험관 내(in-vitro) 또는 생체 내(in-vivo) 방법일 수 있다.
아홉 번째 양상에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스를 사용하여 세포 배양물에 존재하는 세포에서 재조합 헤르페스 바이러스를 생산하는 시험관 내 방법을 제공하며, 바람직하게는 여기에서 세포는 표적 분자로서 인공 분자를 발현하거나 이에 결합하며, 더욱 바람직하게는 표적 분자는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 구성되는 scFv, 가장 바람직하게는 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자를 포함한다.
본 발명의 재조합 헤르페스 바이러스는 인간에서 질병 세포를 감염시키고 사멸시키는 목적을 제공한다. 이는 헤르페스 바이러스의 제공과 그것의 증식 및 생산을 필요로 한다. 인간에서 종양 세포와 같은 질병 세포의 DNA, RNA 및/또는 단백질과 같은 물질의 도입을 피하기 위해 질병 세포에서 헤르페스 바이러스의 증식은 피해야 하므로, 재조합 헤르페스 바이러스는 비 질병 세포 또한 감염시킬 수 있도록 유전자 조작되어야 한다. 이는 재조합 헤르페스 바이러스의 사멸을 위한 질병 세포로의 리타겟팅 및 증식을 위한 비 질병 세포로의 리타겟팅을 필요로 한다. 따라서 본 발명의 아홉 번째 양상은 하나 초과, 예컨대 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게는 2개의 리간드를 갖는 재조합 헤르페스 바이러스의 gD의 변형을 포함한다.
결과적으로, 아홉 번째 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 gD 융합되거나 또는 삽입되는 이종 펩티드 리간드, 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 gD에 융합되거나 또는 삽입되는 추가의, 이종 펩티드 리간드 또는 이종 폴리펩티드 리간드, 바람직하게는 이종 폴리펩티드 리간드인 리간드를 포함한다.
세포에서 헤르페스 바이러스를 성장시키기 위한 적합한 기술 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988), 세포와 함께 헤르페스 바이러스를 배양하고, 감염된 세포 배양물의 배지로부터 헤르페스 바이러스를 회수하는 것을 포함한다. 재조합 헤르페스 바이러스가 생산되는 세포는 이종 펩티드 리간드를 통해 재조합 헤르페스 바이러스가 결합하는 표적 분자를 가진다. 바람직하게는, 표적 분자는 인공 표적 분자이다. 인공 표적 분자는 이종 펩티드 리간드에 결합하도록 특이적으로 제작된다. 반대로, 리간드는 인공 표적 분자에 결합하도록 특이적으로 선택되어 제작된다. 따라서, 표적 분자는 표적 세포에 의해 자연적으로 생성되지 않는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 바람직하게는 scFv일 수 있다. 이종 펩티드 리간드는 천연 폴리펩티드, 바람직하게는 진균 또는 세균 폴리펩티드, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애와 같은 사카로마이세스속으로부터의 폴리펩티드 또는 표적 분자에 결합할 수 있는 천연 폴리펩티드의 일부와 같은 인공 폴리펩티드일 수 있다. 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 임의의 배양된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 비 질병 세포이다. 세포는 세포주로서 존재할 수 있거나, 또는 단리된 세포일 수 있고, 바람직하게는 세포는 세포주로서 존재할 수 있다. 세포주는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 것일 수 있다. 적합한 세포주는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이고, 가장 바람직하게는 Vero 세포이다.
"배양된" 세포는 당업계에 공지된 바와 같이, 유지되고 증식되는 시험관 내 세포 배양물에 존재하는 세포이다. 배양된 세포는 일반적으로 자연환경을 벗어난 제어된 조건하에서 성장한다. 일반적으로, 배양된 세포는 다세포 진핵 생물, 특히 동물 세포로부터 유래된다. "헤르페스 바이러스의 성장을 위해 승인된 세포주"는 헤르페스 바이러스에 의해 감염될 수 있는 것으로 이미 밝혀진, 즉 바이러스가 세포에 들어가서 바이러스를 증식시키고 생산할 수 있는 임의의 세포주를 포함하는 것을 의미한다. 세포주는 단일 세포로부터 유래된 세포 집단으로, 동일한 유전적 구성을 함유한다. 재조합 헤르페스 바이러스의 증식 및 생산을 위한 바람직한 세포는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포이다.
시험관 내 방법의 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 펩티드 리간드에 결합할 수 있는 항체 유도체이다. 더욱 바람직하게는, 이종 펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자의 일부이고, 표적 분자는 리간드에 결합할 수 있는 항체 유도체이고, 세포는 표적 분자를 발현하도록 변형된 세포이다. 가장 바람직하게는, 이종 펩티드 리간드는 서열번호 12의 서열로 표시되는 분자이고, 표적 분자는 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자(scFv 서열과 인간 nectin-1 (PVRL1) 잔기 Met143 내지 Val517를 포함함)이고, 세포는 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자를 발현하도록 변형된 Vero 세포주이며, 여기에서 Vero-GCN4 세포주로 명명된다. 서열번호 19는 서열번호 18로 표시되는 scFv-GCN4-nectin-1 키메라를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 서열번호 17은 N-말단 리더 펩티드, HA 태그 서열, 짧은 GA 링커 및 scFv 서열을 포함하는 scFv에서 GCN4 펩티드까지의 아미노산 서열을 나타낸다.
Vero-GCN4R 세포주는 GCN4 펩티드에 대한 scFv인 인공 수용체를 발현한다. Vero-GCN4R 세포주는 암세포로 리타겟팅된 헤르페스 바이러스 재조합체(recombinant)의 배양을 가능하게 하는 데 도움이 된다. 인간 내로의 종양-유래 물질(DNA, RNA, 단백질)의 우발적인 도입 가능성을 피하기 위해, 사람에게 투여하는(human use) 종양 용해성 재조합 헤르페스 바이러스의 암세포에서의 성장 및 생산은 피해야 한다. 동시에, 헤르페스 바이러스는 질병 세포를 감염시킬 수 있어야 한다. 따라서 Vero-GCN4R 세포주 및 암세포-리타겟팅 헤르페스 바이러스가 제작되었다. Vero-GCN4R 세포주는 GCN4 펩티드에 대해 scFv로 만들어진 인공 수용체를 발현하고, nectin-1의 세포외 도메인 2 및 3, 막관통(TM) 및 C-꼬리에 융합된다. 암세포로 리타겟팅된 헤르페스 바이러스는 gD에서 GCN4 펩티드를 발현한다. 결과적으로, 재조합 헤르페스 바이러스는 암세포를 감염시키고 사멸시키기 위해 암세포에 대해, 그리고 바이러스의 성장 및 생산을 위한 Vero-GCN4R 세포주로 동시에 리타겟팅 된다.
아홉 번째 양상의 특히 바람직한 구현예에서, gD는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 펩티드 리간드를 포함하며, 이에 의해 리간드는 인공 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 천연 폴리펩티드의 일부, 및 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부 및 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 폴리펩티드 리간드를 포함하며, 이에 의해 폴리펩티드 리간드는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 및 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합할 수 있는 scFv일 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 재조합 헤르페스 바이러스는 서열번호 12로 표시되는 분자를 포함하는 키메라 gD 및 서열번호 16로 표시되는 scFv를 포함한다. 이러한 헤르페스 바이러스는 종양 세포를 사멸시키기 위해 종양 세포 상에 존재하는 HER2를 통해 종양 세포를 증식시키고 감염시기키 위해 서열번호 18의 서열로 표시되는 분자를 발현하는 Vero-GCN4R 세포주를 감염시킬 수 있다.
서열
서열번호 1: HSV-1 gD 야생형 전구체(인간 헤르페스 바이러스 1 균주 F, GenBank 등록 번호: GU734771.1; gD는 위치 138281 내지 139465에 의해 암호화됨)의 아미노산 서열.
서열번호 2: R-87의 scFv HER2인 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 3: 구조물(construct) R-87에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되고, 신호 서열(아미노산 1-25로 형성됨)의 절단 후, 성숙 gD의 아미노산 35 내지 39 대신 HER2 수용체에 대한 scFv가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치(flanked by)한다.
서열번호 4: R-39의 scFv HER2인 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 5: 구조물 R-89에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되고, 성숙 gD의 아미노산 214 내지 223 대신 HER2 수용체에 대한 scFv가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 6: R-97의 scFv HER2인 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 7: 구조물 R-97에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv가 삽입되고, 성숙 gD의 아미노산 35 내지 39 대신 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 8: R-99의 scFv HER2인 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 9: 구조물 R-99에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv가 삽입되고, 성숙 gD의 아미노산 214 내지 223 대신 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 10: R-99-2의 scFv HER2인 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 11: 구조물 R-99-2에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv가 삽입되고, 성숙 gD의 아미노산 219 내지 223 대신 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 12: GCN4 펩티드 - 브라케팅(bracketing) 상류 및 하류 GS 링커를 포함하는 GCN4 펩티드의 아미노산 서열. GCN4 에피토프는 YHLENEVARLKK (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/15811626/)이다.
서열번호 13: GCN4 에피토프
서열번호 14: GCN4 효모 전사 인자 UniProtKB - P03069의 아미노산 서열
서열번호 15: Genbank 등록 번호 AJ585687.1 (GCN4 효모 전자 인자를 암호화하는 유전자)
서열번호 16: 두 개의 링커 EN 및 SSGGGSGSGGS에 의해 개재된 scFv HER2 카세트(cassette)의 아미노산 서열.
