PT2138044E - Cultura pura da estirpe ah2 da espécie bacillus velezensis e produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos - Google Patents
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- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Description
ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Cultura pura da estirpe ΆΗ2 da espécie Bacillus velezensls e produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos"
Objecto da Invenção 0 objecto da presente invenção é um produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos, formado por células viáveis de um novo isolado de Bacillus velezensls (Ruiz-Garcia et al., 2005) estirpe AH2, possuindo uma elevada actividade antifúngica, particularmente contra diferentes fungos patogénicos, assim como uma boa capacidade para estimular o crescimento das plantas, por meio de diferentes mecanismos. 0 produto foi formulado a partir de um caldo de fermentação, obtido por meio de uma cultura submersa agitada, gue é utilizado directamente na formulação. Esta formulação mantém uma elevada actividade durante pelo menos seis meses à temperatura ambiente. A estirpe AH2 de Bacillus velezensls utilizada na obtenção da formulação é, além disso, um objecto da presente invenção.
Estado da técnica A necessidade e importância de desenvolver e ampliar processos de produção integrada e agricultura orgânica, como uma alternativa ao uso indiscriminado de produtos guimicos na agricultura, a fim de reduzir os efeitos nocivos destes últimos, foram há muito reconhecidas. O uso de preparações biológicas de microorganismos para o controlo biológico de pragas e doenças, bem como para a fertilização de culturas com interesse comercial, é uma das alternativas mais promissoras neste contexto. Além disso, estas preparações biológicas desempenham um papel importante em modelos de agricultura sustentável, devido à possibilidade de serem produzidas a partir de recursos renováveis (Altieri, 1997). A principal vantagem desta via é que, uma vez que é baseada em mecanismos naturais, é uma alternativa ecológica, amiga do ambiente, não poluidora, que reduz consideravelmente os riscos de os agentes patogénicos adquirirem resistência. Além disso, uma vez que são selectivos no seu modo de acção, é geralmente menos provável que prejudiquem outros organismos benéficos e, em muitos casos, beneficiam o ecossistema e estimulam o crescimento das plantas, tornando a produção agrícola mais 2
ΕΡ 2 138 Ο44/PT sustentável, ao mesmo tempo que os efeitos sobre a saúde humana são mínimos ou nulos. Virtualmente todas as pragas e doenças são afectadas em alguma medida por organismos antagonistas. Em muitos casos, estas entidades biológicas representam o factor mais importante na regulação de populações de organismos patogénicos na natureza.
Um dos grupos mais importantes entre os organismos que causam doenças em plantas é o dos fungos fitopatogénicos, incluindo espécies dos géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Thielaviopsis e Botryosphaeria, entre muitos outros, que podem sobreviver por muitos anos no solo.
Na busca de agentes para controlo biológico que possam ter interesse comercial, uma série de factores devem ser levados em consideração que, estudados em conjunto, podem levar a um bom resultado. Entre eles podem ser mencionados as entidades biológicas a usar de forma independente ou em inóculos mistos, a actividade biológica específica, os mecanismos de acção contra o agente patogénico, o sistema de produção utilizado, bem como o tipo de formulação e a sua estabilidade (Warrior, 2000) . Vários mecanismos têm sido descritos para explicar o fenómeno do controlo biológico destes patogénios, como o parasitismo, a protecção cruzada, a antibiose, a competição e a indução de resistência, entre outros (Shoda, 2000, Walsh et al., 2001).
