PT2029742T - Terapia genética para esclerose lateral amiotrófica e outros transtornos da medula espinal - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TERAPIA GENÉTICA PARA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA E OUTROS TRANSTORNOS DA MEDULA ESPINAL" A presente divulgação refere-se a composições e métodos para o tratamento de distúrbios que afetam a função motora de um sujeito e, em particular, a função motora afetada por uma doença ou lesão no cérebro e/ou da medula espinal. A terapia génica é uma modalidade de tratamento emergente para distúrbios que afetam o sistema nervoso central (SNC). A terapia génica aplicada ao SNC tem sido facilitada pelo desenvolvimento de vetores virais capazes de infetar efetivamente os neurónios pós-mitóticos. 0 sistema nervoso central é constituído pela medula espinal e pelo cérebro. A medula espinal conduz informações sensoriais do sistema nervoso periférico para o cérebro e conduz informações motoras do cérebro para vários efetores. Para uma revisão dos vetores virais para a entrega de genes ao sistema nervoso central, ver Davidson et al. (2003) Nature Rev. 4:353-364.

Virus adeno-associados (AAV) são considerados úteis para a terapia genética do SNC, porque possuem uma toxicidade e perfil de imunogenicidade favoráveis, são capazes de transduzir células neuronais e são capazes de mediar a expressão de longo prazo no SNC (Kaplitt et al. (1994) Nat.

Genet. 8:148-154; Bartlett et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1181-1186; and Passini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6446).

Uma propriedade útil dos vetores de AAV reside na capacidade de alguns vetores de AAV de sofrerem transporte retrógrado e/ou anterógrado em células neuronais. Os neurónios numa região do cérebro estão interligados por axónios às regiões distais do cérebro proporcionando assim um sistema de transporte para a entrega do vetor. Por exemplo, um vetor de AAV pode ser administrado nos ou perto dos terminais de axónios de neurónios. Os neurónios internalizam o vetor de AAV e transportam-no de uma forma retrógrada ao longo do axónio para o corpo da célula. Propriedades semelhantes ao adenovirus, HSV, e pseudo-virus da raiva demonstraram entregar genes a estruturas distais dentro do cérebro (Soudas et al. (2001) FASEB J. 15:2283-2285; Breakef ield et al. (1991) New Biol. 3:203-218; and deFalco et al. (2001) Science, 291:2608-2613). Vários grupos têm reportado que a transdução do cérebro por AAV de serotipo 2 (AAV2) é limitada ao local da injeção intracraniana (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet. 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6446; e Chamberlin et al. (1998) Brain Res. 7 93:169-175). Relatórios recentes sugerem que o transporte axonal retrógrado de vetores virais neurotróficos, também pode ocorrer em circuitos selecionados do cérebro normal de ratazana (rat) (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther. 5:50-56 (vetor de AAV); Kasper et al. (2003) Science 301:839-842 (vetor lentiviral) and Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-417 (vetor lentiviral)). Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11(4):429-433 relatam que a injeção intramuscular de lentivírus expressando o ARN interferente para o silenciamento da superóxido dismutase de Cu/Zn (SODl) humana retardou o início da doença da esclerose lateral amiotrófica (ELA) num modelo de roedor da ELA terapeuticamente relevante.

As células transduzidas por vetores de AAV podem expressar um produto de transgene terapêutico, tal como uma enzima ou um fator neurotrófico, para mediar efeitos benéficos intracelularmente. Estas células podem também secretar o produto do transgene terapêutico, o qual pode ser posteriormente recolhido por células distais nas quais pode mediar os seus efeitos benéficos. Este processo tem sido descrito como correção cruzada (Neufeld et al (1970) Science. 169: 141-146).

No entanto, existe ainda uma necessidade de composições e métodos para tratar a disfunção da medula espinal que resulta na perda da função motora em pacientes humanos. A presente invenção satisfaz esta necessidade bem como proporciona vantagens relacionadas. A presente invenção proporciona métodos e composições para a entrega de um transgene à medula espinal e/ou à região do tronco cerebral de um sujeito por administração intraventricular de um vetor virai recombinante neurotrófico contendo um transgene IGP-1. A entrega virai pode ser sob condições que favorecem a expressão do transgene em células ependimais.

Esta divulgação proporciona métodos e composições para a entrega de um transgene à medula espinal e/ou à região do tronco cerebral de um sujeito por administração intraventricular de um vetor virai recombinante neurotrófico que compreende um transgene selecionado a partir do grupo que consiste em fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), calbindina D28K, parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, RCS-1, SMN-2, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (Shh) , eritropoietina (EPO) , lisil-oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogenina, e lactogénio placentário. A entrega virai pode ser sob condições que favorecem a expressão do transgene em células ependimais.

Esta invenção proporciona métodos e composições para a entrega de um transgene à medula espinal e/ou à região do tronco cerebral de um sujeito por administração intraventricular (conhecida também como intracerebroventricular ou ICV) de um vetor virai recombinante neurotrófico compreendendo pelo menos dois transgenes selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), calbindina D28K, parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, RCS-1, SMN-2, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (Shh), eritropoletina (EPO), lisil-oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogenina, e lactogénio placentário. Numa forma de realização, um vetor virai adeno-associado recombinante compreende IGF-1 e VEGF. A entrega virai pode ser sob condições que favorecem a expressão do transgene em células ependimais. As Tabelas 1-3 proporcionam combinações potenciais de pares de transgenes úteis na presente invenção.

Num aspeto adicional, a divulgação proporciona composições e métodos para melhorar os sintomas de uma desordem de neurónios motores num sujeito por administração de um vetor virai recombinante neurotrófico contendo o transgene terapêutico ao cérebro do sujeito, e em condições que favorecem a expressão do transgene numa quantidade terapeuticamente eficaz. É para ser entendido que tanto a descrição geral anterior como a descrição detalhada que se segue são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas da invenção conforme reivindicada. A Figura 1 mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, comparando a administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase com AAV4 que codifica o IGF1. Foi observada uma diferença significativa na sobrevivência. Os destinatários foram ratinhos SOD. A Figura 2 mostra uma comparação de força do membro anterior entre ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Lac Z) versus AAV4 que codifica o IGF1. Os destinatários de IGF1 perderam força mais gradualmente e de forma mais lenta. A Figura 3 mostra uma comparação de força dos membros posteriores entre ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Lac Z) versus AAV4 que codifica a IGF1. Os destinatários de IGF1 perderam força de forma mais gradual e posterior. A Figura 4 mostra uma comparação to teste de rotarod (latência para a queda) entre os ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Lac Z) versus AAV4 que codifica o IGF1 . Os destinatários de IGF1 desistiam de forma mais gradual e posterior. A Figura 5 mostra uma comparação da perda de massa corporal entre ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Lac Z) versus AAV4 que codifica a IGF1. Os destinatários de IGF1 perderam massa corporal de forma mais gradual e posterior. A Figura 6 mostra uma comparação de coloração GFAP no tronco cerebral de ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Bgal) versus AAV 4 que codifica o IGF1. Como evidenciado pela reduzida coloração GFAP nos ratinhos tratados com AAV4-IGF1, a entrega intraventricular de AAV4-IGF-1 conduziu a uma redução da astrogliose dentro do tronco cerebral. A Figura 7 mostra uma comparação da coloração GFAP na medula espinal ventral de ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Bgal) versus AAV4 que codifica a IGF1. Como evidenciado pela coloração GFAP reduzida nos ratinhos tratados com AAV4-IGF1, a entrega intraventricular de AAV4-IGF-1 conduziu a uma redução da astrogliose na medula espinal ventral. A Figura 8 mostra uma comparação dos níveis de nitrotirosina em ratinhos SOD que receberam a administração intraventricular de AAV4 que codifica a beta-galactosidase (Bgal) versus AAV4 que codifica a IGF1. Como evidenciado pela coloração reduzida nos ratinhos tratados AAV4-IGF1, a entrega intraventricular de AAV4-IGF -1 levou a uma redução nos níveis de nitrotirosina ao longo da medula espinal p.e., cervical, torácica, lombar, e sacral. A Figura 9 mostra a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) em ratinhos tratados com AAV4-GFP. A GFP está distribuída pela camada de células ependimárias do sistema ventricular após a entrega intraventricular de AAV4-GFP.

A Figura 10 mostra a expressão de proteína verde fluorescente (GFP) em ratinhos tratados com AAV4-GFP. A GFP está distribuída pela camada de células ependimárias do canal central da medula espinal após a entrega intraventricular de AAV4-GFP. A Figura 11A mostra os resultados de RT-PCR realizado em tecidos de ratinhos SOD que foram tratados por injeção intraventricular de AAV4-IGF-1. A expressão de B-actina foi medida como um controlo interno. 0 vetor foi detetado em todo o córtex, tronco cerebral e medula espinal após a entrega intraventricular. A Figura 11B mostra os resultados de RT-PCR realizada sobre os tecidos de ratinhos SOD que foram tratados por injeção intraventricular de AAV4-VEGF. A expressão de B-actina foi medida como um controlo interno. 0 vetor foi detetado em todo o córtex, tronco cerebral e medula espinal após a entrega intraventricular de AAV4-VEGF. A Figura 12 mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratinhos S0D1 que receberam a administração intraventricular de AAV4 que codifica a proteína fluorescente verde (GFP) ou de AAV4 que que codifica o VEGF165. Um aumento significativo na mediana da sobrevivência foi observado em ratinhos que receberam AAV4-VEGF. A Figura 13 mostra uma comparação de rotarod (latência para a queda) entre os ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a GFP contra AAV4 que codifica o VEGF165. Os destinatários de VEGF165 desistiam de forma mais gradual e posterior. A Figura 13 também mostra uma comparação da força dos membros posteriores entre ratinhos SOD que receberam administração intraventricular de AAV4 que codifica a GFP contra AAV4 que codifica o VEGF165. Os destinatários de VEGF165 perdiam força de forma mais gradual e posterior.

As Tabelas 1-3 mostram um número de pares de genes potenciais para utilização na presente divulgação, onde a forma de realização utiliza mais do que um gene. A presente invenção é como estabelecido nas reivindicações anexas. A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada. A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e ADN recombinante, as quais estão dentro da competência da tecnologia. Ver, p.e., Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Tal como utilizado na especificação e reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo as suas misturas.