서열번호 17: N-말단 리더 펩티드, HA 태그 서열, 짧은 GA 링커 및 scFv 서열을 포함하는, scFv 내지 GCN4 펩티드의 아미노산 서열
서열번호 18: 서열번호 19에 의해 암호화되는 아미노산 서열; N-말단 리더 펩티드, HA 태그 서열, 짧은 GA 링커, 아미노산 33에서 275까지의 scFv 서열, 짧은 GSGA 링커 및 인간 nectin-1(RVRL1) 잔기 Met143 내지 Val517을 포함하는 GCN4 펩티드에 결합할 수 있는 scFv의 아미노산 서열
서열번호 19: scFv-GCN4-nectin-1 키메라를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 20: 프라이머 gD24_galK_f
서열번호 21: 프라이머 gD25_galK_r
서열번호 22: 프라이머 galK_827_f
서열번호 23: 프라이머 galK_1142_r
서열번호 24: GCN4 펩티드 카세트 - 브라케팅 상류 및 하류 GS 링커(ggatcc and ggcagc)를 포함하는 GCN4 펩티드의 뉴클레오티드 서열
서열번호 25: 프라이머 gD24_GCN4_fB
서열번호 26: 프라이머 gD25_GCN4_rB
서열번호 27: R-81의 키메라 gD-GCN4의 뉴클레오티드 서열
서열번호 28: 구조물 R-81에 의해 암호화되는 바와 같이, 성숙 gD의 아미노산 24와 25 사이에 GCN4 펩티드가 삽입되어 있는 gD의 전구체(서열번호 1)의 아미노산 서열. GCN4 펩티드는 Ser-Gly 링커의 측면에 위치한다.
서열번호 29: 프라이머 gD_ext_f
서열번호 30: 프라이머 gD_ext_r
서열번호 31: 프라이머 galK_gD35_F
서열번호 32: 프라이머 galK_gD39_R
서열번호 33: scFv HER2 카세트의 뉴클레오티드 서열
서열번호 34: 프라이머 gD-34-scFvHER2-F
서열번호 35: 프라이머 gD-40-scFvHER2-R
서열번호 36: 프라이머 scFv_456_r
서열번호 37: 프라이머 galK_gD214_F
서열번호 38: 프라이머 galK_gD223_R
서열번호 39: 프라이머 gD213-scFvHER2f
서열번호 40: 프라이머 gD224-scFvHER2r
서열번호 41: 프라이머 gDintforw
서열번호 42: 프라이머 gD24-scFvHer2-F
서열번호 43: 프라이머 gD25-scFvHer2-R
서열번호 44: 프라이머 gD213-GCN4-F
서열번호 45: 프라이머 gD224-GCN4-R
서열번호 46: 프라이머 HSV_139688_r
서열번호 47: 프라이머 gD35-galK-F
서열번호 48: 프라이머 gD39-galK-R
서열번호 49: 프라이머 gD35-GCN4-F
서열번호 50: 프라이머 gD39-GCN4-R
서열번호 51: 프라이머 scFv4D5 651_f
서열번호 52: 프라이머 gDintrev
서열번호 53: 프라이머 gD219-GCN4-F
실시예
실시예 1. (i) gD의 AA 24와 25 사이에 삽입된 GCN4 펩티드(R-87 및 R-89), 또는 AA 35-39 대신 삽입된 GCN4 펩티드(R-97), 또는 AA 214-223 대신 삽입된 GCN4 펩티드(R-99), 또는 AA 219-223 대신 삽입된 GCN4 펩티드(R-99-2); (ii) AA 35-39를 포함하는 gD의 결실(R-87), AA 214-223을 포함하는 gD의 결실(R-89 및 R-99), AA 219-223을 포함하는 gD의 결실(R-99-2); (iii) HER2에 대한 scFv로의, AA 35-39 결실된 서열의 교체(R-87) 및 AA 214-223 결실된 서열의 교체(R-89); (iv) gD의 AA 24와 25 사이에 삽입된 HER2에 대한 scFv를 가지는 gD의 유전적으로 변형된 형태를 발현하는 HSV 재조합 R-87, R-89, R-97, R-99, R-99-2의 제작
A) R-87과 R-89의 조작에 대한 예비 단계로서, 본 발명자들은 HSV gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드가 삽입된 R-81을 제작하였다.
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49와 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드를 암호화하는 서열을 삽입한 후, AA 1-30을 포함하는 신호 서열을 절단하여 R-81을 조작하였다.
시작 게놈은 BAC LM55였고, 이는 HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 eGFP 서열을 가진다(Menotti et al., 2008). galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, gD에 GCN4 펩티드를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 gD24_galK_f CTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 20) 및 gD25_galK_r TGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 21)에 의해 gD에 대해 상동성 암(arm)을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC LM55 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹(streaked)하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 제한 분석(restriction analysis)에 의한 콜로니의 선별에 유용한 BamHI 엔도뉴클레아제에 대한 침묵 제한 부위(slient restriction site)를 도입하는, 프라이머 gD24_GCN4_fB CTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 25) 및 gD25_GCN4_rB TGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 26)의 어닐링 및 신장을 통해 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖고 gD에 대한 상동성 암에 의해 개재된 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 24, 서열번호 12를 암호화함)를 생성하였다. 재조합 게놈(서열번호 27)은 키메라 gD(서열번호 28)를 암호화하며, 이는 서열 GS와 함께 하나의 하류 Ser-Gly 링크와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제(excision)되고 선택 서열(sequence of choice)이 삽입된 재조합 클론인 GCN4 펩티드를 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gD_ext_f TCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(서열번호 29) 및 gD_ext_r GAGTTTGATACCAGACTGACCGTG(서열번호 30)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
B) R-87
HSV gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드의 삽입, AA 35-39의 결실, HER2 수용체에 대한 scFv로 교체
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49 및 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드를 암호화하는 서열의 삽입 후, AA 1-25를 포함하는 신호 서열의 절단, 및 AA 35-39의 결실을 scFv로의 교체에 의해 R-87(도 1)을 조작하였다.
시작 게놈은 BAC 81이었고, 이는 상기 기술한 바와 같이 HSV gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드, HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 EGFP 서열을 가진다. galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, gD △AA 35-39에 scFv를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 galK_gD35_F TGAAGAAGCTGGTGGGCAGCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 31) 및 galK_gD39_R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 32)에 의해 gD에 대해 상동성 암을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC 81 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gD-34-scFvHER2-F TGAAGAAGCTGGTGGGCAGCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCGAGAATTCCGATATCCAGAT(서열번호 34) 및 gD-40-scFvHER2-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATGGATCCACCGGAACCAGAGC(서열번호 35)에 의해, gD에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 scFv HER2 카세트(서열번호 33, 서열번호 16을 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(서열번호 2)은 키메라 gD(서열번호 3)를 암호화하며, 이는 위치 24 내지 25에 서열 GS 및 AA 35 내지 39 대신 HER2에 대한 scFv를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gD_ext_f TCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(서열번호 29) 및 scFv_456_r AGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(서열번호 36)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
재조합 바이러스 R-87을 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 Vero-GCN4R 세포주 및 SK-OV-3 세포주 내로 형질감염시킨 후, 이들 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gD를 서열 분석함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다. Vero-GCN4R 세포에서 바이러스 스톡(stock)을 생성시키고, Vero-GCN4R 및 SK-OV-3에서 적정하였다.
C) R-89
HSV gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드의 삽입, AA 214 내지 223의 결실, HER2 수용체에 대한 scFv로 교체
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49 및 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드를 암호화하는 서열의 삽입 후, AA 1-25를 포함하는 신호 서열의 절단, 및 AA 214-223의 결실의 HER2에 대한 scFv로의 교체에 의해 R-89(도 1)를 조작하였다.
시작 게놈은 BAC 81이었고, 이는 상기 기술한 바와 같이 HSV gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드, HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 EGFP 서열을 가진다. galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, gD △AA 214-223에 scFv를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 37) 및 galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 38)에 의해 gD에 대해 상동성 암을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC 81 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gD213-scFvHER2f CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCGAGAATTCCGATATCCAGAT(서열번호 39) 및 gD224-scFvHER2r CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGGATCCACCGGAACCAGAGC(서열번호 40)에 의해, gD에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 scFv HER2 카세트(서열번호 33, 서열번호 16을 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(서열번호 4)은 키메라 gD(서열번호 5)를 암호화하며, 이는 위치 24 내지 25에 서열 GS 및 AA 214 내지 223 대신 HER2에 대한 scFv를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gDintforw CCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(서열번호 41) 및 scFv_456_r AGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(서열번호 36)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
재조합 바이러스 R-89를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 Vero-GCN4R 세포주 및 SK-OV-3 세포주 내로 형질감염시킨 후, 이들 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gD를 서열 분석함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다. Vero-GCN4R 세포에서 바이러스 스톡을 생성시키고, Vero-GCN4R 및 SK-OV-3에서 적정하였다.
D) R-97
HSV gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv의 삽입, AA 35-39의 결실, GCN4 펩티드로의 교체
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49 및 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 ScFv를 암호화하는 서열의 삽입 후, AA 1-25를 포함하는 신호 서열의 절단, 및 AA 35-39의 결실의 GCN4 펩티드로의 교체에 의해 R-97(도 1)을 조작하였다.