Um dos nichos ecológicos mais estudados tem sido a rizosfera, devido às relações aqui estabelecidas entre plantas e outros organismos (Guerreiro, 2000) . Os microrganismos da rizosfera têm sido estudados desde a década de 1980 como possíveis substitutos de pesticidas químicos para controlar uma vasta gama de doenças. Devido à sua distribuição abundante no solo, à sua capacidade de colonizar as raízes das plantas, e de produzir uma grande variedade de compostos benéficos, bem como antagonistas de um grande número de agentes patogénicos, estes organismos são altamente adequados para o controlo biológico de pragas e doenças. (Anjaiah et al., 1998; Hill et al., 1994;
Maurhofer et al. , 1991; Rodriguez, e Pfender. 1997; Ross et al., 2000 e Thomashow et al., 1997). 3 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
Entre os grupos microbianos da rizosfera, que têm sido amplamente estudados como agentes para o controlo biológico de pragas e doenças causadas por microrganismos, encontra-se o grupo formado pelos fungos. Tem sido utilizada com sucesso no controlo de fungos patogénicos pertencentes aos géneros Botrytis, Fusarium, Pythium, Phytophthora, Rhizoctonia,
Sclerotinia, Penicillium e Macrophomina e outros (Whipps e Lumsden, 2001, McQuilken et al., 2001, e Jones e Whipps, 2002, entre outros) . Dado o seu variado metabolismo, este grupo microbiano é capaz de produzir uma grande variedade de substâncias úteis para o controlo biológico. Por estas razões, o número de estirpes e produtos à base de fungos para este propósito é cada vez maior e mais variado (Cook et al., 1996,
Whipps, 1997, Fravel et al., 1998, EPA USA 2006. Patente US 6306386 e Patente US 6890530, entre outras). Os mecanismos através dos quais o controlo biológico das doenças é exercido são complexos e é sabido que ser o resultado da adição ou sinergia entre vários deles. Entre estes está a competição por nutrientes e espaço, a capacidade de produzir substâncias que impedem a germinação do esporo (fungistasia) ou produzir morte celular (antibiose) e a modificação da rizosfera por acidificação do solo, o que impede a proliferação do patogénio. Controlo biológico também pode ser um resultado de uma interacção directa entre o patogénio e o agente de biocontrolo (parasitismo), por meio de enzimas hidrolíticas como quitinases e glucanases, ou da acção conjunta destas últimas e metabolitos tóxicos (Benitez, et al., 2004). A utilização de rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (PGPR) para o controlo biológico de pragas e doenças tem sido também extensamente estudada. A particularidade principal deste tipo de agentes é que, em adição ao seu efeito de protecção, têm uma alta capacidade de colonizar as raízes das plantas e um elevado poder de estimulação do crescimento da planta, o que adiciona uma melhoria geral da saúde das culturas ao efeito protector e, por conseguinte, a planta é também mais resistente ao ataque dos agentes patogénicos. Este grupo de agentes tem sido usado em doenças causadas por fungos fitopatogénicos pertencentes aos géneros Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Thielaviopsis, Penicillium, Alternaria e Botrytis, entre outros (Emmert e Handelsman, 1999, Ligon et al., 2000, 4 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
Cavaglieri, et al., 2004 e Roberts, et al., 2005, Patente US 7118739, entre outras). O género Pseudomonas tem sido objecto de um número de estudos ao longo dos anos, uma vez que é um dos agentes mais activos e dominantes na rizosfera (Geels e Schippers, 1983, de Freitas e Germida 1991, de la Cruz et ai., 1992, Ligon et ai., 2000, Patente US 7087424) . Membros deste género produzem diferentes antibióticos que estão intimamente relacionados com a redução e supressão de doenças das plantas. Um outro factor que desempenha um papel importante neste fenómeno é a produção de sideróforos, que, além disso, contribuem para o crescimento das plantas pela via do fornecimento de ferro. Esta capacidade é muito alargada em membros do género Pseudomonas. No entanto, a incapacidade do género para produzir estruturas de resistência durante o seu crescimento limita em alguma medida a estabilidade e a eficácia das preparações biológicas obtidas com estirpes deste género. O género Bacillus também tem sido extensivamente estudado, uma vez que tem grandes potencialidades neste sentido. Tem como principal característica o facto de ser praticamente omnipresente em todos os tipos de solos, a que acrescenta uma alta tolerância ao calor, um rápido crescimento em meios líquidos e a formação de esporos de resistência que lhe permitem sobreviver por longos períodos de tempo. Tudo isto confere às estirpes do género um grande potencial como agentes de controlo biológico. A United States Environmental Protection Agency (EPA) registou mais de dez estirpes de diferentes espécies deste género como biopesticidas e particularmente como biofungicidas (EPA, 2006). Os principais mecanismos associados ao biocontrolo de fungos fitopatogénicos por meio de estirpes deste género também incluem a produção de antibióticos, sideróforos, tensioactivos e enzimas hidrolíticas como as quitinases, entre outras (Utkhede, 1984, Acea et al., 1988, Stanghellini e Miller 1996, Shoda 2000, Banat et al., 2000, Zhang et al., 2001, Ruiz-Garcia et al., 2005, Patente US 7087424 e EP1647188).
