PT2172213E

PT2172213E - Vacinas injetáveis contra múltiplos serogrupos meningocócicos

Info

Publication number: PT2172213E
Application number: PT90755505T
Authority: PT
Inventors: Paolo Costantino
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2013-06-03
Also published as: EP1587537A2; WO2004067030A2; ES2411080T3; US9981031B2; PT2191844E; CN101926988B; CY1112841T1; DK1587537T3; CA2514328A1; US10668142B2; PT1587537E; CN102319427A; CA3042073A1; US20160354457A1; US20180243395A1; JP2006516608A; JP2010275328A; JP2013249314A; EP2191844A1; ES2461350T3

Description

1

DESCRIÇÃO VACINAS INJETÁVEIS CONTRA MÚLTIPLOS SEROGRUPOS MENINGOCÓCICOS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção insere-se no âmbito das vacinas, particularmente contra a meningite bacteriana.

ANTECEDENTES DA ARTE A Neisseria meningitidis é um patógeno humano Gram-negativo [1] que causa meningite bacteriana. Está intimamente relacionada com N. gonorrhoeae, apesar de uma caracteristica que claramente distingue os meningococos ser a presença de uma cápsula polissacaridea que está presente em todos os meningococos patogénicos.

Com base no polissacarídeo capsular do organismo, foram identificados doze serogrupos de N. meningitidis (A, B, C, Η, I, K, L, 29E, W135, X, Y e Z) . 0 serogrupo A ('MenA') é a causa mais comum de doença epidémica na África sub-Sahariana. Os serogrupos B e C são responsáveis pela maioria dos casos em paises desenvolvidos, sendo os casos restantes causados pelos serogrupos W135 e Y.

Além de ser usado para classificação, o polissacarídeo capsular tem sido usado para vacinação. Desde há muitos anos que é conhecida uma vacina tetravalente injetável de polissacarideos capsulares dos serogrupos A, C, Y e W135 [2,3] que está licenciada para uso humano. Apesar de ser eficaz em adolescentes e adultos, induz uma resposta imune débil e com proteção de curta duração e não pode ser usada em crianças [por exemplo, 4]. Os polissacarideos nesta vacina não estão conjugados e estão presentes numa razão em 2 peso de 1:1:1:1 [5]. Mencevax ACWY™ e Menomune™ ambos contêm 50ygde cada polissacarídeo purificado uma vez reconstituídos das suas formas liofilizadas. Os sacarideos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y foram também combinados sob a forma de conjugados [6-9] para proporcionar vacinas tetravalentes, por exemplo, o produto sem adjuvante Menactra™.

Os oligossacarideos conjugados do serogrupo C foram aprovados para uso humano, incluindo Menjugate™ [10,11], Meningitec™ e NeisVac-C™. Os produtos Menjugate™ e Meningitec™ têm antigenos de oligosacarideo conjugados com um veiculo CRM197, enquanto NeisVac-C™ usa o polissacarídeo completo (de-O-acetilado) conjugado com um veículo de toxoide tetânico.

Permanece, contudo, uma necessidade para melhorias nas vacinas conjugadas contra os serogrupos A, W 135 e Y, e no seu fabrico. Essa necessidade é abordada pelos produtos, processos e usos revelados na referência 7, mas permanece âmbito para modificações e melhorias adicionais.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a uma composição imunogénica injetável que compreende sacarideos capsulares de pelo menos dois dos serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis, em que os referidos sacarideos capsulares estão conjugados a proteínas transportadoras e/ou são oligossacarideos, e em que a composição compreende <50 yg sacarídeo meningocócico por dose. A invenção especificamente providencia a composição imunogénica injetável da reivindicação 1. 3 A invenção também providencia a referida composição imunogénica injetável, em que a composição ainda compreende um antigeno de um ou mais do: (a) serogrupo B de N. meningitidis; (b) Haemophilus influenzae tipo B; e/ou (c) Streptococcus pneumoniae.

Os antigenos incluídos em oito composições preferidas da invenção são: (1) serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis; (2) serogrupos A, B, C, W135 e Y de N.meningitidis; H.influenzae tipo B e serogrupos A, C, W135 e Y de N.meningitidis; H.influenzae tipo B e serogrupos A, B, C W135 e Y de N. meningitidis; S.pneumoniae e serogrupos A, C, W135 e Y de N .meningitidis; S. pneumoniae e serogrupos A, B, C, W135 e Y de N. meningitidis; H. influenzae tipo B, S. pneumoniae e serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis, H. influenzae tipo B, S. pneumoniae e serogrupos A, B, C, W135 e Y de N. meningitidis.

Antigenos de sacarídeo nas composições da invenção são preferencialmente oligossacarídeos. Antigenos de sacarídeo nas composições da invenção são mais preferencialmente oligossacarídeos conjugados.

Misturas de sacarídeo meningocócico

As composições da invenção compreendem sacarídeos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis. É preferido que a eficácia protetora de antigenos de sacarídeo individuais não seja removida combinando-os, apesar da imunogenicidade real (por exemplo, títulos de ELISA) poder ser reduzida. 4 A razão (p/p) de sacarídeo MenA:sacarídeo MenC pode ser superior a 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou superior). A razão (p/p) de sacarídeo MenY:sacarídeo MenW135 pode ser superior a 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou superior) e/ou a razão (p/p) de sacarídeo MenY: sacarídeo MenC pode ser inferior a 1 (por exemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, ou inferior).

Uma quantidade típica de cada antígeno de sacarídeo meningocócico por dose é entre 1 pg e 20 pg, por exemplo, cerca de 1 pg, cerca de 2,5 pg, cerca de 4 pg, cerca de 5 pg, ou cerca de 10 pg (expressa como sacarídeo).

Razões (p/p) preferidas para sacarídeos dos serogrupos A:C:W135:Y são: 1:1:1:1,- 1:1:1:2,- 2:1:1:1,-4:2:1:1,- 8:4:2:1,- 4:2:1:2,- 8:4:1:2,- 4:2:2:1,- 2:2:1:2,- e 2:2:2:1. Razões (p/p) preferidas para sacarídeos dos serogrupos C:W135:Y são: 1:1: 1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; e 2:1:1. É preferido usar uma massa substancialmente igual de cada sacarídeo.

Purificação de polissacarideos capsulares

Os polissacarideos capsulares meningocócicos são tipicamente preparados por um processo que compreende as etapas de precipitação do polissacarídeo (por exemplo, usando um detergente catiónico), fracionamento por etanol, extração a frio com fenol (para remover a proteína) e ultracentrifugação (para remover LPS) [por exemplo, referência 15] .

Um processo mais preferido [7], contudo, envolve a precipitação do polissacarídeo seguida de solubilização do 5 polissacarídeo precipitado usando um álcool inferior. A precipitação pode ser conseguida usando um detergente catiónico, tal como sais de tetrabutilamonio e cetiltrimetilamonio (por exemplo, os sais de brometo), ou brometo de hexadimetrina e sais de miristiltrimetilamónio. 0 brometo de cetiltrimetilamonio ('CTAB') é particularmente preferido [16] . A solubilização do material precipitado pode ser conseguida usando um álcool inferior, tal como metanol, propan-l-ol, propan-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol, 2-metil-propan-2-ol, diois, etc., mas etanol é particularmente adequado para solubilizar complexos de polissacarídeo CTAB. 0 etanol é preferencialmente adicionado ao polissacarídeo precipitado para proporcionar uma concentração de etanol final (baseada no conteúdo total de etanol e água) de entre 50% e 95%.

Após re-solubilização, o polissacarídeo pode ser, ainda, tratado para remover contaminantes. Isto é particularmente importante em situações em que mesmo uma contaminação menor não é aceitável (por exemplo, para produção de vacinas humanas). Isto envolverá tipicamente uma ou mais etapas de filtração, por exemplo, filtração de profundidade, pode ser usada filtração por carvão ativado, filtração por tamanho e/ou ultrafiltração.

Uma vez filtrado para remover contaminantes, o polissacarídeo pode ser precipitado para posterior tratamento e/ou processamento. Isto pode ser convenientemente conseguido permutando catiões (por exemplo, através da adição de sais de cálcio ou sódio).

Como alternativa à purificação, os sacarídeos capsulares da presente invenção podem ser obtidos através 6 de síntese total ou parcial, por exemplo, síntese de Hib é revelada na referência 17, e síntese de MenA na referência 18. 0 polissacarídeo pode ser quimicamente modificado. Por exemplo, pode ser modificado para substituir um ou mais grupos hidroxilo com grupos bloqueadores. Isto é particularmente útil para reduzir a hidrólise para o serogrupo A [19] (ver abaixo). Também pode ser realizada a de-O-acetilação dos sacarídeos.

Serogrupo B de N. meningitidis

Algumas composições da invenção incluem um antígeno do serogrupo B de N. meningitidis. Ao contrário dos serogrupos A, C, W135 e Y, o sacarídeo capsular do MenB é inadequado para uso como um imunogénio em humanos devido à sua semelhança com os próprios antigenos. Portanto, se um antígeno de sacarídeo é para ser usado para MenB, é necessário usar um sacarídeo modificado, tal como um no qual os grupos N-acetilo nos resíduos de ácido siálico do sacarídeo são substituídos com grupos N-acilo. Grupos N-acilo adequados são os grupos Cl a C8 acilo, tais como N-propionilo [20] . Em vez de usar um antígeno de sacarídeo, contudo, é preferido usar um antígeno de polipeptídeo.

Assim, a composição pode incluir um ou mais antigenos de polipeptídeo que induze(m) uma resposta imune que protege contra infeção por MenB e/ou que é bactericida contra MenB. Mais geralmente, a composição pode preferencialmente, após administração a um sujeito, induzir uma resposta de anticorpo nesse sujeito que é bactericida contra duas ou mais (por exemplo, 2 ou 3) das linhagens hipervirulentas A4, ET-5 e linhagem 3 de N. meningitidis do serogrupo B. 7 A sequência do genoma da estirpe MC58 de MenB foi publicada [21] e antigenos adequados podem ser selecionados a partir dos polipeptideos codificados [22]. Antigenos preferidos são revelados nas referências 22 a 32. Em vez de consistir num único antigeno, é preferido que a composição da invenção compreenda uma mistura de 10 ou menos (por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antigenos purificados, e é particularmente preferido que a composição não deva incluir misturas complexas ou indefinidas de antigenos por exemplo, é preferido não incluir vesículas de membranas exteriores (OMV's) na composição.

Composições preferidas incluem um ou mais dos seguintes cinco antigenos [32]: (1) uma proteína 'NadA', preferencialmente na forma oligomérica (por exemplo, na forma trimérica); (2) uma proteína '741'; (3) uma proteína '936'; (4) uma proteína '953'; e (5) uma proteína '287'.

Antigenos MenB preferidos que compreendem uma sequência de aminoácidos encontrada numa das estirpes são 2996, MC58, 95N477, e 394/98. A proteína 287 é preferencialmente da estirpe 2996 ou, mais preferencialmente, da estirpe 394/98. A proteína 741 é preferencialmente do serogrupo B das estirpes MC58, 2996, 394/98, ou 95N477, ou do serogrupo C da estirpe 90/18311. A estirpe MC58 é a mais preferida. As proteínas 936, 953 e NadA são preferencialmente da estirpe 2996. Onde uma composição inclui um antigeno de proteína particular (por exemplo, 741 ou 287), a composição pode incluir aquele antigeno em mais do que uma forma variante, por exemplo, a mesma proteína, mas de mais do que uma estirpe. Estas proteínas podem ser incluídas em tandem ou proteínas separadas. 'NadA' (adesina A de Neisseria) da MenB é revelada como proteína '961' na referência 25 (SEQ. ID N.°s 2943 e 2944) e como 'NMB1994' na referência 21 (ver também os números de acesso ao GenBank: 11352904 e 7227256). Um estudo detalhado da proteína pode ser encontrado na referência 33. Quando usado de acordo com a presente invenção, NadA pode tomar várias formas. Formas preferidas da NadA são variantes de truncação ou de deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 29 a 31. Em particular, NadA sem a sua âncora C-terminal de membrana é preferida (por exemplo, deleção dos resíduos 351-405 para a estirpe 2996, para proporcionar SEQ. ID N.° 1 aqui), que é por vezes distinguida aqui através do uso de um 'C' sobrescrito, por exemplo, NadA(c) . A expressão de NadA sem o seu domínio de âncora de membrana em E. coli resulta na segregação da proteína no sobrenadante da cultura com remoção concomitante do seu péptido líder 23mer (por exemplo, deixar um 327mer para a estirpe 2996 [SEQ. ID N.°2 aqui]). Os polipeptídeos sem os seus péptidos líder são por vezes distinguidos aqui pelo uso de um 'NL' sobrescrito, por exemplo, NadA(NL) ou NadA(C) (NL) SEQ. ID N. ° 1, em que n é 7 12, 14, 16, 18 , 20 , 25, 30, 100, 150, 200 1 250 ou mais). (b) carecem de um ou mais 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, inal e/ou do N-terminal da

Polipeptídeos NadA prefe aminoácidos que: (a) tem 50% exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, ID N.° 2; e/ou (b) compreende n aminoácidos consecutivos da ou mais (por exemplo, 8, 10, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90,