Tal como aqui utilizado, o termo "compreendendo" pretende significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em" quando utilizado para definir composições e métodos, deverá significar a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação. Assim, uma composição consistindo essencialmente nos elementos tal como aqui definido não excluiria contaminantes vestigiais do método de isolamento e purificação e transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. "Consistindo em" deve significar a exclusão de elementos mais do que vestigiais de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições desta invenção. As formas de realização definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do âmbito da presente invenção.

Todas as designações numéricas, por exemplo, o pH, a temperatura, o tempo, a concentração e peso molecular, incluindo gamas, são aproximações que variam (+) ou (-) por incrementos de 0,1. É para ser compreendido, embora nem sempre seja afirmado explicitamente, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". É também para ser compreendido, embora nem sempre seja afirmado explicitamente, que os reagentes aqui descritos são meramente exemplificativos e que os seus equivalentes são conhecidos na técnica. O termo "transgene" refere-se a um polinucleótido que é introduzido numa célula de é capaz de ser transcrito em ARN e, opcionalmente, traduzido e/ou expresso sob condições apropriadas. Num aspeto, este confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzido, ou caso contrário leva a um resultado terapêutico ou de diagnóstico desej ado.

Os termos "partículas de genoma (gp)", ou "equivalentes de genoma", ou "cópias de genoma" (gc), quando utilizado em referência a um título virai, referem-se ao número de viriões contendo o genoma de ADN recombinante AAV, independentemente da infeciosidade ou funcionalidade. 0 número de partículas de genoma numa preparação de vetor particular pode ser medido por procedimentos tais como descritos nos Exemplos aqui, ou, p.e., em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

Os termos "unidade de infeção (iu)", "partículas infeciosas", ou "unidade de replicação", quando usados em referência a um titulo virai, referem-se ao número de partículas infeciosas e capazes de replicação do vetor recombinante AAV tal como medido pelo ensaio de centros infeciosos, também conhecido como ensaio de centro de replicação, tal como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973. O termo "unidade de transdução (tu)" quando usado em referência a um título virai, refere-se ao número de partículas infeciosas do vetor recombinante AAV que resultam na produção de um produto transgene funcional, medidos em ensaios funcionais, tais como os descritos em Exemplos neste documento ou, por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (Ensaio LFU).

Os termos "terapêutico", "quantidade terapeuticamente eficaz", e seus cognatos referem-se à quantidade de um produto de ARN, ADN ou expressão de ADN e/ou ARN que resulta na prevenção ou atraso do aparecimento ou na melhoria de sintomas num sujeito ou a realização de um resultado biológico desejado, tais como correção de neuropatologia, p.e., patologia celular associada com uma doença dos neurónios motores tal como esclerose lateral amiotrófica (ELA). 0 termo "correção terapêutica" refere-se a um tal grau de correção que resulta na prevenção ou atraso do aparecimento ou melhoria dos sintomas num sujeito. A quantidade eficaz pode ser determinada por métodos empíricos conhecidos.

Uma "composição" destina-se também a abranger uma combinação de agente ativo e outro transportador, p.e., composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente detetável ou marcador) ou ativo, tal como um adjuvante, diluente, aglutinante, estabilizadores, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes. Os transportadores também incluem excipientes farmacêuticos e aditivos de proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos e hidratos de carbono (p.e., açúcares, incluindo monossacarídeos, di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados tais como alditóis, ácidos aldónicos, açúcares esterifiçados e semelhantes; e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes isoladamente ou em combinação, compreendendo isoladamente ou em combinação 1-99, 99% em peso ou volume. Proteínas excipientes exemplares incluem albumina de soro tal como albumina do soro humano (HSA) , albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e semelhantes. Aminoácido/componentes de anticorpo representativos, que também pode funcionar numa capacidade tamponante, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisterna, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, e semelhantes. Excipientes de hidratos de carbono também são desejados dentro do âmbito da presente invenção, exemplos dos quais incluem mas não estão limitados a monossacarideos tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose, e semelhantes; dissacarideos tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose, e semelhantes; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) e mioinositol. 0 termo transportador inclui ainda um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado a partir de um ácido orgânico ou base. Tampões representativos incluem sais de ácidos orgânicos, tais como sais de ácido citrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succinico, ácido acético, ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Transportadores adicionais incluem excipientes/aditivos poliméricos tais como polivinilpirrolidonas, ficois (um açúcar polimérico) , dextratos (p.e., ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-. quadrature.-ciclodextrina), polietileno-glicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, agentes tensioativos (p.e., polissorbatos, tais como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipidos (p.e., fosfolipidos, ácidos gordos), esteroides (p.e., colesterol) e agentes quelantes (p.e., EDTA).

Tal como aqui utilizado, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" abrange qualquer dos transportadores farmacêuticos padrão, tais como uma solução salina de fosfato tamponada, água e emulsões, tais como uma emulsão óleo/água ou uma emulsão água/óleo, e vários tipos de agentes molhantes. As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes e qualquer um dos transportadores acima assinalados com a disposição adicional que seja aceitável para o uso in vivo. Para exemplos de transportadores, estabilizadores e adjuvantes, ver Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) e Williams & Williams, (1995), e na "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998). Os transportadores também podem compreender liquido cefalorraquidiano artificial (LCRa).

Um "sujeito", "indivíduo" ou "doente" é utilizado indiferentemente no presente documento, referindo-se a um vertebrado, preferencialmente um mamifero, mais preferencialmente a um ser humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a murinos, ratazanas, símios, humanos, animais de quinta, animais de desporto e animais de estimação.

Um "controlo" é um sujeito ou amostra alternativa utilizado numa experiência para fins de comparação. Um controlo pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, quando o objetivo da experiência é determinar a correlação de um nível de expressão alterado de um gene com um determinado tipo de patologia (ver ELA, por exemplo, infra), é geralmente preferível utilizar um controlo positivo (um sujeito ou uma amostra de um indivíduo, que possua essa modificação e que apresente sintomas característicos dessa doença) e um controlo negativo (um sujeito ou uma amostra de um sujeito sem a expressão alterada e sintoma clínico da doença). "Expresso diferencialmente" tal como aplicado a um gene, refere-se à produção diferencial do mARN transcrito a partir do gene ou do produto proteico codificado pelo gene. Um gene expresso diferencialmente pode ser sobre-expresso ou sub-expresso em comparação com o nivel de expressão de uma célula normal ou de um controlo. Num aspeto, refere-se a um diferencial que é pelo menos 1,5 vezes, ou pelo menos 2,5 vezes, ou alternativamente pelo menos 5 vezes, ou alternativamente, pelo menos 10 vezes mais altos ou mais baixos que o nivel de expressão detetada numa amostra de controlo. O termo "expresso diferencialmente" refere-se também a sequências de nucleótidos que são expressos numa célula ou tecido quando estão silenciados numa célula de controlo ou não são expressos quando expressos por uma célula de controlo.

Tal como aqui utilizado, o termo "modular" significa variar a quantidade ou intensidade de um efeito ou resultado, p.e., para melhorar, aumentar, diminuir ou reduzir.

Tal como aqui utilizado, o termo "melhoram" é sinónimo de "atenuar" e meios para reduzir ou aliviar. Por exemplo, pode-se melhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio, tornando-os mais suportáveis.

Para a identificação de estruturas no cérebro humano, ver, p.e., The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; e Co-Planar Stereotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1988. Para a identificação de estruturas no cérebro de ratinho, ver, p.e., The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2nd ed., Academic Press, 2000 . A entrega de um vetor viral recombinante intracerebroventricular, ou intraventricular, pode ser realizada em qualquer um ou mais dos ventrículos do cérebro, que estejam cheios com líquido cefalorraquidiano (LCR). 0 LCR é um líquido transparente que enche os ventrículos, está presente no espaço subaracnoide, e rodeia o cérebro e a medula espinal. 0 LCR é produzido pelos plexos coroides e pela exsudação ou transmissão do fluido tecidular pelo cérebro para os ventrículos. 0 plexo coroide é uma estrutura de revestimento do chão do ventrículo lateral e o teto do terceiro e quarto ventrículos. Alguns estudos indicam que estas estruturas são capazes de produzir 400-600 ccs de líquido por dia, consistente com uma quantidade suficiente para preencher os espaços do sistema nervoso central quatro vezes num dia. Nos adultos, o volume de líquido presente foi calculado como sendo de 125 a 150 ml (4-5 onças). O LCR está em contínua formação, circulação e absorção. Alguns estudos têm indicado que cerca de 430 a 450 ml (cerca de 2 copos) de LCR podem ser produzidos a cada dia. Alguns cálculos estimam que a produção é igual a cerca de 0,35 ml por minuto em adultos e 0,15 por minuto em crianças. Os plexos coroides dos ventrículos laterais produzem a maioria do LCR. Este flui através dos forames de Monro no terceiro ventrículo, onde é adicionado por produção a partir do terceiro ventrículo e continua para baixo através do aqueduto de Sylvius para o quarto ventrículo. O quarto ventrículo acrescenta mais LCR; o líquido em seguida viaja então para o espaço subaracnoide através do forame de Magendie e Luschka. Este circula em seguida ao longo da base do cérebro, para baixo em torno da medula espinal e para cima ao longo dos hemisférios cerebrais. A LCR desagua no sangue através das vilosidades aracnoides e seios vasculares intracranianos.

Em aspetos em que a transferência do gene é mediada por um vetor viral de ADN, tal como um adenovirus (Ad) ou vírus adeno-associado (AAV), uma construção de vetor refere-se ao polinucleótido incluindo o genoma virico ou parte do mesmo, e um transgene. Adenovirus (Ads) são um grupo homogéneo de virus relativamente bem caracterizado, incluindo mais de 50 serotipos. Ver, p.e., Pedido Internacional PCT No. WO 95127071. Ads são fáceis de crescer e não requerem integração no genoma da célula hospedeira. Vetores derivados de Ad recombinante, em particular os que reduzem o potencial para recombinação e geração de virus do tipo selvagem, foram também construídos. Ver, Pedido Internacional PCT Nos. WO 95/00655 e WO 95/11984. Os AAV do tipo selvagem tem uma elevada infeciosidade e especificidade de integração no genoma da célula hospedeira. Ver, Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6466-6470 e Lebkowski, et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

Num aspeto, a invenção proporciona um método para entregar um transgene no cérebro de um sujeito por administração intraventricular de um vetor virai neurotrófico recombinante contendo o transgene de IGF-1. A entrega dá-se em condições que favorecem a expressão do transgene em células ependimais.