Outros géneros de bactérias também têm sido estudados como agentes para controlo biológico, os géneros Enterobacter, Alcaligenes, Stenotrophomonas e Streptomyces (McClure, et al., 5
ΕΡ 2 138 Ο44/PT 1998, Brewster et al., 1997, e Sabaratnam e Traquair, 2002,
Cavaglieri et al., 2004 e outros) estão entre eles. A forma física de um produto preparação biológica é também um factor muito importante que deve ser tomado em conta. O que se procura é que os microorganismos permaneçam viáveis num estado inactivo ou metabolicamente activo (Fernández, 1995). Este último é um dos problemas mais importantes da biotecnologia agrícola, uma vez que as células microbianas não só têm que permanecer viáveis por longos períodos de tempo, como também têm que ser capazes de sobreviver no ambiente e desempenhar a função que lhes estava destinada. W02005/059112 divulga um novo microorganismo, Bacillus amyloliquefaciens KTGB0202, que é activo contra o oídio, Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Phytophthora sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Alternaria sp., Magnaporthe grisea, Puccinia recôndita, Corticium sasaki, e Candida sp. e inibe a infecção pelo vírus do mosaico do tabaco. W02005/059112 divulgou também uma substância activa antifúngica obtida por extracção e purificação a partir da estirpe KTGB0202. US6808917 divulga um inoculo compreendendo uma combinação de um fungo e uma bactéria, em particular o fungo é Trichoderma virens e a bactéria é Bacillus amyloliquefanciens. As estirpes de bactérias preferidas são Bacillus amyloliquefanciens TJ1000 ο 1BE. A combinação fúngico/ bacteriana é utilizada como antagonista e a sua combinação suprime o crescimento de fungos patogénicos para as plantas. A combinação de Trichoderma virens e Bacillus amyloliquefanciens (fúngico/bacteriana) é utilizada como agente de biocontrolo, biopesticida ou biofungicida.
Quando se referem microorganismos esporogénico, há geralmente uma maior flexibilidade no que respeita à formulação, uma vez que estes organismos podem sobreviver por longos períodos de tempo, sendo capazes de germinar e multiplicar-se quando são restabelecidas condições favoráveis. As técnicas de imobilização de células oferecem uma série de vantagens em relação às células livres, que as tornam muito atractivas para a sua aplicação prática (Fernández, 1995, Vassileva et al., 1998a e 1998b, entre outros), e muito particularmente para 6 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ biotecnologia ambiental. A utilização de células imobilizadas pode potenciar os efeitos dos microrganismos sem criar problemas de contaminação, dando origem a produtos muito activos e novos (Bellota et al., 1994, Núnez, 1998, Fonseca, 1998, Pat. espanhola ES2234417).