시작 게놈은 BAC LM55였고, 이는 HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 eGFP 서열을 가진다(Menotti et al., 2008). galK 재조합에 의해 조작을 수행하였다. 간단하게는, gD에 scFv를 삽입하기 위하여, 프라이머 gD24-scFvHer2-F CTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCGAGAATTCCGATATCCAGATG(서열번호 42) 및 gD25-scFvHer2-R TGGATGTGGTACACGCGCCGGACCCCCGGAGGGTCGGTCAGCTGGTCCAGGGATCCACCGGAACCAGAGC(서열번호 43)에 의해 gD에 대해 상동성 암에 의해 개재된 scFv HER2 카세트(서열번호 33, 서열번호 16을 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(BAC 91)은 키메라 gD를 암호화하며, 이는 AA 24 내지 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gD_ext_f TCCATACCGACCACACCGACGAATCCC(서열번호 29) 및 scFv_456_r AGCTGCACAGGACAAACGGAGTGAGCCCCC(서열번호 36)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
그 후, gD △ AA 35-39에 GCN4 펩티드를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 gD35-galK-F GCTCTGGTTCCGGTgGaTCCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 47) 및 gD39-galK-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 48)에 의해 gD에 대해 상동성 암을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC 91 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gD35-GCN4-F GCTCTGGTTCCGGTgGaTCCCTGGACCAGCTGACCGACCCTCCGGGGGTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 49) 및 gD39-GCN4-R GTGATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCTGGTAGGCCCGCCTGGATGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 50)에 의해, gD에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 23, 서열번호 12를 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(서열번호 6)은 키메라 gD(서열번호 7)를 암호화하며, 이는 AA 24 내지 25 사이에 HER2에 대한 scFv 및 AA 35 내지 39 대신 서열 GS를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 scFv4D5 651_f GGACACTGCCGTCTATTATTGTAGCCGCT(서열번호 51) 및 프라이머 gDintrev CCAGTCGTTTATCTTCACGAGCCG(서열번호 52)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다. 재조합 바이러스 R-97을 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 Vero-GCN4R 세포주 및 SK-OV-3 세포주 내로 형질감염시킨 후, 이들 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gD를 서열 분석함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다.
E) R-99
HSV gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv의 삽입, AA 214-223의 결실, GCN4 펩티드로의 교체
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49 및 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 ScFv를 암호화하는 서열의 삽입 후, AA 1-25를 포함하는 신호 서열의 절단, 및 AA 214-223의 결실의 GCN4 펩티드로의 교체에 의해 R-99(도 1)를 조작하였다.
시작 게놈은 BAC 91이었고, 이는 gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv, HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 EGFP 서열을 가지며, 그것의 구조는 상기에 기술하였다. gD △ AA 214-223에 GCN4 펩티드를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 37) 및 galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 38)에 의해 gD에 대해 상동성 암을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC 91 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gD213-GCN4-F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC(서열번호 44) 및 gD224-GCN4-R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 45)에 의해, gD에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 24, 서열번호 12를 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(서열번호 8)은 키메라 gD(서열번호 9)를 암호화하며, 이는 AA 24 내지 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv 및 AA 214 내지 223 대신 서열 GS를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gDintforw CCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(서열번호 41) 및 HSV_139688_r CCGACTTATCGACTGTCCACCTTTCCC(서열번호 46)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
재조합 바이러스 R-99를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 Vero-GCN4R 세포주 및 SK-OV-3 세포주 내로 형질감염시킨 후, 이들 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gD를 서열 분석함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다. Vero-GCN4R 세포에서 바이러스 스톡을 생성시키고, Vero-GCN4R 및 SK-OV-3에서 적정하였다.
F) R-99-2
HSV gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv의 삽입, AA 219-223의 결실, GCN4 펩티드로의 교체
본 발명자들은 전구체 gD의 AA 49 및 50에 상응하는 성숙 gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 ScFv를 암호화하는 서열의 삽입 후, AA 1-25를 포함하는 신호 서열의 절단, 및 AA 219-223의 결실의 GCN4 펩티드로의 교체에 의해 R-99-2(도 1)를 조작하였다.
시작 게놈은 BAC 91이었고, 이는 gD의 AA 24와 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv, HSV-1 게놈의 UL3과 UL4 사이에 삽입된 LOX-P-개재된 pBeloBAC11과 EGFP 서열을 가지며, 그것의 구조는 상기에 기술하였다. gD △ AA 219-223에 GCN4 펩티드를 삽입하기 위하여, 주형으로서 pGalK를 이용하는 프라이머 galK_gD214_F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(서열번호 37) 및 galK_gD223_R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(서열번호 38)에 의해 gD에 대해 상동성 암을 갖는 galK 카세트를 증폭시켰다. 이 카세트를 BAC 91 BG를 가지는 SW102 세균에 전기천공시켰다. 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 갈락토오스, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(15 mM (NH4)2SO4, 100 mM KH2PO4, 1.8 μg FeSO4·H2O, pH7로 조정됨)를 포함하는 플레이트에서 galK 카세트를 가지는 재조합 클론을 선별하였다. galK 위양성 세균 클론을 제외하기 위하여, 이를 1% 갈락토오스와 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 MacConkey 한천기반 플레이트에 스트리킹하고, 프라이머 galK_827_f GCGTGATGTCACCATTGAAG(서열번호 22) 및 galK_1142_r TATTGTTCAGCGACAGCTTG(서열번호 23)를 이용하여 콜로니 PCR로 확인하였다. 다음으로, 프라이머 gD219-GCN4-F CCTACCAGCAGGGGGTGACGGTGGACAGCATCGGGATGCTGCCCCGCTTCATCCCCGAGAACCAGCGCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGG(서열번호 53) 및 gD224-GCN4-R CTCGTGTATGGGGCCTTGGGCCCGTGCCACCCGGCGATCTTCAAGCTGTAGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC(서열번호 45)에 의해, gD에 대한 상동성 암에 의해 개재되는 하류 Ser-Gly 링커와 상류 Ser-Gly 링커를 갖는 GCN4 펩티드 카세트(서열번호 24, 서열번호 12를 암호화함)를 증폭시켰다. 재조합 게놈(서열번호 10)은 키메라 gD(서열번호 11)를 암호화하며, 이는 AA 24 내지 25 사이에 HER2 수용체에 대한 scFv 및 AA 219 내지 223 대신 서열 GS를 갖는 하나의 하류 Ser-Gly 링커와 하나의 상류 Ser-Gly 링커를 포함하는 GCN4 펩티드를 가진다. galK 카세트가 절제되고 선택 서열이 삽입된 재조합 클론을 1 mg/L D-비오틴, 0.2% 데옥시-2-갈락토오스, 0.2% 글리세롤, 45 mg/L L-류신, 1 mM MgSO4·7H2O 및 12 μg/ml 클로람페니콜이 보충된 M63 배지(상기를 참조)를 포함하는 플레이트 상에서 선별하였다. 세균 콜로니를 프라이머 gDintforw CCCTACAACCTGACCATCGCTTGG(서열번호 41) 및 HSV_139688_r CCGACTTATCGACTGTCCACCTTTCCC(서열번호 46)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 선택 서열의 존재에 대해 확인하였다.
재조합 바이러스 R-99-2를 재구성시키기 위하여, 500 ng의 재조합 BAC DNA를 리포펙타민 2000(Life Technologies)으로 Vero-GCN4R 세포주 및 SK-OV-3 세포주 내로 형질감염시킨 후, 이들 세포에서 성장시켰다. 바이러스의 성장을 녹색 형광에 의해 관찰하였다. 전체 gD를 서열 분석함으로써 재조합체의 구조를 확인하였다.
실시예 2. Vero-GCN4R에 대한 그리고 HER-2 양성 SK-OV-3 및 J-HER2 세포에 대한 R-87의 이중 친화성(double tropism)
이전에 gD에서 scFv-HER2의 삽입은 재조합 바이러스 R-LM113에 HER2 수용체를 통해 세포로 들어가는 능력을 부여하며, R-LM113은 AA 6-38 사이에서의 gD 영역의 결실 때문에 천연 gD 수용체 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는 것으로 나타났다.
gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드를 삽입하면 R-87이 Vero-GCN4R 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Vero-GCN4R 세포주 및 비교를 위해 그것의 대응물(counterpart)인 wt-Vero를 사용하였다. R-87이 HER2 수용체를 통해 감염시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단독 수용체로서 HER2를 발현하는 J-HER2 세포, 및 HER2-양성 암세포인 SK-OV-3 세포를 사용하였다. R-87이 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지시된 수용체만을 발현하는 J-nectin-1과 J-HVEM을 사용하였다. SK-OV-3(도 2A) 또는 Vero-GCN4R(도 2B)에서 성장시킨 R-87로 세포를 감염시켰다. 지시된 대로, 허셉틴으로 불리는 HER2에 대한 MAb의 존재하에 28 μg/ml의 농도로 감염을 수행하였다. 1 PFU/세포로 감염을 수행하고, 24시간 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 2A 및 B에 나타낸 바와 같이, R-87은 Vero-GCN4R, J-HER2 및 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. R-87은 또한 이들 세포가 HER-2의 원숭이 오르소로그를 발현하는 것을 고려해 볼 때 예상된 바와 같이 wt-Vero 세포를 감염시켰다. J-HER2, SK-OV-3, wt-Vero의 감염은 허셉틴에 의해 억제되었으며, 이는 HER2를 통해 일어났음을 나타낸다. 그에 반해서, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 억제되지 않았으며, 이는 HER2를 통해서가 아니라 GCN4 펩티드를 통해서 일어났음을 나타낸다. 감염 패턴은 R-87이 SK-OV-3 세포 EH는 Vero-GCN4R 세포에서 자랐는지 여부와 구별될 수 없으므로, R-87의 감염 특이성은 어느 한 세포주 또는 다른 세포주에서 자란 것인지에 따라 변경되지 않았음을 명확하게 보여준다.
