PT2239269E

PT2239269E - Uso de péptidos derivados de copolímero 1 como marcadores de peso molecular

Info

Publication number: PT2239269E
Application number: PT101715530T
Authority: PT
Inventors: Alexander Gad; Dora Lis
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1998-09-25
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2013-04-09
Also published as: NO20011441D0; IL209189A; AU757413B2; EP1115743B1; CA2794705C; CA2343929C; HUP0103889A2; JP2002525378A; ATE431359T1; IL209189A0; HUP0103889A3; NZ511020A; ES2408706T3; IL142116A0; DK2090583T3; DK2239269T3; IL209190A0; CY1110490T1; EP2090583A1; EP1115743A4

Description

1

DESCRIÇÃO

"USO DE PÉPTIDOS DERIVADOS DE COPOLÍMERO 1 COMO MARCADORES DE PESO MOLECULAR"

Introdução A presente invenção proporciona marcadores de peso molecular para determinação precisa do peso molecular do acetato de glatirâmero, de terpolimeros e outros copolimeros. Os marcadores de peso molecular são polipéptidos tendo pesos moleculares identificados entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 40.000 daltons, e uma composição de aminoácidos correspondendo ao acetato de glatirâmero ou a um copolímero rodado. Os pesos moleculares identificados são proporcionados por polipéptidos tendo sequências definidas. Os marcadores de peso molecular correspondendo ao acetato de glatirâmero compreendem os aminoácidos alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina em razões molares especificas. Os marcadores de peso molecular correspondendo aos terpolimeros relacionados compreendem três dos quatro aminoácidos. Numa foram de realização preferencial, o polipéptido tem alanina no N-terminal e tirosina na quarta posição a partir do N-terminal. A presente invenção proporciona adicionalmente uma pluralidade de marcadores de peso molecular para determinação da gama de pesos moleculares de uma composição de copolimeros. A pluralidade de marcadores de peso molecular apresenta idealmente relações entre elipticidade molar e peso molecular, ou entre tempo de retenção e log do peso molecular.

Otimamente, os polipéptidos demonstram atividade biológica similar ao copolimero do qual eles são derivados. Os polipéptidos tendo pesos moleculares definidos e 2 composições de aminoácidos similares ao acetato de glatirâmero têm otimamente utilidade terapêutica para o tratamento de doenças e condições imunes.

Antecedentes da invenção

As doenças autoimunes ocorrem quando o sistema imune de um organismo falha em reconhecer alguns dos tecidos do próprio organismo como "seus" e ataca-os como estranhos. Normalmente, a autotolerância é desenvolvida precocemente por eventos de desenvolvimento no sistema imune que previnem as células T e as células B do próprio organismo de reagirem com os tecidos do próprio organismo. Estas respostas imunes precoces são mediadas pela ligação de antigénios a moléculas do CPH e pela apresentação aos recetores da célula T.

Este processo de autotolerância quebra quando se desenvolvem doenças autoimunes e os tecidos e proteínas do próprio organismo são reconhecidos como "autoantigénios" e atacados pelo sistema imune do organismo. Por exemplo, acredita-se que a esclerose múltipla é uma doença autoimune ocorrendo quando o sistema imune ataca a bainha de mielina, cuja função é insular e proteger os nervos. É uma doença progressiva caracterizada pela desmielinização, seguida da perda neuronal e da função motora. Acredita-se também que a artrite reumatoide ("AR") é uma doença autoimune que envolve a inflamação crónica das articulações sinoviais e a infiltração por células T ativadas, macrófagos e células do plasma, levando a uma destruição progressiva da cartilagem articular. É a forma mais grave de doença das articulações. A natureza do(s) autoantigénio(s) atacado(s) na artrite reumatoide é insuficientemente entendida, embora o colagénio tipo II seja um candidato. 3

Uma tendência para desenvolver esclerose múltipla e artrite reumatoide é herdada. Estas doenças ocorrem mais frequentemente em individuos carregando um ou mais alelos da classe II do CPH característicos. Por exemplo, a suscetibilidade herdada para a artrite reumatoide está fortemente associada com os alelos DRB1 *0401, DRB 1 *0404, ou DRB 1*0405 ou DRB1*0101 da classe II do CPH. Os antigénios do lócus de histocompatibilidade (ALH) encontram-se na superfície das células e aj udam a determinar a individualidade dos tecidos de diferentes pessoas. Os genes para os antigénios do lócus de histocompatibilidade estão localizados na mesma região do cromossoma 6 tal como o complexo principal de histocompatibilidade (CPH). A região do CPH expressa um número de classes distintas de moléculas em várias células do corpo, sendo os genes, em ordem de sequência ao longo do cromossoma, os genes da Classe I, da Classe II e III do CPH. Os genes da Classe I consistem nos genes dos ALH, os quais estão adicionalmente subdivididos nas sub-regiões A, B e C. Os genes da Classe II estão subdivididos nas sub-regiões DR, DQ e DP. As moléculas CR-CPH são as melhores conhecidas; estas ocorrem nas superficies de células apresentadoras de antigénio tais como macrófagos, células dendriticas do tecido linfoide e células epidérmicas. Os produtos da Classe II do CPH são expressos em vários componentes do sistema complemento, bem como em algumas células não imunes relacionadas.

Um número de agentes terapêuticos tem sido desenvolvido para tratar doenças autoimunes, incluindo fármacos anti-inflamatórios esteroides e não esteroides, por exemplo, metotrexato; vários interferões; e certos inibidores da 4 síntese da prostaglandina. No entanto, estes agentes podem ser tóxicos quando usados durante mais do que curtos períodos de tempo ou causar efeitos secundários indesejáveis. Outros agentes terapêuticos ligam-se à e/ou inibem a atividade anti-inflamatória do fator de necrose tumoral (FNT), por exemplo anticorpos específicos anti-FNT ou fragmentos de anticorpo, ou uma forma solúvel do recetor do FNT. Estes agentes estão direcionados para uma proteína na superfície de uma célula T e previnem geralmente a interação com uma célula apresentadora de antigénio (CAA). No entanto, composições terapêuticas contendo proteínas dobradas naturais são frequentemente difíceis de produzir, formular, armazenar, e distribuir. Além disso, a heterogeneidade inata do sistema imune pode limitar a eficácia dos fármacos e complicar o tratamento a longo prazo das doenças autoimunes. 0 acetato de glatirâmero (Copolímero 1; Cop 1; em seguida copolímero de GLAT) é uma mistura de polipéptidos composta por alanina, ácido glutâmico, lisina, e tirosina numa razão molar de aproximadamente 4,6:1,5:3,6:1,0, respetivamente, o qual é sintetizado por polimerização química dos quatro aminoácidos, formando produtos com pesos moleculares médios variando entre cerca de 4.000 a cerca de 13.000 daltons. As frações molares correspondentes são aproximadamente 0,427 para a alanina, 0,141 para o ácido glutâmico, 0,337 para a lisina e 0,093 para a tirosina, e podem variar em cerca de ± 10%. Os copolímeros relacionados são misturas de polipéptidos compostos de três (logo, "terpolímeros") dos quatro aminoácidos acima mencionados. O copolímero 1 e os terpolímeros resolvem a heterogeneidade inata do sistema imune mamífero e da população humana e são eficazes para tratamento de doenças autoimunes e de outras condições 5 imunes. Gamas de pesos moleculares médios e processos de fabrico de terpolimeros preferenciais estão descritos na Patente dos E.U.A No. 5,800,808. Também contemplados pela invenção são outros copolímeros compreendidos por outras combinações de três, quatro, ou cinco ou mais aminoácidos.

Para certificar uma preparação de Copolímero 1 ou de terpolimero para uso em produtos farmacêuticos, é necessário determinar precisamente a distribuição do peso molecular dos polipéptidos na preparação. Um método para determinação do peso molecular é a cromatografia numa coluna Superose 12. Os coeficientes de calibração de colunas para determinação do peso molecular do acetato de glatirâmero têm sido determinados usando lotes de acetato de glatirâmero com pesos moleculares indiretamente medidos. As medições indiretas têm incluído a viscosimetria e a ultracentrifugação de velocidade de sedimentação. Mais recentemente têm sido preparadas lotes de marcadores do acetato de glatirâmero cujos pesos moleculares foram determinados por dispersão da luz laser por ângulos múltiplos (DLLAM).