Fragmentos preferidos para aminoácidos (por exemplo, 1, 15, 20, 25 ou mais) do C-te: iridos têm uma sequência de ou mais de identidade (por 95%, 99% ou mais) com a SEQ. um fragmento de, pelo menos, 9 SEQ. ID N.° 1 (por exemplo, NadA(C), NadA(NL), NadA(C) (NL)) . Outros fragmentos preferidos compreendem um epítopo da SEQ. ID N.° 1, e um fragmento particularmente preferido da SEQ. ID N.° 1 é a SEQ. ID N.° 2. Estas várias sequências incluem variantes da NadA (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.). Várias sequências NadA são apresentadas na Figura 9 da referência 34 . A proteina '741' do MenB é revelada na referência 25 (SEQ. ID N.°s 2535 e 2536) e como 'NMB1870' na referência 21 (ver também o número de acesso ao GenBank GI: 7227128). A proteina correspondente no serogrupo A [35] tem o número de acesso ao GenBank 7379322. 741 é naturalmente uma lipoproteina. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteina 741 pode tomar várias formas. Formas preferidas da 741 são variantes de truncação e deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 29 a 31. Em particular, o N-terminal da 741 pode ser deletado até à e incluindo a sua sequência poliglicina (isto é, deleção dos residuos 1 a 72 para a estirpe MC58 [SEQ. ID N.° 3 aqui]), que é, por vezes, distinguida aqui pelo uso de um prefixo 'AG'. Esta deleção pode aumentar a expressão. A deleção também remove o local de lipidação da 741. As sequências preferidas da 741 têm uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a SEQ. ID N.° 3; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos da SEQ. ID N.° 3, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo da 741. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos 10 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do C-terminal e/ou do N-terminal da SEQ. ID N.° 3. Estas sequências incluem variantes da 741 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.)· Várias sequências da 741 podem ser encontradas nas SEQ. ID N.°s 1 a 22 da referência 31, nas SEQ. ID N.°s 1 a 23 da referência 36, e nas SEQ. ID N.°s 1 a 299 da referência 37. A proteina 741 é um antigeno extremamente eficaz para obter respostas de anticorpo anti-meningocócicas, e é expressa através de todos os serogrupos meningocócicos. A análise filogenética mostra que a proteina divide-se em dois grupos, e que um destes divide-se de novo para proporcionar três variantes no total [38], e enquanto o cultivo em soro contra uma determinada variante é bactericida dentro do mesmo grupo variante, não está ativo contra estirpes que expressam uma das outras duas variantes, isto é, existe uma proteção cruzada intra- variante, mas não uma proteção cruzada inter-variante [36,38]. Para uma eficácia máxima de cruzamento de estirpes, portanto, é preferido que uma composição deva incluir mais do que uma variante da proteina 741. Uma sequência exemplar de cada variante é dada nas SEQ. ID N.°s 10, 11 e 12 aqui, começando com um residuo de cisteina N- terminal ao qual o lipido será anexado covalentemente na forma nativa da lipoproteina. É, portanto, preferido que a composição deva incluir, pelo menos, dois de: (1) uma primeira proteina, que compreenda uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, um a% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 10 e/ou que compreenda uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, x aminoácidos contiguos da SEQ. ID N.° 10; (2) 11 uma segunda proteína, que compreenda uma sequência de aminoácidos que tenha, pelo menos, um b% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 11 e/ou, que compreenda uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, y aminoácidos contíguos da SEQ. ID N.° 11; e (3) uma terceira proteína, que compreenda uma sequência de aminoácidos que tenha, pelo menos, um c% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 12 e/ou que compreenda uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, z aminoácidos contíguos da SEQ. ID N .° 12. 0 valor de a é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 , ou mais. 0 valor de b é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 , ou mais. 0 valor de c é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99, 5, ou mais. Os valores de a, b e c não estão intrinsecamente relacionados uns com os outros. 0 valor de x é, pelo menos , 7 por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 , 50, 60, 70, 80, 90 , i .00, 120, 140 , 160, 180, 200 , 225, 250) . 0 vale >r de y é, pelo menc >s, 7 por ex emplo , 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 35 , 40, . 45, 50, 60, 70 , 80, 90, 100 r 120, : 140, 160, 180 , 2 00, 225, 250 ) . o valor de z é ;, pelo menos, 7 por exemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 , 50, 60, 70, 80, 90, , íoo, : 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Os valores de x, y e z não estão intrinsecamente relacionados uns com os outros. É preferido que qualquer dada sequência de aminoácidos da 741 não caia em mais do que uma das categorias (1), (2) e (3). Qualquer dada sequência da 741 cairá, assim, apenas numa das categorias (1), (2) e (3). É, 12 assim, preferido que: a proteina (1) tenha menos de i% de identidade da sequência com a proteina (2); a proteina (1) tenha menos de j% de identidade da sequência com a proteina (3); e a proteina (2) tenha menos de k% de identidade da sequência com a proteina (3) . 0 valor de i é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83 , 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) e é no máximo a. 0 valor de j é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, r 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82 , 83, 84, 85, co 05 87, 88, 89, 90, etc.) e é no máximo b. 0 valor de k é 60 ou mais (por exemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 00 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) e é no máximo c . Os valores de i, j e k não estão intrinsecamente relacionados uns com os outros. A proteina '936' do seroqrupo B é revelada na referência 25 (SEQ. ID N.°s 2883 e 2884) e como 'NMB2091' na referência 21 (ver também o número de acesso ao GenBank GI: 7227353). 0 gene correspondente no serogrupo A [35] tem o número de acesso ao GenBank 7379093. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteina 936 pode tomar várias formas. Formas preferidas da 936 são variantes de truncação e/ou deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 29 a 31. Em particular, o péptido lider N-terminal da 936 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 23 para a estirpe MC58, para proporcionar 936<NL) [SEQ. ID N.° 4 aqui]). As sequências preferidas da 936 têm uma sequência de aminoácidos que (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a SEQ. ID N.° 4; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos da 13 SEQ. ID N.° 4, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epítopo da 936. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do C-terminal e/ou do N-terminal da SEQ. ID N.° 4. Estas sequências incluem variantes da 936 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.). A proteina '953' do serogrupo B é revelada na referência 25 (SEQ. ID N.°s 2917 e 2918) e como 'NMB1030' na referência 21 (ver também o número de acesso ao GenBank GI: 7226269). A proteina correspondente no serogrupo A [35] tem o número de acesso ao GenBank 7380108. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteina 953 pode tomar várias formas. Formas preferidas da 953 são variantes de truncação ou deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 29 a 31. Em particular, o péptido lider N-terminal da 953 pode ser deletado (por exemplo, deleção dos residuos 1 a 19 para a estirpe MC58, para proporcionar 953<nl) [SEQ. ID N.° 5 aqui]. As sequências preferidas da 953 têm uma sequência de aminoácidos que (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a SEQ. ID N.° 5; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos da SEQ. ID N.° 5, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epitopo da 953. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do C-terminal e/ou do N-terminal da SEQ. ID N.° 5. Estas sequências incluem 14 variantes da 936 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.)· As formas alélicas da 953 podem ser visualizadas na Figura 19 da referência 28. A proteína '287' do serogrupo B é revelada na referência 25 (SEQ. ID N.°s 3103 e 3104), como 'NMB2132' na referência 21, e como 'GNA2132' na referência 22 (ver também o número de acesso ao GenBank GI: 7227388) . A proteína correspondente no serogrupo A [35] tem o número de acesso ao GenBank 7379057. Quando usada de acordo com a presente invenção, a proteína 287 pode tomar várias formas. Formas preferidas da 287 são variantes de truncação ou deleção, tais como aquelas reveladas nas referências 29 a 31. Em particular, o N-terminal da 287 pode ser deletado até à e incluindo a sua sequência poliglicina (por exemplo, deleção dos resíduos 1 a 24 para a estirpe MC58, para proporcionar AG287 [SEQ. ID N.° 6 aqui]. Esta deleção pode aumentar a expressão. As sequências preferidas da 287 têm uma sequência de aminoácidos que (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a SEQ. ID N.° 6; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos da SEQ. ID N.° 6, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epítopo da 287. Outros fragmentos preferidos carecem de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou mais) do C-terminal e/ou do N-terminal da SEQ. ID N.° 6. Estas sequências incluem variantes da 287 (por exemplo, variantes alélicas, homólogas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.). As formas alélicas da 287 podem ser visualizadas nas Figuras 5 e 15 da referência 28, e no 15 exemplo 13 e figura 21 da referência 25 (SEQ. ID N.°s 3179 a 3184) .

Os cinco antigenos MenB básicos (NadA, 741, 953, 936 e 287) podem estar presentes na composição como cinco proteínas separadas, mas é preferido que, pelo menos, dois dos antigenos sejam expressos como uma única cadeia polipeptídica (uma proteína "híbrida" [referências 29 a 31]), isto é, de tal maneira que os cinco antigenos formam menos do que cinco polipeptídeos. As proteínas híbridas oferecem duas vantagens principais: primeiro, uma proteína que pode ser instável ou expressa fracamente por si mesma pode ser assistida adicionando um parceiro híbrido adequado que ultrapasse o problema; segundo, o fabrico comercial é simplificado uma vez que apenas precisa de ser empregue uma expressão e purificação de maneira a produzir duas proteínas úteis separadamente. Uma proteína híbrida incluída numa composição da invenção pode compreender dois ou mais (isto é, 2, 3, 4 ou 5) dos cinco antigenos básicos. Híbridos que consistem em dois dos cinco antigenos são preferidos.

Dentro da combinação dos cinco antigenos básicos, um antígeno pode estar presente em mais do que uma proteína híbrida e/ou como uma proteína não híbrida. É preferido, contudo, que um antígeno esteja presente tanto como um híbrido como um não híbrido, mas não como ambos, apesar de poder ser útil incluir a proteína 741 simultaneamente como um antígeno híbrido e não híbrido (preferencialmente lipoproteína), particularmente onde mais do que uma variante da 741 é usada. 16

As proteínas híbridas podem ser representadas pela fórmula NH2-A- [-X-L-] n-B-COOH, em que: X é uma sequência de aminoácidos de um dos cinco antígenos básicos; L é uma sequência de aminoácidos de ligação (linker) opcional; A é uma sequência de aminoácidos de ligação N-terminal opcional; B é uma sequência de aminoácidos de ligação C-terminal opcional; e n é 2, 3, 4 ou 5.

Se um grupo -X- tem uma sequência de péptido líder na sua forma tipo selvagem, esta pode ser incluída ou omitida na proteína híbrida. Em algumas modalidades, os péptidos líder serão deletados exceto aquele do grupo -X- localizado no N-terminal da proteína híbrida, isto é, o péptido líder de Xi será retido, mas os péptidos líder de X2 ... Xn serão omitidos. Isto é equivalente a deletar todos os péptidos líder e a usar o péptido líder de X2 como grupo -A-.

Para cada n ocasiões de [-X-L-], a sequência de aminoácidos de ligação -L- pode estar presente ou ausente. Por exemplo, quando n=2 o híbrido pode ser NH2-Xi-Li-X2-L2-COOH, NH2-Xi-X2-COOH, NH2-Xi-Li-X2-COOH, NH2-Xi-X2-L2-COOH, etc. A(s) sequência(s) de aminoácidos de ligação -L- serão tipicamente curtas (por exemplo, 20 ou menos aminoácidos, isto é, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Exemplos compreendem sequências de péptidos curtas que facilitam a clonagem, linkers de poliglicina (isto é, compreendendo Glyn onde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), e etiquetas de histidina (isto é, Hisn onde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais). Outras sequências de aminoácidos de ligação adequadas serão aparentes àqueles habilitados na arte. Um linker útil é GSGGGG (SEQ. ID N.°9), com o dipéptido Gly-Ser a ser formado a partir do local de restrição da BamRI, ajudando assim à clonagem e 17 manipulação, e o tetrapéptido (Gly)4 sendo um típico linker de poliglicina. Se Xn+i é uma proteína AG e Ln é um linker de glicina, isto pode ser equivalente a Xn+i não sendo uma proteína AG e estando Ln ausente. -A- é uma sequência de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será tipicamente curta (por exemplo, 40 ou menos aminoácidos, isto é, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, . 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 , 11, r 10, 9, r 8, 7, 6, 5, 4 , 3, 2, D .

Exemplos incluem sequências líder para dirigir o tráfego de proteínas, ou sequências de péptidos curtas que facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, etiquetas de histidina, isto é, Hisn onde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) . Outras sequências de aminoácidos N- terminal adequadas serão aparentes àqueles habilitados na arte. Se o Xi carece da sua própria metionina N-terminal, -A- é preferencialmente um oligopeptídeo (por exemplo, com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos) que providencia uma metionina N-terminal. -B- é uma sequência de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será tipicamente curta (por exemplo, 40 ou menos aminoácidos, isto é, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, CM oo 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9 , 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1).

Exemplos incluem sequências para dirigir o tráfego de proteínas, sequências de péptidos curtas que facilitam a clonagem ou purificação (por exemplo, que compreendem etiquetas de histidina, isto é, Hisn onde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais), ou sequências que aumentam a estabilidade das proteínas. Outras sequências aminoácidos 18 C-terminal adequadas serão aparentes àqueles habilitados na arte.

Mais preferencialmente, n é 2. Dois híbridos de antígeno para uso na invenção compreendem: NadA e 741; NadA e 936; NadA e 953; NadA e 287; 741 e 936; 741 e 953; 741 e 287; 936 e 953; 936 e 287; 953 e 287. Duas proteínas preferidas são: Χχ é uma 936 e X2 é uma 741; Χχ é uma 287 e X2 é uma 953.

Duas proteínas híbridas particularmente preferidas da invenção são como se segue: n A Xi Li X2 l2 B SEQ. ID N° 2 MA AG2 87 GSGGGG 953 (nl) - - 7 2 M 93 6 (nl) GSGGGG AG7 41 - - 8

Estas duas proteínas podem ser usadas em combinação com NadA (particularmente com a SEQ. ID N.° 2). Assim, uma composição preferida de antígenos MenB para uso com a invenção inclui assim um primeiro polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 2, um segundo polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 7 e um terceiro polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 8. Este é um grupo preferido de antígenos MenB para uso com a invenção.

Como mencionado previamente, composições da invenção que incluem antígenos MenB podem preferencialmente induzir uma resposta de anticorpos bactericida no soro que é eficaz contra duas ou três linhagens hipervirulentas de MenB A4, ET-5 e linhagem 3. Elas podem adicionalmente induzir 19 respostas de anticorpos bactericidas contra uma ou mais linhagens hipervirulentas do subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 ou complexo ET-37, e contra outras linhagens, por exemplo, linhagens hiperinvasivas. Estas respostas de anticorpos são convenientemente medidas em ratinhos e são um indicador padrão da eficácia de vacinas [por exemplo, ver nota final 14 da referência 22] . A atividade bactericida no soro (SBA) mede a morte bacteriana mediada pelo complemento, e pode ser testada usando complemento humano ou de cria de coelho. Os padrões da WHO requerem que uma vacina induza, pelo menos, um aumento de 4 vezes na SBA em mais de 90% dos recetores. A composição não precisa de induzir anticorpos bactericidas contra cada e toda estirpe de MenB dentro destas linhagens hipervirulentas; em vez disso, para qualquer dado grupo de quatro ou mais estirpes do serogrupo B meningocócico dentro de uma linhagem hipervirulenta particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra, pelo menos, 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) do grupo. Grupos preferidos de estirpes incluirão estirpes isoladas em, pelo menos, quatro dos seguintes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, e CU. O soro preferencialmente tem um título bactericida de, pelo menos, 1024 (por exemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou superior, preferencialmente, pelo menos, estirpe MC58 214) isto é, o soro é capaz de matar, pelo menos, 50% das bactérias teste de uma estirpe particular quando diluído 1/1024, como descrito na referência 22. Composições preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes estirpes do serogrupo B meningocócico: (i) do grupo A4, estirpe 961-5945 (B:2b:PI.21,16) e/ou estirpe G2136 (B:-); (ii) do complexo ET-5, 20 (Β:15:PI.7,16b) e/ou estirpe 44/76 (B:15:PI.7,16); (iii) da linhagem 3, estirpe 394/98 (B:4:P1.4) e/ou estirpe BZ198 (B:NT:-). Composições mais preferidas podem induzir respostas bactericidas contra as estirpes 961-5945, 44/76 e 394/98. As estirpes 961-5945 e G2136 são ambas estirpes de referência MLST de Neisseria [ID N.°s 638 e 1002 na referência 39] . A estirpe MC58 está amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a estirpe sequenciada na referência 21. A estirpe 44/76 foi amplamente usada e caracterizada (por exemplo, referência 40) e é uma das estirpes de referência MLST de Neisseria [ID N.° 237 na

referência 39; linha 32 do Quadro 2 na referência 41] . A estirpe 394/98 foi originalmente isolada na Nova Zelândia em 1998, e têm sido publicados estudos que usam esta estirpe (por exemplo, referências 42 e 43). A estirpe BZ198 é outra estirpe de referência MLST [ID N.° 409 na referência 39; linha 41 do Quadro 2 na referência 41] . A composição pode adicionalmente induzir uma resposta bactericida contra a estirpe LNP17592 do serogrupo W135 (W135:2a:PI.5,2) , do complexo ET-37. Esta é uma estirpe

Haji isolada em França em 2000.

Outros antígenos de polipeptídeo MenB que podem ser incluídos nas composições da invenção incluem aqueles que compreendem uma das sequências de aminoácidos seguintes: SEQ. ID N.° 650 da referência 23; SEQ. ID N.° 878 da

referência 23; SEQ. ID N.° 884 da referência 23; SEQ. ID N.° 4 da referência 24; SEQ. ID N.° 598 da referência 25; SEQ. ID N. 0 818 da referência 25; SEQ. ID N.° 864 da

referência 25; SEQ. ID N.° 866 da referência 25; SEQ. ID

N.° 1196 da referência 25; SEQ. ID N.° 1272 da referência 25; SEQ. ID N.° 1274 da referência 25; SEQ. ID N.° 1640 da referência 25; SEQ. ID N.° 1788 da referência 25; SEQ. ID 21 Ν.° 2288 da referência 25; SEQ. ID N.° 2466 da referência 25; SEQ. ID N.° 2554 da referência 25; SEQ. ID N.° 2576 da referência 25; SEQ. ID N.° 2606 da referência 25; SEQ. ID N.° 2608 da referência 25; SEQ. ID N.° 2616 da referência 25; SEQ. ID N.° 2668 da referência 25; SEQ. ID N.° 2780 da referência 25; SEQ. ID N.° 2932 da referência 25; SEQ. ID N.° 2958 da referência 25; SEQ. ID N.° 2970 da referência 25; SEQ. ID N.° 2988 da referência 25, ou um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com ditas sequências; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos de ditas sequências, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epítopo da sequência relevante. Mais do que um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6) destes polipeptideos pode ser incluído.

Haemophllus influenzae tipo B (Hib)

Onde a composição inclui um antígeno de H. influenzae tipo B, será tipicamente um antígeno de sacarídeo capsular Hib. Antígenos de sacarídeo de H. influenzae b são bem conhecidos.

De maneira vantajosa, o sacarídeo Hib está covalentemente conjugado com uma proteína transportadora, de maneira a aumentar a sua imunogenicidade, especialmente em crianças. A preparação dos conjugados do polissacarídeo em geral, e do polissacarídeo capsular Hib em particular, está bem documentada [por exemplo, referências 44 a 52 etc.]. A invenção pode usar qualquer conjugado Hib adequado. Proteínas transportadoras adequadas são descritas 22 abaixo, e veículos preferidos para sacarídeos Hib são CRMi97 ('HbOC'), toxoide tetânico ('PRP-T') e o complexo da membrana exterior de N. meningitidis ('PRP-OMP'). A metade sacarídea do conjugado pode ser um polissacarídeo (por exemplo, fosfato de polirribosilribitol inteiro (PRP)), mas é preferido hidrolisar polissacarídeos para formar oligossacarídeos (por exemplo, MW de ~1 a ~5 kDa) .

Um conjugado preferido compreende um oligossacarídeo Hib covalentemente ligado a CRMi97 através de um linker de ácido adípico [53, 54]. Toxoide tetânico é também um veículo preferido. A administração do antígeno Hib resulta preferencialmente numa concentração de anticorpo anti-PRP de >0,15 yg/ml, e mais preferencialmente >1 yg/ml.