실시예 3: Vero-GCN4R에 대한 그리고 HER-2 양성 SK-OV-3 및 J-HER2 세포에 대한 R-89의 이중 친화성
gD의 AA 24와 25 사이에 GCN4 펩티드를 삽입하면 R-89가 Vero-GCN4R 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Vero-GCN4R 세포주 및 비교를 위해 그것의 대응물인 wt-Vero를 사용하였다. R-89가 HER2 수용체를 통해 감염시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단독 수용체로서 HER2를 발현하는 J-HER2 세포, 및 HER2-양성 암세포인 SK-OV-3 세포를 사용하였다. R-89가 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지시된 수용체만을 발현하는 J-nectin-1과 J-HVEM을 사용하였다. SK-OV-3(도 3A) 또는 Vero-GCN4R(도 3Bb)에서 성장시킨 R-89로 세포를 감염시켰다. 지시된 대로, 허셉틴으로 불리는 HER2에 대한 MAb의 존재하에 28 μg/ml의 농도로 감염을 수행하였다. 1 PFU/세포로 감염을 수행하고, 24시간 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 3A 및 B에 나타낸 바와 같이, R-89는 Vero-GCN4R, J-HER2 및 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. R-89는 wt-Vero 세포 및 J-HER2를 저조하게 감염시켰다. SK-OV-3, wt-Vero 및 J-HER2의 감염은 허셉틴에 의해 억제되었으며, 이는 HER2를 통해 일어났음을 나타낸다. 그에 반해서, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 억제되지 않았으며, 이는 HER2를 통해서가 아니라 GCN4 펩티드를 통해서 일어났음을 나타낸다. 감염 패턴은 R-89가 SK-OV-3 세포 EH는 Vero-GCN4R 세포에서 자랐는지 여부와 구별될 수 없으므로, R-89의 감염 특이성은 어느 한 세포주 또는 다른 세포주에서 자란 것인지에 따라 변경되지 않았음을 명확하게 보여준다.
실시예 4. Vero-GCN4R에 대한 그리고 HER-2 양성 SK-OV-3 및 J-HER2 세포에 대한 R-97의 이중 친화성
gD의 AA 35-39 대신 GCN4 펩티드를 삽입하면 R-97이 Vero-GCN4R 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Vero-GCN4R 세포주 및 비교를 위해 그것의 대응물인 wt-Vero를 사용하였다. R-97이 HER2 수용체를 통해 감염시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단독 수용체로서 HER2를 발현하는 J-HER2 세포, 및 HER2-양성 암세포인 SK-OV-3 세포를 사용하였다. R-97이 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지시된 수용체만을 발현하는 J-nectin-1과 J-HVEM을 사용하였다. SK-OV-3 세포에서 성장시킨 R-97로 세포를 감염시켰다. 지시된 대로, 허셉틴으로 불리는 HER2에 대한 MAb의 존재하에 28 μg/ml의 농도로 감염을 수행하였다. 1 PFU/세포로 감염을 수행하고, 24시간 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, R-97은 Vero-GCN4R, J-HER2 및 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. R-97은 또한 이들 세포가 HER-2의 원숭이 오르소로그를 발현하는 것을 고려해 볼 때 예상된 바와 같이 wt-Vero 세포를 감염시켰다. J-HER2, SK-OV-3, wt-Vero의 감염은 허셉틴에 의해 억제되었으며, 이는 HER2를 통해 일어났음을 나타낸다. 그에 반해서, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 억제되지 않았으며, 이는 HER2를 통해서가 아니라 GCN4 펩티드를 통해서 일어났음을 나타낸다.
실시예 5. Vero-GCN4R에 대한 그리고 HER-2 양성 SK-OV-3 및 J-HER2 세포에 대한 R-99의 이중 친화성
gD의 AA 214-223 대신 GCN4 펩티드를 삽입하면 R-99가 Vero-GCN4R 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Vero-GCN4R 세포주 및 비교를 위해 그것의 대응물인 wt-Vero를 사용하였다. R-99가 HER2 수용체를 통해 감염시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단독 수용체로서 HER2를 발현하는 J-HER2 세포, 및 HER2-양성 암세포인 SK-OV-3 세포를 사용하였다. R-99가 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지시된 수용체만을 발현하는 J-nectin-1과 J-HVEM을 사용하였다. SK-OV-3 세포에서 성장시킨 R-99로 세포를 감염시켰다. 지시된 대로, 허셉틴으로 불리는 HER2에 대한 MAb의 존재하에 28 μg/ml의 농도로 감염을 수행하였다. 1 PFU/세포로 감염을 수행하고, 24시간 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, R-99는 Vero-GCN4R, J-HER2 및 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. R-99는 또한 이들 세포가 HER-2의 원숭이 오르소로그를 발현하는 것을 고려해 볼 때 예상된 바와 같이 wt-Vero 세포를 감염시켰다. J-HER2, SK-OV-3, wt-Vero의 감염은 허셉틴에 의해 억제되었으며, 이는 HER2를 통해 일어났음을 나타낸다. 그에 반해서, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 억제되지 않았으며, 이는 HER2를 통해서가 아니라 GCN4 펩티드를 통해서 일어났음을 나타낸다.
실시예 6. Vero-GCN4R에 대한 그리고 HER-2 양성 SK-OV-3 및 J-HER2 세포에 대한 R-99-2의 이중 친화성
gD의 AA 219-223 대신 GCN4 펩티드를 삽입하면 R-99-2가 Vero-GCN4R 세포를 감염시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Vero-GCN4R 세포주 및 비교를 위해 그것의 대응물인 wt-Vero를 사용하였다. R-99-2가 HER2 수용체를 통해 감염시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단독 수용체로서 HER2를 발현하는 J-HER2 세포, 및 HER2-양성 암세포인 SK-OV-3 세포를 사용하였다. R-99-2가 nectin-1과 HVEM으로부터 디타겟팅되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 지시된 수용체만을 발현하는 J-nectin-1과 J-HVEM을 사용하였다. SK-OV-3 세포에서 성장시킨 R-99-2로 세포를 감염시켰다. 지시된 대로, 허셉틴으로 불리는 HER2에 대한 MAb의 존재하에 28 μg/ml의 농도로 감염을 수행하였다. 1 PFU/세포로 감염을 수행하고, 24시간 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, R-99-2는 Vero-GCN4R, J-HER2 및 SK-OV-3 세포를 감염시켰다. R-99-2는 또한 이들 세포가 HER-2의 원숭이 오르소로그를 발현하는 것을 고려해 볼 때 예상된 바와 같이 wt-Vero 세포를 감염시켰다. J-HER2, SK-OV-3, wt-Vero의 감염은 허셉틴에 의해 억제되었으며, 이는 HER2를 통해 일어났음을 나타낸다. 그에 반해서, Vero-GCN4R의 감염은 허셉틴에 의해 억제되지 않았으며, 이는 HER2를 통해서가 아니라 GCN4 펩티드를 통해서 일어났음을 나타낸다.
실시예 7. AA 6-38 사이에서의 결실 대신 gD에 HER2에 대한 scFv를 가지는 재조합 R-LM113의 복제 정도와 비교하여, (A) SK-OV-3 세포 및 (B) Vero-GCN4R 세포에서의 R-87, R-89 및 R-99의 복제 정도
본 발명자들은 SK-OV-3 세포(도 7A) 또는 Vero-GCN4R(도 7B)에서 R-87, R-89 및 R-99의 복제 정도를 재조합 R-LM113의 복제 정도와 비교하였다. R-LM113 바이러스는 서열 6-38 대신 gD에 삽입된 scFv-HER2를 가지며, GCN4 펩티드를 가지지 않는다. 37℃에서 90분 동안 MOI 0.1 PFU/세포로 지시된 바이러스(각각의 세포주에서 적정된 접종물)를 이용하여 (A) SK-OV-3 세포 또는 (B) Vero-GCN4 세포를 감염시켰다. 비흡수된 바이러스를 산성 세척(40 mM 시트르산, 10 mM KCl, 135 mM NaCl [pH 3])에 의해 불활성화시켰다. 복제 배양물을 감염 후 지시된 시간(24 및 48시간)에서 동결시키고, 자손을 SK-OV-3 세포에서 적정하였다. 도 7A 및 B로부터, R-87이 R-LM113과 유사한 역가로 성장하였음을 알 수 있다. 반면, R-89는 24시간에서 R-87보다 약 1-2 로그 적게 성장하였다. R-99는 중간 정도 수준으로 성장하였다.
본 발명자들은 각각 패널 A 및 B에 나타낸 실험에서와 같이 0.1 PFU/세포로 감염된 (C) SK-OV-3 세포 또는 (D) Vero-GCNR4 세포의 세포 외 배지에 대한 자손 바이러스 방출의 정도를 측정하였다. 감염 후 48시간에, 복제 배양물을 전체 용해물(lysate)과 배지(내부 + 외부)로서 동결시켰다. 대안적으로, 배지(외부) 및 세포-관련(내부) 분획을 분리하고 동결시켰다. 자손 바이러스를 SK-OV-3 세포에서 적정하였다. 세포 외 배지에서 자손 방출의 효율성은 세 개의 바이러스 모두와 유사하였다.
실시예 8. 상이한 세포주에서 R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 평판 배양 효율
본 발명자들은 플라크 크기(도 8A) 및 플라크의 수(number)(도 8B)와 관련하여, 상이한 세포주에서 플라크를 형성하는 R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 능력을 비교하였다. (A) R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 복제 분취액을 Vero-GCN4R, wt-Vero, SK-OV-3 세포에 도말하였다. 상이한 세포에서의 R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 상대적 플라크 크기의 전형적인 예가 제시된다. 이 파라미터에 의해 R-87 및 R-89는 SK-OV-3 세포뿐만 아니라 Vero-GCN4R에서 가장 큰 플라크 크기를 나타내었다. (B) R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2의 복제 분취액을 Vero-GCN4R, wt-Vero, SK-OV-3 세포에 도말하였다. 3일 후 플라크의 수를 세었다. 각 바이러스에 대하여, 주어진 세포주에서 계측한 플라크의 수는 SK-OV-3 세포에서 계측한 플라크의 수에 비례하여 나타났고, 이를 100으로 동등하게 만들었다. R-87, R-89, R-97, R-99 및 R-99-2가 Vero-GCN4R 세포에서 많은 수의 플라크를 나타내었다는 것을 알 수 있다.