Assim, existe uma necessidade para marcadores de peso molecular úteis como padrões para a determinação da distribuição do peso molecular de composições de copolímeros contempladas pela invenção. Marcadores de peso molecular desejáveis têm definido pesos moleculares e propriedades físicas que são análogos às moléculas para as quais o peso molecular é para ser determinado, idealmente, há uma relação linear entre os pesos moleculares definidos (ou o log dos pesos moleculares definidos) dos marcadores e uma propriedade física mensurável tal como, por exemplo, a 6 elipticidade molar dos marcadores, ou o tempo de retenção dos marcadores numa coluna de separação molecular.

Isr. J Med. Sei, 33, páginas 280-286 (1997) divulga um copolímero 1 para o tratamento da esclerose múltipla (EM) da encefalomielite alérgica experimental, um modelo animal da EM.

Resumo da invenção

Os marcadores de peso molecular definidos em sequência que têm caracteristicas quimicas e fisicas similares ao copolímero de GLAT proporcionam um conjunto de calibrações precisas e robustas para determinações do peso molecular de lotes de produção. A presente invenção proporciona derivados do copolímero de GLAT úteis como marcadores do peso molecular para a determinação das gamas de pesos moleculares das preparações do copolímero de GLAT e tendo otimamente utilidade terapêutica para o tratamento de condições imunes. A invenção proporciona adicionalmente polipéptidos tendo pesos moleculares definidos que são derivados de outros copolímeros e que são úteis para determinação das gamas de pesos moleculares desses copolímeros. Quando esses copolímeros são terapeuticamente úteis, os polipéptidos derivados têm otimamente utilidade terapêutica. Para a determinação da gama de pesos moleculares de uma preparação de copolímero de GLAT, o derivado preferencial é um polipéptido tendo uma composição de aminoácidos correspondendo aproximadamente ao copolímero de GLAT e um peso molecular identificado que está entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 40.000 daltons. O polipéptido tem preferencialmente razões molares específicas dos aminoácidos alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina. Além do mais, numa forma de realização preferencial o polipéptido tem alanina no N-terminal e 7 tirosina na quarta posição a partir do N-terminal. Para determinação do peso molecular de um terpolimero, o derivado preferencial terá um peso molecular definido e uma composição de aminoácidos correspondendo aproximadamente àquela do terpolimero. Outros copolimeros estão também contemplados pela invenção. Quando se determina o peso molecular de um copolímero contemplado pela invenção, o derivado de polipéptido terá um peso molecular definido e uma composição de aminoácidos correspondendo aproximadamente àquela do copolimero. A presente invenção proporciona adicionalmente uma pluralidade de marcadores de peso molecular para determinação do peso molecular do acetato de glatirâmero ou de um terpolimero ou outro copolimero numa coluna de separação de peso molecular. Os marcadores compreendem dois a dez ou mais polipéptidos, tendo cada polipéptido um peso molecular identificado. Quando se determina a gama dos pesos moleculares do acetato de glatirâmero, uma pluralidade de marcadores de peso molecular preferencial terá definido pesos moleculares de entre cerca de 2.000 daltons a cerca de 40.000 daltons, e composições de aminoácidos correspondendo ao acetato de glatirâmero ou a um terpolimero selecionado. Em formas de realização preferenciais há uma relação linear entre o log do peso molecular dos marcadores de peso molecular dos polipéptidos e ou o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular sobre uma coluna de separação ou entre o peso molecular dos marcadores de peso molecular e a elipticidade molar dos marcadores de peso molecular. A presente invenção também proporciona um processo para preparação de um produto farmacêutico compreendendo acetato de glatirâmero tendo um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons cujo processo compreende os passos de obtenção de uma preparação de acetato de glatirâmero; determinação do peso molecular médio da preparação de acetato de glatirâmero usando um dispositivo cromatográfico que é calibrado usando uma pluralidade de marcadores de peso molecular para estabelecer uma relação linear entre o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular no dispositivo cromatográfico e o log do peso molecular dos marcadores de peso molecular, em que cada um dos marcadores de peso molecular é um polipéptido consistindo em alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina e tendo uma sequência de aminoácidos predeterminada e peso molecular definido; e uso da preparação de acetato de glatirâmero para preparar o produto farmacêutico se a preparação de acetato de glatirâmero tiver um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons. A presente invenção também proporciona um processo de certificação do acetato de glatirâmero para uso num produto farmacêutico compreendendo acetato de glatirâmero tendo um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons cujo processo compreende os passos de determinação do peso molecular médio do acetato de glatirâmero usando um dispositivo cromatográfico que é calibrado usando uma pluralidade de marcadores de peso molecular para estabelecer uma relação linear entre o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular no dispositivo cromatográfico e o log do peso molecular dos marcadores de peso molecular, em que cada um dos marcadores de peso molecular é um polipéptido consistindo em alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina e tendo uma sequência de aminoácidos predeterminada e peso molecular definido; e 9 certificação do acetato de glatirâmero para uso no produto farmacêutico se o acetato de glatirâmero tiver um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons.

Numa ou em mais formas de realização, nos marcadores de peso molecular a fração molar de alanina é de 0,38 a 0,5, de ácido glutâmico é de 0,13 a 0,15, de tirosina é de 0,08 a 0,10 e de lisina é de 0,3 a 0,4.

Numa ou em mais formas de realização, nos marcadores de peso molecular a fração molar de alanina é de 0,422 a 0,444, de ácido glutâmico é de 0,133 a 0,143, de tirosina é de 0,086 a 0,093 e de lisina é de 0,3333 a 0,349.

Numa ou em mais formas de realização, o dispositivo cromatográfico é uma coluna de cromatografia de permeação em gel.

Numa ou em mais formas de realização, em que o dispositivo cromatográfico é uma coluna TSK, uma coluna Sephadex, uma coluna Sepharose, ou uma coluna Superose.

Numa ou em mais formas de realização, um dos marcadores de peso molecular é: (SEÔ iO NO: 1); AKiKyAKKAKAÍOíftKK&YKAAlÊAlOÇAAKYBKAAASKMAKÊAAVÊA (SEO ÍD HO: 2}: AKK.YAKKEKAYAKKãEKãAKKAÉAKãY:KA4EAKKKA£AKYKA.EMKAAAKEAAYSA pQ 10 NO; 3); ΑΥε* ίο m% 4u AKKYA&KE mmSKAEKAAKKASAKsAY KAAEAK KKM&SAK KYAKAAKAÊK KE YAAAEAK ¥K AEÃASAAAKfcMYEA Í5£$ 10 »Oi B) f 10 AKKYAK REKAYAK KAgKAAK K ΑΙ&Κ&ΥΚΑλΕΑ&Κ KAKAEAKKYAKAAHÀEKKEY&AAEA R YK AΕΛΑKKAYKA£AAKAAAK EAAYSA (SEQ ID HÔ: 65; *>* ASStYAKSÃ£líAYAKKAKAAK£KKAYAKKEAKAyKMeAKKKAKA£AKK¥AS^iAKAKK£AtK ΑδΑΚΚΥΑΚΜΗΜ3ίΚΒΥΛΛΑεΑΚ8Αε3%ΑΚΑΥ^ΛεΜΚΑ MKKMffCft «SEO XO HO: em que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina, e E representa ácido glutâmico.

Numa ou em mais formas de realização, a pluralidade dos marcadores de peso molecular é: AKKYAKKEKAAKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA íSEjQ ÍD NO: 1); AKKYAKKAKAEKAKKAYKAAEAKKAAKYEKAAAEKAAAKEAAYEA(SEQ SD NO: 2): AKKYAKKEKAYAKKAEKAAKKAEAKAYKAAEAKKKAEAKYKAEAAKAAAKEAAYEA{SEQ ÍD NO: 3);

AKKYAKKEKAYAKAKKAEAKAAKKAKAEAKKYAKAAKAEKKEYAÂAEAKYKAEAAKAAAKEA AY EA {SEQ ID NO: 4); akkyakkekayakkaekaakkaeakaykaaeakkkakaeakkyakaaraekkeyaaaeakyk AEAAKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 5) ; AKKTAKKEKAΥΑΚΚΑΕΚΑΑΚΚΑEAKAYKAAEAKKΚΑΚΑ E AKK YAKAAKAEKK EYAAAEAK¥ K AEAAKKAYKAEAAKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO; 6); - AKKYAKKAEKAYAKKAKAAKEKKAYAKKEAKAYKAAEAKKKAKAEAKKYAKEAAKAKKEAYK AEAKKYAKAAKAEKKEYAAAEAKKAEAAKAYKAEAAKA AAKEAAYEA (SEQ ID NO: Ί) , em que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina, e E representa ácido glutâmico.