Descrição da Invenção 0 objecto da presente invenção é um produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos, formado por células viáveis de um novo isolado de Bacillus velezensis (Ruiz-Garcia et al., 2005) estirpe AH2. A referida estirpe foi isolada a partir de solos da Região de Múrcia. A principal característica deste isolado é que ele tem uma alta actividade antifúngica contra diferentes agentes causadores de doenças de culturas com interesse económico, tais como os fungos dos géneros Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, Thielaviopsis e Botryosphaeria, entre outros. Além disso, tem a capacidade de estimular o crescimento das plantas através de diferentes mecanismos. O referido microorganismo foi depositado na Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT), que lhe atribuiu o número de acesso CECT-7221. A estirpe foi identificada pelos autores e foi ainda solicitada a identificação na CECT. A identificação da espécie na CECT foi realizada por meio de amplificação directa por PCR do gene de rRNA 16S, sua sequenciação parcial (com leituras em ambos os sentidos) e análise das sequências, finalmente concluindo que é Bacillus velezensis. O produto para controlo biológico de fungos patogénicos e estimulação do crescimento das plantas consiste em uma formulação liquida contendo esporos viáveis da cultura como principal ingrediente activo. O microorganismo Bacillus velezensis da estirpe AH2 CECT-7221, bem como os seus mutantes, são igualmente objecto da presente invenção. Foi obtido por meio de um processo que combina o isolamento em meio de ágar nutriente (Oxoid), após a eliminação de células vegetativas, e a selecção através da sua capacidade antagonista contra diferentes fungos fitopatogénicos, tendo em conta, além disso, a capacidade para estimular o crescimento das plantas (Fernández 2004) . A capacidade de inibir o crescimento dos fungos foi determinada em bioensaios in vitro em meio de ágar de dextrose de batata (PDA) (Oxoid). A estirpe AH2 foi seleccionada, por meio destes 7 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ bioensaios, a partir de todos os isolados testados, devido à sua elevada capacidade de inibir o crescimento de diferentes de fungos fitopatogénicos, tais como espécies dos géneros
Botrytis, Pythium, Rhizoctonia, Alternaria, Fusarium, Phytophthora, e Thielaviopsis e Botryosphaeria. 0 poder estimulante do crescimento de plantas foi verificado por meio de bioensaios laboratoriais, de acordo com os métodos descritos por Bashan et al., 1986, Fernández 1995 e Bashan 1998 . Sua capacidade para estimular o crescimento das plantas foi depois verificada por meio de bioensaios em estufa (Villaverde et al., 2004) . Além disso, verificou-se que é capaz de solubilizar fosfatos, produzir ácido indolo-3-acético e outras substâncias promotoras do crescimento de plantas, assim como de sideróforos. A presença da enzima 1-aminociclopropano-l-carboxilato-desaminase também foi determinada através do crescimento em meios com ácido 1-aminociclopropano-l-carboxílico (ACC), como única fonte de azoto. Todas estas actividades corroboram a sua capacidade para estimular o crescimento das plantas. Villaverde et al., 2004) .
Da mesma forma, o processo de obtenção do produto para o tratamento de doenças causadas por fungos fitopatogénicos é objecto da presente invenção, processo esse que consiste nas seguintes etapas: a) crescimento e esporulação de Bacillus velezensis estirpe AH2 num meio de cultura adequado, por meio de fermentação submersa. Neste passo são atingidos valores de contagem de células da ordem de 109 unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC.mlr1) b) Preparação da formulação através da adição dos outros componentes ao caldo de fermentação com as células.
Este produto tem boa estabilidade e conserva a viabilidade das células, sem perdas significativas, durante pelo menos seis meses, a uma temperatura não superiores a 302C. As actividades antifúngica e estimulante do crescimento das plantas da formulação foram verificadas durante mais de seis meses, conservando suas propriedades iniciais. Demonstrou eficácia no tratamento de doenças causadas por vários diferentes fungos fitopatogénicos e para a estimulação do crescimento das plantas, na sua aplicação em ensaios em estufa. Também demonstrou 8 ΕΡ 2 138 Ο44/PT eficácia para o tratamento de fungos fitopatogénicos e particularmente de Botrytis cinerea em ensaios de campo.
Concretização Preferida da Invenção Propagação da estirpe de Bacillus velezensis AH2
Uma ampola do isolado preservado de Bacillus velezensis estirpe AH2 foi tomada, semeada em placas de meio PDA que foram incubadas a 302C durante 72 horas para a sua activação. Foi preparado um inoculo a partir desta placa para o fermentador, sendo uma porção da cultura tomada com uma ansa, com a qual foi inoculado um balão de Erlenmeyer de 1000 mL com 100 ml de meio de caldo de dextrose de batata (PD) e incubou-se sob agitação a 302C durante 16 horas. Depois o conteúdo do balão foi inoculado num fermentador Braun Biotech BIOSTAT® B de 3 L com meio PD, até um volume final de 2 L. A fermentação foi realizada durante 24 horas a uma velocidade de agitação de 600 rpm, com um arejamento de 1 v.v.m. (2 L.min-1) e uma temperatura de 302C. O pH foi deixado variar livremente e no final tinha um valor < 5,5. Atingiu-se uma concentração final de 2 x 109 células.mlc1 e aproximadamente 80% de esporulação. A taxa de crescimento especifico em fase exponencial ( ) foi de 0,40-¾. As diferentes fases de crescimento foram desenvolvidas durante as primeiras 14 horas de cultura e, em seguida, o processo de esporulação ocorreu até às 24 horas.