Noutro aspeto, a divulgação, proporciona um método de entrega de um produto transgénico terapêutico a uma célula alvo do SNC, a qual é um neurónio ou uma célula glial, num mamífero que sofre de uma desordem nos neurónios motores, por exemplo, de ELA ou lesão traumática da medula espinal, em que o transgene pode ser o IGF-1. O transgene pode ser administrado por meio de um vírus neurotrófico. O vírus pode ser administrado através dos ventrículos. As células ependimais podem ser transduzidas para expressar o transgene e segregar o produto proteico codificado.

Num exemplo alternativo, a invenção proporciona um método para o tratamento de uma desordem nos neurónios motores num sujeito por administração intraventricular de um vetor virai neurotrófico recombinante contendo um transgene terapêutico ao cérebro do sujeito, em que o transgene é expresso numa quantidade terapeuticamente eficaz no sujeito. A invenção também proporciona um método para melhorar os sintomas de uma desordem nos neurónios motores num sujeito por administração intraventricular de um vetor virai neurotrófico recombinante contendo um transgene terapêutico ao cérebro, em que o referido transgene é expresso numa quantidade terapeuticamente eficaz no sujeito.

Os vetores virais neurotróficos adequados para a prática da presente invenção incluem, mas não estão limitados a vetores virais adeno-associados (AAV), vetores virais herpes simplex (U.S. Patent No. 5,672,344) e vetores lentivirais.

Na prática da invenção, podem ser usados AAV de qualquer serotipo. 0 serotipo do vetor virai utilizado em certas formas de realização da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 e AAV8 (ver, p.e., Gao et al. (2 002) PNAS, 99:11854-11859; e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Outros serotipos além daqueles aqui listados podem ser utilizados. Além disso, os vetores de AAV pseudotipados podem também ser utilizados nos métodos aqui descritos. Os vetores de AAV pseudotipados são aqueles que contêm o genoma de um serotipo de AAV no capsídeo de um segundo serotipo de AAV; Por exemplo, um vetor de AAV que contém o capsídeo AAV2 e o genoma AAV1 ou um vetor de AAV que contém o capsídeo AAV5 e o genoma de AAV 2 (Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10 (26) :3075-81) .

Os vetores de AAV são derivados de parvovirus de ADN de cadeia simples (ss) que são não-patogénicos para mamíferos (revisto em Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Resumidamente, os vetores baseados em AAV recombinantes têm os genes virais rep e cap que correspondem a 96% do genoma virai removidos, deixando as duas repetições terminais invertidas (ITRs) de 145-pares de bases (pb) a flanquear, que são utilizados para iniciar a replicação do ADN virai, empacotamento e integração. Na ausência de vírus auxiliar, o AAV de tipo selvagem integra-se no genoma da célula hospedeira humana com sito-especificidade preferencial no cromossoma 19q 13,3 ou pode ser mantido epissomicamente. Uma única partícula de AAV pode acomodar até 5 kb de ssADN deixando portanto cerca de 4,5 kb para um transgene e elementos reguladores, o que é normalmente suficiente. No entanto, sistemas de trans-splicing como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No. 6,544,785, podem quase dobrar esse limite.

Numa forma de realização ilustrativa, AAV é AAV4. Os vírus adeno-associados de vários serotipos, especialmente AAV2, têm sido extensivamente estudados e caracterizados como vetores de terapia génica. Os peritos na tecnologia estarão familiarizados com a preparação de vetores de terapia génica baseados em AAV funcionais. Numerosas referências a vários métodos de produção, purificação e preparação de AAV para administração a seres humanos podem ser encontrados no extenso corpo de literatura publicada (ver, p.e., Virai Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Além disso, a terapia génica baseada em AAV direcionada para células do sistema nervoso central tem sido descrita nas Patente dos Estados Unidos

Nos. 6,180,613 e 6,503,888. Os vetores de AAV exemplificativos adicionais são os vetores de serotipo recombinantes AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8 que codificam proteina humana.

Em certas formas de realização da invenção, o vetor compreende um transgene operacionalmente ligado a um promotor. 0 transgene codifica uma molécula biologicamente ativa, cuja expressão no SNC resulta pelo menos na correção parcial da neuropatologia e/ou estabilização da progressão da doença. O transgene de acordo com a presente divulgação pode ser o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, RCS-1, SMN-2, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (shh), eritropoietina (EPO), lisil-oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogenina, e lactogénio placentário. O transgene para utilização na presente invenção é SMN-1.

Em certas formas de realização da invenção, o vetor compreende mars do que um transgene, no qual cada transgene está operacionalmente ligado a um promotor para permitir a expressão de mais de um trangene a partir de um único vetor de AAV. Em concretizações adicionais, os transgenes podem ser operativamente ligados ao mesmo promotor. Cada transgene codifica uma molécula biologicamente ativa, a expressão da qual no SNC resulta pelo menos na correção parcial da neuropatologia. Além disso, nos casos em que mais do que um transgene é entregue, os transgenes podem ser distribuidos através de mais do que um vetor de AAV, em que cada vetor de AAV compreende um transgene operacionalmente ligado a um promotor. Esses outros transgenes podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, RCS-2, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (shh), eritropoietina (EPO), lisil-oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, e lactogénio placentário. Por exemplo, os transgenes podem compreender o VEGF, tais como VEGF165, e IGF-1. 0 gene do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-1) tem uma estrutura complexa, que é bem conhecido na tecnologia que tem pelo menos dois produtos de splicing alternativo de mARN resultantes do transcrito do gene. Há um péptido de 153 de aminoácidos, conhecido por vários nomes, incluindo IGF-1A ou IGF-lEa, e um péptido de 195 de aminoácidos, conhecido por vários nomes incluindo IGF-1B ou IGF-lEb. A forma Eb também pode ser conhecida como Ec em seres humanos. A forma madura de IGF-1 é um polipéptido de 70 aminoácidos. Tanto o IGF-lEa como o IGF-lEb contêm o péptido maduro de 70 aminoácidos, mas diferem na sequência e comprimento das suas extensões do carboxilo terminal. As sequências de péptidos de IGF-lEa e IGF-lEb são representadas pelas SEQ ID NOS: 1 e 2, respetivamente. Os cADN genómicos funcionais de IGF-1 humano, bem como informação adicional relativamente ao gene de IGF-1 e dos seus produtos, estão disponíveis em Unigene Accession No. NM_00618. A proteína IGF-1 pode ter a sequência apresentada na SEQ ID NO: 3 ou as suas variantes alélicas. As variantes alélicas podem ser diferentes por um único ou um pequeno número de resíduos de aminoácidos, tipicamente menos do que 5, menos do que 4, menos do que 3 resíduos. A sequência da proteína IGF-1 pode ser modificada para conter o domínio de transdução de TAT (YGRKKRRQRRR) como mostrado na SEQ ID NO: 4 .

Embora as suas funções não sejam totalmente conhecidas, a calbindina D28K (também referida como calbindina D28) e a parvalbumina são proteínas de ligação ao cálcio que se teoriza estarem envolvidas no tamponamento de cálcio. Sem estar limitado pela teoria, existem evidências para sugerir que a homeostase do cálcio é alterada em indivíduos com esclerose lateral amiotrófica. Há evidências que sugerem que baixos niveis de calbindina-D28K e/ou parvalbumina podem aumentar a vulnerabilidade dos neurónios motores na ELA reduzindo a sua capacidade de lidar com um aumento da carga de cálcio. Esta redução pode levar à lesão celular e eventual morte dos neurónios motores. Outras evidências sugerem que os neurónios ricos em proteínas de ligação ao cálcio, tais como calbindina D28K e parvalbumina, são resistentes à degeneração. A HIF-1 é uma proteina heterodimérica composta por duas subunidades: (i) uma subunidade beta (β) expressa constitutivamente também conhecido como translocador nuclear de hidrocarboneto de arilo (ARNT) (que é partilhada por outros fatores de transcrição relacionados (p.e., recetor de hidrocarboneto de dioxina/arilo (DR/AhR)); e (ii) uma subunidade alfa (a) (ver, p.e., WO 96/39426, Pedido Internacional No. PCT/US96/10251 que descreve a recente purificação de afinidade e clonagem molecular de HIF -la) cuja acumulação é regulada por um mecanismo pós-translacional de modo que niveis elevados da subunidade alfa só podem ser detetados durante condições hipóxicas. Ambas as subunidades são membros da família de fatores de transcrição hélice-volta-hélice (bHLH)-PAS. Estes domínios regulam a ligação ao ADN e a dimerização. 0 domínio de transativação reside no C-terminal da proteína. A região basídica consiste em cerca de 15 aminoácidos predominantemente básicos responsáveis pela ligação direta ao ADN. Esta região está adjacente a duas hélices alfa anfipáticas, separadas por uma volta (loop) de comprimento variável, que faz a interface primária de dimerização entre membros da família (Moore, A.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 97:10436-41 (2000)). O domínio PAS, que é nomeado com base nas três primeiras proteinas em que foi identificado (Per, RNAT e Sim), engloba 200-300 aminoácidos contendo duas regiões vagamente conservadas, em grande parte hidrofóbicas, com cerca de 50 aminoácidos, designadas PAS A e PAS B. A subunidade HIF-Ια é instável durante condições normóxicas, a sobre-expressão desta subunidade em células cultivadas sob niveis normais de oxigénio é capaz de induzir a expressão de genes normalmente induzidos por hipoxia. Uma estratégia alternativa seria a modificação da subunidade HIF-Ια de tal maneira que já não fosse desestabilizada por condições de normóxia e, por conseguinte, fosse mais potente sob uma gama de condições de oxigénio. A substituição da região C terminal (ou transativação) da proteína do fator induzido por hipóxia por um domínio forte de transativação a partir de uma proteína ativadora da transcrição tal como, por exemplo, Vírus Herpes Simplex (HSV) VP 16, NFkB ou de fatores de transcrição de levedura como GAL4 e GCN4, destina-se a estabilizar a proteína sob condições de normóxia e fornecer uma ativação da transcrição forte e constitutiva. Para estabilizar a proteína do fator induzido por hipóxia em condições de normóxia de fornecer uma ativação da transcrição forte e constitutiva, uma proteína de fusão híbrida/quimérica que consiste nos domínios de ligação ao ADN e de dimerização de HIF-Ια e o domínio de transativação da proteína VP16 do vírus do herpes simplex (HSV) foi construída. A administração deste híbrido/quimera às células de um sujeito através de terapia génica induz a expressão de genes normalmente sobre-reguladas em resposta à hipoxia (por exemplo, VEGF, e outros semelhantes). Um híbrido estável de HIF-Ια constitutivo tem sido demonstrado ser eficaz no tratamento de pacientes isquémicos (Patentes dos E.U. Nos. 6, 432, 927 e 7,053, 062, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