Breve descrição dos desenhos A Figura la proporciona a distribuição de alanina nos marcadores moleculares (marcadores TV) descritos na 11

Tabela 1. A posição do aminoácido está definida pelo eixo dos X. A presença de uma alanina está indicada por uma barra vertical na posição de aminoácido indicada. A Figura lb proporciona a distribuição de lisina nos marcadores TV descritos na Tabela 1. A posição do aminoácido está definida pelo eixo dos X. A presença de um resíduo de lisina está indicada por uma barra vertical na posição do aminoácido indicada. A Figura lc proporciona a distribuição de ácido glutâmico nos marcadores TV descritos na Tabela 1. A posição do aminoácido está definida pelo eixo dos X. A presença de um resíduo de ácido glutâmico está indicada por uma barra vertical na posição de aminoácido indicada. A Figura ld proporciona a distribuição de tirosina nos marcadores TV descritos na Tabela 1. A posição do aminoácido está definida pelo eixo dos X. A presença de um resíduo de tirosina está indicada por uma barra vertical na posição de aminoácido indicada. A Figura 2 proporciona um gráfico da elipticidade molar versus o peso molecular dos presentes marcadores TV comparados com os marcadores de acetato de glatirâmero conhecidos. A elipticidade molar está proporcionada em 10~5 deg cm-2 drnole”1 e o peso molecular está em daltons. Os círculos indicam os marcadores TV e os quadrados representam os marcadores de acetato de glatirâmero. Como mostrado, os marcadores TV proporcionam uma relação linear entre a elipticidade molar e o peso molecular. A Figura 3a proporciona um gráfico do tempo de retenção relativo (TRR) dos presentes marcadores TV versus o log do peso molecular desses marcadores, usando o algoritmo baseado no TRR. 12 A Figura 3b proporciona um gráfico do log do peso molecular dos marcadores TV versus o tempo de retenção (TR) desses marcadores, usando o algoritmo baseado em Millennium. A Figura 4a proporciona um gráfico resumindo várias calibrações do tempo de retenção relativo (TRR) dos presentes marcadores TV versus o peso molecular desses marcadores, usando o algoritmo baseado no TRR. Os dados foram obtidos a partir de dezasseis colunas. Os valores médios para cada uma das dezasseis calibrações estão representados. A Figura 4b proporciona um gráfico resumindo várias calibrações do peso molecular dos marcadores TV versus o tempo de retenção relativo (TRR) desses marcadores, usando o algoritmo baseado em Millennium. Os dados foram obtidos a partir de dezasseis colunas. Os valores médios para cada uma das dezasseis calibrações estão representados. A Figura 5 representa a inibição da ligação do Cop 1 a anticorpos policlonais anti-Cop 1 por quatro marcadores TV e Cop 1 (03494) . A razão de absorvância indica a absorvância medida com concentração do inibidor crescente relativa à absorvância na ausência de inibição da ligação. A Figura 5 é para comparação.

Descrição detalhada da invenção

Os marcadores de peso molecular da invenção (e.g., marcadores TV) incluem polipéptidos tendo uma composição de aminoácidos correspondendo aproximadamente ao acetato de glatirâmero ou a terpolimeros relacionados, e um peso molecular identificado que está entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 40.000 daltons e são úteis para a determinação precisa do peso molecular do copolimero de 13 GLAT e terpolímeros relacionados. Segue-se a partir da exigência de um peso molecular identificado que um marcador TV deve ter um peso molecular discreto e não uma gama de pesos moleculares. Conformemente, os marcadores TV são sintetizados de acordo com uma sequência de aminoácidos predeterminada que corresponde em composição ao copolímero para o qual a gama dos pesos moleculares é para ser determinada. Otimamente, os marcadores TV têm atividade terapêutica que é similar ao copolímero correspondente. Estes marcadores podem ser usados em qualquer sistema de discriminação do tamanho molecular usando qualquer processo ou dispositivo de determinação do peso molecular disponível. Por exemplo, os presentes marcadores podem ser usados para calibração de qualquer processo ou dispositivo cromatográfico que seja usado para determinações do peso molecular de polipéptidos ou proteínas. Um tal dispositivo cromatográf ico pode ser uma coluna de separação do peso molecular que separa polipéptidos com base no seu tamanho molecular. Exemplos de colunas de separação do peso molecular incluem colunas TSK, colunas Sephadex, colunas Sepharose e colunas Superose. De modo a proporcionar marcadores de peso molecular de tamanho e composição discretos, os marcadores de peso molecular da invenção podem ser sintetizados de acordo com sequências predeterminadas por métodos que são bem conhecidos daqueles peritos na técnica.

As frases "aminoácido" e "sequência de aminoácidos" como definidas aqui e nas reivindicações podem incluir um ou mais componentes que são derivados de aminoácidos e/ou análogos de aminoácidos compreendendo parte ou a totalidade dos resíduos para qualquer um ou mais dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente indicados por essa sequência. Por 14 exemplo, numa sequência de aminoácidos tendo um ou mais resíduos de tirosina, uma porção de um ou mais desses resíduos pode ser substituída por homotirosina. Adicionalmente, uma sequência de aminoácido tendo uma ou mais ligações não peptídicas ou peptidomiméticas entre dois resíduos adjacentes está incluída nesta definição.

Os códigos de aminoácidos de uma letra e três letras (e o aminoácido que cada um representa) são como se segue: A significa ala (alanina); C significa cys (cisterna); D significa asp (ácido aspártico); E significa glu (ácido glutâmico); F significa phe (fenilalanina); G significa gly (glicina); H significa his (histidina); I significa ile (isoleucina); K significa lys (lisina); L significa leu (leucina); M significa met (metionina); N significa asn (asparagina); P significa pro (prolina); Q significa gin (glutamina); R significa arg (arginina); S significa ser (serina); T significa thr (treonina); V significa vai (valina); W significa trp (triptofano); e Y significa tyr (tirosina). 0 termo aminoácido "hidrofóbico" é definido aqui e nas reivindicações como incluindo os aminoácidos alifáticos alanina (A, ou ala), glicina G, ou gly), isoleucina (I, ou ile) , leucina (L, ou leu), prolina (P, ou pro), e valina (V, ou vai), sendo os termos entre parêntesis as abreviaturas de códigos padrão de uma letra e três letras para cada aminoácido, e os aminoácidos aromáticos triptofano (W, ou trp), fenilalanina (F, ou phe), e tirosina (Y, ou tyr) . Os aminoácidos conferem hidrofobicidade como uma função das cadeias laterais alifáticas e do tamanho das cadeias laterais aromáticas, quando encontrados como resíduos dentro de uma proteína. 15 0 termo aminoácido "carregado" é definido aqui e nas reivindicações como incluindo os aminoácidos ácido aspártico (D, ou asp), ácido glutâmico (E, ou glu) , histidina (H, ou his), arginina (R, ou arg) e lisina (K, ou lys) , que conferem uma carga positiva (his, lys e arg) ou negativa (asp e gly) a valores fisiológicos de pH em soluções aquosas em proteínas contendo estes residuos.

Composições de Polipéptidos Contempladas pela Invenção - De acordo com a presente invenção, os polipéptidos tendo pesos moleculares definidos e compreendendo três ou todos os quatro aminoácidos tirosina, ácido glutâmico, alanina e lisina são preferenciais para os marcadores presentes.

Além do mais, os marcadores de peso molecular da invenção podem ser compostos por L- ou D-aminoácidos. Como é conhecido de um perito na técnica, os L-aminoácidos ocorrem na maioria das proteinas naturais. No entanto, os D-aminoácidos estão comercialmente disponíveis e podem ser substituídos por alguns dos ou todos os aminoácidos usados para fazer os marcadores de peso molecular da invenção. A presente invenção contempla marcadores de peso molecular formados a partir de misturas de D- e L-aminoácidos, bem como marcadores de peso molecular consistindo essencialmente em ou L- ou D-aminoácidos. 0 peso molecular médio e a fração molar média dos aminoácidos nos presentes polipéptidos podem variar. No entanto, está contemplada uma gama de pesos moleculares de cerca de 2.000 a cerca de 40.000, e polipéptidos básicos, ao invés de polipéptidos ácidos, são preferenciais. 16

Numa forma de realização preferencial, a presente invenção proporciona marcadores de polipéptido contendo tirosina, alanina, ácido glutâmico e lisina em razões molares definidas. Numa forma de realização mais preferencial, a razão molar dos aminoácidos dos presentes polipéptidos é aquela encontrada no copolímero de GLAT. Uma tal correspondência nas razões molares proporciona os melhores marcadores de peso molecular porque esses marcadores terão uma carga e uma forma molecular que são similares àquelas do copolimero de GLAT. Quando são usados marcadores estruturalmente diferentes, os marcadores podem migrar ou eluir até certo grau diferentemente das preparações de copolimero de GLAT, mesmo embora essas preparações tenham o mesmo peso molecular que os marcadores.