실시예 9. (A) SK-OV-3 및 (B) Vero-GCN4R을 96웰 플레이트 8 x 103 세포/웰에 씨딩하고, 비교를 위해 R-87, R-89, R-99 및 R-LM113에 노출시키거나 또는 37℃에서 90분간 모의-감염(mock-infected)시켰다. 감염 다중도(multiplicity of infection)의 투입량(input)(상응하는 세포주에서 적정되는 것과 같음)은 SK-OV-3 및 Vero-GCN4R에 대하여 3 PFU/세포였다. 감염 후 지시된 날짜에 배양 배지에 Alamar-Blue(10 μl/웰, Life Technologies)를 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 플레이트를 판독하였다. 플레이트를 글로맥스 디스커버 시스템(GloMax Discover System, Promega)으로 560 및 600 nm에서 판독하였다. 각 시점에 대하여, 세포 생존율을 감염된 세포 대 비감염 세포에서 Alamar-Blue 감소의 백분율로 나타내었고, 각 샘플에 대한 배지 단독의 기여는 제외하였다. 모든 바이러스는 Vero-GCN4R 세포에 대해 세포독성이 훨씬 적은 R-LM113을 제외하고는, SK-OV-3 및 Vero-GCN4R 세포와 유사한 세포독성을 나타내었으며, 이 세포에 대한 리타겟팅의 결여와 일치하였다.
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Cys Pro Ile Arg Thr Gln Pro Arg Trp 145 150 155 160 Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp Asn Leu Gly Phe 165 170 175 Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr Tyr Leu Arg Leu 180 185 190 Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe Ile Leu Glu His 195 200 205 Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Pro 210 215 220 Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly Val Thr Val Asp 225 230 235 240 Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn Gln Arg Thr Val 245 250 255 Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro 260 265 270 Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala 275 280 285 Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu 290 295 300 Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr 325 330 335 Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu 340 345 350 Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr 355 360 365 Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp 370 375 380 Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 385 390 <210> 2 <211> 2010 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of chimeric gD-GCN4, scFv HER2 of R-87 <400> 2 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgga tccaagaact accacctgga gaacgaggtg 180 gccagactga agaagctggt gggcagcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtcgag 240 aattccgata tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg 300 gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag 360 aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc 420 ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg 480 cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc 540 ggacagggta ccaaggtgga gatcaaatcg gatatgccga tggctgatcc gaaccgtttc 600 cgcggtaaga acctggtttt tcattctgag gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg 660 gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac 720 acctatatac actgggtgcg tcaggccccg ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt 780 tatcctacga atggttatac tagatatgcc gatagcgtca agggccgttt cactataagc 840 gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact 900 gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg gacggcttct atgctatgga ctactggggt 960 caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt ggcggtggct ctggttccgg tggatccatc 1020 caggcgggcc taccagaccc gttccagccc cccagcctcc cgatcacggt ttactacgcc 1080 gtgttggagc gcgcctgccg cagcgtgctc ctaaacgcac cgtcggaggc cccccagatt 1140 gtccgcgggg cctccgaaga cgtccggaaa caaccctaca acctgaccat cgcttggttt 1200 cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgctcctac 1260 aacaagtctc tgggggcctg tcccatccga acgcagcccc gctggaacta ctatgacagc 1320 ttcagcgccg tcagcgagga taacctgggg ttcctgatgc acgcccccgc gtttgagacc 1380 gccggcacgt acctgcggct cgtgaagata aacgactgga cggagattac acagtttatc 1440 ctggagcacc gagccaaggg ctcctgtaag tacgccctcc cgctgcgcat ccccccgtca 1500 gcctgcctgt ccccccaggc ctaccagcag ggggtgacgg tggacagcat cgggatgctg 1560 ccccgcttca tccccgagaa ccagcgcacc gtcgccgtat acagcttgaa gatcgccggg 1620 tggcacgggc ccaaggcccc atacacgagc accctgctgc ccccggagct gtccgagacc 1680 cccaacgcca cgcagccaga actcgccccg gaagaccccg aggattcggc cctcttggag 1740 gaccccgtgg ggacggtggc gccgcaaatc ccaccaaact ggcacatacc gtcgatccag 1800 gacgccgcga cgccttacca tcccccggcc accccgaaca acatgggcct gatcgccggc 1860 gcggtgggcg gcagtctcct ggcagccctg gtcatttgcg gaattgtgta ctggatgcgc 1920 cgccgcactc aaaaagcccc aaagcgcata cgcctccccc acatccggga agacgaccag 1980 ccgtcctcgc accagccctt gttttactag 2010 <210> 3 <211> 669 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gD having inserted the GCN4 peptide and scFv to HER2 receptor as encoded by the construct R-87. <400> 3 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys 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gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 720 cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 780 agcatcggga tgctgccccg cttcgagaat tccgatatcc agatgaccca gtccccgagc 840 tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc accatcacct gccgtgccag tcaggatgtg 900 aatactgctg tagcctggta tcaacagaaa ccaggaaaag ctccgaagct tctgatttac 960 tcggcatcct tcctctactc tggagtccct tctcgcttct ctggtagccg ttccgggacg 1020 gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag 1080 caacattata ctactcctcc cacgttcgga cagggtacca aggtggagat caaatcggat 1140 atgccgatgg ctgatccgaa ccgtttccgc ggtaagaacc tggtttttca ttctgaggtt 1200 cagctggtgg agtctggcgg tggcctggtg cagccagggg gctcactccg tttgtcctgt 1260 gcagcttctg gcttcaacat taaagacacc tatatacact gggtgcgtca ggccccgggt 1320 aagggcctgg aatgggttgc aaggatttat cctacgaatg gttatactag atatgccgat 1380 agcgtcaagg gccgtttcac tataagcgca gacacatcca aaaacacagc ctacctacaa 1440 atgaacagct taagagctga ggacactgcc gtctattatt gtagccgctg gggaggggac 1500 ggcttctatg ctatggacta ctggggtcaa 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Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Glu Asn Ser Asp 260 265 270 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 275 280 285 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 290 295 300 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 305 310 315 320 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 325 330 335 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 340 345 350 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 355 360 365 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Asp Met Pro Met Ala 370 375 380 Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val Phe His Ser Glu Val 385 390 395 400 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 405 410 415 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile 420 425 430 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg 435 440 445 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 450 455 460 Arg Phe Thr Ile Ser Ala 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gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840 gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900 ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtcgga 960 tccaagaact accacctgga gaacgaggtg gccagactga agaagctggt gggcagcatc 1020 caggcgggcc taccagaccc gttccagccc cccagcctcc cgatcacggt ttactacgcc 1080 gtgttggagc gcgcctgccg cagcgtgctc ctaaacgcac cgtcggaggc cccccagatt 1140 gtccgcgggg cctccgaaga cgtccggaaa caaccctaca acctgaccat cgcttggttt 1200 cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgctcctac 1260 aacaagtctc tgggggcctg tcccatccga acgcagcccc gctggaacta ctatgacagc 1320 ttcagcgccg tcagcgagga taacctgggg ttcctgatgc acgcccccgc gtttgagacc 1380 gccggcacgt acctgcggct cgtgaagata aacgactgga cggagattac acagtttatc 1440 ctggagcacc gagccaaggg ctcctgtaag tacgccctcc cgctgcgcat ccccccgtca 1500 gcctgcctgt ccccccaggc ctaccagcag ggggtgacgg tggacagcat cgggatgctg 1560 ccccgcttca tccccgagaa ccagcgcacc gtcgccgtat acagcttgaa gatcgccggg 1620 tggcacgggc 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ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgag aattccgata tccagatgac ccagtccccg 180 agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat 240 gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt 300 tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg 360 acggatttca ctctgaccat cagcagtctg cagccggaag acttcgcaac ttattactgt 420 cagcaacatt atactactcc tcccacgttc ggacagggta ccaaggtgga gatcaaatcg 480 gatatgccga tggctgatcc gaaccgtttc cgcggtaaga acctggtttt tcattctgag 540 gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 600 tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgcg tcaggccccg 660 ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt tatcctacga atggttatac tagatatgcc 720 gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta 780 caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840 gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900 ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 960 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 1020 acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 1080 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 1140 accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 1200 accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 1260 aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 1320 cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 1380 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 1440 cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 1500 agcatcggga tgctgccccg cttcggatcc aagaactacc acctggagaa cgaggtggcc 1560 agactgaaga agctggtggg cagctacagc ttgaagatcg ccgggtggca cgggcccaag 1620 gccccataca cgagcaccct gctgcccccg gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag 1680 ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg 1740 gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct 1800 taccatcccc cggccacccc gaacaacatg ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt 1860 ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa 1920 gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag 1980 cccttgtttt actag 1995 <210> 9 <211> 664 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gD having inserted the scFv to HER2 receptor and the GCN4 peptide as encoded by the construct R-99. <400> 9 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 35 40 45 Val Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 50 55 60 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 65 70 75 80 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 85 90 95 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 100 105 110 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 115 120 125 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser 145 150 155 160 Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val 165 170 175 Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 180 185 190 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 195 200 205 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 210 215 220 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 225 230 235 240 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 245 