Os membros da família de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) estão entre os mais potentes moduladores da biologia vascular. Eles regulam a vasculogénese, angiogénese, e manutenção vascular. 0 VEGF165 é um membro da família VEGF que pode ser usado na presente divulgação. A base molecular da atrofia muscular espinal (AMS), um distúrbio autossómico recessivo neuromuscular, é a perda homozigótica do gene da sobrevivência de neurónios motores 1 (SMN1). Uma cópia quase idêntica do gene SMN1, chamado SMN2, modula a severidade da doença. A diferença funcional entre ambos os genes é uma mutação translacional silenciosa que, no entanto, interrompe um elicitador de splicing exónico causando a falta do exão 7 na maioria dos transcritos de SMN2. Apenas 10% das transcrições SMN2 codificam uma proteína funcional de comprimento total idêntico ao SMN1. A proteína SMN desempenha um papel bem estabelecido na montagem do spliceossoma e pode também mediar o tráfego de mARN no axônio e nervo terminal dos neurónios. O CNTF (fator neurotrófico ciliar) é uma neurocitocina expressa por células gliais em nervos periféricos e no sistema nervoso central. O CNTF é geralmente reconhecido pela sua função no suporte e sobrevivência de tipos de células não-neuronais e neuronais. Ver, p.e., Vergara, C and Ramirez, B; Brain Res Brain Res. Rev. 2004; 47:161-73. 0 sonic hedgehog (Shh) controla processos de desenvolvimento importantes, incluindo a sobrevivência de células neuronais e gliais. A eritropoietina (EPO) é o principal regulador das células progenitoras eritroides. No entanto, é expresso de forma funcional no sistema nervoso e foi reportado ter um efeito neuroprotetor. Ver, p.e., Bartesaghi, S., 2005. Neurotoxicology, 26:923-8. A lisil-oxidase (LOX) oxida a cadeia lateral do peptidilo de lisina convertendo assim determinados resíduos de lisina em alfa-aminoadípico-delta-semialdeído. Esta é uma modificação pós-translacional que, por exemplo, permite a reticulação covalente das cadeias componentes de colagénio e elastina. Esta estabiliza os depósitos fibrosos destas proteínas na matriz extracelular. A LOX também pode oxidar a lisina dentro de uma variedade de proteínas catiónicas, o que sugere que as suas funções são mais amplas do que a estabilização ou do que a matriz extracelular. A LOX é sintetizada como uma pré-proteína; que emerge a partir da célula como proLOX e é processada proteoliticamente para formar a enzima ativa. Ver, p.e., Lucero, HA and Kagan, HM, Cell Mol. Life Sci. 2006; 63 (19-20):2304-16. A progranulina (PGRN) é uma proteína pleitrópica que tem despertado a atenção da comunidade neurocientífica com as recentes descobertas de mutações no gene que causam a degeneração do lobo frontotemporal. A PGRN no sistema nervoso central é expressa pela microglia e neurónios e desempenha um papel no desenvolvimento do cérebro. A PGRN também está envolvida em vários processos de "modelação do tecido", incluindo o desenvolvimento, reparação de feridas e tumorigénese. A PGRN é convertida em granulina (GRN) por enzimas de elastase. Enquanto a progranulina tem propriedades tróficas, as GRNs são mais parecidas com mediadores inflamatórios. Estudos de expressão do gene a partir de modelos animais de doença no SNC mostram um aumento diferencial na PRGN combinados com a ativação da microglia e inflamação. Isto sugere que o aumento da expressão da PGRN está intimamente relacionado com a ativação da microglia e a neuroinflamação. Além disso, a expressão da PGRN é aumentada em microglia ativada em muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença dos neurónios motores e doença de Alzheimer. Estudos têm identificado que mutações na PGRN são uma causa da doença neurodegenerativa e indicam a importância da função da PGRN para a sobrevivência neuronal. A prolactina e lactogénio placentário: os oligodendrócitos, células mielinizantes do sistema nervoso central, continuam a ser gerados por células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) durante a vida adulta (Gensert and Goldman, 1997; Levison et al., 1999; Menn et al., 2006; Peters and Sethares, 2004) e são necessários para a reparação intrínseca de danos da mielina no SNC adulto (Polito and Reynolds, 2005) . Os eventos fisiológicos que modulam a proliferação de OPCs e a geração de novos oligodendrócitos mielinizantes no SNC adulto são amplamente conhecidos.

Recentemente, foi relatado que os pacientes com esclerose múltipla, uma doença desmielinizante, têm uma taxa de recaída reduzida durante o terceiro trimestre da gravidez, sugerindo que as hormonas influenciam a geração de oligodendrócitos (Confavreux et al., 1998; Voskuhl, 2003). A remissão em pacientes com esclerose múltipla está correlacionada com uma diminuição no número e tamanho das lesões ativas da matéria branca (van Walderveen et al., 1994). Curiosamente, a gravidez em ratinhos resulta num aumento da geração de novos oligodendrócitos e do número de axónios mielinizados no SNC materno (Gregg et al., 2007). A prolactina, uma hormona que atinge o platô durante a fase final da gravidez, tem sido demonstrado que regula a proliferação de OPC durante a gravidez e promove a reparação da matéria branca nos ratinhos fêmeas virgens (Gregg et al., 2007). Há razões para acreditar que o lactogénio placentário humano (hPL), uma hormona que também atinge o pico durante o terceiro trimestre da gravidez (Selenkow et al., 1969), pode ter uma influência semelhante na geração de oligodendrócitos. 0 hPL tem uma série de atividades biológicas que são qualitativamente semelhantes à hormona do crescimento humana (hGH) e à prolactina (Lesniak et al., 1977) e parece ser um regulador principal da produção do IGF-1 (Handwerger et al., 1992; Zimkeller, 2000;. Handwerger et al., 2000). Tanto a hGH como o IGF-1 têm mostrado ser estimuladores da mielinização do SNC adulto (Carson et al., 1993; Peltwon et al., 1977). Portanto, o tratamento de doenças do SNC que envolvem a desmielinização tais como a esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral e lesão da medula espinal podem beneficiar de terapias baseadas em PRL ou hPL por injeção intraventricular de um vetor virai expressando rhPRL ou hPL. A grelina é uma hormona gástrica que foi reconhecida em 1999 como um mediador da libertação da hormona de crescimento. Ver p.e. Wu, JT et al., 2004; Ann. Surg. 239: 464 . A neuroserpina é um membro da família de inibidores da protease serpina. Em certas condições do sistema nervoso central, a neuroserpina pode desempenhar um papel neuroprotetor potencial através do bloqueio dos efeitos de tPA. Ver, p.e., Galliciotti, G and Sonderegger, P, 2006, Front Biosci 11: 33; Simonin, Y et al., 2006, J Neurosci; 26:10614; Miranda, E and Lomas, DA, 2006, Cell Mol Life Sci 63:709. A angiogenina é um membro da superfamilia das ARNses. É urn constituinte normal da circulação, mas também tem sido implicado como um fator de risco em desordens dos neurónios motores.

Sem se ser limitado pela teoria, o IGF-1 é uma proteina terapêutica para o tratamento da ELA, devido às suas muitas ações em diferentes niveis do neuroeixo (ver Dore et al., Trends Neurosci, 1997, 20:326-331). No cérebro: pensa-se que reduz tanto a apoptose neuronal como a glial, protege os neurónios contra a toxicidade induzida por ferro, colchicina, desestabilizadores de cálcio, peróxidos, e citocinas. Pensa-se também que modula a libertação de neurotransmissores acetilcolina e glutamato. Pensa-se também que induz a expressão do neurofilamento, tubulina, e a proteina básica da mielina. Na medula espinal: pensa-se que o IGF-1 modula a atividade de ChAT e atenua a perda do fenótipo colinérgico, melhora a expansão de neurónios motores, aumenta a mielinização, inibe a desmielinização, estimula a proliferação de neurónios motores e a diferenciação de células precursoras e promove a divisão, maturação e crescimento das células de Schwann. No músculo: pensa-se que IGF-1 induz a formação de agregados de recetores de acetilcolina na junção neuromuscular, e aumenta a função neuromuscular e a força muscular. 0 nivel de expressão do transgene em células eucarióticas é largamente determinado pelo promotor transcricional dentro da cassete de expressão do transgene. Os promotores que mostram atividade a longo prazo e são específicos para tecidos e ainda para células são utilizados em algumas formas de realização. Exemplos não limitativos de promotores incluem, mas não estão limitados a, o promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat Genet. 8:148-154), promotor CMV/globina^3 humana (Mandei et al. (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), promotor de GFAP (Xu et al. (2001). Gene Ther. 8:1323-1332), o promotor da enolase específica de neurónios de 1,8-kb (NSE) (Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194), promotor da beta actina de galinha (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277), o promotor da β-glucuronidase (GUSB) (Shipley et al. (1991)

Genetics 10:1009-1018), e promotores de ubiguitina tais como os isolados a partir de ubiquitina A humana, ubiquitina B humana, e ubiquitina C humana, tal como descrito na Patente US No 6,667,174. Para prolongar a expressão, outros elementos reguladores podem adicionalmente ser ligados operacionalmente ao transgene, tais como, p.e., o Elemento Pós-Regulador do vírus da hepatite da marmota (WPRE) (Donello et al. (1998) J. Virol. 72:5085-5092) ou o local de poliadenilação da hormona de crescimento bovino (BGH).