Além do mais, numa forma de realização preferencial, a alanina está no N-terminal e a tirosina está na posição quatro a partir do N-terminal. As análises de degradação de Edman realizadas em vários lotes de acetato de glatirâmero revelaram uma maior abundância de alanina no N-terminal e de tirosina na posição quatro a partir do N-terminal. Portanto, em certas formas de realização preferenciais, os marcadores de peso molecular do copolimero de GLAT têm alanina no N-terminal e tirosina na posição quatro a partir do N-terminal. Estudos da reação de polimerização usada para sintetizar o copolimero de GLAT indicaram que a alanina e o ácido glutâmico polimerizam mais rapidamente do que a lisina. Como resultado, a porção C-terminal do copolimero de GLAT tende a ser mais rica em alanina e em ácido glutâmico, enquanto a porção N-terminal tende a ser mais rica em lisina. Em formas de realização preferenciais, a distribuição de resíduos de aminoácidos em marcadores de 17 peso molecular de copolimero de GLAT reflete esta tendência.

Quando se determina a gama dos pesos moleculares do copolimero de GLAT, um marcador de peso molecular preferencial consiste essencialmente nos aminoácidos alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina em frações molares de cerca de 0,38 a cerca de 0,50 de alanina, de cerca de 0,13 a cerca de 0,15 de ácido glutâmico, de cerca de 0,08 a cerca de 0,10 de tirosina, e de cerca de 0,3 a cerca de 0,4 de lisina.

Noutras formas de realização, a presente invenção proporciona marcadores de peso molecular contendo três dos quatro aminoácidos alanina, ácido glutâmico, tirosina, e lisina em razões definidas. Em formas de realização preferenciais, as frações molares dos aminoácidos presentes nos marcadores de peso molecular correspondem àquelas encontradas num terpolimero correspondente.

Quando o marcador de peso molecular contém alanina, ácido glutâmico e tirosina, a alanina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,600, o ácido glutâmico pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,300, e a tirosina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,250. O peso molecular é de cerca de 2.000 a cerca de 40.000 daltons, e preferencialmente de cerca de 3000 a cerca de 12.000 daltons.

Quando o marcador de peso molecular contém alanina, ácido glutâmico e lisina, a alanina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,600, o ácido 18 glutâmico pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,300, e a lisina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,2 a cerca de 0,7. O peso molecular é entre cerca de 2.000 e cerca de 40.000 daltons, e preferencialmente entre cerca de 3000 e cerca de 12.000 daltons.

Quando o marcador de peso molecular contém alanina, tirosina e lisina, a alanina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,3 a cerca de 0,6, a tirosina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,250, e a lisina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,1 a cerca de 0,5. O peso molecular é entre cerca de 2.000 e cerca de 40.000 daltons, e preferencialmente entre cerca de 3000 e cerca de 12.000 daltons.

Quando o marcador de peso molecular contém ácido glutâmico, tirosina e lisina, o ácido glutâmico pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,300, a tirosina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,005 a cerca de 0,250, e a lisina pode estar presente numa fração molar de cerca de 0,3 a cerca de 0,7. O peso molecular é entre cerca de 2.000 e cerca de 40.000 daltons, e preferencialmente entre cerca de 3000 e cerca de 12.000 daltons.

Os polipéptidos da invenção podem ser usados para determinações da gama de pesos moleculares de outros copolimeros contemplados pela invenção. Os copolímeros contemplados podem consistir em combinações de três, quatro, ou cinco ou mais aminoácidos. Em geral, de modo a determinar a gama de pesos moleculares de um copolimero 19 contemplado pela invenção, o marcador de peso molecular de polipéptido terá um peso molecular definido e uma composição de aminoácidos correspondendo aproximadamente àquela do copolimero. Será aparente para um perito da técnica que qualquer tendência na distribuição dos aminoácidos num copolimero pode ser determinada como descrito acima para o copolimero de GLAT. Por exemplo, as quantidades relativas de aminoácidos incorporadas em cada posição de uma população de terpolimero podem ser obtidas pela análise dos produtos de cada passo de uma degradação de Edman. Alternativamente, as proporções de aminoácidos incorporadas numa população de terpolimero durante a sintese podem ser monitorizadas. Onde aplicável, os marcadores de peso molecular podem então ser sintetizados o que reflete a tendência. Adicionalmente, certos marcadores de peso molecular de terpolimero preferenciais terão alanina ou tirosina na posição quatro.

Exemplos de sequências de marcadores de peso molecular de polipéptidos preferenciais em questão são dadas na Tabela 1 (SEQ ID NOS: 1-7) usando os códigos de aminoácidos de letra simples convencionais e lendo a partir do N-terminal para o C-terminal. As sete sequências indicadas são preparações individuais de polipéptidos tendo uma composição de aminoácidos correspondendo ao acetato de glatirâmero. Usualmente, os aminoácidos compreendendo um marcador de peso molecular são predominantemente de uma configuração (configuração D ou L) . Em formas de realização preferenciais, uma molécula de marcador de peso molecular é composta inteiramente de aminoácidos da mesma configuração. No entanto, moléculas de marcador de peso molecular compreendendo aminoácidos de configuração mista podem ser preferenciais em certas formas de realização onde o peso 20 molecular está ser determinado para uma preparação de acetato de glatirâmero compreendendo aminoácidos de configuração mista.

Tabela 1. Sequências de aminoácidos de marcadores TV selecionados

SEQ ID NO Sequência 1 AKKYAKKEKÂAKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA 2 akkyak^kaekakkaykaaêakkaakyêkaaaêkaaake** AÂYEA 3 AKKYA7CKEKAYAKKAEKAAKKA£AKAVKAAcAICKKA£AKY- KAEAAKAAAKEAAYE* 4 AKKYAKKEKAYAKAKKAEAKAAKKAKAeAKKYAKAAKAEK- ΚΓ^ΑΑΑ£ΑΚΥΚΑΕΑΑΚΑΑΑΚΕΑΑΥΞΛ 5 AKKYAIO<EKAYAKKAEKAAKKAEAKAYKAAEAKKKAKA£A* KKYAKAAKAEKKEYAAAEAKYKAcAAKAAAKãAAYEA 6 ΑΚΚΥΑΚΚΗΚΑΥΑΚΚΑΕΚΑΑΚΚΑΞΑΚΑΥΚΑΑΕΑΚΚΚΑΚΑΕΑ- KKYAKAAKASKKSYAAAEAKYKAE.AAKKAYKAEAAKAAAK- eaayea 7 AKKYAKKA.EKAYAKKAKAAKÊKK,AYAKKEAKAYKAA£AKX- ΚΑΚΑΞΑΚΚΥΑΚΕΑΑΚΑΚΚΕΑΥΚΑΞΑΚΚΥΑΚΑΑΚΑΕΚΚΕΥΑ- AASAKKAEAAKAYKAEAAKAAAKEMYãA

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma pluralidade de marcadores de peso molecular para determinação do peso molecular do acetato de glatirâmero ou de um terpolimero numa coluna de separação de pesos moleculares. A pluralidade de marcadores de peso molecular é polipéptidos. A pluralidade de marcadores pode ser de dois a cerca de dez ou mais. Numa forma de realização preferencial, a pluralidade de marcadores é de sete. Cada polipéptido tem um peso molecular identificado que está entre cerca de 2.000 daltons e cerca de 40.000 daltons, e uma composição de aminoácidos que corresponde 21 aproximadamente àquela do acetato de glatirâmero ou de um terpolímero.

Quando é usada uma tal pluralidade de marcadores de peso molecular como padrão para a determinação do peso molecular do acetato de glatirâmero ou um de terpolímero, existe uma relação que é aproximadamente linear entre o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular na coluna cromatográfica e o log do peso molecular. A pluralidade de marcadores é usada quando é suficiente para estabelecer a relação aproximadamente linear, embora se possam usar mais. A Fig. 3 mostra a relação aproximadamente linear entre o tempo de retenção relativo e o log do peso molecular para os marcadores TV da invenção.