Composições da invenção podem compreender mais do que um antígeno Hib.

Onde uma composição inclui um antígeno de sacarídeo Hib, é preferido que não inclua também um adjuvante de hidróxido de alumínio. Se a composição inclui um adjuvante de fosfato de alumínio então o antígeno Hib pode ser adsorvido ao adjuvante [55] ou pode ser não adsorvido [12]. A prevenção da adsorção pode ser conseguida selecionando o pH correto durante a mistura do antígeno/adjuvante, um adjuvante com um ponto apropriado de carga zero, e uma ordem apropriada de mistura para os vários antígenos diferentes numa composição [56]. 23

Antígenos Hib podem ser liofilizados, por exemplo, junto com antigenos meningocócicos.

Streptococcus pneumoniae

Onde a composição inclui um antigeno de 5. pneumoniae, será tipicamente um antigeno de sacarideo capsular que é preferencialmente conjugado com uma proteina transportadora [por exemplo, referências 57 a 59]. É preferido incluir sacarideos de mais do que um serotipo de S. pneumoniae. Por exemplo, misturas de polissacarideos de 23 serotipos diferentes são amplamente usadas, tal como o são vacinas conjugadas com polissacarideos de entre 5 e 11 serotipos diferentes [60]. Por exemplo, PrevNar™ [61] contém antigenos de sete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, e 23F) com cada sacarideo individualmente conjugado com CRMi97 por aminação redutora, com 2ygde cada sacarideo por 0,5 ml dose (4ygde serotipo 6B) , e com conjugados adsorvidos num adjuvante de fosfato de alumínio. Composições da invenção preferencialmente incluem, pelo menos, os serotipos 6B, 14, 19F e 23F. Os conjugados podem ser adsorvidos num fosfato de alumínio.

Como alternativa ao uso de antígenos de sacarideo de pneumococo, a composição pode incluir um ou mais antígenos de polipeptídeo. As sequências do genoma para várias estirpes de pneumococo estão disponíveis [62,63] e podem ser submetidas a vacinologia reversa [64-67] para identicar antígenos de polipeptídeo adequados [68,69]. Por exemplo, a composição pode incluir um ou mais dos antígenos seguintes: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 e Spl30, como definido na referência 70. A composição pode incluir mais do que um (por exemplo, 24 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14) destes antígenos.

Em algumas modalidades, a composição pode incluir ambos antígenos de sacarídeo e polipeptídeo de pneumococo. Estes podem ser usados em mistura simples, ou o antígeno de sacarídeo pneumocócico pode ser conjugado com uma proteína pneumocócica. Proteínas transportadoras adequadas para tais modalidades incluem os antígenos listados no parágrafo anterior [70].

Os antígenos pneumocócicos podem ser liofilizados, por exemplo, junto com antígenos meningocócicos e/ou Hib.

Sacarideos modificados do serogrupo A de N. meningitidis A composição da invenção inclui um antígeno de sacarídeo MenA. 0 antígeno é preferencialmente um sacarídeo modificado no qual um ou mais dos grupos hidroxilo no sacarídeo nativo foi/foram substituídos por um grupo bloqueador [19]. Esta modificação melhora a resistência à hidrólise, e significa que o antígeno do serogrupo A pode ser armazenado e usado numa formulação líquida em vez de requerer liofilização. 0 número de unidades monossacarídicas que têm grupos bloqueadores pode variar. Por exemplo, todas ou substancialmente todas as unidades monossacarídicas podem ter grupos bloqueadores. Em alternativa, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das unidades monossacarídicas podem ter grupos bloqueadores. Pelo menos, 1, 2, 3, LO k>. 7, 8, 9, O \—1 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 unidades monossacarídicas podem ter grupos bloqueadores. 25

Da mesma maneira, o número de grupos bloqueadores numa unidade monossacaridica pode variar. Por exemplo, o número de grupos bloqueadores numa unidade monossacaridica pode ser 1 ou 2. 0 grupo bloqueador estará geralmente na posição 4 e/ou posição 3 das unidades monossacaridicas. A unidade monossacaridica terminal pode ou não ter um grupo bloqueador em vez do seu hidroxilo nativo. É preferido reter um grupo hidroxilo anomérico livre numa unidade monossacaridica terminal de maneira a providenciar um cabo para futuras reações (por exemplo, conjugação). Grupos hidroxilo anoméricos podem ser convertidos em grupos amino (-NH2 ou -NH-E, onde E é um grupo protetor de azoto) por aminação redutora (usando, por exemplo, NaBHsCN/NíhCl), e podem depois ser regenerados após outros grupos hidroxilo terem sido convertidos em grupos bloqueadores.

Grupos bloqueadores para substituir grupos hidroxilo podem ficar diretamente acessíveis através de uma reação de derivação do grupo hidroxilo, isto é, substituindo o átomo de hidrogénio do grupo hidroxilo por outro grupo. Derivados dos grupos hidroxilo adequados os quais atuam como grupos bloqueadores são, por exemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, ésteres, éteres (por exemplo, éteres de sililo ou éteres de alquilo) e acetais. Alguns exemplos específicos de tais grupos bloqueadores são alilo, Aloe, benzilo, BOM, t- butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Outros grupos bloqueadores que não estão diretamente acessíveis e que substituem completamente o grupo hidroxilo incluem Ci-i2alquilo, C3-i2alquilo, Cs-i2arilo, Cs-i2arilo-Ci-6alquilo, NR1R2 (R1 e R2 são definidos no parágrafo seguinte) , H, F, 26

Cl, Br, C02H, C02(Ci-6 alquilo), CN, CF3, CC13, etc. Grupos bloqueadores preferidos são grupos de retirada de eletrões.

Grupos bloqueadores preferidos são da fórmula: -0- X-Y ou -0R3 em que: X é C (0) , S (0) ou S02; Y é Ci-i2alquilo, Ci_i2alcoxi, C3_i2cicloalquilo, Cs_i2arilo ou Cs-i2aril-Ci-6alquilo, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados a partir de F, Cl, Br, C02H, C02 (Ci_6alquilo) , CN, CF3 ou CC13; ou Y é NR1R2; R1 e R2 são independentemente selecionados a partir de H, Ci-i2alquilo, C3-i2cicloalquilo, C5-i2arilo, C5_i2aril-Ci-6alquilo; ou R1 e R2 podem ser unidos para formar um grupo heterocíclico saturado C3_i2; R e Ci-i2alquilo ou C3-i2cicloalquilo, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído com 1, 2 ou 3 grupos independentemente selecionados a partir de F, Cl, Br, C02 (Ci-6alquilo) , CN, CF3 ou CC13; ou R3 é C5-i2arilo ou C5-12aril-Ci-6alquilo, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído com 1, 2, 3, 4 ou 5 grupos selecionados a partir de F, Cl, Br, C02H, C02 (Ci_6alquilo) , CN, CF3 ou CC13. Quando R3 é Ci_i2alquilo ou C3-i2cicloalquilo, é tipicamente substituído com 1, 2 ou 3 grupos como definido em cima.

Quando R1 e R2 são unidos para formar um grupo heterocíclico saturado C3-i2, significa que R1 e R2 juntos com o átomo de azoto formam um grupo heterocíclico saturado que contém qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, C6, C7, C8, Cg, Cio, C11; C12) . 0 grupo heterocíclico pode conter 1 ou 2 heteroátomos (tais como N, 0 ou S) em vez do átomo de azoto. Exemplos de grupos heterocíclico saturados C3_i2 são pirrolidinil, piperidinil, morfolinil, piperazinil, imidazolidinil, azetidinil e aziridinil. 27

Grupos bloqueadores -O-X-Y e -0R3 podem ser preparados a partir de grupos -OH por procedimentos de derivação padrão, tais como reação do grupo hidroxilo com um haleto de ácido, haleto de alquilo, haleto de sulfonilo, etc. Assim, átomo de oxigénio em -O-X-Y é preferencialmente o átomo de oxigénio do grupo hidroxilo, enquanto o grupo -X-Y em -O-X-Y substitui preferencialmente o átomo de hidrogénio do grupo hidroxilo.

Em alternativa, os grupos bloqueadores podem ficar acessíveis através de uma reação de substituição, tal como uma substituição tipo Mitsonobu. Estes e outros métodos de preparar grupos bloqueadores a partir de grupos hidroxilo são bem conhecidos.

Mais preferencialmente, o grupo bloqueador é -0C(0)CF3 [71], ou um grupo carbamato -0C(0)NR1R2, onde R1 e R2 são independentemente selecionados a partir do Ci-6alquilo. Mais preferencialmente, R1 e R2 são ambos metilo, isto é, o grupo bloqueador é -0C(0)NMe2. Grupos bloqueadores carbamatos têm um efeito estabilizador na ligação gi icosídica e podem ser preparados sob condições temperadas.

Sacarídeos modificados MenA preferidos contêm n unidades monossacarídicas, onde, pelo menos, h% das unidades monossacarídicas não têm grupos -OH em ambas posições 3 e 4. 0 valor de h é 24 ou mais (por exemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ou 100) e é preferencialmente 50 ou mais. Os grupos -OH ausentes são preferencialmente grupos bloqueadores como definido anteriormente. 28

Outros sacarideos modificados MenA preferidos compreendem unidades monossacaridicas, em que, pelo menos, s das unidades monossacaridicas não têm -OH na posição 3 e não têm -OH na posição 4 . 0 valor de s é, pelo menos, 1 (por exemplo, 2 3 4 r r r 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80 , 90) . Os grupos -OH ausentes são preferencialmente grupos bloqueadores como definido anteriormente.

Os sacarideos modificados MenA adequados para uso com a invenção têm a fórmula:

OH

em que n é um número inteiro de 1 a 100 (preferencialmente um número inteiro de 15 a 25) ; 29 T é da fórmula (A) ou (B):

cada grupo Z é independentemente selecionado a partir de OH ou de um grupo bloqueador como definido anteriormente; e cada grupo Q é independentemente selecionado a partir de OH ou de um grupo bloqueador como definido anteriormente; Y é selecionado a partir de OH ou de um grupo bloqueador como definido anteriormente; E é H ou um grupo protetor de azoto; e em que mais do que cerca de 7% (por exemplo, 8%, 9%, 10% ou mais) dos grupos Q são grupos bloqueadores.

Cada um dos grupos n+2 Z pode ser o mesmo ou diferentes uns dos outros. Da mesma maneira, cada um dos grupos n+2 Q pode ser o mesmo ou diferentes uns dos outros. Todos os grupos Z podem ser OH. Em alternativa, pelo menos, 10%, 20, 30%, 40%, 50% ou 60% os grupos Z podem ser OAc. Preferencialmente, cerca de 70% dos grupos Z são OAc, sendo os restantes grupos Z OH ou grupos bloqueadores como definido anteriormente. Pelo menos, cerca de 7% dos grupos Q são grupos bloqueadores. Preferencialmente, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mesmo 100% dos grupos Q são grupos bloqueadores.

Composições preferidas da invenção podem ser armazenadas durante 28 dias a 37°C e, depois deste período, 30 menos de f% da quantidade total inicial do sacarideo MenA conjugado será desconjugado, onde f é 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou inferior.

Oligossacarideos

Sacarideos capsulares serão geralmente usados sob a forma de oligossacarideos. Estes são convenientemente formados por fragmentação de polissacarideo capsular purificado (por exemplo, por hidrólise) , que será seguida normalmente pela purificação dos fragmentos do tamanho desej ado. A fragmentação dos polissacarideos é preferencialmente realizada para proporcionar um grau médio final de polimerização (DP) no oligossacarideo de menos de 30 (por exemplo, entre 10 e 20, preferencialmente cerca de 10 para o serogrupo A; entre 15 e 25 para os serogrupos W135 e Y, preferencialmente cerca de 15-20; entre 12 e 22 para o serogrupo C; etc.). DP pode convenientemente ser medido por cromatografia de troca iónica ou por ensaios colorimétricos [72] .

Antigenos de sacarideo MenC preferidos são revelados na referência 10, como usado em Menjugate™.

Se a hidrólise é realizada, o hidrolisado terá geralmente um tamanho de maneira a remover oligossacarideos curtos [73] . Isto pode ser conseguido de várias maneiras, tais como ultrafiltração seguida de cromatografia de troca iónica. Os oligossacarideos com um grau de polimerização de menos de ou igual a cerca de 6 são preferencialmente removidos para o serogrupo A, e aqueles com menos de cerca 31 de 4 são preferencialmente removidos para os serogrupos W135 e Y.

Conjugação covalente

Sacarideos capsulares em composições da invenção serão normalmente conjugados com proteína(s) transportadora(s). Em geral, a conjugação aumenta a imunogenicidade dos sacarideos uma vez que os converte de antígenos T-independentes em antígenos T-dependentes, permitindo assim aparelhamento para memória imunológica. A conjugação é particularmente útil para vacinas pediátricas [por exemplo, referência 74] e é uma técnica bem conhecida [por exemplo, revista nas referências 44 a 52, etc.].

Proteínas transportadoras preferidas são toxinas bacterianas ou toxoides, tais como toxoide diftérico ou toxoide tetânico. 0 toxoide diftérico CRMi97 [75-77] é particularmente preferido. Outras proteínas transportadoras adequadas incluem a proteína da membrana exterior de N. meningitidis [78], péptidos sintéticos [79,80], proteínas de choque térmico [81,82], proteínas pertussis [83, 84], citocinas [85], linfocinas [85], hormonas [85], fatores de crescimento [85], proteínas artificiais que compreendem múltiplos epítopos CD4+ de célula T humano de vários antígenos derivados de patógenos [86], proteína D de H.influenzae [87,88], proteína de superfície pneumocócica PspA [89], proteínas captadoras de ferro [90], toxina A ou B de C. difficile [91], etc. Veículos preferidos são toxoide diftérico, toxoide tetânico, proteína D de H. influenzae, e CRM197.

Dentro de uma composição da invenção, é possível usar mais do que uma proteína transportadora, por exemplo, para reduzir o risco de supressão do veículo. Assim, podem ser 32 usadas diferentes proteínas transportadoras para serogrupos diferentes, por exemplo, sacarídeos do serogrupo A podem ser conjugados com CRM197, enquanto sacarídeos do serogrupo C podem ser conjugados com toxoide tetânico. Também é possível usar mais do que uma proteína transportadora para um antígeno de sacarídeo particular, por exemplo, sacarídeos do serogrupo A podem estar em dois grupos, com alguns conjugados com CRM197 e outros conjugados com toxoide tetânico. Em geral, contudo, é preferido usar a mesma proteína transportadora para todos os sacarídeos.

Uma única proteína transportadora pode transportar mais do que um antígeno de sacarídeo [92]. Por exemplo, uma única proteína transportadora pode ter conjugados a si sacarídeos dos serogrupos A e C. Para atingir este objetivo, os sacarídeos podem ser misturados antes da reação de conjugação. Contudo, em geral, é preferido ter conjugados separados para cada serogrupo.

Conjugados com uma razão sacarídeo:proteína (p/p) de até 1:5 são preferidos. Razões de até 1:2 são preferidas, como são mais preferidas razões entre 1:1,25 e 1:2,5.

Conjugados podem ser usados em conjunção com proteína transportadora livre [93]. Quando uma determinada proteína transportadora está presente em ambas formas livre e conjugada numa composição da invenção, a forma não conjugada é preferencialmente não mais de 5% da quantidade total da proteína transportadora na composição como um todo, e mais preferencialmente presente em menos de 2% por peso. 33

Pode ser usada qualquer reação de conjugação adequada, com qualquer linker adequado quando necessário. 0 sacarídeo será tipicamente ativado ou tornado funcional antes da conjugação. A ativação pode envolver, por exemplo, reagentes cianilos tais como CDAP (por exemplo, l-ciano-4-dimetilamino piridinio tetrafluoroborato [ 94, 95,etc.]) . Outras técnicas adequadas usam carbodimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; ver também a introdução da referência 50).

Podem ser feitas ligações através um grupo de ligação usando qualquer procedimento conhecido, por exemplo, os procedimentos descritos nas referências 96 e 97. Um tipo de ligação envolve aminação redutora do polissacarideo, unindo o grupo amino resultante com um terminal do grupo de ligação de ácido adípico, e depois unindo uma proteína ao outro terminal do grupo de ligação de ácido adípico [48, 98, 99]. Outros linkers incluem B-propionamido [100], nitrofenil-etilamina [101], haletos de haloacilo [102], ligações glicosídicas [103], ácido 6-aminocapróico [104], ADH [105], metades C4 a C12 [106] etc. A ligação direta à proteína pode compreender oxidação do polissacarideo seguida de aminação redutora com a proteína, como descrito, por exemplo, nas referências 107 e 108.