Para algumas aplicações de terapia génica do SNC, pode ser necessário controlar a atividade transcricional. Para este fim, a regulação farmacológica da expressão do gene com vetores virais pode ser obtida através da inclusão de diversos elementos reguladores e promotores responsivos a drogas como descrito, por exemplo, em Haberma et al. (1998) Gene Ther. 5:1604-16011; e Ye et al. (1995) Science 283:88-91.

Em certas formas de realização, a concentração ou título do vetor na composição é de pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1012 gp/mL) ; (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 109 tu/mL) ; ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1010 iu/mL) .

Num aspeto da divulgação, o transgene codifica uma molécula biologicamente ativa, a expressão da qual no SNC resulta, pelo menos na correção parcial da neuropatologia e/ou estabilização da progressão da doença. Em alguns casos, o produto do transgene terapêutico é uma proteína IGF-1 que alivia e/ou previne os sintomas da ELA. Ver Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph et al. (2005) Nat.

Med. 11(4):429-433. Noutros aspetos da divulgação, dois transgenes são codificados, por exemplo, IGF-1 e VEGF, a expressão dos quais resulta no SNC pelo menos na correção parcial da neuropatologia tal como o alivio e/ou prevenção e/ou estabilização e/ou atraso da progressão dos sintomas de ELA.

Num aspeto, durante a realização destes métodos, o transgene expressa uma quantidade terapêutica de fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbumina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, RCS-1, SMN- 2, CNTF (fator neurotrófico ciliar), sonic hedgehog (Shh), eritropoietina (EPO), lisil oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogenina, e lactogénio placentário.

Para a entrega da solução ou outra composição contendo o vetor viral especificamente a uma região particular do sistema nervoso central, tal como a um ventrículo particular, p.e., para os ventrículos laterais ou para o quarto ventrículo do cérebro, esta pode ser administrada por microinjeção estereotáxica. Por exemplo, no dia da cirurgia, os pacientes terão a base da moldura estereotáxica fixa no lugar (aparafusada no crânio). O cérebro será fotografado com a base da moldura estereotáxica (compatível com IRM com marcações fiduciárias) usando ressonância magnética de alta resolução. As imagens de ressonância magnética serão transferidas em seguida para um computador que executa o software estereotáxico. Uma série de imagens coronais, sagitais e axiais irão ser utilizadas para determinar o local alvo da injeção de vetor e a trajetória. 0 software traduz diretamente a trajetória em coordenadas tridimensionais adequadas para a moldura estereotáxica. Orificios de trepanação são perfurados acima do local de entrada e do aparelho estereotáxico localizado com a agulha implantada a uma dada profundidade. A solução do vetor num veiculo farmaceuticamente aceitável será em seguida injetada. Rotas adicionais de administração podem ser usadas, p.e., aplicação cortical superficial sob visão direta, ou outra aplicação não estereotáxica.

Um modo para entregar o vetor virai é a utilização de uma bomba. Tais bombas estão disponíveis comercialmente, por exemplo, a partir de Alzet (Cupertino, CA) ou Medtronic (Minneapolis, MN). A bomba pode ser implantável. Outra maneira conveniente de administrar o vetor consiste em utilizar uma cânula ou um cateter. A presente invenção proporciona métodos para modular, corrigir ou aumentar a função motora num sujeito que sofra de uma lesão neuronal motora. Com o propósito ilustrativo apenas, o sujeito pode sofrer de uma ou mais das seguintes condições esclerose lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular bulbo-espinal, atrofia muscular espinal, ataxia espinocerebral, esclerose lateral primária (ELP), ou lesão traumática da medula espinal.

Sem ser limitado pela teoria, a patologia associada com danos nos neurónios motores pode incluir degeneração neuronal motora, gliose, anormalidades no neurofilamento, perda de fibras mielinizadas nos tratos corticoespinais e nas raizes ventrais. Dois tipos de inicio são reconhecidos: o início bulbar, que afeta os neurónios motores do tronco cerebral, (afeta os músculos faciais, fala e deglutição); e início no membro, que afeta os neurónios motores da medula espinal, reflete-se pela espasticidade, fraqueza generalizada, atrofia muscular, paralisia, e insuficiência respiratória. Na ELA, os sujeitos têm ambos inicio bulbar e inicio no membro. Na ELP, os indivíduos têm inicio bulbar. A capacidade de organizar e executar atos motores complexos depende de sinais provenientes das áreas motoras no córtex cerebral, i.e., o córtex motor. Os comandos motores corticais descem em dois tratos. As fibras corticobulares controlam os núcleos motores do tronco cerebral que movem os músculos faciais e as fibras corticoespinais que controlam os neurónios motores da coluna vertebral que inervam os músculos do tronco e membros. 0 córtex cerebral também influencia indiretamente a atividade motora espinal, agindo sobre as vias descendentes do tronco cerebral. 0 córtex motor primário encontra-se ao longo do giro pré-central na área de Broadmann (4). Os axónios dos neurónios corticais que projetam para a medula espinal passam juntos no trato corticoespinal, um feixe maciço de fibras contendo cerca de 1 milhão de axónios. Cerca de um terço delas originam do giro pré-central do lobo frontal. Outro terço tem origem a partir da área 6. 0 restante é originário das áreas 3, 2 e 1 no córtex sensorial somático e regulam a transmissão do input aferente através do corno dorsal.

As fibras corticoespinais passam em conjunto com as fibras corticobulbares através da parte posterior da cápsula interna para alcançar a porção ventral do mesencéfalo. Estas separam-se na ponte em pequenos feixes de fibras que rumam entre os núcleos pontinos. Estas reagrupam-se na medula para formar a pirâmide medular. Cerca de três quartos das fibras corticoespinais cruzam a linha média na decussação piramidal na junção entre a medula e a medula espinal. As fibras cruzadas descem na parte dorsal das colunas laterais (coluna dorsolateral) da medula espinal, formando o trato corticoespinal lateral. As fibras não cruzadas descem nas colunas ventrais tal como o trato corticoespinal ventral.

As divisões laterais e ventrais do trato corticoespinal terminam sobre as mesmas regiões de matéria cinzenta espinal como os sistemas lateral e medial do tronco cerebral. 0 trato corticoespinal lateral projeta-se em primeiro lugar para núcleos motores na parte lateral do corno anterior e para interneurónios na zona intermediária. 0 trato corticoespinal ventral projeta-se bilateralmente para a coluna de células ventromedial e para as porções adjacentes da zona intermédia que contêm os neurónios motores que inervam os músculos axiais.

Se desejado, a estrutura do cérebro humano pode ser correlacionada com estruturas semelhantes no cérebro de outro mamífero. Por exemplo, a maioria dos mamíferos, incluindo humanos e roedores, mostram uma organização topográfica semelhante das projeções entorrinal-hipocampo, com os neurónios na parte lateral de ambos os córtex entorrinal lateral e medial que se projetam para a parte dorsal ou polo septal do hipocampo, enquanto a projeção para o hipocampo ventral tem origem principalmente em neurónios nas partes mediais do córtex entorrinal (Principles of Neural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-Hill, 1991; The Rat Nervous System, 2nd ed, ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Além disso, as células da camada II do córtex entorrinal projetam para o giro denteado, e terminam nos dois terços exteriores da camada molecular do giro denteado. Os axónios de células da camada III projetam bilateralmente para as áreas corno de Ammon (cornu Ammonis) CAI e CA3 do hipocampo, terminando na camada molecular do estrato lacunoso.

Num aspeto, os métodos divulgados incluem a administração ao SNC de um sujeito afetado um vetor virai neurotrófico carregando um transgene que codifica um produto terapêutico e permitindo que o transgene seja expresso no SNC perto do local de administração a um nivel suficiente para exercer um efeito terapêutico dado que a proteína expressa é transportada por meio do LCE ao longo do SNC. Além disso, o vetor pode compreender um polinucleótido que codifica para uma molécula biologicamente ativa eficaz para o tratamento do distúrbio do SNC. Tais moléculas biologicamente ativas podem compreender péptidos incluindo mas não se limitando a versões nativas ou mutadas de proteínas de comprimento total, versões nativas ou mutadas de fragmentos de proteínas, polipéptidos sintéticos.

Numa forma de realização ilustrativa, a administração é realizada por injeção direta de uma solução de vetor de título elevado num ou mais dos espaços ventriculares do cérebro, tais como o ventrículo lateral de um sujeito ou paciente. Por exemplo, a administração é por injeção de bolus direta em um ou mais ventrículos do cérebro tais como os ventrículos laterais e o quarto ventrículo.

Em alguns casos, os métodos compreendem a administração de um vetor neurotrófico de título elevado transportando um transgene terapêutico de modo que o produto do transgene é expresso a um nível terapêutico num primeiro local dentro do SNC distai para o local final da ação do produto expresso. Em algumas formas de realização, o título virai da composição é de pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1012 gp/ml) ; (b) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 109 tu/ml) ; ou (c) 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x 1010 Ul/ml) .

Em ratinhos experimentais, o volume total de solução de AAV injetada é por exemplo, entre 1 a 20 pL. Para outros mamíferos, incluindo o cérebro humano, volumes e taxas de entrega são apropriadamente dimensionadas. Por exemplo, tem sido demonstrado que volumes de 150 mL podem ser injetadas de forma segura no cérebro de primatas (Janson et al. (2002) Hum. Gene Ther. 13:1391-1412). O tratamento pode consistir de uma única injeção por local alvo, ou podem ser repetidas em um ou mais ventrículos. Os ventrículos adequados incluem os ventrículos laterais, terceiro ventrículo, e o quarto ventrículo. Múltiplos locais de injeção podem ser utilizados. Por exemplo, em algumas formas de realização, em adição ao primeiro local de administração, uma composição contendo um vetor virai carregando um transgene é administrada a um outro local que pode ser contralateral ou ipsilateral ao local da primeira administração. As injeções podem ser únicas ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.

Preparações de AAV de título elevado podem ser produzidas usando técnicas conhecidas na técnica, p.e., como descrito na Patente dos Estados Unidos No. 5,658,776 e Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003.

Os exemplos seguintes ilustram a presente divulgação. Um vulgar perito na técnica vai reconhecer as numerosas modificações e variações que podem ser realizadas sem alterar o espírito ou âmbito da presente divulgação. Os exemplos não limitam de forma alguma a invenção.