Uma terminada a fermentação, os 2 L de caldo fermentado foram tomados e adicionaram-se-lhe os ácidos propiónico, sórbico e ascórbico a 0,5, 0,1 e 0,2%, respectivamente. A viabilidade das células em meio de Ágar Nutriente foi determinada para deste produto, periodicamente, verificando que mantém mais do que 80% de viabilidade após seis meses de conservação a temperaturas não superiores a 30 2C.
Todos os ensaios sobre a capacidade antifúngica e estimulante do crescimento das plantas foram realizados com o produto preparado de acordo com este esquema de fabrico com resultados muito satisfatórios. ENSAIOS DE ANTAGONISMO IN VITRO. 9 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
Estes ensaios foram realizados em placas de Petri. Os patogénios foram cultivados em placas de PDA durante 48-72 horas a uma temperatura de 252C. Foi então tomada uma porção de aproximadamente 1 cm de diâmetro, porção essa que foi colocada no centro de uma placa com meio PDA. A referida placa foi inoculada nas extremidades com Bacillus velezensis estirpe AH2 por meio de uma ansa. Subsequentemente, foi incubada durante 48-72 horas a 282C até se observar a inibição. No caso do ensaio com Botryosphaeria sp., foi também cultivada em meio PD agitado, centrifugada e o sobrenadante foi adicionado em poços de 1 cm2 na mesma placa para determinar a capacidade antifúngica do caldo fermentado isento de células. A Figura 1 mostra os ensaios de antagonismo in vitro contra alguns dos patogénios testados. Como pode ser observado, existe uma forte actividade inibidora do crescimento de fungos em cada um dos fungos patogénicos ensaiados.
Além disso, o ensaio realizado com o sobrenadante da cultura, no caso de Botryosphaeria sp. mostra que a bactéria tem actividade antifúngica exocelular, como ocorre com muitas outras estirpes do género Bacillus.
ENSAIOS DE ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO DAS PLANTAS
Para verificar a capacidade de estimular o crescimento das plantas, foi realizado um ensaio em plantas de pepino em condições experimentais em estufa, em vasos de plantas. 0 produto Bioprón PMC3 de Probelte SA foi usado como controlo positivo dada a sua reconhecida capacidade para estimular o crescimento de plantas de diferentes culturas.
Os resultados deste ensaio são mostrados na Figura 2.
Como pode ser observado nesta Figura 2, houve um aumento considerável no peso fresco total, bem como em que no da parte verde e no da raiz. Embora estes valores sejam inferiores, não foram estatisticamente diferentes, com 95% de confiança, dos obtidos quando foi usado o Bioprón PMC3, mas eram diferentes, como observado no gráfico, dos valores do controlo. Estes ensaios foram realizados com outras culturas, como tomate e alface, onde foram obtidos resultados semelhantes, o que permitiu verificar a capacidade estimulante do crescimento de 10 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ plantas do Bacillus velezensis estirpe AH2 isolado nos laboratórios de investigação da Probelte S.A.