Um processo envolvendo a introdução de grupos amino no sacarídeo (por exemplo, substituindo grupos terminal =0 com -NH2) seguido de derivatização com um diéster adípico (por exemplo, ácido diéster adípico N-hidroxisuccinimido) e reação com a proteína transportadora é preferido. Outra 34 reação preferida usa ativação de CDAP com um veiculo da proteina D, por exemplo, para MenA ou MenC.

Após a conjugação, sacarideos livres e conjugados podem ser separados. Existem muitos métodos adequados, incluindo cromatografia hidrofóbica, ultrafiltração tangencial, diafiltração, etc. [ver também referências 109 e 110, etc. ] .

Onde a composição da invenção inclui um oligossacarideo conjugado, é preferido que a preparação do oligossacarideo preceda a conjugação.

Preparação de composições da invenção

Composições da invenção compreendem sacarideos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis. Os sacarideos são preferencialmente preparados separadamente (incluindo qualquer fragmentação, conjugação, etc.) e depois misturados para proporcionar uma composição da invenção. É preferido que o sacarideo do serogrupo A não seja combinado com outro sacarideo(s) até um pouco antes do uso, de maneira a minimizar o potencial para hidrólise. Isto pode ser convenientemente conseguido tendo o componente do serogrupo A (tipicamente junto com excipientes apropriados) sob a forma liofilizada e o(s) outro(s) componente(s) do serogrupo sob a forma líquida (também com excipientes apropriados), sendo os componentes liquidos usados para reconstituir o componente MenA liofilizado quando pronto para ser usado. Onde um adjuvante de sal de aluminio é usado, é preferido incluir o adjuvante no frasco que contém 35 com a vacina líquida, e liofilizar o componente MenA sem o adj uvante.

Uma composição da invenção pode, assim, ser preparada a partir de um kit compreendendo: (a) sacarídeo capsular do serogrupo A de N. meningitidis, sob a forma liofilizada; e (b) sacarídeos capsulares dos serogrupos C, W135 e Y, de N. meningitidis sob a forma líquida. A invenção também providencia um método para preparar uma composição da invenção, que compreende misturar um sacarídeo capsular liofilizado do serogrupo A de N. meningitidis com sacarídeos capsulares dos serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis em que ditos sacarídeos se encontram sob a forma líquida. A invenção também providencia uma composição da invenção, que compreende sacarídeos capsulares dos serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis em que os sacarídeos se encontram sob a forma líquida. Esta composição é empacotada com um antígeno de sacarídeo do serogrupo A liofilizado, para reconstituição.

Apresentação das composições da invenção

Composições da invenção podem ser apresentadas e empacotadas em várias maneiras.

As composições podem ser apresentadas em frascos, ou podem ser apresentadas em seringas cheias prontas a usar. As seringas podem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa incluirá uma dose única da composição, ao passo que um frasco pode incluir uma dose única ou múltiplas doses. Composições injetáveis serão normalmente soluções líquidas ou suspensões. Em alternativa, podem ser apresentadas sob a 36 forma sólida (por exemplo, liofilizadas) para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção.

Composições da invenção podem ser empacotadas sob a forma de dose unitária ou sob a forma de múltiplas doses. Para formas de múltiplas doses, os frascos são preferidos às seringas cheias. Volumes de dosagem eficazes podem ser rotineiramente estabelecidos, mas uma dose típica humana da composição para injeção tem um volume de 0,5 ml.

Onde uma composição da invenção é para ser preparada extemporaneamente antes do uso (por exemplo, onde o sacarídeo do serogrupo A é apresentado sob a forma liofilizada) e é apresentada como um kit, o kit pode compreender dois frascos, ou pode compreender uma seringa cheia pronta a usar e um frasco, sendo os conteúdos da seringa usados para reativar os conteúdos do frasco antes da injeção.

Dentro de cada dose, a quantidade de um antígeno de sacarideo individual será geralmente mais de lyg (medido como massa do sacarideo), com cerca de 2,5 yg, 5 yg ou 10 yg de cada sendo preferido. Com razões A:C:W135:Y por peso de 1:1:1:1,- 1:1:1:2,- 2:1:1:1,- 4:2:1:1,- 8:4:2:1,- 4:2:1:2,-8:4:1:2,- 4:2:2:1,- 2:2:1:1,- 4:4:2:1,- 2:2:1:2,- 4:4:1:2,- e 2:2:2:1, como tal, a quantidade representada pela figura 1 é preferencialmente cerca de 2,5 yg, 5 yg ou 10 yg.

Composições preferidas têm cerca dos seguintes yg de sacarídeo por dose: A 10 5 2,5 C 5 5 2,5 37 W135 5 5 2,5 Y 5 5 2,5

As composições da invenção compreendem <25 pg de sacarideo meningocócico por dose. Outras composições preferidas compreendem ^20 de sacarideo meningocócico por dose. As composições da invenção compreendem, pelo menos, 10 pg de sacarideo meningocócico por dose.

As composições da invenção são preferencialmente estéreis. São preferencialmente livres de pirogénios. São preferencialmente tamponadas, por exemplo, a pH entre 6 e 8, geralmente cerca de pH 7. Onde uma composição compreende um sal de hidróxido de alumínio, é preferido usar um tampão de histidina [111] . As composições da invenção podem ser isotónicas com respeito aos humanos. 38

Adjuvantes

As composições incluirão geralmente um ou mais adjuvantes. 0(s) adjuvante(s) pode(m) ser adicionado(s) aos sacarideos antes e/ou depois deles serem misturados para formar uma composição da invenção, mas é preferido combinar o adjuvante com um antigeno de sacarideo antes de misturar os diferentes sacarideos.

Contudo, não é necessário que a cada sacarideo tenha que ser adicionado um adjuvante antes de tal mistura. Adjuvante em excesso pode ser incluído numa preparação de sacarideo de tal maneira que, quando mais antigeno(s) de sacarideo sem adjuvantes é/são adicionados, o excesso é diluído numa concentração final desejada. Numa modalidade particular, onde a composição da invenção é preparada a partir de um antigeno liofilizado (por exemplo, um componente do serogrupo A liofilizado) pode ser preferido não incluir um adjuvante no material liofilizado.

Adjuvantes preferidos para inclusão em composições da invenção são sais de alumínio (alum), tais como hidróxidos de alumínio (incluindo oxihidróxidos), fosfatos de alumínio (incluindo hidroxifosfatos), sulfato de alumínio, etc. [Capítulos 8 e 9 na referência 112]. Hidroxifosfato de alumínio é particularmente preferido, particularmente em composições que incluem um antigeno de sacarideo de H. influenzae, e um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com uma razão molar PO4/AI entre 0,84 e 0,92, incluída a 0,6 mg Al3+/ml. A adsorção com uma dose baixa de fosfato de alumínio pode ser usada, por exemplo, entre 50 e 100pgAl3+ por conjugado por dose. Onde existe mais do que um conjugado numa composição, não todos os conjugados precisam de ser adsorvidos. Os conjugados 39

Menjugate™ e NeisVac™ MenC usam um adjuvante hidróxido, enquanto Meningitec™ usa um fosfato.

Fosfato de cálcio é outro adjuvante preferido.

Outros adjuvantes que podem ser usados em adição a ou em lugar de sais de aluminio incluem: A. Composições que contêm minerais

As composições que contêm minerais adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de aluminio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais tais como hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) , sulfatos, etc. [por exemplo, ver capítulos 8 e 9 da referência 112], ou misturas de compostos minerais diferentes, tomando os compostos qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), e sendo a adsorção preferida. As composições que contêm minerais também podem ser formuladas como uma partícula de sal de metal [113] . B. Emulsões oleosas

As composições de emulsões oleosas adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões de água Squalene, tais como MF59 [Capítulo 10 da referência 112; ver também referência 114] (5% Squalene, 0,5% Tween 80, e 0,5% Span 85, formuladas em partículas submicrónicas usando um microfluidizador) . Adjuvante Completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA) também podem ser usados. 40 C. Formulações de saponina [capítulo 22 da referência 112]

As formulações de saponina também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. As saponinas são um grupo heterólogo de glicosideos esteróis e glicosideos triterpenóides que são encontrados na casca, folhas, caules, raizes e até em flores de um grande conjunto de espécies de plantas. As saponinas da casca da árvore Quillaia saponaria, Molina têm sido amplamente estudadas como adjuvantes. As saponinas também podem ser obtidas comercialmente a partir de Smilax ornata (cerveja de raiz), Gypsophilla paniculata (véu de noiva), e Saponaria officianalis (sabão de raiz). As formulações de adjuvante de saponina incluem formulações purificadas, tais como QS21, bem como formulações lipidicas, tais como ISCOMs. QS21 é comercializado como Stimulon™.

As composições de saponina têm sido purificadas usando HPLC e RP-HPLC. Têm sido identificadas frações purificadas especificas usando estas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. Preferencialmente, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na referência 115. Formulações de saponina também podem compreender um esterol, tal como colesterol [116] .

Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas únicas chamadas complexos imunoestimuladores (ISCOM's) [capítulo 23 da referência 112]. Os ISCOM's incluem também tipicamente um fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOM's. 41

Preferencialmente, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC. ISCOM's são ainda descritos nas referências 116-118. Opcionalmente, os ISCOM's podem ser desprovidos de detergente adicional [119].

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseados em saponinas pode ser encontrada nas referências 120 e 121. D. Virossomas e partículas tipo vírus

Os virossomas e partículas tipo vírus (VLP's) também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Estas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus opcionalmente combinado ou formulado com um fosfolípido. São geralmente não patogénicos, não replicantes e geralmente não contêm qualquer do genoma virai nativo. As proteínas virais podem ser produzidas por recombinação ou isoladas a partir dos vírus inteiros. Estas proteínas virais adequadas para uso em virossomas ou VLP's incluem proteínas derivadas do vírus da influenza (tais como HA ou NA), vírus da Hepatite B (tais como proteínas do núcleo ou da cápside), vírus da Hepatite E, vírus do sarampo, vírus Sindbis, Rotavírus, vírus da doença do pé e boca, Retrovírus, vírus de Norwalk, vírus do papiloma humano, HIV, RNA-fagos, QP-fago (tais como proteínas de revestimento), GA-fago, fr-fago, AP205 fago, e Ty (tais como proteína pl retrotransposon Ty) . VLP's são discutidos adicionalmente nas referências 122-127. Os virossomas são discutidos ainda, por exemplo, na referência 128. E. Derivados bacterianos ou microbianos 42

Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos tais como derivados não tóxicos de lipopolissacarideo enterobacteriano (LPS), derivados do Lipido A, oligonucleotideos imunoestimulatórios e toxinas ADP-ribosilantes e derivados desintoxicantes dos mesmos.

Derivados não tóxicos de LPS incluem monofosforil lipido A (MPL) e MPL 3-0-deacilado (3dMPL) . 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipido A 3 de-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Uma forma de "partícula pequena" preferida de monofosforil lipido A 3 de-O-acilado é revelada na referência 129. Tais "partículas pequenas" de 3dMPL são suficientemente pequenas para serem filtradas estéreis através de uma membrana com 0,22 ym [129]. Outros derivados não tóxicos de LPS incluem mimicos do monofosforil lipido A, tais como derivados do fosfato de aminoalquilo glucosaminida, por exemplo, RC-529 [130,131].

Os derivados do Lipido A incluem derivados de lipido da Escherichia coli tais como OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, nas referências 132 e 133.

Oligonucleotideos imunoestimulatórios adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem sequências nucleotidicas que contêm um motivo CpG (uma sequência dinucleotidica que contém uma citosina não metilada ligada por uma ligação fosfato a uma guanosina). ARN's de cadeia dupla e oligonucleotideos contendo sequências palindrómicas ou poli(dG) também foram mostradas como sendo imunoestimulatórias. 43

Os CpG's podem incluir modificações/análogos dos nucleotideos tais como modificações fosforotioato e podem ser de cadeia dupla ou de cadeia simples. As referências 134, 135 e 136 revelam possiveis substituições análogas, por exemplo, substituição de guanosina com 2'-deoxi-7-deazaguanosina. 0 efeito adjuvante de oligonucleotideos de CpG é discutido ainda nas referências 137-142. A sequência CpG pode ser dirigida para TLR9, tal como o motivo GTCGTT ou TTCGTT [143] . A sequência CpG pode ser especifica para induzir uma resposta imune Thl, tal como CpG-A ODN, ou pode ser mais especifica para induzir uma resposta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A e CpG-B ODNs são discutidas nas referências 144-146. Preferencialmente, o CpG é uma CpG-A ODN.

Preferencialmente, o oligonucleotideo CpG é construído de maneira que o terminal 5' está acessível para reconhecimento do recetor. Opcionalmente, duas sequências de oligonucleotideos CpG podem ser anexadas aos seus terminais 3' para formar "imunómeros". Ver, por exemplo, as referências 143 e 147-149.

Toxinas bacterianas ADP-ribosilantes e derivados desintoxicados das mesmas podem ser usados como adjuvantes na invenção. Preferencialmente, a proteína é derivada da E. coli (enterotoxina lábil ao calor da E. coli "LT"), cólera ("CT"), ou pertussis ("PT"). 0 uso de toxinas desintoxicadas ADP-ribosilantes como adjuvantes das mucosas está descrito na referência 150 e como adjuvantes parenterais na referência 151. A toxina ou toxoide está preferencialmente sob a forma de uma holotoxina, que compreende ambas subunidades A e B. Preferencialmente, a 44 subunidade A contém uma mutação desintoxicadora; preferencialmente a subunidade B não é mutada. Preferencialmente, o adjuvante é um mutante desintoxicado de LT tal como LT-K63, LT-R72, e LT-G192. 0 uso de toxinas ADP-ribosilantes e derivados desintoxicados das mesmas, particularmente LT-K63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas referências 152-159. A referência numérica para substituições de aminoácidos é preferencialmente baseada nos alinhamentos das subunidades A e B das toxinas ADP-ribosilantes apresentadas na referência 160, especificamente incorporada aqui por referência na sua totalidade. F. Imunomoduladores humanos

Imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [161], etc.) [162], interferões (por exemplo, interferão -y) , fator estimulador de colónias de macrófagos, e fator de necrose tumoral. G. Bioadesivos e mucoadesivos

Bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluem microsferas de ácido hialurónico esterifiçadas [163] ou mucoadesivos tais como derivados com ligação cruzada de ácido poli(acrílico), álcool polivinílico, polivinil pirolidona, polissacarídeos e carboximetilcelulose. Quitosano e derivados do mesmo também podem ser usados como adjuvantes na invenção [164]. 45 H. Micropartículas

Micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. As micropartículas (isto é, uma partícula de -100 nm a -150 pm em diâmetro, mais preferencialmente -200 nm a -30 pm em diâmetro, e mais preferencialmente -500 nm a -10 pm em diâmetro) formadas a partir de materiais que são biodegradáveis e não tóxicos (por exemplo, um ácido poli(α-hidroxi), um ácido polihidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona, etc.), com poli(lactido-co-glicolido) são preferidos, opcionalmente tratados para ter uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiónico, tal como CTAB). I. Lipossomas (Capítulos 13 e 14 da referência 112)

Exemplos de formulações de lipossomas adequados para uso como adjuvantes estão descritos nas referências 165-167. J. Formulações de éter de polioxietileno e éster de polioxietileno

Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno [168]. Tais formulações incluem ainda tensioativos de éster de sorbitano polioxietileno em combinação com um octoxinol [169] bem como éteres de alquilo polioxietileno ou tensioativos de éster em combinação com, pelo menos, um tensioativo não iónico adicional tal como um octoxinol [170] . Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados a partir do grupo seguinte: éter de polioxietileno- 9- 46 lauril (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteoril, éter de polioxitileno-8-esteoril, éter de polioxietileno-4-lauril, éter de polioxietileno-35-lauril, e éter de polioxietileno-23-lauril. K. Polifosfazeno (PCPP)

Formulações de PCPP estão descritas, por exemplo, nas referências 171 e 172. L. Péptidos de muramilo

Exemplos de péptidos de muramilo adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetilmuramil-L-tre-onil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), e N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). M. Compostos de imidazoquinolona

Exemplos de compostos de imidazoquinolona adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem Imiquamod e os seus homólogos (por exemplo, "Resiquimod 3M"), descritos nas referências 173 e 174. A invenção também pode compreender combinações de um ou mais dos adjuvantes identificados anteriormente. Por exemplo, as seguintes composições de adjuvante podem ser usadas na invenção: (1) uma saponina e uma emulsão óleo em água [175]; (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) [176]; (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado não tóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol; (4) uma 47 saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) [177]; (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo em água [178]; (6) SAF, contendo 10% de Squalane, 0,4% de Tween 84™, 5% de polímero de bloco plurónico L121, e thr-MDP, seja microfluidizado numa emulsão submicrónica ou em vortex para gerar uma emulsão de tamanho de partículas maiores. (7) O sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) contendo 2% de Squalene, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede da célula bacteriana do grupo que consiste em monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox™) ; e (8) um ou mais sais minerais (tal como um sal de alumínio) + um derivado não tóxico de LPS (tal como 3 dMP L).

Outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes são reveladas no capítulo 7 da referência 112 .

Onde um fosfato de alumínio é usado, é possível adsorver um ou mais dos sacarídeos ao sal de alumínio, mas é preferido não o fazer, e isto é favorecido incluindo iões de fosfato livres em solução (por exemplo, através do uso de um tampão de fosfato) . Onde um hidróxido de alumínio é usado, é preferido adsorver os sacarídeos ao sal. O uso do hidróxido de alumínio como um adjuvante pode ser preferido para sacarídeos do serogrupo A. É possível nas composições da invenção adsorver alguns antígenos a um hidróxido de alumínio mas ter outros antígenos em associação com um fosfato de alumínio. Para as combinações tetravalentes de serogrupo de N. meningitidis 48 da invenção, por exemplo, estão disponíveis as seguintes permutações:

Serogrupo Sal de alumínio (H = um hidróxido; P = um fosfato) Ά P H P H H H P P P H H H P P P H C P H H P H H P H H P P H P H P P W135 P H H H P H H P H H P P P P H P Y P H H H H P H H P P H P H P P P

Componentes adicionais das composições

Além dos antígenos descritos anteriormente, composições da invenção podem incluir antígenos de proteína meningocócica.

Antígenos não meningocócicos e não neisserianos, preferencialmente uns que não diminuam a resposta imune contra os componentes meningocócicos, também podem ser incluídos. A referência 179, por exemplo, revela combinações de oligossacarídeos dos serogrupos B e C de N. meningitidis junto com o sacarídeo Hib. Antígenos de pneumococos, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, B. pertussis, difteria, tétano, poliomielite e/ou H. influenzae são preferidos. Antígenos particularmente preferidos incluem: - um antígeno diftérico, tal como um toxoide diftérico [por exemplo, capítulo 3 da referência 180]. - um antígeno tetânico, tal como um toxoide tetânico [por exemplo, capítulo 4 da referência 180]. - holotoxina pertussis (PT) e hemoglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [por exemplo, referências 181 e 182]. - antígeno pertussis celular. - um antígeno do vírus da hepatite A, tal como vírus 49 desativado [por exemplo, 183, 184]. - um antígeno do vírus da hepatite B, tal como antígenos de núcleo e/ou superfície [por exemplo, 184, 185], com antígeno de superfície sendo preferencialmente adsorvidos num fosfato de alumínio [186].

Preparações de microvesícuias serogrupo B de N. meningitidis [187], "OMV's nativos" [188], blebs ou vesículas da membrana exterior [por exemplo, referências 189 a 190 191 192 193 194, etc.]. Estas podem ser preparadas a partir de bactérias que foram manipuladas geneticamente [195-196 197 198], por exemplo, para aumentar a imunogenicidade (por exemplo, imunogenes hiper-express), para reduzir a toxicidade, para inibir a síntese de polissacarídeo capsular, para regular para baixo a expressão de PorA, etc. Podem ser preparadas a partir de estirpes hiper-blebbing [199-200 201 202]. As vesículas de uma Neisseria não patogénica podem ser incluídas [203] . OMV's podem ser preparados sem o uso de detergentes [204,205]. Podem expressar proteínas não neisserianas na sua superfície [206]. Podem ser escassas em LPS. Podem ser misturadas com antígenos recombinantes [189,207]. Vesículas de bactérias com subtipos diferentes de proteínas classe I da membrana exterior podem ser usadas, por exemplo, seis subtipos diferentes [208,209] usando duas populações diferentes de vesículas fabricadas por engenharia genética cada exibindo três subtipos, ou nove subtipos diferentes usando três populações diferentes de vesículas fabricadas por engenharia genética cada exibindo três subtipos, etc. Subtipos úteis incluem: Pl.7,16; PI.5-1,2-2; Pl.19,15-1; PI.5-2,10; Pl.12-1,13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; Pl.7-1,1; P1.18-1,3,6. - antígeno(s) da poliomielite [por exemplo, 210, 211] tal como IPV. 50 A mistura pode compreender um ou mais destes antígenos adicionais, que podem ser desintoxicados quando necessário (por exemplo, desintoxicação de toxina pertussis por meios químicos e/ou genéticos).

Onde um antígeno diftérico é incluído na mistura é preferido também incluir antígeno tetânico e antígenos pertussis. Do mesmo modo, onde um antígeno tetânico é incluído é preferido também incluir antígenos diftérico e pertussis. Do mesmo modo, onde um antígeno pertussis é incluído é preferido também incluir antígenos diftérico e tetânico. Tais combinações DTP podem ser usadas para reconstituir conjugados liofilizados.

Antígenos na mistura estão tipicamente presentes numa concentração de, pelo menos, 1 yg/ml cada. Em geral, a concentração de qualquer dado antígeno será suficiente para despoletar uma resposta imune contra esse antígeno.

Como alternativa ao uso de antígenos de proteínas na mistura, pode ser usado o antígeno que codifica o ácido nucleico. Componentes proteicos da mistura podem, assim, ser substituídos por ácido nucleico (preferencialmente ADN por exemplo, sob a forma de um plasmídeo) que codifica a proteína. Do mesmo modo, composições da invenção podem compreender proteínas que imitam antígenos de sacarídeo, por exemplo, mimotopos [212] ou anticorpos anti-idiotipo. Estes podem substituir os componentes individuais de sacarina, ou podem suplementá-los. Como um exemplo, a vacina pode compreender um mímico de péptido do polissacarídeo capsular MenC [213] ou MenA [214] em lugar do próprio sacarídeo. 51

Composições da invenção podem incluir um antimicrobiano, particularmente quando empacotadas em formato de múltiplas doses.

Composições da invenção podem compreender detergentes (por exemplo, um Tween (polissorbato) , tais como Tween 80) em niveis baixos (por exemplo, <0,01%).

Composições da invenção podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para proporcionar tonicidade. A concentração de 10±2 mg/ml de NaCl é tipica.

Composições da invenção incluirão geralmente um tampão. Um tampão de fosfato é típico.

Composições da invenção podem compreender um álcool de açúcar (por exemplo, manitol) ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose [215] ou trealose [216]) por exemplo, cerca de 15-30 mg/ml (por exemplo, 25 mg/ml), particularmente se é para serem liofilizados ou se incluem material que foi reconstituído a partir de material liofilizado. O pH de uma composição para liofilização pode ser ajustado para cerca de 6,1 antes da liofilização. A invenção providencia a composição da reivindicação 1, em que a composição ainda compreende sacarose. Os sacarídeos são preferencialmente oligossacarídeos. A composição deverá compreender, pelo menos, 10 yg e <25 yg de sacarídeo meningocócico total por dose (por exemplo ^20 yg, 10 yg). Podem ser usados sacarídeos modificados MenA. A composição pode estar sob a forma aquosa ou seca (por exemplo, liofilizada). Quando na forma aquosa, a 52 concentração de sacarose é preferencialmente entre 5-50 mg/ml por exemplo, cerca de 25 mg/ml. Quando na forma liofilizada, é preferido que a composição não inclua um adjuvante de sal de alumínio. A composição pode compreender adicionalmente um antígeno de um ou mais do (a) serogrupo B de N. meningitidis; (b) Haemophilus influenzae tipo B; e/ou (c) Streptococcus pneumoniae. 53

Imunogenicidade

Composições da invenção são imunogénicas. Composições imunogénicas preferidas são vacinas. As vacinas, de acordo com a invenção, podem tanto ser profiláticas (isto é, para prevenir a infeção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a doença após a infeção), mas serão tipicamente profiláticas.

Composições imunogénicas e vacinas da invenção compreenderão tipicamente, além dos antigenos descritos anteriormente, "veículos farmaceuticamente aceitáveis", que incluem qualquer veiculo que não induza ele próprio a produção de anticorpos nefastos para o indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados são tipicamente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, ácidos aminopoliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarose, trealose [216], lactose, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas), partículas de vírus inativas. Tais veículos são bem conhecidos àqueles com habilitação comum na arte. As vacinas também podem conter diluentes, tais como água, solução salina, glicerol, etc. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes emulsionantes ou humidificadores, substâncias tamponantes de pH, e afins, podem estar presentes. Solução salina fisiológica tamponada com fosfato, estéril e livre de pirogénios é um veículo típico. Uma discussão mais exaustiva de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência 217 .

Composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de cada antígeno, bem como de quaisquer outros dos componentes 54 previamente mencionados, conforme necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" entende-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, seja em dose única ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, idade, grupo taxonómico a ser tratado (por exemplo, primata não humano, humano, etc.), da capacidade do sistema imune de um indivíduo sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação da situação médica feita pelo médico que prescreve o tratamento, e outros fatores relevantes. A quantidade cai dentro de um intervalo relativamente amplo que pode ser determinado através de ensaios de rotina, e uma quantidade típica de cada antígeno de sacarídeo meningocócico por dose é entre 1 yg e 20 yg, por exemplo, cerca de 1 yg, cerca de 2,5 yg, cerca de 4 yg, cerca de 5 yg, ou cerca de 10 yg (expressa como sacarídeo). A imunogenicidade de composições da invenção pode ser determinada administrando-as a sujeitos teste (por exemplo, crianças com 12-16 meses de idade, ou modelos animais [218]) e depois determinando parâmetros padrão incluindo anticorpos bactericidas do soro (SBA) e títulos de ELISA (GMT) de IgG anti-cápsula total e de alta avidez. Estas respostas imunes serão geralmente determinadas por volta das 4 semanas após a administração da composição, e comparadas com valores determinados antes da administração da composição. Um aumento da SBA de, pelo menos, 4 vezes ou 8 vezes é preferido. Onde mais do que uma dose da composição é administrada, pode ser feita mais do que uma determinação pós-administração. 55

Composições preferidas da invenção podem conferir um titulo de anticorpos num paciente que é superior ao critério para seroproteção para cada componente antigénico para uma percentagem aceitável de sujeitos humanos. Antigenos com um titulo de anticorpo associado acima do qual um hospedeiro é considerado ter-se seroconvertido contra o antigeno são bem conhecidos, e tais titulos estão publicados por organizações tais como a WHO.

Preferencialmente mais de 80% de uma amostra estatisticamente significativa de sujeitos é seroconvertida, mais preferencialmente mais de 90%, ainda mais preferencialmente mais de 93% e mais preferencialmente 96-100%.

Administração de composições da invenção

Composições da invenção são injetáveis.

Injeção parenteral pode ser subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular. A administração intramuscular na coxa ou no braço anterior é preferida. A injeção pode ser através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas injeção sem agulha pode ser usada em alternativa. Um valor tipico de dose intramuscular é 0,5 ml. A administração pode ser um esquema de dose única ou um esquema de múltiplas doses. Doses múltiplas podem ser usadas num esquema de imunização primária e/ou num esquema de imunização de reforço. Um esquema de dose primário pode ser seguido de um esquema de dose de reforço. Intervalos de tempo adequados entre doses primárias (por exemplo, entre 4-16 semanas), e entre primárias e de reforço, podem ser determinados rotineiramente. 56 A administração será geralmente a um animal e, em particular, sujeitos humanos podem ser tratados. As composições são particularmente úteis para vacinar crianças e adolescentes.

Usos médicos A invenção providencia o uso no fabrico de um medicamento injetável para despoletar uma resposta imune num paciente, de uma composição da invenção. A resposta imune é preferencialmente protetora contra a doença meningocócica, e pode compreender uma resposta imune humoral e/ou uma resposta imune celular. 0 paciente é preferencialmente uma criança. 0 medicamento pode despoletar uma resposta de aumento, num paciente gue já foi imunizado contra a N. meningitidis. A invenção também providencia o uso de (i) sacarideos capsulares de, pelo menos, dois dos serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis em gue ditos sacarideos capsulares são conjugados com proteínas transportadoras e/ou são oligossacarídeos, e (ii) um antígeno de um ou mais do (a) serogrupo B de N. meningitidis; (b) Haemophilus influenzae tipo B; e/ou (c) Streptococcus pneumoniae, no fabrico de um medicamento injetável para despoletar uma resposta imune num animal. 0 medicamento é preferencialmente para prevenção e/ou tratamento de meningite bacteriana.

Uma maneira de verificar a eficácia de um tratamento terapêutico envolve monitorizar a infeção bacteriana após administração da composição da invenção. Uma maneira de 57 verificar a eficácia do tratamento profilático envolve monitorizar as respostas imunes contra os antígenos administrados após a administração da composição.

Hospedeiro heterólogo

Enquanto a expressão de polipeptídeos para uso nas composições da invenção pode ocorrer no hospedeiro nativo (por exemplo, num N. meningitidis ou S. pneumoniae) , um hospedeiro heterólogo é preferencialmente usado. 0 hospedeiro heterólogo pode ser procarionte (por exemplo, uma bactéria) ou eucarionte. É preferencialmente E.coli, mas outros hospedeiros adequados incluem Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactmnica, Neisseria cinerea, Micobactérias (por exemplo, M. tuberculosis), levedura, etc.

Geral 0 termo "compreendendo" significa "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, a composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, a composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

As estirpes bacterianas podem ser indicadas como um subescrito, por exemplo, 741Mc58 é a proteina 741 da estirpe 58 MC58. A menos que indicado o contrário, as proteinas mencionadas aqui (por exemplo, sem subescrito) são da estirpe 2 996 de N. meningitidis, que pode ser tomada como uma estirpe "referência". Será apreciado, contudo, que a invenção não seja em geral limitada pela estirpe. Como mencionado previamente, referências gerais a uma proteina (por exemplo, '287', '919' etc.) podem ser tomadas para incluir aquela proteina de qualquer estirpe. Isto terá tipicamente uma identidade de sequência com a 2996 de 90% ou mais (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) . Onde são usadas proteinas híbridas, os antígenos individuais dentro do híbrido (isto é, metades-X-individuais) podem ser de uma ou mais estirpes. Onde n=2, por exemplo, X2 pode ser da mesma estirpe que Xi ou de uma estirpe diferente. Onde n=3, as estirpes podem ser (i) Xi = X2 = X3 (ii) Xi = X2 Φ X3 (iii) Xi Φ X2 = X3 (iv) Xi Φ X2 Φ X3 ou (v) Χι=Χ3 Φ X2, etc. O termo "alquilo" refere-se a grupos alquilo tanto nas formas ramificadas como lineares. O grupo alquilo pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados de -O-, -NH- ou -S-. O grupo alquilo também pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 ligações duplas e/ou triplas. No entanto, o termo "alquilo" normalmente refere-se a grupos alquilo que não têm interrupções de heteroátomos ou interrupções de ligação dupla ou tripla. Onde é feita referência a C1-12 alquilo, significa que o grupo alquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 12 (por exemplo, Ci, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C3, Cg, Cio, Cu, Ci2) . Do mesmo modo, onde é feita referência a C1-6 alquilo, significa que o grupo alquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 6 (por exemplo, Ci, C2, C3, C4, C5, Cg) . 59 0 termo "cicloalquilo" inclui cicloalquilo, policicloalquilo, e grupos cicloalquenilo, bem como combinações destes com grupos alquilo, tais como grupos cicloalquiloalquilo. 0 grupo cicloalquilo pode ser interrompido com 1, 2 ou 3 heteroátomos selecionados de -0-, -NH- ou -S-. No entanto, o termo "cicloalquilo" normalmente refere-se a grupos cicloalquilo sem interrupções de heteroátomos. Exemplos de grupos cicloalquilo incluem grupos ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo e adamantilo. Onde é feita referência a C3-12 cicloalquilo, significa que o grupo cicloalquilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 3 e 12 (por exemplo, C3, C4, C5, Ce, C7, Cs, Cg, Cio, Cu, C12) · 0 termo "arilo" refere-se a um grupo aromático, tal como fenilo ou naftilo. Onde é feita referência a C5-12 arilo, significa que o grupo arilo pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 5 e 12 (por exemplo, C5, Cβ, C7, C8, Cg, Cio, Cu, C12) · 0 termo "C5-12 aril-Ci_6 alquilo" refere-se a grupos tais como benzilo, feniletilo e naftilmetilo.

Grupos protetores de azoto incluem grupos sililo (tais como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tais como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benziloxicarbonilo (Z ou Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2- (trimetilsilil)etoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troe)), derivados do sulfonilo (tais como [β- trimetilsililetanesulfonilo (SES)), derivados do sulfenilo, 60

Ci-i2 alquilo, benzilo, benzidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Um grupo protetor de azoto preferido é Fmoc.