Titulação de Vetores Recombinantes

Os títulos de vetores AAV são medidos de acordo com o número de cópias do genoma (partículas genómicas por mililitro). Concentrações de partículas de genoma são baseados em PCR Taqman® do ADN do vetor conforme descrito anteriormente (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et aL (2002) Mol. Ther., 6:272-278).

Os vetores que transportam um gene marcador detetável tal como a β-galactosidase (LacZ) ou o gene da proteína fluorescente verde (GFP) podem ser titulados utilizando um ensaio de infectividade. As células suscetíveis (por exemplo, células HeLa, ou COS) são transduzidas com o AAV e realiza-se um teste para determinar a expressão do gene, tais como a coloração de células transduzidas por vetores β-galactosidase com X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactopiranósido) ou microscopia de fluorescência para as células transduzidas com GFP. Por exemplo, o ensaio é realizado como se segue: 4 χ 104 células HeLa foram semeadas em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços utilizando meio de cultura normal. Depois da adesão, i.e., cerca de 24 horas mais tarde, as células são infetadas com Ad tipo 5 numa multiplicidade de infeção (MOI) de 10 e transduzidas com diluições em serie do vetor empacotado e incubados a 37°C. Um a três dias mais tarde, antes de serem observados efeitos citopáticos extensos, é realizado o ensaio apropriado nas células (por exemplo, coloração com X-gal, ou microscopia de fluorescência). Se um gene repórter tal como β-galactosidase for usado, as células são fixadas em paraformaldeído a 2%, glutaraldeído a 0,5% e coradas para a atividade de β-galactosidase usando X-gal. As diluições de vetor que dão células bem separados são contadas. Cada célula positiva representa uma unidade de transdução (tu) do vetor.

Modelo Terapeuticamente Relevante de Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA). A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal que se caracteriza por uma perda seletiva dos neurónios motores no córtex, tronco cerebral e medula espinal. A progressão da doença pode levar à atrofia do membro, axial e dos músculos respiratórios. A morte celular dos neurónios motores é acompanhada por gliose reativa, anormalidades no neurofilamento, e uma perda significativa de grandes fibras mielinizadas nos tratos corticoespinais e raizes ventrais1-6. Embora a etiologia da ELA seja mal compreendida, as evidências acumuladas indicam que a ELA esporádica (ELAE) e familiar (ELAF) compartilham muitas caracteristicas patológicas similares; assim, proporcionando uma esperança de que o estudo de qualquer forma irá levar a um tratamento comum7. A ELAF é responsável por aproximadamente 10% dos casos diagnosticados, dos quais 20% são associados a mutações hereditárias predominantemente nas superóxido dismutase de Cu/Zn (SOD1)8. Ratinhos transgénicos que expressam a proteína SOD1 humana mutante (p.e., ratinhos S0D1G93A) recapitulam muitas caracteristicas patológicas de ELA e são um modelo animal disponível para o estudo de ELA9. Para a ELAS, uma miríade de mecanismos patológicos têm sido implicados como causa básica, incluindo excitotoxicidade induzida por glutamato, exposição a uma toxina, disfunção do proteassoma, danos mitocondriais, desorganização do neurof ilamento e perda do suporte neurotróf ico10,11.

Até à data não existe uma terapia eficaz para o tratamento da ELA. Os fatores neurotróf icos, tais como o fator de crescimento semelhante a insulina I (IGF-1), têm sido investigados extensivamente pela sua potencial utilidade no tratamento da ELA. A entrega intracraniana de vetores virais para as regiões do SNC que estão interligados com o tronco cerebral e neurónios espinais motores através do LCR proporciona um meio de administração de agentes terapêuticos potenciais, tais como IGF-1, a áreas que, de outra forma seriam dificeis de atingir através de meios técnicos anteriores.

Sem se ser limitado pela teoria, o IGF-1 é uma proteina terapêutica para o tratamento da ELA, devido às suas muitas ações em diferentes niveis do neuroeixo (ver Dore et al., Trends Neurosci, 1997, 20:326-331). No cérebro: Pensa-se que reduz tanto a apoptose neuronal como a glial, protege os neurónios contra a toxicidade induzida por ferro, colchicina, desestabilizadores de cálcio, peróxidos, e citocinas. Pensa-se também que modula a libertação dos neurotransmissores acetilcolina e glutamato. Pensa-se também que induz a expressão do neurofilamento, tubulina, e a proteina básica da mielina. Na medula espinal: pensa-se que IGF-1 modula a atividade de ChAT e atenua a perda do fenótipo colinérgico, melhora a expansão dos neurónios motores, aumenta a mielinização, inibe a desmielinização, estimula a proliferação dos neurónios motores e a diferenciação de células precursoras, e promove a divisão, maturação e crescimento das células de Schwann. No músculo: pensa-se que IGF-1 induz a formação de agregados de recetores de acetilcolina na junção neuromuscular, e aumenta a função neuromuscular e a força muscular. Nas experiências seguintes, utilizou-se a forma IGF-lEa da proteina.

Exemplo 1: entrega intracerebroventricular de AAV4-IGF-1

Realizamos experiencias para determinar se a entrega intraventricular de AAV4-IGF-1 leva a (1) uma extensão significativa de tempo de vida; (2) melhora o desempenho em tarefas de rotarod e força de preensão; e (3) reduz a neuropatologia (i.e., redução na gliose e melhoria da sobrevivência dos neurónios motores) no tronco cerebral e na medula espinal.

Os ratinhos S0D1 sintomáticos (i.e., com 90 dias de idade) foram tratados com AAV4-IGF-1 ou com o vetor de controlo AAV4-Bgal (Bgal também é referido como Lac Z) . Para cada ratinho, foram injetados vetores tanto nos ventrículos lateral (AP: -0.3 do bregma, ML: -1.0 do bregma, DV: - 2.0 da dura, barra de incisão 0.0) como no quarto ventrículo (AP: -5,90 do bregma ML: 0.0 do bregma, DV: -2.9 da dura, barra de incisão: 0.0), utilizando uma moldura estereotáxica. Os vetores foram entregues com uma seringa Hamilton de 10 pL a uma taxa de 0,5 mL/minuto para um total de 1,80 x 1010 cópias do genoma por ventrículo. O volume de injeção final de cada vetor foi de 10 pL/ventrículo. Com a idade de 110 dias ou na fase final, 4 ratinhos de cada grupo de tratamento foram sacrificados para análise histológica (i.e., coloração GFAP (proteína glial fibrilar ácida) e contagens de NM no tronco cerebral e da medula espinal). Os endpoints que foram avaliados incluem a análise de sobrevivência, rotarod, testes de força de preensão dos membros posteriores e dos membros anteriores e massa corporal. O teste da função motora usando um dispositivo rotarod e medidor de força de preensão (Columbus Instruments, Columbus, OH) pode começar aos 7 0 dias de idade. Cada sessão semanal pode consistir em três ensaios sobre o rotarod de aceleração elevada começando a 5 rpm/min. O tempo que cada ratinho permanece na haste pode ser registrado automaticamente. O teste do medidor de força de preensão pode ser efetuado permitindo que os animais se agarrem a uma plataforma puxando de seguida o animal até que ele liberte a plataforma: a medição da força é registada em quatro ensaios separados. O aparecimento de fraqueza relacionada com a doença é definido quando um membro posterior exiba fraqueza muscular e pelo arrastamento do membro no rotarod, tal como avaliado por dois observadores independentes. Para a determinação da mortalidade de uma forma fiável e humana, utiliza-se um endpoint artificial definido pela incapacidade dos ratinhos de endireitarem-se 30 sequndos após terem sido colocados sobre os seus lados. A entrega intracerebroventricular de AAV4-IGF-1 resultou num aumento significativo do período de vida em ratinhos S0D1 em comparação com os ratinhos que receberam AAV4-Bgal como vetor de controlo. Os ratinhos que receberam AAV4-IGF1 tiveram um tempo de sobrevivência médio de 141,5 dias, em comparação com um tempo de sobrevivência médio de 121 dias em ratinhos tratados com AAV4-Bgal (Figura 1). Os ratinhos S0D1 tratados com AAV4-IGF-1 tinham melhorado os resultados funcionais, tal como medido pelos testes rotarod, a força de preensão dos membros anteriores e força de preensão dos membros posteriores em relação aos ratinhos tratados com o controlo. Os resultados são mostrados nas Figuras 1-5. A avaliação histológica de GFAP, que é um marcador de gliose e uma característica patológica de ELA, demonstrou que a astrogliose foi significativamente reduzida em ratinhos tratados com AAV4-IGF1, em comparação com ratinhos de controlo tratados com AAV4-Bgal. Esta redução foi observada em ambas as regiões do tronco cerebral do SNC (p.e., núcleo trigeminal, núcleo facial, núcleo do nervo hipoglosso; Figura 6) e a medula espinal ventral (p.e., cervical, torácica, lombar, sacral; Figura 7). A avaliação histológica dos níveis de nitrotirosina, que é um marcador de peroxinitrito e um marcador patológico associado com ELA, demonstrou que os níveis de nitrotirosina foram significativamente reduzidos em ratinhos tratados com AAV4-IGF1, em comparação com ratinhos de controlo tratados com AAV4-Bgal. Essa redução foi observada nos niveis de nitrotirosina ao longo da medula espinal, por exemplo, cervical, torácica, lombar, e sacral (Figura 8) .

Exemplo 2: entrega intracerebroventricular de AAV4-IGF-1 e AAV4-GFP

Os ratinhos SOD1 sintomáticos (i.e., 88-90 dias de idade) foram tratados quer com AAV4-IGF-1 ou AAV4-GFP por meio de injeção intracerebroventricular do vetor tanto no ventrículo lateral como no quarto. Os ratinhos receberam uma dose de 2 elO gc/ventrículo. A proteína fluorescente verde foi utilizada como proteína de controlo, o que permitiu a visualização de expressão mediada pela injeção dos vetores de AAV.