Noutra forma de realização, existe uma relação aproximadamente linear entre a elipticidade molar dos marcadores de peso molecular e o peso molecular dos marcadores. Quando se determina o peso molecular de uma preparação de acetato de glatirâmero por elipticidade molar, é usada uma pluralidade de marcadores que é suficiente para estabelecer a relação aproximadamente linear, embora se possam empregar mais. 0 peso molecular do acetato de glatirâmero ou da preparação de terpolímero é então obtido com base na relação linear. A Fig. 2 mostra a relação aproximadamente linear entre a elipticidade molar e o peso molecular para os marcadores TV da invenção.

Os exemplos que se seguem descrevem a invenção em detalhe no que diz respeito a mostrar como certas suas formas de realização representativas específicas podem ser feitas, sendo os materiais, dispositivo e passos do processo 22 entendidos como exemplos que se destinam a ser apenas ilustrativos.

Ao longo desta aplicação, várias publicações, patentes, e aplicações de patentes têm sido referidas. Os ensinamentos e divulgações destas publicações, patentes, e aplicações de patentes nas suas totalidades descrevem mais completamente o estado da técnica à qual a presente invenção pertence.

Os seguintes exemplos ilustram adicionalmente a invenção. EXEMPLO 1

Propriedades Físicas dos marcadores TV Síntese da fase sólida

Prepararam-se sete marcadores de peso molecular com pesos moleculares variando de cerca de 3700-12 000 daltons no laboratório do Prof. M. Fridkin (Weizman Institute of Science) (Tabela 2) . Estes marcadores são referidos como marcadores TV. Aos péptidos individuais foi atribuído o nome TV ##, onde ## é o número de resíduos de aminoácidos (e.g. TV-35 é o marcador 35-mêro) . A composição de aminoácidos destes marcadores reúne as especificações do acetato de glatirâmero (Tabela 2).

Tabela 2 TV-35 - Péptido com um peso molecular = 3757 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 15 5 3 12 Fração molar 0,429 0,143 0,086 0,343 23 (continuação) TV-45 - Péptido com um peso molecular = 4790 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 20 5 4 15 Fração molar 0,444 0,133 0,089 0,333 TV-56 - Péptido com um peso molecular = 6008 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 24 8 5 129 Fração molar 0,429 0,143 0,089 0,339 TV-65 - Péptido com um peso molecular = 7040 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 29 9 6 22 Fração molar 0,439 0,136 0,091 0,333 TV-77 - Péptido com um peso molecular = 8259 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 33 11 7 25 Fração molar 0,429 0,143 0,091 0,338 TV-85 - Péptido com um peso molecular = 9220 daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 37 12 8 29 Fração molar 0,430 0,140 0,0893 0,3437 TV-109 - Péptido com um peso molecular = 11727 ' daltons Ala Glu Tyr Lys Número de resíduos 46 15 10 38 Fração molar 0,422 0,138 0,092 0,349

As Figuras la, lb, lc e ld proporcionam a distribuição de alanina, de lisina, de ácido glutâmico e de tirosina, respetivamente, nos marcadores TV descritos na Tabela 2. A posição do aminoácido é definida pelo eixo dos X, com o primeiro aminoácido correspondendo à posição C-terminal. A presença de um aminoácido é indicada por uma barra vertical na posição de aminoácido indicada. 24

Confirmação da massa e da sequência

Espetroscopia de Massa - As amostras de polipéptidos foram analisadas imediatamente após a sua síntese usando um espetrofotómetro de massa de plataforma VG equipado com uma fonte de iões de pulverização de eletrões. Vários meses mais tarde a análise foi repetida na TEVA usando um espetrofotómetro de massa PE-Sciex AP1300 equipado com uma fonte de iões de pulverização de eletrões (Tabela 3, primeira preparação). Estes resultados indicam que cada marcador TV de polipéptido tem um componente principal único com a massa molecular pretendida.

Tabela 3. Espetroscopia de Massa de Polipéptidos definidos como Sequência

Polipéptido Massa molecular designada (daltons) Massa molecular determinada -primeira preparação (daltons) Massa molecular determinada -segunda preparação (daltons) TV-3 5 3757 3757 3757 TV-4 5 4790 4790 4790 TV-5 6 6008 6008 6008 TV-6 6 7040 7041 7040 TV-7 7 8259 8259 8259 TV-8 6 9220 9220 9220 TV-109* 11727 11728 11727 *0 109-mêro foi adicionalmente purificado por fracionamento numa coluna de fase inversa. Foram recolhidas três frações e a fração número 2 foi designada para propósitos de calibração e referida como TV-109.

Um segundo lote de marcadores foi preparado. A

espetroscopia de massa confirmou que os polipéptidos da segunda preparação eram idênticos aos polipéptidos da primeira preparação (Tabela 3, segunda preparação). A 25 similaridade entre as duas preparações foi também confirmada por cromatografia em Superose 12. Cada um dos marcadores eluiu com um pico pronunciado a um tempo de retenção distinto, não obstante o lote analisado. Consequentemente, os marcadores TV da presente invenção podem ser sintetizados com massa reprodutível.

Degradação de Edman - A sequência pretendida dos polipéptidos foi confirmada pela análise da degradação de Edman da primeira preparação.

Caracterização dos polipéptidos

Dicroismo Circular- A similaridade estrutural entre os marcadores de peso molecular e o acetato de glatirâmero é um pré-requisito para uma calibração apropriada de uma coluna de separação molecular. As diferenças na estrutura dos polipéptidos podem resultar em diferente tamanho hidrodinâmico e consequentemente em tempo de retenção alterado no sistema cromatográfico. A elipticidade, determinada por dicroismo circular, serve como uma medida da estrutura secundária de um polipéptido. Quando a elipticidade dos marcadores de peso molecular e do acetato de glatirâmero é similar, as estruturas dos dois serão similares. A elipticidade molar dos polipéptidos foi determinada num espetrofotómetro de DC Jobin-Yvon. A Figura 2 e a Tabela 4 mostram que a extensão da elipticidade molar se correlacionou com o peso molecular do polipéptido. 0 péptido mais pequeno exibiu o valor de elipticidade mais baixo. A elipticidade molar dos novos marcadores foi da mesma ordem de grandeza do que aquelas dos marcadores de 26 peso molecular de acetato de glatirâmero usados correntemente. Note-se que enquanto o peso molecular exato para os marcadores TV foi representado graficamente, a média em número para o peso molecular do acetato de glatirâmero foi usado no gráfico.

Assim, os novos marcadores e o acetato de glatirâmero possuem estruturas semelhantes e são portanto adequados para uso como marcadores de peso molecular para novas preparações de acetato de glatirâmero.

Tabela 4. Elipticidade Molecular

Marcador do PM PM (daltons) Elip-m (210 nm) Marcadores TV TV-3 5 3757 -1,5367 TV-4 5 4790 -2,1651 TV-5 6 6008 -3,9658 TV-6 6 7040 -3,5172 TV-7 7 8259 -4,8365 TV-8 6 9220 -5,4546 TV-109 11727 -6,818 acetato de glatirâmero BD 743 3700 -2,0186 BD 714 5600 -4,4182 BD 681 6600 -5,2019 BD 577 7000 -6,0153 56895 8000 -6,9062 90995 8500 -9,1736 BD 655 8900 -8,8576

Estes dados analíticos indicam que os polipéptidos de marcador TV sintetizados exibem um grau substancial de similaridade em relação aos marcadores de peso molecular do acetato de glatirâmero usados correntemente. 0 conteúdo de aminoácido está dentro das especificações do acetato de 27 glatirâmero. Os novos polipéptidos e os marcadores de peso molecular do acetato de glatirâmero têm estrutura secundária similar, expressa como elipticidade molar. Consequentemente espera-se que os marcadores TV migrem ou eluam num sistema cromatográfico com permeação em gel (CPG) , tal como Superose 12, como uma preparação de acetato de glatirâmero.