Será apreciado que anéis de açúcar possam existir em forma aberta e fechada e que, enquanto as formas fechadas sejam mostradas nas fórmulas estruturais aqui, as formas abertas são também abrangidas pela invenção.

As sequências incluídas para facilitar a clonagem ou purificação, etc., não contribuem necessariamente para a invenção e podem ser omitidas ou removidas.

Polipeptídeos da invenção podem ser preparados por vários meios (por exemplo, expressão recombinante, purificação a partir de cultivo celular, síntese química (pelo menos, em parte), etc.) e em várias formas (por exemplo, nativas, fusões, não-glicosiladas, lipidadas, etc.). São preferencialmente preparadas na forma substancialmente pura (isto é, substancialmente livre de outras proteínas de N. meningitidis ou da célula hospedeira).

De acordo com a invenção os ácidos nucleicos podem ser preparados de muitas maneiras (por exemplo, por síntese química (pelo menos, em parte), de bibliotecas genómicas ou de cADN, do próprio organismo, etc.) e podem tomar várias formas (por exemplo, cadeia simples, cadeia dupla, vetores, sondas, etc.). São preferencialmente preparados na forma substancialmente pura (isto é, substancialmente livre de outros ácidos nucleicos de N. meningitidis ou da célula hospedeira). O termo "ácido nucleico" inclui ADN e ARN, e também os seus análogos, tais como aqueles que contêm 61 espinhas dorsais modificadas (por exemplo, fosforotioatos, etc.), e também ácidos nucleicos peptídicos (ANP) etc. A invenção inclui ácido nucleico compreendendo sequências complementares àquelas descritas anteriormente (por exemplo, para fins de anti-senso ou de sondas).

Após o serogrupo, a classificação meningocócica inclui serotipo, serosubtipo e depois imunotipo, e as listas de nomenclatura padrão serogrupo, serotipo, serosubtipo, e imunotipo, cada separado por uma vírgula, por exemplo, B : 4:PI.15:L3,7, 9. Dentro do serogrupo B, algumas linhagens causam frequentemente doença (hiperinvasiva), algumas linhagens causam formas mais severas da doença do que outras (hipervirulentas) , e outras raramente causam doença de todo. São reconhecidas sete linhagens hipervirulentas, nomeadamente subgrupos I, III e IV-1, complexo ET-5, complexo ET-37, grupo A4 e linhagem 3. Estas foram definidas por eletroforese enzimática multilocus (fuga), mas também tem sido usada tipagem de sequências multilocus (MLST) para classificar meningococos [referência 41].

MODOS PARA EXECUTAR A INVENÇÃO 1. Composições de sacarídeo meningocócico para administração intramuscular humana

Os oligossacarideos conjugados de MenC, MenW135, MenY e, opcionalmente, MenA foram preparados como revelado na referência 7. Estes foram usados para preparar doses individuais de 0,5 ml das seguintes seis composições (quantidades por 0,5 ml de dose): 62

Componente A* B c* D* E* F Conjugado do oligossacarideo CRM191 do Serogrupo A pg 10 0 10 5 2,5 0 Conjugado do oligossacarideo CRM197 do Serogrupo C pg 10 10 5 5 2,5 10 Conjugado do oligossacarideo CRM197 do Serogrupo W135 pg 10 10 5 5 2,5 0 Conjugado do oligossacarideo CRM197 do Serogrupo Y pg 10 10 5 5 2,5 0 Adjuvante de fosfato de alumínio mg 00 o Cloreto de sódio mg 4,5 Manitol mg 7,5 Fosfato de sódio monobásico (pH 7,6) mg 0, 69 Dihidrogenofosfato de potássio mg 0,34 Tween™ 80 mg 0, 025 * 0 componente do serogrupo A estava na forma liofilizada e foi diluído com uma composição CWY líquida para proporcionar a composição ACWY final.

Estas vacinas são administradas por injeção intramuscular na região da coxa a crianças com 12-16 meses de idade, tanto em dose única (que é eficaz para Menjugate™ em crianças >12 meses) ou com uma segunda injeção 4 semanas depois. Os soros BCA e IgG podem ser comparados antes da vacinação e após a vacinação (por exemplo, às 4 semanas, e depois às 8 semanas se foram recebidas duas doses). 2. Composição em dois frascos

Conjugados para uso humano foram preparados em dois frascos separados. 0 frasco 1 continha um pó liofilizado de conjugado de MenA, com sacarose e dihidrogeno fosfato de potássio. 0 frasco 2 continha os conjugados de MenC, MenW135 e MenY, com cloreto de sódio, polissorbato 80, 63 63 tampão de fosfato alumínio opcional, uso, o frasco 1 é frasco 2, para administração. de sódio, e um adjuvante de fosfato de que está presente em suspensão. Antes do reconstituído com 0,6 ml de líquido do proporcionar 0,5 ml disponível para

Três doses foram preparadas. Na forma reconstituída, as vacinas continham antígenos como se segue:

Componente Quantidade por 0,5 ml de dose Conjugado do Serogrupo A 10 pg sacarídeo + 12,5-33 pg CRMi97 OU 5 pg sacarídeo + 6,25-16,5 pg CRM197 OU 2,5 pg sacarídeo + 3,125-8,25 pg CRMi 97 Conjugado do Serogrupo C 10 pg sacarídeo + 12,5-25 pg CRMi97 OU 5 pg sacarídeo + 6,25-12,5 pg CRM197 OU 2,5 pg sacarídeo + 3,125-6,25 pg CRMt 97 Conjugado do Serogrupo W135 10 pg sacarídeo + 6,6-20 pg CRMi97 OU 5 pg sacarídeo + 3,3-10 pg CRM197 OU 2,5 pg sacarídeo + 1,65-5 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo Y 10 pg sacarídeo + 6,6-20 pg CRMi97 OU 5 pg sacarídeo + 3,3-10 pg CRM197 OU 2,5 pg sacarídeo + 1,65-5 pg CRM197

Na forma reconstituída, as vacinas continham outros componentes como se segue:

Componente Quantidade por 0,5 ml de dose Adjuvante de fosfato de alumínio 0,3 mg como Al3+ zero Dihidrogenofosfato de potássio 1 mM 2,5 mM Hidrogenofosfato de dissódio dihidratado 9 mM 7,5 mM Tampão de fosfato de sódio 10 mM Dihidrogenofosfato de potássio 5 mM Tween™ 80 (tensioativo) 0,025 mg 64

Cloreto de sódio (tonicidade) 4,5 mg Sacarose (liofilização e tonicidade) 12,5 mg Água para injeção Para o volume final Seis vacinas estão, assim, disponíveis - três doses diferentes (10, 20 ou 40 pg de sacarídeo total), cada com ou sem adjuvante de fosfato de alumínio. A vacina adjuvantada com a dose de sacarídeo mais alta foi administrada a sujeitos saudáveis humanos com idade entre 18 e 45. Para comparação, os sujeitos controlo receberam tanto (a) produtos do frasco 1 (reconstituído em tampão) e do frasco 2 em diferentes braços ao mesmo tempo, ou (b) Mencevax™. Cada grupo de pacientes contém 30 pessoas. 0 sangue foi colhido antes e 28 dias após a vacinação para avaliar a resposta imune e recolher parâmetros de segurança de laboratório (hemograma, análises químicas sanguíneas, testes de função renal e do fígado e análise à urina). A vacina foi bem tolerada, sem reações adversas inesperadas. Não ocorreram alterações anormais significativas nos parâmetros de laboratório durante o estudo.

Os SBA e IgG específicos do Serogrupo A, C, W-135, Y (medidos por ELISA) foram determinados nas amostras de soro. Os títulos de SBA foram expressos como o recíproco da diluição de soro final proporcionando >50% de morte aos 60 minutos. Para medição do IgG, foi realizado um ELISA modificado para testar os anticorpos de elevada avidez. Para a deteção de anticorpos funcionais, foram usados SBA's com duas fontes exógenas diferentes de complemento: uma fonte de complemento de cria de coelho e uma fonte de complemento humana. 65

Os resultados de IgG seguintes (GMC médio (pg/mL) 95%) : de elevada avidez foram os com intervalos de confiança a

Serogrupo Soro Grupo vacina ACWY A+CWY Mencevax™ A Pré Pós 0,67 (0,3-1,2) 10 (6,6-16) 0,85 (0,4-1,5) 14 (8,8-22) 0,45 (0,2-0,8) 9,8 (6,2-15) C Pré Pós 0,21 (0,1-0,3) 7,7 (4,7-13) 0,13 (0,07-0,2) 5,2 (3,19-8,46) 0,16 (0,1-0,2) 8,5 (5,2-14) W-135 Pré Pós 0,21 (0,1-0,3) 12 (6,5-21) 0,2 (0,1-0,3) 9 (5,5-18) 0,29 (0,19-0,4) 6,7 (3,7-12) Y Pré Pós 0,35 (0,2-0,5) 18 (12-29) 0,31 (0,1-0,5) 21 (13-33) 0,57 (0,3-0,9) 20 (12-31)

Os resultados SBA foram os seguintes (% respondedores e GMT médio, ambos com IC 95%):

Serogr upo Grupo vacina Complemento SBA de coelho Complemento SBA Humano Titulos >1:128 (%) GMT Titulos >1:4 (%) GMT A ACWY 93 (78-99) 989 (558-1754) 90 (73-98) 42 (23-76) A+CWY 97 (83-100) 2566 (1448-4549) 97 (83-100) 6 6 (36-119) Mencevax 100 (88-100) 3132 (1767-5552) 83 (65-94) 28 (15-50) C ACWY 97 (82-100) 4480 (2455-8176) 100 (88-100) 213 (106-427) A+CWY 100 (88-100) 3794 (2100-6855) 100 (88-100) 162 (80-325) Mencevax 93 (78-99) 3829 (2119-6918) 100 (88-100) 223 (111-448) 6 6 W-135 ACWY 100 (88-100) 10343 (5988-17865) 100 (88-100) 248 (123-500) A+CWY 100 (88-100) 10376 (6007-17923) 93 (78-99) 142 (71-287) Mencevax 100 (88-100) 6795 (3934-11737) 97 (83-100) 99 (49-199) Y ACWY 100 (88-100) 22075 (14689-33175) 100 (88-100) 263 (151-457) A+CWY 10 (88-100) 24034 (15993-36120) 100 ( 88-100) 162 (194-588) Mencevax 100 (88-100) 14630 (9735-21987) 100 (88-100) 198 (114-344)

Para cada serogrupo e em cada grupo vacina (ACWY, A+CWY e controlo Mencevax) a GMC dos IgG da ELISA anti-capsular de elevada avidez e a GMT do SBA medido com ambos ensaios com complemento humano e de coelho, aumentaram após a injeção. Ao dia 29 após a injeção da vacina, a percentagem de sujeitos com títulos de complemento humano > 1:4 para cada serogrupo oscilou entre 90%-100% nas vacinas dos conjugados e entre 83%-100% no grupo controlo. Usando a fonte de complemento de coelho, a percentagem de sujeitos com títulos SBA > 1:128 para cada serogrupo oscilou entre 93%-100% para as vacinas dos conjugados e entre 90%-100% para o grupo controlo.

Globalmente, as respostas imunes (GMC e GMT) foram melhores nos grupos conjugados do que no grupo controlo Mencevax. A melhoria foi particularmente observada para o serogrupo W-135. As vacinas dos conjugados da invenção são, assim, seguras, bem toleradas e induzem respostas imunes funcionais iguais a ou melhores às observadas após a imunização com uma vacina tetravalente de polissacarídeo licenciada. 67 3. Uso de sacarideo MenA modificado

Polissacarídeo capsular foi purificado a partir de MenA e foi hidrolisado para proporcionar oligossacarideo de MenA. 0 polissacarideo (2 g) foi hidrolisado a 50°C em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,75, a uma concentração de polissacarideo de 10 mg/mL durante cerca de 4 horas [73]. Após hidrólise, a solução foi seca por evaporação rotatória. O oligossacarideo foi ativado usando o seguinte esquema de reação:

Sacc = metade de sacarideo 0 .8 v O oligossacarideo foi dissolvido em DMSO para proporcionar uma concentração de sacarideo de 10 mg/mL. De acordo com uma razão molar de oligossacarideo:CDI de 1:20, foram depois adicionadas 21, 262 g de CDI e a mistura da reação mexida durante 16 horas à temperatura ambiente. O composto MenA-CDI resultante foi purificado por precipitação seletiva numa mistura 80:20 (v/v) acetona:DMSO seguido de centrifugação. A eficiência da reação de ativação foi calculada como sendo cerca de 67,9% determinando a razão de imidazol livre para imidazol ligado. 68

No segundo passo da reação, o oligossacarídeo MenA-CDI foi solubilizado em DMSO a uma concentração de sacarídeo de cerca de 10 mg/mL. De acordo com uma razão molar de unidade MenA-CDI:DMA de 1:100, foram adicionados 36,288 g de cloridrato de dimetilamina a 99% (isto é, R1 e R2 = Me) e a mistura da reação foi mexida durante 16 horas à temperatura ambiente. 0 produto da reação foi liofilizado e re-solubilizado em 10 mg/mL de solução de água.

Para remover o reagente da reação com baixo peso molecular (em particular a dimetilamina (DMA)) da

preparação do oligossacarideo, foi realizado um passo de diálise através de uma membrana MWCO com 3,5 kDa (Spectra/Por™) . Foram levados a cabo quatro passos de diálise: (i) 16 horas contra 2 L de cloreto de sódio a 1 M (fator de diálise 1:20), (ii) 16 horas contra 2 L de cloreto de sódio a 0,5 M (fator de diálise 1:20), (iii) e (iv) 16 horas contra 2 L de WFI (fator de diálise 1:20). Para melhorar a purificação um passo de diafiltração foi também realizado através de uma membrana MWCO com 1 kDa (Centricon™). O produto purificado de MenA-CDI-DMA foi tamponado a pH 6,5 em 25 mM de L-histidina (Fluka™).

Para preparar os conjugados do sacarideo de MenA modificado (MenA-CDI-DMA) , o processo global foi como se segue: - hidrólise do polissacarideo para proporcionar fragmentos de oligossacarideo - calibração do tamanho dos fragmentos do oligossacarideo - aminação redutora dos grupos aldeido terminais nos 69 oligossacarídeos de tamanho calibrado - proteção dos grupos -NH2 terminais por grupo Fmoc antes

da reação CDI

- desproteção intrínseca de grupos -NH2 durante a reação DMA - ativação de grupos -NH2 terminais por SIDEA (ácido N-hidroxisuscinimida adípico) - anexação covalente à proteína CRMi97. 0 conjugado do oligossacarídeo MenA modificado demonstrou ser muito mais resistente à hidrólise do que o seu correspondente natural a temperaturas elevadas. Após 28 dias a 37°C, por exemplo, a percentagem de sacarídeo libertado é 6,4 % para o oligossacarídeo modificado versus 23,5 % para o antígeno natural. Além disso, os títulos induzidos pelos oligossacarídeos modificados não são significativamente mais baixos do que os obtidos usando as estruturas de açúcar nativas. 0 conjugado MenA modificado é combinado com conjugados MenC, MenW135 e MenY como um substituto para o conjugado de oligossacarídeo não modificado.