Os endpoints avaliados incluíram a sobrevivência, o teste rotarod, a força de preensão (membro posterior e membro anterior), a contagem de células de neurónios motores, a distribuição da proteína GFP, os níveis de proteína glial fibrilar acídica (GFAP), os níveis de nitrotirosina, e RT-PCR para medir a distribuição virai dentro do SNC. Com a idade de 110 dias ou na fase final, os ratinhos de cada grupo de tratamento foram sacrificados para análise adicional. Os níveis da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) foram avaliados histologicamente. A GFAP é um marcador de gliose, que é uma característica patológica da ELA. Os níveis nitrotirosina foram avaliadas histologicamente; a nitrotirosina é um marcador de peroxinitrito. A entrega intracerebroventricular de AAV4-IGF-1 resultou num aumento significativo do período de vida em ratinhos S0D1 em comparação com os ratinhos que receberam AAV4-GFP como um vetor de controlo. Os ratinhos S0D1 tratados com AAV4-IGF-1 tinham melhorado os resultados funcionais, tal como medido por testes rotarod, pela força de preensão dos membros anteriores e pela força de preensão dos membros posteriores em relação aos ratinhos tratados com controlo. A visualização da expressão da proteína fluorescente verde (GFP) em ratinhos que tinham sido tratados com AAV4-GFP indicou que a GFP foi distribuída por toda a camada de células ependimárias do sistema ventricular. Por exemplo, a GFP foi visualizada nos ventrículos laterais anteriores, nos ventrículos laterais, no terceiro ventrículo, e no quarto ventrículo (Figura 9). A GFP foi visualizado também no plexo coroide do sistema ventricular e na camada de células ependimárias do canal central da medula espinal (incluindo as regiões cervical, torácica e lombar) (Figura 10) . RT-PCR para o vetor AAV4-IGF-1 demonstrou que o vetor estava presente no córtex, tronco cerebral e na medula espinal após a entrega intraventricular (Figura 11A).

Exemplo 3: entrega intracerebroventricular de AAV4-VEGF e AAV4-GFP

Os ratinhos SOD1 sintomáticos (i.e., 88-90 dias de idade) foram tratados quer com AAV4-VEGF-165 ou AAV4-GFP por meio de injeção intracerebroventricular do vetor tanto no ventrículo lateral como no quarto. Os ratinhos receberam uma dose de 2 elO gc/ventrículo. A proteína fluorescente verde foi utilizada como proteína de controlo, o que permitiu a visualização de expressão mediada pela injeção dos vetores de AAV.

Os endpoints avaliados incluíram sobrevivência, o teste rotarod, a força de preensão (membro posterior e membro anterior), e RT-PCR para medir a distribuição virai dentro do SNC. A entrega intracerebroventricular de AAV4-VEGF resultou num prolongamento significativo do tempo de vida em ratinhos S0D1 em comparação com os ratinhos que receberam AAV4-GFP como um vetor de controlo. 0 tempo de sobrevivência mediano de ratinhos que receberam AAV4-VEGF foi de 140 dias, enquanto que o tempo médio de sobrevivência para ratinhos que receberam AAV4-GFP foi de 120 dias (Figura 12).

Os ratinhos tratados com SOD1 AAV4-VEGF tinham melhorado os resultados funcionais, tal como medido pelo teste de rotarod (Figura 13), força de preensão do membro anterior e força de preensão do membro posterior (Figura 13) em comparação com ratinhos tratados com o controlo. A entrega intraventricular de AAV4-VEGF não influenciou a massa corporal em ratinhos SOD1. RT-PCR para o vetor AAV4-IGF-1 demonstrou que o vetor estava presente no córtex, tronco cerebral e na medula espinal após a entrega intraventricular (Figura 11B). A especificação é entendida mais completamente à luz dos ensinamentos das referências citadas na especificação. As formas de realização dentro da especificação fornecem uma ilustração das concretizações do invento e não devem ser interpretados como limitantes do âmbito da invenção. O perito na técnica reconhece facilmente que muitas outras concretizações são abrangidas pelo invento.

Salvo indicação em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tratamento, e assim por diante utilizados na especificação são para ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que indicado de outra forma em contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas que se procuraram obter. A menos que indicado de outra forma, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser entendido que se refere a todos os elementos na série. Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às concretizações especificas da invenção aqui descrita.

Tabela 1: Pares de genes potenciais para uso num vetor virai recombinante

Tabela 2: Pares de genes potenciais para uso num vetor virai recombinante

Tabela 3: Pares de genes potenciais para uso num vetor virai recombinante

REFERÊNCIAS 1. Leigh, P.N. & Swash, M. Cytoskeletal pathology in motor neuron diseases. Adv Neurol 56, 115-24 (1991). 2. Carpenter, S. Proximal axonal enlargement in motor neuron disease Neurology 18 841-51 (1968). 3. Gonatas, N.K. et al. Fragmentation of the Golgi apparatus of motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis. Am JPathol 140, 731-7 (1992). 4. Hirano, A. et al. Fine structural study of neurofibrillary changes in a family with amyotrophic lateral sclerosis. JNeuropathol Exp Neurol 43, 471-80 (1984). 5. Leigh, P.N. et al. Ubiquitin-immunoreactive intraneuronal inclusions in amyotrophic lateral sclerosis. Morphology, distribution, and specificity. Brain 114 (Pt 2), 775-88 (1991). 6. Delisle, M.B. & Carpenter, S. Neurofibrillary axonal swellings and amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci 63, 241-50 (1984). 7. Hirano, A. Neuropathology of ALS: an overview. Neurology 47, S63-6 (1996). 8. Rosen, D.R. et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature 362, 59-62 (1993). 9. Gurney, M.E. et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science 264, 1772-5 (1994). 10. Rowland, L.P. & Shneider, N.A. Amyotrophic lateral sclerosis. N Engl J Med 344, 1688-700 (2001). 11. Bruijn, L.L, Miller, T.M. & Cleveland, D.W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci 27, 723-49 (2004). 12. Cleveland, D.W. & Rothstein, J.D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci 2, 806-19 (2001). 13. Lindsay, R.M. Neurotrophic growth fators and neurodegenerative diseases: therapeutic potential of the neurotrophins and ciliary neurotrophic fator. Neurobiol Aging 15, 249-51 (1994). 14. Kaspar, B.K., Liado, J., Sherkat, N., Rothstein, J.D. & Gage, F.H. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science 301, 839-42 (2003). 15. Clement, A.M. et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science 302, 113-7 (2003). 16. Matsushita, M. Projections from the lowest lumbar and sacral-caudal segments to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 404, 21-32 (1999). 17. Matsushita, M. & Gao, X. Projections from the thoracic cord to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 386, 409-21 (1997). 18. Matsushita, M. & Xiong, G. Projections from the cervical enlargement to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 377, 251-61 (1997). 19. Matsushita, M. & Yaginuma, H. Afferents to the cerebellar nuclei from the cervical enlargement in the rat, as demonstrated with the Phaseolus vulgaris leucoagglutinin method. Neurosci Lett 113, 253-9 (1990). 20. Matsushita, M. & Yaginuma, H. Projections from the central cervical nucleus to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 353, 234-46 (1995). 21. Voogd, J. The cerebellar nuclei and their efferent pathways, in The rat nervous system (ed. Paxinos, G.) 208-215 (Elsevier Academic Press, San Diego, 2004). 22. Dodge, J.C. et al. Gene transfer of human acid sphingomyelinase corrects neuropathology and motor deficits in a mouse model of Niemann-Pick type A disease. Proc Natl Acad Sci USA 102, 17822-7 (2005). 23. Corse, A.M. et al. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic fators in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis 6, 335-46 (1999). 24. Seeburger, J.L. & Springer, J.E. Experimental rationale for the therapeutic use of neurotrophins in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol 124, 64-72 (1993). 25. Kasarskis, E.J. et al. A controlled trial of recombinant methionyl human BDNF in ALS: The BDNF Study Group (Phase III). Neurology 52, 1427-33 (1999). 26. Miller, R.G. et al. A placebo-controlled trial of recombinant human ciliary neurotrophic (rhCNTF) fator in amyotrophic lateral sclerosis. rhCNTF ALS Study Group. Ann Neurol 39, 256-60 (1996). 27. Borasio, G.D. et al. A placebo-controlled trial of insulin-like growth fator-I in amyotrophic lateral sclerosis. European ALS/IGF-I Study Group. Neurology 51, 583-6 (1998). 28. Lai, E.C. et al. Effect of recombinant human insulinlike growth fator-I on progression of ALS. A placebo-controlled study. The North America ALS/IGF-I Study Group. Neurology 49, 1621-30 (1997). 29. Gorio, A., Lesma, E., Madaschi, L. & Di Giulio, A.M.