Exemplo 2

Calibração da Coluna de Superose 12 com marcadores TV

Espera-se que os marcadores TV e a preparação de acetato de glatirâmero demonstrem uma correlação similar entre o tempo de retenção relativo (TRR) e o log do peso molecular. Os marcadores TV foram cromatografados em várias colunas Superose 12. 0 pico do tempo de retenção para cada um dos polipéptidos foi registado. A correlação linear entre o Log do Peso Molecular (PM) e o Tempo de Retenção Relativo (TRR) foi calculado como se segue: TRR = BI + B2 x logPM (ver Fig. 3a e Tabela 5). 0 sistema de aquisição de dados baseado em Millennium recentemente introduzido (Waters Corp., Milford, MA) proporciona a calibração integrada de colunas GPC. 0 algoritmo para a calibração é baseado no tempo de retenção e é dado pela equação:

Log PM = A + B x TR ou PM = 10(A + B x TR> onde PM é o peso molecular, TR é o tempo de retenção, A e B, respetivamente, são o limite e o declive da função de regressão calculada (Fig. 3b, Tabela 5). 28

Os resultados obtidos por este algoritmo são praticamente idênticos àqueles obtidos com o algoritmo correntemente aplicado, baseado no TRR. Na tentativa de automatizar procedimentos, o sistema de aquisição de dados com base Millennium foi empregue para realizar a calibração usando os marcadores TV. Os métodos analiticos foram atualizados conformemente.

Obteve-se uma boa correlação (r2 > 0,98) entre o log PM e o TRR, embora os pontos não se distribuam uniformemente à volta da linha de regressão. Esta distribuição é devida às diferenças na elipticidade dos vários marcadores, como é também observado para o acetato de glatirâmero. O marcador de baixo peso molecular de alguma maneira afastado da linearidade não pode ser excluído porque a regressão tem de abranger valores abaixo de 2500 daltons para o primeiro parâmetro de distribuição de desvio padrão (+ 1 DP). Isto é um traço geral de todos os péptidos mais pequenos - eles são menos helicoidais e mais lineares.

Para a calibração baseada nos marcadores de peso molecular do acetato de glatirâmero, o limite (Bl) e o declive (B2) foram, respetivamente, 1,7415 e -0,2784. Isto compara-se favoravelmente com os valores de calibração obtidos para os marcadores TV (Bl = 1,6996; B2 = - 0.2705). Os pesos moleculares obtidos usando os dois conjuntos de calibração dentro da gama de especificação diferiram em, tipicamente, não mais do que 20% na gama de pesos moleculares baixos e em não mais do que 12% na gama de especificação do TRR do pico (peso molecular médio). Esta diferença relativamente pequena apoia a reivindicação de que estes marcadores podem substituir os marcadores de peso molecular de acetato de 29 glatirâmero usados correntemente sem mudança significativa nos valores de peso molecular registados.

Tabela 5a. Calibração por marcadores PM do acetato de glatirâmero

Marcador PM LOG PM PICO TR TRR* TV-3 5 3757 3,575 28,97 0,728 TV-4 5 4790 3, 68 27,96 0,703 TV-5 6 6008 3,779 27,12 0,682 TV-6 6 7040 3, 848 26,32 0,662 TV-7 7 8259 3, 917 25, 56 0,643 TV-8 6 9220 3, 965 24,93 0,627 TV-109 11727 4,069 23, 57 0,593 INTERSEÇÃO * *A 6,2516 * * *B1 1,6996 DECLIVE B -0,0918 B -0,2705 r2 0,9927 -0,9923 *TRR = TR/TRAcetona **calculado de acordo com a equação Millenium: log PM = A + B x TR ***calculado de acordo com a equação: TRR = Bi + B2 x log PM A calibração com base em marcadores TV foi comparada com a calibração com base nos marcadores de peso molecular de acetato de glatirâmero (Tabela 5b) . As duas calibrações foram comparadas pelo cálculo dos valores de peso molecular para cada conjunto de calibração na gama do TRR de 0,5 a 0,8. O conjunto de calibrações dos marcadores TV incluiu uma fração de TV-109 que foi purificado por cromatografia de fase inversa antes do uso para a calibração da coluna.

Tabela 5b. Calibração da coluna por marcadores TV TRR TR* (min) Ac. Glatir. (PM1) TV (0,1) (PMm) Diferença (PMm - PM1) Daltons Daltons Daltons o o 0, 5 19,89 28800 26700 -2100 -7,3% 0,51 20,28 26500 24500 -2000 -7,5% 0,52 20, 68 24400 22600 -1800 -7,4% 30 TRR TR* (min) Ac. Glatir. (PM1) TV (0,1) (PMm) Diferença (PMm - PMl) Daltons Daltons Daltons o o 0,53 21,08 22500 20700 -1800 -8,0% 0,54 21,48 20700 19100 -1000 -7,7% 0,55 21,87 19000 17500 -1500 -7, 9% 0,56 22,27 17500 16100 -1400 -8,0% 0,57 22,67 16100 41800 -1300 -8,1% 0,58 23,07 14900 13600 -1300 -8, 7% 0,59 23,46 13700 12500 -1200 -8, 8% 0, 6 23,85 12600 11500 -1100 -8, 7% 0,61 24,26 11600 10600 -1000 -8, 7% 0,62 24,66 10700 9700 -1000 -9, 3% 0,63 25,06 9800 9000 -800 -8,2% 0,64 25,45 9000 8200 -800 -8, 9% 0,65 25,85 8300 7600 -700 -8,4% 0,66 26,25 7700 7000 -700 -9,1% 0,67 25,65 7100 6400 -700 -9, 9% 0,68 27,04 6600 6900 -600 -9, 2% 0,69 27,44 6000 5400 -600 -10,0% 0,70 27,84 5500 5000 -500 -9,1% 0,71 28,24 5100 4600 -500 -9, 8% 0,72 28,63 4700 4200 -500 -10,6% 0,73 29,03 4300 3900 -400 -9,3% 0,74 29, 43 4000 3600 -400 -10,0% 0,75 29, 63 3600 3300 -300 -8,3% 0,76 30,23 3400 3000 -400 -11,8% 0,77 30,62 3100 2800 -300 -9, 7% 0,78 31,02 2800 2500 -300 -10,7% 0,79 31,42 2600 2300 -300 -11,5% 0,80 31,82 2400 2100 -300 -12,5%

Pureza dos marcadores TV - Três dos marcadores (TV-66, TV-77 e TV-86) foram adicionalmente purificados por cromatografia de fase inversa. Foram obtidas três frações para cada marcador. A fração intermédia contendo a maior 31 porção do pico foi cromatografada no sistema Superose 12 em comparação com os marcadores não fracionados (Tabela 6). Os marcadores TV foram cromatografados de acordo com o tamanho sem purificação (Regular) e após purificação por cromatografia de fase inversa (Purificado). Os tempos de retenção do pico foram determinados e as diferenças foram calculadas. 0 tempo de retenção do pico não foi afetado pelo grau de pureza. Portanto, o produto final da síntese é útil para a calibração precisa e não é necessária purificação extra.

Tabela 6. Efeito da Purificação no Tempo de Retenção

Marcador TV Tempo de Retenção (TR) (min) Diferença (%) Regular Purificado TV-6 6 26,200 26,233 -0,13% TV-7 7 25,450 25,450 0,00% TV-8 6 24,867 24,850 0,07%

Consistência nos valores registados (Validação cruzada) -

Seis lotes de acetato de glatirâmero, manufaturado em 1993 e 1994, foram reanalisados por CPG calibrada com os marcadores TV. Os seus pesos moleculares médios e a distribuição do peso molecular foram comparados com os valores registados ao tempo da sua libertação. A Tabela 7 mostra uma comparação dos dados de peso molecular do certificado original de análise e dos dados do peso molecular obtidos usando uma coluna Superose 12 calibrada com marcadores TV. As diferenças nos valores registados são tipicamente menores do que 10%. 32

Tabela 7. Comparação das Determinações de Peso Molecular

Preparação de Cop 1 PM Millenium PM CoA % diferença 00193 média 10250 9900 -3, 5% -1 DP 20950 19100 -9, 7% + 1 DP 51000 4800 -6, 2% 00594 média 6700 6550 -2,3% -1 DP 15700 15100 -4,0% + 1 DP 3600 3400 -5, 9% 00993 média 9200 8600 -7,0% -1 DP 18500 17350 -6, 9% + 1 DP 4700 4400 -6, 8% 04194 média 6100 6150 0,8% -1 DP 12600 12500 -0,8% + 1 DP 3200 3200 0,0% 01793 média 8800 3300 -6,0% -1 DP 18100 17300 -4,6% + 1 DP 5200 4750 -9, 5% 05494 média 8100 8300 2,4% -1 DP 17800 17450 -2,0% + 1 DP 4100 4100 0,0%