4. Adição de antígenos MenB

Antes da reconstituição do conjugado de MenA liofilizado como descrito anteriormente, antígenos MenB AG287-953 (SEQ. ID N.° 7), 936-AG741 (SEQ. ID N.° 8) e NadA (SEQ. ID N.° 2) são adicionados à mistura C-W135-Y líquida de dose mais elevada para proporcionar uma concentração final de 20 yg/dose de cada m dos três polipeptídeos. A vacina reconstituída contém, assim, os seguintes antígenos: 70

Componente Quantidade por 0,5 ml de dose Conjugado do Serogrupo A 10 pg sacarídeo + 12,5-33 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo C 10 pg sacarídeo + 12,5-25 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo W135 10 pg sacarídeo + 6, 6-20 pg CRMi97 Conjugado do Serogrupo Y 10 pg sacarídeo + 6, 6-20 pg CRMi97 AG287-953 20 pg polipeptídeo 936-A741 20 pg polipeptídeo NadA 20 pg polipeptídeo 5. Adição de antígeno Hib

Conjugado liofilizado de HbOC é misturado com o conjugado liofilizado de MenA e ambos são reconstituídos juntos com mistura C-W135-Y líquida para proporcionar a vacina seguinte:

Componente Quantidade por 0,5 ml de dose Conjugado do Serogrupo A 10 pg sacarídeo + 12,5-33 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo C 10 pg sacarídeo + 12,5-25 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo W135 10 pg sacarídeo + 6, 6-20 pg CRM197 Conjugado do Serogrupo Y 10 pg sacarídeo + 6, 6-20 pg CRM197 Conjugado do HbOC Hib 10 pg sacarídeo + 2-5 pg CRMi97 6. Adição de antígenos pneumocócicos

Antes da reconstituição do conjugado de MenA liofilizado como descrito anteriormente, os conjugados de antígenos pneumocócicos são adicionados à mistura C-W135-Y líquida de dose média para proporcionar uma concentração final de 2 yg/dose de cada dos serotipos (dupla para o serotipo 6B) . A vacina reconstituída contém, assim, os seguintes antígenos:

Componente

Quantidade por 0,5 ml de dose 71

Conjugado do Serogrupo A 5 pg sacarideo + 6,25-16,5 pg Conjugado do Serogrupo C 5 pg sacarideo + 6,25-12,5 pg Conjugado do Serogrupo W135 5 pg sacarideo + 3,3-10 pg CRMi97 Conjugado do Serogrupo Y 5 pg sacarideo + 3,3-10 pg CRMi97 Conjugado do serotipo 4 de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRMi97 Conjugado do serotipo 9V de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado do serotipo 14 de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado do serotipo 18C de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado do serotipo 19F de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRMi97 Conjugado do serotipo 23F de Pneumococcus 2 pg sacarideo + 2,5 pg CRM197 Conjugado do serotipo 6B de Pneumococcus 4 pg sacarideo + 5 pg CRMi97

Será entendido que a invenção foi descrita como exemplo apenas e podem ser feitas modificações desde que permaneçam no âmbito das reivindicações em anexo. REFERENCIAS ( [1] Capitulo 28 de Vaccines (Plotkin & Orenstein) 3a Edição (1999) ISBN 0-7216-7443-7.

[2] Armand et al. (1982) J. Biol. Stand. 10:335-339.

[3] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342.

[4] MMWR (1997) 46(RR-5) 1-10.

[5] Baklaic et al. (1983) Infect. Immun. 42:599-604.

[6] WO02/058737.

[7] W003/007985.

[8] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979.

[9] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851. 72 [10] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698.

[11] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.

[12] W002/00249.

[13] W097/28273.

[14] Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499-1503.

[15] Frash (1990) páginas 123-145 de Advances in Biotechnological Processes vol. 13 (Editores Mizrahi & Van Wezel) [16] Inzana (1987) Infect . Immun. 55:1 573-1579. [17] Kandil et al. (1997) Glycoconj J 14:13-17 . [18] Berkin et al. (2002) Chemistry 8: 4424-4433. [19] WO03/0 80678.

[20] WO98/08543.

[21] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[22] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.

[23] W099/24578.

[24] W099/36544.

[25] WO99/57280.

[26] WO00/22430.

[27] WOOO/66791.

[28] WOOO/66741.

[29] WOO1/64920.

[30] WOO1/64922.

[31] W003/020756.

[32] Pedidos de patente UK N.°s 0223741.0, 0305831.0 e 0309115.4, e pedido internacional W02004/032958.

[33] Comanducci et al. (2002) J. Exp. Med. 195:1445-1454.

[34] W003/010194.

[35] Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506.

[36] Pedido de patente internacional W02004/048404.

[37] WO03/063766.

[38] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.

[39] http://neisseria.org/nm/typing/mlst/ 73 [40] Pettersson et al. (1994) Microb Pathog 17(6):395-408.

[41] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.

[42] Welsch et al. (2002) Thirteenth International

Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of

Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Genome- derived antigen (GNA) 2132 elicits protetive serum antibodies to groups B and C Neisseria meningitides strains.

[43] Santos et al. (2002) Thirteenth International

Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of

Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bactericidal responses in rhesus macagues immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis.

[44] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28-36.

[45] Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168.

[46] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.

[47] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.

[48] Patente Europeia 0477508.

[49] Patente US 5,306,492.

[50] W098/42721.

[51] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114.

[52] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368.

[53] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42:421-427.

[54] Ravenscroft et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103: 35-47.

[55] W097/00697.

[56] W096/37222; Patente US 6,333,036.

[57] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[58] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[59] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[60] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440.

[61] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630.

[62] Tettelin et al. (2001) Science 293:498-506.

[63] Hoskins et al (2001) J Bacteriol 183:5709-5717.

[64] Rappuoli (2000) Curr Opin Microbiol 3:445-450 [65] Rappuoli (2001) Vaccine 19:2688-2691.

[66] Masignani et al. (2002) Expert Opin Biol Ther 2:895 905.

[67] Mora et al. (2003) Drug Discov Today 8:459-464.

[68] Wizemann et al. (2001) Infect Immun 69:1593-1598.

[69] Rigden et al. (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:143 168.

[70] WO02/22167.

[71] Nilsson & Svensson (1979) Carbohydrate Research 69 292-296) [72] Ravenscroft et al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.

[73] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263.

[74] Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-196.

[75] Anonymous Jan 2002) Research Disclosure, 453077.

[76] Anderson (1983) Infect Immun 39(1):233-238.

[77] Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76(1):52-59.

[78] EP-A-0372501.

[79] EP-A-0378881.

[80] EP-A-0427347.

[81] W093/17712 [82] W094/03208.

[83] W098/58668 .

[84] EP-A-0471177 .

[85] WO91/01146 [86] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[87] EP-A-0594 610 . 75 [88] WO00/56360.

[89] W002/091998.

[90] WOOl/72337 [91] WOOO/61761.

[92] WO99/42130 [93] WO96/40242 [94] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.

[95] WO95/08348.

[96] US patent 4,882,317 [97] US patent 4,695,624 [98] Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.

[99] EP-A-0208375 [100] WO00/10599 [101] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165:171-288 (1979) .

[102] Patente US 4,057,685.

[103] Patentes US 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.

[104] Patente US 4,459,286.

[105] Patente US 4,965,338 [106] Patente US 4,663,160.

[107] Patente US 4,761,283 [108] Patente US 4,356,170 [109] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264.

[110] WOOO/38711; Patente US 6,146,902.

[111] W003/009869.

[112] Vaccine Design...(1995) Editores Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

[113] WO00/23105.

[114] WO90/14837 .

[115] Patente US 5,057,540.

[116] W096/33739.

[117] ΕΡ-Δ-0 109942.

[118] W096/11711. 76 [119] WOOO/07621.

[120] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[121] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery

Reviews 32:321-338.

[122] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.

[123] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

[124] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

[125] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.

[126] W003/024480 [127] W003/024481 [128] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

[129] EP-A-0 68 9454 .

[130] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273- 2278 .

[131] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[132] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[133] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.

[134] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[135] WO02/26757.

[136] W099/62923.

[137] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.

[138] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medicai

Microbiology 32:179-185 [139] WO98/40100.

[140] Patente US 6,207,646.

[141] Patente US 6,239,116.

[142] Patente US 6,429,199.

[143] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society

Transactions 31 (part 3):654-658.

[144] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[145] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65. 77 [146] WOOl/95935.

[147] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.

[148] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.

[149] WO03/035836.

[150] W095/17211.

[151] W098/42375.

[152] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[153] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[154] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[155] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306- 5313.

[156] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[157] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[158] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[159] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.

[160] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[161] WO99/40936.

[162] W099/44636.

[163] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[154] WO99/27950 .

[165] Patente US 6,090,406 [166] Patente US 5,916,588 [167] EP-A-0 62 6169.

[168] W099/52549.

[169] W001/21207.

[170] WO01/21152 .

[171] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[172] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185- 196.

[173] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[174] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[175] W099/11241. 78 [176] W094/00153.

[177] W098/57659.

[178] Pedidos de patente Europeias 0835318, 0735898 e 0761231.

[179] WO96/14086.

[180] Vaccines (eds. Plotkin & Mortimer), 1988. ISBN: 0- 7216-1946-0 [181] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349- 355.

[182] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.

[183] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[184] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[185] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.

[186] W093/24148 .

[187] W002/09643.

[188] Katial et al. (2002) Infect Iinmun 70:702-707.

[189] WO01/52885.

[190] Patente Europeia 0301992.

[191] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.

[192] Fukasawa et al. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[193] W002/09746.

[194] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323- 333.

[195] WO01/09350.

[196] Patente Europeia 0449958.

[197] EP-A-0996712.

[198] EP-A-0680512.

[199] WO02/062378.

[200] W099/59625.

[201] Patente US 6,180,111.

[202] WOOl/34642.

[203] W003/051379.

[204] Patente US 6,558,677 79 [205] W02004/019977.

[206] W002/062380.

[207] WOOO/25811.

[208] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.

[209] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655.

[210] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287- 308.

[211] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

[212] Charalambous & Feavers (2001) J Med Microbiol 50:937-939.

[213] Westerink (2001) Int Rev Immunol 20:251-261.

[214] Grothaus et al. (2000) Vaccine 18:1253-1263.

[215] Paoletti et al. (2001) Vaccine 19:2118-2126.

[216] WOOO/56365.

[217] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of

Pharmacy. 20th ed ISBN: 0683306472 [218] WO01/30390. 80

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. <120> Vacinas injetáveis de combinação de sacarideos

<130> P053819WO <150> GB0302217.5 <151> 2003-01-30 <150> GB0323101.6 <151> 2003-10-01 <150> PCT/IB2004/000651 <151> 2004-01-30 <150> EP04706762.4 <151> 2004-01-30 <160> 12 <170> SeqWin99, version 1.02

<210> 1 <211> 350 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 1 81

Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Léu Ala Thr 1 S 10 15 The Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lys Lys 20 25 30 Ala Ala Thr Vai Ala Ile Ala Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gin Glu Ile 35 40 45 Asn Gly Phe Lys Ala Gly Glu Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Glu Asp Gly 50 Sb eo Thr Ile Thr Lys Lys Asp Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp 6S 70 75 80 Phè Lys Gly Leu Gly Leu Lys Lys val val Thr Asn Leu Thr Lys Thr 85 90 95 Vai Asn Glu Asn Lys Gin Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala GlU 100 105 110 Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala 115 120 125 Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn 130 135 140 Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys Thr Asn 145 150 IBS 160

Ile Vai Lys Ile Asp Glu Lys Leu Glu Ala Vai Ala Asp Thr vai Asp 165 82

Lys His Ala Glu Ala Fhe Asn Asp 180 ASíl Thr Lys Ala Asp Glu Ala val 135 200 Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gin Asn 210 215 Glu Thr Ala Ala Gly Lys Ala Glu 225 230 Alá Ala Asp Lys Ala Glu Ala Vái 245 Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Asp 260 Ala ASP Vai Tyr Thr Arg Glu Glu 275 280 ASp Gly Leu Asn Ala Thr Thr Glu 230 235 Ala Glu Lys Ser He Ala Asp His 305 310 Lys Thr Vai Ser Asp Leu Arg Lys 325 Gin Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe

34D 170 175 ile 285 Ala Asp Ser Leu ASP Glu 290 Thr Lys Thr Ala Asn Glu Ala Lys 205 Gin Vai Asp Ala Lys 220 Vai Lys Ala Ala Ala Ala Ala 235 Gly Thr Ala Asn Thr 240 Ala Ala 2S0 Lys vai Thr Asp Ile 255 Lys Asn 265 Ile Ala Lys Lys Ala Asn 270 Ser Ser Asp Ser Lys Phe Vai Arg 285 Ile Lys Leu Asp Thr 300 Arg Leu Ala Ser Asp Thr Arg 325 Leu Asn Gly Leu Asp 320 Glu Thr 330 Arg Gin Gly Leu Ala 335 Glu Gin 345 Pro Tyr Asn Vai Gly 350

<210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 2 83

Ala Thr Asn Asp Asp ASp vai Lys Lys Ala Ala Thr Vai Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gin Glu Ile Asn Gly Phe Lyâ Ala Gly Glu 20 25 30 Thr Ile Tyr Asp lie Asp Glu Asp Gly Thr Ile Thr Lys Lys Asp Ala 35 40 45 Thr Ala Ala Asp vai Glu Ala Asp Asp Phe Lys Gly Leu Gly Leu Lys 50 55 60 Lys Vai Vai Thr Asn Leu Thr Lys Thr Vai Asn Glu Asn Lys Gin Asn 65 70 75 80 Vai Asp Ala Lys Vai Lys Ala Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala 100 10S 110 84

Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr 115 120 125 Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys Thr Asn ile Val Lys lie Asp Glu Lys 130 135 140 Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp Lys His Ala Glu Ala Phe Asn 14S ISO 155 160 Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr Lys Ala Asp Glu Ala 165 170 175 Vâl Lys Thr Ala Asn Glu Ala Lys Gin Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gin 180 185 190 Asr. Val Asp Ala Lys val Lys Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gly Lys Ala 195 200 205 Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala As» Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala 210 215 220 Vai Ala Ala Lys Val Thr Asp lie Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lyg 225 230 235 240 Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu 245 250 255 Glu Ser Asp Ser Lys Phe Val Arg Ile ASp Gly Leu Asn Ala Thr Thr 260 265 270 Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Ile Ala Asp 275 2S0 285 His Asp Thr Arg Leu Asn Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg 290 295 300 Lys Glu Thr Arg Glu Gly Leu Ala Glu Gin Ala Ala Léu Ser Gly Leu 305 310 315 320 Phe Gin Piro Tyr Asn Val Gly 325

<210> 3 <211> 248 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 3 85

Val Ala 1

Leu Asp

Val Arg

Thr Tyr 50

Ala ASp

His Lys 20

Lys Asn 35

Gly Asia lie Oiy 5

Asp Lys Glu Lys Gly Asp

Ala Gly Leu Ala Asp 10 Gly Leu Gin Ser Leu 25 Leu Lys Leu Ala Ala 40 Ser Leu Asn, Thr Gly 55

Ala Leu xhr Ala Pro 15 Thr Leu Asp Gin Ser 30 Gin Gly Ala Glu Lys 45 Lys Leu Lys Aan Asp SQ

Lys Vai Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gin Ile Glu Val Asp Gly Gin 65 70 ?5 80 Leu Ile Thr Lêu Glu Ser Gly Glu Phe Gin. vai Tyr Lys Gin Ser His 85 90 95 Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gin Thr Glu Gin Ile Gin Asp Ser Glu His 100 105 IIQ Ser Gly Lys Met Vai Ala Lys Arg Gin Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala 115 120 125 Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr 130 05 140 Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr 14 5 ISO 155 160 Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gin Gly Asn Gly Lys Ile Glu His 165 170 175 Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Vai Asp Leu Ala Ala Ala Asp lie Lys X80 185 190 Pro Asp Gly Lys Arg His Ala vai Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn 195 200 205 Gin Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala 210 215 220 Gin Glu Vai Ala Gly Ser Ala Glu vai Lys Thr Val Aan Gly Ile Arg 225 230 235 240 His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gin 245 86

<210> 4 <211> 179 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 4 vai ser Ala Vai Ile Gly Ser Ala Ala Vai Gly Ala Lys Ser Ala vai 1 S 10 15

Asp Arg Arg Thr Thr Gly Ala Gin Thr Asp Asp Asn Vai Met Ala Leu 20 25 30

Arg Ile Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Asa Asn Gin Thr 35 40 45

Lys Gly Tyr Thr Pro Gin Ile Ser Vai Vai Gly Tyr Asn Arg Hia Leu 50 55 S0

Leu Leu Leu Gly Gin Vai Ala Thr Glu Gly Glu Lys Gin Phe Vai Gly 65 70 75 80

Gin Ile Alã Arg Ser Glu Gin Alá Ala Glu Gly Vai Tyr Asn Tyr Ile 85 90 55

Thr Vai Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala Gly Asp lie Ala Gly Asp Thr 100 105 110

Trp Asn Thr Ser Lys Vai Arg Ala Thr Leu Leu Gly Xle Ser pro Ala

115 12 0 12S

Thr Gin Ala Arg Vai Lys Ile Vai Thr Tyr Gly Asn Vai Thr Tyr vai 130 135 140

Met Gly lie Leu Thr Pro Glu Glu Gin Ala Gin Ile Thr Gin Lys Vai 145 150 155 160 ser Thr Thr Vai Gly Vai Gin Lys Vai Ile Thr Leu Tyr Gin Asn Tyr 155 170 175

Vai Gin Arg 87 <210> 5 <211> 168 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 5

Ala Thr Tyr Lys Vai Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile 1 5 10 15 Asp His Phe Asn Thr Ser Thr Asn Vai Gly Gly Phe Tyr Gly Leu Thr 20 25 30 Gly Ser Vai Glu Phe Asp Gin Ala Lys Arg Asp Gly Lys Ire Asp Ile 35 4.0 45 Thr íle Pro ile Ala Asn Leu Gin Ser Gly Ser Gin His Phe Thr Asp 50 55 60 His Leu Lys Ser Ala Asp Ile Phe Asp Ala Ala Gin Tyr Pro Asp lie 65 70 75 80 arg Phe Vai Ser Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys Leu Val Ser 85 90 95 Vai Asp Gly Asn Leu Thr Met His Gly Lys Thr Ala Pro Val Lys Leu 100 105 110 Lys Ala Glu Lys Phe Asn Cys Tyr Gin Ser Pro Met Glu Lys Thr Glu 115 120 125 Vai Cvs Gly Gly Asp Phe Ser Thr Thr Ile Asp Arg Thr Lys Trp Gly 130 135 140 S4et Asp Tyr Leu Vai Asn Vai Gly Mefc Thr Lys Ser val Arg Ile Asp 145 ISO 155 160 n« Gin Ile Glu Ala Ala Lys Gin 165

<210> 6 <211> 464 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 6 88

Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala Ala Pro 15 10 15

Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Ala Pro Gin Ala 20 25 10

Gly Ser Gin Gly Gin Gly Ala Pro 35 40

Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr

50 SS

Asp Asn. Pro Lys Asn Glu Asp Glu 65 70

Asn Ala Ala Gly Thr Asp Ser Ser 85

Asn Met Leu Ala Gly Asn Met Glu 100

Ser Ser Gin Pro Ala Asn Gin Pro 115 120

Met Gin Gly Asp Asp Pro Ser Ala 130 135

Ala Ala Gin Gly Ala Asn Gin Ala 145 150

Ser Asp Pro Ile Pro Ala Ser Asn 165

Asn Phe Gly Arg Val Asp Leu Ala 180

Ser Gin Asn lie Thr Leu Thr His 105 200

Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val 210 215

Leu Ser Asp Ala Asp Lys lie Ser 225 230

Asp Lys Phe Val Gly Leu Val Ala 245

Asn Gin Tyr Ile Ile Phe Tyr Lys 260

Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg 275 280

Leu Ilè Pro Val Asn Gin Ala Asp 290 295

Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly 305 310 ser Ala Gin Gly Ser Gin Asp «et 45

Gly Asn Gly Gly Ala Val Thr Ala 60

Val Ala Gin Asn Asp Met Pro Gin 75 ao

Thr Pro Asn His Thr Pro Asp Pro 90 95

Asn Gin Ala Thr Asp Ala Gly Glu 105 110

Asp Met Ala Asn Ala Ala Asp Gly 125

Gly Gly Gin Asn Ala Gly Asn Thr 140 .