EFICACIA DO ENSAIO EM CONDIÇOES DE PRODUÇÃO
Referência do ensaio: Nome comercial do produto: Cultura: Condições: Padrão de plantio: Densidade de plantio Tipo de solo: Ingrediente activo:
Uso genérico do produto: Tipo de formulação: Modo de aplicação: Patogénio alvo objecto do ensaio: Produto de referência:
AFS Mazarron Tomato 2006 AFS
Tomate Amadeo (Lycopersícon esc. M) Estufa de produção, irrigação localizada 1 m x 0, 6 m
Aprox. 16 600 plantas/ha Areia argilosa
Bacillus velezensis estirpe AH2,
108 UFC/mL
Fungicida Liquido solúvel Pulverização foliar Botrytis cinerea
Karbel (Registado na R.O.P.M.F. (Registo oficial de produtos e materiais fitofarmacêuticos) N.2 23506/14 (25% de Carbendazima + 25% de Dietofencarb. 1 g/L da Probelte S.A.)
Tese a ensaiar
Tese Nome Doses Ingrediente ou ingredientes activos N. 2 1 CONTROLO N. 2 2 AFS 15 (mL/L) Bacillus velezensis, 108 UFC/mL N. 2 3 TRL 5 (mL/L) Trichoderma harzianum + T. viride, 108 UFC/mL N. 2 4 AFS 5 (L/ha) Bacillus velezensis, 108 UFC/mL N. 2 5 KARBEL 1 (g/L) 25% de Carbendazima + 25% de Dietofencarb
Foi realizado um ensaio com um desenho em blocos completamente randomizado com quatro repetições. O tamanho da parcela elementar foi de 15 m2 e 60 m2 de área total para cada tratamento. 11 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
Foram realizadas duas aplicações durante o ensaio, por meio de pulverização foliar, Ti e T2, num volume de calda de 1200 L/ha. A primeira aplicação foi 2,5 meses após o plantio e a segunda aplicação foi 17 dias após a realização da primeira.
Para realizar a avaliação do ensaio, o número total de tomates que havia em cada planta foi contado na parcela elementar, os tomates com Botrytis foram registados e foi atribuído um valor de 1 a 4 de acordo com a intensidade do ataque do patogénio e com base nisto foi realizado o cálculo da infestação. Foram realizadas três avaliações durante o ensaio, uma avaliação inicial Vo e duas avaliações após terminados os tratamentos, Vi 7 dias após a realização do segundo tratamento e V2 15 dias depois.
Resultados do ensaio.
Avaliação Vo. Não foi observado nenhum sintoma da doença Primeira avaliação Vi (Uma semana após o segundo tratamento) BLOCOS A B c D Média Total TESE Infestação CONTROLO 0, 063 0,145 0,083 0, 145 0,108 0,433 AFS (15 mL/L) 0 0,020 0 0, 020 0, 01 0,04 TRL (5 mL/L) 0 0,020 0,041 0 0,015 0,061 AFS (5 L/ha) 0, 041 0,041 0,041 0, 020 0,035 0,143 KARBEL (1 g/L) 0 0,041 0 0, 041 0,020 0,082
Eficácia ABBOTT TESE MÉDIA % DE EFICÁCIA CONTROLO 0,108 AFS (15 mL/L) 0, 01 90, 82 TRL (5 mL/L) 0,015 85, 99 AFS (5 L/ha) 0,035 67,16 KARBEL (1 g/L) 0,020 81,17 12 ΕΡ 2 138 044/ΡΤ
Teste de gama múltipla de Duncan TESE Diferenças significativas CONTROLO b AFS (15 mL/L) to TRL (5 mL/L) to AFS (5 L/ha) b KARBEL (1 g/L) to
Segunda avaliação V2 (Quinze dias após o segundo tratamento) BLOCOS A B C D Média Total TESE Infestação CONTROLO 0,166 0, 104 0,250 0,250 0,192 0,77 AFS (15 mL/L) 0 0, 062 0,041 0,041 0, 036 0,144 TRL (5 mL/L) 0 0, 020 0,083 0,062 0, 041 0,165 AFS (5 L/ha) 0, 020 0, 083 0,041 0,104 0, 062 0,248 KARBEL (1 g/L) 0, 020 0, 083 0,041 0,062 0, 051 0,206
Eficácia ABBOTT TESE MÉDIA % DE EFICÁCIA CONTROLO 0,192 AFS (15 mL/L) 0,036 81, 30 TRL (5 mL/L) 0,041 78, 57 AFS (5 L/ha) 0,062 67, 79 KARBEL (1 g/L) 0,051 73,25
Teste de gama múltipla de Duncan TESE Diferenças significativas CONTROLO b AFS (15 mL/L) a TRL (5 mL/L) a AFS (5 L/ha) a KARBEL (1 g/L) a
Como pode ser observado, em ambas as avaliações o tratamento com AFS a 15 ml/L causa uma protecção que é eficaz 13
ΕΡ 2 138 Ο44/PT e maior do que a do produto químico comercial utilizado como controlo s. Em todos os momentos a infestação foi mantida sob controlo e a eficácia do produto ensaiado foi muito elevada. A análise estatística realizada mostrou que não existem diferenças significativas entre os produtos biológicos testados e o produto químico de controlo.