Estabilidade dos marcadores em solução - Os marcadores TV foram cromatografados quatro vezes ao longo de um período de 24 horas. Todos os marcadores foram conservados como soluções à temperatura ambiente e foram analisados em intervalos de 8 horas. A Tabela 8 mostra o tempo de retenção do pico medido para os marcadores TV em cada um dos quatro pontos do tempo. A uma concentração de 0,1 mg/mL, os marcadores TV foram estáveis em solução durante pelo menos 24 horas à temperatura ambiente. 33Tabela 8. Estabilidade dos marcadores TV em solução àtemperatura ambiente

Tempo de Retenção do Pico (min) Média DPR TV-3 5 29,883 29,883 29,900 29,950 29,904 0,106% TV-4 5 28,933 28,917 28,917 28,933 28,925 0,032% TV-5 6 28,250 28,217 28,283 28,250 28,250 0,095% TV-6 6 57,400 27,350 27,433 27,433 27,404 0,143% TV-7 7 26,750 26,700 26,750 26,783 26,746 0,128% TV-8 6 26,117 26,100 26,150 26,150 26,129 0,095% TV-109Fr-ll 24,783 24,850 24,883 24,850 24,842 0,169%

Adicionalmente, as soluções dos marcadores foram armazenadas durante até 3 meses 1/2 sob várias condições de armazenamento (2-8°C, -10 a 20°C, com/sem azida). Os marcadores TV são estáveis durante pelo menos 3 meses quando armazenados como soluções congeladas (Tabela 9) . Como precaução foi decidido permitir o armazenamento de soluções congeladas durante dois meses.

Os marcadores TV liofilizados são estáveis durante pelo menos dois anos de acordo com os dados de estabilidade acumulados. 3. 9. Estabilidade dos marcadores TV c Le -10° a Data da calibração: 22-maio-97 09-jul-97 04-set-97 Intervalo (dias): - 48 105 Marcador PM TR TR TR TV-3 5 3757 28,857 28,867 28,957 TV-4 5 4790 27,833 27,917 27,950 TV-5 6 6008 27,076 27,133 27,100 TV-6 6 7040 26,233 26,317 26,300 TV-7 7 8259 25,467 25,617 25,550 TV-8 6 9220 24,883 25,017 24,950 TV-109 11727 23,500 23,650 23,583 34

Resumo dos dados de calibração - Globalmente, os marcadores TV foram analisados 53 vezes em dois laboratórios. Um resumo dos dados é apresentado na Fig. 4 e na Tabela 10. As diferenças observadas entre as operações individuais (Fig. 4) refletem variações entre colunas ao invés de diferenças entre os laboratórios participantes. Isto é indicado na Fig. 4 através do uso de diferentes símbolos para algumas das operações. As constantes de calibração na Tabela 10 foram calculadas usando a equação Millennium para dados obtidos para 53 conjuntos de calibração injetados em 16 colunas.

Tabela 10. Constantes de calibração obtidas nos Labs

Plantex e Abic TR TR Marcador PM Média DP DPR% Min Máx Média -DP Média + DP TV-3 5 3757 29, 69 0,463 1,6% 28, 85 30,35 28,30 31,08 TV-4 5 4790 28,72 0,481 1,7% 27, 88 29,40 27,28 30,16 TV-5 6 6008 27,99 0,520 1,9% 27,08 28,77 26,43 29, 55 TV-6 6 7040 27,19 0,525 1,9% 26, 26 27,96 25, 61 23, 77 TV-7 7 8259 26,49 0,550 2,1% 25, 51 27,33 24,84 28,14 TV-8 6 9220 25, 89 0,556 2,1% 24,89 26, 72 24,22 27,56 TV-109 11727 24,56 0,557 2,3% 23, 53 25, 41 22,89 26,23 Interseção (A) 6,4706 0,1220 1,9% 6,2561 6,6500 6,1046 6,8366 Declive (B) -0,0969 0,0032 -3,3% -0,1014 -0,0919 -0,1064 -0,0873 2 R 0,9901 0,0022 0,2% 0,9868 0,9328 0,9836 0,9967

Distribuição do peso molecular de uma preparação de acetato de glatirâmero - 0 peso molecular foi determinado para um lote de acetato de glatirâmero (BN 90995) . A Tabela 11 resume os dados obtidos de 16 determinações em colunas calibradas com marcador TV. 35

Tabela 11a. TR do acetato de glatirâmero (BN 90995) Média DP DPR% Pico 26,208 0,434 1,66 -2 DP (2,5%) 19,865 0,528 2,66 -1 DP (16%) 22,578 0,477 2,11 +1 DP (84%) 28,934 0,324 1,12

Tabela 11b. TRR do acetato de glatirâmero (BN 90995) Média DP DPR% Pico 0,664 0,014 2,09 -2 DP (2,5%) 0,503 0,016 3, 09 -1 DP (16%) 0, 572 0,015 2, 54 +1 DP (84%) 0, 733 0,011 1, 53

Tabela 11c. PM (Daltons) do acetato de glatirâmero (BN 90995) Média DP DPR% Pico 7459 146 1,95 -1 DP (16%) 16622 466 2,80 +1 DP (84%) 4089 77 1,89 A aplicação de um peso molecular e de um conjunto de marcadores definido por sequência para a calibração da coluna Superose 12 tem várias vantagens sobre os marcadores de peso molecular de acetato de glatirâmero correntemente usados.

Primeiramente, o uso de síntese da fase sólida assegura a consistência entre as várias preparações de cada lote. Os resultados da espetroscopia de Massa (Tabela 3) confirmaram a reprodutibilidade da síntese. Esta consistência proporciona precisão melhorada nas determinações do peso molecular. 36

Em segundo lugar, a calibração corrente é baseada na determinação do TRR a 50% da área do pico para cada um dos marcadores de peso molecular do acetato de glatirâmero. Os novos marcadores eluem como picos pronunciados. O seu uso em calibração é mais preciso do que o tempo de retenção calculado a 50% da área de um pico largo.

Em terceiro lugar, o uso de marcadores tendo pesos moleculares definidos pela sequência predeterminada evita qualquer incerteza que possa acompanhar o uso de marcadores cujo peso molecular é determinado pela medição inexata de propriedades físicas.

Em quarto lugar, o procedimento de calibração facilita a normalização de colunas para determinações de peso molecular, não obstante as mudanças menores entre os lotes de colunas, idade ou instrumentação.

Lista de sequências <110> YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO., LTD.

<120> POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS COM COPOLÍMEROS 1 PARA USO COMO MARCADORES DE PESO MOLECULAR E PARA USO TERAPÊUTICO <130> P1594 EP/2 S3 <140> <141> 1999-09-24 <150> EUA 60/101,693 <151> 1998-09-25 37 < 16 Ο > 7 <17Ο> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> (1)..(35) <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Péptido sintético" <4 0 0> 1

Ala 1 Lys Lys Tyr Ala 5 Lys Lys Glu Lys Ala 10 Ala Lys *Lys Ala Tyr 15 Lys Lys Ala Lys 20 Ala Lys AÍ.& Ala Glu 25 Ala Ala Ala Lys Glu 30 Ala Ala

Tyr Glu Ala 35

<210> 2 <211> 45 <212> PRT

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> LO \—1 38 <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 2

Ala 1 Lys Lys Tyr Ala 5 Lys Lys Ala Lys Ala 10 Glu Lys Ala Lys Lys 15 Ala Tyr Lys Ala Ala 20 Glu Ala Lys Lys Ala 25 Alâ Lys Tyr Glu Lys 30 Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Tyr Glu Ala 35 40 45

<210> 3 <211> 56 <212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> (1)..(56) <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 3

Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Lys Ala Glu 1 5 10 15

Lys Ala Ala Lys Lys Ala Glu Ala Lys Ala Tyr Lys Ala Ala Glu Ala 20 25 30

Lys Lys Lys Ala Glu Ala Lys Tyr Lys Ala Glu Ala Ala Lys Ala Ala 35 40 45

Ala Lys Glu Ala Ala Tyr Glu Ala 50 55 <210> 4 <211> 66 39

<212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> (1)..(66) <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 4

Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Ala Lys Lys 1 5 10 15 Ala Glu Ala Lys Ala Ala Lys Lys Ala Lys Ala Glu Ala Lys Lys Tyr 20 25 30 Ala Lys Ala Ala Lys Ala Glu Lys Lys Glu Tyr Ala Ala Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Tyr Lys Ala Glu Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Tyr 50 55 60

Glu Ala 65

<210> 5 <211> 77 <212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> (1) . . (77) <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 5 40