Co-administration of IGF-I and glycosaminoglycans greatly delays motor neurone disease and affects IGF-I expression in the wobbler mouse: a long-term study. J Neurochem 81, 194-202 (2002) . 30. Hantai, D. et al. Beneficial effects of insulin-like growth fator-I on wobbler mouse motoneuron disease. J Neurol Sci 129 Suppl, 122-6 (1995). 31. Zheng, C., Nennesmo, I., Fadeel, B. & Henter, J.I. Vascular endothelial growth fator prolongs survival in a transgenic mouse model of ALS. Ann Neurol 56, 564-7 (2004). 32. Nagano, I. et al. Therapeutic benefit of intrathecal injection of insulin-like growth fator-1 in a mouse model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurol Sci 235, 61-8 (2005). 33. Azzouz, M. et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivetor prolongs survival in a mouse ALS model. Nature 429, 413-7 (2004). 34. Federici, T. & Boulis, N.M. Gene-based treatment of motor neuron diseases. Muscle Nerve 33, 302-23 (2006). 35. Boillee, S. & Cleveland, D.W. Gene therapy for ALS delivers. Trends Neurosci 27, 235-8 (2004). 36. Chirmule, N. et al. Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humans. Gene Ther 6, 1574-83 (1999). 37. High, K.A. Clinical gene transfer studies for hemophilia B. Semin Thromb Hemost 30, 257-67 (2004). 38. Maheshri, N., Koerber, J.T., Kaspar, B.K. & Schaffer, D.V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat Biotechnol 24, 198-204 (2006) . 39. Braunstein GD, Rasor JL, Engvall E, Wade ME. Interrelationships of human chorionic gonadotropin, human placental lactogen, and pregnancy-specific beta 1-glycoprotein throughout normal human gestation. Am J Obstet Gynecol. 1980 Dec 15,-138(8): 1205-13. 40. Confavreux C, Hutchinson M, Hours MM, Cortinovis-Tourniaire P, Moreau T. Rate of pregnancy-related relapse in multiple sclerosis. Pregnancy in Multiple Sclerosis Group. N Engl J Med. 1998 Jul 30,-339(5):285-91 . 41. Carson M. J., Behringer R. R., Brinster R. L. and McMorris F. A. (1993) Insulin-like growth fator I increases brain growth and central nervous system myelination in transgenic mice. Neuron 10, 729-740. 42. Gensert JM, Goldman JE (1997) Endogenous progenitors remyelinate demyelinated axons in the adult CNS. Neuron 19:197-203. 43. Gregg C, Shikar V, Larsen P, Mak G, Chojnacki A, Yong VW, Weiss S. White matter plasticity and enhanced remyelination in the maternal CNS. J Neurosci. 2007 Feb 21,-27 (8) :1812-23. 44. Handwerger S, Freemark M. The roles of placental growth hormone and placental lactogen in the regulation of human fetal growth and development. J Pediatr Endocrinol Metab. 2000 Apr;13(4):343-56. 45. Lesniak MA, Gorden P, Roth J. Reactivity of non-primate growth hormones and prolactins with human growth hormone recetors on cultured human lymphocytes. Clin Endocrinol Metab. 1977 May;44(5):838-49. 46. Levison SW, Young GM, Goldman JE (1999) Cycling cells in the adult rat neocortex preferentially generate oligodendroglia. J Neurosci Res 57:435- 446. 47. Menn B, Garcia-Verdugo JM, Yaschine C, Gonzalez-Perez 0, Rowitch D, Alvarez-Buylla A (2006) Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci 26:7907-7918. 48. Pelton EW, Grindeland RE, Young E, Bass NH. Effects of immunologically induced growth hormone deficiency on myelinogenesis in developing rat cerebrum. Neurology. 1977 Mar;27(3):282-8. 49. Peters A, Sethares C (2004) Oligodendrocytes, their progenitors and other neuroglial cells in the aging primate cerebral cortex. Cereb Cortex 14:995-1007. 50. Polito A, Reynolds R (2005) NG2-expressing cells as oligodendrocyte progenitors in the normal and demyelinated adult central nervous system. J Anat 207:707-716. 51. Selenkow HA, Saxena BN, Dana CL. Measurement and pathophysiologic significance of human placental lactogen. In Pecile A, Finzi C (eds). The Feto-Placental Unit. Amersterdam, Excerpta Medica, 1969, p340. 52. van Walderveen MA, Tas MW, Barkhof F, Polman CH, Freguin ST, Hommes OR, Valk J (1994) Magnetic resonance evaluation of disease activity during pregnancy in multiple sclerosis. Neurology 44:327-329. 53. Voskuhl RR (2003) Hormone-based therapies in MS. Int MS J 10:60-66. 54. Zumkeller W. Current topic: the role of growth hormone and insulin-like growth fators for placental growth and development. Placenta. 2000 Jul-Aug;21(5-6):451-67.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Dodge, James

<120> A TERAPIA GENÉTICA PARA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA E OUTROS DISTÚRBIOS DA MEDULA ESPINAL <130> 003482.00033 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 < 211> 153

< 212> PRT < 213> Homo sapiens <400> 1

Nesfe 63.y Lys lie Set Ser Leo Fro Thr Gin Lav Phe Lys Cys Cys phe

I...... ..... S 10! IS

Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Set His Le« m 25 30·

Phe Tyr he« Ala Leu Cys Leu Leu Tht Phe Thr Ser Set Ale Thr Ala " ..3¾ - ' :M 45

Sly Fr» Glu Thr Leu Cys Sly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gin Phe SO SS SO '

Vai Cys Sly Asp Arc? Sly Phe Tyr Phe Asn Lys Fro Thr Gly Tyr Sly 65 7 0 76 60

Ser Ser Ser ftsg Arp Ale Fro Sin Thr Sly lie val Asp 01u Cys Cys 35! 3Ώ 95

Phe Arg Set Cys Asp Leu Atg Atg Leu Gin Met Tyr Cys Ala Fro Lau ISO 105 116

Lye Pro Ala Lye Ser Ala Arg Ser Val Arg, Ala Gin Arc? His Thr Asp 116 im 123

Met Fro Lye Tht Gin Lye Glu -Val Mia Leu Lys Aan Ala Set Arg Sly

130 135! 14Q

Sar Ala Sly Ass Lys Asn Tyr Arg Met

Li S ' '' 15 0 <210> 2 < 211> 195

< 212> PRT < 213> Homo sapiens <400> 2

Matt <51y Lys lit Sei Sss Leu Pro Thx Gin Leu Phe Lye Cy# -Gy* Phe ;3i * 5 ::10: 15

Cys Asp Fhe hen Lys vbI Lys mt. m&amp; Thr «et Ser Ser Ser His %eu 20 :

PHe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr· Phe Thr Ser- Ser Ma Thr Ala 35 40. «S

Giy Fre 51 u Thr Lsu Cys Gly &amp;i« 51¾ Leu Vai Asp Ala Leu Gin Ffce SÔ:-i SS 60 Vâl Cys Gly Asp Ârg Gly PH* Tyr Pha Asn Lys Pr* Thr Gly Tyr Gly

63 70 75 SO

Ssr Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gin Thr Gly lie Vai Asp Giu Cys Cys 85 00 95

Phe Axg Ser Cy» Asp Leu Arg &amp;rg Leu Gl» «et Tyr Cye Ale Pro Leu ICO 105 110

Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Vai Arg Ala Gin Arg 8iss Thr Asp 115 ISO 125

Met Pro Lye Thr Gin Lys Tyr Sin Pro. Pro Ser Thr Asm Lys Aso Thr 130 135 140

Lys Ser Gin Arg Aro Lys Gly Trp ?ni Lys Thr His Pro Gly Gly Glu: 145 150 155 160

Gin Lys Glu Giy Thr Glu Ala Ser Leu Gin lie Arg Gly Lys Ly® Lys 185 170 .:17&amp;

Glu Gin Arg Arg Glu 11® Gly Ssr Ary As* Ala Glu Cys Arg Gly Lys 18C 18 S 190

Lys Gly Lys 105

Sequência génica para IGF-1: tcaccgtcac cgecaaatte agagcagatt agagecfcgtg csatggaats aagfccetc&amp;a asttgesatg tgacsttget ctcasoatct ccoatctetc tggartfccct tttgottcat isffcecfcgct aecoastfcca tttfeeegsot tfcgtactfceaa ga&amp;gc&amp;atgg gaa&amp;a&amp;tcag ragtcttcca aeccsafctat t r.a&amp;gtgctg cfct ttgtyat. ttcttgaagg fcgsagatgca caecatgtoe hccfccgcatc tefctetseet ggegctgcgc otgctcacct tcgccagetc tgccacgget ggaeeggaga egefcetgcgg ggrtgaget-g gtggargefce eteagtregr gtgtggagac aggggctttt attfecaaeaa gcccacaggg tatggeteca gcagtcggag ggegeetcag acaggeatcg tggatgagtg ctgetteegg agctgtgatc taaggagget ggagstgtst tgcgcaccee tcaagcotge esagteaget cgctctgtcc gtgece&amp;gcg ccacaccgac atgcccaaga cccagaagga agtacatttg aagaacgcaa gc&amp;gagggsg tgeaggaaac aagaactaca ggatgtagga agacectccr g&amp;ggsgfcg&amp;s gagtgacatg ocsoege&amp;gg afecetttget cogo&amp;cgagt caootgt taa aetteggaac aoctaccsaa aaafcaagfcfct gst&amp;aeafefct aasagstggg cgtttcccec aatgaaaisc scaegtaaac attceasear rgtctttagg agfcgat.tt.13r accfctgcaaa aatggfccctg gagfctggtsg attgctgttg atcttfctatc aafcaafcgttc tatagaaaag asaaeaaaat.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Um vetor virai recombinante neurotrófico compreendendo um transgene, para utilização num método de entrega do produto do transgene na medula espinal de um sujeito, em que o método compreende a administração do vetor virai em, pelo menos, um ventrículo do cérebro, por meio do qual o referido transgene é expresso e o produto do transgene expresso é entregue na medula espinal, em que o vetor virai é um virus adeno-associado (AAV) e em que o transgene é SMN-1.

2. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o método compreende a administração do vetor virai por injeção direta num ventrículo do cérebro.

3. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o método compreende a administração do vetor virai por injeção direta no ventrículo lateral do cérebro.

4. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o método compreende a administração do vetor virai por injeção direta no quarto ventrículo do cérebro.

5. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o transgene expressa uma proteína adicional selecionada de entre o grupo que consiste em fator de crescimento semelhante a insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbumina, HIF1-alfa, 2-SIRT, VEGF, RCS-2, CNTF (fator neurotrófico ciliar) , sonic hedgehog (Shh), eritropoietina (EPO), lisil- oxidase (LOX), progranulina, prolactina, grelina, neuroserpina, angiogenina, e lactogénio placentário.

6. 0 vetor viral recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o sujeito tem atrofia muscular espinal.

7. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é um mamífero.

8. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido mamífero é selecionado de entre o grupo consistindo em um roedor, um murino, um símio, e um ser humano.

9. 0 vetor virai recombinante neurotrófico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo é um paciente humano.

10. Um vetor virai recombinante de AAV, compreendendo um transgene que codifica SMN-1, para utilização num método de entrega de SMN-1 para a medula espinal de um sujeito com atrofia muscular espinal, em que o método compreende a administração do vetor virai em pelo menos um ventrículo do cérebro selecionado a partir do grupo que consiste num ventrículo lateral e no quarto ventrículo, em que o referido transgene é expresso e SMN-1 é entregue na medula espinal.

11. Uso de um vetor virai recombinante de AAV, compreendendo um transgene de SMN-1 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da atrofia muscular espinal num sujeito, em que o tratamento compreende a administração do vetor virai em, pelo menos, um ventrículo do cérebro selecionado a partir do grupo que consiste num ventrículo lateral e no quarto ventrículo, em que o referido transgene é expresso.

12. 0 vetor virai recombinante para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 10, em que o produto do transgene é uma proteina que compreende um motivo de 11 aminoácidos a partir do dominio de transdução da proteina da proteina TAT de HIV.

13. A utilização da reivindicação 11, em que o produto do transgene é uma proteína que compreende um motivo de 11 aminoácidos a partir do domínio de transdução da proteína da proteína TAT de HIV.