Conclusões: • No ensaio realizado em Mazarrón (Murcia) , em pulverização foliar para controlo de Botrytis cinerea e observar o seu comportamento no futuro, o AFS teve uma actividade muito boa relativamente ao controlo que não recebeu qualquer tratamento. • Na avaliação Vi obtiveram-se eficácias na ordem de 90% para a dose de 15 mL/L, • Na avaliação V2 as eficácias foram elevadas, superiores a 70% e, particularmente no caso do AFS, superiores a mais 80%. • Deve-se ressaltar que o nível de incidência do patogénio na cultura foi mantido sob controlo com os tratamentos realizados. • Após a realização da análise da variância em ambas as avaliações, nos parâmetros medidos, quando foi realizado o teste de gama múltipla de Duncan, constatou-se que não há diferenças com 99% de confiança entre as doses em estudo e que há diferenças em relação ao controlo não tratado. • Não foi observado nenhum sintoma de toxicidade na cultura com a dose mais elevada. • Conclui-se por conseguinte que o AFS numa dosagem de 15 mL/L constitui uma formulação adequada para o controlo de Botrytis cinerea em tomates.
Lisboa, 2014-10-27
Claims (10)
- ΕΡ 2 138 044/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Cultura pura da estirpe denominada AH2 da espécie Bacillus velezensis, bem como seus mutantes, caracterizada por ter uma elevada actividade antifúngica e em particular contra fungos fitopatogénicos dada a sua capacidade para produzir substâncias antagonistas, bem como uma boa capacidade para estimular o crescimento das plantas, a estirpe sendo capaz de solubilizar fosfatos, produzir ácido indolo-3-acético e sideróforos, bem como sendo capaz de crescer em ácido 1-aminociclopropano-l-carboxílico (ACC) como única fonte de azoto, tendo a referida estirpe sido depositada na Colección Espanola de Cultivos Tipo (CECT) com o número CECT-7221.
- 2. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas, caracterizado por conter células viáveis de Bacillus velezensis estirpe AH2 (CECT-7221).
- 3. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as células viáveis mencionadas estarem na forma de esporos.
- 4. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado por as células microbianas serem obtidas por meio de um processo de fermentação submersa em que são atingidas concentrações de esporos superiores a 101 2 3 4 UFC/mL.
- 5. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado por conter uma concentração total de esporos superior a 104 UFC/mL. 1 Produto para o controlo biológico de fungos 2 fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de 3 acordo com uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado por conter, em adição às células bacterianas, o sobrenadante da cultura com matéria orgânica e substâncias com actividade 4 antifúngica, entre outros.
- ΕΡ 2 138 044/ΡΤ 2/2
- 7. Produto para ο controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ter uma estabilidade à temperatura ambiente não inferior a 6 meses.
- 8. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a estabilidade ser assegurada por meio da utilização de substâncias inibidoras do crescimento microbiano.
- 9. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado por a substância inibidora do crescimento microbiano ser seleccionada entre um ou vários ácidos orgânicos utilizados como conservantes.
- 10. Produto para o controlo biológico de fungos fitopatogénicos e estimulante do crescimento de plantas de acordo com as reivindicações 2 a 9, caracterizado por possuir uma actividade elevada quando é aplicado por meio de pulverização foliar. Lisboa, 2014-10-27
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