250 255 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 260 265 270 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 275 280 285 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg 305 310 315 320 Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro 325 330 335 Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg 340 345 350 Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly 355 360 365 Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp 370 375 380 Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr 385 390 395 400 Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr 405 410 415 Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp 420 425 430 Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr 435 440 445 Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe 450 455 460 Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu 465 470 475 480 Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly 485 490 495 Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Gly Ser Lys Asn 500 505 510 Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Ser 515 520 525 Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly Pro Lys Ala Pro Tyr Thr 530 535 540 Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu Thr Pro Asn Ala Thr Gln 545 550 555 560 Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asp 565 570 575 Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro Pro Asn Trp His Ile Pro 580 585 590 Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His Pro Pro Ala Thr Pro Asn 595 600 605 Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Gly Ser Leu Leu Ala Ala 610 615 620 Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met Arg Arg Arg Thr Gln Lys 625 630 635 640 Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile Arg Glu Asp Asp Gln Pro 645 650 655 Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 660 <210> 10 <211> 2013 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of chimeric gD-GCN4, scFv HER2 of R-99-2 <400> 10 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgag aattccgata tccagatgac ccagtccccg 180 agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg gtcaccatca cctgccgtgc cagtcaggat 240 gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa gcttctgatt 300 tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc ccttctcgct tctctggtag ccgttccggg 360 acggatttca ctctgaccat cagcagtctg cagccggaag acttcgcaac ttattactgt 420 cagcaacatt atactactcc tcccacgttc ggacagggta ccaaggtgga gatcaaatcg 480 gatatgccga tggctgatcc gaaccgtttc cgcggtaaga acctggtttt tcattctgag 540 gttcagctgg tggagtctgg cggtggcctg gtgcagccag ggggctcact ccgtttgtcc 600 tgtgcagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatac actgggtgcg tcaggccccg 660 ggtaagggcc tggaatgggt tgcaaggatt tatcctacga atggttatac tagatatgcc 720 gatagcgtca agggccgttt cactataagc gcagacacat ccaaaaacac agcctaccta 780 caaatgaaca gcttaagagc tgaggacact gccgtctatt attgtagccg ctggggaggg 840 gacggcttct atgctatgga ctactggggt caaggaacac tagtcaccgt ctcctcgagt 900 ggcggtggct ctggttccgg tggatccctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 960 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 1020 acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 1080 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 1140 accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 1200 accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 1260 aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 1320 cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 1380 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 1440 cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 1500 agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcggatccaa gaactaccac 1560 ctggagaacg aggtggccag actgaagaag ctggtgggca gctacagctt gaagatcgcc 1620 gggtggcacg ggcccaaggc cccatacacg agcaccctgc tgcccccgga gctgtccgag 1680 acccccaacg ccacgcagcc agaactcgcc ccggaagacc ccgaggattc ggccctcttg 1740 gaggaccccg tggggacggt ggcgccgcaa atcccaccaa actggcacat accgtcgatc 1800 caggacgccg cgacgcctta ccatcccccg gccaccccga acaacatggg cctgatcgcc 1860 ggcgcggtgg gcggcagtct cctggcagcc ctggtcattt gcggaattgt gtactggatg 1920 cgccgccgca ctcaaaaagc cccaaagcgc atacgcctcc cccacatccg ggaagacgac 1980 cagccgtcct cgcaccagcc cttgttttac tag 2013 <210> 11 <211> 670 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gD having inserted the scFv to HER2 receptor and the GCN4 peptide as encoded by the construct R-99-2 <400> 11 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 35 40 45 Val Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 50 55 60 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 65 70 75 80 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 85 90 95 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 100 105 110 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 115 120 125 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 130 135 140 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser 145 150 155 160 Asp Met Pro Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asn Leu Val 165 170 175 Phe His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 180 185 190 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 195 200 205 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 210 215 220 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 225 230 235 240 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 245 250 255 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 260 265 270 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 275 280 285 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg 305 310 315 320 Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro 325 330 335 Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg 340 345 350 Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly 355 360 365 Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp 370 375 380 Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr 385 390 395 400 Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr 405 410 415 Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp 420 425 430 Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr 435 440 445 Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe 450 455 460 Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu 465 470 475 480 Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly 485 490 495 Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn 500 505 510 Gln Arg Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 515 520 525 Lys Lys Leu Val Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly 530 535 540 Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu 545 550 555 560 Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 565 570 575 Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro 580 585 590 Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His 595 600 605 Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly 610 615 620 Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met 625 630 635 640 Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile 645 650 655 Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 660 665 670 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> GCN4 peptide <400> 12 Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys 1 5 10 15 Leu Val Gly Ser 20 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> GCN4 epitope <400> 13 Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 281 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 14 Met Ser Glu Tyr Gln Pro Ser Leu Phe Ala Leu Asn Pro Met Gly Phe 1 5 10 15 Ser Pro Leu Asp Gly Ser Lys Ser Thr Asn Glu Asn Val Ser Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Thr Ala Lys Pro Met Val Gly Gln Leu Ile Phe Asp Lys Phe 35 40 45 Ile Lys Thr Glu Glu Asp Pro Ile Ile Lys Gln Asp Thr Pro Ser Asn 50 55 60 Leu Asp Phe Asp Phe Ala Leu Pro Gln Thr Ala Thr Ala Pro Asp Ala 65 70 75 80 Lys Thr Val Leu Pro Ile Pro Glu Leu Asp Asp Ala Val Val Glu Ser 85 90 95 Phe Phe Ser Ser Ser Thr Asp Ser Thr Pro Met Phe Glu Tyr Glu Asn 100 105 110 Leu Glu Asp Asn Ser Lys Glu Trp Thr Ser Leu Phe Asp Asn Asp Ile 115 120 125 Pro Val Thr Thr Asp Asp Val Ser Leu Ala Asp Lys Ala Ile Glu Ser 130 135 140 Thr Glu Glu Val Ser Leu Val Pro Ser Asn Leu Glu Val Ser Thr Thr 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Thr Pro Val Leu Glu Asp Ala Lys Leu Thr Gln Thr 165 170 175 Arg Lys Val Lys Lys Pro Asn Ser Val Val Lys Lys Ser His His Val 180 185 190 Gly Lys Asp Asp Glu Ser Arg Leu Asp His Leu 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ctcgacaact 480 tcattcttac ccactcctgt tctagaagat gctaaactga ctcaaacaag aaaggttaag 540 aaaccaaatt cagtcgttaa gaagtcacat catgttggaa aggatgacga atcgagactg 600 gatcatctag gtgttgttgc ttacaaccgc aaacagcgtt cgattccact ttctccaatt 660 gtgcccgaat ccagtgatcc tgctgctcta aaacgtgcta gaaacactga agccgccagg 720 cgttctcgtg cgagaaagtt gcaaagaatg aaacaacttg aagacaaggt tgaagaattg 780 ctttcgaaaa attatcactt ggaaaatgag gttgccagat taaagaaatt agttggcgaa 840 cgctga 846 <210> 16 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of scFv HER2 cassette <400> 16 Glu Asn Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val 20 25 30 Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr 85 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Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 35 40 45 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 50 55 60 Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 65 70 75 80 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 100 105 110 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 115 120 125 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro 165 170 175 Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 180 185 190 Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 195 200 205 Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala 210 215 220 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val 225 230 235 240 Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr 245 250 255 Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 260 265 270 Val Ser Ser 275 <210> 18 <211> 654 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the scFv to GCN4 peptide comprising human nectin-1 residues <400> 18 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 35 40 45 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 50 55 60 Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 65 70 75 80 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 100 105 110 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 115 120 125 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro 165 170 175 Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 180 185 190 Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 195 