Gly Asn Asn Gin Ala Ala Gly Ser 155 160

Pro Ala Pro Ala Asn Gly Gly Ser 170 175

Asn Gly Val Leu Ile Asp Gly Pro 185 190

Cys Lys Gly Asp Ser Cys Ser Gly 205

Gin Leu Lys Ser Glu Phe Glu Lys 220

Asn Tyr Lys Lys Asp Gly Lys Asn 235 240

Asp Ser Val Gin Met Lys Gly Ile 250 255

Pro Lys Pro Thr Ser Phe Ala Arg 265 270

Arg Ser Leu Pro Ala Glu Met Pro

28S

Thr Leu Ile Val Asp Gly Glu Ala 300

Asn Ile Phe Ala Pro Gin Gly Asn 315 320 89

Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys Leu Pro Gly Gly Ser Tyr 325 330 335 Ala Leu Arg Vai Gin Gly Glu Pro Ala Lys Gly Glu Met Leu Ala Gly 340 345 350 Ala Ala Vai Tyr Asa Gly Glu Vai Leu Hls Phe His Thr Glu Asn Gly 355 360 365 Arg Pro Tyr Pro Thr Arg Gly Arg Phe Ala Ala Lys val Asp Phe Gly 370 375 380 Ser Lys Ser Vai Asp Gly Ile Ile Asp Ser Gly Asp Asp Leu His Met. 385 390 395 400 Gly Thr Gin Lys Phe Lys Ala Ala lie Asp Gly Aon Gly Phe Lys Gly 405 410 41S Thr Trp Thr Glu Asn Gly Ser Gly Asp val Ser Gly Lys Phe Tyr Gly 420 425 430 Pro Ala Gly Glu Glu Vai Ala Gly Lys Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Asp 435 440 445 Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Vai Phe Ala Gly Lys Lys Glu Gin ASp 450 455 460 <210> 7 <211> 644 <212> PRT <213> Neisseria mening <4Ο0> 7 90

Met Ala Ser pro ASp val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala 1 5 10 IS Al a Pro Vai Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu ASp Ala Pro 20 25 30 Gin Ala Gly Ser Gin Gly Gin Gly Ala Pro Ser Ala Gin Gly Gly Gin 3 5 40 45 Asp Met Ala Ala val Ser Glu Glu Asm Thr Gly Asn Gly Gly .Ala Ala SO S5 60 AXâ Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gin Asn Asp Met €5 70 75 30 Pro Gin Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn His Thr Pro 85 00 55 Ala Ser Asn Het Pro Ala Gly Asn Mefc Glu Asn Gin Ala Pro Asp Ala 100 105 110 Gly Glu Ser Glu Glu Pro Ala Asn Gin Pro Asp Het Ala Asn Thr Ala 115 120 125 Asp Gly Het Gin Gly ASp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Sly 130 135 140 91 ASn Thr Ala Ala Gin Gly Thr Asn Gin Ala Glu Asn Asn Gin Thr Ala 145 150 155 160 Gly Ser Gin Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn pro Ser Ala Thr Asn Ser 165 170 175 Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn Vai Gly Asn Ser Val Val He Asp ISO 185 190 Gly Pr© Ser Gin Asn He Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser Cys 195 200 205 Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Vai Gin Leu Lys Ser Glu Phe 210 215 220 Glu Lys Leu ser ASp Ala ASp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly 225 230 235 24 0 Lys Asn Asp Gly Lys A6h Asp Lys Phe vai Gly Leu Val Ala Asp Ser 245 250 255 Val Gin Met Lys Gly He Asn Gin Tyr He He Phe Tyr Lys Pro Lys 260 265 270 Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser 275 280 285 Leu Fr© Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Vai Asn Gin Ala Asp Thr Leu 290 295 300 lie Vai Asp Gly Glu Ala Vai Ser Leu Thr Gly His Ser Gly Asn He 305 310 315 320 Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys 325 330 335 Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg vai Gin Gly Glu Pro Ser Lys 340 345 350 Gly Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala Vai Tyr Asn Gly Glu Val Leu His 355 360 365 Phe His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Ser Pro Ser Arg Gly Arg Phe Ala 370 37S 380 Ala Lys Vai Asp Phe Gly Ser Lys Ser vai Asp Gly Ile Ile Asp Ser 385 390 395 400 Gly Asp Gly Leu His Met Gly Thr Gin Lys Phe Lys Alá Ala Ile Asp 405 410 415 Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Gly Gly Asp Val 420 425 430 ser Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lys Tyr 435 440 445 Ser Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val Phe Ala 450 455 460

Gly Lys Lys Glu Gin Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys 92 465 470 475 480 Vai Aap Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile Asp HiS Phe Asn 485 450 495 Thr Ser Thr Asn Vai Gly Gly Phe Tyr Gly Leu Thr Gly Ser vai GlU 500 505 510 Phe Asp Gin Ala Lys Arg Aep Gly Lys Ile ASp ile Thr ile Pro Vai 515 520 525 Ala Asn Leu Gin Ser Gly ser Gin His Phe Thr ASp His Leu Lys Ser 530 535 540 Ala Asp ile Phe Asp Ala Ala Gin Tyr Pro Asp Ile Arg Phe Vai Ser 545 SSO 555 560 Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys Leu Vai Ser Vai Asp Gly Asn S65 570 575 Leu Thr «et His Gly Lys Thr Ala Pro Vai Lys Leu Lys Ala Glu Lys 580 585 S9Ô Phe Asn Cys Tyr Gin Ser Pro Mefc Ala Lys Thr Glu Vai Cys Gly Gly 595 600 605 Asp Phe Ser Thr Thr 11« Asp Arg Thr Lys Trp Gly vai Asp Tyr Leu 610 615 620 Vai Asn Vai Gly Met Thr Lys Ser Vai Arg Ile Asp Ile Gin Ile Glu 625 630 635 540

Ala Ala Lys Gin

<210> 8 <211> 434 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 93

Met Vai Ser Ala vai Ile Gly Ser Ala Ala Val Gly Ala Lys Ser Ala 1 5 10 15 Vai Asp Arg Arg Thr Thr Gly Ala Gin Thr Asp Asp Asn Val Met Ala 20 25 30 Leu Arg Ile Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Asn Asn Gin 35 40 45 Thr Lys Gly Tyr Thr Pro Gin 11« Ser Vai val Gly Tyr Asn Arg HÍS 50 $5 60 Leu Leu Leu Leu Gly Gin Vai Ala Thr Glu Gly Glu Lys Gin Phe val 65 00 75 30 Gly Gin tle Ala Arg Ser Glu Gin Ala Ala Glu Gly Val Tyr Asn Tyr 85 90 95 Πβ Thr Vai Ala Ser Leu Prô Arg Thr Ala Gly Asp Ile Ala Gly ASp 100 105 110 94

Thr Trp Asn Thr Ser Lys val Arg Ala Thr Leu. Leu Gly ile Ser Pro 115 120 125 Ala Thr Gin Ala Arg Val Lys Ile val Thr Tyr Gly Asn val Thr Tyr 130 135 140 Val Met Gly Ile Leu Thr Pro Glu Glu Glh Ala Gin ile Thr Gin Lys 14 S 150 155 160 Val Ser Thr Thr Val Gly Val Gin Lys val ile Thr Leu Tyr Gin ASh 165 170 175 Tyr Val Gin Arg Gly ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly 180 185 190

Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 195 200 205

Gly Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Vai Arg Lys Asn Glu Lys 210 215 220

Leu Lys Leu Ala Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp 225 230 235 240

Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Vai Ser Arg Phe Asp

245 250 25S

Phe Χίε Arg Gin lie Glu Vai Asp Gly Gin Leu Ile Thr Leu Glu Ser 260 265 270

Gly Glu Phe Gin Val Tyr Lys Gin Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 275 280 285

Gin Thr Glu Gin Ile Gin Asp Ser Glu His Ser Gly Lys fSet Vai Ala 290 295 300

Lys Arg Gin Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe 305 310 315 320

Asp Lye Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe 325 330 335

Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala 340 345 350

Ala Lys Gin Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu teu 355 360 365

Asn val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His 370 375 380

Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gin Ala Glu Lys Gly Ser 385 390 395 400

Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gin Glu Val Ala Gly Ser 405 410 415

Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala 420 425 430

Lys Gin 9 95 9 95 <210> <211> <212> <213> <4 Ο 0> 6

PRT

Neisseria meningitidis 9

Gly S&r Gly 1

Gly Gly Gly S <210> <211> <212> <213> <4 Ο 0> 10 255

PRT

Neisseria meningitidis 10 96

Cye Ser Ser Gly Gly Gly Gly Vai Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 S 10 ÍS

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp Mis Lys Asp Lys Gly Leu Gin 20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Vai Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45

Ala Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Vai Ser Arg Phe Asp Phe ile Arg 65 70 75 Θ0

Gin Xle Glu Vai Asp Gly Gin Leu Lie Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 55 00 05

Gin Vai Tyr Lys Gin Ser Hi s Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gin Thr Glu 100 105 110

Gin Xle Gin Asp Ser Glu Sis Ser Gly Lys Met Vai Ala Lys Arg Gin 115 120 125

Phe Arg lie Gly Asp He Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu 130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ma Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp 145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gin 165 170 175

Gly Asn Gly Lys xle Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Vai Asp 180 185 100

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Vai He 195 200 205

Ser Gly Ser Vai Leu Tyr Asn Gin Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu 210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gin Glu Vai Ala Gly Ser Ala Glu Vai 225 330 235 240

Lys Thr Vai Asn Gly ile Arg His xle Gly Leu Ala Ala Lys Gin 245 250 255 97

<210> 11 <211> 254 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 Ο 0> 11 98

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Vai 1 5 Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu 20 Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Vai 3S 40 Ala Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr 50 55 Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys 65 70 Gin Ile Glu Vai Asp Gly Gin Leu 85 Gin. Ile Tyr Lys Gin Asp His Ser 100 Lya Ile Asn Asn Pro Aâp Lys Ile 115 120 Phe Leu Vai Ser Gly Leu Gly Gly 130 135 Pro Asp Gly Lys Ala Glu yyx HiS 14S 150 Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr 165 Hís Gly Lys lie Glu His Leu Lys ISO Ala Ala Ala Gin Leu Lys Ala Asp 195 2GQ Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu 210 215 Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gin Glu 225 230 Xle Gly Glu Lys Vai His Glu Ile 245

Ala Ala 10 Asp ile Gly Ala Gly 15 Leu Asp 25 HÍS Lys Asp Lys Ser 30 Gin Arg Lys Asn Glu Lys 45 Leu Lys Leu Tyr Gly Asn Gly 60 Asp Ser Leu Asn Vai Ser Arg 75 Phe Asp phe Ile Arg 80 Ile Thr 90 Leu Glu Ser Gly Glu 95 Phe Ala 10$ Val val Ala Leu Gin 110 Ile Glu Asp Ser Leu Ile Asn 125 Gin Arg Ser GlU HÍS Thr Ala 140 Phe Asn Gin Leu Gly Lys Ala 155 Phe Ser ser ASp Asp ISO ile Asp 170 phe Ala Ala Lys Gin 175 Gly Thr 185 Pro Glu Gin Asn Val 190 Glu Leu Glu Lys Ser His Ala 205 val Ile Leu Glu Lys Gly Thr 220 Tyr Hís Leu Ala Ile Ala Gly 235 Ser Thr Val Lys 240 Gly Ile 25© Ala Gly Lys Gin <210> 12 <211> 262

<212> PRT 99 <213> Neisseria meningitidis <400> 12

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp 1 5 10 15 lie Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu ASp His Lys 20 25 39 Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser lie Pro Gin ASn 35 40 45 Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala 50 55 60 Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys 65 70 75 80 lie Ser Arg Phe ASp Phe vai Gin Lys Ile Glu val Asp Gly Gin Thr 85 so 95 ile Thr Leu Ala Ser Giy Glu Phe Gin ile Tyr Lys Gin Asn His Ser 100 105 110 Ala Vai Val Ala Leu Gin Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr 115 120 125 Asp Ser Leu Xle Asn Gin Arg ser Phe Leu val Ser Gly Leu Gly Gly 130 13 5 .140 Glu His Thr Ala Phe Asn Gin Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His 145 ISO 1SS .160 Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser 165 170 175 Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gin Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys ISO 185 190 Thr Leu Glu Gin Asn Vai Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp 195 200 205 Glu Lys Ser fila Ala Vai Ik Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu 210 215 229 Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly ASp Arg Ala Gin Glu 225 230 235 249 Tle Ala Gly Ser Ala Thr Vai Lys ile Gly GlU Lys Val His Glu Ile 245 250 255

Gly Ile Ala Gly Lys Gin 260

Lisboa; 27 de Maio de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição imunogénica injetável que compreende sacarídeos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, em que: (i) os ditos sacarídeos capsulares são conjugados separados a uma proteína transportadora com um grupo de ligação e são depois misturados; (ii) os conjugados têm uma razão sacarídeo:proteína (p/p) com excesso de proteína; e (iii) a composição contém pelo menos entre 10 yg e 25 yg de sacarídeo capsular meningocócico por dose.

2. A composição da reivindicação 1, em que dentro de cada dose, os antígenos de sacarídeo individual dos serogrupos A, C, W135 e Y têm uma razão por peso de 1:1:1:1 ou 2:1:1:1

3. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o sacarídeo capsular do serogrupo A é modificado para substituir um ou mais grupos hidroxilo com grupos bloqueadores

4. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda antígenos não meningocócicos e não neisserianos.

5. A composição da reivindicação 4, em que os antígenos são de pneumococos, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, B. pertussis, difteria, tétano, poliomielite e/ou H. influenzae. 2

6. A composição das reivindicações 1-3, compreendendo ainda antígenos de proteína meningocócica.

7. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os sacarideos capsulares da composição são oligossacarídeos.

8. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um adjuvante de sal de alumínio.

9. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, para ser utilizada para despoletar uma resposta imune num paciente.

10. Utilização de sacarideos capsulares dos serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis no fabrico de uma composição medicamentosa imunogénica injetável para despoletar uma resposta imune contra a doença meningocócica num paciente, em que (i) os ditos sacarideos capsulares são conjugados separados a uma proteína transportadora com um grupo de ligação e são depois misturados; (ii) os conjugados têm uma razão sacarídeo:proteína (p/p) com excesso de proteína; e (iii) a composição contém pelo menos entre 10 yg e 25 yg de sacarídeo capsular meningocócico por dose.

11. A utilização da reivindicação 10, em que o medicamento é uma composição de qualquer uma das reivindicações 2 a 8. Lisboa, 27 de Maio de 2013