Ala 1 Lys Lys Tyr Ala 5 Lys Lys Glu Lys Ala 10 Tyr Ala Lys Lys Ala 15 Glu Lys Ala Ala Lys 20 Lys Ala Glu Ala Lys 25 Ala Tyr Lys Ala Ala 30 Glu Ala Lys Lys Lys 35 Ala Lys Ala Glu Ala 40 Lys Lys Tyr Ala Lys 45 Ala Ala Lys Ala Glu 50 Lys Lys Glu Tyr Ala 55 Ala Ala Glu Ala Lys 60 Tyr Lys Ala Glu Ala 65 Ala Lys Ale Ala Ala 70 Lys Glu Ala Ala Tyr 75 Glu Ala

<210> 6 <211> 86 <212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <220> <221> Fonte <222> (1)..(86) <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 6

Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Glu 1 5 Lys Ala Ala Lys Lys Ala Glu Ala 20 Lys Lys Lys Ala Lys Ala Glu Ala 35 40

Ala Glu Lys Lys Glu Tyr Ala Ala 50 55

Ala Ala Lys Lys Ala Tyr Lys Ala 65 70

Lys Ala 10 Tyr Ala Lys Lys Ala 15 Glu Lys 25 Ala Tyr Lys Ala Ala 30 Glu Ala Lys Lys Tyr Ala Lys 45 Ala Ala Lys Ala Glu Ala Lys 60 Tyr Lys Ala Glu Glu Ala Ala 75 Lys Ala Ala Ala Lys 80

Glu Ala Ala Tyr Glu Ala 85 41

<210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <221> Fonte <222> (1) .. (109) <223> /nota= "Descrição da sequência artificial: péptido sintético" <400> 7

Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Lys Ala Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Lys Ala 1 5 10 15 Lys Alâ Ala Lys Glu Lys Lys Ala Tyr Ala Lys Lys Glu Ala Lys Ala 20 25 30 Tyr Lys Ala AI a Glu Ala Lys Lys Lys Ala Lys Ala Glu Ala Lys Lys 35 40 45 Tyr Ala Lys Glu Ala Ala Lys Ala Lys Lys Glu Ala Tyr Lys Ala Glu 50 55 60 Ala Lys Lys Tyr Ala Lys Ala Ala Lys Ala Glu Lys Lys Glu Tyr Ala 65 . 70 75 80 Ala Ala Glu Ala Lys Lys Ala Glu Ala Ala Lys Ala Tyr Lys Ala Glu 85 90 95 Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Tyr Glu Ala 100 105

Lisboa, 03 de Abril de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparação de um produto farmacêutico compreendendo acetato de glatirâmero tendo um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons cujo processo compreende os passos de obtenção de uma preparação de acetato de glatirâmero; determinação do peso molecular médio da preparação de acetato de glatirâmero usando um dispositivo cromatográfico que é calibrado usando uma pluralidade de marcadores de peso molecular para estabelecer uma relação linear entre o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular no dispositivo cromatográfico e o log do peso molecular dos marcadores de peso molecular, em que cada um dos marcadores de peso molecular é um polipéptido consistindo em alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina e tendo uma sequência de aminoácidos predeterminada e peso molecular definido; e uso da preparação de acetato de glatirâmero para preparar o produto farmacêutico se a preparação de acetato de glatirâmero tiver um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons.

2. Um processo para certificação do acetato de glatirâmero para uso num produto farmacêutico compreendendo acetato de glatirâmero tendo um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons cujo processo compreende os passos de determinação do peso molecular médio do acetato de glatirâmero usando um dispositivo cromatográfico que é calibrado usando uma pluralidade de marcadores de peso molecular para estabelecer uma relação linear entre o tempo de retenção dos marcadores de peso molecular no dispositivo cromatográfico e o log do peso molecular 2 dos marcadores de peso molecular, em que cada um dos marcadores de peso molecular é um polipéptido consistindo em alanina, ácido glutâmico, tirosina e lisina e tendo uma sequência de aminoácidos predeterminada e peso molecular definido; e certificação do acetato de glatirâmero para uso no produto farmacêutico se o acetato de glatirâmero tiver um peso molecular médio de 4.000 a 13.000 Daltons.

3. 0 processo da reivindicação 1 ou 2, em que nos marcadores de peso molecular a fração molar de alanina é de 0,38 a 0,5, de ácido glutâmico é de 0,13 a 0,15, de tirosina é de 0,08 a 0,10 e de lisina é de 0,3 a 0,4.

4. O processo de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que nos marcadores de peso molecular a fração molar de alanina é de 0,422 a 0,444, de ácido glutâmico é de 0,133 a 0,143, de tirosina é de 0,086 a 0,093 e de lisina é de 0,3333 a 0,349.

5. O processo de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o dispositivo cromatográfico é uma coluna de cromatografia de permeação em gel.

6. O processo de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o dispositivo cromatográfico é uma coluna TSK, uma coluna Sephadex, uma coluna Sepharose, ou uma coluna Superose.

7. O processo de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que um dos marcadores de peso molecular é: 3 AKKYAKKEKAÂKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: í}; AKKYAKKAKAEKAKKAYAAEAKKAAKYEi^AAEKAAAKEAAYEA {SEQ IO NO: 2); akxyaíckjekayakkaekaajckaeaicavkaaeakkkaeakykaeaajcaaa KEAAYEAÇSEQ ID NO: 3); AKK Y AKKEKA Y AKAKKAEAKAAKKAKAE AKK Y AKAAKAÊKLiCE Y AAAE AK YKAEAAKAAAKJEAAYEA (SEQ ID NO: 4); ΑΚΚΥΑΚΧΕΚΑΥΑΚΚΑΕΚΑΑΚΚΑΕΑΚΑΥΚΑΑΕΑΚΚΚΑΚΑΕΑΚΙΚΥΑΚΑΑΚΑ EKKEYAAAEAKYKAEAAKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 5); akk yakkekay akkxekaakkaeakaykaaeakkkaklaeakkyakaaka EKJCÊYAAAEAKYKAEAAKKAYKAEAAKAAAKEAAYEA (SEQ ID NO: 6); ou AKK YAKKAEKA YAKKAKAAKEKKA Y AKKEAICAYíCAAEAKJOCAKAEAIUCY akeaakakkeaykaeakkyakaakaekkeyaaaeakkaeaakaykaeaak A AAKEAA YEA (SEQ ΓΟ NO: 7), em que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina, e E representa ácido glutâmico.

8. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que a pluralidade dos marcadores de peso molecular é: AKKYAKKEKAAKKAYKKEAKAKAAEAAAKEAAYEA (SEQ ÍD MO: 1); ΑΚΚΥΑΚΚΑΚΑΕΚΑΚΚΑ.ΥΚΑΑΕΑΚΚΑΑΚΥΕΚΑΑΑΕΚΑΑΑΚΕΑΑΥΕΑ (SEQ iD NO: 2% AKK Y AKKEKA Y AKKAEKAAKKAE AKLA YKAAE AKJKJCAE AK YKAEAAKAAA KEAAYEA (SEQ ÍD NO: 3); AKK Y AKJCEKA Y AKAOCAE AKAAKKAKAEAKK Y AKAAKAEKKE Y AAAEAJC YKAEAAKAAAKEAAYEA (SEQ ÍD NO: 4); 4 A KJC Υ ΑΚΚΕΚΑΥ ΑΚΚΑΕΚΛΑΚΚΛΕ ΑΚΑ YKAAEÀICKKAKABAKK Υ ΑΚΑΑΚΑ ΕΚΚΕΥΑΑΑΕΑΚΥΚΑΕΑΑΚΑΑΑΚΕΑΑΥΕΑ {SEQ ΙΌ ΝΟ: 5), ΑΚΚ Υ AKJCEKA Υ AKICAEKAAKJCAE AKA\TCAAE ΑΚΚΚΑΚΑΕ A ΚΚ Υ A KAAKLA EKJCJEΥΑΑ.ΑΕΑΧΥΚΑΕΑΑΚΚΑΥΚΑΕΑΑΚΑΑΑΚΕΑΑΥΕΑ (SEQ ΙΟ ΝΟ: 6); e ακκύακκαεκλύακκακαλκέκκαύακκεακαυκααεακκκακαβακκύ AICE AAÍCAIOCJEA ΥΚΑΕΑΚΚΥ ÃKAAKABKJCEYAAAEAIOCAEAAKA ΥΚΑΕΑΑΚ Α ΑΑΚΕΑΛΥΕΑ (SEQ TD ΝΟ: 7), em que A representa alanina, K representa lisina, Y representa tirosina, e E representa ácido glutâmico. Lisboa, 03 de Abril de 2013