200 205 Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala 210 215 220 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val 225 230 235 240 Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr 245 250 255 Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 260 265 270 Val Ser Ser Gly Ser Gly Ala Met Ala Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu 275 280 285 Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val 290 295 300 Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn Gly Lys Pro Pro Ser Val Val 305 310 315 320 Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg 325 330 335 Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu Ala Cys Ile Val Asn Tyr His 355 360 365 Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro 370 375 380 Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met 385 390 395 400 Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu 405 410 415 Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala 420 425 430 Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala 435 440 445 Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly 450 455 460 Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro 465 470 475 480 Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly 485 490 495 Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu Ile Val Val Gly Gly Ile Val 500 505 510 Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr 515 520 525 Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln 530 535 540 His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp 545 550 555 560 Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu 565 570 575 Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly 580 585 590 Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val 595 600 605 Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly 610 615 620 Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp Leu Ala Glu Asn Met Val Ser 625 630 635 640 Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys Lys Glu Trp Tyr Val 645 650 <210> 19 <211> 1965 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the scFv to GCN4 peptide comprising human nectin-1 residues <400> 19 atggaaaccg acacccttct tttgtgggtg cttcttcttt gggtgcccgg gagcaccggg 60 gactacccct acgacgtgcc cgactacgcc ggggctgatg ccgtggtgac ccaggagagc 120 gccttgacca caagccccgg ggagaccgtg accttgacct gtagaagcag cacaggggcc 180 gttacaacct ctaactacgc cagctgggtt caggagaagc ccgaccacct tttcaccgga 240 cttatcggag ggaccaacaa cagagccccc ggggtgcctg ctagattcag cgggagcctt 300 attggggaca aggccgccct taccattacc ggggctcaga ccgaagacga ggctatctac 360 ttctgtgctc tttggtacag caaccattgg gtgttcggag gcgggacaaa gcttacagtg 420 cttggaggcg gtggaggcag cggcggaggt gggtctggtg gagggggctc tgggggaggc 480 ggtagcgacg tgcagcttca gcagagcggg cccgggcttg tggccccctc tcagtctctt 540 agcataacgt gcaccgtgag cgggttcagc cttaccgact atggggttaa ctgggtgaga 600 cagtctcctg ggaaggggct tgagtggttg ggagttatct ggggagacgg aatcaccgac 660 tacaacagcg ccttgaagag cagactttct gtgacaaagg acaactctaa gagccaggtg 720 ttccttaaga tgaacagcct tcagagcggg gactctgcca gatactactg cgtgacaggg 780 cttttcgact actggggaca agggaccacc ttgaccgtga gcagcggaag cggagccatg 840 gccaagccca ccaactggat cgaggggaca caggccgtgc ttagagccaa gaaggggcag 900 gacgacaagg ttcttgttgc tacttgcacc agcgccaacg gaaagccccc cagcgtggtg 960 agctgggaga caagattgaa aggggaggcc gagtatcagg agatcagaaa ccctaacggg 1020 accgtgaccg tgatcagcag atacagactt gtgcctagca gagaggccca ccagcagagc 1080 cttgcctgca tcgttaacta ccacatggac agattcaagg agagccttac acttaacgtg 1140 cagtacgaac ccgaggtgac catcgagggg ttcgacggga actggtacct tcagagaatg 1200 gacgtgaagc ttacctgcaa ggccgacgcc aaccctcccg ccaccgagta ccactggacc 1260 acccttaacg ggagccttcc caaaggggtg gaggcccaga acagaaccct tttcttcaag 1320 gggcccatca attacagcct tgccgggacc tacatctgcg aggccaccaa ccccatcggg 1380 accagaagcg gtcaagtgga ggtgaacatc accgagttcc cctacacccc cagcccaccc 1440 gagcacggga gaagagctgg gcccgttccc accgccatca tcggaggggt ggccgggagc 1500 atcttgcttg tgcttatcgt ggtgggtggg attgtggtgg cccttagaag aagaagacat 1560 accttcaaag gggactacag caccaagaag cacgtgtacg ggaacgggta cagcaaggcc 1620 ggaatccctc agcaccatcc acctatggcc cagaaccttc agtaccccga cgacagcgac 1680 gatgagaaga aggctgggcc ccttggtggg agcagctacg aagaggagga agaagaggaa 1740 gagggtggcg gcggtggaga gagaaaagtg ggagggcctc atcccaaata cgacgaggac 1800 gccaagagac cctacttcac cgtggacgag gccgaggcca gacaggacgg gtacggggac 1860 agaacccttg ggtaccagta cgaccccgag cagttggact tggccgagaa catggtgagc 1920 cagaacgacg gaagcttcat ctctaagaag gagtggtacg tgtga 1965 <210> 20 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD24_galK_f <400> 20 ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 21 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD25_galK_r <400> 21 tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_827_f <400> 22 gcgtgatgtc accattgaag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_1142_r <400> 23 tattgttcag cgacagcttg 20 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GCN4 peptide cassette <400> 24 ggatccaaga actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 60 <210> 25 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD24_GCN4_fB <400> 25 ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc ggatccaaga 60 actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110 <210> 26 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD25_GCN4_rB <400> 26 tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag gctgcccacc 60 agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110 <210> 27 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of chimeric gD-GCN4 of R-81 <400> 27 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcgga tccaagaact accacctgga gaacgaggtg 180 gccagactga agaagctggt gggcagcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 240 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctacca gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 300 acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 360 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 420 accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 480 accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 540 aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 600 cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 660 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 720 cgcatccccc cgtcagcctg cctgtccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 780 agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc 840 ttgaagatcg ccgggtggca cgggcccaag gccccataca cgagcaccct gctgcccccg 900 gagctgtccg agacccccaa cgccacgcag ccagaactcg ccccggaaga ccccgaggat 960 tcggccctct tggaggaccc cgtggggacg gtggcgccgc aaatcccacc aaactggcac 1020 ataccgtcga tccaggacgc cgcgacgcct taccatcccc cggccacccc gaacaacatg 1080 ggcctgatcg ccggcgcggt gggcggcagt ctcctggcag ccctggtcat ttgcggaatt 1140 gtgtactgga tgcgccgccg cactcaaaaa gccccaaagc gcatacgcct cccccacatc 1200 cgggaagacg accagccgtc ctcgcaccag cccttgtttt actag 1245 <210> 28 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the precursor of gD having inserted the GCN4 peptide, as encoded by the construct R-81 <400> 28 Met Gly Gly Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val Ile Leu Phe Val Val 1 5 10 15 Ile Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Met Ala Asp Pro Asn Arg Phe Arg Gly Lys Asp Leu Pro 35 40 45 Val Gly Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys 50 55 60 Lys Leu Val Gly Ser Leu Asp Gln Leu Thr Asp Pro Pro Gly Val Arg 65 70 75 80 Arg Val Tyr His Ile Gln Ala Gly Leu Pro Asp Pro Phe Gln Pro Pro 85 90 95 Ser Leu Pro Ile Thr Val Tyr Tyr Ala Val Leu Glu Arg Ala Cys Arg 100 105 110 Ser Val Leu Leu Asn Ala Pro Ser Glu Ala Pro Gln Ile Val Arg Gly 115 120 125 Ala Ser Glu Asp Val Arg Lys Gln Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ala Trp 130 135 140 Phe Arg Met Gly Gly Asn Cys Ala Ile Pro Ile Thr Val Met Glu Tyr 145 150 155 160 Thr Glu Cys Ser Tyr Asn Lys Ser Leu Gly Ala Cys Pro Ile Arg Thr 165 170 175 Gln Pro Arg Trp Asn Tyr Tyr Asp Ser Phe Ser Ala Val Ser Glu Asp 180 185 190 Asn Leu Gly Phe Leu Met His Ala Pro Ala Phe Glu Thr Ala Gly Thr 195 200 205 Tyr Leu Arg Leu Val Lys Ile Asn Asp Trp Thr Glu Ile Thr Gln Phe 210 215 220 Ile Leu Glu His Arg Ala Lys Gly Ser Cys Lys Tyr Ala Leu Pro Leu 225 230 235 240 Arg Ile Pro Pro Ser Ala Cys Leu Ser Pro Gln Ala Tyr Gln Gln Gly 245 250 255 Val Thr Val Asp Ser Ile Gly Met Leu Pro Arg Phe Ile Pro Glu Asn 260 265 270 Gln Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Trp His Gly 275 280 285 Pro Lys Ala Pro Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro Pro Glu Leu Ser Glu 290 295 300 Thr Pro Asn Ala Thr Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 305 310 315 320 Ser Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Gly Thr Val Ala Pro Gln Ile Pro 325 330 335 Pro Asn Trp His Ile Pro Ser Ile Gln Asp Ala Ala Thr Pro Tyr His 340 345 350 Pro Pro Ala Thr Pro Asn Asn Met Gly Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly 355 360 365 Gly Ser Leu Leu Ala Ala Leu Val Ile Cys Gly Ile Val Tyr Trp Met 370 375 380 Arg Arg Arg Thr Gln Lys Ala Pro Lys Arg Ile Arg Leu Pro His Ile 385 390 395 400 Arg Glu Asp Asp Gln Pro Ser Ser His Gln Pro Leu Phe Tyr 405 410 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD_ext_f <400> 29 tccataccga ccacaccgac gaatccc 27 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD_ext_r <400> 30 gagtttgata ccagactgac cgtg 24 <210> 31 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_gD35_F <400> 31 tgaagaagct ggtgggcagc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 32 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_gD39_R <400> 32 gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 33 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Nucleotide sequence of scFv HER2 cassette <400> 33 gagaattccg atatccagat gacccagtcc ccgagctccc tgtccgcctc tgtgggcgat 60 agggtcacca tcacctgccg tgccagtcag gatgtgaata ctgctgtagc ctggtatcaa 120 cagaaaccag gaaaagctcc gaagcttctg atttactcgg catccttcct ctactctgga 180 gtcccttctc gcttctctgg tagccgttcc gggacggatt tcactctgac catcagcagt 240 ctgcagccgg aagacttcgc aacttattac tgtcagcaac attatactac tcctcccacg 300 ttcggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa tcggatatgc cgatggctga tccgaaccgt 360 ttccgcggta agaacctggt ttttcattct gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc 420 ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag cttctggctt caacattaaa 480 gacacctata tacactgggt gcgtcaggcc ccgggtaagg gcctggaatg ggttgcaagg 540 atttatccta cgaatggtta tactagatat gccgatagcg tcaagggccg tttcactata 600 agcgcagaca catccaaaaa cacagcctac ctacaaatga acagcttaag agctgaggac 660 actgccgtct attattgtag ccgctgggga ggggacggct tctatgctat ggactactgg 720 ggtcaaggaa cactagtcac cgtctcctcg agtggcggtg gctctggttc cggtggatcc 780 <210> 34 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD-34-scFvHER2-F <400> 34 tgaagaagct ggtgggcagc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc gagaattccg 60 atatccagat 70 <210> 35 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD-40-scFvHER2-R <400> 35 gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat ggatccaccg 60 gaaccagagc 70 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer scFv_456_r <400> 36 agctgcacag gacaaacgga gtgagccccc 30 <210> 37 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_gD214_F <400> 37 cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 38 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer galK_gD223_R <400> 38 ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 39 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD213-scFvHER2f <400> 39 cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc gagaattccg 60 atatccagat 70 <210> 40 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD224-scFvHER2r <400> 40 ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta ggatccaccg 60 gaaccagagc 70 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gDintforw <400> 41 ccctacaacc tgaccatcgc ttgg 24 <210> 42 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD24-scFvHer2-F <400> 42 ctctcaagat ggccgacccc aatcgctttc gcggcaaaga ccttccggtc gagaattccg 60 atatccagat g 71 <210> 43 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD25-scFvHer2-R <400> 43 tggatgtggt acacgcgccg gacccccgga gggtcggtca gctggtccag ggatccaccg 60 gaaccagagc 70 <210> 44 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD213-GCN4-F <400> 44 cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc ggatccaaga 60 actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110 <210> 45 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD224-GCN4-R <400> 45 ctcgtgtatg gggccttggg cccgtgccac ccggcgatct tcaagctgta gctgcccacc 60 agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer HSV_139688_r <400> 46 ccgacttatc gactgtccac ctttccc 27 <210> 47 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD35-galK-F <400> 47 gctctggttc cggtggatcc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc cctgttgaca 60 attaatcatc ggca 74 <210> 48 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD39-galK-R <400> 48 gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat tcagcactgt 60 cctgctcctt 70 <210> 49 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD35-GCN4-F <400> 49 gctctggttc cggtggatcc ctggaccagc tgaccgaccc tccgggggtc ggatccaaga 60 actaccacct ggagaacgag gtggccagac tgaagaagct ggtgggcagc 110 <210> 50 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD39-GCN4-R <400> 50 gtgatcggga ggctgggggg ctggaacggg tctggtaggc ccgcctggat gctgcccacc 60 agcttcttca gtctggccac ctcgttctcc aggtggtagt tcttggatcc 110 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer scFv4D5 651_f <400> 51 ggacactgcc gtctattatt gtagccgct 29 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gDintrev <400> 52 ccagtcgttt atcttcacga gccg 24 <210> 53 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer gD219-GCN4-F <400> 53 cctaccagca gggggtgacg gtggacagca tcgggatgct gccccgcttc atccccgaga 60 accagcgcgg atccaagaac taccacctgg agaacgaggt ggccagactg aagaagctgg 120

Claims (22)

  1. 헤르페스 바이러스의 외피에 존재하는 당단백질 D에 융합되거나 삽입되는 표적 분자에 결합할 수 있는 5 내지 131개의 아미노산 길이를 가지는, 이종 펩티드 리간드를 포함하는 재조합 헤르페스 바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    이종 펩티드 리간드는 5 내지 120개의 아미노산, 바람직하게는 5 내지 100개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5 내지 80개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 60개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 45개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 40개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 35개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 5 내지 30개의 아미노산, 여전히 더욱 바람직하게는 10 내지 30개의 아미노산 또는 여전히 더욱 바람직하게는 12 내지 20개의 아미노산 길이를 갖는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    이종 펩티드 리간드는 GCN4 효모 전사 인자(GCN4 yeast transcription factor)의 일부, 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프, 더욱 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 GCN4 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부를 포함하며, 가장 바람직하게는 펩티드는 서열번호 12로 표시되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    이종 펩티드 리간드는 세포 배양물(cell culture)에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하거나, 또는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하거나, 또는
    여기에서 재조합 헤르페스 바이러스는 하나 초과의 이종 펩티드 리간드를 포함하며, 여기에서 하나 초과의 이종 펩티드 리간드 중 하나는 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하고, 하나 초과의 이종 펩티드 리간드 중 다른 하나는 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합하며,
    바람직하게는 여기에서 헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하는 세포의 막과 융합하는 능력, 여전히 더욱 바람직하게는 상기 세포에 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 상기 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    세포 배양물에 존재하는 세포는 헤르페스 바이러스의 성장에 적합한 배양된 세포, 바람직하게는 헤르페스 바이러스 성장을 위해 승인된 세포주, 더욱 바람직하게는 Vero, 293, 293T, HEp-2, HeLa, BHK 또는 RS 세포, 여전히 더욱 바람직하게는 Vero 세포이고, 및/또는
    여기에서 세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자는 항체, 항체 유도체(derivative) 또는 항체 모방체(mimetic), 바람직하게는 단일-사슬 항체(scFv), 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 GCN4 효모 전사 인자의 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 13으로 표시되는 GCN4 에피토프, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 구성되는 GCN4 효모 전사 인자의 일부에 결합할 수 있는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 17로 구성되는 scFv 또는 여전히 더욱 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 scFv이고,
    가장 바람직하게는, 여기에서 세포 배양물에 존재하는 세포는 서열번호 18로 표시되는 scFv를 표적 분자로서 가지는 Vero 세포인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤르페스 바이러스는 gD에 융합되거나 삽입되는, 질병 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드를 더 포함하고,
    바람직하게는, 여기에서 헤르페스 바이러스는 표적 분자를 발현하는 질병 세포의 막과 융합하는 능력, 여전히 더욱 바람직하게는 상기 세포에 들어가는 능력, 가장 바람직하게는 상기 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  7. 제6항에 있어서,
    세포 배양물에 존재하는 세포 상에 존재하는 표적 분자에 결합할 수 있는 이종 펩티드 리간드, 및 이종 폴리펩티드 리간드를 포함하는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병 세포에 존재하는 표적 분자는 종양 세포 상에 존재하고,
    바람직하게는, 여기에서 표적 분자는 종양 관련 수용체, 더욱 바람직하게는 HER2, EGFR, EGFRIII 또는 EGFR3 (ERBB3), EGFRvIII을 포함하는 EGF 수용체 패밀리의 구성원(member), 또는 MET, FAP, PSMA, CXCR4, CEA, CEA-CAM, Ep-CAM, CADC, 뮤신, 엽산 결합 단백질(Folate-binding protein), gp100, GD2, VEGF 수용체 1 및 2, CD19, CD20, CD30, CD33, CD52, CD55, 인테그린 패밀리, IGF1R, 에프린(Ephrin) 수용체 패밀리, 단백질-티로신 키나아제(protein-tyrosine kinase, TK) 패밀리, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13R알파, UPAR, 테나신(Tenascin), PD-1, PD-L1, CTL-A4, TIM-3, LAG3, B7-H3, 또는 IDO를 포함하는 면역 체크포인트 패밀리 수용체의 구성원, 종양 관련 당단백질 72, 강글리오사이드(gangioside) GM2, A33, 루이스 Y 항체 또는 MUC1, 가장 바람직하게는 HER2이고, 또는
    여기에서 질병 세포는 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포이고,
    더욱 바람직하게는, 여기에서 종양 세포, 감염된 세포, 퇴행성 장애 관련 세포 또는 노화 세포에 결합할 수 있는 이종 폴리펩티드 리간드는 항체, 항체 유도체 또는 항체 모방체, 여전히 더욱 바람직하게는 scFv, 여전히 더욱 바람직하게는 HER2에 결합하는 scFv 또는 가장 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 scFv인 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    gD는 수용체 HVEM 및/또는 nectin-1과 상호작용하는 재조합 헤르페스 바이러스의 능력이 감소, 바람직하게는 실질적으로 제거(ablated)되도록 변형되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    gD의 nectin-1 결합 부위는 불활성화되며,
    바람직하게는, 여기에서 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동(homologous) gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이들의 서브셋을 함유하거나 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이들의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223을 함유하는 gD의 부분(portion)이 gD로부터 결실되고,
    더욱 바람직하게는, 여기에서 아미노산 35 내지 39, 아미노산 214 내지 223 또는 아미노산 219 내지 223이 결실되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  11. 제10항에 있어서,
    이종 펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키거나, 또는
    여기에서 이종 폴리펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    gD의 HVEM 결합 부위는 불활성화되며, 바람직하게는 이종 펩티드 리간드 또는 이종 폴리펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 gD의 아미노산 6 및 34의 사이 또는 여전히 더욱 바람직하게는 gD의 아미노산 24 및 25의 사이에 삽입되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  13. 제12항에 있어서,
    이종 펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 gD의 6과 34의 사이, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25의 사이에 삽입되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신, 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키거나, 또는
    여기에서 이종 폴리펩티드 리간드는 gD의 HVEM 결합 부위, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 6과 34 사이에, 더욱 바람직하게는 아미노산 24와 25 사이에 삽입되고, 이종 펩티드 리간드는 gD에 삽입, 바람직하게는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되어 nectin-1 결합 부위를 불활성화시키고,
    바람직하게는, 여기에서 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 삽입되고, 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신 gD에 삽입되거나, 또는
    여기에서 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25의 사이에 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 삽입되고, 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 또는 이의 서브셋 대신 또는 아미노산 214 내지 223 또는 이의 서브셋, 예컨대 아미노산 215 내지 223, 216 내지 223, 217 내지 223, 218 내지 223 또는 219 내지 223 대신에 gD에 삽입되고,
    더욱 바람직하게는, 여기에서 서열번호 12로 표시되는 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 서열번호 16으로 표시되는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 대신 또는 아미노산 214 내지 223 대신 또는 아미노산 219 내지 223 대신 gD에 삽입되거나, 또는
    여기에서 서열번호 16으로 표시되는 이종 폴리펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD에 대하여 아미노산 24와 25 사이 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산 내에 삽입되고, 서열번호 12로 표시되는 이종 펩티드 리간드는 서열번호 1로 구성되는 성숙 gD 또는 상동 gD의 상응하는 아미노산에 대하여 아미노산 35 내지 39 대신 또는 아미노산 214 내지 223 대신 또는 아미노산 219 내지 223 대신에 gD에 삽입되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    헤르페스 바이러스는 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 분자를 암호화하는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 헤르페스 바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 선택적으로 세포, 바람직하게는 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 분자(들)를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양, 감염, 퇴행성 장애 또는 노화 관련 질병의 치료에 사용하기 위하여, 질병 세포에 대해 숙주 면역 반응을 조절하는 하나 이상의 분자(들)와 조합하여 선택적으로 투여되는 것인, 재조합 헤르페스 바이러스.
  17. 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드 리간드가 융합되거나 삽입된, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 gD를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 분자.
  18. 제17항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  19. 이종 펩티드 리간드 및 선택적으로 이종 폴리펩티드가 융합되거나 삽입된, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 gD를 포함하는 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 헤르페스 바이러스, 제17항에 따른 핵산 분자, 제18항에 따른 벡터 또는 제19항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 헤르페스 바이러스를 이용하여 세포를 감염시키는 방법.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 헤르페스를 이용하여 세포 배양물에 존재하는 세포에서 헤르페스 바이러스를 생산하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법.
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